KR20090079963A - 증가된 열적 안정성을 가진 단백질-함유 물질 - Google Patents

증가된 열적 안정성을 가진 단백질-함유 물질 Download PDF

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브루노 윈터
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에이비 엔자임스 게엠베하
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Abstract

본 발명은 하나 이상의 생물학적 활성 단백질을 포함하는 코어 및 콩과 식물로부터 미분화된 생성물을 포함하는 코팅층을 포함하는 증가된 열적 안정성을 갖는 물질, 이 물질의 생성을 위한 방법 뿐만 아니라, 과립화된 생성물의 생성을 위한 방법에서 뿐만 아니라 동물 사료, 음식 및 약제학의 생성을 위한 방법에서 생물학적 활성 단백질의 열적 안정성을 증가시키기 위한 콩과 식물로부터 미분화된 생성물의 용도에 관한 것이다.
콩과 식물, 코팅층, 열적 안정성

Description

증가된 열적 안정성을 가진 단백질-함유 물질{PROTEIN-CONTAINING SUBSTANCE WITH INCREASED THERMAL STABILITY}
본 발명은 하나 이상의 생물학적 활성 단백질을 가진 코어(core)와 콩과 식물로부터 미분화된(micronized) 생성물을 함유하는 코팅층을 포함하는 증가된 열적 안정성을 가진 단백질-함유 물질에 관한 것이다. 또한 본 발명은 증가된 열적 안정성을 가진 단백질-함유 물질의 생산을 위한 방법 뿐만 아니라 단백질-함유 물질의 높은 생체 이용율을 유지하는, 과립화된 및/또는 펠렛화된 생성물의 생산 방법에서 생물학적 활성 단백질의 열적 안정성을 증가시키기 위한 콩과 식물로부터 미분화된 생성물의 용도에 관한 것이다.
생물학적 활성 단백질과 특히 효소는 일반적으로 건조 과립화된 제조물로 사용된다. 단백질-함유 생성물은 이런 형태로 다루기와 복용(dose)하기가 용이하다. 이러한 과립화된 생성물의 생산을 위한 수많은 기술들이 알려져있다. 예를 들면, 유동층 건조기(유동층 응집기)에서 입자들은 다공성 담체 상의 기류에 분산되고 응집체를 형성하고, 그 후 이들 응집체는 임의적으로 코팅되고 최종적으로 건조된다. 예를 들면 쟁기날 혼합기와 같은 혼합 응집기에서, 응집체 또는 과립물의 형성은 입자 충돌에 의해 생기고, 그것에 의해 조밀하거나 덜 조밀한 응집체가 전단 력(shear force)에 상응하여 형성될 수 있다. 연이어서 이러한 응집체는 일정한 잔여 습도로 건조될 수 있다. 더욱이, 단백질을 함유한 페이스트(paste)를 펠렛으로 압축하거나 작은 개구를 통해 압력 하에서 압출하고, 그리고나서 입자들로 자르고, 연이어서 건조시킨, 압출되거나 펠렛화된 생성물 또한 종종 사용된다. 이러한 모든 방법에서 전단력 및 온도에 관여하는 더 또는 덜 강한 조건이 사용된다. 동물 사료 생산의 분야에서 사용되는 단백질, 특히 효소는 그들의 처리 과정에서 그러한 부하(load)에 노출될 수 있고, 그것에 의해 단백질 또는 효소는 이것의 기능이 제한될 수 있다. 예를 들면, 분쇄되거나 과립화된 효소의 동물 사료 펠렛으로의 통합에서 효소의 불활성화는 사료에서 억제제와 접촉함에 의해 발생할 수 있고 그리고/또는 동물 사료 펠렛화 과정의 조건화 단계에서 증기 흐름의 증가된 온도 및 습도에 의해 발생할 수 있다.
이러한 제조 방법에서 생물학적 활성 단백질의 불활성화 및 특히 열적 불활성화를 피하기위해 실험들이 있었다. 예를 들면, 효소는 상대적으로 큰 입자들(예를 들면, 카사바 전분의 전분-함유 입자, 사고 전분, 쌀 전분, 밀 전분, 수수 전분 또는 보리 전분)에 공유적으로 고정되지 않았고; cf. 실리카 입자의 WO 97/39116 (cf. US 5,318,903; WO 94/26883) 또는 식물성 밀가루가 담체로 사용되었다(cf. US 4,106,991). 더욱이, 물질 가까이의 수분 함량이, 예를 들면 황산 나트륨에 의해 감소되었고(cf. WO 97/39116, WO 92/12645, WO　01/04279), 그리고/또는 내수성 및 내-증기막, 즉, 코팅은 고온 단독으로나 물 또는 수증기와 조합에서 그들의 효과로부터 증가된 수분 함량에서 생물학적으로 민감한 물질을 보호하기 위해 수행되었 다(cf. WO 97/39116, US 6,610,519, WO 00/01793, WO　92/12645, WO 96/16151, WO 01/04279). 더욱이, 바람직하기는 열적 및 기계적 에너지를 흡수한 성분들은 특히 효소 과립물에 첨가되었다. 피타제를 안정시키는 유산(lactic acid)의 용도는 WO　00/20569에 개시되어 있다.
효소의 경우, 효소 안정화제, 예를 들면 트레할로즈 및 황산 아연, 콘침지수(corn steep water), 피트산 및 이노시톨 모노포스페이트(피타제의 경우) 또한 첨가되었다. 피트산 및 이노시톨 포스페이트도 포함한, 콘침지수의 첨가는, 예를 들면 WO 00/20569에 개시되어 있다. 특이적 무기 염 황산아연 및 특히 황산 마그네슘의 첨가는 US 5,972,669, US 5,827,709와 EP 0 758 018에 개시되어 있다.
코팅용 트레할로즈, 황산아연 및 폴리에틸렌 글리콜의 사용은 WO 98/55599에 개시되어 있다.
그러나, 이들 방법은 동물들의 모든 사료 배급량에 많은 양의 황산아연, 미량 원소와 같은 첨가제(>15%; cf. US 5,827,709)를 적용할 수 없다는 단점을 갖는다. 왁스, 지방 등과 같은 소수성 재료로 만들어진 코팅제는 효소가 위장에서만 매우 느리게 방출된다는 점에서 효소의 생물학적 유용성이 감소하고, 그러므로 효능을 나타낼 수 있는 많은 양, 예를 들면 약 4시간의 제한된 보유 시간내에 돼지에 작용할 수 있는 많은 양으로 복용되어야만 한다. 더욱이, 이들 많은 조성물은 단지 특이적으로 최적화되고 예를 들면, 피타제와 같은 특정 효소에만 효과적이다. 카올린, 지올리스 및 실리카와 같은 다른 첨가제는 생물학적으로 분해될 수 없는 불용성 성분이어서, 이들의 사용을 강력하게 제한한다. 담체에 분사하는 것이나 팽윤할 수 있는 폴리사카라이드에 의한 흡착은, 분사과정 동안 덩어리를 초래할 수 있기 때문에, 단백질의 적용가능한 양과 생산에서 처리량을 제한한다. 따라서 생성된 효소 입자들에서 최대로 얻어질 효소 활성은 적용할 수 있는 효소에 대한 담체의 비율에 의해서도 제한된다.
그러므로, 생물학적 활성 단백질의 열적 안정성을 증가시키는 방법이 필요하다. 특히, 한정된 및/또는 작은 곡물 크기의 물질들의 생산 방법에서, 바람직하기는 예를 들면, 펠렛화된 생성물의 생산 방법에 사용하기 위한, 생물학적 활성 단백질의 열적 안정성이 증가할 것이다. 효소 제조물에서 열 부하 후에 사용된 효소 활성의 회복인, 열적 안정성은 특히 증가할 것이다. 생산 방법은 쉽고 확실하게 적용할 수 있을 것이다. 더욱이, 이 방법은 인간 및 동물 소비에 독성이 없고 무해한 과립화된 생성물을 만들 것이다. 이 방법은 일반적으로 응집 생성물, 과립 생성물 및 압출 생성물에 적용할 수 있고 심지어 높은 처리 온도에서 생성된 생성물의 적용에 효소의 충분한 온도 안정성을 보장할 것이다. 게다가, 이 방법에서 사용된 물질에 의해, 생물학적 활성 단백질과 다른 부정적 상호작용은 발생하지 않을 것이다. 더구나, 이 방법은 환경 친화적이고, 즉 예를 들면, 생물학적으로 분해될 수 있고 비-친환경적 화학물이나 용매의 재활용을 포함하지 않는 물질이 사용될 것이다. 사용된 성분들은 특히 동물 사료, 음식 및 약제학의 분야에서 사용이 용인될 것이다. 활성 단백질, 특히 효소 단백질을 코팅함에 의해, 예를 들면 실제로 미네랄 프리믹스에 존재하는 억제 물질과의 그것의 접촉이 역시 방지될 것이고, 저장-안정성 혼합물이 생성될 것이다.
콩과 식물로부터 미분화된 생성물의 하나 또는 여러 층을 생물학적 활성 단백질을 포함하는 입자에 적용하는 것에 의해, 또는 생물학적 활성 단백질을 함유한 핵(kernel)의 코팅, 커버, 캡슐화에 의해, 이러한 생물학적 활성 단백질의 열적 안정성(열안정성)은 다른 방법으로 코팅된 단백질의 활성에 영향없이 강하게 증가될 수 있음을 놀랍게도 발견하였다. 콩과 식물로부터 미분화된 생성물의 코팅층을 적용하고, 그것에 의해 단백질-함유 입자의 오직 외부층이 콩과 식물로부터 미분화된 생성물에 접촉한다. 이것은 생성물의 열 부하를 포함하는 처리방법에서 증가된 온도에 대한 코팅된 생물학적 활성 단백질의 효과적인 보호를 야기한다. 코팅은 또한 예를 들면, 억제제로 작용하는 물질이 있는 혼합물에 보관하는 동안 효소를 보호한다. 더욱이, 이 방법은 제조 및 사용의 추가의 단계에서 열안정성에 관하여 본 발명에 따른 특성을 가진 매우 높게 농축된 생성물(효소 생성물)의 생산을 가능하게 한다.
그러므로, 본 발명은 코어가 하나 이상의 생물학적 활성 단백질을 포함하는 것과 코팅층이 콩과 식물로부터 미분화된 생성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 코어와 코팅층을 포함하는 증가된 열적 안정성을 가진 단백질-함유 제제나 물질에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 그러한 단백질-함유 물질의 생산 방법에 관한 것으로, 여기서 콩과 식물로부터 미분화된 생성물을 포함하는 현택액이 하나 이상의 생물학적 활성 단백질을 포함하는 코어에 적용되고 따라서 얻어진 코팅된 입자들은 건조된다. 본 발명은 또한 생물학적 활성 단백질의 열적 안정성을 증가시키기 위해 콩과 식물로부터 미분화된 생성물의, 바람직하기는 펠렛화된 생성물의 생산 방법에 서의 사용에 관한 것이다.
본 발명에 따른 방법 또는 본 발명에 따른 사용은 높은 온도 및 습도에서 변성하는 조건에 대항하여 최적으로 효소를 보호하는, 작은 과립 입자들 또한 형성될 수 있다는, 당해 기술 분야의 방법을 넘는 이점을 갖는다. 예를 들면, 압출 방법(WO 00/47060)에 따른 또는 쟁기날 혼합기에 의한 생산(WO 01/04279)에 따른 입자들은 약 400 - 2,000 ㎛이다. 본 발명에 따른 입자들은 100 - 300 ㎛ 일 수 있고, 따라서, 특히 만약 입자들이 높은 효소 활성을 나타낸다면, 이들은 균질의(homogenous) 생성물을 생산하는데 매우 적합하다.
본 발명에 따른 방법 및 본 발명에 따른 사용은 일반적으로 열안정성, 특히 효소의 제조의 열안정성을 증가시키는데 적합하고, 예를 들면, 펠렛화된 동물 사료에 적용할 수 있다; 물질의 높은 용해성 때문에 효소는 또한 즉시, 생물학적으로 이용가능하다. 당해 기술분야의 방법과는 대조적으로 적용되는 물질의 양이 적고, 따라서 높은 활성 효소 입자들의 생산을 가능하게 한다.
본 발명에 따른 코팅된 단백질-함유 물질의 생산을 위한 본 발명에 따른 방법에서 콩과 식물로부터의 미분화된 생성물, 특히 미분화된 대두 생성물은 하나 이상의 생물학적 단백질을 포함하는 코어에 적용된다. 콩과 식물로부터 미분화된 생성물은 단순한 분사 및 연이은 건조에 의해 적용될 수 있다. 그러나, 콩과 식물로부터 미분화된 생성물은 유동층 건조기 또는 평판층 분사 건조기와 같은 각각 선택된 과정의 단계에도 직접적으로 또한 적용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 코팅층은 콩과 식물로부터 미분화된 생성물을 포함하거나 미분화된 생성물로 구성되어 있다. 본 발명에 따르면, 이것은 지방, 단백질, 전분 및 보존제와 같은 다른 탄수화물을 함유한 미분화된 콩과 식물(fabaceae)에 관한 것이다. 그것의 예로는 완두콩, 렌즈콩, 강낭콩, 땅콩, 대두콩, 리마 콩, 병아리콩(garbanzos), 동부(cow beans), 루핀으로부터 미분화된 생성물이다. 바람직하기는, 콩과 식물로부터의 미분화된 생성물은 미분화된 대두 생성물이다. 콩과 식물로부터 미분화된 생성물은 생물학적 활성 단백질의 코팅을 위해 사용될 수 있거나 또는 기술적으로 필요하고 합리적인 첨가제와 조합하여 사용될 수 있다. 이들은 예를 들면 pH 값을 조정하기 위한 산 및 염기 및/또는 염, 완충 물질 등 일 수 있다. 콩과 열매의 미분화된 성분, 예를 들면 탈지방화 한 후 잔여물이, 사용될 수 있다. 각각의 콩과 전체 열매로부터의 콩과 식물로부터 미분화된 생성물의 사용이 바람직하다. 따라서 콩과 식물로부터 미분화된 생성물은 그 자체로 알려진 모든 미세화 방법에 따라 생성될 수 있다. 미세화는 높은 온도로 짧은 시간동안 가열하는 과정이다. 그로인해 출발 물질이 상당한 수분 손실없이 몇 초의 펄스로 가열된다. 이와 관련하여 1.8 내지 3.4 ㎛의 파장을 가지는 적외선 펄스에 의한 미세화가 특히 적합하다.
콩과 식물로부터 미분화된 생성물은 수용액에서, 가능하게는 특정 pH 값을 조절한 후, 교반하여 현탁될 수 있거나 Ultraturrax에 의해 균질화 될 수 있다. 생산 과정에서 이것은 분사 노즐의 바로 앞에서 인-라인 균질기에 의해 수행되어 현탁액의 분리를 피한다. 그리하여 얻어진 현탁액은 모든 종류의 입자 상으로 분사될 수 있다. 입자들은 예를 들면 분사 건조 과정, 과립 과정, 응집 과정 또는 압출 과정으로 얻을 수 있다. 그리고나서 코팅층은 유동층 건조기, Wurster 튜브가 있거나 없는 코터(coater), ProCell 장치 등과 같은 분리 장치에서 배치 법에 따라, 또는 예를 들면 과립 또는 응축에 뒤이은 평판층(flat bed) 분사 건조기에서 또는 ProCell 장치에 관한 고도의(high) 최종 건조 과정 전에 후방(back) 분사 챔버의 하나에서 연속적으로 적용될 수 있다. 모든 코팅층 적용 방식들은, 예를 들면, >90% 건조 질량(mass), 바람직하기는 >92%, 더 바람직하기는 >95%, 가장 바람직하기는 >97% 건조 질량을 얻은, 전체 생성물의 고도의 최종 건조에 주의를 요한다. 콩과 식물로부터 미분화된 생성물의 적용된 질량은 사용된 단백질-함유 입자를 기초로 2 내지 50%(w/w) 건조 질량일 수 있다.
콩과 식물로부터 미분화된 생성물은 바람직하기는 미분화된 대두 생성물이고 특히 바람직하기는 Micronizing Company (UK) Ltd.의 아래-기재된 생성물인 "미분화된 소자(micronized soja)"일 수있다.
실시예에서 코팅층에 적용하기위해 사용된 미분화된 대두 생성물은 완전한 지방 대두를 기초로 생성되었다.
본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있는 미분화된 대두 생성물을 예시하는 것은 Micronizing Company (UK) Ltd., Charnwood Mill, Framlingham, Suffolk, IP13 9PT(www. micronizing.com)에 의한 "미분화된 소자" 생성물이다. 이 생성물은 적외선 미분화에 의해 생산되고, 그로 인해 1.8 내지 2.3 ㎛의 파장의 적외선이 사용되었다. 이 생성을 위한 전형적인 제조 과정은 다음의 과정을 포함한다:
- 예비-정제된 생성물을 적외선으로 120℃에서 진동 컨베이어 상에서 계속해서 끓여지고, 그로 인해 수증기의 부분적 압력이 강하게 증가하고 그러므로 단백질, 셀룰로즈, 헤미셀룰로즈 등과 같은 함유된 성분들이 소화된다. 예를 들면, 대두에 있는 항-영양 요소들이 또한 불활성화되고 재료는 동물 사료로서 매우 높은 영양적 가치를 달성한다.
- 가열된 생성물은 5 내지 15분 동안 컨테이너에 보관된다.
- 그리고나서 생성물이 고성능 분쇄기에서 플레이크로 연마되고 그 후 실온에서 냉각된다. 대두와 다른 지질(oil)-함유 종자 및 곡식과 관련하여, 연마 과정은 지질체의 소화와 함유된 지질의 소화를 야기한다.
- 플레이크를 분쇄기에 넣어 전-지방(full-fat) 가루를 얻는다. 적용을 위해 얻어진 입자들의 입자 크기는 직경 1 mm 이하, 더 좋게는 0.5 mm 이하, 훨씬 더 좋게는 0.3 mm 이하이다.
이 방법 또는 같은 결과를 갖는 상응하는 방법이 또한 다른 콩류의 미분화에 사용할 수 있다는 것이 명백하다. 예를 들면, 온도 및 시간과 같은 방법 매개변수 뿐만 아니라 방법 단계들의 순서는 미분화될 콩의 유형과 양에 따라 변화될 수 있다. 그러한 변화는 당해 기술분야의 당업자가 잘 알고 있고 단순한 반복 실험에 의해 결정될 수 있다. 1 mm 직경보다 작게, 바람직하기는 0.5 mm 보다 더 작게, 훨씬 더 바람직하기는 0.3 mm 보다 더 작게 입자 크기의 축소가 미분화에 의해 심지어 분사하기 전 균질화와 조합하여 얻어지는 것이 필수이다.
콩과 식물로부터 미분화된 생성물은 생물학적 활성 단백질 및 콩과 식물로부터 미분화된 생성물을 함유한 입자들의 건조질량 기준으로 50% (w/w)의 범위의 양으로, 바람직하기는 2 내지 50%, 더 바람직하기는 5 내지 35%, 및 가장 바람직하기는 7 내지 25%로 적용된다. 그 때문에 콩과 식물로부터 미분화된 생성물은 그 자체로 수용액으로 적용되거나 또는 따라서 순수한 현택액보다 더 미세한 분해물로 균질화 될 수 있다. 현탁액은 바람직하기는 물로 생성되고, 적용 전에 완충 물질 및/또는 염기나 산으로, 특정 pH 값으로 조절될 수 있거나, 예를 들면 염과 같은 추가의 물질이 콩과 식물로부터 미분화된 생성물의 효과를 증진시키기 위해 첨가될 수 있다.
본 발명에 따르면, 콩과 식물로부터 미분화된 생성물로 이루어진 코팅층이 적용된 코어는, 하나 이상의 생물학적 활성 단백질, 임의적으로 기술적 필요하고 적당한 물질을 함께 포함한다. 또한 몇몇 생물학적 활성 단백질의 조합, 임의적으로 기술적인 필요하고 적당한 첨가제와 함께 포함할 수 있다. 생물학적 활성 단백질은 바람직하기는 열적으로 불안정하다. 생물학적 활성 단백질은 효소가 바람직하다. 코어는 또한 생물학적 활성 단백질로만으로 이루어질 수 있다.
이 효소는 바람직하기는 피타제, 포스파타제, 알파-갈락토시다아제, 베타-갈락토시다아제, 락카아제, 포스포리파제, 엔도글루카나제, 특히 엔도-베타-1,4-글루카나제, 엔도-베타-1,3(4)-글루카나제, 엔도-1,2-베타-글루카나제 및 엔도-1,3-알파-글루카나제, 셀룰라제, 자일로시다제, 갈락타나제, 특히 아라비노갈락탄-엔도-1,4-베타-갈락토시다아제 및 아라비노갈락탄-엔도-1,3-베타-갈락토시다아제, 펙틴-분해 효소, 특히 펙티나제, 펙틴 에스테라제, 펙틴 리아제, 폴리갈락투로나제, 아라바나나제, 람노갈락투로나제, 람노갈락투로난 아세틸 에스테라제, 람노갈락투로난-알파-람노시다제, 펙테이트 리아제 및 알파-갈락투로니다제, 만나나아제, 베타-만노시다제, 만난 아세틸 에스테라제, 자일란 아세틸 에스테라제, 프로테아제, 다른 자일라나제, 아라비노자일라나제, 리파제와 같은 지질분해 효소, 디갈락토시드 디글리세라이드 에스테라제 및 큐티나제, 및 락카아제 및 트란스글루타미나제와 같은 다른 효소들로부터 선택된다. 효소는 특히 바람직하기는 피타제, 엔도글루카나제, 자일라나제 또는 포스파타제로부터 선택된다.
하나 이상의 생물학적 활성 단백질을 포함하는 코어는 추가로 담체 물질 및 첨가제, 예를 들면 옥수수 전분, 밀 전분 등과 같은 부분적으로 가수분해된 전분 생성물, 예를 들면 탈지 분유, 카제인 가수분해물, 효모 가수분해물 또는 자가분해물과 같은 단백질-함유 물질, 예를 들면 셀룰로즈, 헤미셀룰로즈 또는 리그닌-함유 성분 및 세포 추출물과 같은 다른 식물성 성분, 예를 들면 칼슘 프로피오네이트와 같은 유기 및 무기 염, 시트르산 또는 시트르산의 염, 완충 물질, pH 값을 조절하기 위한 산 및 염기를 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면 콩과 식물로부터 미분화된 생성물의 코팅층을 적용함에 의해 코팅된 생물학적 활성 단백질은 더 높은 온도 안정성(열안정성)을 얻는다. 부여된 증가된 열안정성에 의해, 생물학적 활성 단백질은 통상 단백질의 부분적 또는 완전 불활성화가 일어날 수 있는 조건 하에서 활성된다. 단백질로 주어진 열안정성은 열적 조건 하에서 추가의 처리가 가능하고(만약 그렇지 않으면 생물학적 활성 단백질의 불활성화를 가져올 것이다), 아울러 상대적으로 더 긴 보관 시간과 증가된 온도에서 보관이 가능하다. 코팅은 또한 추가의 처리 또는 보관 동안 싸여진(encased) 단백질에 억제하는 쪽으로 작용할 수 있는 다른 제제와 단백질과의 접촉을 방지한다.
본 발명에 따라 얻어진 증가된 열안정성을 위해, 하나 이상의 생물학적 활성 단백질을 포함하는 코어가 콩과 식물로부터 미분화된 생성물의 코팅층에 의해 완전히 코팅되는 것이 특히 중요하다. 생물학적 활성 단백질을 함유하는 출발 물질을 덮는 코팅은 일반적으로 코팅 적용시에 주의 깊은 과정 관리에 의해 얻어진다. 콩과 식물로부터 미분화된 생성물은 미분화된 상태 때문에 특히 완벽하게 출발 입자를 둘러싼다는 것을 인식할 수 있다. 앞에서 언급한 양(amounts) 내에서 콩과 식물로부터 미분화된 생성물의 사용은 또한 바람직하기는 출발 재료의 코팅이 바람직하게 완벽하도록 기여한다. 단백질-함유 물질의 질량을 기초로, 단백질-함유 물질의 입자 크기가 더 작을수록, 적용될 콩과 식물로부터 미분화된 생성물의 양이 더 많다. 이것은 표면에 대한 용적의 비율에 의해 야기된다. 용적과 비교하여, 더 작은 입자의 표면은 큰 입자들 보다 더 크다.
콩과 식물로부터 미분화된 생성물의 코팅층에 의해 주어진 증가된 열안정성 때문에, 예비-처리된 출발 물질은 특히 작은 곡물 크기를 갖는 제제의 사용 방법에서, 특히 펠렛화된 생성물의 생산 방법에서의 적용에 적합하다. 특히 동물 사료는 펠렛화 상태로 매우 자주 사용된다. 증가된 온도가 규칙적으로 펠렛화 조건에서 발생하기 때문에, 본 발명에 따른 방법 또는 본 발명에 따른 사용은 각각 사용된 단백질의 생물학적 활성의 최대 수확으로 펠렛화된 동물 사료 생성물을 제조하는 기회를 제공한다.
코팅된 단백질-함유 물질 또는 본 발명에 따른 입자들은 그 자체로서 또는 처리된 형태로 추가 사용을 위해 첨가될 수 있다. 예를 들면, 그것들은 동물 사료, 음식 또는 약제에 병합될 수 있다. 대응 방법 및 적용은 당해 기술분야에서 당업자에게 잘 알려져 있다.
첨부된 도면은 더 자세히 본 발명을 설명한다:
도 1은 증기 발생기의 개략도를 나타낸다(스팀기; 실험장치):
도 2는 방법 A)의 80℃ 조건에 상응하는 조건 하의 증기 발생기에서 사료/효소 샘플의 전형적인 온도 프로파일을 나타낸다(아래 참조).
도 3은 다른 산으로 pH 값의 조정 후, 산 포스파타제의 열안정성에 대한 코팅층의 영향을 나타낸다.
도 4는 글루시덱스(Glucidex) 코어에 적용하기 전에 글루시덱스를 첨가하고 그리고 첨가하지 않고 그리고 연이어 미분화된 대두의 10%(w/w) 건조 질량으로 코팅된 엔도글루카나제 과립물에 실험 스팀기에 의한 열 부하 후의 활성 회복을 나타낸다.
본 발명은 아래의 실시예를 기초로 더 자세히 설명한다:
참조예 1: 피타제 활성의 측정
피타제 활성은 0.5% (w/w) 피트산(약 5 mM), 200 mM 구연산 나트륨, pH 5.0 을 함유한 분석 혼합물에서 측정하였다. 37℃에서 인큐베이션 15분 후, 반응을 15% (v/v) 트리클로로아세트산의 동일 용적을 첨가하여 멈추었다. 방출된 포스페이트 이온은, 50℃에서 인큐베이션 및 820 nm의 20분 동안 지속 후, 900 ㎕ H2O 및 1 ㎖ 0.6 M H2SO4, 2% (w/v) 아스코르브산 및 0.5% (w/v) 몰리브덴산 암모늄이 있는 분석 혼합물 100 ㎕을 혼합하여 정량적으로 측정하였다. 포타슘 포스페이트 표준 용액을 참조로서 사용하였다.
참조예 2: 산 포스파타제 활성의 측정
산 포스파타제 활성의 측정은, 기질 용액이 250 mM 글리신/HCl 버퍼(pH 2.5)에 10 mM α-글리세롤포스페이트인 차이를 가지고, 참조예 1의 피타제 측정과 유사하게 수행하였다.
참조예 3: 엔도-β-1,4-글루카나제 활성의 측정
β-글루카나제는 용해된 보리 글루칸에서 글리코시드 결합을 가수분해한다. 방출된 환원당은 DNS 시약과 반응하여 색상 복합체로 되고, 이것의 함량은 광학적으로 540 nm에서 측정된다.
β-글루카나제 활성의 1 단위는 정해진 조건 하에서 분 마다 글루코스를 환원하는 당 등가물의 1 μmol을 방출하는데 필요한 효소의 양으로 정의된다. 효소 반응은 pH 5.5 및 40℃에서 수행한다.
DNS 시약:
10 g NaOH 펠렛 및 200 g 타르타르산 나트륨은 탈-이온화수 800 ㎖에 용해한 다. 3,5-디니트로살리실산 메틸 에스테르(DNS) 10 g의 첨가 후, 1시간동안 30-40℃에서 교반하였고 1ℓ까지 채웠다.
보리-글루칸 기질 용액:
1 g 보리 글루칸(Megazyme # P-BGBM)을 탈-이온수 60-70 ㎖에 현탁하였고 그리고나서 글루칸이 용해될 때 까지 저으면서 80-85℃로 가열하였다. 연이어, 저으면서 실온까지 냉각하였다. 10 ㎖ 버퍼(pH 5.5)의 첨가 후, 100 ㎖까지 채웠다.
β-글루카나제 활성을 측정하기 위해, 0.9 ㎖ 기질 용액 및 0.1　㎖ 희석된 효소 용액의 배치를 15분 동안 40℃에서 배양하였다. 1.5 ㎖ DNS 시약의 첨가 후, 배치를 20분 동안 끓는 물 배스에서 가열하였고 그리고나서 실온으로 냉각하였다. 2 ㎖ 탈-이온수의 첨가 후에, 광학밀도는 광도측정계로 540 nm에서 측정하였다. 효소 용액 대신 물을 블랭크로 사용하여 측정하였다. β-글루카나제 활성의 측정은 글루코스의 보정 곡선으로 측정하였다.
실시예 1: 코팅층 적용
미분화된 대두 생성물의 코팅층을 적용할 수 있음에 따라, 두개의 바람직한 구현예를 아래 기재하였다. 위에서 언급된 생성물인 Micronizing Company(UK)의 "미분화된 대두(micronized soja)"를 사용하였다. 이러한 방법 변화는 실시예 3 내지 10에 인용하였다.
코팅층은 다음의 방법 변화로 적용될 수 있다:
방법 A): 타입 Strea-1, Aeromatic-Fielder AG, Bubendorf, Switzerland의 유동층 건조기(Aerocoater)에서 코팅층 적용
이 방법에서 미분화된 대두 생성물을 포함하는 코팅층을 특정 유동층 건조기에 의해 생물학적 활성 단백질을 포함하는 과립물에 적용한다. 과립물은 그 자체로 알려진 방법으로 생성된 단백질 과립물이다.
공기 압축기는 6 bar(600 kPa)로 압축된 건조한, 지방이 없는 공기를 생성한다. 타입 Strea-1의 유동층 건조기에서 처리될 수 있는 단백질-함유 과립물의 전형적인 차지(charge) 크기는 표준 방법에 따라 측정될 수 있다. 코팅 실험은 바닥 분사 장치(Aerocater)가 있는 Strea-1로 수행된다. 전형적인 차지(charge) 크기는 50 내지 300 g 범위의 과립물이다. 조절된(tempered) 압축된 공기는 0.6 bar(600 kPa)의 압력으로 바닥에 공기 분산 판의 중앙에 배치된, 1.2 mm 분사 노즐에 의해 도입된다. 공기 분산 판은 중앙으로 >95% 공기 흐름이 있고 남아있는 5%가 관의 가장자리 영역으로 완전히 흐르게 하여 벽과 습한 과립물의 접촉을 피하게 하는 방식으로 제조된다. 짧은 Wurster 파이프를 코팅 실험의 대부분에 사용하고 공기 분산 판 위 0.8 cm에 부착한다. 몇몇의 실험에서, Wurster 파이프에 과립물의 흐름을 유지하는 것이 어렵고, 그래서 코팅은 파이프가 없이 수행한다. 현탁되거나 균질화된 "미분화된 소자"를 포함하는 코팅 액체의 전형적인 흐름 속력은 1 내지 6 ㎖ 분-1이다. 분사를 위해 사용된 현탁액은 분사하기 직전 Ultraturrax에 의해 균질화된, "미분화된 소자"의 5% 내지 25% 건조 질량을 가진 수성 현탁액이었다. 바닥 분사 장치를 가진 구현예에서 노즐의 막힘을 피하기 위해, 공기 유입 온도는 분사하는 동안 60℃를 초과하지 않아야 한다. 완전 "미분화된 소자"를 적용할 때, 공기 유입 온도는 80-95℃로 증가시켜 5 내지 10%의 최종 수분 함량으로 코팅된 과립물이 건조되게 한다. 그리하여 얻어진 과립물은 그 자체로 사용할 수 있거나 처리될 수 있다.
방법 B): 타입 GPCG1, Glatt Systemtechnik GmbH, Dresden, Germany의 유동층 건조기에서 코팅층 적용
이 방법에서 미분화된 대두 생성물을 포함하는 코팅층은 특정 유동층 건조기에서 생물학적 활성 단백질을 포함하는 과립물에 적용한다. 과립물은 그 자체로 알려진 방법으로 생성된 단백질 과립물이다.
예를 들면 분사 과립기, 타입 SBD 76, APV Anhydro AS, Denmark을 가지고 산업적 방법으로부터 유도된, 과립물의 더 높은 양을 상층 분사 방법이나 바닥 분사 방법으로 GPCG1, Glatt에서 코팅한다. 약 500 g 단백질 과립물을 각각 실험에서 GPCG1에 둔다. 코팅 조건은 다음과 같다:
상층 분사 코팅:
과립물 온도: 40-43℃
공기 온도: 55℃
바닥 분사 코팅:
과립물 온도: 38-40℃
공기 온도: 55℃
"미분화된 소자"는 물 중의 10%(w/w) 현탁액으로 젓고 분사하기 전에 인-라인 균질기로 균질화한다.
균질화된 미분화된 대두 현탁액의 분사율(속력)은 과립물이 응고되지 않는 방식으로 조정하고, 그리하여 오직 사용된 과립물 입자 크기는 코팅 때문에 상당하게 변한다. 현택액의 전형적인 분사율은 약 5-15 ㎖ 분-1이다. 두개의 제트 노즐을 미분화된 대두 현탁액 10% (w/w)를 도입하고 적용하기 위해 사용한다.
코팅은 일반적으로 사용된 과립물의 건조 질량을 기준으로 10%(w/w)이다; 그러나, 또한 5 내지 30% (w/w)일 수 있다.
실시예 2: 열 부하 테스트 수행
"미분화된 소자"에 의해 코팅된 생성물에 포함된 단백질, 특히 효소는 다음의 방법에 따라 열안정성을 테스트할 수 있다. 코팅된 생성물을 아래 기재된 방법 중 하나로 열 부하를 받게 한다. 이러한 방법들은 예시적으로 효소를 함유한 입자들의 열안정성 테스트에 관한 것이다. 다른 생물학적 활성 단백질들을 함유한 입자들의 열안정성이 유사하게 테스트될 수 있다.
다음의 방법에서 생성될 최종 생성물에 첨가되는 효소 활성은 열 부하 전 및 후에 테스트될 효소에 특이적인 측정 방법으로 측정한다(참조예 1-3 참조). 열 부하 후 회복되는 효소 활성은 백분율 회복의 형태로 사용된 효소 활성의 백분율로 나타낸다. 열 부하는 코팅되지 않은 그리고 코팅된 물질을 가진 코팅층의 효능을 증명하고 비교하는 것을 수행한다.
방법 A): 파일럿 펠렛화 식물에서 열안정성 테스트하기(Institute of Biotechnology of the Research Institute for Food and Molecular Biotechnology, Kolding, Denmark에서 실행가능함; 테스트는 또한 다른 상응하는 펠렛화 공장에서 수행될 수 있다)
효소 균류 또는 박테리아 피타제 함유하는 코팅되거나 코팅되지 않은 과립물, 실시예 1의 방법 A) 또는 B)에 따라 생산된 산 포스파타제 또는 엔도글루카나제를 타입 550의 밀가루와 프리믹스하여 효소-함유 프리믹스 300 g을 얻었다. 프리믹스는 Institute of Biotechnology of the Research Institute for Food and Molecular Biotechnology, Kolding에서 동물사료 15 kg과 혼합하여, 285 kg 동물사료에 그것의 혼합을 위한 광학 희석 및 펠렛화된 재료에서 잘 측정할 수 있는 효소 활성을 보장한다. 코팅된 과립물의 사용된 양은 코팅된 재료에 함유된 효소의 활성 높이에 따라 대부분의 실험에서 동물 사료 kg 당 0.1 내지 10 g이고, 따라서 피타제의 약 5 유닛(U) g-1 동물사료 또는 산 포스파타제의 약 6 유닛(U) g-1 또는 엔도글루카나제의 약 230-270 유닛(U) g-1의 효소 활성을 가져온다. 펠렛화 공장에서 처리되는 300 kg 동물 사료는 표 1의 조성물을 갖는다.
표 1: 펠렛화되는 동물 사료의 조성물
성분 [%]
히프로 소자 48 20
대두유 4.75
비타민/미네랄, 베타 Avitren 90 0.25
효소 프리믹스* 300 g
밀 ad 100
* 균류 또는 박테리아 피타제, 산 포스파타제 또는 엔도글루카나제 펠렛화 조건은 다음과 같다:
700 ℓ의 수평 혼합기, 48 rpm(0.8 헤르츠); 혼합된 양이 80 내지 300 kg의 범위이다.
수평 스크류 컨베이어를 혼합기를 비우기 위해 혼합기에 부착하는데, 그것의 운반 속도는 다음 단계에 맞춰진다.
혼합기는 길이 130 cm, 직경 30 cm, 155 rpm(2.58 헤르츠) 및 37 챔버를 가진 Kahl 캐스케이드 혼합기(컨디셔너)이다. 처리량은 시간당 300 kg 이다. 사료 및 본 발명에 따른 효소-함유 입자들은 약 30 초 동안 습한 증기와 접촉한다(증기와 온도에 관한 조건은 표 2에 나타내었다).
Dan Stoker 고압 보일러에서 생성된, 증기는 2 bar(200 kPa)와 압력으로 압력-조절 밸브를 통해 캐스케이드 혼합기로 흐른다. 벨브는 캐스케이드 혼합기로 흐르는 증기의 양을 조절하고 여기서 효소-함유 사료를 가열을 초래한다.
조건화된 재료를 Simon Heesen 프레스로 펠렛화하고 연이어 1,500 m3 h-1로 흐름 천공 박스에서 공기-냉각한다. 펠렛화 프레스는 7.5 kW의 투입(input)에서 500 rpm으로 가동하고 그것에 의해 3 x 20 mm의 펠렛이 생성된다.
표2: Institute of Biotechnology of the Research Institute for Food and Molecular Biotechnology, Kolding, Denmark의 공장에서 본 발명에 따른 입자를 포함하는 동물 사료를 펠렛화하는 다른 온도를 얻는 증기 조건
설정 온도 [℃] 증기 [%] 실제 온도 [℃]
70 3.6 69.8 - 70.0
75 3.9 74.8 - 74.9
80 4.3 79.7 - 79.9
85 4.6 84.7 - 84.8
90 5.0 89.8 - 90.0
95 5.4 94.9 - 95.1
코팅된 입자들의 열안정성을 테스트하기 위한 열 부하는 다른 공장들에서도 상응하게 수행될 수 있다. 연이어서, 펠렛화된 동물 사료에 코팅된 입자들과 코팅 되지 않은 입자들에 여전히 남아있는 효소 활성을 참조예 1-3에 따라 측정하였다.
방법 B): 실험실 기구-실험실 스팀기에서 열 부하 테스트 수행
닫혀진 용기(vessel)에서 수행되는 열 부하 테스트, 요컨대 열안정성 테스트들은 이들이 가속화된(accelerated) 보관 테스트로서 작용하기 때문에, 증가된 보관 안정성의 지시자에 가장 좋다. 그러나, 사료용 펠렛화 조건 하에서 증가된 열안정성을 테스트하기 위해, 사료 분쇄기(mill)에서 발생하는 조건 하에서 사료와 부하로의 병합으로 효소의 열안정이 확실하게 측정될 수 있는 것에 의해 실험 방법이 발전되었다(방법 A 참조). 효소-함유 사료가 증가된 온도 및 습도를 받을 때, 즉 사료의 증기 조건화 동안 발생하는 조건 하에서, 효소 불활성화의 다수가 일어난다는 것을 발견하였다. 이 불활성화 정도를 측정하기 위해, 동물 사료에서 효소 과립물을 실험실 규모의 장치에 증기 가열을 받게 한다. 방법은 한정된 온도(75-85℃)에 관해 설정된다. 그러한 테스트가 수행될 수 있는 장치는 도 1에 나타내었고 사료가 도입된 천공된 삽입체를 갖는 황동 용기로 이루어지고 또한 사료에 증기를 도입하는 메카니즘을 갖는다. 증기는 4.7 bar(470 kPa) 압력으로 보통의 증기 생성기(Euroflex)로부터 충전된다. 용기에 들어가는 증기의 양은 두개의 조절 밸브로 조절되는데, 이들은 또한 사료를 갖는 삽입체 아래의 용기 부분으로부터 물 응축물의 제거를 조절한다. 증기 파이프는 응축물로부터 유리되고 황동 용기에 부착되기 전 이미 작동 온도에 있는 것이 중요하다.
용기를 테스트되는 사료로 채우는데(50-100 g, 전형적으로 50 g, 조성물 표1 참조), 본 발명에 따른 효소-함유 입자들을 포함하고, 증기가 용기에 도입된다. 샘 플은 말단에 열전소자(thermoelement)를 가지는 긴 바벨로 휘젖고 열전자소자는 탐침에 있는 동물 사료로 별도로 도입된다. 사료 샘플의 온도는 측정 신호의 A/D 전환 후 데이터이력기록기(DrDAQ, company Pico Technology, UK)로 탐침과 접촉하게 하여 개인 컴퓨터에 일관되게 기록한다.
원하는 온도를 얻을 때(대개 80℃ 또는 85℃), 온도를 30 내지 60초 동안 유지하고, 사료를 용기에서 꺼내 평평한 플라스틱 컨테이너에서 냉각한다. 80℃에서 이들 테스트를 위한 전형적인 온도 프로파일은 도 2에 나타내었다(방법 A)에 따른 방법에서 80℃의 조건에 상응하는 증기에서 사료/효소 샘플의 온도 프로파일). 얻어진 최대 온도와 이 온도를 유지하는 시간의 길이(span)는 밸브를 바꾸는 것 및/또는 분산된 증기 양을 조절하는 것에 의해 조절될 수 있다.
열부하 실험은 항상 실험 장치로 두번의 이상 측정하였다. 온도 곡선 아래 영역은 반복된 샘플이 동일한 총 열 부하를 받았는지를 측정하기 위해 통합되었다. 그러나 80℃ 또는 85℃의 정의된 온도에서 노출 시간이 중요하다. 혼합물에서 코팅되거나 코팅되지 않은 입자들에 여전히 남아있는 효소 활성이 참조예 1-3에 따라 측정하였다.
실시예 3: 사상균(filamentous fungus)의 피타제의 온도 안정성
A 부
예를 들면, WO 94/03612에 따른 재조합 Trichoderma Reesei 균주로 생성된, Aspergillus niger var. awamori 피타제의 UF 농축물은 UF 농축물에 용해된 다른 첨가제를 가진 APV 분사 과립기에서 건조하였고(cf. 실시예 1, 방법 B)) 그리고나 서 실시예 1, 방법 B)에 따른 방법에 의해 코팅하였다. 상층 분사 방법으로 코팅된 과립물은 UF 농축물의 건조 질량을 기준으로 15% (w/w) 시트르산을 함유하고, pH 값을 3으로 조정하였다. 더욱이 바닥 분사 방법에 의해 코팅된 과립물은 말토덱스트린 10%(w/w)를 함유하는데, 이것은 건조하기 전에 UF 농축물에 용해하였다. 이 방식으로 맞춰진 모든 UF 농축물은 80 내지 180 bar(8,000 내지 18,000 kPa)의 분사 압력으로 APV 건조기에 도입하였다. 그로 인해 얻어진 입자 크기는 생성된 모든 과립물에 대해 200 내지 300 ㎛였다. 열 부하 테스트(짧은 열안정성 테스트에서)는 실시예 2, 방법 A)에 따라 수행하였다. 결과물은 표 3에 나타내었다.
표 3: "미분화된 소자" 10%(w/w)로 코팅에 의해 과립물에서 Aspergillus 피타제의 열 안정성의 증가. 분사 과립화 전에 UF 농축물의 pH 값을 조정하기 위해, 시트르산을 사용하였다.
회복 효소 활성 [%]
온도 [℃] 코팅되지 않음 상층 분사에 의해 코팅됨 바닥 분사에 의해 코팅됨
70 46.7 99.3 84.7
75 31.9 70.4 71.5
80 21.0 43.3 32.1
85 9.5 28.1 18.3
90 5.3 14.1 10.9
95 3.6 5.0 5.1
모든 코팅되지않은 생성물과 코팅된 생성물의 입자 크기는 Malvern 장치에서 레이저 회절로 측정시, 200 내지 300 ㎛이었다. 표 3에서 결과는 펠렛화 과정에 존재하는 열 부하 하에 코팅된 입자들에서 싸여진 효소의 열안정성의 증가가 UF 여과물에서 선택된 첨가제와는 독립적으로 얻어졌다는 것을 보여준다. 더욱이, 발달하는 분사 과립물의 크기와 형태에도 영향을 주는, 분사 압력은 펠렛화 과정에서 관 찰되는 코팅된 분사 과립물에 싸여진 효소의 열안정성의 증진에 영향을 미치지는 않는다. 발명에 따른 입자들(과립물)은, 여기서 싸여진 효소가 열 부하에서 처리되지 않은 입자에서 더 낮은 불활성화를 겪는데, 상층 분사 방법 뿐만 아니라 바닥 분사 방법에 의해서도 생성될 수 있다.
B 부
A 부의 UF 농축물을, UF 농축물의 건조 질량을 기준으로 50%(w/w) 탈지 분유(30% 락토즈)를 첨가하여, 그리고 구연산 나트륨으로 pH 5.1로 pH 값을 조정한 후에, ProCell5, Glatt에 코어없이 분사 과립물로 건조하였다. 이것은 배치 과정을 초과하는 6-25 g 분-1의 분사율을 가진 두개의 제트 노즐에 의해 ProCell5에서 공기흐름에 대항하여 상층 분사 방법에 약 15-2%의 건조 질량을 가진 상기 언급된 용액의 분사에 의해 일어난다. 추가적인 공기의 온도는 분사동안 90-100 m3 h-1의 추가적인 공기의 양에서 70-95℃이고, 그것에 의해 생성물 온도는 50℃로 유지된다. 전체 용액이 분사되었을 때, 추가적인 공기의 온도는 최대로 증가된다. 추가로 5분 동안 100℃로, 그것에 의해 생성된 온도는 55℃를 초과하지 않아서 얻어진 과립물에서 >95% 건조질량의 원하는 양을 얻는다. 배치 방법에서 상기 언급된 용액의 약 2 ℓ를 분사 과립물로 처리된다. 분사 과립물의 입자 크기는 300 ㎛ 이하이다. 따라서 얻어진 분사 과립물은 실시예 1A)에 기재된 방법에 의한 "미분화된 소자"의 10%(w/w) 균질화된 현탁액로 코팅하였고, 그로 인해 코팅은 분사 과립물의 건조질량을 기초로 10% (w/w)의 양을 가졌다. 실시예 2, 방법 A)에 따른 온도 부하 테스 트(열안정성 테스트)를 수행하였다. 활성 회복의 결과를 표 4에 나타내었다.
표 4: 10% (w/w) "미분화된 소자"로 코팅함에 의해 과립물에서 Aspergillus 피타제의 열 안정성의 증가, 이로 인해 탈지 분유를 분사 과립물로 처리하기 전 UF 농출물에서 용해하였다.
회복 효소 활성 [%]
온도 [℃] 코팅되지 않음 코팅됨
70 70.1 77.8
75 45.4 61.0
80 29.4 42.8
85 9.1 13.0
90 0.4 7.2
95 0.2 0.4
표 4에서 결과는 건조시에 Aspergillus 피타제에 시트르산이 아닌 다른 첨가제가, 특히 탈지 분유의 첨가가, 효소 안정성에 또한 유리하게 작용할 수 있음을 나타낸다. 그러나, 싸여진 효소의 열안정성의 추가의 증진은, A 부 뿐만 아니라 코팅되는 효소-함유 분사 과립물의 조성물에 독립적인 "미분화된 소자"로부터 코팅의 적용에 의한 B 부에서도 도달하였다.
실시예 4: 사상균의 피타제의 열안정성에 대한 미분화된 대두의 코팅 정도의 효과
"미분화된 소자"의 10% 현탁액은 물에서 생성하였는데, 그것이 또한 실시예 3에서도 코팅을 위해 사용되었기 때문이다. 불용성 성분은 원심분리로 분리하였다. 그래서 전개된 수용성 분획은, 열부하 테스트에서 싸여진 피타제의 열안정성 증가의 효과가 "미분화된 소자"에 함유된, 피타제의 기질인 피트산에 의해 야기되는지를 시험하기 위한 실험에 사용하였다. 코팅에서 "미분화된 소자"로 10% w/w 코팅을 얻은 것이 필요하기 때문에, 분취량으로 나누어 사용하였다. 실시예 3에 따른 UF 농축물로부터 생성된, ROAL OY 회사의 FINASE® PC 제품이 사용되었다.
실시예 1, 방법 A)에 따른 방법으로 FINASE® PC를 코팅하였다. 열 부하는 30초 동안 80℃에서 실시예 2, 방법 B)의 방법에 따라 수행하였고, 연이어 처리된 재료에서 잔여 효소 활성을 측정하였다.
표 5는 열 부하 테스트 동안 입자에 함유된 효소의 열안정성에 대한 "미분화된 소자"로부터의 수성 추출물의 효능을 나타낸다.
표 5:
번호 입자 설명 활성 회복 [%]
1 FINASE® PC 46
2 FINASE® PC 300 g을 기초, "미분화된 소자"로 5% 코팅 양에 상응하는 "미분화된 소자" 현탁액의 10% 현탁액의 수성 추출물로 분사 46
샘플 1 및 2의 비교로부터 알 수 있듯이, 대두의 수성 추출물로 코팅은 펠렛화 과정 동안 분사 과립물에서 효소에 대한 안정화 효과가 없다. 콩가루는 피타제의 기질인, 피트산이 풍부하다. 피트산은 피타제(WO 98/55599)에 안정화 효과를 갖는 것으로 일컬어진다. 본 실험은 실시예 3에서 얻어진 열안정성에 증가가, 펠렛화 과정의 열부하 하에서 보여질 수 있기 때문에, 이 효과에 기여될 수 없음을 나타낸다. 과립물의 가장자리 층으로의 피트산의 여과는, 그것이 코팅하는 동안 발생될 수 있으므로 펠렛화 과정의 조건 하에서도 관찰된 열안정성 증가를 설명하는데 충분하지 않다.
실시예 5: 글루시덱스의 코어를 가진 분사 과립물에서 "미분화된 소자"로 박테리아( E. coli ) 피타제의 코팅
본 실시예에서 글루시덱스의 코어를 가진 박테리아(E. coli) 피타제-함유 분사 과립물을 미분화된 대두로 코팅하였다.
과립화
800 g 글루시덱스 12(1% 글루코스, 2% 디사카라이드 및 97% 고급(higher) 폴리사카라이드를 함유한 Roquette, France의 옥수수 전분 가수분해물(hydrosylate))는 STREA 1, Aeromatic Fielder에 존재시키고, 재조합 T. reesei 균주(WO 2006/042719)로 생성된 E. coli 피타제(pH 2.5, 황산으로 조정됨)의 500 g UF 농축물로 분사하였다.
코팅
그리고나서 분사 과립물은 실시예 1, 방법 A)의 방법에 따라(건조 질량을 기준으로 5% (w/w) "미분화된 소자") 코팅하였고, 그리고 분사 과립물에서 피타제의 열안정성을 실시예 2, 방법 A)에 따라 테스트하였다. 결과는 표 6에 나타내었다.
표 6: "미분화된 소자"의 코팅에 의한 글루시덱스 12-코어를 가진 분사 과립화로 부터의 입자들에서 E. coli 피타제의 열안정성의 증가
온도 [℃] 활성 회복 [%] 코팅되지 않음 활성 회복 [%] 5% 코팅됨
70 61.7 94.2
75 45.5 73.3
80 36.9 50.4
85 21.8 23.7
90 6.0 10.1
95 0.2 1.3
표 6의 결과는 실시예 2, 방법 A)의 테스트 조건 하에서 효소-함유 분사 과립물에 E. coli 피타제의 열안정성이 이미 분사 과립물의 건조 질량을 기준으로 5% (w/w)의 "미분화된 소자"로부터 코팅층의 적용에 의해 증가되었음을 나타낸다.
실시예 6: 박테리아( E. coli ) 피타제를 함유한, 코어가 없는 분사 과립물의 코팅
본 실시예는 "미분화된 소자"로 코팅 적용에 의한 코어가 없는 분사 과립물에서 박테리아 피타제의 열안정성 증가를 나타낸다.
과립화
추가의 실험에서 ProCell 5, Glatt에 E. coli 피타제 (실시예 5 참조)의 2kg UF 농축물을 코어없는 분사 과립물을 생산하는데 사용하였다(실시예 3, B 부 참조). UF 농축물 및 4.4 g Ca 프로피오네이트의 전체 단백질을 기준으로 30% (w/w) 탈지 분유(30% 락토스 함량)를 UF 농축물에 첨가하였다. pH 값은 황산이나 수산화나트륨용액으로 pH 5로 조정하였다.
코팅
연이어서 분사 과립물은 실시예 1, 방법 A)의 방법에 따라 코팅하였고(건조 질량을 기준으로 10% (w/w) "미분화된 소자"), 열부하는 실시예 2, 방법 A)의 방법에 따라 수행하였고, 그리고나서 분사 과립물에서 피타제의 열안정성을 테스트하였다. 결과는 표 7에 나타내었다.
표 7: 글루시덱스 코어가 없는 분사 과립물에서 E. coli 피타제의 열안정성
온도 [℃] 활성 회복 [%] 코팅되지 않음 활성 회복 [%] 10% 코팅됨
70 85.7 99.9
75 49.6 82.1
80 19.3 41.6
85 4.5 18.3
90 0.3 9.7
95 0.3 4.7
결과가 보여주듯이, 펠렛화 실험에 존재하는 조건 하에서 "미분화된 소자"에 의해 코팅된 이들 분사 과립물에 함유된 피타제를 위한 증가된 열안정성을 나타낸다.
실시예 5와 실시예 6의 코팅되지않은 분사 과립물과 코팅된 분사 과립물의 데이터의 비교는, 글루시덱스 코어가 열안정성 증가에 책임이 없음을 나타내는데, 그것이 "미분화된 소자"로 코팅의 적용에 의해 얻어지기 때문이다. 실시예 5와 실시예 6의 코팅되지 않은 입자에 대한 활성 회복은 선택된 실험 조건 하에서 효소의 열안정성의 다른 분포를 보이지만; 그러나 그 결과는 "미분화된 소자"로 코팅하여 얻어진 결과보다 비슷한 수준과 각각의 시간에 아주 낮다. 사실, 예를 들면, WO 98/54980 및 WO 00/24877에 가정된, 코어의 효과를 증명하는 것은 불가능했다. WO 98/54980은 열부하에서 얻어진 효소에 안정화 효과를 특히 탄수화물 폴리머에서 효소 용액의 흡수와 연이은 건조의 탓으로 돌리는데, 그들이 동물 사료에서 펠렛화 조건에서 일어나기 때문이다. 안정화 효과는, 분사 즉, 비흡수의 기존 경우에서, 탄수화물 폴리머에 효소 용액을 얻을 수 없었다.
본 실시예에서 결과는 또한, 비록 피타제가 실시예 3 및 6에서 사용되었더라도, 피타제의 특정 종류로 제한되지 않는다는 것을 나타낸다. 실시예 3에서 사상균의 피타제와 실시예 6에서 박테리아 유래의 피타제가 사용되었으나, 이는 오직 아미노산 수준에만 18%의 상동성이 나타났으므로, 두개는 완벽하게 독립된 단백질로 여겨진다.
실시예 7: 사상균의 산 포스파타제를 함유하는 과립물의 코팅
본 실시예에서 사상균의 산 포스파타제의 열안정성 증가는 "미분화된 소자" 로 과립물을 코팅하여 실험하였다.
과립화
예를 들면, WO 94/03612에 따라, 재조합 T. reesei 균주에 의해 생성된 Aspergillus niger pH 2.5 산 포스파타제의 200 ㎖ UF 농축물을 HCl 또는 H2SO4로 pH 4로 조정한 후, STREA 1, Aeromatic Fielder에 500 g 글루시덱스 12 상에 분사 건조하였다. 황산으로 pH 값의 조정에서 떨어진 CaSO4양은 분사 과립화 전에 원심분리로 분리하였다.
코팅
분사 과립물은 실시예 1, 방법 A)의 방법에 따른 "미분화 소자"의 다른 양으로 코팅하였다. 분사 과립물에서 산 포스파타제의 열부하는 60초 동안 85℃에서 실시예 2, 방법 B)에 기재한 방법에 따라 수행하였고, 열안정성은 후에 잔여 활성의 측정에 의해 결정하였다. 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 결과는 실시예 2, 방법 B)에 따른 펠렛화 과정의 조건 하에서 코팅된 분사 과립물에서 산 포스파타제의 얻어진 열안정성의 증가가 적용된 미분화된 대두의 양과 직접적으로 연관된다는 것을 보여준다.
더욱이, 분사-과립된 UF 농축물에서 유리 칼슘의 양은, WO 97/05245, US 5,972,669, US　5,827,709와 EP 0 758 018에 나타난 바와 같이, 산 포스파타제와 밀접히 관련된 효소인 피타제와 대조적으로 효소의 열안정성에 효과가 없는 산의 선택에 의해 보여주는 것이 가능했고, 칼슘, 마그네슘 또는 아연과 같은 2가의 양이 온, 특히 무기 염의 형태로 첨가시, 분사 과립동안 UF 농축물에 첨가는 특정 열부하 테스트 하에서 피타제의 열안정성 증가를 이끌었다. pH 조정에서 황산을 사용으로, 황산 칼슘의 침전이 있고, 그리하여 칼슘 농축물에서 감소는 pH 조정이 염산에 의해 수행된 UF 농축물과 비교된다.
실시예 8: 미분화된 대두로 코팅하고 그리고 코팅하지 않은 산 포스파타제를 함유한 과립물의 열안정성에 대한 글루시덱스 또는 탈지 분유의 효과.
본 실시예에서 산 포스파타제의 코팅된 분사 과립물의 열안정성에 대한 미분화된 대두의 코팅층의 효과와 비교된 효소의 분사 과립물에서 UF 농축물에 글루시덱스와 탈지 분유의 첨가의 효과를 테스트 하였다.
과립화
재조합 T. reesei 균주에 의해 생성된(실시예 6 참조), Aspergillus niger pH 2.5 산 포스파타제의 UF 농축물은 UF 농축물(30% 글루시덱스나 50% 탈지 분유[SMP])에 용해된 다른 첨가제들과 함께, ProCell5, Glatt에서 300 ㎛까지의 크기의 입자로 분사-과립화하였다. 분사 과립물에 사용된 용액의 pH 값은 각각 pH 4였다.
코팅
코팅은 실시예 1, 방법 A)에 따라 수행하였다. "미분화된 소자"의 적용된 양은 건조 질량을 기준의 10% (w/w)였다. 결과는 표 8에 나타내었다.
표 8: 산 포스파타제의 코팅되지 않은 그리고 코팅된 분사 과립물의 열안정성
온도 [℃] 활성 회복 [%] 코팅되지 않음 활성 회복 [%] 코팅됨
첨가 없음 30% 글루시덱스 50% SMP 첨가 없음 30% 글루시덱스 50% SMP
70 83.5 91.7 100.0 n.d. 93.8 100.0
75 76.5 87.8 96.0 n.d. 99.9 100.0
80 50.0 82.0 93.4 n.d. 95.9 96.6
85 25.1 57.4 64.8 n.d. 76.6 95.4
90 2.0 7.4 3.5 n.d. 13.6 13.9
n.d.: 정의되지 않음
표 8의 데이터 비교는 분사 과립화 전에 산 포스파타제의 UF 농축물에 글루시덱스 또는 탈지 분유의 첨가는 또한 펠렛화 실험에서 Aspergillus niger var. awamori의 산 포스파타제에 대한 안정화 효과를 갖는다는 것을 나타낸다. 분사 과립화 전에 효소의 UF 농축물에 탈지 분유의 첨가는 E. coli 피타제에 뿐만 아니라 산 포스파타제와 펠렛화 실험의 조건 하에서 효소의 열안정성에 관한 Aspergillus niger var. awamori 유래의 피타제에도 긍정적일 것이라는 것을 증명했다. 그러나, 모든 경우에서 분사 과립물에서 효소의 열안정성(활성 회복의 %로 표현됨)은 펠렛화 실험에서 "미분화된 소자"의 코팅층의 적용에 의해 추가로 증진될 수 있다. 효소를 포함하는 분사 과립물의 사용된 구성 또는 조성에 독립적으로, "미분화된 소자"의 적용은 전체 입자에서 효소의 열안정성 증가를 야기한다.
실시예 9: "미분화된 소자"로 코팅되거나 코팅되지 않은 글루시덱스 코어를 가진 엔도-1,4-β-글루카나제 과립물의 열안정성
본 실시예에서 Trichoderma reesei 유래의 효소 엔도-1,4-β-글루카나제 I의 열안정성은 "미분화된 소자"로 코팅한 후 글루시덱스 코어를 가진 과립물에서 측정하였다. 이 효소는 두개의 다른 효소 활성-엔도-1,4-β-글루카나제 및 동등하게 높 은 엔도-β-1,4-자일라나제를 나타낸다.
과립
재조합 T. reesei 균주에 의해 생성된(Karhunen et al., Mol Gen Genet 1993, 241:515-522), trichoderma reesei 엔도글루카나제 1 (엔도-1,4-β-글루카나제)의 UF 농축물은 STREA　1, Aeromatic Fielder에서 다른 분사 과립물을 생산하는데 사용하였다. 분사 과립물은 500 g 글루시덱스 12 코어 재료(Roquette, France) 상에 200 ㎖ UF 농축물의 분사 건조에 의해, 또는 건조 질량에 기준으로 글루시덱스 12 10%(w/w)를 글루시덱스 코어 상에 분사 건조하기 전에 추가적으로 용해한 200 ㎖ UF 농축물의 분사 건조에 의해 얻었다.
코팅
분사 건조에 의해 얻은 과립물은 "미분화된 소자"의 10% 현탁액의 적용에 의해 실시예 1, 방법 A)의 방법에 따라 코팅하였다. 코팅 재료의 양은 코팅된 과립물의 건조 질량을 기준으로 10%(w/w)였다.
과립물에 함유된 엔도글루카나제의 열안정성 증가는 실시예 2, 방법 B)에 기재된 방법에 따라 측정하였다.
도 4는 실험 기구(Laborstreamer)에 열 부하를 수행한 후 "미분화된 소자" 상에 10% 코팅층의 적용이 있고 그리고 적용이 없는 과립물들에서 엔도글루카나제 I의 활성 회복을 나타낸다. 열 부하 실험에서 Trichoderma reesei 유래의 엔도글루카나제 I의 얻어진 열안정성은 또한 분사 건조 전에 UF 농축물에 말토덱스트린의 첨가에 의존한다. 도 4는 효소-함유 과립물의 사용된 구성 또는 효소-함유 과립물 의 생산에서 UF 농축물에 첨가와 독립적으로, 코팅 방법에서 "미분화된 소자"의 적용은 실험 조건 하에서 코팅된 과립물에 함유된 효소의 열안정성의 증가를 이끌어낸다. 더욱이, 코팅층의 적용에 의해 얻어진 열안정성의 증진은 분사 건조에서 UF 농축물에 10% 글루시덱스 12의 첨가에 의해 얻어질 수 있는 것 보다 더 크다.
실시예 10: "미분화된 소자"로의 코팅을 가진 그리고 코팅을 가지지 않은 엔도-1,4-β-글루카나제의 열안정성
본 실시예에서 글루시덱스 코어가 없는 분사 과립물에서 엔도-1,4-β-글루카나제(엔도글루카나제 1)의 열안정성을 "미분화된 소자"로 코팅한 후 실험하였다.
과립화
재조합 T. reesei 균주(Karhunen et al., Mol Gen Genet 1993, 241:515-522)에 의해 생성된, Trichoderma reesei 엔도글루카나제 1의 UF 농축물에서, 건조 질량을 기준으로 20% 글루시덱스 12 (w/w)를 용해하였고 pH 값은 H2SO4/NaOH로 pH 4.5로 조정하였다. 이 농축물은 ProCell5, Glatt에 건조하여, 300 ㎛까지의 크기의 분사 과립물로 건조하였다(실시예 3, B 부 참조).
코팅
분사 과립물은 실시예 1, 방법 A)에 따라 코팅하였다. "미분화된 소자"의 적용된 층은 건조 질량을 기준으로 10%(w/w)였다. 실시예 1, 방법 A)에 따른 열 부하 후 활성 회복의 결과를 표 9에 나타내었다.
표 9: 글루시덱스 코어가 없이 생성된 과립물에서 코팅을 가진 그리고 코팅 을 가지지 않은 Trichoderma reesei 유래의 엔도글루카나제 I의 열안정성
온도 [℃] 활성 회복 [%] 코팅되지 않음 활성 회복 [%] 코팅됨
70 83.5 94.2
75 68.0 81.2
80 41.5 49.4
85 24.9 30.9
90 5.7 13.3
표 9의 데이타는 과립물에 둘러싸여진, Trichoderma reesei 유래의 엔도글루카나제 I의 열안정성은, "미분화된 소자"의 코팅에 의한 글루시덱스의 코어의 부재에서도 증진될 수 있음을 나타낸다. 탄수화물 재료의 코어는 "미분화된 소자"로 코팅에 의한 열안정성에서 증가에 대해 전제조건이 아니다.

Claims (20)

  1. 코어와 코팅층을 포함하는 증가된 열적 안정성을 가진 물질로, 상기 코어는 하나 이상의 생물학적 활성 단백질을 포함하고 상기 코팅층은 콩과 식물로부터 미분화된 생성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 물질.
  2. 제1항에 있어서, 콩과 식물로부터 미분화된 생성물이 미분화된 대두 생성물인 것을 특징으로 하는 물질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 코어는 추가로 말토덱스트린을 포함하는 것을 특징으로 하는 물질.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 코어는 추가로 탈지 분유를 포함하는 것을 특징으로 하는 물질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 활성 단백질은 효소인 것을 특징으로 하는 물질.
  6. 제5항에 있어서, 효소는 피타제, 엔도글루카나제, 자일라나제 또는 포스파타제로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 물질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 코팅층은 물질의 총 건조 질량을 기초로 2-50%(w/w)인 것을 특징으로 하는 물질.
  8. 제7항에 있어서, 코팅층은 2-30% (w/w)인 것을 특징으로 하는 물질.
  9. 제8항에 있어서, 코팅층은 5-25% (w/w)인 것을 특징으로 하는 물질.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른, 물질을 포함하거나 물질로 구성되는 것을 특징으로 하는 동물 사료.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른, 물질을 포함하거나 물질로 구성되는 것을 특징으로 하는 음식 조성물.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른, 물질을 포함하거나 물질로 구성되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 물질을 생성하는 방법으로, 콩과 식물로부터 미분화된 생성물을 포함하는 용액을 하나 이상의 생물학적 활성 단백질을 포함하는 코어에 적용하고, 그리고 얻어진 코팅된 입자를 건조하는 것을 특징으로 방법.
  14. 제13항에 있어서, 콩과 식물로부터 미분화된 생성물을 포함하는 용액의 적용및 건조는 유동층 건조기에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 콩과 식물로부터 미분화된 생성물은 미분화된 대두 생성물인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 과립화된 생성물의 생산을 위한 방법에서 생물학적 활성 단백질의 열적 안정성을 증가시키기 위한 콩과 식물로부터 미분화된 생성물의 용도.
  17. 동물 사료의 생산을 위한 방법에서 생물학적으로 활성 단백질의 열적 안정성을 증가시키기 위한 콩과 식물로부터 미분화된 생성물의 용도.
  18. 음식의 생성을 위한 방법에서 생물학적 활성 단백질의 열적 안정성을 증가시키기 위한 콩과 식물로부터 미분화된 생성물의 용도.
  19. 약제학적 조성물의 생산을 위한 방법에서 생물학적 활성 단백질의 열적 안정성을 증가시키기 위한 콩과 식물로부터 미분화된 생성물의 용도.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 콩과 식물로부터 미분화된 생성물은 미분화된 대두 생성물인 것을 특징으로 하는 용도.
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