HUT75662A - Use of a thermostable enzyme as a feed additive - Google Patents
Use of a thermostable enzyme as a feed additive Download PDFInfo
- Publication number
- HUT75662A HUT75662A HU9602980A HU9602980A HUT75662A HU T75662 A HUT75662 A HU T75662A HU 9602980 A HU9602980 A HU 9602980A HU 9602980 A HU9602980 A HU 9602980A HU T75662 A HUT75662 A HU T75662A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- xylanase
- feed
- activity
- cereal
- viscosity
- Prior art date
Links
Classifications
-
- D—TEXTILES; PAPER
- D21—PAPER-MAKING; PRODUCTION OF CELLULOSE
- D21C—PRODUCTION OF CELLULOSE BY REMOVING NON-CELLULOSE SUBSTANCES FROM CELLULOSE-CONTAINING MATERIALS; REGENERATION OF PULPING LIQUORS; APPARATUS THEREFOR
- D21C5/00—Other processes for obtaining cellulose, e.g. cooking cotton linters ; Processes characterised by the choice of cellulose-containing starting materials
- D21C5/005—Treatment of cellulose-containing material with microorganisms or enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
- C12N9/248—Xylanases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01008—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01032—Xylan endo-1,3-beta-xylosidase (3.2.1.32), i.e. endo-1-3-beta-xylanase
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S426/00—Food or edible material: processes, compositions, and products
- Y10S426/807—Poultry or ruminant feed
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Paper (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Fodder In General (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
A találmány tárgya egy enzim alkalmazása adalékként állati takarmányokhoz, különösen olyan enzim alkalmazása, amely hőstabil, azaz aktivitása nem csökken jelentősen a viszonylag magas hőmérsékletű takarmányfeldolgozás során. A találmány tárgya továbbá takarmányadalék, valamint gabonaalapú takarmány, amely egy hőstabil enzimet tartalmaz.
Állandóan folynak kutatások az állati takarmányok olyan javítására, amely lehetővé teszi, hogy az állatok a takarmányt hatékonyabban emésszék meg. A fő irányok egyike, hogy a takarmányátalakítási arányt [Feed Conversion Ratio (FCR)] javítsák anélkül, hogy a tömegegységre eső ár növekedne. A takarmány FCR értéke az elfogyasztott takarmány mennyiségének és az állat tömegnövekedésének arányát jelenti. Az alacsony FCR azt jelenti, hogy a takarmány egy adott mennyisége a fejlődő állat viszonylag nagyobb tömegnövekedését eredményezi. Ez azt jelenti, hogy az állat hatékonyabban tudja a takarmányt hasznosítani. Az FCR csökkentésének egyik módja az, hogy fokozzák annak emészthetőségét az állat által, ezáltal növelik az állat táplálékhasznosítását.
Egy takarmány tápanyag-komponenseinek, például keményítő-, zsír-, protein- és aminosavtartalmának emészthetőségét különféle tényezők korlátozzák, ezek (i) az állat belében jelenlévő anyagok viszokitása. Ez a viszkozitás - legalábbis részben - az oldható, nem-keményítő típusú poliszacharidoknak, például a vegyesen kötött β-glükánoknak és arabinoxilánoknak tulajdonítható;
(ii) a tápanyagok a takarmány sejtfalán belül, különösen a gabonafélék aleuron-rétegén belül rekednek. Ezt a bennrekedést • · · ·
- 3 a gabonafélék sejtfalában lévő, nem-keményítő jellegű poliszacharidok magas koncentrációja okozza, amelyek viszonylag ellenállnak az állatok emésztőrendszere általi lebontásnak. Ez megakadályozza, hogy a sejtbezárt tápanyagok az állat számára táplálékként hozzáférhetők legyenek; és (iii) mind az állat, mind a bél-mikroorganizmus populáció endogén enzimaktivitásának hiánya, különösen fiatal állatokban. Az emészthetőséget zavaró fenti problémák különösen figyelemreméltóak a gabonaalapú takarmányok, például a magas búzatartalmú takarmányok esetében.
A takarmányok tápanyagainak való rossz emészthetősége miatt rendszerint a takarmányokat úgy kell összeállítani, hogy nagyobb koncentrációban tartalmazzanak energia- és protein-tartalmú anyagokat, hogy az állat tápanyagszükségletét kielégítsék.
Sikerült bebizonyítanunk, hogy bizonyos kiegészítő enzimek bevitele a gabonaalapú állati takarmányokba előnyösen csökkenti az állat belében jelenlévő anyag viszkozitását. Ez a csökkenés enzimekkel, például xilanázokkal érhető el, amelyek az oldható xilánokat hidrolizálják, ezáltal csökkentik az emésztett anyag viszkozitását, ami jelentős korlátozó tényező az emésztés folyamatában.
Az adalékként hozzáadott xilanázoknak stabilnak és aktívnak kell lenniük az állat gyomor-bél-rendszerében (GI) található pH és hőmérsékletviszonyok között. Ha ezek az enzimek nem stabilak és nem aktívak akkor, amikor ilyen in vivő körülmények közé kerülnek, nem lesznek képesek jelentős mértékben csökkenteni az emésztett anyag viszkozitását. Jelenleg ismert a különféle gombákból, például Trichoderma longibrachiatumból, • · · · • · · ·
- 4 Aspergillus nigerből és Humicola insolensből származó xilanázok adalékkénti alkalmazása állati takarmányokban.
Bedford és Classen (The Journal of Nutrition, 122, 560-569) leírták, hogy szignifikáns összefüggés van az in vivő mért emésztett-anyag-viszkozitás és a testtömeggyarapodás és FCR értékek között broiler csirkék esetében. Baromfik búza- és rizsalapú táppal való etetése során kimutatták, hogy a testtömegnövekedés és FCR változásának 70-80%-a egyedül az intesztináis viszkozitásbeli különbségeken alapult. Ez mutatja az emésztettanyag-viszkozitás jelentőségét az oldható arabinoxilánokat nagy koncentrációban tartalmazó, gabonaalapú takarmányoknál. Az emésztettanyag-viszkozitásának növekedése csökkenti az összes tápanyag emészthetőségét a pankreáz enzimek, szubsztrátok és az emésztési folyamat végtermékei diffúziójának zavarása által.
Azt tapasztalták, hogy egy xilanáz beiktatása egy állati takarmányba elősegíti az emésztettanyag-viszkozitás csökkenést az állatban. Ennek eredményeként fokozódik az állat takarmány-emésztő képessége és növekedik az elfogyasztott takarmány egységnyi mennyiségére vonatkoztatva az állat tömeggyarapodásának sebessége, és csökken a takarmány FCR értéke.
Az enzim adalékokat, például a xilanázt szokásos módon úgy viszik be az állattakarmányba, hogy az enzimmel egy fiziológiásán elfogadható hordozót, például egy gabonát impregnálnak. Az impregnált hordozót a takarmány egyéb komponenseivel összekeverik, majd kocka vagy szemcse formára préselik, amellyel az állatot közvetlenül takarmányozzák.
Újabban nagy fejlődés történt a különböző tápanyagkomponensek formákká, például hasábokká vagy szemcsékké való fel• · · ·
- 5 dolgozásában. A kifejlesztett eljárásokban viszonylag magas hőmérsékleteket alkalmaznak. Ez elsősorban azért van, hogy javítsák a gyártási eljárás hatékonyságát, másodsorban azért, hogy olyan takarmányt állítsanak elő, amely az ártalmas baktériumoktól, főleg Salmonellától mentes. Ezenkívül a magas hőmérsékletek alkalmazásával javul a kapott kocka formájú és szemcsés termékek minősége és eltarthatósága, növekszik a hatékonyan kezelhető komponensek választéka és a takarmányba keverhető folyékony komponensek, például zsír és melasz koncentrációja is növelhető.
A jelenleg alkalmazott gyártási eljárásokban viszonylag magas hőmérsékleteken kezelik a takarmánykomponensek elegyét, viszonylag hosszú időn keresztül. Ezenkívül az elegyet viszonylag magas nyomásnak teszik ki a feldolgozás során, ami szintén hozzájárul a kialakított kockák vagy szemcsék eltarthatóságának növeléséhez.
A takarmányok táplálkozási tulajdonságainak javítására kifejlesztett eljárások egyike a gőz-szemcsézés. Ezen eljárás során a takarmánykeveréket gőzzel kezelik, hogy annak hőmérsékletét és nedvességtartalmát fokozzák. Ezt a lépést kondicionálásnak nevezik. A kondicionálás néhány másodperctől több percig tarthat, a takarmány összetételétől és típusától függően. A kondicionálóban a hőmérséklet 100 °C-ra emelkedhet. Ezután a takarmányt egy szemcsézőszerszámon vezetik keresztül, ahol hőmérséklete gyorsan megnő a súrlódás következtében.
Újabban egy új eszközt alkalmaznak a takarmányok előkezelésére vagy kondicionálására, amelyet expandernek neveznek. Ez hosszantartó kondicionálást tesz lehetővé nyomás alatt, ame• · • · · ·
- 6 lyet a szemcsézés követ. E módszer szerint a különféle takarmány komponenseket, amelyeket előzőleg gőzkondicionálásnak vetettek alá, egy sajtoló csigába táplálják be, amelybe még több gőzt injektálnak, és az egész tömeget ezután fokozódó nyomásnak és nyírásnak teszik ki, majd egy változtatható kilépő résen átnyomják. A sajtolt terméket a részecskeméret csökkentése után egy szokásos szemcséző présbe táplálják be.
A takarmánykomponensek duzzadási ideje az expanderben körülbelül 5-20 másodperc, és az elért hőmérséklet 145 °C is lehet. Körülbelül 3,5 MPa kompressziós nyomást érnek el, de mind a hőmérséklet, mind a nyomás nagyon gyorsan emelkedik, és mindkettő gyorsan le is csökken, amikor a terméket a kilépő résen keresztülsajtolják.
Az expanderek alkalmazása előnyös, mivel ezek hatékonyan eliminálják a káros baktériumokat, főleg a Salmonellát. Ezenkívül lehetővé teszik viszonylag nagy mennyiségű zsír vagy egyéb cseppfolyós komponens bevitelét az elegybe a szemcsézés előtt. Ezen túlmenően a főzés és a nyomás/nyíróhatás a keményítő fokozottabb zselatinálódását eredményezi.
Sajnálatos módon a magas hőmérsékletű és magas nyomású feldolgozási körülmények, különösen olyan nedvességi viszonyok között alkalmazva, amelyekkel a szemcsézés során szokásos módon dolgoznak, potenciálisan bomlást okozhatnak bizonyos takarmánykomponensekben. Ez különösen igaz a jelenlévő enzimekre, például a xilanázokra.
Jól ismert, hogy az enzimek proteinek, amelyek aminosavakból épülnek fel. Az aminosavak szekvenciája, azaz a primer szerkezet határozza meg a protein természetét. Az aminosav- 7 -lánc ezután különféle szekunder szerkezetbe rendeződhet el, például lap vagy hélix szerkezetet vehet fel. Ezek a szerkezetek szintén szerveződnek egymáshoz viszonyítva, így kapjuk a tercier szerkezetet; például a lapok egymáshoz képest párhuzamosan helyezkedhetnek el, az újság lapjaihoz hasonlóan. Végül több alegység asszociálódhat egy adott enzimmé, és ez adja az ún. kvaterner szerkezetet.
A működéshez az enzimnek egy aktív hellyel kell rendelkeznie, amely képes az adott szubsztrát reakcióját katalizálni. Ennek az aktív helynek gyakran nagyon specifikus alakja van, amelyet az enzim primer, szekunder, tercier és kvaterner szerkezete határoz meg. A katalitikus hely alakjában bekövetkezett változások valószínűleg dezaktiválják az enzimet.
Számos faktor van, például hő, nyomás és pH, amely megváltoztathatja az enzim alakját, tehát az enzim aktív helyének alakját is. A takarmány előállítása során az elegyben már jelenlévő minden enzim, amely már ki van téve azoknak a hőmérsékleteknek és nyomásoknak, amelyek az enzimet - legalábbis részlegesen - denaturálhatják, és így az enzim teljesen vagy részlegesen elveszítheti aktivitását. Minél magasabb hőmérsékletnek van kitéve az enzim az előállítás során, annál nagyobb aktivitásának csökkenése. A mezofil xilanázok rendszerint 65 °C-ig stabilak, de teljes aktivitásukat elvesztik, ha legalább 95 °C hőmérsékletnek tesszük ki vizes oldatban.
Ha hőmérséklet által okozott denaturálódás megy végbe a takarmány előállítása során, ez temészetesen rendkívül hátrányos, mivel az enzim nem fogja betölteni azt a funkciót, amiért a takarmányhoz adták, vagy azt a funkciót csak kisebb mér- 8 tékben fogja ellátni. A fenti probléma leküzdésének egyik lehetősége az, hogy szignifikánsan nagyobb relatív mennyiségben adják az enzimet a takarmányhoz annak érdekében, hogy a dezaktiválást bizonyos mértékben kompenzáljuk. Azonban a nagyobb mennyiségek hozzáadása gazdaságossági szempontból előnytelen, mivel az állattakarmányba bevitt enzimek viszonylag drágák.
Ismert az enzim stabilizálásának azon módja is, amikor speciális hordozókat vonnak be velük, vagy speciális bevonóeljárások alkalmazásával bevonják azokat. Azonban az ilyen módszerek nem jelentenek hatékony megoldást a viszonylag szigorú feldolgozási körülmények miatti problémára, amellyel a magas hőmérsékletű gőz-szemcsézés során, egy expanderben vagy egy extruderben számolni kell.
Egy alternatív megoldás lenne az is, hogy az enzimeket, például a xilanázt az előzetesen kialakított szemcsékhez adagolják, amelyeket már hőkezeltek. Ez azonban nem ideális megoldás, mivel először is komplex és drága berendezés szükséges a szemcsék enzimmel való finom bevonásához, hogy a beépülés kívánt viszonylagos mennyiségét elérjék. Másodszor, az ilyen bevonóeljárásban alkalmazott enzimoldatok tárolási stabilitása korlátozott, és baktériumokkal szennyeződhetnek.
Fentieknek megfelelően, annak ellenére, hogy léteznek részleges megoldások az enzimstabilitás problémájának megoldására a takarmány előállítása során, ezek egyike sem oldja meg a problémát teljesen hatékony módon.
- 9 A leírásban utalunk a xilanáz-aktivitás egységére. Ezt az aktivitást jelen esetben az alábbi vizsgálati eljárással határoztuk meg.
Xilanáz-aktivitás meghatározása
A xilanáz-aktivitás egy egysége az enzim azon mennyisége, amely 1 pmol redukáló cukrot szabadít fel (xilóz ekvivalensben kifejezve) a szubsztrátból 1 perc alatt az alább ismertetett körülmények között.
Reagensek
1) 1 vegyes%-os xilán szubsztrát
1,0 g xilánhoz (Fluka 95590) 10 ml 0,5 mol/1 koncentrációjú nátrium-hidroxid-oldatot adunk. Az elegyet mágneses keverővei 30 percen keresztül keverjük. Hozzáadunk körülbelül 40 ml 0,05 mol/1 koncentrációjú nátrium-acetát puffért (pH 6,5). A pH-t 1 mol/1 koncentrációjú ecetsavval 6,5-re állítjuk. Az oldatot 0,05 mol/1 koncentrációjú nátrium-acetát pufferrel (pH 6,5) 100 ml-re töltjük fel. A szubsztrátot alkalmazáskor egész idő alatt keverni kell.
2) 1 mol/1 koncentrációjú ecetsavoldat
5,7 ml jégecetet mérőlombikba pipettázunk, és desztillált vízzel 100 ml-re töltjük fel.
3) 0,05 mol/1 koncentrációjú nátrium-acetát puffer (pH 6,5)
A) 4,1 g nátrium-acetátot desztillált vízben oldunk, és desztillált vízzel 1000 ml-re töltjük fel.
B) 3,0 g jégecetet desztillált vízben oldunk, és desztillált vízzel 1000 ml-re feltöltjük.
Az A) oldat pH-ját a B) oldattal 6,5-re állítjuk be.
• β · · · · • ···· ·· ·
- 10 4) Dinitro-szalicilsav (DNS) reagens
20,0 g 3,5-dinitro-szalicilsavat körülbelül 800 ml desztillált vízben szuszpendálunk. Folyamatos keverés közben részletekben hozzáadunk 300 ml nátrium-hidroxid-oldatot, amely 32,0 g nátrium-hidroxidot tartalmaz 300 ml desztillált vízben. A szuszpenziót vízfürdőn (hőmérséklete nem lépheti túl a +48 °C-ot), keverés közben addig melegítjük, amíg az oldat kitisztul. Fokozatosan hozzáadunk 600 g kálium-nátrium-tartarátot. Az oldatot szükség esetén melegítjük (a hőmérséklet nem haladhatja meg a +48 °C-ot), amíg az oldat kitisztul.
Az oldatot desztillált vízzel 200 ml-re töltjük fel, és durva, zsugorított üvegszűrőn szűrjük.
Az oldatot szobahőmérsékleten, sötét üvegben tároljuk. A reagens maximum 6 hónapon keresztül stabil.
Módszer
1) Enzim minta ml enzim-hígítást (0,05 mol/1 koncentrációjú nátrium-acetát pufferben, pH 6,5) 50 °C-on ekvilibrálunk. Hozzáadunk 1 ml xilán szubsztrátot, és +50 °C-on pontosan 30 percen keresztül keverjük és inkubáljuk. Hozzáadunk 3 ml DNS-reagenst, és a reakcióelegyet keverés közben pontosan 5 percen keresztül forraljuk. A reakcióelegyet hidegvizes fürdőn szobahőmérsékletre hűtjük, és abszorbcióját 540 nm-en desztillált vízzel szemben mérjük.
2) Enzim vakpróba ml xilán szubsztrátot +50 °C-on 30 percen keresztül inkubálunk. Hozzáadunk 3 ml DNS-oldatot, és keverjük. Hozzáadunk 1 ml enzim-hígítást (0,05 mol/1 koncentrációjú nátrium-acetát • ·
- 11 pufferben, pH 6,5), és keverjük. Az elegyet pontosan 5 percen keresztül forraljuk. A reakcióelegyet hidegvizes fürdőn szobahőmérsékletre hűtjük, és 540 nm-en, desztillált vízzel szemben mérjük abszorpcióját.
Az enzim minta abszorpciója és az enzim vakpróba abszorpciója különbségének 0,3 és 0,5 között kell lennie.
3) Standard görbe
A standard oldatokat vízmentes xilózból készítjük 0,05 mol/1 koncentrációjú nátrium-acetát pufferben (pH 6,5). A xilóz koncentrációja a standard oldatokban 0,05 - 0,5 mg/ml. Egy kémcsőbe 1 ml standard oldatot, 1 ml xilán szubsztrátot és 3 ml DNS-reagenst pipettázunk. A kémcső tartalmát összekeverjük, és pontosan 5 percen keresztül forraljuk. Hidegvizes fürdőn szobahőmérsékletre hűtjük, és abszorpcióját 540 nm-en, standard vakpróbával szemben mérjük. A standard vakpróbában a xilóz oldatot 1 ml 0,05 mol/1 koncentrációjú nátrium-acetát pufferrel (pH 6,5) helyettesítjük. Egyébként a standard vakpróbát a xilóz standard oldattal azonos módon kezeljük.
A xilóz koncentrációját az abszorpció függvényében ábrázoljuk. Minden egyes új DNS-reagens esetén új standard görbét készítünk.
Számítás
A minta xilanáz-aktivitását az alábbi egyenlet szerint számítjuk ki:
{[A(X) - A(O)] · k + Ce} 1000 · Df
Aktivitás (Egység/g) =
MWxll · t • · *··
- 12 ahol
A(X) = A(O) = k
Ce
1000
Df
MWxil = t
enzim minta abszorpciója enzim vakpróba abszorpciója standard görbe meredeksége a xilóz standard görbe oordináta metszete mmol -> pmol átváltási faktor hígítási faktor (ml/g) xilóz móltömeg (150,13 mg/mmol) reakcióidő (30 perc)
Fentiek szerint a találmány egyik tárgya egy xilanáz, mint adalékanyag állati takarmányhoz, amely lényegében teljes aktivitását megtartja a viszonylag magas hőmérsékleten végzett eljárásban.
Ennek megfelelően a találmány Microtetraspora flexuosából nyerhető, hőstabil xilanáz állati takarmányok adalékanyagaként! alkalmazására vonatkozik, a xilanázra jellemző, hogy 95 °C-os vízfürdőn 1 percen keresztül tartó melegítést képes elviselni aktivitásának lényeges csökkenése nélkül, mialatt azt értjük, hogy 1%-os búza arabinoxilán-oldat viszkozitását pH 6,5 értéken és 40 °C hőmérsékleten ugyanazon végső viszkozitás ± 0,001 Pa.s értékre képes csökkenteni, mint a hőkezeletlen kontroll.
A xilanáz előnyösen 1%-os búza arabinoxilán-oldat viszkozitását pH 6,5 értéken és 40 °C hőmérsékleten azonos végső viszkozitás értékre ± 0,0005 Pa.s értékre képes csökkenteni, mint a hőkezeletlen kontroll.
A xilanáz-aktivitás vizsgálata a fentiek szerint egy in vitro viszkozitás-csökkenés vizsgálat, amelyben viszkózus szubsztrát- 13 ként búza arabinoxilánt alkalmazunk olyan körülmények között, amelyek az állat gyomor-bél-rendszerében található körülményeket utánozzák. Egy ilyen in vitro vizsgálat tájékoztatást ad arra nézve, hogy a xilanáz (vagy xilanázok elegye) rendelkezik-e a kívánt emésztettanyag-víszkozitást csökkentő hatással, ha állati takarmány adalékaként alkalmazzuk.
A xilanáz viszkozitáscsökkentő képességének meghatározására alkalmazott módszert részletesen az alábbiakban ismertetjük. A vizsgálatot minden esetben két párhuzamossal végezzük.
A vizsgálandó xilanáz enzimet 0,1 mol/1 koncentrációjú nátrium-foszfát pufferrel (pH 6,5) hígítva a xilanáz-koncentrációt olyan értékre állítjuk be, hogy a kapott oldat xilanáz-aktivitása 1,0 egység/ml legyen. A xilanáz-aktivitást az alábbi eljárás szerint határozzuk meg.
100 μΐ enzimoldatot adunk 400 μΐ búza arabinoxilán (gyártja a Megazyme Pty) 0,1 mol/1 koncentrációjú nátrium-foszfáttal (pH 6,5) készült oldatához egy kémcsőben, a kapott oldatban az enzim végkoncentrációja 0,2 egység/ml, és a búza arabinoxilán végkoncentrációja 1,0 tömeg%.
Az oldatot tartalmazó kémcsövet ezután lezárjuk, és 95 °C-ra állított vízfürdőre helyezzük meghatározott ideig, rendszerint 1 percre vagy 5 percre. E hőkezelés után a kémcsövet jeges vizes fürdőn lehűtjük. A kapott oldat viszkozitását 20 perc elteltével 40 °C-on Brookfiled DV-II, CP 40 viszkoziméterrel meghatározzuk, amely úgy van beállítva, hogy a viszkozitást másodpercenként egyszer méri.
A találmány értelmében egy hőstabil xilanáz alkalmazása adalékanyagként állati takarmányhoz azzal az előnnyel jár, hogy • ·
- 14 a xilanáz aktivitása lényegesen nem csökken azután, hogy a takarmány egyéb komponenseivel összekevertük, és a szokásos takarmányfeldolgozási eljárásnak alávetettük, például egy expander vagy extruder alkalmazásával. A találmány szerint alkalmazható hőstabil xilanáz Microtetraspora flexuosából nyerhető.
A hőstabil xilanázok izolálását Microtetraspora flexuosából az alábbiakban részletesen ismertetjük. Azt találtuk, hogy a Microtetraspora flexuosából öt különböző hőstabil xilanázt lehet izolálni. Ezeket a xilanázokat az alábbiakban 1-5. xilanáz néven említjük. Ezeket a xilanázokat homogenitásig tisztítottuk, amelyet ezüstfestéses izoelektromos fókuszáló gélben mértünk. A xilanázokat ioncserélő kromatográfia és hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfia kombinációjával tisztítottuk. Az egyes tisztított xilanázokra jellemző, hogy széles pH tartományban hőstabilak. Közelebbről mindegyik xilanáz megtartja aktivitásának több, mint 80%-át pH 6-9 tartományban.
A xilanázok további jellemzői az alábbiak. A 1. xilanáz móltömege körülbelül 33100 dalton, pl értéke körülbelül 8,5, és maximális aktivitást mutat pH 7,0 - 7,5 tartományban körülbelül 70 °C-on. A 2. xilanáz móltömege körülbelül 13300 dalton, pl értéke körülbelül 7,5, és maximális aktivitást mutat pH 7,0 - 7,5 tartományban körülbelül 65 °C-on. A 3. xilanáz móltömege körülbelül 31000 dalton, pl értéke körülbelül 6,2, és maximális aktivitást mutat pH körülbelül 7,5 értéken körülbelül 65 °C-on. A
4. xilanáz móltömege körülbelül 50000 dalton, pl értéke körülbelül 5,8 és maximális aktivitást mutat pH körülbelül 7,5 értéken körülbelül 65 °C-on. Az 5. xilanáz móltömege körülbelül • ·
- 15 35000 dalion, pl értéke körülbelül 5,3 és maximális aktivitást mutat pH körülbelül 7,5 értéken körülbelül 70 °C-on.
A Microtetraspora flexuosa xilanázait a találmány értelmében vagy az öt xilanáz elegyeként, azaz teljes xilanáz felülúszóként, vagy külön-külön, vagy bármely kombinációban alkalmazhatjuk. A találmány értelmében alkalmazható xilanázok előállításának másik módja az, hogy megfelelő rekombináns DNS módszerekkel előállítunk egy gazda mikroorganizmust, amely a kívánt hőstabil xilanázt termeli. így a xilanázt egy genetikailag átalakított gazdából lehet kapni, az átalakítás például egy hőstabil xilanázt kódoló gén bevitele lehet a Microtetraspora flexuosából a gazda baktérium vagy gomba törzsbe.
A Microtetraspora flexuosából kapott 1-5. xilanáz az ATCC 35864 számon deponált törzsből származik (ATCC, Bethesda, ND, USA), tehát a törzs a köz számára hozzáférhető. Az új xilanázokat úgy izoláljuk, hogy az extracelluláris xilanázokat ioncserélő kromatográfia (IEC) és hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfia (HIC) kombinációjával tisztítjuk tetszőleges sorrendben, a tisztítandó xilanáztól függően.
A Microtetraspora flexuosából származó öt, kémiailag különböző xilanáz izolálására és jellemzésére alkalmazott két tisztítási eljárást az alábbiakban ismertetjük. Mindkét eljárásban a Microtetraspora flexuosa sejteket centrifugálással eltávolítjuk, és a tenyésztőlevet ultraszűréssel koncentráljuk. Az első eljárásban az 1. xilanázt (pl 8,5), a 2. xilanázt (pl 7,5) és a 4. xilanázt (pl 5,8) választjuk el és tisztítjuk. A sejtmentes, teljes tenyésztőlevet anioncserélő oszlopra visszük fel, és növekvő só (nátrium-klorid) grádienssel mossuk és hígítjuk. A frakciók össze• · · ·
- 16 gyűjtése után a xilanáz-aktivitást remazol brilliáns kékkel megfestett nyírfa xilán vizsgálattal (RBB-xilán vizsgálat) mérjük. Az 1. xilanáz és a 2. xilanáz az oszlop áttörésben eluálódnak. Az effluens áttörést összegyűjtjük, és felvisszük egy hidrofób kölcsönhatáson alapuló oszlopra (fenil-Sepharose). Az 1. xilanázt és a 2. xilanázt úgy választjuk szét egymástól, hogy az oszlopot etilénglikol növekvő koncentrációival eluáljuk. A 4. xilanáz kötődik az anioncserélő oszlopon, és a többi megkötött xilanázzal (3. és 5. xilanáz) együtt eluálódik a só grádiensben. A
4. xilanázt a többi xilanázoktól HlC-vel választjuk el. Az eljárást részletesen az 1. példában ismertetjük. A tisztított 1., 2. és
4. xilanázt izoelektromos fókuszálással és tömegspektrometriásan vagy nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid-gélelektroforézissel (SDS-PAGE) analizáljuk tovább.
A második eljárás szerint a fent ismertetett, sejtmentes, teljes tenyésztőlevet első lépésben HlC-nek vetjük alá a 3. xilanáz (pl 6,2) és az 5. xilanáz (pl 5,3) tisztítása céljából. A két xilanáz együtt eluálódik ugyanazon ammónium-szulfát koncentrációnál. A 3. xilanázt az 5. xilanáztól úgy választjuk el, hogy az összegyűjtött, enzimaktivitást mutató eluátumokat IEC-nek vetjük alá. A 3. xilanáz alacsonyabb só-koncentrációnál eluálódik az anioncserélő oszlopról, mint az 5. xilanáz. Mindkét tisztított xilanázt először izoelektromos fókuszálással és MS-sel vagy SDS-PAGE-vel jellemezzük.
Az egyes xilanázok egymástól biokémiai tulajdonságaikban, például móltömegükben, pl értékükben, optimális hőmérséklet és pH értékükben, hidrofób tulajdonságaikban és hőstabilitásukban különböznek egymástól. Mind az öt xilanáz képes magas hőmér• · · ·
- 17 sékletek tolerálására 90 °C-ig, és a lúgos körülményeknek is ellenállnak pH 7,0 és pH 10,0 közötti tartományban. Az öt tisztított xilanáz félélettartama 80 °C-on 30 perc és 110 perc között van. A homogenitásig tisztított öt xilanáz további jellemzése a
2. referenciapéldában található.
A találmány további tárgya takarmányadalék, amely fiziológiásán elfogadható hordozót és Microtetraspora flexuosából nyerhető, hőstabil xilanázt tartalmaz, amelynek jellemzője, hogy 95 °C-ra állított vízfürdőn 1 percen keresztül tartó melegítést képes elviselni aktivitásának lényeges csökkenése nélkül, mialatt azt értjük, hogy 1%-os búza arabinoxilán-oldat viszkozitását pH 6,5 értéken és 40 °C hőmérsékleten ugyanazon végső viszkozitás ± 0,001 Pa.s értékre képes csökkenteni, mint a hőkezeletlen kontroll.
E szempontból a hőstabil xilanáz a fentiekben ismertetett xilanázok bármelyike, vagy azok elegye lehet.
A fiziológiásán elfogadható hordozó e vonatkozásban előnyösen egy gabonaféle, vagy egy gabonaféléből származó anyag. A fenti gabonafélék közé tartoznak az őrölt búza, kukorica, szója, cukrok, keményítők vagy ezek melléktermékei. A fenti hordozókat e szakterületen szokásosan használják, és ezért ezeket közelebbről nem szükséges ismertetni.
A találmány szerinti takarmányadalékot egyéb takarmány komponensekkel kombinálva állítjuk elő a gabonaalapú takarmányt. Egyéb takarmánykomponensként egy vagy több (előnyösen hőstabil) enzim-kiegészítőt, vitamin takarmányadalékot, ásványi takarmányadalékot és aminosav takarmányadalékot értünk. A kapott (kombinált) takarmányadalékot - amely többféle, kü• ·
- 18 lönböző típusú vegyületet tartalmazhat - ezután megfelelő menynyiségben keverhetjük az egyéb takarmánykomponensekkel, például a gabonával és protein-kiegészítőkkel az állati takarmány előállítása céljából. A fenti komponensek állati takarmánnyá történő feldolgozását bármely jelenleg alkalmazott feldolgozó készülékkel elvégezhetjük, például kettős szemcsézőgéppel, gőz-szemcsézőgéppel, expanderrel vagy extruderrel.
Az így kapott gabonaalapú takarmányban lévő hőstabil xilanáz hatására csökken a takarmány FCR értéke. A xilanáz ezenkívül, vagy alternatív módon fokozza a gabonaalapú takarmány emészthetőségét. A xilanáz bevitele következtében ezenkívül, vagy alternatív módon növekedhet az állat egységnyi elfogyasztott takarmányra eső testtömegnövekedésének mértéke.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy gabonaalapú takarmány, amely legalább 20 tömeg% gabonát és 0,00001 - 10 g hőstabil xilanázt tartalmaz a takarmány 1 kg-jára vonatkoztatva, amely xilanáz Microtetraspora flexuosából kapható, és jellemzője, hogy 95 °C-ra állított vízfürdőn 1 percen keresztüli melegítést képes elviselni aktivitásának lényeges csökkenése nélkül, mialatt azt értjük, hogy 1%-os búza arabinoxilán-oldat viszkozitását pH 6,5 értéken és 40 °C hőmérsékleten ugyanazon végső viszkozitás ± 0,001 Pa.s értékre képes csökkenteni, mint a hőkezeletlen kontroll.
A találmány e kiviteli alakjában a hőstabil xilanáz szintén a fentiekben ismertetett hőstabil xilanázok bármelyike, vagy azok elegye lehet. A találmány szerinti gabonaalapú takarmányban a gabona előnyösen búza, árpa, kukorica, cirok, rozs, zab, triticale • ·
- 19 és rizs lehet. Különösen előnyös, ha gabonaként búzát alkalmazunk.
A találmány szerinti gabonaalapú takarmánnyal etethetünk például pulykát, libát, kacsát, juhot és tehenet. Különösen előnyös, ha a takarmánnyal sertést vagy baromfit, és különösen broiler csirkét etetünk.
A találmány szerinti gabonaalapú takarmány előnyösen 0,0001 -lg xilanáz proteint tartalmaz a takarmány 1 kg-jára vonatkoztatva; ez a mennyiség előnyösebben 0,001 - 0,1 g/kg.
A találmány szerinti gabonaalapú takarmány legalább 20 tömeg% gabonát tartalmaz. A takarmány még előnyösebben legalább 30 tömeg% gabonát, legelőnyösebben legalább 50 tömeg% gabonát tartalmaz. A gabona a fent említettek bármelyike lehet, különösen előnyös a búza.
Noha a találmány szerinti gabonaalapú takarmány gabona komponense proteinforrást is jelent, rendszerint kiegészítő proteinforrások bevitelére is szükség van a takarmányba, például a hallisztből, húslisztből vagy zöldségekből származó proteinekre. A zöldség-proteinek forrása lehet például a teljes zsíros szójabab, repcemag, canola, szójababliszt, repcemagliszt és canolaliszt. A hagyományos takarmányokhoz viszonyítva kiegészítő proteinforrások, például halliszt, húsliszt vagy növényi protein relatív mennyisége csökkenthető a találmány szerinti kitanítás alkalmazásával, ami jelentős költségmegtakarítást eredményez. Ez azért van, mivel a gabonafélék viszonylagos ára lényegesen kisebb, mint a szokásos protein-kiegészítőké. A találmány értelmében olyan takarmányt állíthatunk elő, amely azonos táplálkozási értékkel rendelkezik a hozzáférhető energia, aminosavak • · · · • ·
- 20 és proteinek vonatkozásában, mint a hagyományos takarmány, de viszonylag nagyobb arányban tartalmaz gabonát és kisebb arányban protein-kiegészítőket. Azt is tapasztaltuk, hogy a hőstabil xilanáz bevitele egy állati takarmányba olyan hatással bír, hogy csökkenti az energia-kiegészítők, például zsírok és olajok koncentrációját, amelyek meghatározott tulajdonságokkal rendelkező takarmány kialakításához szükségesek.
Egy hőstabil xilanáz állati takarmányba történő bevitelével a találmány értelmében növeljük a takarmány nyers protein értékét és/vagy emészthetőségét és/vagy aminosav-tartalmát és/vagy emészthetőségi koefficiensét, ami lehetővé teszi a proteinforrások és/vagy aminosav-kiegészítők azon mennyiségének csökkentését a korábban szükséges mennyiségekhez képest. Ha a protein emészthetőségi koefficiens és/vagy a búza hozzáférhető nyers protein tartalma növekedik a hőstabil xilanáz hozzáadásának hatására, nagymértékű megtakarításokat lehet elérni a proteinés/vagy energia-kiegészítők mennyiségének csökkentése révén, amelyeket a hagyományos takarmányhoz hozzá kellett adni. Alternatív módon, ha csak az aminosav-tartalom vagy emészthetőségi koefficiens érték növekedik a hőstabil xilanáz hozzáadására, a fő megtakarítást a hagyományos takarmányban szükségesen alkalmazott aminosav-kiegészítők csökkent mennyiségével lehet elérni.
A találmány szerinti takarmány egyéb enzim-kiegészítőket is tartalmazhat, például egy vagy több β-glükanázt, glükoamilázt, mannázt, α-galaktozidázt, fitázt, lipázt, cc-arabinofuranozidázt, proteázt, α-amilázt és pektinázt. Különösen előnyös, ha további enzim-kiegészítőként egy proteázt, például a Bacillus
- 21 nemzetségből származó szubtilizint alkalmazunk. Ilyen szubtilizineket ismertetnek például részletesen az US-A 4 760 025 számú szabadalmi leírásban.
A találmány értelmében a takarmányt úgy állíthatjuk elő, hogy előállítjuk a fiziológiásán elfogadható hordozót és hőstabil xilanázt tartalmazó takarmányadalékot, majd ezt az adalékot 0,01 - 50 g/kg, előnyösebben 0,1 - 10 g/kg, és legelőnyösebben körülbelül 1 g/kg mennyiségben keverjük az állati takarmányt alkotó egyéb komponensekkel (beleértve a gabonát és az egyéb protein-kiegészítő forrásokat).
A leírásban foglalt ábrákat röviden alább ismertetjük.
Az 1. ábra mutatja a Microtetraspora flexuosából származó öt tisztított xilanáz aktivitás-pH profilját.
A 2. ábra mutatja a Microtetraspora flexuosából származó öt tisztított xilanáz aktivitás-hőmérséklet profilját.
A 3. ábra mutatja a Microtetraspora flexuosából származó öt tisztított xilanáz hőmérséklet—stabilitás profilját.
A találmányt közelebbről az alábbi referenciapéldákkal és példákkal kívánjuk ismertetni.
1. referenciapélda
Microtetraspora flexuosa által termelt öt xilanáz tisztítása
Xilanáz vizsgálatok
A xilanáz jelenlétét remazol brilliáns kékkel festett nyírfa xilán (RBB-xilán) szubsztrát (Megazyme, Ausztrália a szubsztrát kereskedelmi forgalmazója) alkalmazásával határoztuk meg.
200 pl mintát 250 pl szubsztrát-oldattal [2 vegyes% RBB-xilán 50 pmol/1 koncentrációjú nátrium-citrát pufferben (pH 6,5)] ele- 22 gyítünk, és 37 °C-on 10 percen keresztül inkubáljuk. Az emésztetlen xilánt 1 ml 95%-os etanol hozzáadásával kicsapjuk, és centrifugálással eltávolítjuk. Az oldatban maradt, szabaddá vált festék mennyiségét spektrofotometriásán (OD590) határozzuk meg, vakpróbaként etanolt alkalmazunk, ez a festékmennyiség arányos a xilanáz-aktivitással. Az aktivitást egy standard görbe segítségével lehet mennyiségileg meghatározni, és XAU/ml-ben (xilanáz aktivitás egység/ml) adjuk meg.
Gél-felülrétegező eljárást is kifejlesztettünk RBB-xilán szubsztrát alkalmazásával több xilanáz jelenlétének kimutatására és azok izoelektromos pontjának (pl) meghatározására. Az izoelektromos fókuszáló (IEF) géleket (pH grádiens 3-9) egy megolvasztott agaróz/szubsztrát szuszpenzióval [4 vegyes% agaróz, 7 mg/ml RBB-xilán és 0,5 térfogat% glicerin 50 pmol/l koncentrációjú nátrium-citrát pufferben (pH 6,5)] rétegezzük felül, és 37 °C-on inkubáljuk. Körülbelül 1 óra elteltével a xilanáz aktivitását a kitisztuló zónák mutatják. A gélt hagyjuk teljesen megszáradni, és tárolhatjuk. A xilanáz pl értékét ezüsttel festett pl standardeket tartalmazó IEF gélek azonos körülmények közötti futtatásával összehasonlítva határozzuk meg.
Minta
A Microtetraspora flexuosa ATCC 35864 fermentlevének sejtmentes felülúszóját (körülbelül 14 XAU/ml) ultraszűréssel (Amicon keverőkamra, 350 ml PM-10 membrán) ötszörösére koncentráljuk. Minden egyes mintát szűréssel sterilizálunk. A protein-koncentráció 12,5 mg/ml BCA módszerrel (Pierce) végzett meghatározás szerint. Gél-felülrétegező analízissel kimutattuk öt xilanáz jelenlétét, amelyeknek pl értéke 8,5, 7,5, • ·
- 23 > 6,2, 5,8 és 5,3. Ezt az öt xilanázt nevezzük a leírásban 1-5.
xilanáznak.
*
Tisztítási eljárások
Az öt xilanáz tisztítására ioncserélő kromatográfia (IEC) és hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfia (IEC és HIC) kombinációját alkalmaztuk.
1. xilanáz és 2. xilanáz tisztítása
Első lépésben IEC-t alkalmaztunk az 1. és 2. xilanáz tisztítására. A koncentrált mintát 10 mmol/1 koncentrációjú tris-HCl (pH 9,0) pufferrel szemben (A puffer) dializáljuk. 50 ml-t viszünk fel 1 ml/perc sebességgel Pharmacia FPLC rendszer alkalmazásával egy standard kromatográfiás oszlopra (Pharmacia C 16/40), amely az A pufferrel ekvilibrált 72 ml Q-Sepharose HP-vel (Pharmacia) van töltve. Az oszlopot 50 ml A pufferrel mossuk, majd 400 ml lineárisan növekedő só grádienssel (A puffer
0,25 mol/1 NaCl/Α puffer) eluáljuk. Az oszlopon maradt, megkötött proteint 2 mol/1 nátrium-kloridot tartalmazó A pufferrel mossuk. 10 ml-es frakciókat gyűjtünk, és a fentiek szerint analizáljuk.
Az 1. és 2. xilanáz együtt eluálódik az oszlopról a kezdetben átfolyó frakcióval, míg a protein maradéka az oszlopon kötve marad. (Az 1. és 2. xilanáz képviseli az oszlophoz nem kötődő frakciókat.)
Az 1. és 2. xilanáz tisztítására és izolálására második lépésben hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfiát (HIC) alkalmazunk. Az aktív frakciókat összegyűjtjük, és 2 mol/1 koncentrációjú ammónium-szulfát hozzáadásával 0,2 mol/1 ammónium-szulfát végkoncentrációt állítunk be. 50 mmol/1 koncentrá« ·
- 24 ciójú nátrium-citrátot (pH 6,5) adunk hozzá 10 mmol/1 végkoncentrációban, és az anyagot (körülbelül 100 ml) 0,5 ml/perc sebességgel standard kromatográfiás oszlopra (Pharmacia C 16/20) visszük, amely 0,2 mol/1 ammónium-szulfát/10 mmol/1 nátrium-citrát (pH 6,5) pufferrel (B puffer) ekvilibrált 36 ml fenil-Sepharose CL-4B-vel (Pharmacia) van töltve. Az oszlopot 60 ml B pufferrel mossuk, majd eluáljuk a sókoncentrációt lépcsőzetesen csökkentve 10 pmol/l nátrium-citrát (pH 6,5) pufferig (C puffer) 70 ml-en át, az etilénglikol (EG) koncentrációt lépcsőzetesen csökkentve 10 térfogat%-ra C pufferben 50 ml-en át, 200 ml 10 —» 32% EG lineáris grádienst alkalmazva, 80 ml 32% EG mellett mosva, 150 ml 32 —» 38% EG grádienst alkalmazva, és végül az EG koncentrációt lépcsőzetesen 50%-ra növelve 50 ml-en át teljesen mossuk az oszlopot. 10 ml-es frakciókat gyűjtünk, és a fentiek szerint analizáljuk. A fenti körülmények között homogén 2. xilanáz eluálódik a 32% EG-t tartalmazó mosófolyadékkal, míg a homogén 1. xilanáz a 32 —» 38% EG grádiens végénél eluálódik.
4. xilanáz tisztítása
Az 1. és 2. xilanáz tisztítására alkalmazott, fent ismertetett első lépés (IEC) során a 4. és 5. xilanáz együtt eluálódik az A pufferben körülbelül 0,16 mol/1 NaCl koncentrációnál. Az aktív frakciókat összegyűjtjük, és 0,4 mol/1 ammónium-szulfát - 10 mmol/1 nátrium-citrát (pH 6,5) koncentrációra (D puffer) állítjuk be a fent leírtak szerint. A körülbelül 100 ml anyagot 1 ml/perc sebességgel visszük fel a fent ismertetett HIC oszlopra, amelyet D pufferrel. ekvilibráltunk. Az oszlopot 50 ml D pufferrel mossuk, 130 ml D puffer -» C puffer lineáris grádienssel eluáljuk, • · · · • · · · · · • · · · · * « ···« ·· 4
- 25 majd azonnal eluáljuk 200 ml C puffer —> 50% EG lineáris grádienssel. 10 ml--es frakciókat gyűjtünk, és a fentiek szerint analizáljuk. A 4. xilanáz körülbelül 20% EG koncentrációnál eluálódik.
3. és 5. xilanáz tisztítása
A 3. és 5. xilanáz esetében első lépésként HlC-t alkalmazunk. A koncentrált mintát C pufferben 0,5 mol/1 ammónium-szulfát koncentrációra állítjuk be 2 mol/1 koncentrációjú ammónium-szulfát oldat és 50 mmol/1 koncentrációjú nátrium-citrát (pH 6,5) hozzáadásával a fent leírtak szerint. Az anyagból szűréssel eltávolítjuk a csapadéknyomokat, és 50 ml-t viszünk fel 1 ml/perc sebességgel a fent ismertetett HIC oszlopra, amelyet 0,5 mol/1 ammónium-szulfátot tartalmazó C pufferrel (E puffer) ekvilibráltunk. Az oszlopot ezután 87,5 ml E pufferrel mossuk, majd 147 ml E puffer -» C puffer lineáris grádienssel eluáljuk. 10 ml-es frakciókat gyűjtünk, és a fentiek szerint analizáljuk. A
3. és 5. xilanáz körülbelül 0,05 mol/1 ammónium-szulfát koncentrációnál együtt eluálódik.
A 3. és 5. xilanáz izolálására és tisztítására IEC-t alkalmazunk. Az aktív HIC frakciókat összegyűjtjük (70 ml), 10 mmol/1 koncentrációjú tris-HCl-lel (pH 8,0) szemben (F puffer) teljesen dializáljuk, és körülbelül 20 ml-re koncentráljuk a fenti eljárással. Az anyagot 1 ml/perc sebességgel a fent ismertetett IEC oszlopra visszük, amelyet F pufferrel ekvilibráltunk. Az oszlopot 150 ml F pufferrel mossuk, és 150 ml F puffer -» 0,25 mol/1 NaCl/F puffer grádienssel eluáljuk. 10 ml-es frakciókat gyűjtünk, és a fentiek szerint analizáljuk. A 3. xilanáz körülbelül • · • · · · · · • · · · · · • ♦· · · ·· *
- 26 0,05 mol/1 NaCl koncentrációnál, míg az 5. xilanáz körülbelül 0,15 mol/1 NaCl koncentrációnál eluálódik.
2. referenciapélda
Microtetraspora flexuosa által termelt öt xilanáz jellemzése
Tisztítás után minden egyes xilanázon elvégeztük az izoelektromos fókuszálást és a molekulatömeg meghatározást az alábbi eljárások szerint. A xilanázok biokémiai jellemzésének eredményeit az 1. táblázatban foglaljuk össze.
Az izoelektromos fókuszálást PhastSystem (Pharmacia Biotech) alkalmazásával végeztük a gyártó útmutatása szerint. A pl meghatározására markerként egy széles tartományú pl készletet (pH 3,5 - 9,3) alkalmaztunk (Pharmacia Biotech). A proteineket PhastSystem kifejlesztő ezüstfestéssel tettük láthatóvá a gyártó instrukciói szerint.
A móltömeg meghatározásokat két módszerrel végeztük el: nátrium-dodecil-szulfát/poliakrilamid gél-elektroforézissel (SDS-PAGE) és tömegspektroszkópiával (MS). Az SDS-PAGE eljárást, és ezt követően az ezüstfestéssel történő vizualizálást PhastSystem alkalmazásával hajtottuk végre a fent leírtak szerint. Móltömeg markerként a Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) termékeit alkalmaztuk. A tömegspektroszkópiát a Charles Evans and Associates (301 Chesapeake Drive, Redwood City, CA 94063) végezte.
• ·
- 27 1. táblázat
Microtetraspora flexuosa xilanázok
| Szám | pi | Móltömeg (kD)eljárás | PH | Hőmérséklet | ||
| Optimum | Stabilitás | Optimum (°C) | Stabilitás felezési idő 80 °C-on (perc) | |||
| 1. | 8,5 | 33,1-MS | 7,0-7,5 | 6-8,5 | 70 | 110 |
| 2. | 7,5 | 13,3-MS | 7,0-7,5 | 6-8 | 65 | 55 |
| 3. | 6,2 | 31,0-SDS | 7,5 | 6-9 | 65 | 30 |
| 4. | 5,8 | 50,0-SDS | 7,5 | 6-9 | 65 | 90 |
| 5. | 5,3 | 35,0-SDS | 7,5 | 6-9 | 70 | 30 |
A pH optimumot RBB vizsgálat alkalmazásával határoztuk meg a fent leírtak szerint, azzal az eltéréssel, hogy a puffereket a mért pH tartománytól függően (azaz pH 4,5 - 12,0) változtattuk (lásd 1. ábrát). Szakember kötelező tudásához tartozik a megfelelő puffer előállítása a vizsgálat kiválasztott pH értékéhez.
A hőstabilitás azt az időt jelenti egy megadott hőmérsékleten, amely alatt az aktivitás fele megmaradt. Az aktivitást közelítőleg 18-37 °C-on mértük. A mintát egy adott hőmérsékleten inkubáltuk, és az aktivitást RBB vizsgálattal mértük. A felezési idő az az idő percekben kifejezve, amely alatt az aktivitás fele elveszik (lásd 3. ábrát).
A hőmérséklet optimum az a hőmérséklet, ahol a legmagasabb aktivitást találtuk. A 2. ábra mutatja az 1-5. xilanázok hő• · . · · · · · • · · · · · • ···· · · *
- 28 mérséklet profilját, amelyet RBB vizsgálattal mértünk. Mind az 1., mind a 2. ábrán a százalékos maximális aktivitást a legmagasabb mért aktivitáshoz viszonyítottuk, amelyet 100-nak vettünk, és az összes többi számot ehhez a standardhoz viszonyítottuk.
1. példa
A Microtetraspora flexuosából előállított 1-5. xilanázt, Thermomonospora fuscából előállított TfxA xilanázt és Trichoderma virideből és Aspergillus nigerből kapott xilanázokat vizsgáltunk, hogy meghatározzuk a búza arabinoxilán szubsztrát viszkozitást csökkentő képességüket a fent részletesen ismertetett viszkozitáscsökkenés vizsgálat alkalmazásával. Minden egyes enzimkészítmény esetén meghatároztuk a viszkozitást hőkezelés nélkül (kontroll) és az 1, illetve 5 percen keresztül 95 °C-os vízfürdőn végzett hőkezelés után. Az eredményeket a 2. táblázatban foglaljuk össze.
2. táblázat
| Xilanáz | Kontroll (hőkezelés nélkül) | Viszkozitás (Pa.s) 20 perc (40 °C-on) 95 °C-on végzett hőkezelés után | |
| 1 percen keresztül | 5 percen keresztül | ||
| 1-5. xilanáz M. Flexuosából | 1,8 x 10’3 | 1,8 x 10’3 | 8,8 x 10'3 |
| TfxA xilanáz T. fuscából | 7,9 x 10’3 | 8,2 x 10’3 | 1,6 x 10’2 |
| Xilanáz T. virideből | 2,0 x 10’3 | 1,1 x 10'2 | 1,1 x 10'2 |
| Xilanáz A. nigerből | 1,4 x 10'3 | 7,2 x 10'3 | 7,3 x 10‘3 |
• · · · · · • · · · · · • ···· ·· *
- 29 A fenti eredményekből látható, hogy ha az egyes xilanázokat vagy a xilanázok elegyét 95 °C hőmérsékletnek tesszük ki 5 percen keresztül, a xilanáz-aktivitás szignifikánsan csökken, amit a viszkozitáscsökkenés vizsgálattal határozunk meg. Azonban azt is megfigyeltük, hogy az 1. xilanáz esetén 95 °C-on 1 percen keresztül tartó hőkezelés után a mért viszkozitás nem tért el szignifikánsan a kontrolitól ± 0,001 Pa.s határokon belül. Másrészről az is nyilvánvaló, hogy a T. virideből és az A. nigerből kapott xilanázok sokkal érzékenyebbek hőre, mint a találmány értelmében alkalmazott hőstabil xilanázok.
2. példa
Microtetraspora flexuosából kapott 1. és 2. xilanáz hőstabilitását vizsgáltuk az 1. példa szerinti viszkozitáscsökkenés vizsgálattal. Az 1. példához hasonlóan, mindegyik xilanáz esetén felvettük a kontrollértéket is a hőkezelés nélküli kontrollal. A hőkezelést is hasonlóan végeztük, azaz két hőkezelést végeztünk úgy, hogy az enzimet 95 °C-ra állított vízfürdőn 1, illetve 5 percen keresztül melegítettük. A kísérlet eredményeit a 3. táblázatban foglaljuk össze.
3. táblázat
| Enzim | Kontroll (hőkezelés nélkül) | Viszkozitás (Pa.s) 95 °C-on végzett hőkezelés után | |
| 1 percen keresztül | 5 percen keresztül | ||
| 1. xilanáz | 1,7 χ 10'3 | 1,9 x 10'3 | 2,4 χ 10’3 |
| 2. xilanáz | 1,7 x 10‘3 | 2,3 x 10’3 | 2,5 x 10~3 |
···· · · ·· * ·
- 30 A 3. táblázat eredményeiből látható, hogy mind az 1., mind a 2. xilanáz esetén 95 °C-on 1 percen keresztül tartó hőkezelés után a mért viszkozitás ± 0,00006 Pa.s határon belül maradt a kontroll viszkozitásához képest. Ennek megfelelően nyilvánvaló, hogy ezen két xilanáz aktivitása lényegesen nem csökkent a 95 °C-on 1 percen keresztül tartó hőkezelés hatására.
Claims (9)
- Szabadalmi igénypontok1. Microtetraspora flexuosából nyerhető, hőstabil xilanáz állati takarmányok adalékanyagaként! alkalmazása, amely xilanáz 95 °C-os vízfürdőn 1 percen keresztül tartó melegítést képes elviselni aktivitásának lényeges csökkenése nélkül, azaz 1%-os búza arabinoxilán-oldat viszkozitását pH 6,5 értéken és 40 °C hőmérsékleten ugyanazon végső viszkozitás ± 0,001 Pa.s értékre képes csökkenteni, mint a hőkezeletlen kontroll.
- 2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a xilanáz az (i)- (v) csoportjellemzők közül legalább eggyel rendelkezik:(i) móltömege körülbelül 33100 dalion, pl értéke körülbelül8.5, és maximális aktivitást mutat pH 7,0 - 7,5 tartományban, körülbelül 70 °C-on;(ii) móltömege körülbelül 13300 dalton, pl értéke körülbelül7.5, és maximális aktivitást mutat pH 7,0 - 7,5 tartományban, körülbelül 65 °C-on;(iii) móltömege körülbelül 31000 dalton, pl értéke körülbelül6.2, és maximális aktivitást mutat körülbelül pH 7,5 értéken, körülbelül 65 °C-on;(iv) móltömege körülbelül 50000 dalton, pl értéke körülbelül5,8, és maximális aktivitást mutat körülbelül pH 7,5 értéken, körülbelül 65 °C-on;(v) móltömege körülbelül 35000 dalton, pl értéke körülbelül5.3, és maximális aktivitást mutat körülbelül pH 7,5 értéken, körülbelül 70 °C-on.
- 3. Takarmányadalék, amely fiziológiásán elfogadható hordozót és Microtetraspora flexuosából nyerhető, hőstabil xilanázt ·*«· ·*- 32 tartalmaz, amelynek jellemzője, hogy 95 °C-ra állított vízfürdőn 1 percen keresztül tartó melegítést képes elviselni aktivitásának lényeges csökkenése nélkül, azaz 1%-os búza arabinoxilán-oldat viszkozitását pH 6,5 értéken és 40 °C hőmérsékleten ugyanazon végső viszkozitás ± 0,001 Pa.s értékre képes csökkenteni, mint a hőkezeletlen kontroll.
- 4. A 3. igénypont szerinti takarmányadalék, amely hordozóanyagként gabonát vagy egy gabonából származó anyagot tartalmaz.
- 5. A 4. igénypont szerinti takarmányadalék, amely hordozóanyagként őrölt búzát, kukoricát, szóját vagy ezek melléktermékét tartalmazza.
- 6. A 3-5. igénypontok bármelyike szerinti takarmányadalék alkalmazása gabonaalapú takarmány adalékolására, a takarmány átalakulási arány javítására és/vagy emészthetőségének fokozására és/vagy az állat egységnyi elfogyasztott takarmányra vonatkoztatott tömeggyarapodásának fokozására.
- 7. Gabonaalapú takarmány, amely legalább 20 tömeg% gabonát és 0,00001 - 10 g hőstabil xilanázt tartalmaz a takarmány1 kg-jára vonatkoztatva, amely xilanáz Microtetraspora flexuosából kapható, és jellemzője, hogy 95 °C-ra állított vízfürdőn 1 percen keresztüli melegítést képes elviselni aktivitásának lényeges csökkenése nélkül, azaz 1%-os búza arabinoxilán-oldat viszkozitását pH 6,5 értéken és 40 °C hőmérsékleten ugyanazon végső viszkozitás ± 0,001 Pa.s értékre képes csökkenteni, mint a hőkezeletlen kontroll.• · • ···· ··- 33 /·
- 8. A 7. igénypont szerinti gabonaalapú takarmány, amely gabonaként búzát, árpát, kukoricát, cirkot, rozsot, zabot triticalét és/vagy rizst tartalmaz.
- 9. A 7. vagy 8. igénypont szerinti gabonaalapú takarmány alkalmazása baromfiak vagy sertések takarmányozására.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/234,338 US5437992A (en) | 1994-04-28 | 1994-04-28 | Five thermostable xylanases from microtetraspora flexuosa for use in delignification and/or bleaching of pulp |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9602980D0 HU9602980D0 (en) | 1997-01-28 |
| HUT75662A true HUT75662A (en) | 1997-05-28 |
Family
ID=22880947
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9602980A HUT75662A (en) | 1994-04-28 | 1995-04-28 | Use of a thermostable enzyme as a feed additive |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5437992A (hu) |
| EP (3) | EP0758378B1 (hu) |
| JP (2) | JPH11501502A (hu) |
| CN (1) | CN1147271A (hu) |
| AU (2) | AU684026B2 (hu) |
| BR (1) | BR9507540A (hu) |
| CA (2) | CA2188558A1 (hu) |
| CZ (1) | CZ285839B6 (hu) |
| DE (2) | DE69516133T2 (hu) |
| DK (2) | DK0758378T3 (hu) |
| ES (1) | ES2146756T3 (hu) |
| FI (2) | FI121469B (hu) |
| HU (1) | HUT75662A (hu) |
| NO (1) | NO964549L (hu) |
| NZ (2) | NZ285406A (hu) |
| PL (1) | PL316997A1 (hu) |
| WO (2) | WO1995029998A1 (hu) |
| ZA (1) | ZA953458B (hu) |
Families Citing this family (51)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5298694A (en) * | 1993-01-21 | 1994-03-29 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Acoustical insulating web |
| JPH0787957A (ja) * | 1993-07-28 | 1995-04-04 | Nippon Paper Ind Co Ltd | 微生物ｓｋｂ−１１５２株及びそれを利用したパルプの漂白方法 |
| US5437992A (en) * | 1994-04-28 | 1995-08-01 | Genencor International, Inc. | Five thermostable xylanases from microtetraspora flexuosa for use in delignification and/or bleaching of pulp |
| US5935836A (en) * | 1994-07-29 | 1999-08-10 | Rohm Enzyme Finland Oy | Actinomadura xylanase sequences and methods of use |
| US6300114B1 (en) * | 1994-07-29 | 2001-10-09 | Rohm Enzyme Finland Oy | Sequences of xylanase and xylanase expression vectors |
| US7816129B2 (en) * | 1994-07-29 | 2010-10-19 | Ab Enzymes Gmbh | Production and secretion of proteins of bacterial origin in filamentous fungi |
| US6057438A (en) * | 1996-10-11 | 2000-05-02 | Eastman Chemical Company | Process for the co-production of dissolving-grade pulp and xylan |
| CA2314865C (en) * | 1997-12-19 | 2003-09-23 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Methods for preventing and treating mastitis |
| US7060482B1 (en) | 1998-11-16 | 2006-06-13 | National Research Council Of Canada | Thermostable xylanases |
| CA2385245C (en) * | 1998-11-16 | 2011-04-12 | Iogen Bio-Products Corporation | Thermostable xylanases |
| US7718411B1 (en) | 2004-08-05 | 2010-05-18 | Danisco Us Inc. | Trichoderma reesei G/11 xylanases with improved stability |
| FI108728B (fi) * | 1999-10-12 | 2002-03-15 | Carbozyme Oy | Menetelmä perheen G/11 ksylanaasien stabiilisuuden parantamiseksi ja optimaalisen pH-alueen muuttamiseksi |
| AU2002226210A1 (en) | 2000-12-22 | 2002-07-08 | Iogen Bio-Products Corporation | Alkaline extraction stages comprising xylanase |
| BR0212068A (pt) * | 2001-08-20 | 2004-08-03 | Leuven K U Res & Dev | Polissacarìdeos exceto amido |
| WO2003028476A1 (fr) * | 2001-09-11 | 2003-04-10 | Meiji Seika Kaisha, Ltd. | Nouvelles compositions enzymatiques pour volailles |
| US7566556B2 (en) * | 2002-03-01 | 2009-07-28 | Academia Sinica | Enhancing enzyme thermostability by mixing with sorghum liquor waste |
| KR20050010053A (ko) * | 2002-06-14 | 2005-01-26 | 다이버사 코포레이션 | 자일라나제, 이를 암호화하는 핵산, 및 이의 제조 및 사용방법 |
| US20050000666A1 (en) * | 2003-05-06 | 2005-01-06 | Novozymes A/S | Use of hemicellulase composition in mechanical pulp production |
| CN108486086A (zh) | 2003-07-02 | 2018-09-04 | 维莱尼姆公司 | 葡聚糖酶，编码它们的核酸以及制备和使用它们的方法 |
| DE10330551B4 (de) * | 2003-07-05 | 2005-07-21 | Fachhochschule Flensburg | Bestimmung der Startkommutierung in Synchron-Servo-Antrieben |
| NO319624B1 (no) | 2003-09-15 | 2005-09-05 | Trouw Internat Bv | Fiskefôr for laksefisk i ferskvann og anvendelse av slikt fôr. |
| EP1771554A4 (en) * | 2003-12-19 | 2008-03-05 | Syngenta Participations Ag | MICROBIAL EXPRESSED XYLANASES, THEIR USE AS FOOD ADDITIVES AND OTHER APPLICATIONS |
| CA2638801C (en) | 2006-02-14 | 2016-12-13 | Verenium Corporation | Xylanases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
| AU2007356171B8 (en) | 2006-08-04 | 2014-01-16 | Bp Corporation North America Inc. | Glucanases, nucleic acids encoding them, and methods for making and using them |
| EP2057178B1 (en) | 2006-09-21 | 2013-11-06 | Verenium Corporation | Phytases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
| CN101210394B (zh) * | 2006-12-29 | 2010-05-19 | 汪官久 | 一种纯生物纸浆生产工艺 |
| GB0718974D0 (en) | 2007-09-28 | 2007-11-07 | Univ Leuven Kath | oligosaccharides derived from arabinoxylan for prevention of gastrointestinal infection |
| AU2008307371B2 (en) | 2007-10-03 | 2015-05-28 | Bp Corporation North America Inc. | Xylanases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
| NL2001338C2 (nl) | 2008-02-29 | 2009-09-01 | Smurfit Kappa Roermond Papier | Werkwijze voor het verwerken van bloem in papier. |
| DK2268804T3 (en) * | 2008-03-21 | 2017-12-11 | Danisco Us Inc | HEMICELLULASE-ENRICHED COMPOSITIONS FOR IMPROVED BIOMASS HYDROLYSE |
| GB0805360D0 (en) * | 2008-03-25 | 2008-04-30 | Univ Leuven Kath | Arabinoxylan oligosaccharide preparation |
| WO2010074821A1 (en) | 2008-12-22 | 2010-07-01 | The Regents Of The University Of California Office Of Technology Transfer | Acidothermus celluloyticus xylanase |
| DE202009006579U1 (de) | 2009-05-06 | 2009-07-16 | Kertes, Miroslav | Vorrichtung zur Versorgung eines Lastkraftwagens aus einer Zusatzenergiequelle |
| CN101554208B (zh) * | 2009-05-21 | 2012-07-04 | 广州市威司特生物科技有限公司 | 一种耐高温木聚糖酶在动物饲料中的配方方法 |
| KR101817253B1 (ko) | 2009-05-21 | 2018-01-10 | 신젠타 파티서페이션즈 아게 | 피타제, 이를 코딩하는 핵산 및 그의 제조 및 사용 방법 |
| EP3296394B1 (en) | 2009-09-23 | 2020-11-04 | Danisco US Inc. | Novel glycosyl hydrolase enzymes and uses thereof |
| US20110108222A1 (en) * | 2009-11-11 | 2011-05-12 | International Paper Company | Effect of low dose xylanase on pulp in prebleach treatment process |
| EP2516663B1 (en) | 2009-12-23 | 2020-02-12 | Danisco US Inc. | Methods for improving the efficiency of simultaneous saccharification and fermentation reactions |
| RU2013146245A (ru) | 2011-03-17 | 2015-04-27 | ДАНИСКО ЮЭс ИНК. | Способ уменьшения вязкости в процессе осахаривания |
| CN103997902B (zh) * | 2011-11-09 | 2021-04-02 | 焙乐道有限责任公司 | 用木聚糖酶补充的饲料组分 |
| EP2814965B1 (en) | 2012-02-16 | 2018-03-21 | Syngenta Participations AG | Engineered pesticidal proteins |
| WO2013136274A1 (en) | 2012-03-13 | 2013-09-19 | University Of Guelph | Myb55 promoter and use thereof |
| US9850512B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-12-26 | The Research Foundation For The State University Of New York | Hydrolysis of cellulosic fines in primary clarified sludge of paper mills and the addition of a surfactant to increase the yield |
| US9951363B2 (en) | 2014-03-14 | 2018-04-24 | The Research Foundation for the State University of New York College of Environmental Science and Forestry | Enzymatic hydrolysis of old corrugated cardboard (OCC) fines from recycled linerboard mill waste rejects |
| CN103900981A (zh) * | 2014-04-14 | 2014-07-02 | 西北农林科技大学 | 一种发酵液中木聚糖酶的快速测定方法 |
| BR112017012362A2 (pt) | 2014-12-12 | 2018-07-31 | Syngenta Participations Ag | composições e métodos para controle de pragas de plantas. |
| CA3076020A1 (en) | 2017-10-02 | 2019-04-11 | Syngenta Participations Ag | Engineered pesticidal proteins and methods of controlling plant pests |
| EP3502242A1 (en) | 2017-12-20 | 2019-06-26 | Technische Universität München | New xylanase with improved thermostability and increased enzyme activity on arabinoxylan |
| US20220194994A1 (en) | 2019-02-20 | 2022-06-23 | Syngenta Crop Protection Ag | Engineered pesticidal proteins and methods of controlling plant pests |
| WO2023154887A1 (en) | 2022-02-11 | 2023-08-17 | Northeast Agricultural University | Methods and compositions for increasing protein and/or oil content and modifying oil profile in a plant |
| WO2024160989A1 (en) | 2023-02-03 | 2024-08-08 | Syngenta Crop Protection Ag | Herbicide resistant plants |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4742005A (en) * | 1985-01-07 | 1988-05-03 | Agency Of Industrial Science & Technology, Ministry Of International Trade & Industry | Method for production of cellulolytic enzymes and method for saccharification of cellulosic materials therewith |
| GB9018426D0 (en) * | 1990-08-22 | 1990-10-03 | Sandoz Ltd | Improvements in or relating to novel compounds |
| FR2672300B1 (fr) * | 1991-02-01 | 1994-09-23 | Agronomique Inst Nat Rech | Xylanase, souches de bacillus productrices de xylanase et leurs utilisations. |
| DK69591D0 (da) * | 1991-04-18 | 1991-04-18 | Novo Nordisk As | Nye mikroorganismer |
| DK175391D0 (da) * | 1991-10-18 | 1991-10-18 | Novo Nordisk As | Nye enzymer |
| JP3603322B2 (ja) * | 1992-12-14 | 2004-12-22 | 萬有製薬株式会社 | インドロピロロカルバゾール誘導体の製造法 |
| US5437992A (en) * | 1994-04-28 | 1995-08-01 | Genencor International, Inc. | Five thermostable xylanases from microtetraspora flexuosa for use in delignification and/or bleaching of pulp |
-
1994
- 1994-04-28 US US08/234,338 patent/US5437992A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-04-21 US US08/426,505 patent/US5683911A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-28 DE DE69516133T patent/DE69516133T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-28 CZ CZ963155A patent/CZ285839B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1995-04-28 DE DE69521534T patent/DE69521534T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-28 WO PCT/US1995/005016 patent/WO1995029998A1/en active IP Right Grant
- 1995-04-28 CA CA002188558A patent/CA2188558A1/en not_active Abandoned
- 1995-04-28 CN CN95192807A patent/CN1147271A/zh active Pending
- 1995-04-28 PL PL95316997A patent/PL316997A1/xx unknown
- 1995-04-28 NZ NZ285406A patent/NZ285406A/en unknown
- 1995-04-28 ES ES95917136T patent/ES2146756T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-28 AU AU24485/95A patent/AU684026B2/en not_active Ceased
- 1995-04-28 ZA ZA953458A patent/ZA953458B/xx unknown
- 1995-04-28 EP EP95917136A patent/EP0758378B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-28 DK DK95917136T patent/DK0758378T3/da active
- 1995-04-28 AU AU23949/95A patent/AU681031B2/en not_active Ceased
- 1995-04-28 JP JP7528002A patent/JPH11501502A/ja active Pending
- 1995-04-28 JP JP7528323A patent/JPH09512709A/ja active Pending
- 1995-04-28 EP EP95918619A patent/EP0758379A1/en not_active Ceased
- 1995-04-28 WO PCT/EP1995/001628 patent/WO1995029997A1/en not_active Application Discontinuation
- 1995-04-28 EP EP99102458A patent/EP0926234B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-28 CA CA002188874A patent/CA2188874C/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-28 HU HU9602980A patent/HUT75662A/hu unknown
- 1995-04-28 DK DK99102458T patent/DK0926234T3/da active
- 1995-04-28 US US08/732,242 patent/US6132716A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-28 BR BR9507540A patent/BR9507540A/pt not_active Application Discontinuation
-
1996
- 1996-10-24 FI FI964283A patent/FI121469B/fi not_active IP Right Cessation
- 1996-10-25 FI FI964319A patent/FI964319A0/fi unknown
- 1996-10-25 NO NO964549A patent/NO964549L/no not_active Application Discontinuation
-
1998
- 1998-10-15 NZ NZ332345A patent/NZ332345A/xx unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HUT75662A (en) | Use of a thermostable enzyme as a feed additive | |
| EP0865484B1 (en) | Novel xylanase composition and method for production thereof | |
| EP0805856B2 (en) | Animal feed additives comprising xylanase | |
| RU2261910C2 (ru) | ШТАММ Penicillium funiculosum, ПРОДУЦИРУЮЩИИЙ КОМПЛЕКС ФЕРМЕНТОВ - ЦЕЛЛЮЛАЗУ, ЭНДО-1,4-β-КСИЛАНАЗУ, ЦЕЛЛОБИОГИДРОЛАЗУ, β-ГЛЮКОЗИДАЗУ, ЭНДО-1,3(4)- β-ГЛЮКАНАЗУ, ФЕРУЛОИЛ-ЭСТЕРАЗУ, ЖИДКАЯ КОРМОВАЯ ДОБАВКА И СУХОЙ КОРМ ДЛЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ | |
| Paloheimo et al. | Xylanases and cellulases as feed additives. | |
| US8715647B2 (en) | Enzyme feed additive and animal feed including it | |
| EP0684770B1 (en) | An enzyme feed additive and animal feed including it | |
| RU2275052C2 (ru) | Способ получения водной жидкости, содержащей фитазу, водная жидкость, содержащая фитазу, способ получения гранулированного материала, содержащего фитазу, содержащий фитазу гранулированный материал, гранулированный материал, корм для животных, премикс или полуфабрикат корма для животных, способ его получения, способ стимуляции роста животного | |
| WO1996005739A1 (en) | An enzyme feed additive and animal feed including it | |
| Imran et al. | Role of enzymes in animal nutrition: a review | |
| Dhiman et al. | Recent advances and industrial applications of microbial xylanases: a review | |
| ZA200300473B (en) | Methods for high-temperature hydrolysis of galactose-containing oligosaccharides in complex mixtures. | |
| AU730501B2 (en) | Animal feed additives | |
| Chadha et al. | Two endoxylanases active and stable at alkaline pH from the newly isolated thermophilic fungus, Myceliophthora sp. IMI 387099 | |
| Pierce et al. | Nutrition and gut microbiology: redirecting nutrients from the microbes to the host animal with SSF | |
| Richards et al. | Equine α–amylase: Does it limit starch digestion in the small intestine of the horse | |
| CA2251798C (en) | Animal feed additives | |
| WO2020261164A1 (en) | Xylanase additives for food or feeds | |
| Vardan | Role of Enzymes in Animal Nutrition: A Review | |
| CN108603184A (zh) | 阿拉伯聚糖酶及其用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFC4 | Cancellation of temporary protection due to refusal |