CN101534801B - 热稳定性增加的含蛋白物质 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种热稳定性增加的含蛋白物质,包括核心和包被层,其特征在于所述核心包含至少一种生物活性蛋白而所述包被层包含来源于豆科植物的微粒化产品,还涉及一种生产这种物质的方法以及来源于豆科植物的微粒化产品在颗粒状产品的生产过程中增加生物活性蛋白的热稳定性的用途,以及在生产动物饲料、食品和药物的方法中的用途。
Description
本发明涉及一种热稳定性增加的含蛋白物质,包括具有至少一种生物活性蛋白的核心和含有一种豆科植物的微粒化产品的包被层。本发明还涉及一种生产热稳定性增加的含蛋白的物质的方法,以及一种豆科植物的微粒化产品在生产颗粒状和/或丸状产品的方法中增加生物活性蛋白的热稳定性的用途,并保持含蛋白物质的高生物活性。
生物活性蛋白,尤其是酶,通常以干燥颗粒状制剂的形式被使用。此种形式的含蛋白产品易于使用和给药。已知多种技术可用于生产这些颗粒状产品。例如,在流化床干燥器(流化床团粒机)中,颗粒散布在多孔载体上的气流中并形成团块,所述团块随后被任选地包覆并最终干燥。在混合团粒机如犁片桨式搅拌混合器中,团块或颗粒是通过粒子碰撞形成的,由此相应于剪切力形成致密或不致密的团块。这些团块随后可被干燥至某一个残余湿度。此外,也经常使用挤出或丸状的产品,其中将一种含有蛋白的糊状物压成微丸或将其在压力下压过一个小孔然后再切成颗粒,随后使所述微丸或颗粒干燥。在所有这些方法中,或多或少地使用了激烈的剪切力和温度条件。用于动物饲料生产领域中的蛋白——尤其是酶——在它们的生产过程中可能遭受这样的处理,因此所述蛋白或酶的功能可能被限制。因此,例如,将粉末状或颗粒状的酶加到动物饲料微丸的过程中,可能会由于与饲料中的抑制剂接触或由于动物饲料粒化过程的处理步骤的气流中温度和湿度增加而失活。
已经有实验来避免在这种制备方法中的失活,尤其是生物活性蛋白的热失活。例如,酶不是共价固定在较大的颗粒上(如得自木薯淀粉、西米淀粉、米淀粉、小麦淀粉、高粱淀粉或大麦淀粉的含淀粉颗粒;参见WO97/39116),而是用硅粒子(参见US 5,318,903;WO 94/26883)或植物粉末作为载体(参见US 4,106,991)。而且,用例如硫酸钠(参见WO 97/39116、WO 92/12645、WO 01/04279)降低了所述物质附近的水含量,和/或使用防水和防蒸汽屏障即包衣,在水含量增加的情况下保护生物敏感物质免受高温以及高温单独或者与水或水蒸汽结合所造成的影响(参见WO97/39116、US 6,610,519、WO 00/01793、WO 92/12645、WO 96/16151、 WO 01/04279)。另外,在酶颗粒中特别加入了优选地吸收热能和机械能的成分。WO 00/20569中公开了乳酸稳定植酸酶的用途。
对于酶的情况,还加入了酶稳定剂,如海藻糖和硫酸锌、玉米浸渍液、植酸和肌醇一磷酸酯(对于植酸酶的情况)。例如,WO 00/20569中公开了加入还含有植酸和肌醇磷酸的玉米浸渍液。US 5,972,669、US 5,827,709以及EP 0758018中具体地公开了加入具体的无机盐硫酸锌和硫酸镁。
WO 98/55599中公开了海藻糖、硫酸锌和聚乙二醇用于包衣的用途。
然而,这些方法的缺点是,大量加入例如硫酸锌(一种痕量元素)(>15%;参见US 5,827,709)不适用于所有动物的饲料配比。由疏水材料如蜡、脂肪等制成的包衣会降低所述酶的生物利用度,因为所述酶要很长时间才能在胃中释放,因此必须以高剂量给药才能显示效果,如可在约4小时的适时限制保留时间内对猪起作用。此外,这些组合物中的许多只特异性地针对某些酶如植酸酶优化甚至仅对这些酶有效。其他添加剂如高岭土、沸石和硅石是不能被生物降解的不可溶化合物,这极大地限制了它们的用途。喷雾到载体上或用可膨胀多聚糖吸收会限制蛋白的可用量和生产的产量,因为它会导致在喷雾过程中凝集。这样生产的酶颗粒中最大可获得的酶活性也受到载体与可用酶的比率的限制。
因此,需要一种方法来增加生物活性蛋白的热稳定性。具体地,需要增加用于生产具有确定颗粒大小和/或小颗粒大小的物质的方法——优选地用于生产例如丸状产品的方法——的生物活性蛋白的热稳定性。特别需要增加酶制备过程中的热稳定性,即在热负载后恢复所用酶的活性。所述生产方法可以容易和可靠地实施。此外,所述方法可得到对于人类和动物消耗无毒和无害的颗粒状产品。所述方法可广泛适用于任何结块产品、颗粒状产品和挤出产品,并可保证即使在高加工温度下应用由此生产的产品时,所述酶也具有足够的温度稳定性。而且,此方法所用的物质与所述生物活性蛋白不会发生其他负面相互作用。此外,所述方法是环保的,即所使用的物质可生物降解,并且不包括任何例如不环保的化学品或溶剂的再循环。所用的成分是被特别容许在动物饲料、食品和药物领域中使用的。通过包覆活性蛋白(特别是酶蛋白),还防止了所述活性蛋白与例如存在于矿物质预混料中的抑制性物质接触,并且生产出可稳定储存的混合物。
令人惊奇的是,已经发现通过将一层或数层豆科植物的微粒化产品应 用在含有生物活性蛋白的颗粒上或者通过包覆、覆盖、封装含有生物活性蛋白的核心,可大幅度增加这些生物活性蛋白的耐热性(热稳定性)而不以任何其他方式影响由此获得的包覆蛋白的活性。因此应用了由来源于豆科植物的微粒化产品获得的包被层,这样只有含蛋白颗粒的外层与豆科植物的微粒化产品接触。这使得可有效保护如此包覆的生物活性蛋白,抵御产品热负载的加工方法中温度的升高。所述包衣也用于例如以与作为抑制剂的物质的混合物储存时酶的保护。此外,所述方法允许在生产和使用的其他步骤中生产具有本发明的特性的高度浓缩的产品(酶产品)。
因此,本发明涉及一种热稳定性增加的包括核心和包被层的含蛋白试剂或物质,其特征在于所述核心包含至少一种生物活性蛋白而所述包被层包含一种来源于豆科植物的微粒化产品。此外,本发明还涉及一种生产这种含蛋白物质的方法,其中将含有来源于豆科植物的微粒化产品的悬浮液应用于包含至少一种生物活性蛋白的核心并且干燥由此获得的包覆颗粒。本发明还涉及一种豆科植物的微粒化产品用于——优选地在生产颗粒状产品的方法中——增加生物活性蛋白热稳定性的用途。
本发明的方法或本发明的用途优于现有技术中方法的优势是可形成微小的颗粒状颗粒,其最佳地保护所述酶抵御在高温和高湿度的变性条件。例如,用挤出法(WO 00/47060)或犁片桨式搅拌混合器(WO01/04279)生产的颗粒为约400-2000μm。本发明的颗粒可为100-300μm,并且因此它们非常适合于生产均质产品,尤其当所述颗粒显示高酶活性时。
本发明的方法或本发明的用途普遍适于增加热稳定性,尤其是酶制品的热稳定性,并且可适于用在如丸状动物饲料中;由于所述物质的高溶解性,所述酶也立即是生物有效的。使用的材料量少,这不同于现有技术的方法,因此能够生产高活性酶颗粒。
在本发明的制备包覆的含蛋白物质的方法中,将一种来源于豆科植物的微粒化产品——优选地为微粒化大豆产品——施用到包含至少一种生物蛋白的核心上。所述来源于豆科植物的微粒化产品可通过简单喷雾然后干燥来应用。然而,所述来源于豆科植物的微粒化产品也可被直接用于各个选定方法的一个步骤中,如流化床干燥器或平板喷雾干燥器中。
根据本发明,所述包被层包含一种豆科植物的微粒化产品或由其组成。根据本发明,这涉及含有脂肪、蛋白、淀粉和其他碳水化合物作为储存剂的微粒化的豆类植物(豆科)。其实例是豌豆、小扁豆、菜豆、花生、大豆、利马豆、鹰嘴豆、豇豆、羽扇豆的微粒化产品。优选地,所述来源于豆科植物的微粒化产品是一种微粒化的大豆产品。所述来源于豆科植物的微粒化产品本身可用于包覆生物活性蛋白,或者结合从技术上来讲必须的和合理的添加剂使用。这些可为,例如,用于调节pH值的酸和碱,和/或盐、缓冲物质等。可使用豆科植物果实的微粒化成分,例如去脂肪后的残渣。优选地使用各种豆科植物的完整果实的微粒化产品。因此可根据任何本身已知的微粒化方法来生产所述豆科植物的微粒化产品。微粒化是一个短时间高温加热过程。因此用几秒钟的脉冲将起始材料加热,但没有严重的失水。在此方面,用波长为1.8-3.4μm的红外脉冲进行微粒化尤其合适。
可能地,在调节到一个特定pH值之后,将所述豆科植物的微粒化产品可在水溶液中通过搅拌悬浮或用Ultraturrax匀浆。在生产过程中,这是通过在流水线中位于喷雾器嘴之前的匀浆器进行的,以避免悬浮液分相。如此获得的悬浮液可被喷雾到任何种类的颗粒上。所述颗粒可来自于,例如喷雾干燥过程、粒化过程、结块过程或挤出过程。然后可根据间歇法用单独的设备(如流化床干燥器、装备或未装备Wurster管的包衣机、ProCell设备等)施用所述包被层,或者也可在粒化或结块之后用例如平层喷雾干燥器或在最后干燥过程之前用后喷雾室之一中的ProCell设备连续地施用所述包被层。所有施用所述包被层的方法都需要对全部产品进行高度的最后干燥,这样获得如>90%的干质量,优选地>92%,更优选地>95%,最优选地>97%的干质量。所述来源于豆科植物的微粒化产品的施用量可以为所用的含蛋白颗粒干质量的2-50%(w/w)。
在本发明的实施方案中,在所述的包括核心和包被层的热稳定性增加的物质中,所述包被层优选为所述物质的总干质量的2-30%(w/w),更优选地为所述物质的总干质量的5-25%(w/w)。
所述豆科植物的微粒化产品优选地为一种微粒化的大豆产品,特别优选地为Micronizing Company(UK)Ltd.的下述产品“微粒化大豆(micronized soja)”。
实施例中用于施用包被层的微粒化大豆产品是用全脂肪大豆生产的。
一种示例性的可用于本发明目的的微粒化大豆产品是Micronizing Company(UK)Ltd.,Charnwood Mill,Framlingham,Suffolk,IP13 9PT(www.micronizing.com)的产品“微粒化大豆(micronized soja)”。此产品通过红外微粒化生产,其中使用波长为1.8-2.3μm的红外线。用于此产品的典型生产方法包括如下步骤:
-用红外线使预先纯化的产品在120℃下在振动式传送机上持续地沸腾,籍此水蒸汽的分压强烈地增加并且所述产品含有的成分如蛋白质、纤维素、半纤维素因此被消化。抗营养因子——它例如存在于大豆中——也因此失活并且所述材料作为动物饲料具有很高的营养价值。
-加热的产品被储存于一个容器中5-15分钟。
-然后用一个高性能的磨粉机将所述产品碾成薄片,随后冷却至室温。对于大豆和其他含油种子和作物,研磨过程导致油体的消化和所含油的释放。
-所述薄片被置于粉碎机中以获得全脂肪面粉。这样得到的待用颗粒的颗粒大小为直径小于1mm,优选地小于0.5mm,更优选地小于0.3mm。
很明显此方法或具有同样结果的相应方法也可用于其他豆科植物的微粒化。方法中的参数(如温度和时间)以及所述方法步骤的顺序可根据待微粒化的豆科植物的种类和数量而变化。这些变化在本领域专业人员的知识范围之内并可通过简单的常规实验确定。重要的是,在喷雾前通过微粒化甚至结合匀浆化得到的颗粒大小降低到直径小于1mm,优选地降低到直径小于0.5mm,甚至更优选地降低到直径小于0.3mm。
所述来源于豆科植物的微粒化产品的使用量的范围是达到含有所述生物活性蛋白和所述来源于豆科植物的微粒化产品的颗粒的干质量的50%(w/w),优选2-50%(w/w),更优选5-35%,最优选7-25%。因此,所述来源于豆科植物的微粒化产品本身可以水溶液的形式使用,或者被匀浆化,并由此以比纯粹的悬浮液更精细的崩解物的形式使用。优选地用水来生产所述悬浮液,并且可在施用前用缓冲物质和/或碱或酸将其调节至特定的pH值,或者可加入其他物质如盐以提高所述豆科植物的微粒化产品的效果。
根据本发明,来源于豆科植物的微粒化产品组成的包被层被施用于其 上的核心包含至少一种生物活性蛋白,任选地结合从技术上来讲必需和合理的物质。它还可能包含数种生物活性蛋白的结合物,任选地结合从技术上来讲必需和合理的物质。所述生物活性蛋白优选地为热不稳定的。所述生物活性蛋白优选地为一种酶。所述核心也可能只由所述生物活性蛋白构成。
此酶优选地选自植酸酶、磷酸酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、漆酶、磷脂酶、内切葡聚糖酶(尤其是内切-β-1,4-葡聚糖酶、内切-β-1,3(4)-葡聚糖酶、内切-1,2-β-葡聚糖酶和内切-1,3-α-半乳糖苷酶)、纤维素酶、木糖苷酶、半乳聚糖酶(尤其是阿拉伯半乳聚糖-内切-1,4-β-半乳糖苷酶和阿拉伯半乳聚糖-内切-1,3-β-半乳糖苷酶)、果胶降解酶(尤其是果胶酶、果胶酯酶、果胶裂合酶、多聚半乳糖醛酸酶、阿拉伯糖酶、鼠李半乳糖醛酸酶(rhamnogalacturonase)、半乳糖醛酸鼠李聚糖乙酰酯酶、半乳糖醛酸鼠李聚糖-α-鼠李糖苷酶、果胶裂解酶和α-葡糖苷酸酶)、甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、甘露聚糖乙酰酯酶、木聚糖乙酰酯酶、蛋白酶、其他木聚糖酶、阿拉伯木聚糖酶、脂肪分解酶(如脂肪酶、二半乳糖苷酶甘油二酯酶和角质酶),以及其他酶如漆酶和转谷氨酰胺酶。所述酶特别优选地选自植酸酶、内切葡聚糖酶、木聚糖酶或磷酸酶。
所述包含至少一种生物活性蛋白的核心还可包含载体物质和添加剂,例如部分水解的淀粉产物(如玉米淀粉、小麦淀粉等)、含蛋白的物质(如脱脂奶粉、干酪素水解物、酵母水解物或自溶物)、其他植物成分(如纤维素、半纤维素或含木质素的成分和细胞提取物)、有机盐和无机盐(如丙酸钙、柠檬酸或柠檬酸盐),以及用于调节pH值的缓冲物质、酸和碱。
通过施用本发明的豆科植物微粒化产品的包被层,如此包覆的生物活性蛋白可获得更高的温度稳定性(热稳定性)。通过所获得的增加的热稳定性,所述生物活性蛋白在该蛋白通常会发生部分或全部失活的条件下仍保持活性。蛋白获得的增加的热稳定性允许它们在原本会导致所述生物活性蛋白失活的热条件下被进一步加工,以及相应的更长的储存时间或在更高的温度下储存。所述包被层也可防止所述蛋白在进一步加工或储存过程中与其他对被包覆蛋白有抑制作用的物质接触。
对于所获得的本发明增加的热稳定性来说,包含至少一种生物活性蛋白的核心被豆科植物微粒化产品包被层完全包覆是很重要的。这种含有生 物活性蛋白的起始物质的包覆包被层通常要通过施用所述包被层时仔细的加工操作而获得。由于处于微粒化状态,可想象到所述豆科植物微粒化产品会包围尤其是完全包围起始物质。使用前述量范围内的豆科植物微粒化产品也可促成对所述起始材料的优选完全包覆。基于所述含蛋白物质的质量,含蛋白物质的颗粒越小,豆科植物微粒化产品的使用量就越高。这是由体积和表面积的比导致的。以体积为基准,较小颗粒的表面积比较大颗粒的表面积要大。
由于所述豆科植物微粒化产品包被层使热稳定性增加,如此预处理的起始材料尤其适于应用在使用小粒径试剂的方法中,特别是对于颗粒产品的生产。具体而言,动物饲料经常以微粒状态使用。因为温度增加通常发生在微粒化条件下,本发明的方法或本发明的用途提供了制备具有所用蛋白分别具有的最大生物活性的微粒动物饲料产品的可能性。
本发明包覆的含蛋白物质或颗粒可本身或以加工形式被加入,以用于另外的用途。例如,它们可加入到动物饲料、食品或药物中。相应的方法和用途为本领域技术人员所熟知。
附图更详细地解释了本发明:
图1显示了一个蒸汽发生器(蒸锅;实验仪器)的结构图:
图2显示了饲料/酶样品在蒸汽发生器中一个典型的温度曲线,其中条件对应于方法A的80℃的条件(见下)。
图3显示了用各种酸调节pH值后,所述包被层对酸性磷酸酶热稳定性的影响。
图4显示了在应用于Glucidex麦芽糊精核心之前添加和不添加Glucidex麦芽糊精,以及随后用10%(w/w)干质量的微粒化大豆包覆的内切葡聚糖酶颗粒中,用实验室蒸锅进行热负载后的活性恢复。
以下实施例更详细地解释了本发明。
实施例
参考实施例1:植酸酶活性的测定
在一种含有0.5%(w/w)植酸(约5mM)、200mM柠檬酸钠、pH 5.0的试验混合物中测量植酸酶活性。在37℃下培养15分钟之后,通过加 入等体积的15%(v/v)的三氯乙酸使反应停止。将100μl所述试验混合物与900μl H2O和1ml 0.6M H2SO4、2%(w/w)抗坏血酸和0.5%(w/v)钼酸铵混合,在50℃下培养20分钟后,在820nm定量测定释放的磷酸盐离子。因此磷酸钾的标准溶液被用作基准。
参考实施例2:酸性磷酸酶活性的测定
酸性磷酸酶活性的测定与参考实施例1中植酸酶的测定类似,不同在于底物溶液是溶于250mM甘氨酸/HCl缓冲液中的10mM α-甘油磷酸酯,pH 2.5。
参考实施例3:内切-β-1,4-葡聚糖酶活性的测定
β-葡聚糖酶使溶解的大麦葡聚糖中的糖苷键水解。所释放的还原糖与DNA试剂反应生成一种有色复合物,其含量用光度测定法在540nm测定。
1单位的β-葡聚糖酶活性被定义为在规定条件下每分钟释放1μmol能还原葡萄糖的糖等价物所需的酶量。所述酶反应在pH 5.5和40℃下进行。
DNS试剂:
将10g颗粒状NaOH和200g酒石酸钠溶解在800ml去离子水中。加入10g 3,5二硝基水杨酸甲酯(DNS)后,在30-40℃搅拌1小时再补加至1L。
大麦-葡聚糖底物溶液:
将1g大麦葡聚糖(Megazyme#P-BGBM)悬浮在60-70ml去离子水中,然后加热至80-85℃并伴随搅拌直至这些葡聚糖溶解。随后,将溶液伴随搅拌冷却至室温。添加10ml缓冲液后,pH为5.5,再补加至100ml。
为测定所述β-葡聚糖酶的活性,将一组0.9ml底物溶液和0.1ml稀释的酶溶液在40℃下培育15分钟。加入1.5mL DNS试剂后,该组被置于沸腾的水浴中加热20分钟然后冷却至室温。加入2ml去离子水后,用光度计在540nm测定光密度。所述测定是用水代替酶溶液作为空白进行的。β-葡聚糖酶活性的测定是通过葡萄糖校准曲线进行的。
实施例1:施用包被层
两种优选的实施方式如下描述,根据所述实施方式可施用一种微粒化大豆产品的包被层。因此使用了上面提到的Micronizing Company(UK)的产品“微粒化大豆”。实施例3-10列举了这些方法的变型。
所述包被层可在下列方法变型中施用:
方法A:在Aeromatic-Fielder AG,Bubendorf,Switzerland公司的Strea-1型流化床干燥器(Aerocoater)上施用所述包被层。
在此方法中,包含微粒化大豆产品的包被层通过特定的流化床干燥器被施用于包含生物活性蛋白的颗粒。所述颗粒是一种用本身已知的方法生产的蛋白颗粒。
空气压缩机产生干燥、不含脂肪的压缩至6bar(600kPa)的空气。Strea-1型流化床干燥器可加工的含蛋白颗粒的一般装填容量可根据标准方法确定。所述包覆实验在带有底部喷雾装置(Aerocater)的Strea-1型干燥器上进行。一般装填容量在50-300g颗粒的范围内。通过一根1.2mm的喷雾喷嘴引入压力为0.6bar(60kPa)的缓和压缩的空气,所述喷嘴被安装于底部气体分配板的中央。该气体分配板被修改以使>95%的气流进入中央,且剩余的5%完全流入该容器的边缘区域以避免潮湿的颗粒与器壁接触。短的沃斯特管(wurster pipe)被用于大部分包覆实验并被安装于所述配气板上方的0.8cm处。在某些实验中,维持所述颗粒在沃斯特管中的流动很困难,因此所述包覆在无此管的情况下进行。一般含有悬浮或均匀的“微粒化大豆”的包覆液体的流速为1-6ml/min。用于喷雾的悬浮液是一种干质量在5-25%之间的“微粒化大豆”的水悬浮液,其在喷雾前不久通过匀浆器进行匀浆。在一个带有底部喷雾装置的实施方式中,为避免喷嘴堵塞,喷雾过程中空气入口的温度不应超过60℃。当施用完整的“微粒化”大豆时,所述空气进口的温度会增加到80-95℃,用于使包覆的颗粒干燥,使最终的水含量为5-10%。如此获得的颗粒可直接使用或再加工。
方法B:在Glatt Systemtechnik GmbH,Dresden,Germany公司的GPCG1型流化床干燥器中施用所述包被层。
在此方法中,包含微粒化大豆产品的包被层在特定的流化床干燥器中 被施用于包含生物活性蛋白的颗粒。所述颗粒为使用一种本身已知的方法生产的蛋白颗粒。
通过使用例如APV Anhydro AS,Denmark公司的SBD 76型喷雾制粒机的工业方法获得的的更大量的颗粒,在GPCG1,Glatt中以顶部喷雾方法或底部喷雾方法被包覆。在每个实验中,在GPCG1中放入大约500g蛋白颗粒。包覆条件如下:
顶部喷雾包覆
制粒温度:40-43℃
空气温度:55℃
底部喷雾包覆
制粒温度:38-40℃
空气温度:55℃
“微粒化大豆”在水中搅拌成10%(w/w)的悬浮液并在喷雾前通过一个线上的匀浆机被匀浆。
调节均质微粒化大豆悬浮液的喷雾速率,从而使得颗粒不发生凝结,并且因此,使用的颗粒的颗粒大小由于包被层仅发生微不足道的变化。所述悬浮液典型的喷雾速率约5-15ml min-1。一个双注喷嘴被用来加入和施用10%(w/w)的微粒化大豆悬浮液。
包被层通常是所用颗粒的干质量的10%(w/w);然而,也可介于5和30%(w/w)之间。
实施例2:进行热负载试验
被“微粒化大豆”包覆的产品中所含的蛋白,尤其是酶,可根据以下方法试验它们的热稳定性。被包覆的产品因此根据下述方法之一进行热负载。这些方法示例性地涉及对含酶颗粒的热稳定性进行的试验。含有其他生物活性蛋白的颗粒的热稳定性可被类似地试验。
在以下方法中被添加到所产生的终产品中的酶活性可通过一种测量方法确定,该试验方法专门用于待测试的试验热负载前后的酶(见参考实施例1-3)。在热负载后恢复的酶活性以恢复百分数的形式表示为所用酶的活性的百分比。进行热负载以说明和比较包覆的和未包覆的材料中包被层的功效。
方法A:在一家中试制粒厂中试验所述热稳定性(在丹麦科灵的食品和分子生物技术研究所的生物技术研究所内进行;所述试验也可在其他相应的制粒厂内进行)。
将根据实施例1的方法A)或者B)生产的含有真菌或者细菌植酸酶,酸性磷酸酶或者内切葡聚糖酶的包覆的或者未包覆的颗粒与550型小麦粉预混合以获得300g含酶预混料。将此预混料与15kg动物饲料在丹麦科灵食品和分子生物技术研究所的生物技术研究所内混合,以保证该预混料在285kg动物饲料中最佳的混合稀释度以及在粒化材料中可准确测定的酶活性。在大多数试验中包覆颗粒的用量为0.1-10g/kg动物饲料,取决于包覆的材料中所含的酶的活性高度,并因此导致植酸酶的酶活性大约为5单位(U)/g动物饲料,或者酸性磷酸酶的酶活性大约为6单位(U)g-1 或者内切葡聚糖酶的酶活性大约为230-270单位(U)g-1。在制粒厂中处理的300kg动物饲料成分如表1所示。
表1:待制粒的动物饲料的成分
成分 | [%] |
Hipro大豆48 | 20 |
豆油 | 4.75 |
维生素/矿物质,βAavitren 90 | 0.25 |
酶预混剂* | 300g |
小麦 | 加至100 |
*与真菌或细菌植酸酶、酸性磷酸酶或者内切葡聚糖酶混合
制粒条件如下:
700L容量的卧式搅拌机,48rpm(0.8赫兹);混合量为80-300kg。
水平螺旋输送机连接在搅拌机上以清空搅拌机,其传送速度按照下列步骤调节。
所述搅拌机是长度为130cm,直径为30cm,155rpm和37室的Kahl阶式搅拌机(调节器)。生产能力为300kg/小时。将本发明的饲料和含酶颗粒与湿蒸汽接触约30s。(涉及蒸汽和温度的条件见表2)。
Dan Stoker高压锅炉产生的蒸汽流经压力调节阀进入过压为2bar (200kPa)的阶式搅拌机。所述调节阀控制流入阶式搅拌机的蒸汽量从而加热其中的含酶饲料。
经调整处理的物质经过Simon Heesen压力机(Press)粒化,随后在多孔盒中以1,500m3/h的流速进行空气冷却。制粒压力机在7.5kW的输入功率下以500rpm(8.33赫兹)运行,由此生产出3x 20mm的颗粒。
表2:在丹麦科灵食品和分子生物技术研究所的生物技术研究所的工厂中,为在使含有本发明颗粒动物饲料制粒时获得不同的温度而具有的蒸汽条件
设定温度[℃] | 蒸汽[%] | 实际温度[℃] |
70 | 3.6 | 69.8-70.0 |
75 | 3.9 | 74.8-74.9 |
80 | 4.3 | 79.7-79.9 |
85 | 4.6 | 84.7-84.8 |
90 | 5.0 | 89.8-90.0 |
95 | 5.4 | 94.9-95.1 |
对包被层颗粒的热稳定性进行试验的热负载也可在其他工厂中相应地进行。接下来,根据参考实施例1-3确定粒化动物饲料中包覆的和未包覆的颗粒中剩余的酶活性。
方法B:在实验室设备-实验室蒸锅上进行热负载试验
在密闭的容器内进行的热负载试验,简称热稳定性试验至多是储存稳定性增加的指示,因为它们以加速的储存试验进行。但是,为了试验在饲料制粒条件下增强的热稳定性,建立了一种实验室方法,其可以可靠地确定加入饲料中的酶的热稳定性以及在饲料研磨机中的条件(见方法A)下的负载。已发现,当含酶饲料遭受温度和湿度的增加时,即发生在蒸汽调节饲料期间的条件下,大部分酶会失活。为测定这种失活的程度,在一个实验室规模的设备中用蒸汽加热动物饲料中的酶颗粒。所述方法被控制在一个限定的温度(75-85℃)。进行这种试验的设备示于图1,由一个黄铜容器和一个多孔插入物组成,饲料在所述插入物上被引入,所述设备还具有一个将蒸汽引入饲料的机械装置。蒸汽从一个常规的蒸汽发生器 (Euroflex)中释放,压力为4.7bar(470kPa)。进入所述容器的蒸汽量由两个控制阀门调节,其也调节由所述插入物下面的容器部分除去的冷凝水和饲料。重要地,蒸汽管不含冷凝水并且在连接到所述黄铜容器之前就已经达到操作温度。
将待试验的饲料(50-100g,通常为50g,成分见表1)装入所述容器中,所述饲料包含本发明的含酶颗粒,并将蒸汽引入所述容器中。所述样品用一个末端具有热电偶的长柄搅拌,或者将热电偶作为探针单独引入动物饲料中。通过将所述探针与数据记录器(DrDAQ,company Pico Technology,UK)连接,从而在测量信号A/D转换后用个人电脑连续地记录饲料样品的温度。
当获得所需温度(通常为80或85℃)时,将温度保持30-60秒,然后将饲料从容器中取出并在一个扁平塑料容器中冷却。这些试验在80℃的典型温度曲线示于图2中(在对应于方法A中80℃条件下的蒸汽中的饲料/酶样品的温度曲线)。所获得的最大温度和在此温度下保持的时长可通过开关阀门和/或调节蒸汽的分配量来控制。
热负载实验常常在实验仪器以至少两次的测量进行。温度曲线下的面积被积分以确定重复样品是否经历了同样的总热负载。然而,在80或85℃的限定温度下的暴露时间是很重要的。混合物中包覆的和未包覆的颗粒中剩余的酶活性根据参考实施例1-3测定。
实施例3:丝状真菌的植酸酶的温度稳定性
A部分
由重组里氏木霉(Trichoderma Reesei)菌株按照例如WO 94/03612生产的黑曲霉变种泡盛曲霉(Aspergillus niger var.awamori)的植酸酶的UF浓缩物在APV喷雾制粒机中被干燥,所述UF浓缩物中溶解有不同的添加剂(参见实施例1,方法B),然后根据实施例1,方法B的方法被包覆。以顶部喷雾法包覆的颗粒含有的柠檬酸为所述UF浓缩物干质量的15%(w/w),且其pH值被调节到pH 3。用底部喷雾法包覆的颗粒还含有10%(w/w)的麦芽糖糊精,其在干燥前溶解于UF浓缩物。所有以此方法调节的UF浓缩物都被注入APV干燥器中,喷雾压力为80-180bar(8000至18000kPa)。由此产生的颗粒的颗粒大小介于200-300μm之间。进行 热负载试验(简称热稳定性试验)根据实施例2,方法A进行。结果示于表3中。
表3:被10%(w/w)“微粒化大豆”包覆的颗粒中曲霉(Aspergillus)植酸酶热稳定性增加。在喷雾制粒之前,使用柠檬酸来调节UF浓缩物的pH值。
通过马尔文(Marvern)设备上的激光衍射测量,所有未包覆的和包覆的产品的颗粒大小都在200-300μm之间。表3中的结果显示封闭在被包覆颗粒中的酶在制粒过程中的热负载下热稳定性的增加与UF滤液中选定的添加剂无关。另外,同样影响所形成的喷雾颗粒(具有酶活性的颗粒)的大小和形状的喷雾压力对在制粒过程中待观察到的封闭于被包覆颗粒中的酶的热稳定性的增加没有影响。本发明的颗粒(粒料)可由顶部喷雾法及底部喷雾法生产,其中被封闭的酶在热负载下的失活程度较未处理的颗粒要低。
B部分
向A部分的UF浓缩物中加入干质量的50%(w/w)的脱脂奶粉(30%乳糖),并加入柠檬酸钠将pH值调节至pH 5.1,之后将UF浓缩物在ProCell5,Glatt中干燥以喷雾制造无核心的颗粒。该过程如下发生,将上面提到的干质量约为15-20%的溶液在顶部喷雾法中相对用ProCell5中通过两注喷嘴的气流以超过间歇法的6-25g/min的速率进行喷雾。加入的空气的温度为70-95℃,喷雾时所加入的空气的量为90-100m3/h,从而使 产品温度保持在50℃。当全部溶液都被喷雾时,加入的空气的温度增加到最大为100℃并持续5分钟,从而产品温度不超过55℃以在所得到的颗粒中获得所需的>95%的干质量。在间歇法中,大约2L的上面提到的溶液被加工以喷雾制粒。所述喷雾制粒的颗粒大小为300μm以下。这样获得的喷雾颗粒用10%(w/w)的“微粒化大豆”均匀悬浮液根据实施例1的方法A包覆,从而使包被层的量为所述喷雾颗粒干质量的10%(w/w)。根据实施例2,方法A进行热负载试验(热稳定性试验)。活性恢复的结果示于表4。
表4:用10%(w/w)“微粒化大豆”包覆的颗粒中的曲霉植酸酶热稳定性增加,其中在进行喷雾制粒之前将脱脂奶粉溶解在UF浓缩物中。
表4的结果显示干燥过程中除柠檬酸以外的其他添加到曲霉植酸酶中的添加物也有利于酶的稳定性,特别是脱脂奶粉的添加。然而,通过使用“微粒化大豆”包被层,在A部分和B部分中封闭的酶的热稳定性都获得了进一步提高,而这与被包覆的含酶喷雾颗粒的成分无关。
实施例4:微粒化大豆的包覆程度对丝状真菌植酸酶的热稳定性的作用
在水中生产10%的“微粒化大豆”悬浮液,因为其在实施例3中也用于包覆。不溶的成分通过离心被分离。如此形成的水溶性片段被用于一个实验以检查封闭的植酸酶在热负载试验中热稳定性的增加是否是由“微粒化大豆”中所含的植酸(植酸酶的底物)所导致的。等分的量由于对在 包覆中获得10%w/w的“微粒化大豆”的包被层是必需的而被使用。使用ROAL OY公司销售的商品 其是由实施例3中的UF浓缩物产出的。
表5显示了“微粒化大豆”的水相提取物在热负载试验中对颗粒中包含的酶的热稳定性的作用。
表5:
如可从实施例1和2的比较中理解的,具有大豆水相提取物的包被层在制粒过程中对喷雾颗粒中的酶没有稳定作用。大豆面粉富含植酸酶的底物——植酸。据说,植酸对植酸酶具有稳定作用(WO 98/55599)。本实验表明,可能在制粒过程的热负载下显现出的在实施例3中获得的热稳定性的增加不能归结于此作用。因此,可能在包覆时发生的植酸渗透到所述颗粒的边缘层的现象也不足以解释在制粒过程的条件下观察到的热稳定性的增加。
实施例5:在具有Glucidex核心的喷雾颗粒上用“微粒化大豆”对细菌(E.coli)植酸酶的包覆
在本实施例中,含有细菌(E.coli)植酸酶的具有Glucidex核心的喷雾颗粒被微粒化大豆包覆。
制粒
将800g Glucidex 12(法国Roquette公司的玉米淀粉水解物,含有1%的葡萄糖、2%的二糖和97%的更高级的多糖)置于STREA 1(Aeromatic Fielder)中,然后用由重组里氏木霉(WO 2006/042719)菌株产生的E.Coli植酸酶的500g UF浓缩物(pH 2.5,以硫酸调节)喷雾。
包覆
然后所述喷雾颗粒根据实施例1方法A的方法被包覆(干质量5%(w/w)的“微粒化大豆”),并且根据实施例2方法A的方法测试所述喷雾颗粒中植酸酶的热稳定性。结果示于表6。
表6:喷雾制成的具有Glucidex 12核心的颗粒用“微粒化大豆”包覆后E.Coli植酸酶的热稳定性增加
表6的数据表明,含酶喷雾颗粒中的E.Coli植酸酶在实施例2方法A的试验条件下的热稳定性通过使用所述喷雾颗粒干质量5%(w/w)的“微粒化大豆”包被层而增加。
实施例6:含有细菌(E.coli)植酸酶的无核心的喷雾颗粒的包覆
本实施例显示了通过使用“微粒化大豆”包被层,无核心喷雾颗粒中细菌植酸酶热稳定性的增加。
制粒
在另一实验中,2kg的E.Coli植酸酶UF浓缩物在(见实施例5)ProCell 5,Glatt中被用于产生无核心的喷雾颗粒(见实施例3,B部分)。向所述UF浓缩物中加入基于UF浓缩物总蛋白30%(w/w)的脱脂奶粉(含30%乳糖)和4.4g丙酸钙。用硫酸或氢氧化钠溶液将pH值调节到pH 5。
包覆
随后所述喷雾颗粒根据实施例1方法A的方法被包覆(干质量10%(w/w)的“微粒化大豆”),并且根据实施例2方法A的方法进行热负载,然后测量所述喷雾颗粒中植酸酶的热稳定性。结果示于表7。
表7:无Glucidex核心的喷雾颗粒中E.coli植酸酶的热稳定性
如结果所示,这些被“微粒化大豆”包覆的喷雾颗粒所含的植酸酶的热稳定性在制粒实验的条件下有所增加。
实施例5和实施例6中未包覆和包覆的喷雾颗粒的数据的比较表明,热稳定性增加不是因为Glucidex核心,而是通过使用“微粒化大豆”包被层而获得的。实施例5和6的未包覆颗粒的活性恢复显示了在选定的实验条件下所述酶的热稳定性的不同分布;然而,所述结果处于相似水平上,每次都远低于用“微粒化大豆”包覆所获得的结果。无法证明在例如WO98/54980和WO 00/24877中所假定的由核心产生的影响。WO 98/54980特别地将热负载中获得的酶的稳定作用归因于酶溶液在碳水聚合物中的吸收和随后的干燥,如在动物饲料的制粒条件下发生的。此稳定作用不能在本发明中的将酶溶液喷雾——而非吸收——在碳水聚合物上的条件下获得。
本实施例的结果还表明,所述作用不限于特定种类的植酸酶,尽管在实施例3和6中使用了植酸酶。在实施例3中使用了丝状真菌的植酸酶,在实施例6中使用了细菌来源的植酸酶,然而它们在氨基酸水平上只显示出18%的同源性,因此被认为是两种完全无关的蛋白。
实施例7:含丝状真菌的酸性磷酸酶的颗粒的包覆
在本实施例中通过用“微粒化大豆”对颗粒进行包覆检测了丝状真菌酸性磷酸酶热稳定性的增加。
制粒
由重组里氏木霉菌株根据例如WO 94/03612产生的200ml pH 2.5的黑曲霉酸性磷酸酶UF浓缩物在用HCl或H2SO4将pH值调整至pH4后,在STREA 1(Aeromatic Fielder)中喷雾干燥于500g Glucidex 12上。用硫酸调整pH值时沉淀出来的CaSO4在喷雾制粒之前通过离心分离。
包覆
根据实施例1方法A的方法,用不同量的“微粒化大豆”对所述喷雾颗粒进行包覆。热负载根据实施例2方法B所述的方法在85℃下对喷雾颗粒中酸性磷酸酶进行60秒,并通过测量之后残存的活性来测定热稳定性。结果示于图3。
图3所示的结果表明,在实施例2方法B的制粒过程的条件下,包覆的喷雾颗粒中所获得的酸性磷酸酶热稳定性增加与使用的微粒化大豆的量直接相关。
此外,通过酸的选择还可能表明,被喷雾制粒的UF浓缩物中游离钙的量对所述酶的热稳定性没有影响,这与植酸酶相反,植酸酶是一种与酸性磷酸酶密切相关的酶,如在WO 97/05245、US 5,972,669、US 5,827,709以及EP 0,758,018中所示的酶,其中在喷雾制粒过程中向UF浓缩物中添加二价阳离子如钙、镁或锌,尤其以无机盐形式进行添加,会导致在某些热负载试验中植酸酶热稳定性的增加。使用硫酸调整pH会产生硫酸钙沉淀,因此,与使用盐酸调整pH值的UF浓缩物相比,钙浓度降低。
实施例8:Glucidex或脱脂奶粉对用具有和不具有微粒化大豆包覆层的含酸性磷酸酶颗粒的热稳定性的影响
在本实施例中,试验了向酶的喷雾制粒UF浓缩物中添加Glucidex和脱脂奶粉的影响与微粒化大豆包被层相比对包覆的酸性磷酸酶喷雾颗粒的热稳定性的作用的比较。
制粒
由重组里氏木霉菌株产生的pH2.5的黑曲霉酸性磷酸酶的UF浓缩物(见实施例6),在ProCell5,Glatt中被喷雾制粒成大至300μm的颗粒,其中有不同的添加物溶解在UF浓缩物中(30%Glucidex或50%脱脂奶粉[SMP])(见实施例3B部分)。每种用于喷雾制粒的溶液的pH值都为pH 4。
包覆
根据实施例1方法A进行包覆。“微粒化大豆”的用量以干质量计为10%(w/w)。结果示于表8中。
表8:未包覆和包覆的喷雾颗粒的酸性磷酸酶热稳定性
n.d.:未确定的
比较表8的数据表明,在制粒试验中,喷雾制粒前向酸性磷酸酶的UF浓缩物中添加Glucidex或脱脂奶粉对黑曲霉变种泡盛曲霉的酸性磷酸酶也具有稳定作用。关于在制粒实验中酶的热稳定性,在喷雾制粒前在酶的UF浓缩物中添加脱脂奶粉被证明不仅对E.Coli植酸酶而且对酸性磷酸酶和黑曲霉变种泡盛曲霉的植酸酶也是有利的。然而,在所有情况下,喷雾颗粒中的酶的热稳定性(表示为活性恢复%)都可通过在制粒试验中使用“微粒化大豆”包被层被进一步加强。与含酶喷雾颗粒所用的构造或成分无关,“微粒化大豆”的使用导致整个颗粒的酶的热稳定性增加。
实施例9:具有和不具有“微粒化大豆”包被层的具有Glucidex核 心的内切-1,4-β-葡聚糖酶颗粒的热稳定性
在本实施例中,在用“微粒化大豆”包覆后的具有Glucidex核心的颗粒中测定了来源于里氏木霉的酶——内切-1,4-β-葡聚糖酶I的热稳定性。此酶表现了两种不同的酶活性,即内切-1,4-β-葡聚糖酶活性和一个同样高的内切-β-1,4-木聚糖酶活性。
制粒
使用由重组里氏木霉菌株(Karhunen et al.,Mol Gen Genet 1993,241:515-522)产生的里氏木霉内切葡聚糖酶1(内切-1,4-β-葡聚糖酶)的UF浓缩物,以在STREA 1(Aeromatic Fielder)中生产不同的喷雾颗粒。喷雾颗粒通过在500g Glucidex 12(Roquette,France)核心材料上喷雾干燥200ml UF浓缩物获得,或者通过在喷雾干燥到Glucidex核心之前喷雾干燥额外溶解有以干质量计为10%(w/w)的Glucidex 12的200mlUF浓缩物而获得。
包覆
通过喷雾干燥获得的颗粒根据实施例1方法A的方法使用10%的“微粒化大豆”悬浮液进行包覆。包覆材料的量基于包覆颗粒的干质量为10%(w/w)。
根据实施例2方法B所述方法确定颗粒中所含的内切葡聚糖酶的热稳定性增加。
图4显示在实验室设备(实验室蒸锅)中进行热负载后,在使用和没使用10%“微粒化大豆”包被层的颗粒中内切葡聚糖酶I的活性恢复。在热负载试验中,由里氏木霉获得的内切葡聚糖酶I的热稳定性还与喷雾干燥前向UF浓缩物中添加麦芽糊精有关。图4表明,除了含酶颗粒所用构造或者生产含酶颗粒时向UF浓缩物中加入的添加物以外,在包覆方法中使用“微粒化大豆”导致实验条件下包覆的颗粒所含的酶的热稳定性增加。而且,通过使用包被层获得的热稳定性的增加比在喷雾干燥中通过向UF浓缩物中添加10%的Glucidex 12而获得的热稳定性的增加要大。
实施例10:具有和不具有“微粒化大豆”包被层的内切-1,4-β-葡聚糖酶的热稳定性
在本实施例中,无Glucidex核心的喷雾颗粒中的内切-1,4-β-葡聚糖 酶(内切葡聚糖酶I)的热稳定性在用“微粒化大豆”包覆后被检测。
制粒
在由重组里氏木霉菌株(Karhunen et al.,Mol Gen Genet 1993,241:515-522)产生的里氏木霉内切葡聚糖酶I的UF浓缩物中,以干质量计为的20%的Glucidex 12(w/w)被溶解且用H2SO4/NaOH将pH调节到pH 4.5。所述浓缩物在ProCell5,Glatt中干燥,以喷雾制成尺寸最高达300μm的颗粒(见实施例3,B部分)。
包覆
所述喷雾颗粒根据实施例1方法A被包覆。使用的“微粒化大豆”层以干质量计为10%(w/w)。进行实施例1方法A的热负载后的活性恢复的结果示于表9中。
表9:无Glucidex核的具有和不具有包被层的颗粒中来源于里氏木霉的内切葡聚糖酶I的热稳定性
表9的数据表明被封闭在颗粒中的来源于里氏木霉的内切葡聚糖酶I的热稳定性在缺少Glucidex核心时也可通过用“微粒化大豆”包覆而改善。碳水化合物材料的核心并不是使用“微粒化大豆”包被层使热稳定性增加的先决条件。
Claims (19)
1.一种热稳定性增加的颗粒,包括核心和包被层,其特征在于所述核心包含至少一种生物活性蛋白而所述包被层包含一种来源于豆科植物的微粒化产品,其中所述生物活性蛋白是一种酶,所述来源于豆科植物的微粒化产品来自含有脂肪、蛋白、淀粉和其他碳水化合物作为储存剂的微粒化的豆类植物,所述包被层为所述颗粒的总干质量的2-50%(w/w)。
2.根据权利要求1的颗粒,其特征在于所述来源于豆科植物的微粒化产品为来自豌豆、小扁豆、菜豆、花生、大豆、利马豆、鹰嘴豆、豇豆或羽扇豆的微粒化产品。
3.根据权利要求2的颗粒,其特征在于所述来源于豆科植物的微粒化产品是一种微粒化的大豆产品。
4.根据权利要求1、2或3任一项的颗粒,其特征在于所述核心还包括麦芽糊精。
5.根据权利要求1、2或3任一项的颗粒,其特征在于所述核心还包括脱脂奶粉。
6.根据权利要求1、2或3任一项的颗粒,其特征在于所述酶选自植酸酶、内切葡聚糖酶、木聚糖酶或磷酸酶。
7.根据权利要求1、2或3任一项的颗粒,其特征在于所述包被层为所述颗粒的总干质量的2-30%(w/w)。
8.根据权利要求7的颗粒,其特征在于所述包被层为所述颗粒的总干质量的5-25%(w/w)。
9.一种动物饲料组合物,特征在于其包括权利要求1-8任一项的颗粒。
10.一种食品组合物,特征在于其包括权利要求1-8任一项的颗粒。
11.一种药物组合物,特征在于其包括权利要求1-8任一项的颗粒。
12.一种生产权利要求1-8任一项的颗粒的方法,其特征在于将含有一种来源于豆科植物的微粒化产品的溶液施用于包含至少一种生物活性蛋白的核心上,然后将如此获得的包覆的颗粒干燥。
13.根据权利要求12的方法,其特征在于所述含有一种来源于豆科植物的微粒化产品的溶液的施用和干燥在一个流化床干燥器上进行。
14.一种来源于豆科植物的微粒化产品用于在生产一种颗粒状产品的方法中增加生物活性蛋白热稳定性的用途,其中所述生物活性蛋白是一种酶,且所述来源于豆科植物的微粒化产品来自含有脂肪、蛋白、淀粉和其他碳水化合物作为储存剂的微粒化的豆类植物。
15.一种来源于豆科植物的微粒化产品用于在生产动物饲料的方法中增加生物活性蛋白热稳定性的用途,其中所述生物活性蛋白是一种酶,且所述来源于豆科植物的微粒化产品来自含有脂肪、蛋白、淀粉和其他碳水化合物作为储存剂的微粒化的豆类植物。
16.一种来源于豆科植物的微粒化产品用于在生产一种食品的方法中增加生物活性蛋白热稳定性的用途,其中所述生物活性蛋白是一种酶,且所述来源于豆科植物的微粒化产品来自含有脂肪、蛋白、淀粉和其他碳水化合物作为储存剂的微粒化的豆类植物。
17.一种来源于豆科植物的微粒化产品用于在生产一种药物组合物的方法中增加生物活性蛋白热稳定性的用途,其中所述生物活性蛋白是一种酶,且所述来源于豆科植物的微粒化产品来自含有脂肪、蛋白、淀粉和其他碳水化合物作为储存剂的微粒化的豆类植物。
18.根据权利要求14-17任一项的用途,其特征在于所述来源于豆科植物的微粒化产品是一种来自豌豆、小扁豆、菜豆、花生、大豆、利马豆、鹰嘴豆、豇豆或羽扇豆的微粒化的产品。
19.根据权利要求18的用途,其特征在于所述来源于豆科植物的微粒化产品是一种微粒化的大豆产品。
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