WO2008055626A1 - Protein-enthaltender stoff mit erhöhter temperaturstabilität - Google Patents

Protein-enthaltender stoff mit erhöhter temperaturstabilität Download PDF

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Definitions

  • the invention relates to a protein-containing substance with increased temperature stability, comprising a core with at least one biologically active protein and a coating layer comprising a micronized legume product.
  • the invention further relates to a method for producing the protein-containing substance with increased temperature stability and to the use of a micronised legume product for increasing the temperature stability of biologically active proteins in processes for producing granulated and / or pelletized products while maintaining the high biological availability of the protein - containing substance.
  • Biologically active proteins and in particular enzymes, are commonly used as dry granulated preparations.
  • protein-containing products are easy to handle and dose.
  • Numerous technologies are known for producing such granulated products.
  • agglomerators fluid-bed agglomerators
  • particles are fluidized above a porous support in the air stream and form agglomerates, which are then optionally coated and finally dried.
  • mixed agglomerators such as plowshare, the agglomeration or granulate formation takes place by particle collision, whereby dense or less dense agglomerates can be formed corresponding to the shear forces. These agglomerates can then be dried to a certain residual moisture.
  • extruded or pelletized products in which a paste containing the protein is compressed into pellets or extruded under pressure through a small opening and then cut into particles which are subsequently dried. All of these methods use more or less drastic conditions of shear and temperature. Proteins, in particular Enzymes, which can be used in the animal feed industry, be exposed during their processing such loads, whereby the protein or enzyme can be limited in its function. For example, in the incorporation of a powdered or granulated enzyme into animal feed pellets, inactivation of the enzyme may occur by contact with inhibitors in the feed and / or by increased temperature and moisture in the vapor stream in the conditioning step of the pelleting process of the animal feed.
  • enzyme stabilizers have also been added, for example trehalose and zinc sulfate, corn steep liquor, phytic acid and inositol monophosphate (in the case of phytase).
  • corn steep liquor which also contains phytic acid and inositol phosphates
  • WO 00/20569 The addition in particular of the special inorganic salts zinc sulfate and magnesium sulfate is described in US 5,972,669, US 5,827,709 and EP 0 758 018.
  • the use of trehalose, zinc sulfate and polyethylene glycol for the coating is described in WO 98/55599.
  • thermostability of biologically active proteins for use in processes for the production of substances of defined and / or small particle size, preferably for use in processes for the production of, for example, pelletized products should be increased.
  • thermal stability ie the recovery of the enzyme activity used after thermal stress, should be increased in enzyme preparations.
  • the manufacturing process should be simple and reliable.
  • the method should lead to granulated products that are non-toxic and are safe for human and animal consumption.
  • the process should be universally applicable to any agglomeration, granulation and extrusion products and also at high process temperatures in the application of so produced products ensure sufficient temperature stability of the enzymes.
  • the process should be environmentally compatible, ie it should be possible to use substances which are biodegradable and in which, for example, no non-environmentally compatible chemicals or solvents have to be disposed of.
  • the components used should be approved in particular for use in the animal feed sector, in the food sector and in the pharmaceutical sector.
  • the invention thus relates to a protein-containing substance or substance with increased temperature stability, comprising a core and a coating layer, the characterized in that the core comprises at least one biologically active protein and that the coating layer comprises a micronized legume product. Furthermore, the invention relates to a method for producing such a protein-containing substance, which comprises applying to a core comprising at least one biologically active protein, a suspension comprising a micronized leguminous product, and drying the coated particles thus obtained. The invention further relates to the use of a micronized legume product for increasing the temperature stability of biologically active proteins, preferably in processes for producing a pelletized product.
  • the method according to the invention or the use according to the invention has the advantage over the prior art methods that it is also possible to form small granule particles which optimally protect the enclosed enzyme against the denaturing conditions at high temperatures and humidity.
  • Particles are according to the methods of extrusion (WO 00/47060) or the preparation of plowshare mixer (WO 01/04279) about 400 - 2000 microns in size.
  • the particles according to the invention can be 100-300 ⁇ m in size and are therefore very suitable for the production of homogeneous products, in particular if the particles contain high enzyme activities.
  • the process according to the invention or the use according to the invention is universally suitable for increasing the thermostability, in particular of enzyme preparations, and is e.g. applicable for use in pelleted animal feed; Due to the high solubility of the substance, the enzyme is also readily available biologically.
  • the amount of material to be applied is small in contrast to the methods of the prior art and thus allows the production of highly active enzyme particles.
  • a micronized leguminous product preferably a micronized soya product
  • a core which comprises at least one biological protein.
  • the application of the micron The legume product can be made by simply spraying on and then drying.
  • the micronized leguminous product can also be introduced directly in one step in the process process selected in each case, for example in a fluidized-bed dryer or flat-bed spray dryer.
  • the coating layer comprises or consists of a micronized legume product.
  • these are micronized legumes (Fabaceae) which contain fat, protein, starch and other carbohydrates as storage substances. Examples include micronized products from peas, lentils, beans, peanuts, soybeans, lima beans, chickpeas, cowpea, lupins.
  • Preferred is the micronized legume product, a micronized soy product.
  • the micronized legume product can be used to coat biologically active proteins as such or in combination with technologically necessary and useful auxiliaries. These may e.g. Acids and alkalis to adjust the pH and / or salts, buffering agents, etc.
  • Micronised portions of legume fruits may be used, e.g.
  • micronized legume product from the respective leguminous full-fruit.
  • the micronized legume product can be prepared according to known and any method for micronization.
  • Micronization is a high temperature, short term heating process. The starting material is heated with pulses of a few seconds without significant loss of water. Micronization by means of infrared pulses of wavelengths of 1.8 to 3.4 ⁇ m is particularly suitable in this context.
  • the micronized legume product may be suspended in aqueous solutions, possibly after adjusting a specific pH by stirring, or homogenized by means of Ultraturrax. In production processes, this is done by in-line homogenizers shortly before the spray nozzle to avoid separation of the suspension.
  • the suspension thus obtained can be in any way be sprayed by particles.
  • the particles may originate, for example, from spray-drying, granulation, agglomeration or extrusion processes.
  • the application of the coating layer can then in a batch process in separate equipment such as fluidized bed dryers, coaters with and without Wurster tube, ProCell equipment, etc.
  • the applied mass of micronized legume product may be from 2 to 50% (w / w) dry matter based on the particles containing protein.
  • the micronized legume product is a micronized soy product, and most preferably the micronized soy product of Micronizing Company (UK) Ltd. described below.
  • micronized soy product used to apply a coating layer in the examples was made on the basis of full-fat soybeans.
  • micronized soy product that can be used for the purposes of the present invention is the product "micronized soy” from Micronizing Company (UK) Ltd., Charnwood MiII, Framlingham, Suffolk, IP13 9PT (www.micronizing.com) Product is manufactured by infrared micronization using infrared light with a wavelength of 1, 8 to 3.4 ⁇ m
  • a typical manufacturing process for this product comprises the following stages:
  • the pre-cleaned products are uniformly cooked with infrared on a vibratory conveyor at 12O 0 C with a strong increase in the water vapor partial pressure and thus to a digestion of the components contained such as proteins, cellulose, hemicellulose, etc .. Thereby also inactivates the anti-nutritive factors that occur eg in soy and the material receives a very high nutritional value as animal feed.
  • the heated product is stored in a container for a period of between 5 and 15 minutes.
  • the product is then ground into flakes in a high-performance mill and then cooled to room temperature.
  • a high-performance mill In the case of soybeans and other oil-bearing seeds and seeds, the milling process leads to the breakdown of the oil bodies and the release of the oil contained in them.
  • the flakes are passed through a crusher to get full fat flour.
  • the particle size of the particles thus obtained for use is less than 1 mm in diameter, better below 0.5 mm, even better below 0.3 mm in diameter.
  • the micronized legume product is added in an amount in the range of 50% (w / w) based on the dry matter of the biologically active protein-containing particles and the micronized legume product, preferably in the range of 2 to 50%, more preferably in the range of 5 to 35%. and most preferably in the Range of 7 to 25% applied.
  • the micronized legume product can be applied as such in aqueous suspension or homogenized and thus in finer size reduction than in pure suspension.
  • the suspension is preferably prepared with water and can be brought to a certain pH value before application with buffer substances and / or alkalis and acids, or even other substances such as salts can be added to the effect of the micronized leguminous product improve.
  • the core to which the coating layer of micronized legume product is applied comprises at least one biologically active protein, optionally together with technologically necessary and useful substances.
  • the biologically active protein is heat labile.
  • the biologically active protein is an enzyme.
  • the core can only consist of the biologically active protein.
  • This enzyme is preferably selected from phytases, phosphatases, alpha-galactosidases, beta-galactosidases, laccases, phospholipases, endoglucanases, in particular endo-beta-1, 4-glucanases, endo-beta-1,3,3-glucanases, endo-1,2-beta-glucanases and endo-1,3-alpha-glucanases, cellulases, xylosidases, galactanases, in particular arabinogalactan-endo-1,4-beta-galactosidases and arabinogalactan-endo-1,3 beta-galactosidases, pectin-degrading enzymes, especially pectinases, pectin esterases, pectin lyases, polygalacturonases, arabananases, rhamnogalacturonases, rhamn
  • Galacturonidases mannanases, beta-mannosidases, mannanacetyl esterases,
  • Xylanacetyl esterases proteases, other xylanases, arabinoxylanases, lipolytic enzymes such as lipases, digalactoside diglyceride esterases and cutinases, and other enzymes such as laccases and transglutaminases.
  • the enzyme is selected from phytases, endoglucanases, xylanases or phosphatases.
  • the core which comprises at least one biologically active protein may also contain further carrier and auxiliary substances, for example partially hydrolysed starch products such as maize starch, wheat starch, etc., proteinaceous substances such as e.g. Skimmed milk powder, casein hydrolysates, yeast hydrolysates or autolysates, other vegetable ingredients such as e.g. Cellulose, hemicellulose or lignin-containing components and cell extracts, organic and inorganic salts such as e.g. Calcium propionate, citric acid or salts of citric acid, buffering substances, acids and bases for adjusting the pH.
  • partially hydrolysed starch products such as maize starch, wheat starch, etc.
  • proteinaceous substances such as e.g. Skimmed milk powder, casein hydrolysates, yeast hydrolysates or autolysates
  • other vegetable ingredients such as e.g. Cellulose, hemicellulose or lignin-containing components and cell extracts
  • organic and inorganic salts such as
  • the thus enveloped biologically active protein is given increased temperature stability (thermal stability).
  • thermostability By conferring increased thermostability, the biologically active proteins retain their activity under conditions which would normally result in partial or total inactivation of the protein.
  • the thermostability imparted to the proteins thus enables their further processing under thermal conditions which would otherwise lead to the inactivation of the biologically active protein, as well as a correspondingly longer storage time or storage at elevated temperature.
  • the wrapper also prevents contact of the protein with other substances that may be inhibitory of the entrapped protein during further processing or storage.
  • the core which comprises at least one biologically active protein
  • the coating layer of micronized legume product is completely enveloped by the coating layer of micronized legume product.
  • an opaque coating of the starting material containing the biologically active protein is achieved by careful process control when applying the coating layer.
  • the micronized legume product may be due to the micronized state especially completely around the starting particles.
  • the use of the micronized legume product within the ranges of amounts indicated above contributes to the most complete possible encapsulation of the starting material.
  • the amount of micronized leguminous product to be applied, based on the mass of the protein-containing substance is greater the smaller the particle size of the protein-containing substance. This is due to the ratio of volume to surface. The surface is larger in the case of small particles than in the case of large particles.
  • such pretreated starting material is particularly well suited for use in processes for the use of materials having a small particle size, in particular for the production of pelletized products.
  • animal feeds are very often used in a pelletized state. Since elevated temperatures regularly occur in the pelletizing conditions, the process according to the invention or the use according to the invention offers the possibility of producing pelleted animal feed products with maximum retention of the biological activity of the proteins used in each case.
  • coated (coated) proteinaceous substances or particles or particles obtained according to the invention can be supplied to other uses as such or in processed form. For example, they may be incorporated into an animal feed, food or drug. Corresponding methods and applications are well known to a person skilled in the art.
  • FIG. 1 shows a schematic drawing of a steam generator (streamer, laboratory device).
  • Figure 2 shows a typical temperature profile of feed / enzyme samples in a steam generator under conditions corresponding to the 80 ° C conditions of method A) (see below).
  • FIG. 3 shows the influence of the coating layer on the thermal stability of acid phosphatase after adjustment of the pH with various acids.
  • FIG. 4 shows the activity recovery after thermal loading by means of a laboratory strainer on an endoglucan granulate with and without addition of Glucidex before application to a glucidex core and subsequent coating with 10% (w / w) dry matter of micronized soya.
  • the phytase activity is measured in an assay mixture containing 0.5% (w / w) phytic acid (about 5 mM), 200 mM sodium citrate, pH 5.0. After 15 minutes
  • the liberated phosphate ions are prepared by mixing 100 ⁇ l of the assay mixture with 900 ⁇ l H 2 O and 1 ml 0.6 M
  • the determination of the acid phosphatase activity is analogous to the determination of the phytase in Reference Example 1, with the difference that the substrate solution is 10 mM ⁇ -glycerophosphate in 250 mM glycine / HCl buffer, pH 2.5.
  • Reference Example 3 Determination of endo- ⁇ -1,4-glucanase activity
  • ß-Glucanase hydrolyzes the glycosidic bonds in dissolved barley glucan.
  • the liberated reducing sugars react with the DNA reagent to form a color complex whose content is determined photometrically at 540 nm.
  • One unit of ⁇ -glucanase activity is defined as the amount of enzyme needed to release 1 ⁇ mol of glucose reducing sugar equivalents per minute under defined conditions.
  • the enzyme reaction is carried out at pH 5.5 and 40 0 C.
  • micronized soya is used by Micronizing Company (UK) Ltd. These process variants are cited in Examples 3 to 10.
  • the application of the coating layer can take place in the following process variants:
  • Method A Applying the coating layer in a fluidized-bed dryer (aerocoater) of the Strea-1 type, Aeromatic-Fielder AG, Bubendorf, Switzerland
  • the application of a coating layer comprising micronized soy product to granules containing a biologically active protein is carried out in a special fluidized bed dryer.
  • the granules are produced in a conventional manner protein granules.
  • An air compressor produces dry, fat-free air compressed to 6 bar.
  • Typical batch sizes of proteinaceous granules that can be processed in the Strea-1 fluid bed dryer can be determined by standard methods. Coating experiments are carried out in the Strea-1 with soil spray devices (Aerocoater). Typical batch sizes are in the range between 50 and 300 g of granules.
  • the tempered compressed air is introduced at a pressure of 0.6 bar with a 1, 2 mm spray nozzle, which is mounted in the center of the air distribution plate at the bottom.
  • the air distribution plate is modified to provide> 95% air flow into the center and the remaining 5% flow fully into the peripheral areas of the vessel to prevent contact of the wet granules with the walls.
  • a short Wurster tube is used in most coating trials and is placed 0.8 cm above the air distribution plate. introduced. In some experiments, the flight of granules in the Wurster tube can be difficult to maintain and the coating is then done in the absence of the tube.
  • Typical flow rates of the coating liquids containing the homogenized micronized soya are 1 to 6 ml min -1 .
  • the suspension used for spraying was an aqueous suspension having a dry matter of between 5% and 25% of micronized soy which was homogenized just prior to spraying using an Ultraturrax To prevent blockage of the nozzle in a bottom spray device embodiment short of the air inlet temperature 60 0 C is not exceeded during spraying.
  • the air inlet temperature is increased to 80-95 0 C in order to dry the coated granules to a final water content of 5 to 10%.
  • the granules thus obtained can be used as such or further processed.
  • Method B application of the coating layer in a fluid bed dryer of the type GPCG1, Glatt Systemtechnik GmbH, Dresden, Germany
  • a coating layer comprising a micronized soy product to a granulate containing a biologically active protein is carried out in a special fluidized bed dryer.
  • the granules are produced in a conventional manner protein granules.
  • the "micronized soya” is stirred in water to a 10% (w / w) suspension and homogenized by an in-line homogenizer before spraying.
  • the spray rate of the homogenized micronized soybean suspension is adjusted so that it does not coagulate granules
  • the typical spray rate for the suspension is about 5-15 ml min -1 .
  • a two-jet nozzle is used for the application and application of the 10% (w / w) micronized soy suspension.
  • the coating is usually 10% (w / w) based on the dry mass of the granules submitted, but may also be between 5 and 30% (w / w).
  • the proteins contained in micronized soya-coated products can be tested for thermal stability using the following methods:
  • the coated products are subjected to thermal stress in one of the procedures described below
  • Thermostability of particles containing an enzyme Analogously, the thermostability of particles containing other biologically active proteins can be tested.
  • the enzyme activity added to the final products to be produced before and after the thermal exposure is determined by a measuring method specific to the enzyme to be tested (see Reference Examples 1-3).
  • the enzyme activity recovered after the thermal load is expressed as a percentage of the enzyme activity used in the form of the percentage recovery.
  • the thermal loads become visible the effectiveness of the coating layer with ungecoatetem and coated material performed and compared.
  • Method A Testing the thermostability in a pilot pelleting plant (feasible at the Biotechnology Institute of the Research Institute for Food and Molecular Biotechnology, Kolding, Denmark, the test can also be carried out in another corresponding pelleting plant).
  • Coated or uncoated granules containing the enzymes fungal or bacterial phytase, acid phosphatase or endoglucanase and prepared according to process A) or B) from example 1 are premixed with wheat flour type 550 to obtain 300 g of an enzyme-containing premix.
  • This premix is mixed with 15 kg of animal feed at the Biotechnology Institute of the Research Institute for Food and Molecular Biotechnology, Kolding, in order to ensure an optimal dilution for incorporation into 285 kg of animal feed and a readily determinable enzyme activity in the pelleted material.
  • the amount of coated granules used amounts to between 0.1 and 10 g per kg animal feed in most experiments and leads to an enzyme activity of about 5 units (U) g "1 animal feed for phytase, or about 6 units (U) g "1 for acid phosphatase or about 230-270 units (U) g '1 for endoglucanase.
  • the 300 kg of animal feed treated in the pelletizing plant have the composition of Table 1.
  • the pelleting conditions are as follows:
  • Horizontal mixer with 700 l volume, 48 rpm; The amount that is mixed is in the range of 80 to 300 kg.
  • a horizontal screw conveyor for emptying the mixer, whose conveying speed is adapted to the subsequent step.
  • the mixer is a Kahl cascade mixer (conditioner) 130 cm long, 30 cm diameter, 155 rpm and 37 chambers.
  • the throughput is 300 kg per hour.
  • Feed and enzyme-containing particles of the invention have about 30 s contact with wet steam. (The steam and temperature conditions are given in Table 2.)
  • the steam provided by a Dan Stoker high-pressure boiler flows at 2 bar overpressure through a pressure regulating valve into the cascade mixer.
  • the valve regulates the amount of steam that flows into the cascade mixer where it leads to heating of the enzyme-containing feed.
  • the conditioned material is pelleted by a Simon Heesen press and
  • pelleting press runs at 500 rpm at a power consumption of 7.5 kW, producing pellets of 3 x 20 mm.
  • Table 2 Steam conditions for achieving the various temperatures when pelleting animal feed containing the particles according to the invention, in the Annex to the Biotechnology Institute of the Research Institute for Food and Molecular Research Biotechnology, Kolding, Denmark
  • the thermal load for testing the thermal stability of coated particles can also be carried out in other systems. Subsequently, the remaining enzyme activity in the coated and uncoated particles in the pelleted animal feed is determined according to Reference Examples 1-3.
  • thermostability tests in short thermostability tests carried out in closed vessels, give at best an indication of an increase in storage stability since they act as an accelerated storage test.
  • a laboratory method has been developed to reliably determine the thermostability of enzymes when incorporated into feed and under the conditions found in a feed mill (see method A). can be true. It has been found that the major part of enzyme inactivation occurs when enzyme-containing feeds are exposed to elevated temperature and humidity, that is, under conditions occurring during the steam conditioning of feed. To determine this degree of inactivation, an enzyme granule is subjected to steam heating in animal feed in a laboratory scale device. The process is designed for a defined temperature (75-85 ° C).
  • FIG. 1 An apparatus in which such tests can be performed is shown in Figure 1 and consists of a brass vessel with a perforated insert on which the feed is placed and further contains a mechanism to introduce steam into the feed. Steam is fed at 4.7 bar pressure from a conventional steam generator (Euroflex). The amount of steam entering the vessel is regulated by the two control valves, which also regulate the removal of water condensate from the part of the vessel under use with the feed. Importantly, the steam lines are free of condensate and are already at operating temperature prior to attachment to the brass vessel.
  • Euroflex conventional steam generator
  • the vessel is charged with the feed to be tested (50-100 g, typically 50 g, composition see Table 1) containing the enzyme-containing particles according to the invention, and steam is introduced into the vessel.
  • the sample is stirred with a long dumbbell, which either has a thermocouple at the end, or the thermocouple is guided separately on a probe into the animal feed.
  • the temperature obtained in the feed sample is constantly recorded by connecting the probe to a data logger (DrDAQ, Pico Technology, UK) after A / D conversion of the measurement signal by means of a personal computer.
  • the temperature is maintained for 30 to 60 seconds, taken out the feed from the overall barrel and cooled in a shallow plastic container.
  • Typical temperature profiles for these tests at 80 ° C. are shown in FIG. 2 (temperature profile of feed / enzyme samples in a steam according to the conditions of 80 0 C in a method according to method A)).
  • the maximum temperature attained and the period of time for which this temperature is maintained can be regulated by switching the valves and / or regulating the amount of steam delivered.
  • the tests for thermal loading were always carried out in the laboratory device at least as duplicate determinations.
  • the areas under the temperature curves were integrated to determine if repeated samples had been subjected to the same overall thermal load.
  • the holding time at the specified temperature of 80 ° C or 85 ° C is important.
  • the remaining enzyme activity in the coated or uncoated particles in the mixture is determined according to Reference Examples 1-3.
  • Example 3 Temperature stability of the phytase of a filamentous fungus
  • UF concentrate from Aspergillus niger was.
  • awamori phytase prepared with a recombinant Trichoderma reese ' strain according to, for example, WO 94/03612 was dried with various additives dissolved in the UF concentrate in an APV spray granulator (see Example 1, Method B)) and then after Method according to Example 1, method B) coated.
  • the granules, which were coated in the Topspray compiler contained 15% (w / w) of citric acid based on the dry matter of the UF concentrate and the pH was adjusted to pH 3.
  • the bottom-spray granules also contained 10% (w / w) maltodextrin, which was dissolved in the UF concentrate before drying.
  • the particle size of all uncoated and coated products was between 200 and 300 microns measured by laser diffraction on a Malvern device.
  • the results in Table 3 show that an increase in the thermostability of the enzyme enclosed in the coated particles is obtained under the thermal stresses present in the pelleting process, independently of the additives selected in the UF filtrate.
  • the spray pressure, the size and shape of the resulting spray granules (particles with enzyme activity) also had no influence on the observed improvement in the thermostability of the enzyme enclosed in the coated spray granulate in the pelleting process.
  • Both top spray and bottom spray processes can be used to produce particles (granules) according to the invention in which the entrapped enzyme undergoes less inactivation during thermal loading than in the untreated particle.
  • the UF concentrate of Part A was added to 50% (w / w) skimmed milk powder (30% lactose) based on the dry matter of the UF concentrate and after adjusting the pH with sodium citrate to pH 5.1 in a ProCel] 5, smooth, dried to spray granules without core. This is done by spraying the above-mentioned solution with a dry mass of about 15-20% in the top spray method against the air flow in the ProCell ⁇ through a twin-flow nozzle with an injection rate of 6-25 g min -1 which increases over the batch process.
  • the supply air temperature is 70 ° -95 ° C at a supply air volume of 90-100 m 3 h "1 during the spraying while the product temperature is maintained at 50 0 C.
  • Table 4 Increase in heat stability of Aspergillus phytase in granules by coats with 10% (w / w) "micronized soya" wherein in the UF
  • Example 4 Effect of micronized soy coating level on the thermostability of the filamentous fungus phytase
  • a 10% suspension of "micronized soya” was prepared in water as it was also used for coating in Example 3. By centrifugation, the insoluble constituents were separated. The resulting water-soluble fraction was used to test whether the effect of increasing the thermostability of the entrapped phytase in the thermal stress tests is caused by the phytic acid, the substrate of the phytase, contained in the micronized soy.
  • the aliquot portion as used in coating to achieve a 10% w / w serving with "micronized soya” was used as enzyme test material, the sales product FINASE® Pc from the company ROAL Oy which is made from a UF concentrate according to Example 3 was used.
  • FINASE® PC was coated according to the method of Example 1, method A).
  • the thermal load was performed by the method of Example 2, Method B) at 80 ° C. for 30 seconds and then the residual enzyme activity in the treated material was determined.
  • Table 5 shows the effect of aqueous extract of micronized soy on the thermostability of the enzyme contained in the particle during the thermal stress test.
  • Example 5 Coating of bacterial (E. coli) "micronized soya" phytase in granulated granules of Glucidex
  • a bacterial (E. coli) phytase-containing granule containing Glucidex is coated with micronized soy. granulation
  • Glucidex 12 corn starch hydrolyzate from Roquette, France, containing 1% glucose, 2% disaccharides and 97% higher polysaccharides
  • STREA 1 Aeromatic Fielder
  • Phytase pH 2.5, adjusted with sulfuric acid
  • T. reese / ' strain WO 2006/042719
  • Example 1 The spray granules were then coated by the method of Example 1, method A) (5% (w / w) "micronized soy” based on dry masses) and according to the method of Example 2, method A), the thermostability of the phytase in The spray granules are tested and the results are shown in Table 6.
  • Example 6 Coating of a bacterial (E. coli) phytase-containing spray granulate without a core
  • the present example demonstrates the enhancement of thermal stability of bacterial phytase in a non-core spray granule by the application of a "micronized soy" coating.
  • WO 98/54980 ascribes to the absorption of the enzyme solution in a carbohydrate polymer and subsequent drying a stabilizing effect on the enzyme contained in a Thermobelas- tion as they occur in the pelleting conditions in animal feed. In the case of spraying, not soaking, of an enzyme solution solution to a carbohydrate polymer, this stabilizing effect could not be achieved.
  • Example 3 a phytase of a filamentous fungus and in Example 6 a phytase of bacterial origin were used which, however, have only a homology of 18% at the amino acid level and should therefore be regarded as two completely independent proteins.
  • Example 7 Coating of a granulate containing an acidic phosphatase of a filamentous fungus
  • thermostability of the acid phosphatase of a filamentous fungus was examined by coating the granules with "micronized soya".
  • the spray granules were coated with various amounts of "micronized soya” according to the method of Example 1, Method A.
  • the thermal loading of the acid phosphatase in the spray granules was determined by the method mentioned in Example 2, Method B) at 85 ° C, 60 sec and the thermostability is determined by measuring the residual activity thereafter
  • the results are shown in FIG.
  • the results shown in FIG. 3 show that the achieved increase in the thermostability of the acid phosphatase in the coated spray granules under the conditions of the pelleting process according to Example 2, Method B) is directly related to the amount of micronized soya applied.
  • thermostability of the enzyme in contrast to phytase, an enzyme very closely related to the acid phosphatase, as shown in WO 97/05245, US Pat. No. 5,972,669, US Pat. No. 5,827,709 and EP 0 758 018, where the addition of divalent cations such as calcium, magnesium or zinc, in particular as an additive in the form of inorganic salts to the UF concentrate during spray granulation, increases the thermostability had led the phytase under certain thermoblast tests.
  • the use of sulfuric acid in the pH-5 setting leads to precipitations of calcium sulfate and thus to a decrease in the calcium concentration in comparison to the UF concentrates in which the pH was adjusted with hydrochloric acid.
  • Example 8 Effect of Glucidex or Skimmed Milk Powder on the Thermo-o Stability of Acid Phosphatase-Containing Granules with and Without Coating with Micronized Soy
  • the effect of adding Glucidex and skim milk powder to the UF concentrate in the spray granulation of the enzyme 5 was compared to the effect of a micronized soy coating layer on the thermostability of a coated acid phosphatase spray granule.
  • Granulation o UF concentrate of Aspergillus niger pH 2.5 acid phosphatase produced by a recombinant T. reese / 'strain (see Example 6), was dissolved in a ProCell ⁇ , Glatt, the WUR dissolved in the UF concentrate with various additives - the (30% Glucidex, or 50% skimmed milk powder [SMP]) sprayed into particles of size up to 300 microns (see Example 3, Part B).
  • the pH of the solutions used for spray granulation was in each case pH 4.
  • Example 1 The coating was carried out according to Example 1, method A).
  • the applied amount of "micronized soya” was 10% (w / w) based on dry weight
  • Table 8 The results are shown in Table 8.
  • the thermal stability (expressed as% activity recovery) could of the enzyme in the spray granules can be further improved by applying the coating layer of "micronized soya" in the pelleting experiment, regardless of the structure or composition of the spray granules containing the enzyme, as a result of the application to "micronized soya", an increase in the thermostability of the enzyme in the total particle.
  • thermostability of the enzyme endo-1, 4- ⁇ -glucanase I from Trichoderma reesei was determined in a granule with a glucidexkem after coating with "micronized soya.”
  • This enzyme exhibits two different enzyme activities - endo-1, 4- ⁇ Glucanase and an equally high endo- ⁇ -1,4-xylanase activity.
  • the spray granules were obtained by spray-drying 200 ml of UF concentrate on 500 g of Gulcidex 12 core material, Roquette, France, or by spray-drying 200 ml of UF concentrate in an additional 10% (w / w) based on dry weight of Glucidex 12 were dissolved on the Glucidexkem before spray drying.
  • the granules obtained by the spray-drying were coated by the method of Example 1, Method A) by applying a 10% suspension "micronized soya.”
  • the proportion of coating material was 10% (w / w) based on the dry weight of the coated granules.
  • the increase in the thermostability of the endoglucanase contained in the granules was determined according to the method described in Example 2, method B).
  • thermostability of endoglucanase I from Trichoderma reesei is in The thermal stress tests also depend on the addition of maltodextrin in the UF concentrate before spray drying
  • Figure 4 shows that, regardless of the structure of the enzyme-containing granules or the addition to the UF concentrate in the preparation of the enzyme-containing granules, the application of "micronized soya" in a coating process leads to an increase in the thermal stability of the enzyme contained in the coated granules under the test conditions. Furthermore, the thermal stability improvement obtained by the application of the coating layer is greater than that which can be obtained by the addition of 10% Glucidex 12 in the UF concentrate in spray drying.
  • thermostability of endo-1,4- ⁇ -glucanase (endoglucanase 1) in a granulate without Glucidex core was examined after coating with "micronized soya”.
  • Example 1 The spray granules were coated according to Example 1, method A).
  • the applied layer of "micronized soya” was 10% (w / w) based on dry weight
  • Table 9 The results of activity recovery after the thermal stress of Example 2, Method A) are shown in Table 9.
  • thermostability of the Trichoderma reesei endoglucanase I encapsulated in the granules can be improved by micronized soy cladding even without the presence of a core of Glucidex A core of carbohydrate containing material is useful for improving the Thermostability by a coating with "micronized soya" not a prerequisite.

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Abstract

Die Erfindung betrifft einen Stoff mit erhöhter Temperaturstabilität, umfassend einen Kern und eine Coatingschicht, dadurch gekennzeichnet, dass der Kern mindestens ein biologisch aktives Protein umfasst, und dass die Coatingschicht ein mikronisiertes Leguminosenprodukt umfasst, ein Verfahren zur Herstellung dieses Stoffs sowie die Verwendung eines mikronisierten Leguminosenprodukts zur Erhöhung der Temperaturstabilität von biologisch aktiven Proteinen in Verfahren zur Herstellung eines granulierten Produkts, sowie in Verfahren zur Herstellung von Tierfutter, Lebensmitteln und Arzneimitteln.

Description

Protein-enthaltender Stoff mit erhöhter Temperaturstabilität
Die Erfindung betrifft einen Protein-enthaltenden Stoff mit erhöhter Temperaturstabilität, umfassend einen Kern mit mindestens einem biologisch aktiven Protein und eine Coatingschicht, die ein mikronisiertes Leguminosenprodukt umfasst. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung des Protein-enthaltenden Stoffs mit erhöhter Temperaturstabilität sowie die Verwendung eines mikronisier- ten Leguminosenprodukts zur Erhöhung der Temperaturstabilität von biologisch aktiven Proteinen in Verfahren zur Herstellung granulierter und/oder pelletisierter Produkte unter Beibehaltung der hohen biologischen Verfügbarkeit des Protein- enthaltenden Stoffes.
Biologisch aktive Proteine und insbesondere Enzyme werden üblicherweise als trockene granulierte Präparate verwendet. In dieser Form sind proteinhaltige Produkte leicht handhabbar und dosierbar. Zur Herstellung solcher granulierter Pro- dukte sind zahlreiche Technologien bekannt. So werden beispielsweise in Wϊrbel- schichtagglomeratoren (Fluid-bed-Agglomeratoren) Teilchen über einem porösen Träger im Luftstrom aufgewirbelt und bilden Agglomerate, die anschließend gegebenenfalls beschichtet und endgetrocknet werden. In Mischagglomeratoren, wie z.B. Pflugscharmischem, erfolgt die Agglomerat- bzw. Granulatbildung durch Teil- chenkollision, wobei entsprechend den Scherkräften dichte bzw. weniger dichte Agglomerate gebildet werden können. Diese Agglomerate können anschließend auf eine bestimmte Restfeuchtigkeit getrocknet werden. Häufig verwendet werden ferner extrudierte oder pelletisierte Produkte, bei denen eine das Protein enthaltende Paste zu Pellets verpresst wird oder unter Druck durch eine kleine Öffnung extrudiert und dann in Teilchen geschnitten wird, welche anschließend getrocknet werden. Bei all diesen Verfahren werden mehr oder weniger drastische Bedingungen bezüglich Scherkräften und Temperatur verwendet. Proteine, insbesondere Enzyme, die im Bereich der Tierfutterherstellung eingesetzt werden können, im Laufe ihrer Verarbeitung solchen Belastungen ausgesetzt sein, wodurch das Protein bzw. Enzym in seiner Funktion eingeschränkt werden kann. So kann beispielsweise bei der Einarbeitung eines pulverisierten oder granulierten Enzyms zu Tierfutterpellets eine Inaktivierung des Enzyms durch Kontakt mit Hemmstoffen in dem Futter und/oder durch die erhöhte Temperatur und Feuchtigkeit im Dampfstrom im Konditionierschritt des Pelletiervorganges des Tierfutters eintreten.
Es wurden bereits Versuche unternommen, die Inaktivierung und insbesondere die thermische Inaktivierung von biologisch aktiven Proteinen bei derartigen Herstellungsverfahren zu verhindern. Dazu wurden beispielsweise Enzyme nicht ko- valent auf relativ großen Teilchen immobilisiert (z.B. stärkehaltige Partikel aus Cassava- Sago-, Reis-, Weizen-, Sorghum- oder Gerstenstärke; vgl. WO 97/39116 von Silikapartikel (vgl. US 5,318,903; WO 94/26883), oder pflanzliche Mehle als Trägerstoffe (vgl. US 4,106,991) verwendet. Ferner wurde der Wassergehalt in der Nähe der Substanz verringert z.B. durch Natriumsulfat (vgl. WO 97/39116, WO 92/12645, WO 01/04279) und/oder es wurde eine wasser- und dampffeste Barriere, d.h. eine Beschichtung vorgenommen, um die biologisch empfindlichen Substanzen bei erhöhtem Wassergehalt vor hohen Temperaturen und deren Auswirkungen alleine und zusammen mit Wasser oder Wasserdampf zu schützen (vgl. WO 97/39116, US 6,610,519, WO 00/01793, WO 92/12645, WO 96/16151 , WO 01/04279). Ferner wurden auch Enzymgranulaten gezielt Komponenten zugesetzt, die thermische und mechanische Energie bevorzugt absorbieren sollen. Die Nutzung von Milchsäure zur Stabilisierung von Phytase ist in WO 00/20569 beschrieben.
Im Falle von Enzymen wurden weiterhin auch Enzymstabilisatoren zugesetzt, beispielsweise Trehalose und Zinksulfat, Maisquellwasser, Phytinsäure und Inositol- monophosphat (im Falle von Phytase). Der Zusatz von Maisquellwasser, das auch Phytinsäure und Inositolphosphate enthält, ist z.B. beschrieben in WO 00/20569. Der Zusatz insbesondere der speziellen anorganischen Salze Zinksulfat und Magnesiumsulfat ist in US 5,972,669, US 5,827,709 sowie EP 0 758 018 beschrieben. Der Einsatz von Trehalose, Zinksulfat und Polyethylenglycol für das Coating ist in WO 98/55599 beschrieben.
Diese Verfahren besitzen jedoch den Nachteil, dass Zusätze wie Zinksulfat, ein Spurenelement, in hohen Mengen (>15%; vgl. US 5,827,709) nicht für alle Futterrationen bei Tieren anwendbar ist. Überzüge aus hydrophoben Materialien wie Wachs, Fett etc. verringern die biologische Verfügbarkeit des Enzyms dadurch, dass das Enzym im Magen erst sehr spät freigesetzt wird und daher in großen Mengen dosiert werden muss, um Wirksamkeit zeigen zu können, z.B. um in der zeitlich begrenzten Retentionszeit von ca. 4 h beim Schwein wirken zu können. Weiterhin sind viele dieser Kompositionen nur speziell für ganz bestimmte Enzyme, wie z.B. Phytase, optimiert oder sogar wirksam. Andere Zusätze wie Kaolin, Zeolithe und Silica sind unlösliche und biologisch nicht abbaubare Verbindungen, was ihren Einsatz stark limitiert. Das Aufsprühen auf Trägerstoffe, bzw. das Auf- saugen durch quellbare Polysaccharide, limitiert die auftragbare Menge an Protein und den Durchsatz bei der Herstellung, da es ansonsten zu Verklumpungen im Sprühprozess kommt. Auch die maximal erreichbare Enzymaktivität in derart hergestellten Enzympartikeln ist durch das Verhältnis Trägermaterial zu aufbringbarem Enzym limitiert.
Es besteht somit ein Bedarf nach einem Verfahren zur Erhöhung der Thermosta- bilität von biologisch aktiven Proteinen. Insbesondere soll die Thermostabilität von biologisch aktiven Proteinen zur Verwendung in Verfahren zur Herstellung von Stoffen mit definierter und/oder kleiner Korngröße, bevorzugt zur Verwendung in Verfahren zur Herstellung von z.B. pelletisierten Produkten erhöht werden. Insbesondere soll die Thermostabilität, also die Wiederfindung der eingesetzten Enzymaktivität nach thermischen Belastungen, in Enzympräparaten erhöht werden. Das Herstellverfahren soll einfach und zuverlässig anwendbar sein. Ferner soll das Verfahren zu granulierten Produkten führen, die untoxisch sind und für den menschlichen und tierischen Verzehr unbedenklich sind. Das Verfahren soll universell für beliebige Agglomerations-, Granulations- und Extrusionsprodukte anwendbar sein und auch bei hohen Verfahrenstemperaturen in der Anwendung der so hergestellten Produkte eine ausreichende Temperaturstabilität der Enzyme gewährleisten. Ferner soll durch die bei diesem Verfahren verwendeten Substanzen keine sonstige negative Wechselwirkung mit den biologisch aktiven Proteinen eintreten. Weiterhin soll das Verfahren umweltverträglich sein, d.h. es sollen Stof- fe eingesetzt werden können, die biologisch abbaubar sind und bei denen beispielsweise keine nicht umweltverträglichen Chemikalien oder Lösungsmittel zu entsorgen sind. Die genutzten Komponenten sollen insbesondere für den Einsatz im Tierfutterbereich, im Lebensmittelbereich und im Arzneimittelbereich zugelassen sein. Durch die Umhüllung eines aktiven Proteins, insbesondere eines En- zymproteins soll auch dessen Kontakt mit inhibierenden Substanzen, wie er z.B. in Mineralpremixen vorliegt, unterbunden werden und es sollen lagerungsstabile Mischungen hergestellt werden können.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass durch Aufbringen einer oder mehrerer Schichten eines mikronisierten Leguminosenprodukts auf Teilchen, die biologisch aktives Protein enthalten, bzw. durch Umhüllen, Ummanteln, Einkapseln von Kernen, die biologisch aktives Protein umfassen, die Temperaturstabilität (Thermostabilität) dieser biologisch aktiven Proteine stark erhöht werden kann ohne die Aktivität des so umhüllten Proteins in sonstiger Weise zu beeinträchti- gen. Dabei wird eine Coatingschicht aus einem mikronisierten Leguminosenprodukt aufgebracht, wobei nur die Außenschicht der proteinhaltigen Teilchen mit dem mikronisierten Leguminosenprodukt in Kontakt kommt. Dadurch entsteht ein wirksamer Schutz der so umhüllten biologisch aktiven Proteine gegenüber erhöhten Temperaturen in Verarbeitungsverfahren, die mit thermischer Belastung der Produkte einhergehen. Die Umhüllung dient auch als Schutz z.B. von Enzymen bei der Lagerung in Mischungen mit inhibitorisch wirkenden Substanzen. Weiterhin ermöglicht das Verfahren die Herstellung sehr hoch konzentrierter Produkte (Enzymprodukte) mit den erfindungsgemäßen Eigenschaften bzgl. der Thermostabilität in den weiteren Verarbeitungs- bzw. Verwendungsschritten.
Die Erfindung betrifft somit einen Protein-enthaltenden Stoff bzw. Substanz mit erhöhter Temperaturstabilität, umfassend einen Kern und eine Coatingschicht, der dadurch gekennzeichnet ist, dass der Kern mindestens ein biologisch aktives Protein umfasst und dass die Coatingschicht ein mikronisiertes Leguminosenprodukt umfasst. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines derartigen Protein-enthaltenden Stoffs, wobei man auf einen Kern, der mindestens ein biologisch aktives Protein umfasst, eine Suspension, die ein mikronisiertes Leguminosenprodukt umfasst, aufbringt und die so erhaltenen beschichteten Partikel trocknet. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung eines mikronisierten Leguminosenprodukts zur Erhöhung der Temperaturstabilität von biologisch aktiven Proteinen, bevorzugt in Verfahren zur Herstellung eines pelletisierten Produkts.
Das erfindungsgemäße Verfahren bzw. die erfindungsgemäße Verwendung hat gegenüber den Verfahren aus dem Stand der Technik den Vorteil, dass sich auch kleine Granulatpartikel bilden lassen, die das eingeschlossene Enzym optimal gegen die denaturierenden Bedingungen bei hohen Temperaturen und Feuchtigkeit schützen. Z.B. sind Partikel nach den Verfahren der Extrusion (WO 00/47060) oder der Herstellung über Pflugscharmischer (WO 01/04279) ca. 400 - 2000 μm groß. Die erfindungsgemäßen Partikel können 100 - 300 μm groß sein und eignen sich daher sehr gut zur Herstellung von homogenen Produkten, insbesondere wenn die Partikel hohe Enzymaktivitäten enthalten.
Das erfindungsgemäße Verfahren, bzw. die erfindungsgemäße Verwendung eignet sich universell zur Steigerung der Thermostabilität insbesondere von Enzympräparaten und ist z.B. bei der Verwendung in pelletiertem Tierfutter anwendbar; dabei ist durch die hohe Löslichkeit der Substanz auch das Enzym biologisch so- fort verfügbar. Die aufzubringende Menge an Material ist klein im Gegensatz zu den Verfahren im Stand der Technik und ermöglicht so die Herstellung hochaktiver Enzympartikel.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen beschichteten Protein-enthaltenden Stoffs wird ein mikronisiertes Leguminosenprodukt, bevorzugt ein mikronisiertes Sojaprodukt auf einen Kern, der mindestens ein biologisches Protein umfasst, aufgebracht. Das Aufbringen des mikroni- sierten Leguminosenprodukts kann durch einfaches Aufsprühen und anschließendes Trocknen erfolgen. Das mikronisierte Leguminosenprodukt kann aber auch direkt in einem Schritt im jeweils gewählten Verfahrensprozess, wie beispielsweise in einem Wirbelschichttrockner oder Flachbettsprühtrockner, einge- bracht werden.
Erfindungsgemäß umfasst die Coatingschicht ein mikronisiertes Leguminosenprodukt oder besteht daraus. Erfindungsgemäß handelt es sich hierbei um mikronisierte Leguminosen (Fabaceae), die Fett, Eiweiß, Stärke und andere Kohlenhyd- rate als Speicherstoffe enthalten. Beispiele hierfür sind mikronisierte Produkte aus Erbsen, Linsen, Bohnen, Erdnüssen, Sojabohnen, Limabohnen, Kichererbsen, Kuhbohnen, Lupinen. Bevorzugt ist das mikronisierte Leguminosenprodukt, ein mikronisiertes Sojaprodukt. Das mikronisierte Leguminosenprodukt kann zur Be- schichtung biologisch aktiver Proteine als solches oder in Kombination mit techno- logisch notwendigen und sinnvollen Hilfsstoffen eingesetzt werden. Diese können z.B. Säuren und Laugen zum Einstellen des pH-Wertes sein und/oder Salze, Puffersubstanzen etc.. Es können mikronisierte Anteile von Leguminosenfrüchten verwendet werden, z.B. die Reste nach einer Entfettung. Bevorzugt ist die Nutzung eines mikronisierten Leguminosenprodukts aus der jeweiligen Leguminosen- vollfrucht. Dabei kann das mikronisierte Leguminosenprodukt nach an sich bekannten und beliebigen Verfahren zur Mikronisierung hergestellt werden. Bei der Mikronisierung handelt es sich um einen Kurzzeit-Erhitzungsprozess mit hoher Temperatur. Dabei wird das Ausgangsmaterial mit Pulsen von wenigen Sekunden ohne signifikanten Wasserverlust erhitzt. Besonders geeignet ist in diesem Zu- sammenhang die Mikronisierung mittels Infrarotpulsen von Wellenlängen von 1 ,8 bis 3,4 μm.
Das mikronisierte Leguminosenprodukt kann in wässrigen Lösungen, eventuell nach Einstellen eines spezifischen pH-Wertes durch Rühren suspendiert werden, oder mittels Ultraturrax homogenisiert werden. In Produktionsprozessen erfolgt dies durch in-Line Homogenisatoren kurz vor der Sprühdüse um eine Auftrennung der Suspension zu vermeiden. Die so erhaltene Suspension kann auf jede Art von Partikel aufgesprüht werden. Die Partikel können z.B. aus Sprühtrocken-, Granulations-, Agglomerations- oder Extrudierprozessen stammen. Das Aufbringen der Coatingschicht kann dann im Batchverfahren in separaten Geräten wie Wirbelschichttrocknern, Coatern mit und ohne Wurster-Rohr, ProCell-Geräten, etc. oder auch kontinuierlich z.B. in einem Flachbettsprühtrockner im Anschluss an die Granulation oder Agglomeration oder bei einer ProCell Anlage in einer der hinteren Sprühkammern vor dem Endtrocknungsprozess durchgeführt werden. Bei allen Arten der Auftragung der Coatingschicht ist auf eine hohe Endtrocknung des Gesamtproduktes zu achten, die z.B. >90% Trockenmasse, bevorzugt >92%, noch bevorzugter >95%, am bevorzugtesten >97% Trockenmasse erreichen soll. Die aufgebrachte Masse an mikronisiertem Leguminosenprodukt kann dabei von 2 bis zu 50% (w/w) Trockenmasse bezogen auf den vorgelegten Protein enthaltenden Partikel betragen.
Bevorzugt ist das mikronisierte Leguminosenprodukt ein mikronisiertes Sojaprodukt und besonders bevorzugt das nachstehend beschriebene Produkt „microni- zed soja" von Micronizing Company (UK) Ltd.
Das zum Aufbringen einer Coatingschicht in den Beispielen verwendete mikroni- sierte Sojaprodukt wurde auf der Basis vollfetter Sojabohnen hergestellt.
Ein beispielhaftes mikronisiertes Sojaprodukt, das für die Zwecke der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, ist das Produkt „micronized soja" von Micronizing Company (UK) Ltd., Charnwood MiII, Framlingham, Suffolk, IP13 9PT (www.micronizing.com). Dieses Produkt wird durch Infrarotmikronisierung herge- stellt, wobei Infrarotlicht mit einer Wellenlänge von 1 ,8 bis 3,4 μm verwendet wird. Ein typischer Verarbeitungsprozess für dieses Produkt umfasst folgende Stufen:
- Die vorgereinigten Produkte werden auf einem Vibrationsförderer bei 12O0C gleichmäßig mit Infrarot gekocht wobei es zu einem starken Anstieg des Wasserdampfpartialdrucks kommt und so zu einem Aufschluss der enthaltenen Komponenten wie Proteine, Cellulose, Hemicellulose, etc.. Dabei wer- den auch antinutritive Faktoren, die z.B. in Soja vorkommen, inaktiviert und das Material erhält einen sehr hohen Nährwert als Tierfutter.
- Das aufgeheizte Produkt wird während einer zwischen 5 und 15 Minuten schwankenden Zeit in einem Behälter gelagert.
- Das Produkt wird nun in einer Hochleistungsmühle zu Flocken gemahlen und anschließend auf Raumtemperatur abgekühlt. Der Mahlprozess führt bei Soja und anderen ölhaltigen Samen und Saaten zu einem Aufschluss der Öl- körper und Freisetzung des enthaltenen Öls.
- Die Flocken werden durch einen Zerkleinerer gegeben, um Vollfettmehl zu bekommen. Die Partikelgröße der so erhaltenen Partikel für die Anwendung liegt unter 1 mm Durchmesser, besser unter 0,5 mm, noch besser unter 0,3 mm Durchmesser.
Es ist offensichtlich, dass dieses Verfahren oder ein entsprechendes Verfahren mit gleichem Ergebnis auch zur Mikronisierung von anderen Leguminosen verwendet werden kann. Dabei können Verfahrensparameter wie z.B. Temperatur und Zeit sowie die Abfolge der Verfahrensschritte in Abhängigkeit von der Art und der Menge der zu mikronisierenden Leguminose variiert werden. Derartige Variationen liegen im Bereich des Könnens eines Durchschnittsfachmanns und können durch einfache Routineversuche ermittelt werden. Wesentlich ist, dass durch das Mikronisieren, auch in Kombination mit dem Homogenisieren vor dem Aufsprü- hen, eine Reduzierung der Partikelgröße auf kleiner 1 mm Durchmesser, bevorzugt kleiner 0,5 mm Durchmesser, noch bevorzugter kleiner 0,3 mm Durchmesser erzielt wird.
Das mikronisierte Leguminosenprodukt wird in einer Menge im Bereich von 50% (w/w) bezogen auf die Trockenmasse der das biologisch aktive Protein enthaltenden Partikel und des mikronisierten Leguminosenprodukts, bevorzugt im Bereich von 2 bis 50%, bevorzugter im Bereich von 5 bis 35% und am bevorzugtesten im Bereich von 7 bis 25% aufgetragen. Dabei kann das mikronisierte Leguminosenprodukt als solches in wässriger Suspension aufgetragen werden oder homogenisiert und damit in feinerer Zerkleinerung als in reiner Suspension. Die Suspension wird bevorzugt mit Wasser hergestellt und kann vor dem Auftragen noch mit Puffersubstanzen und/oder Laugen und Säuren auf einen bestimmten pH- Wert gebracht werden, bzw. es können auch noch weitere Substanzen wie z.B. Salze zugesetzt werden um die Wirkung des mikronisierten Leguminosenprodukts zu verbessern.
Erfindungsgemäß umfasst der Kern, auf den die Coatingschicht aus mikronisier- tem Leguminosenprodukt aufgetragen wird, mindestens ein biologisch aktives Protein, gegebenenfalls zusammen mit technologisch notwendigen und sinnvollen Stoffen. Es können aber auch Kombinationen aus mehreren biologisch aktiven Proteinen enthalten sein, gegebenenfalls zusammen mit technologisch notwendi- gen und sinnvollen Hilfsstoffen. Bevorzugt ist das biologisch aktive Protein hitzelabil. Bevorzugt ist das biologisch aktive Protein ein Enzym. Der Kern kann auch nur aus dem biologisch aktiven Protein bestehen.
Bevorzugt ist dieses Enzym ausgewählt aus Phytasen, Phosphatasen, alpha- Galactosidasen, beta-Galactosidasen, Laccasen, Phospholipasen, Endoglukana- sen, insbesondere endo-beta-1 ,4-Glucanasen, endo-beta-1 ,3(4)-Glucanasen, en- do-1 ,2-beta-Glucanasen und endo-1 ,3-alpha-Glucanasen, Cellulasen, Xylosida- sen, Galactanasen, insbesondere Arabinogalactan-endo-1 ,4-beta-Galactosidasen und Arabinogalactan-endo-1 ,3-beta-Galactosidasen, Pectin-abbauenden Enzy- men, insbesondere Pectinasen, Pectinesterasen, Pectinlyasen, Polygalacturona- sen, Arabananasen, Rhamnogalacturonasen, Rhamnogalacturonanacetylestera- sen, Rhamnogalacturonan-alpha-Rhamnosidasen, Pectatlyasen und alpha-
Galacturonidasen, Mannanasen, beta-Mannosidasen, Mannanacetylesterasen,
Xylanacetylesterasen, Proteasen, andere Xylanasen, Arabinoxylanasen, lipolyti- sehen Enzymen wie Lipasen, Digalactosid-Diglycerid Esterasen und Cutinasen, und andere Enzyme wie Laccasen und Transglutaminasen. Besonders bevorzugt ist das Enzym ausgewählt aus Phytasen, Endoglucanasen, Xylanasen oder Phosphatasen.
Der Kern, der mindestens ein biologisch aktives Protein umfasst, kann noch weite- re Träger- und Hilfssubstanzen enthalten, beispielsweise partiell hydrolysierte Stärkeprodukte wie Maisstärke, Weizenstärke, etc., proteinhaltige Substanzen wie z.B. Magermilchpulver, Caseinhydrolysate, Hefehydrolysate oder Autolysate, andere pflanzliche Inhaltsstoffe wie z.B. Cellulose, Hemicellulose oder ligninhaltige Komponenten und Zellextrakte, organische und anorganische Salze wie z.B. CaI- ciumpropionat, Citronensäure oder Salze der Citronensäure, puffernde Substanzen, Säuren und Laugen zur Einstellung des pH-Wertes.
Durch das erfindungsgemäße Aufbringen einer Coatingschicht aus mikronisiertem Leguminosenprodukt wird dem so umhüllten biologisch aktiven Protein eine er- höhte Temperaturstabilität (Thermostabilität) verliehen. Durch die verliehene erhöhte Thermostabilität erhalten die biologisch aktiven Proteine unter Bedingungen ihre Aktivität, unter denen üblicherweise eine teilweise oder vollständige Inaktivie- rung des Proteins eintreten würde. Die den Proteinen verliehene Thermostabilität ermöglicht so deren Weiterverarbeitung unter thermischen Bedingungen, die an- sonsten zur Inaktivierung des biologisch aktiven Proteins führen würden, sowie eine entsprechend längere Lagerzeit bzw. eine Lagerung bei erhöhter Temperatur. Die Umhüllung verhindert auch den Kontakt des Proteins mit anderen Stoffen, die möglicherweise inhibierend auf das eingeschlossene Protein während der Weiterverarbeitung bzw. der Lagerung, wirken können.
Für die erfindungsgemäß erzielte erhöhte Thermostabilität ist von besonderer Bedeutung, dass der Kern, der mindestens ein biologisch aktives Protein umfasst, vollständig von der Coatingschicht aus mikronisiertem Leguminosenprodukt umhüllt ist. Üblicherweise wird eine solche deckende Umhüllung der das biologisch aktive Protein enthaltenden Ausgangssubstanz durch sorgfältige Verfahrensführung beim Aufbringen der Coatingschicht erzielt. Es ist vorstellbar, dass das mikronisierte Leguminosenprodukt sich aufgrund des mikronisierten Zustands be- sonders vollständig um die Ausgangspartikel legt. Auch die Verwendung des mikronisierten Leguminosenprodukts innerhalb der vorstehend angegebenen Mengenbereiche trägt zu einer möglichst vollständigen Umhüllung des Ausgangsmaterials bei. Die aufzubringende Menge an mikronisiertem Legumino- senprodukt ist bezogen auf die Masse des Protein-enthaltenden Stoffes umso größer, je kleiner die Partikelgröße des Protein-enthaltenden Stoffes ist. Dies ist durch das Verhältnis Volumen zu Oberfläche bedingt. Die Oberfläche ist im Vergleich zum Volumen bei kleinen Partikeln größer als bei großen Partikeln.
Aufgrund der durch die Coatingschicht aus einem mikronisierten Leguminosenprodukt verliehene erhöhte Temperaturstabilität eignet sich derartig vorbehandeltes Ausgangsmaterial besonders gut zur Anwendung in Verfahren zur Verwendung von Stoffen mit kleiner Korngröße, insbesondere zur Herstellung von pelleti- sierten Produkten. Insbesondere Tierfuttermittel werden sehr oft in pelletisiertem Zustand verwendet. Da bei den Pelletisierbedingungen regelmäßig erhöhte Temperaturen auftreten, bietet das erfindungsgemäße Verfahren bzw. die erfindungsgemäße Verwendung die Möglichkeit einer Herstellung von pelletisierten Tierfutterprodukten unter maximalem Erhalt der biologischen Aktivität der jeweils verwendeten Proteine.
Die erfindungsgemäß erhaltenen beschichteten (gecoateten) proteinhaltigen Stoffe bzw. Partikel bzw. Teilchen können als solche oder in verarbeiteter Form weiteren Verwendungen zugeführt werden. Zum Beispiel können sie in ein Tierfuttermittel, Lebensmittel oder Arzneimittel eingearbeitet werden. Entsprechende Ver- fahren und Anwendungen sind einem Fachmann gut bekannt.
Die beigefügten Figuren erläutern die Erfindung näher:
Die Figur 1 zeigt eine schematische Zeichnung eines Dampferzeugers (Streamer; Laborgerät). Die Figur 2 zeigt ein typisches Temperaturprofil von Futter/Enzymproben in einem Dampferzeuger unter Bedingungen, die den 80°C-Bedingungen von Verfahren A) (siehe nachstehend) entsprechen.
Die Figur 3 zeigt den Einfluss der Coatingschicht auf die Thermostabilität von saurer Phosphatase nach Einstellung des pH-Werts mit verschiedenen Säuren.
Die Figur 4 zeigt die Aktivitätswiederfindung nach einer thermischen Belastung mittels eines Laborstreamers an einem Endoglucanasegranulat mit und ohne Zu- satz an Glucidex vor dem Aufbringen auf einen Glucidexkern und mit anschließendem Coating mit 10% (w/w), Trockenmasse mikronisiertem Soja.
Die Erfindung wird anhand der nachstehenden Beispiele näher erläutert:
Beispiele
Referenzbeispiel 1 : Bestimmung der Phytaseaktivität
Die Phytaseaktivität wird in einem Assay-Gemisch enthaltend 0,5% (w/w) Phytin- säure (etwa 5 mM), 200 mM Natriumcitrat, pH 5,0 gemessen. Nach 15-minütiger
Inkubation bei 370C wird die Reaktion durch Zugabe eines gleichen Volumens
15% (v/v) Trichloressigsäure gestoppt. Die freigesetzten Phosphationen werden durch Mischen von 100 μl des Assay-Gemisches mit 900 μl H2O und 1 ml 0,6 M
H2SO4, 2% (w/v) Ascorbinsäure und 0,5% (w/v) Ammoniummolybdat nach Inkuba- tion bei 5O0C und einer Dauer von 20 min bei 820 nm quantitativ bestimmt. Dabei werden Kaliumphosphat-Standardlösungen als Referenz verwendet.
Referenzbeispiel 2: Bestimmung der sauren Phosphataseaktivität
Die Bestimmung der sauren Phosphataseaktivität erfolgt analog zu der Bestimmung der Phytase in Referenzbeispiel 1 mit dem Unterschied, dass die Substratlösung 10 mM α-Glycerophosphat in 250 mM Glycin/HCl Puffer, pH 2,5 ist. Referenzbeispiel 3: Bestimmung der Endo-ß-1 ,4-Glukanaseaktivität
ß-Glukanase hydrolysiert die glycosidischen Bindungen in gelöstem Gersten- Glukan. Die freigesetzten reduzierenden Zucker reagieren mit dem DNS-Reagenz zu einem Farbkomplex, dessen Gehalt photometrisch bei 540 nm bestimmt wird.
1 Einheit der ß-Glukanaseaktivität ist definiert als die Menge an Enzym, die benötigt wird, um 1 μmol an Glukose reduzierenden Zuckeräquivalenten pro Minute unter definierten Bedingungen frei zu setzen. Die Enzymreaktion wird bei pH 5,5 und 400C durchgeführt.
DNS-Reagenz:
10 g NaOH Pellets und 200 g Natriumtartrat werden in 800 ml deionisiertem Was- ser gelöst. Nach Zugabe von 10 g 3,5-Dinitrosalicylsäuremethylester (DNS) wird 1 h bei 30-400C gerührt und auf 1 I aufgefüllt.
Gersten-Glukan Substratlösung:
1 g Gersten-Glukan (Megazyme # P-BGBM) wird in 60-70 ml deionisiertem Was- ser suspendiert und dann unter Rühren auf 80-850C erwärmt bis das Glucan gelöst ist. Anschließend wird auf Raumtemperatur unter Rühren abgekühlt. Nach Zugabe von 10 ml Puffer, pH 5,5 wird auf 100 ml aufgefüllt.
Zur Bestimmung der ß-Glukanaseaktivität wird ein Ansatz von 0,9 ml Substratlö- sung und 0,1 ml verdünnter Enzymlösung für 15 min bei 400C inkubiert. Nach Zugabe von 1 ,5 ml DNS-Reagenz wird der Ansatz für 20 min in einem kochenden Wasserbad erhitzt und anschließend auf Raumtemperatur abgekühlt. Nach Zugabe von 2 ml deionisiertem Wasser wird die optische Dichte bei 540 nm in einem Photometer bestimmt. Die Messung erfolgt gegen Blindwerte, die Wasser anstatt Enzymlösung verwenden. Die Berechnung der ß-Glukanaseaktivität erfolgt mittels einer Kalibrierkurve mit Glukose. Beispiel 1 : Aufbringen der Coatingschicht
Nachstehend sind zwei bevorzugte Ausführungsformen beschrieben, gemäß denen eine Coatingschicht aus einem mikronisierten Sojaprodukt aufgebracht wer- den kann. Dabei wird das vorstehend genannte Produkt „micronized soja" von Micronizing Company (UK) Ltd. eingesetzt. Diese Verfahrensvarianten sind in den Beispielen 3 bis 10 zitiert.
Das Aufbringen der Coatingschicht kann in folgenden Verfahrensvarianten erfol- gen:
Verfahren A): Aufbringen der Coatingschicht in einem Wirbelschichttrockner (Ae- rocoater) vom Typ Strea-1 , Firma Aeromatic-Fielder AG, Bubendorf, Schweiz
Bei diesem Verfahren wird das Aufbringen einer Coatingschicht, die mikronisiertes Sojaprodukt umfasst, auf ein Granulat, das ein biologisch aktives Protein enthält, in einem speziellen Wirbelschichttrockner vorgenommen. Bei dem Granulat handelt es sich um ein in an sich bekannter Weise hergestelltes Proteingranulat.
Ein Luftkompressor erzeugt trockene, fettfreie, auf 6 bar komprimierte Luft. Typische Chargengrößen an proteinhaltigem Granulat, die in dem Wirbelschichttrockner vom Typ Strea-1 verarbeitet werden können, lassen sich nach Standardverfahren bestimmen. Die Beschichtungs- bzw. Coating-Experimente werden in der Strea-1 mit Bodensprühvorrichtungen (Aerocoater) vorgenommen. Typische Chargengrößen liegen im Bereich zwischen 50 und 300 g Granulat. Die temperierte komprimierte Luft wird mit einem Druck von 0,6 bar mit einer 1 ,2 mm- Spraydüse, die im Zentrum der Luftverteilungsplatte am Boden angebracht ist, eingebracht. Die Luftverteilungsplatte ist so modifiziert, dass sich ein Luftfluss > 95% in das Zentrum ergibt und die verbleibenden 5% vollständig in die Randge- biete des Gefäßes fließen, um einen Kontakt des feuchten Granulats mit den Wänden zu verhindern. Ein kurzes Wursterrohr wird bei den meisten Beschich- tungsversuchen verwendet und wird 0,8 cm über der Luftverteilungsplatte ange- bracht. In einigen Versuchen kann der Flug des Granulats im Wursterrohr schwierig aufrechterhalten werden und die Beschichtung wird dann in Abwesenheit des Rohres vorgenommen. Typische Flussraten der Beschichtungsflüssigkeiten, die das suspendierte bzw. homogenisierte „micronized soja" enthalten, sind 1 bis 6 ml min"1. Die zum Besprühen benutzte Suspension war eine wässrige Suspension mit einer Trockenmasse zwischen 5% und 25% an „micronized soja", das kurz vor dem Versprühen mit Hilfe eines Ultraturrax homogenisiert wurde. Um ein Blockieren der Düse bei einer Ausführungsform mit Bodensprühvorrichtung zu verhindern, sollte die Lufteinlasstemperatur 600C während des Sprühens nicht über- schreiten. Nachdem das gesamte „micronized soja" aufgetragen wurde, wird die Lufteinlasstemperatur auf 80-950C erhöht, um das beschichtete Granulat auf einen Endwassergehalt von 5 bis 10% zu trocknen. Das so erhaltene Granulat kann als solches verwendet oder weiterverarbeitet werden.
Verfahren B): Aufbringen der Coatingschicht in einem Wirbelschichttrockner vom Typ GPCG1 , Firma Glatt Systemtechnik GmbH, Dresden, Deutschland
Bei diesem Verfahren wird das Aufbringen einer Coatingschicht, die ein mikroni- siertes Sojaprodukt umfasst, auf ein Granulat, das ein biologisch aktives Protein enthält, in einem speziellen Wirbelschichttrockner vorgenommen. Bei dem Granulat handelt es sich um ein in an sich bekannter Weise hergestelltes Proteingranulat.
Größere Mengen an Granulaten, die z.B. aus einem industriellen Prozess mit ei- nem Sprühgranulator, Typ SBD 76, Firma APV Anhydro AS, Dänemark, stammen, werden in einer GPCG1 , Glatt, im Top- bzw. Bottomsprayverfahren gecoated. Dazu werden je Versuch ca. 500 g Proteingranulat in der GPCG1 vorgelegt. Die Coa- tingbedingungen sind wie folgt:
Top-Spray Coating:
Granulattemperatur: 40 - 43°C Lufttemperatur 55°C Bottom-Spray Coating: Granulattemperatur: 38 - 400C Lufttemperatur 55°C
Das „micronized soja" wird in Wasser zu einer 10% (w/w) Suspension angerührt und durch einen in-line Homogenisator vor dem Einsprühen homogenisiert. Die Sprührate der homogenisierten mikronisierten Sojasuspension wird so eingestellt, dass es nicht zu einer Koagulation von Granulat kommt und die Partikelgrö- ße des vorgelegten Granulats sich damit nur unwesentlich durch die Umhüllung ändert. Die typische Sprührate für die Suspension beträgt dabei ca. 5-15 ml min"1. Zum Ein- und Aufbringen der 10%igen (w/w) mikronisierten Soja-Suspension wird eine Zweistrahldüse benutzt. Das Coating beträgt üblicherweise 10% (w/w) bezogen auf die Trockenmasse des vorgelegten Granulats, kann jedoch auch zwischen 5 und 30% (w/w) betragen.
Beispiel 2: Durchführung der thermischen Belastungstests
Die in mit „micronized soja" beschichteten Produkte enthaltenen Proteine, insbe- sondere Enzyme können nach den folgenden Verfahren auf ihre Thermostabilität getestet werden. Dabei werden die gecoateten Produkte einer thermischen Belastung in einem der unten beschriebenen Verfahren unterzogen. Diese Verfahren betreffen beispielhaft das Testen der Thermostabiliät von Partikeln, die ein Enzym enthalten. In analoger Weise kann die Thermostabilität von Partikeln, die andere biologisch aktive Proteine enthalten, getestet werden.
In den nachstehenden Verfahren wird die den herzustellenden Endprodukten zugegebene Enzymaktivität vor und nach der thermischen Belastung durch eine für das zu testende Enzym spezifische Meßmethode bestimmt (siehe Referenzbei- spiele 1-3). Die nach der thermischen Belastung wiedergefundene Enzymaktivität wird als Prozentsatz der eingesetzten Enzymaktivität in Form der prozentualen Wiederfindung angegeben. Die thermischen Belastungen werden zum Aufzeigen der Wirksamkeit der Coatingschicht mit ungecoatetem und gecoatetem Material durchgeführt und miteinander verglichen.
Verfahren A): Testen der Thermostabilität in einer Pilotpelletieraniage (durchführ- bar am Biotechnologischen Institut des Research Institutes for Food and Molecu- lar Biotechnology, Kolding, Dänemark; der Test kann auch in einer anderen entsprechenden Pelletieranlage durchgeführt werden.)
Gecoatete bzw. ungecoatete Granulate enthaltend die Enzyme pilzliche oder bak- terielle Phytase, saure Phosphatase oder Endoglucanase und hergestellt nach den Verfahren A) bzw. B) aus dem Beispiel 1 werden mit Weizenmehl Typ 550 vorgemischt, um 300 g einer enzymhaltigen Vormischung zu erhalten. Diese Vormischung wird am Biotechnologischen Institut des Research Institutes for Food and Molecular Biotechnology, Kolding mit 15 kg Tierfutter vermischt, um eine op- timale Verdünnung für die Einmischung in 285 kg Tierfutter und eine gut bestimmbare Enzymaktivität in dem pelletierten Material zu gewährleisten. Die eingesetzte Menge an gecoatetem Granulat beträgt bei den meisten Versuchen je nach Aktivitätshöhe des im gecoateten Material enthaltenen Enzyms zwischen 0,1 und 10 g je kg Tierfutter und führt dabei zu einer Enzymaktivität von ca. 5 Einhei- ten (U) g"1 Tierfutter bei Phytase, bzw. ca. 6 Einheiten (U) g"1 bei saurer Phosphatase oder ca. 230 - 270 Einheiten (U) g'1 bei Endoglucanase. Die 300 kg Tierfutter, die in der Pelletieranlage behandelt werden, haben die Zusammensetzung von Tabelle 1.
Tabelle 1 : Zusammensetzung des zu pelletierenden Tierfutters
Figure imgf000019_0001
* mit pilzlicher oder bakterieller Phytase, saurer Phosphatase oder Endoglucanase
Die Pelletierbedingungen sind wie folgt:
Horizontalmischer mit 700 I Volumen, 48 UpM; Die Menge, die gemischt wird, liegt im Bereich 80 bis 300 kg.
An den Mischer angeschlossen ist eine Horizontalförderschnecke zum Entleeren des Mischers, deren Fördergeschwindigkeit an den nachfolgenden Schritt ange- passt ist.
Der Mischer ist ein Kahl Kaskadenmischer (Konditionierer) mit 130 cm Länge, 30 cm Durchmesser, 155 UpM und 37 Kammern. Der Durchsatz beträgt 300 kg pro Stunde. Futtermittel und erfindungsgemäße enzymhaltige Partikel haben ca. 30 s Kontakt mit Nassdampf. (Die Bedingungen bezüglich Dampf und Temperatur sind in Tabelle 2 angegeben.)
Der Dampf, der durch einen Dan Stoker Hochdruckkessel bereitgestellt wird, strömt mit 2 bar Überdruck durch ein Druckregulationsventil in den Kaskadenmischer. Das Ventil regelt die Menge Dampf, die in den Kaskadenmischer einströmt und dort zur Erwärmung des enzymhaltigen Futtermittels führt.
Das konditionierte Material wird durch eine Simon-Heesen-Presse pelletiert und
.-1 anschließend in einer mit 1500 m h durchströmten perforierten Box durch Luft gekühlt. Die Pelletierpresse läuft mit 500 UpM bei einer Leistungsaufnahme von 7,5 kW und erzeugt dabei Pellets von 3 x 20 mm.
Tabelle 2: Dampfkonditionen zum Erzielen der verschiedenen Temperaturen beim Pelletieren von Tierfutter, das die erfindungsgemäßen Partikel enthält, in der Anlage am Biotechnologischen Institut des Research Institutes for Food and Molecu Ia r Biotechnology, Kolding, Dänemark
Figure imgf000020_0001
Die thermische Belastung zum Testen der Thermostabilität von gecoateten Partikeln kann entsprechend auch in anderen Anlagen durchgeführt werden. Anschließend wird die noch vorhandene Enzymaktivität in den gecoateten und den unge- coateten Partikeln im pelletierten Tierfutter gemäß den Referenzbeispielen 1-3 bestimmt.
Verfahren B): Durchführung der thermischen Belastungstests in einem Laborgerät - Laborsteamer
Thermische Belastungstests, kurz Thermostabilitätstests, die in geschlossenen Gefäßen durchgeführt werden, geben bestenfalls einen Hinweis auf eine Erhöhung der Lagerungsstabilität, da sie als ein beschleunigter Lagerungstest wirken. Um jedoch eine erhöhte Thermostabilität unter den Pelletierbedingungen für Futtermittel zu testen, wurde ein Laborverfahren entwickelt, mit dem zuverlässig die Thermostabilität von Enzymen bei Einarbeitung in Futtermittel und Belastung un- ter den in einer Futtermühle auftretenden Bedingungen (siehe Verfahren A) be- stimmt werden kann. Es wurde gefunden, dass der Hauptteil der Enzyminaktivie- rung eintritt, wenn Enzym-enthaltende Futtermittel einer erhöhten Temperatur und Feuchtigkeit ausgesetzt sind, also unter Bedingungen, die während der Dampf- konditionierung von Futter auftreten. Um diesen Grad an Inaktivierung zu bestim- men, wird ein Enzymgranulat in Tierfutter einer Dampfhitze in einer Vorrichtung im Laboratoriumsmaßstab unterworfen. Das Verfahren ist für eine definierte Temperatur (75-85°C) ausgelegt. Eine Vorrichtung, in der solche Tests durchgeführt werden können, ist in Figur 1 dargestellt und besteht aus einem Messinggefäß mit einem perforierten Einsatz auf den das Futtermittel eingebracht wird und enthält weiterhin einen Mechanismus, um Dampf in das Futtermittel einzubringen. Dampf wird mit 4,7 bar Druck aus einem herkömmlichen Dampferzeuger (Euroflex) eingespeist. Die Menge an Dampf, die in das Gefäß eintritt, wird durch die zwei Kontrollventile reguliert, die auch die Entfernung von Wasserkondensat aus dem Teil des Gefäßes unter dem Einsatz mit dem Futtermittel regulieren. Von Bedeutung ist, dass die Dampfleitungen frei von Kondensat sind und vor Anbringung an dem Messinggefäß bereits auf Betriebstemperatur sind.
Das Gefäß wird mit dem zu testenden Futter (50-100 g, typischerweise 50 g, Zusammensetzung siehe Tabelle 1), das die erfindungsgemäßen enzymhaltigen Partikel enthält, beschickt und Dampf wird in das Gefäß eingeleitet. Die Probe wird mit einer langen Hantel, die entweder am Ende ein Thermoelement besitzt, gerührt oder das Thermoelement wird separat an einer Sonde in das Tierfutter geführt. Die in der Futterprobe erhaltene Temperatur wird durch Verbinden der Sonde an einen Datenlogger (DrDAQ, Firma Pico Technology, UK) nach A/D- Wandlung des Messsignals konstant mittels eines Personal Computers aufgezeichnet.
Wenn die gewünschte Temperatur erreicht ist (üblicherweise 800C oder 85°C), wird die Temperatur 30 bis 60 Sekunden gehalten, das Futtermittel aus dem Ge- faß entnommen und in einem flachen Plastikbehälter abgekühlt. Typische Temperaturprofile für diese Tests bei 800C sind in Figur 2 dargestellt (Temperaturprofil von Futtermittel/Enzymproben in einem Dampf entsprechend den Bedingungen von 800C in einem Verfahren gemäß Verfahren A)). Die erreichte Maximaltemperatur und die Zeitspanne, für die diese Temperatur gehalten wird, kann durch Schalten der Ventile und/oder Regulieren der abgegebenen Dampfmenge reguliert werden.
Die Versuche zur Thermobelastung wurden in dem Laborgerät immer mindestens als Doppelbestimmungen durchgeführt. Die Flächen unter den Temperaturkurven wurden integriert, um festzustellen, ob wiederholte Proben der gleichen Gesamt- Thermobelastung unterworfen worden sind. Wichtig ist jedoch die Haltezeit bei der festgelegten Temperatur von 80°C bzw. 85°C. Die noch vorhandene Enzymaktivität in den gecoateten bzw. ungecoateten Partikeln in der Mischung wird gemäß den Referenzbeispielen 1-3 bestimmt.
Beispiel 3: Temperaturstabilität der Phytase eines filamentösen Pilzes
Teil A
UF-Konzentrat von Aspergillus niger war. awamori-Phytase, hergestellt mit einem rekombinanten Trichoderma reese/'-Stamm gemäß beispielsweise WO 94/03612 wurde mit verschiedenen in dem UF-Konzentrat aufgelösten Zusätzen in einem APV-Sprühgranulator (vgl. Beispiel 1 , Verfahren B)) getrocknet und dann nach dem Verfahren gemäß Beispiel 1 , Verfahren B) gecoated. Die Granulate, die im Topsprayverfahren gecoated wurden, enthielten 15% (w/w) Zitronensäure bezogen auf die Trockenmasse des UF Konzentrates und der pH-Wert war auf pH 3 eingestellt. Das per Bottomsprayverfahren gecoatete Granulat enthielt darüber hinaus noch 10% (w/w) Maltodextrin, das vor dem Trocknen in dem UF- Konzentrat gelöst wurde. Alle so eingestellten UF-Konzentrate wurden bei Sprühdrücken von 80 bis 180 bar in den APV Trockner eingedüst. Die daraus resultierenden Partikelgrößen lagen für alle hergestellten Granulate zwischen 200 und 300 μm. Es wurden thermische Belastungstests (kurz Thermostabilitätstests) ge- maß Beispiel 2, Verfahren A) durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengestellt. Tabelle 3: Erhöhung der Hitzestabilität von Aspergillus-Phytase in Granulaten durch Coaten mit 10% (w/w) „micronized soja". Zur Einstellung des pH- Wertes des UF-Konzentrates vor der Sprühgranulierung wurde Zitronensäure verwendet.
Figure imgf000023_0001
Die Teilchengröße aller ungecoateten und gecoateten Produkte lag zwischen 200 und 300 μm gemessen mittels Laserbeugung auf einem Malvern-Gerät. Die Ergebnisse in Tabelle 3 zeigen, dass eine Erhöhung der Thermostabilität des in den gecoateten Partikeln eingeschlossenen Enzyms unter den thermischen Belastungen wie sie im Pelletierprozess vorliegen unabhängig von den gewählten Zusätzen in dem UF-Filtrat erhalten wird. Ferner hatte auch der Sprühdruck, der Größe und Form der entstehenden Sprühgranulate (Partikel mit Enzymaktivität) mit be- einflusst, keinen Einfluss auf die zu beobachtende Verbesserung der Thermostabilität des im gecoateten Sprühgranulat eingeschlossenen Enzyms im Pelletierprozess. Sowohl durch Topspray- wie auch durch Bottomsprayverfahren lassen sich erfindungsgemäße Partikel (Granulate) herstellen in denen das eingeschlossene Enzym bei der thermischen Belastung eine geringere Inaktivierung erfährt als in dem unbehandelten Partikel.
Teil B
Das UF-Konzentrat von Teil A wurde unter Zusatz von 50% (w/w) Magermilchpulver (30% Lactose) bezogen auf die Trockenmasse des UF-Konzentrats und nach Einstellung des pH-Wertes mit Natriumeitrat auf pH 5,1 in einer ProCel]5, Glatt, zu Sprühgranulat ohne Kern getrocknet. Dies geschieht durch das Einsprühen der genannten Lösung mit einer Trockenmasse von ca. 15-20% im Topsprayverfahren gegen den Luftstrom in der ProCellδ durch eine Zweistromdüse mit einer über den Batchprozess steigenden Einsprührate von 6 - 25 g min"1. Die Zulufttemperatur beträgt 70°-95°C bei einer Zuluftmenge von 90-100 m3 h"1 während des Einsprü- hens wobei die Produkttemperatur auf 500C gehalten wird. Nachdem die gesamte Lösung eingesprüht ist, wird die Zulufttemperatur auf max. 100°C erhöht für weitere 5 min, wobei die Produkttemperatur nicht über 55°C ansteigt, um den gewünschten Trockenmassengehalt von >95% in dem erzeugten Granulat zu erhalten. In einem Batchverfahren werden ca. 2 I der genannten Lösung zu Sprühgranulat verarbeitet. Die Partikelgröße der Sprühgranulate lag unter 300 μm. Die so erhaltenen Sprühgranulate wurden mittels des in Beispiel 1 A) beschriebenen Verfahrens mit einer 10% (w/w) homogenisierten Suspension an „micronized soja" gecoated, wobei die Umhüllung einen Anteil von 10% (w/w) bezogen auf die Trockenmasse der Sprühgranulate hatte. Es wurden thermische Belastungstests (Thermostabilitätstests) gemäß Beispiel 2, Verfahren A) durchgeführt. Die Ergebnisse der Aktivitätswiederfindung sind in Tabelle 4 zusammengestellt.
Tabelle 4: Erhöhung der Hitzestabilität von Aspergillus-Phytase in Granula- ten durch Coaten mit 10% (w/w) „micronized soja" wobei in dem UF-
Konzentrat Magermilchpulver vor dem Verarbeiten zu Sprühgranulat aufgelöst wurde.
Figure imgf000024_0001
Die Ergebnisse in Tabelle 4 zeigen, dass auch andere Zusätze als Zitronensäure zu Aspergillus Phytase bei der Trocknung sich vorteilhaft auf die Enzymstabilität auswirken können, im speziellen hier der Zusatz von Magermilchpulver. Jedoch wurde sowohl in Teil A wie auch in Teil B durch das Aufbringen einer Umhüllung aus „micronized soja" eine weitere Verbesserung der Thermostabilität des eingeschlossenen Enzyms erreicht, unabhängig von der Zusammensetzung des zu umhüllenden enzymhaltigen Sprühgranulats.
Beispiel 4: Wirkung des Umhüllungsgrads an mikronisiertem Soja auf die Thermostabilität der Phytase eines filamentösen Pilzes
Eine 10%ige Suspension von „micronized soja wurde in Wasser hergestellt wie sie auch zum Coaten in Beispiel 3 verwendet wurde. Durch Zentrifugation wurden die unlöslichen Bestandteile abgetrennt. Die so entstandene wasserlösliche Frak- tion wurde für einen Versuch eingesetzt, um zu überprüfen, ob die Wirkung der Erhöhung der Thermostabilität der eingeschlossenenen Phytase in den Thermo- belastungstests durch die im micronized Soja enthaltene Phytinsäure, dem Substrat der Phytase hervorgerufen wird. Es wurde der aliquote Anteil wie er beim Coaten zum Erzielen einer 10% w/w Umhüllung mit „micronized soja" notwendig ist verwendet. Als Enzymtestmaterial diente das Verkaufsprodukt FINASE® Pc der Firma ROAL Oy das aus einem UF Konzentrat nach Beispiel 3 hergestellt wird.
FINASE® PC wurde nach dem Verfahren gemäß Beispiel 1 , Verfahren A) gecoa- ted. Die thermische Belastung wurde nach dem Verfahren von Beispiel 2, Verfahren B) bei 800C für 30 Sekunden durchgeführt und anschließend die Restenzymaktivität in dem behandelten Material ermittelt.
Die Tabelle 5 zeigt die Wirkung von wässrigem Extrakt aus „micronized soja" auf die Thermostabilität des im Partikel enthaltenen Enzyms während des thermischen Belastungstests. Tabelle 5:
Figure imgf000026_0001
Wie aus einem Vergleich der Probe 1 mit 2 ersichtlich ist, hat ein „Coating" mit dem wässrigen Extrakt aus Soja keine stabilisierende Wirkung auf das Enzym im Sprühgranulat während des Pelletiervorgangs. Sojamehl ist reich an Phytinsäure, dem Substrat der Phytase. Phytinsäure wird eine stabilisierende Wirkung auf Phytase nachgesagt (WO 98/55599). Der vorliegende Versuch zeigt, dass die in Bei- spiel 3 erreichte Erhöhung der Thermostabilität, wie sie unter der Thermobelas- tung des Pelletierprozesses gezeigt werden konnte, nicht auf diesen Effekt zurückzuführen ist. Ein Eindringen von Phytinsäure in die Randschichten des Granulates wie sie beim Coaten stattfinden könnte, ist also nicht ausreichend um die beobachtete Erhöhung der Thermostabilität unter den Bedingungen des Pelletier- prozesses zu erklären.
Beispiel 5: Beschichtung bakterieller (E. coli) Phytase mit „micronized soja" in Sprühgranulaten mit Kern aus Glucidex
In dem vorliegenden Beispiel wird ein bakterielle (E. coli) Phytase-enthaltendes Sprühgranulat mit Kern aus Glucidex mit mikronisiertem Soja beschichtet. Granulation
800 g Glucidex 12 (Maisstärkehydrolysat der Firma Roquette, Frankreich, enthaltend 1% Glucose, 2% Disaccharide und 97% höhere Polysaccharide) wurden in der STREA 1 , Aeromatic Fielder, vorgelegt und mit 500 g UF-Konzentrat von E. co//-Phytase (pH 2,5, eingestellt mit Schwefelsäure), hergestellt mit einem rekom- binanten T. reese/'-Stamm (WO 2006/042719), besprüht.
Coating
Die Sprühgranulate wurden anschließend nach dem Verfahren von Beispiel 1 , Verfahren A) gecoated (5% (w/w) „micronized soja" bezogen auf Trockenmassen) und entsprechend der Methode aus Beispiel 2, Verfahren A) wurde die Thermo- stabilität der Phytase in den Sprühgranulaten getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt.
Tabelle 6: Erhöhung der Thermostabilität von E. coli -Phytase in Partikeln aus Sprühgranulation mit Glucidex 12-Kern durch Coaten mit „micronized soja"
Figure imgf000027_0001
Die Daten in Tabelle 6 zeigen, dass bereits durch das Aufbringen einer Coating- schicht aus „micronized soja" von 5% (w/w) bezogen auf die Trockenmasse des Sprühgranulates die Thermostabilität der E. coli Phytase in dem enzymhaltigen Sprühgranulat unter den Testbedingungen von Beispiel 2, Verfahren A) erhöht wurde.
Beispiel 6: Beschichtung eines bakterielle (E. coli) Phytase-enthaltenden Sprühgranulats ohne Kern
Das vorliegende Beispiel zeigt die Erhöhung der Thermostabilität bakterieller Phytase in einem Sprühgranulat ohne Kern durch das Aufbringen einer Beschichtung mit „micronized soja".
Granulation
In einem weiteren Test wurde 2 kg UF-Konzentrat von E. co//-Phytase (siehe Beispiel 5), in einer ProCellδ, Glatt, benutzt, um Sprühgranulate ohne Kern herzustellen (siehe Beispiel 3, Teil B). Dem UF-Konzentrat wurde 30% (w/w) Magermilch- pulver (30% Lactosegehalt) bezogen auf Gesamtprotein des UF-Konzentrates und 4,4 g Ca-Propionat zugegeben. Der pH-Wert wurde durch Korrektur mittels Schwefelsäure oder Natronlauge auf einen Wert von pH 5 eingestellt.
Coating Die Sprühgranulate wurden anschließend nach dem Verfahren von Beispiel 1 , Verfahren A) gecoated (10% (w/w) „micronized soja" bezogen auf Trockenmassen) und entsprechend der Methode aus Beispiel 2, Verfahren A) wurde die Ther- mobelastung durchgeführt und damit die Thermostabilität der Phytase in den Sprühgranulaten getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt.
Tabelle 7: Thermostabilität von E. co//-Phytase in Sprühgranulaten ohne GIu- cidex-Kern
Figure imgf000029_0001
Wie die Ergebnisse zeigen, ergibt sich für die in diesen mit „micronized soja" umhüllten Sprühgranulaten enthaltene Phytase eine erhöhte Thermostabilität unter den Bedingungen wie sie in den Pelletierversuchen herrschen.
Der Vergleich der Daten für die ungecoateten und die gecoateten Sprühgranulate von Beispiel 5 mit 6 zeigt, dass ein Glucidex-Kern nicht für die Erhöhung der Thermostabilität verantwortlich ist, wie sie durch das Aufbringen der Umhüllung mit „micronized soja" erhalten wird. Die Aktivitätswiederfindungen für die nicht umhüllten Partikel aus Beispiel 5 und 6 zeigen zwar eine unterschiedliche Verteilung der Thermostabilität des Enzyms unter den gewählten Testbedingungen, jedoch liegen die Ergebnisse auf ähnlichem Niveau und jeweils weit unter den Ergebnissen, die durch die Beschichtung mit „micronized soja" erzielt wurden. Ein Einfluss des Kerns konnte nicht nachgewiesen werden wie dies z.B. in WO 98/54980 und WO 00/24877 postuliert wird. Insbesondere WO 98/54980 schreibt dem Aufsaugen der Enzymlösung in ein Kohlenhydratpolymer und anschließendes Trocknen eine stabilisierende Wirkung auf das enthaltene Enzym bei einer Thermobelas- tung zu wie sie bei den Pelletierbedingungen beim Tierfutter auftreten. In dem hier ausgeführten Fall des Aufsprühens, also nicht Aufsaugens, einer Enzymlö- sung auf ein Kohlenhydratpolymer konnte diese stabilisierende Wirkung nicht erzielt werden.
Die Ergebnisse in diesem Beispiel zeigen auch, dass, obwohl in den Beispielen 3 und 6 Phytasen benutzt wurden, die Wirkung nicht auf spezielle Arten der Phyta- sen beschränkt ist. Es wurde in Beispiel 3 eine Phytase eines filamentösen Pilzes und in Beispiel 6 eine Phytase bakteriellen Ursprungs benutzt, die jedoch auf A- minosäurenebene nur eine Homologie von 18% aufweisen und daher als zwei völlig unabhängige Proteine zu betrachten sind.
Beispiel 7: Beschichtung eines Granulats eine sauere Phosphatase eines filamentösen Pilzes enthaltend
In dem vorliegenden Beispiel wurde die Erhöhung der Thermostabilität der sauren Phosphatase eines filamentösen Pilzes durch eine Beschichtung des Granulates mit „micronized soja" untersucht.
Granulation
200 ml UF-Konzentrat von Aspergillus niger pH 2,5 saurer Phosphatase, hergestellt mittels eines rekombinanten T. reese/-Stammes, z.B. nach WO 94/03612, wurde in der STREA 1 , Aeromatic Fielder, nach Einstellung des pH-Wertes mit HCl bzw. H2SO4, auf pH 4 auf 500 g Glucidex 12 sprühgetrocknet. Die bei der Einstellung des pH-Wertes mit Schwefelsäure ausfallende Menge an CaSO4 wurde durch Zentrifugation vor der Sprühgranulation abgetrennt.
Coatinq
Die Sprühgranulate wurden mit verschiedenen Mengen an „micronized soja" nach dem Verfahren von Beispiel 1 , Verfahren A) gecoated. Die Thermobelastung der sauren Phosphatase in den Sprühgranulaten wurde mit der in Beispiel 2, Verfahren B) genannten Methode bei 85°C, 60 s durchgeführt und durch Messen der danach vorliegenden Restaktivität die Thermostabilität bestimmt. Die Ergebnisse sind in Figur 3 dargestellt. Die in Figur 3 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die erzielte Erhöhung der Thermostabilität der sauren Phosphatase in den umhüllten Sprühgranulaten unter den Bedingungen des Pelletierprozesses nach Beispiel 2, Verfahren B) in direktem Zusammenhang mit der Menge an aufgebrachtem mikronisierten Soja steht.
Weiterhin konnte hier durch die Wahl der Säure gezeigt werden, dass die Menge an freiem Calcium im UF-Konzentrat, das sprühgranuliert wurde, keinen Einfluss auf die Thermostabilität des Enzyms hatte, im Gegensatz zu Phytase, einem mit der sauren Phosphatase sehr eng verwandten Enzym, wie in WO 97/05245, USo 5,972,669, US 5,827,709 sowie EP 0 758 018 gezeigt, wo der Zusatz an bivalenten Kationen wie Calcium, Magnesium oder Zink, insbesondere als Zusatz in Form anorganischer Salze zum UF Konzentrat während der Sprühgranulation zu einer Erhöhung der Thermostabilität der Phytase unter bestimmten Thermobelas- tungstests geführt hatten. Durch den Einsatz von Schwefelsäure bei der pH-5 Einstellung kommt es zu Ausfällungen von Calciumsulfat und damit zu einer Erniedrigung der Calciumkonzentration im Vergleich zu den UF-Konzentraten in denen die pH-Einstellung mit Salzsäure erfolgte.
Beispiel 8: Wirkung von Glucidex bzw. Magermilchpulver auf die Thermo-o Stabilität von saurer Phosphatase enthaltendem Granulat mit und ohne Be- schichtung mit mikronisiertem Soja
In dem vorliegenden Beispiel wurde der Einfluss der Zugabe von Glucidex und Magermilchpulver in das UF-Konzentrat bei der Sprühgranulation des Enzyms5 verglichen mit der Wirkung einer Umhüllungsschicht an mikronisiertem Soja auf die Thermostabilität eines gecoateten Sprühgranulats von saurer Phosphatase getestet.
Granulation o UF-Konzentrat von Aspergillus niger pH 2,5 saurer Phosphatase, hergestellt mittels eines rekombinanten T. reese/'-Stammes (siehe Beispiel 6), wurde in einer ProCellδ, Glatt, mit verschiedenen Zusätzen die in dem UF-Konzentrat gelöst wur- den (30% Glucidex, bzw. 50% Magermilchpulver [SMP]) zu Partikeln in der Größe bis zu 300 μm sprühgranuliert (siehe Beispiel 3, Teil B). Der pH-Wert der zum Sprühgranulieren verwendeten Lösungen betrug jeweils pH 4.
Coating
Das Coating wurde nach Beispiel 1 , Verfahren A) durchgeführt. Die aufgetragene Menge an „micronized soja" betrug 10% (w/w) bezogen auf die Trockenmasse. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 dargestellt.
Tabelle 8: Thermostabilität von ungecoateten und gecoateten Sprühgranulaten von saurer Phosphatase
Figure imgf000032_0001
n.d.: nicht bestimmt
Der Vergleich der Daten in Tabelle 8 zeigt, dass auch die Zusätze von Glucidex, bzw. Magermilchpulver zum UF-Konzentrat der sauren Phosphatase vor dem Sprühgranulieren einen stabilisierenden Einfluss auf die saure Phosphatase aus Aspergillus niger var. awamori in den Pelletierversuchen haben. Der Zusatz von Magermilchpulver in das UF-Konzentrat des Enzyms vor dem Sprühgranulieren erwies sich sowohl bei der E. coli Phytase als auch bei der sauren Phosphatase und der Phytase aus Aspergillus niger var. awamori als positiv bzgl. der Thermostabilität der Enzyme unter den Bedingungen im Pelletierversuch. Jedoch konnte in allen Fällen die Thermostabilität (ausgedrückt als %-Aktivitätswiederfindung) des Enzyms in den Sprühgranulaten durch das Aufbringen der Coatingschicht von „micronized soja" in dem Pelletierversuch weiter verbessert werden. Unabhängig vom verwendeten Aufbau bzw. Zusammensetzung des das Enzym enthaltenden Sprühgranulats kommt es also durch das Aufbringen an „micronized soja" zu einer Erhöhung der Thermostabilität des Enzyms im Gesamtpartikel.
Beispiel 9: Thermostabilität eines Endo-1,4-ß-Glucanase-Granulats mit GIu- cidexkern mit und ohne Beschichtung mit „micronized soja"
Im vorliegenden Beispiel wurde die Thermostabilität des Enzyms Endo-1 ,4-ß- Glucanase I aus Trichoderma reesei in einem Granulat mit einem Glucidexkem nach Beschichtung mit „micronized soja" bestimmt. Dieses Enzym zeigt zwei verschiedene Enzymaktivitäten - Endo-1 ,4-ß-Glucanase und eine gleich hohe Endo- ß-1 ,4-Xylanaseaktiität.
Granulation
UF-Konzentrat von Trichoderma reese/'-Endoglucanase 1 (Endo-1 ,4-ß- Glucanase), hergestellt mittels eines rekombinanten T. reese/'-Stammes (Karhu- nen et al., Mol Gen Genet 1993, 241 :515-522), wurde verwendet, um verschiede- ne Sprühgranulate in einer STREA-1 , Aeromatic Fielder, herzustellen. Die Sprühgranulate wurden durch Sprühtrocknen von 200 ml UF Konzentrat auf 500 g GIu- cidex 12-Kernmaterial, Roquette, Frankreich, erhalten bzw. durch Sprühtrocknen von 200 ml UF-Konzentrat in dem zusätzlich 10% (w/w) bezogen auf Trockenmasse Glucidex 12 vor dem Sprühtrocknen auf den Glucidexkem aufgelöst wur- den.
Coatinq
Die durch die Sprühtrocknung erhaltenen Granulate wurden nach dem Verfahren von Beispiel 1 , Verfahren A) durch Aufbringen einer 10% Suspension „micronized soja" gecoated. Der Anteil an Coatingmaterial betrug 10% (w/w) bezogen auf Trockenmasse des gecoateten Granulates. Die Erhöhung der Thermostabilität der in den Granulaten enthaltenen Endogluca- nase wurde gemäß dem Verfahren beschrieben in Beispiel 2, Verfahren B), bestimmt.
In Figur 4 ist die Aktivitätswiederfindung der Endoglucanase I in den Granulaten mit und ohne Aufbringen einer 10% Coating-Schicht an „micronized soja" nach Durchführung der thermischen Belastung im Laborgerät (Laborsteamer) dargestellt. Die erhaltene Thermostabilität der Endoglucanase I aus Trichoderma reesei ist in den thermischen Belastungstests auch abhängig von der Zugabe von Malto- dextrin in das UF-Konzentrat vor der Sprühtrocknung. Figur 4 zeigt, dass unabhängig vom verwendeten Aufbau des enzymhaltigen Granulats oder dem Zusatz in das UF-Konzentrat bei der Herstellung des enzymhaltigen Granulats, das Aufbringen von „micronized soja" in einem Coating-Verfahren zu einer Erhöhung der Thermostabilität des im gecoateten Granulat enthaltenen Enzyms unter den Test- bedingungen führt. Weiterhin ist die durch das Aufbringen der Coatingschicht erhaltene Thermostabilitätsverbesserung größer als die durch den Zusatz von 10% Glucidex 12 in das UF-Konzentrat beim Sprühtrocknen erhalten werden kann.
Beispiel 10: Thermostabilität von Endo-1,4-ß-Glucanase mit und ohne Be- Schichtung mit „micronized soja"
In dem vorliegenden Beispiel wurde die Thermostabilität von Endo-1 ,4-ß- Glucanase (Endoglucanase 1) in einem Sprühgranulat ohne Glucidex-Kern nach Beschichtung mit „micronized soja" untersucht.
Granulation
In UF-Konzentrat von Trichoderma reese/-Endoglucanase 1 , hergestellt mittels eines rekombinanten T. reese/-Stammes (Karhunen et al., Mol Gen Genet 1993, 241 :515-522), wurde 20% Glucidex 12 (w/w) bezogen auf Trockenmasse gelöst und der pH-Wert mit H2SO4ZNaOH auf pH 4,5 eingestellt. Dieses Konzentrat wurde in einer ProCellδ, Glatt, zu Sprühgranulaten in der Größe bis zu 300 μm getrocknet (siehe Beispiel 3, Teil B). Coating
Die Sprühgranulate wurden nach Beispiel 1 , Verfahren A) gecoated. Die aufgetragene Schicht an „micronized soja" betrug 10% (w/w) bezogen auf Trockenmasse. Die Ergebnisse der Aktivitätswiederfindung nach der thermischen Belastung nach Beispiel 2, Verfahren A) sind in Tabelle 9 dargestellt.
Tabelle 9: Thermostabilität von Endoglucanase I aus Trichoderma reesei mit und ohne Coating in Granulaten, die ohne Glucidex-Kern hergestellt wurden.
Figure imgf000035_0001
Die Daten in Tabelle 9 zeigen, dass die Thermostabilität der in dem Granulat eingeschlossenen Endoglucanase I aus Trichoderma reesei durch Umhüllung mit „micronized soja" auch ohne das Vorhandensein eines Kerns aus Glucidex verbessert werden kann. Ein Kern aus einem kohlenhydrathaltigen Material ist für die Verbesserung der Thermostabilität durch eine Umhüllung mit „micronized soja" keine Vorraussetzung.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Stoff mit erhöhter Temperaturstabilität, umfassend einen Kern und eine Coa- tingschicht, dadurch gekennzeich net, dass der Kern mindestens ein biologisch aktives Protein umfasst, und dass die Coatingschicht ein mikronisiertes Leguminosenprodukt umfasst.
2. Stoff nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das mikroni- sierte Leguminosenprodukt ein mikronisiertes Sojaprodukt ist.
3. Stoff nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch geke n nze ich net, dass der Kern weiterhin Maltodextrin umfasst.
4. Stoff nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch geke n n ze ich - n e t , dass der Kern weiterhin Magermilchpulver umfasst.
5. Stoff nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch geke n n ze ich net, dass das biologisch aktive Protein ein Enzym ist.
6. Stoff nach Anspruch 5, dadurch geke n nzeich net, dass das Enzym ausgewählt ist aus Phytasen, Endoglucanasen, Xylanasen oder Phosphatasen.
7. Stoff nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch geken nzeich- n e t , dass die Coatingschicht 2-50% (w/w) bezogen auf die Gesamt- Trocken masse des Stoffs beträgt.
8. Stoff nach Anspruch 7, dadurch geke n nzeich net , dass die Coatingschicht 2-30% (w/w) beträgt.
9. Stoff nach Anspruch 8, dadurch geken nzeich net , dass die Coatingschicht 5-25% (w/w) beträgt.
10. Tierfuttermittelzusammensetzung, dadurch ge ke n nze ich net , dass sie einen Stoff nach Anspruch 1 bis 9 umfasst oder daraus besteht.
11. Lebensmittelzusammensetzung, dadurch geke n nzei ch net , dass sie einen Stoff nach Anspruch 1 bis 9 umfasst oder daraus besteht.
12. Arzneimittelzusammensetzung, dadurch geken nzeich net, dass sie einen Stoff nach Anspruch 1 bis 9 umfasst oder daraus besteht.
13. Verfahren zur Herstellung eines Stoffs nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch geke n nzeich net, dass man auf einen Kern, der mindestens ein biologisch aktives Protein umfasst, eine Lösung, die ein mikronisiertes Leguminosenprodukt umfasst, aufbringt und die so erhaltenen beschichteten Partikel trocknet.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeich net, dass das Aufbringen und Trocknen der Lösung, die ein mikronisiertes Leguminosenprodukt umfasst, in einem Wirbelschichttrockner erfolgt.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 oder 14, dadurch geken nzeichnet, dass das mikronisierte Leguminosenprodukt ein mikronisiertes Sojaprodukt ist.
16. Verwendung eines mikronisierten Leguminosenprodukts zur Erhöhung der Temperaturstabilität von biologisch aktiven Proteinen in Verfahren zur Herstellung eines granulierten Produkts.
17. Verwendung eines mikronisierten Leguminosenprodukts zur Erhöhung der Temperaturstabilität von biologisch aktiven Proteinen in Verfahren zur Herstellung von Tierfutter.
18. Verwendung eines mikronisierten Leguminosenprodukts zur Erhöhung der Temperaturstabilität von biologisch aktiven Proteinen in Verfahren zur Herstellung eines Lebensmittels.
19. Verwendung eines mikronisierten Leguminosenprodukts zur Erhöhung der Temperaturstabilität von biologisch aktiven Proteinen in Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels.
20. Verwendung nach einem der Ansprüche 16, 17, 18 oder 19, dadurch g e - ken nzeichnet, dass das mikronisierte Leguminosenprodukt ein mikroni- siertes Sojaprodukt ist.
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