CN108603184A

CN108603184A - 阿拉伯聚糖酶及其用途

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Publication number: CN108603184A
Application number: CN201780009740.3A
Authority: CN
Inventors: A·翰勒切; J·法伊弗; S·沃驰; G·孔泽; T·施瓦伦贝格; R·佩兹
Original assignee: Bao Platt Co
Current assignee: Bao Platt Co
Priority date: 2016-02-18
Filing date: 2017-02-17
Publication date: 2018-09-28
Anticipated expiration: 2037-02-17
Also published as: PL3417057T3; US11053487B2; EP3417057B1; ES2919825T3; US20180355334A1; DK3417057T3; BR112018016297A2; CA3010581C; CA3010581A1; AU2017220672B2; CN108603184B; EP3417057A1; AU2017220672A1; WO2017140878A1

Abstract

本发明涉及分离的阿拉伯聚糖酶作为家畜饲养中的饲料添加剂的用途，所述酶包括(1‑5)‑α‑L‑阿拉伯聚糖)中的(1‑5)‑α‑阿拉伯呋喃糖苷键的内切水解(EC 3.2.1.99，和α‑L‑阿拉伯聚糖或α‑L‑阿拉伯糖‑低聚物的非还原末端处的(1‑5)‑α‑阿拉伯呋喃糖苷键的水解的活性(EC 3.2.1.55)，所述酶特别是从Arxula adeninivorans中分离的阿拉伯聚糖降解酶。此外，本发明涉及阿拉伯聚糖酶在果汁或生物燃料的生产中的应用。

Description

阿拉伯聚糖酶及其用途

本发明涉及具有阿拉伯聚糖酶活性的水解酶及其在家畜饲养中作为饲料添加剂的用途。

背景技术

阿拉伯聚糖是一种主要作为果胶的侧链出现的中性多糖。直链α-L-阿拉伯聚糖由通过α-1,5-糖苷(阿拉伯呋喃糖苷)键连接的阿拉伯糖单体的主链组成。在支链α-L-阿拉伯聚糖中，阿拉伯糖单体或阿拉伯糖低聚物通过α-1,2-或α-1,3-糖苷(阿拉伯呋喃糖苷)键与主链连接。

阿拉伯聚糖酶是能够切割阿拉伯聚糖的水解酶。内切阿拉伯聚糖酶(EC3.2.1.99)水解α-L-阿拉伯聚糖的直链主链内的α-1,5-糖苷键。α-L-阿拉伯糖-呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)在α-L-阿拉伯聚糖或α-L-阿拉伯糖-低聚物的非还原末端处水解α-1,5-和/或α-1,3-和/或α-1,2-糖苷键，从而释放阿拉伯糖单体。

菜籽粕(RSM)和豆粕(SBM)是生物乙醇和食品生产的副产物。它们廉价，可大规模获得，并且具有高蛋白质含量。由于这些原因，它们通常用作家禽和猪的饲料成分。它们含有许多非淀粉多糖(NSP)，主要是果胶，其只能被动物部分消化。对于家禽来说，来自菜籽粕和豆粕的NSP的消化率分别为14％和20％。猪能够消化58％的来自菜籽粕的NSP，和84％的来自豆粕的NSP。底物的消化程度在不同年龄的动物之间也不同。特别是幼小动物不能充分利用饮食中存在的碳水化合物，其对生长表现具有负面影响(抗营养作用)。

如果饲料成分仅被部分消化，则不能利用饲料成分中包含的所有能量。此外，未消化的NSP对消化道内饲料的粘度有影响。增强流动性导致其他营养素的消化率受损。

为了改善NSP的消化，可以机械、热或酶预处理饲料成分或复合饲料。

在20世纪80年代建立了酶在家畜饲养中的应用。添加到饲料中的普通酶制剂包含纤维素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶和/或果胶酶活性。某些制剂含有几种酶活性(多组分制剂)，其他制剂仅含有一种活性(单组分制剂)。

WO 1992017592 A1(“Cloning and expression of DNA molecules encodingarabinan-degrading enzymes of fungal origin)描述了真菌阿拉伯聚糖酶的克隆及其在水果和蔬菜汁生产中的用途。

WO 1994020611 A1("An enzyme with arabinanase activity")描述了一种富含来自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的阿拉伯聚糖酶的酶制剂。

WO 1995029598 A1("Enzymatic treatment of soy")描述了用于处理豆粕的水性悬浮液的包含几种酶活性的混合物(包括真菌来源的内切阿拉伯聚糖酶)。

US 2011/0287135("Novel arabinohydrolases")描述了用于水解植物生物质中存在的阿拉伯聚糖的包含几种具有阿拉伯聚糖酶活性的酶的多酶组合物。

本发明所要解决的问题是改善富含果胶的饲料成分或混合饲料的可消化性。该问题通过独立权利要求的主题而解决。

具体实施方式

本发明的第一方面涉及具有阿拉伯聚糖酶活性的分离酶和具有阿拉伯聚糖酶活性的分离酶的用途。阿拉伯糖酶活性的特征在于其包含以下活性：

a.(1-5)-α-L-阿拉伯聚糖中(1-5)-α-阿拉伯呋喃糖苷键的内切水解(EC3.2.1.99)，和

b.α-L-阿拉伯聚糖或α-L-阿拉伯糖-低聚物的非还原末端处的(1-5)-α-阿拉伯呋喃糖苷键的水解(EC 3.2.1.55)。

在本说明书的上下文中，术语“阿拉伯聚糖”表示包含通过α-1,5-糖苷键连接的阿拉伯糖单体的主链的多糖。在支链阿拉伯聚糖中，阿拉伯糖单体或阿拉伯糖低聚物通过α-1,2-和/或α-1,3-糖苷键与主链连接(图1)。

在本说明书的上下文中，术语“酶”表示由单个氨基酸链组成的单个蛋白质。

在本说明书的上下文中，术语“分离酶”表示所述酶是有意产生/分离的，并且不是随机的、次要的或可忽略的组分或副产物。

根据本发明的具有阿拉伯聚糖酶活性的酶能够从还原末端(阿拉伯呋喃糖苷酶活性)和阿拉伯聚糖链内(内切阿拉伯聚糖酶活性)降解阿拉伯聚糖。因此它是双功能性的。

在某些实施方式中，所述酶的特征在于，氨基酸序列与SEQ ID NO 02表现出至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％、99％或100％的同一性。

根据本发明的酶从A.adeninivorans基因组DNA扩增。

在某些实施方式中，所述酶另外催化α-L-阿拉伯聚糖或α-L-阿拉伯糖-低聚物非还原末端处的(1-3)和/或(1,2)-α-阿拉伯呋喃糖苷键的水解。

内切阿拉伯聚糖酶活性和阿拉伯呋喃糖苷酶活性的存在具有可以更有效地降解支链阿拉伯聚糖的优点。阿拉伯呋喃糖苷酶活性降解与阿拉伯聚糖主链连接的阿拉伯糖低聚物，并除去与阿拉伯聚糖主链连接的阿拉伯糖单体(脱支)。平行地，直链主链被内切阿拉伯聚糖酶活性降解(解聚)。已知内切阿拉伯聚糖酶活性抑制阿拉伯聚糖低聚物的存在。由于阿拉伯呋喃糖苷酶活性，在解聚过程中产生的低聚物被降解。因此，根据本发明的酶的双重活性导致阿拉伯聚糖的完全和有效降解。

所述酶在40℃至55℃的温度下表现出最佳活性。所述酶在3.5至5.5的pH下表现出最佳活性。

无需进一步配制，根据本发明的酶可热稳定至约65℃的温度。在60℃温育2小时期间，酶活性不降低。这与从棘孢曲霉分离的阿拉伯聚糖酶(WO 1994020611A1)(其在50℃下被部分抑制)相比表示改善的热稳定性。根据本发明的酶在pH 3至pH 9之间以及在50mmol/l～100mmol/l的盐浓度下也是稳定的。

这些性质使得能够产生包含根据本发明的酶的饲料。阿拉伯聚糖酶活性可被进一步保护，例如通过防止造粒过程中酶活性损失的热保护涂层进行进一步保护。

根据本发明的酶在消化道内的环境条件下具有活性。

本发明的另一方面涉及根据本发明第一方面的任何实施方式的分离酶用于降解植物生物质或用于制备原料添加剂的用途。在本发明该方面的某些实施方式中，植物生物质是富含果胶的植物生物质。

在本发明该方面的某些实施方式中，制备原料添加剂(feedstock additive)并用于家畜饲养。

在本发明该方面的某些实施方式中，植物生物质是包含含果胶的植物材料的液体制剂，特别是苹果汁、梨汁、葡萄汁、橙汁、柠檬汁、番茄汁或胡萝卜汁。使用分离酶降解植物生物质包括使液体制剂与酶接触。

在本发明该方面的某些实施方式中，植物生物质的降解涉及用于生物燃料生产，特别是生物气和生物乙醇生产的底物的改善的降解。

本发明的另一方面涉及分离的核酸序列。可以表达用于实施本发明的酶的核酸序列

a.编码根据本发明的第一方面的酶；和/或

b.包含SEQ ID NO 01所示的核酸序列或基本上由其组成；和/或

c.包含至少750、800、850、900、950、1000、1050、1100或1150个碱基对的序列，其能够在高严谨条件下与SEQ ID NO 01杂交。

在本说明书的上下文中，术语“高严谨条件”涉及杂交条件，其基本上需要500bp长度的多核苷酸的所有碱基与其它多核苷酸的互补碱基配对。

本发明的另一方面涉及重组表达载体，从其可以表达用于实施本发明的酶。该载体包含如上所述的核酸序列，其中所述核酸序列与促进核酸序列在宿主细胞中表达的调控元件可操作地连接。

本发明的另一方面涉及包含上述核酸序列或上述重组表达载体的细胞。

在本发明该方面的某些实施方式中，所述细胞是原核细胞，特别是属于埃希氏菌(Escherichia)属或芽孢杆菌(Bacillus)属的细胞。

在本发明该方面的某些实施方式中，所述细胞是真核细胞，特别是丝状真菌或酵母细胞。丝状真菌可选自曲霉属(Aspergillus ssp)细胞，特别是米曲霉(Aspergillusoryzea)细胞或黑曲霉(Aspergillus niger)细胞，或选自木霉属(Trichoderma ssp)细胞，特别是里氏木霉(Trichoderma reesei)细胞。酵母细胞可选自Arxula adeninivorans细胞、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)细胞、毕赤酵母属(Pichia ssp.)细胞，特别是巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞。

本发明的另一方面涉及合成用于实施本发明的酶的方法。合成用于实施本发明的酶的方法包括以下步骤：

a.提供包含细胞，特别是酵母细胞，特别是Arxula adeninivorans或多形汉逊酵母的细胞培养物，其中所述细胞包含重组表达载体，所述重组表达载体包含编码所述酶的DNA序列，

b.以分批进料程序发酵所述细胞，和

c.从细胞培养物中纯化所述酶。

在本发明该方面的某些实施方式中，所述细胞选自Arxula adeninivorans或多形汉逊酵母。

在本发明该方面的某些实施方式中，分批进料程序包括分批阶段和进料阶段，其中进料阶段在pH 6和pO₂ 40％下进行。

根据本发明的另一方面，提供了包含具有阿拉伯聚糖酶活性的酶的单组分酶制剂。阿拉伯聚糖酶活性催化

a.(1-5)-αL阿拉伯聚糖中的(1-5)-α-阿拉伯呋喃糖苷键的内切水解(EC3.2.1.99)，和

在本说明书的上下文中，术语“单组分酶制剂”表示基本上含有单一酶的酶制剂。

根据本发明的单组分酶制剂基本上含有单一双功能酶。使用含有双功能酶而不是多组分酶制剂的“单组分酶制剂”的一个优点是单一酶制剂的生产更快且更具成本效益。生产和使用的参数可以更容易地优化。此外，用作饲料添加剂的多组分酶制剂的注册比单一组分酶制剂的注册复杂得多且具有挑战性。

在本发明该方面的某些实施方式中，具有阿拉伯聚糖酶活性的酶的特征在于，SEQID NO 02的氨基酸序列或与SEQ ID NO 02表现出至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在本发明该方面的某些实施方式中，阿拉伯聚糖酶活性另外催化α-L-阿拉伯聚糖或α-L-阿拉伯糖-低聚物的非还原末端处的(1-3)-α-和/或(1-2)-α-阿拉伯呋喃糖苷键的水解。

根据本发明的另一个方面，提供了根据本发明第一方面的任何实施方式的分离酶用于制备用于降解植物生物质或用于制备原料添加剂的单组分酶制剂的用途。在本发明该方面的某些实施方式中，植物生物质是富含果胶的植物生物质。

根据本发明的另一方面，提供了一种降解植物生物质的方法。该方法包括以下步骤：

a.提供植物生物质的含水制剂，特别是选自包含含果胶的植物材料的液体制剂，特别是苹果汁、梨汁、葡萄汁、橙汁、柠檬汁、番茄汁或胡萝卜汁，或用于生物燃料生产的底物，然后

b.添加具有本文所述阿拉伯聚糖酶活性的分离酶，

c.在所述分离酶存在下，在35℃至60℃，特别是40℃至55℃的温度和3.5至5.5的pH下，使所述植物生物质的含水制剂反应，和

d.从所述方法中收集降解产物。

根据本发明的另一方面，提供了一种复合饲料，其包含以下或基本上由其组成：

a.富含果胶的生物质，和

b.如本发明各个方面所述的单组分酶制剂。

在本说明书的上下文中，术语“复合饲料”涉及包含多种组分的动物饲料。这些组分的非限制性实例是含碳水化合物的组分、含蛋白质的组分和诸如维生素或酶制剂等饲料添加剂。

在本发明的背景下，术语“富含果胶的生物质”涉及其中细胞壁包含以干重计超过12％果胶的生物质。富含果胶的生物质的非限制性实例是大豆和豆粕(SBM)、羽扇豆、菜籽、菜籽粕(RSM)、其他油籽和豆科植物以及甜菜。

在某些实施方式中，所述复合饲料包含5％～50％(w/w)，特别是15％～25％(w/w)的富含果胶的生物质。

根据本发明上述方面的替代方式，提供了一种复合饲料，其包含富含果胶的生物质和如本发明各个方面所述的单组分酶制剂，并且另外包含另一种饲料组分，特别是含有淀粉的饲料组分，例如谷物或玉米。

换句话说，本发明提供了具有显著百分比的富含果胶的生物质和添加以促进果胶组分利用的单一酶制剂的复合饲料。果胶和阿拉伯聚糖酶组分可以单独成球团(pelleted)，或与富含淀粉(小麦、玉米)并且通常构成饲喂给农场动物的复合饲料的50％至95％的常规复合饲料组分一起成球团。

根据本发明的酶作为饲料添加剂的应用改善了诸如大豆和豆粕(SBM)、羽扇豆、菜籽、菜籽粕(RSM)、其他油籽和豆科植物以及甜菜等富含果胶的食品的可消化性。

令人惊讶的是，本发明的发明人发现，添加根据本发明的高活性双功能阿拉伯聚糖酶能够以意想不到的程度改善诸如豆粕或菜籽粕等富含果胶的饲料成分的降解。阿拉伯聚糖酶仅作用于阿拉伯聚糖。它释放阿拉伯糖聚合物、低聚物和单体，其可被进一步开发。此外，改善了饲料的流动性。观察到的效果是令人惊讶的，因为酶不作用于主要由聚半乳糖醛酸组成的果胶主链。如植酸酶VP(DSM)等果胶酶制剂主要作用于果胶主链。

出乎意料的是，在从天然存在的聚合物中释放阿拉伯糖-低聚物和/或单体时，根据本发明的阿拉伯聚糖酶比相当的果胶酶制剂更快且更有效。饲料添加剂的快速效果是有利的，因为对于家禽和其他单胃动物，肠道内的保留时间仅为4小时至8小时(Enzyms infarm animal nutrition，第2版，Bedford und Partridge，2010)。

在本发明该方面的某些实施方式中，所述酶制剂的浓度为1mg/kg～500mg/kg，特别是10mg/kg～400mg/kg，更特别是100mg/kg～300mg/kg。

在本发明该方面的某些实施方式中，富含果胶的生物质选自甜菜、油籽和豆科植物，更特别是菜籽、菜籽粕、羽扇豆、大豆和豆粕。

在本发明该方面的某些实施方式中，所述复合饲料还包含另外的分离酶，特别是植酸酶、蛋白酶和/或NSP降解酶，其浓度为1mg/kg～500mg/kg，更特别是10mg/kg～400mg/kg，更特别是100mg/kg～300mg/kg。

在本发明该方面的某些实施方式中，所述复合饲料包含两种分离酶，其选自：

a.根据本发明的第一方面的酶和植酸酶；

b.根据本发明的第一方面的酶和NSP降解酶，特别是果胶酶；和

c.根据本发明的第一方面的酶和蛋白酶，特别是酸稳定的丝氨酸蛋白酶。

阿拉伯聚糖酶和植酸酶的协同作用已在家禽饮食中显示出。不希望受理论束缚，本发明的发明人认为果胶被阿拉伯聚糖酶部分降解降低了该特定NSP部分(fraction)的抗营养作用并增加了表观代谢能。阿拉伯聚糖侧链的水解还可以促进植酸盐的降解，其对补充的植酸酶变得更可及，导致更高的磷酸盐和复合的微量元素的释放。微量元素的存在也可能增加阿拉伯聚糖酶的活性，这在先前的实验室实验中显示。

阿拉伯聚糖酶和NSP降解酶(特别是果胶酶)的补充，在家禽饮食中显示出协同作用。这两种酶的优点，即阿拉伯聚糖酶对侧链的快速解聚和果胶酶对果胶主链的有效降解，导致富含NSP的饮食中抗营养作用的减少和表观代谢能的增加(图3和4)。

蛋白酶和阿拉伯聚糖酶的协同作用已在家禽饮食中显示出。果胶被阿拉伯聚糖酶部分降解降低了该特定NSP部分的抗营养作用。阿拉伯聚糖侧链的降解有利于接近蛋白质，所述蛋白质被果胶和纤维包裹。蛋白酶催化之前难以接近的蛋白质分解，导致肽和氨基酸的释放更高。通过组合方法似乎强烈地增加了表观代谢能。

根据本发明的另一方面，提供了上述复合饲料在家畜饲养中的用途。所述家畜选自单胃动物，特别是家禽或猪，更特别是选自鸡、鸭和火鸡的家禽。

根据本发明的另一方面，根据本发明的任一上述方面或实施方式所述的酶用于处理含果胶的植物材料，例如水果和蔬菜。

该方面的某些实施方式提供了用于处理包含含果胶植物材料的水果醪(fruitmash)或液体制剂的方法。该方法包括使植物材料的醪或液体制剂与本发明第一方面中所述的分离的阿拉伯聚糖酶或其制剂接触。在某些实施方式中，还可含有纤维素酶、葡聚糖酶、淀粉酶和/或果胶酶的阿拉伯聚糖酶制剂用于改善水果和蔬菜中醪的可提取性和降解性。将酶或酶制剂加入水果醪中，并在10℃至25℃的温度下以10mg/kg～400mg/kg，更特别是100mg/kg～300mg/k醪的浓度温育1小时至5小时。在酶促预处理后，从醪中压出汁液。在某些实施方式中，阿拉伯聚糖酶制剂用于降低粘度，尤其是在苹果汁或梨汁中。在某些实施方式中，阿拉伯聚糖酶制剂用于防止雾度产生。将阿拉伯聚糖酶或阿拉伯聚糖酶制剂加入到浑浊汁液中，其pH值在3和4.5之间，以10℃至25℃温度，10mg/kg～400mg/kg，更特别是100mg/kg～300mg/kg果汁的浓度并且温育1小时至5小时。然后通过添加硅藻土、膨润土或其他添加剂来清洁果汁并过滤。通过巴氏杀菌保存所得澄清果汁。

在某些实施方式中，植物材料的液体制剂是果汁，特别是来自苹果、梨或葡萄的汁液。在某些实施方式中，植物材料的液体制剂是蔬菜汁，特别是来自番茄或胡萝卜的汁液。

可以调整果汁的稠度和外观。例如来自水果和蔬菜(如苹果、浆果、葡萄、柑橘、番茄或胡萝卜)的澄清果汁、云稳(cloud stable)果汁或果泥等具有特定性质的产品可以单独使用本发明的阿拉伯聚糖酶或与其他酶(如纤维素酶、葡聚糖酶、果胶酶和/或淀粉酶)组合产生。

根据本发明的另一方面，根据本发明的任一个方面或实施方式所述的酶用于处理含有果胶的植物材料，例如甜菜、全植物青贮料、水果或生物燃料生产过程中含阿拉伯聚糖的其他有机底物。生物燃料生产包括生物乙醇或生物气的生产。

通过用本发明的阿拉伯聚糖酶单独或与其他水解酶组合预处理富含果胶的生物质(如甜菜、水果、水果醪和其他含果胶的底物)可以增强生物乙醇的产生。将酶或酶制剂加入富含果胶的生物质中，并在30℃至60℃的温度下以10mg/kg～400mg/kg，更特别是100mg/kg～300mg/kg醪的浓度温育1小时至5小时。令人惊讶的是，果胶的阿拉伯聚糖侧链的降解导致葡萄糖的更高释放，这在发酵后导致更高量的乙醇。

对于生物气生产，将农业底物(例如甜菜、全植物青贮料或其他含阿拉伯聚糖的生物质)添加到厌氧生物气发酵罐中。将单独的阿拉伯聚糖酶制剂或阿拉伯聚糖酶和其他NSP降解酶(如纤维素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶或果胶酶)的组合，或阿拉伯聚糖酶和诸如酸稳定的丝氨酸蛋白酶等蛋白酶的组合，例如每天与底物一起或通过单独的供应系统定期添加到该过程中。生物气发酵在30℃～60℃的温度下进行。水力保留时间(Hydraulic retentiontime)介于30天至150天之间。加入的酶制剂的量取决于进料至发酵罐的底物量。需要1mg/kg～500mg/kg底物，更特别是10mg/kg～400mg/kg底物，更特别是100mg/kg～300mg/kg底物的剂量。

令人惊讶的是，单独使用本发明的阿拉伯聚糖酶或与其他酶(如纤维素酶、葡聚糖酶、果胶酶、木聚糖酶或蛋白酶)组合使用，导致粘度降低和/或在厌氧条件下从富含果胶的底物产生更高的生物气。

附图说明

图1显示阿拉伯聚糖的示意图。

图2显示分批进料程序。

图3显示根据本发明的阿拉伯聚糖酶和通过已建立的饲料添加剂对豆粕的降解。

图4显示根据本发明的阿拉伯聚糖酶和通过已建立的饲料添加剂对菜籽粕的降解。

图5显示根据本发明的阿拉伯聚糖酶和通过黑曲霉的阿拉伯聚糖酶对豆粕的降解。

图6显示根据本发明的阿拉伯聚糖酶和通过黑曲霉的阿拉伯聚糖酶对菜籽粕的降解。

实施例

以下实施例旨在说明本发明及其某些实施方式，但不限制本发明的范围。

克隆和酵母转化

用分别含有EcoRI和PstI的限制性位点的寡核苷酸5’-CAGGAATTCG GCAGAGGCACAATGAAGA-3’(SEQ ID NO 03)和5’-CAGCTGCAGT GGATAGTAGA TGGATGGTAG TA-3’(SEQ IDNO 04)从A.adeninivorans基因组DNA扩增阿拉伯聚糖酶基因(AABN)，以用于亚克隆到pBS-TEF1-PHO5载体(Wartmann，Fems Yeast Research，2003.3(2)：第223-232页)。选择以下PCR参数：使用Long PCR Enzyme Mix(Thermo scientific)，95℃2分钟，95℃15秒，58℃15秒，72℃3分钟(25个循环)。大肠杆菌Xl1-Blue细胞(recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17supE44 relA1 lac[F′proAB lacI^qZΔM15 Tn10(Tet^r)])用于标准热转化(Green,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第四版).2012:Cold Spring HarborLaboratory Press)并在LB培养基中生长，在需要选择时补充以氨苄青霉素(50μg mL^-1；AppliChem，德国)。该质粒作为模板，以应用与上述相同的PCR条件，使用寡核苷酸5’-CTGCCGCGGC TCGACTTCAA TCT-3’(SEQ ID NO 05)和5’-CCGCCGCGGC CCCAGCTTGC ATG-3’(SEQ ID NO 06)来扩增配备有组成型TEF1启动子的AABN基因，所述5’-CTGCCGCGGCTCGACTTCAA TCT-3’(SEQ ID NO 05)和5’-CCGCCGCGGC CCCAGCTTGC ATG-3’(SEQ ID NO06)两者都含有SacII限制性位点，以用于将构建体整合到表达/转化载体中(Boer，Appl Microbiol Biotechnol，2009.84(3)：第583-594页)。在用AscI限制性酶切所得质粒后，根据Hollenberg转化方法(Dohmen，Yeast，1991.7(7)：第691-692页)将仅由包含ATRP1选择标记的酵母序列组成的AABN表达盒转化到营养缺陷型突变体A.adeninivorans G1212[aleu2 atrp1：ALEU2](Steinborn，J Biotechnol，2007.127(3)：第392-401页)。

基于阿拉伯聚糖酶的氨基酸序列，单体的估计分子量为42326.16道尔顿。除去推定的23个氨基酸分泌信号后，成熟单体的分子量为40094.45道尔顿。

酶活性的确定

所述酶表现出内切阿拉伯聚糖酶活性和阿拉伯呋喃糖苷酶活性(EC 3.2.1.99，EC3.2.1.55)。

在光度测定法中确定内切阿拉伯聚糖酶活性。直链阿拉伯聚糖(例如脱支的阿拉伯聚糖Megazyme P-DBAR)用作底物。在一定温度下(40℃、45℃、50℃、55℃或60℃)将酶与底物在具有一定pH(pH 4、5、6、7或8)的缓冲液中一起孵育一定时间(10分钟、20分钟或30分钟)。在温育时间结束时，在氧化还原反应中检测到通过酶从底物释放的单糖和寡糖的还原末端。在该反应中，碳水化合物的末端半缩醛基被氧化成羧基，而加入的2-羟基-3,5-二硝基苯甲酸(3,5-二硝基水杨酸，DNSA)被还原，导致吸收波长在光度测定上可检测的增加(红移)。

将结果与校准曲线进行比较，校准曲线表示几种已知阿拉伯糖浓度与吸收波长之间的线性关系。

使用在55℃下pH为5.0的乙酸盐缓冲液中的底物脱支的阿拉伯聚糖(Megazyme)测定酶制剂中的内切阿拉伯聚糖酶活性。取决于批次，活性为3000U g^-1～5000U g^-1制剂。甘油(10％)中的干燥产品和酶溶液可稳定数月。

使用合成底物对硝基苯基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷确定阿拉伯呋喃糖苷酶活性。在特定温度(40℃)下，将酶与底物在具有一定pH(pH 4、5、6、7或8)的缓冲液中一起温育一定时间(10分钟、20分钟、30分钟或40分钟)。所述酶从阿拉伯糖中释放对硝基苯酚，导致在415nm处吸收的在光度测定上可检测的变化。使用对硝基苯酚校准曲线进行评估。

使用在40℃下pH为5.0的柠檬酸盐缓冲液中的底物对硝基苯基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷(1mM)确定酶制剂中的阿拉伯呋喃糖苷酶活性。取决于批次，测量的活性为200U g^-1～400U g^-1制剂。

根据以下公式确定酶活性：

pH稳定性和温度稳定性

无需进一步配制，阿拉伯聚糖酶可热稳定至约65℃的温度。在60℃温育2小时或在pH 3至9温育48小时期间，酶活性不降低。所述酶在40℃至55℃的温度和3.5至5.5的pH下表现出最佳活性。在pH为5.5的柠檬酸盐缓冲液中确定最佳温度。使用乙酸盐缓冲液(pH 3-6.5)、柠檬酸盐缓冲液(pH 3.5-7)、磷酸盐缓冲液(pH 5.5-7.5)和Tris HCl(pH 7-9)确定最佳pH。锰盐(MnSO₄、MnCl₂)的存在对酶活性具有正面影响。

阿拉伯聚糖酶的产生

为了产生阿拉伯聚糖酶，包含阿拉伯聚糖酶(AABN)表达盒的A.adeninivorans以分批进料程序发酵。

在分批阶段期间，使用以下完全培养基：

在进料阶段期间，使用下列两种底物：

在15小时的分批阶段之后，开始进料循环(图2)。发酵在40％pO₂和pH 6下发生5天；使用NaOH(25％)和H₃PO₄(10％)调节pH。在发酵过程结束时，上清液中的酶活性为80U g^-1～90U g^-1。在离心步骤中除去酵母细胞，从上清液中纯化酶。

通过水解酶确定植物生物质降解(非生物实验)

根据时间、温度、pH和酶浓度确定植物生物质降解的程度。

在1.4ml McIlvaine缓冲液(pH 6)中的反应管(V＝2ml)中提供50mg无水的研磨植物生物质(挥发性固体，VS)。缓冲液含有叠氮化钠(0.02％)和抗生素(青霉素：100I.U.ml^-1，链霉素：0.1mg ml^-1)，从而防止微生物生长和由测试酶释放的糖部分的消化。

在每个实验时间点(TP)，样品和对照(底物对照和酶对照)重复两次(表1)。此外，在McIlvaine缓冲液(pH 6)中制备0mmol l^-1～500mmol l^-1的葡萄糖标准样品。

向底物对照中加入140μl水，同时向样品中加入140μl酶制剂。温育在40℃下振荡发生。分析时间点为2小时(TP 1)、4小时(TP 2)和6小时(TP 3)。在每个时间点，通过添加140μl NaOH(2M)和140μl葡萄糖(30mM)来终止酶促反应。然后将样品以10.000g离心5分钟。

将40μl上清液转移到新的反应管中。加入180μl蒸馏水和100μl二硝基水杨酸试剂(DNSA)。将样品在水浴中加热(10分钟，100℃)，随后在冰上冷却。加入1ml蒸馏水。将250μl每种样品转移至微量滴定板，并使用光度计在530nm下分析。

通过用葡萄糖标准曲线比较样品而确定由酶促反应释放的葡萄糖的量(以mg计)。酶的降解活性由释放的还原糖和展开(deployed)的底物的比例(50mg植物生物量，VS)而确定。

表1

豆粕(SBM)的降解

如之前部分所述，分析了根据本发明的酶对豆粕的降解。为了将结果与现有技术相关联，平行确定了作为饲料添加剂(植酸酶Multigrain和植酸酶VP)建立的两种酶制剂的降解活性。

所有三种酶制剂均以25.000ppm使用，该剂量约比实际应用的推荐剂量高100倍。高剂量是在非生物测试程序中获得快速和可靠结果所必需的。

6小时后，植酸酶Multigrain(主要含有木聚糖酶和葡聚糖酶)对SBM的降解约为1％。6小时后，植酸酶VP(含有半纤维素酶和果胶酶)对SBM的降解约为8％。6小时后，根据本发明的阿拉伯聚糖酶对SBM的降解约为11％(图3)。

令人惊讶的是，阿拉伯聚糖酶对SBM的降解比植酸酶VP对SBM的降解要快得多。这种观察是重要的，因为通过消化道只需要几个小时。因此，与使用目前建立的饲料添加剂相比，使用阿拉伯聚糖酶作为用于家禽、猪或其他单胃动物的饲料添加剂是显著的改善。

本发明的发明人表明，通过组合添加根据本发明的阿拉伯聚糖酶和果胶酶产物，可以实现协同效应。

菜籽粕(RSM)的降解

如之前部分所述，分析了根据本发明的酶对菜籽粕的降解。为了将结果与现有技术相关联，平行确定了作为饲料添加剂(植酸酶Multigrain和植酸酶VP)建立的两种酶制剂的降解活性。

植酸酶Multigrain(主要含有木聚糖酶和葡聚糖酶)对RSM的降解约为1％。6小时后，植酸酶VP(含有半纤维素酶和果胶酶)对RSM的降解约为7％。6小时后，根据本发明的阿拉伯聚糖酶对RSM的降解约为10％(图4)。

令人惊讶的是，阿拉伯聚糖酶对RSM的降解比植酸酶VP对RSM的降解要快得多。这种观察是重要的，因为通过消化道只需要几个小时。因此，与使用目前建立的饲料添加剂相比，使用阿拉伯聚糖酶作为用于家禽、猪或其他单胃动物的饲料添加剂是显著的改善。

饲养实验(家禽)

为了评估根据本发明的阿拉伯聚糖酶的功效，给肉鸡饲喂补充有本发明的阿拉伯聚糖酶的复合饲料。在10日龄时，将96只肉鸡分成4组。所有肉鸡均接受包含菜籽粕(35％)和玉米(60％)的基础饮食。A组接受未补充的基础饮食，B组接受补充有确定的饲料酶产品(植酸酶VP)的基础饮食，C组和D组接受补充有本发明酶的基础饮食(表2)。饲养实验的持续时间为15天。在适应阶段(第11天～14天)期间，所有组都接受了无任何酶补充的基础饮食。在实验阶段(第15天～25天)期间，所有组都接受相应的补充饮食。在整个实验期间每天测定饲料摄入。在达到时，在第14天、第21天和第25天确定体重。从第21天至第25天每天三次收集排泄物，以评估表观代谢能。

表2

在实验开始和实验期间对补充有酶的实验饮食的分析表明阿拉伯聚糖酶活性在整个实验中是可检测的和稳定的。

分析了以下参数：

饲料摄入	每日
		体重	在第14天、第21天和第25天
表观代谢能(AME)	第21天至第25天

观察到接受不含酶的饮食的组(A组)比阳性对照组(B)和两个测试组(C和D)的重量增加更少。此外，A组的饲料摄入量低于其他组(B～D)。对于D组(1,61)和B组(1,62)，饲料转化率最佳，这意味着接受植酸酶VP或实验性阿拉伯聚糖酶的组可以最有效地利用饮食中存在的能量。

这表明富含果胶的饮食与阿拉伯聚糖酶的补充导致富含果胶的底物的更好降解，菜籽粕的抗营养作用的降低和能量代谢方面的强烈积极效果。

阿拉伯聚糖酶活性的比较

以光度测定法确定本发明的阿拉伯聚糖酶(Arxula adeninivorans)和来自黑曲霉的商业阿拉伯聚糖酶(Megazyme E-EARAB)的内切活性。使用脱支的阿拉伯聚糖(Megazyme P-DBAR)作为底物。在55℃将酶与底物一起在pH为5的缓冲液中温育20分钟。在温育时间结束时，在氧化还原反应中检测通过酶从底物释放的单糖和寡糖的还原末端。在该反应中，碳水化合物的末端半缩醛基被氧化成羧基，而加入的2-羟基-3,5-二硝基苯甲酸(3,5-二硝基水杨酸，DNSA)被还原，导致吸收波长在光度测定上可检测的增加(红移)。

在所述条件下，本发明的阿拉伯聚糖酶的活性为5500U/g，商业上可获得的黑曲霉阿拉伯聚糖酶的活性为645U/g。

如上文详述，在非生物测试中确定由两种酶引起的植物生物质降解。使用菜籽粕和豆粕作为不溶性底物，因为这些底物含有大量的果胶，其富含阿拉伯聚糖侧链。

对于该实验，将12,500ppm的Arxula adeninivorans的阿拉伯聚糖酶和107,000ppm的黑曲霉添加到底物中，其意味着将相等的酶活性添加到底物中(68个单位/克底物oDM)。

将所有样品在40℃下温育24小时。在4小时、6小时和24小时后，确定上清液中还原糖的量。使用Arxula阿拉伯聚糖酶在最初的24小时内降解了9％的豆粕，而曲霉属阿拉伯聚糖酶仅释放了2％的碳水化合物(图5)。如果使用Arxula阿拉伯聚糖酶，则菜籽粕的降解也高于使用曲霉属阿拉伯聚糖酶的情况(图6)。

令人惊讶的是，尽管应用了相等水平的内切阿拉伯聚糖酶活性，但本发明的阿拉伯聚糖酶在降解不溶解的植物材料方面比黑曲霉的阿拉伯聚糖酶有效地多。

序列表

<110> 百奥普拉特公司

<120> 阿拉伯聚糖酶及其用途

<130> bpt101wo

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1173

<212> DNA

<213> Arxula adeninivorans

<400> 1

atgaagagcc aattgatcgc tacaattgca accgttgccc tgggctctat gagctctgtg 60

gtggcagcaa agtctaagac cgatgattcc aatacctatg atcgattcag gggactggtt 120

gattccaaca cctatgactt gatgaacaat tcactgggtg gaacatatgt ccacactccc 180

aacttgacgg tcattgatac tcccgattgg cctttgccta atccggttat tggagacatt 240

gtgccctggg gaggtgttca ccttcatgac ccttctatta tcaagcacaa tgggtattac 300

tactctttca ccacccacaa cttgattgga atttccaagg ctccatccat gtttggtccc 360

tggcaaaaga ttggaagtgt gttggaggag tccagtatca ttaacagtac tggaagcaca 420

gatccttggg cccctgatgt gcaaaaggtt ggagacacat tctactgcta ctacgccgtc 480

tcctcctttg gaagccccaa gtcgtcaatt ggactagcta cgtccaagac gcttgagccc 540

ggttcttgga ccgaccacgg agaggttatc agttctggtc ccaatgctcc ttaccctctc 600

aatgactcca atgccattga cgctaacctg cttgttgtgg agaatggcaa ttccgttcag 660

gaggcttatc tgctgtgggg gtctttctgg tctaacattt ggcagatcaa gctcaacaat 720

gatctgaccg tgccagacaa tgccattgcc aatgctgtcc agctcgccta cgacggcaca 780

attgacactc atccagttga aggtgcttat ctccacaagg ccagcaatgg atactactac 840

ttgtttgtgt ccaatggagt gtgctgtgga tacgacgctg ctctgcctga tgctggccga 900

gagtataaga tcttggtcgg tcgttcaaag tctccatctg gtcctttcct tgacaagaac 960

ggggtcgaca tggccaaggg cggtggatct cgaatctatg gttctcatgg aattgtctat 1020

ggacctggag gacagggagt gtttactgat gatgacggac aggatatcat ttactaccac 1080

tatgttgatc tgagagtcag tcttgccgat gatgacaagc gtctgggatg gaactatctc 1140

aagtacgaag acggttggcc aaaactcgtt tag 1173

<210> 2

<211> 390

<212> PRT

<213> Arxula adeninivorans

<400> 2

Met Lys Ser Gln Leu Ile Ala Thr Ile Ala Thr Val Ala Leu Gly Ser

1 5 10 15

Met Ser Ser Val Val Ala Ala Lys Ser Lys Thr Asp Asp Ser Asn Thr

20 25 30

Tyr Asp Arg Phe Arg Gly Leu Val Asp Ser Asn Thr Tyr Asp Leu Met

35 40 45

Asn Asn Ser Leu Gly Gly Thr Tyr Val His Thr Pro Asn Leu Thr Val

50 55 60

Ile Asp Thr Pro Asp Trp Pro Leu Pro Asn Pro Val Ile Gly Asp Ile

65 70 75 80

Val Pro Trp Gly Gly Val His Leu His Asp Pro Ser Ile Ile Lys His

85 90 95

Asn Gly Tyr Tyr Tyr Ser Phe Thr Thr His Asn Leu Ile Gly Ile Ser

100 105 110

Lys Ala Pro Ser Met Phe Gly Pro Trp Gln Lys Ile Gly Ser Val Leu

115 120 125

Glu Glu Ser Ser Ile Ile Asn Ser Thr Gly Ser Thr Asp Pro Trp Ala

130 135 140

Pro Asp Val Gln Lys Val Gly Asp Thr Phe Tyr Cys Tyr Tyr Ala Val

145 150 155 160

Ser Ser Phe Gly Ser Pro Lys Ser Ser Ile Gly Leu Ala Thr Ser Lys

165 170 175

Thr Leu Glu Pro Gly Ser Trp Thr Asp His Gly Glu Val Ile Ser Ser

180 185 190

Gly Pro Asn Ala Pro Tyr Pro Leu Asn Asp Ser Asn Ala Ile Asp Ala

195 200 205

Asn Leu Leu Val Val Glu Asn Gly Asn Ser Val Gln Glu Ala Tyr Leu

210 215 220

Leu Trp Gly Ser Phe Trp Ser Asn Ile Trp Gln Ile Lys Leu Asn Asn

225 230 235 240

Asp Leu Thr Val Pro Asp Asn Ala Ile Ala Asn Ala Val Gln Leu Ala

245 250 255

Tyr Asp Gly Thr Ile Asp Thr His Pro Val Glu Gly Ala Tyr Leu His

260 265 270

Lys Ala Ser Asn Gly Tyr Tyr Tyr Leu Phe Val Ser Asn Gly Val Cys

275 280 285

Cys Gly Tyr Asp Ala Ala Leu Pro Asp Ala Gly Arg Glu Tyr Lys Ile

290 295 300

Leu Val Gly Arg Ser Lys Ser Pro Ser Gly Pro Phe Leu Asp Lys Asn

305 310 315 320

Gly Val Asp Met Ala Lys Gly Gly Gly Ser Arg Ile Tyr Gly Ser His

325 330 335

Gly Ile Val Tyr Gly Pro Gly Gly Gln Gly Val Phe Thr Asp Asp Asp

340 345 350

Gly Gln Asp Ile Ile Tyr Tyr His Tyr Val Asp Leu Arg Val Ser Leu

355 360 365

Ala Asp Asp Asp Lys Arg Leu Gly Trp Asn Tyr Leu Lys Tyr Glu Asp

370 375 380

Gly Trp Pro Lys Leu Val

385 390

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> 包含限制性位点的引物，其用于扩增来自A. adeninivorans基因组DNA的阿拉伯聚糖酶基因(AABN)

<400> 3

caggaattcg gcagaggcac aatgaaga 28

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<400> 4

cagctgcagt ggatagtaga tggatggtag ta 32

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> 包含限制性位点的克隆引物

<400> 5

ctgccgcggc tcgacttcaa tct 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<220>

<223> 包含限制性位点的克隆引物

<400> 6

ccgccgcggc cccagcttgc atg 23

Claims

1.具有阿拉伯聚糖酶活性的分离酶的用途，其用于降解植物生物质，特别是富含果胶的植物生物质，或用于制备饲料添加剂，其中，所述阿拉伯聚糖酶活性包含以下活性：

a.(1-5)-α-L-阿拉伯聚糖中(1-5)-α-阿拉伯呋喃糖苷键的内切水解(EC 3.2.1.99)，和

2.如权利要求1所述的具有阿拉伯聚糖酶活性的分离酶的用途，其特征在于，氨基酸序列与SEQ ID NO 02表现出至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％、99％或100％的同一性。

3.如权利要求1或2所述的具有阿拉伯聚糖酶活性的分离酶的用途，其中，所述酶另外催化α-L-阿拉伯聚糖或α-L-阿拉伯糖-低聚物的非还原末端处的(1-3)-α-和/或(1,2)-α-阿拉伯呋喃糖苷键的水解。

4.如以上权利要求中任一项所述的具有阿拉伯聚糖酶活性的分离酶的用途，其中，所述酶在40℃至55℃的温度，和/或在3.5至5.5的pH下表现出最佳活性。

5.如以上权利要求中任一项所述的具有阿拉伯聚糖酶活性的分离酶在家畜饲养中的用途。

6.如权利要求1～4中任一项所述的具有阿拉伯聚糖酶活性的分离酶的用途，其中，所述植物生物质是包含含果胶的植物材料的液体制剂，特别是苹果汁、梨汁、葡萄汁、橙汁、柠檬汁、番茄汁或胡萝卜汁，并且所述用途包括使所述液体制剂与所述酶接触。

7.如权利要求1～4中任一项所述的具有阿拉伯聚糖酶活性的分离酶的用途，其用于改善用于生物燃料生产、特别是生物气和生物乙醇生产的底物降解。

8.具有阿拉伯聚糖酶活性的分离酶在制备单组分酶制剂中的用途，所述单组分酶制剂用于降解植物生物质或用于制备饲料添加剂，其中，所述阿拉伯聚糖酶活性包括以下活性：

b.α-L-阿拉伯聚糖或α-L-阿拉伯糖-低聚物的非还原末端处的键(EC 3.2.1.55)。

9.如权利要求8所述的具有阿拉伯聚糖酶活性的分离酶在制备单组分酶制剂中的用途，其中，所述酶的特征在于，氨基酸序列与SEQ ID NO 02表现出至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％、99％或100％的同一性。

10.如权利要求8或9中任一项所述的具有阿拉伯聚糖酶活性的分离酶在制备单组分酶制剂中的用途，其中，所述单组分酶制剂用于家畜饲养。

11.一种降解植物生物质的方法，该方法包括以下步骤：

a.提供植物生物质的含水制剂，其特别选自包含含果胶的植物材料的液体制剂，特别是苹果汁、梨汁、葡萄汁、橙汁、柠檬汁、番茄汁或胡萝卜汁，或用于生物燃料生产的底物，然后

b.添加权利要求2所述的具有阿拉伯聚糖酶活性的分离酶，

d.从所述方法中收集降解产物。

12.一种复合饲料，其包含以下a和b或基本上由a和b组成：

a.富含果胶的生物质，特别是选自甜菜、油籽、羽扇豆和豆科植物的富含果胶的生物质，更特别是菜籽、菜籽粕、大豆和豆粕；和

b.如权利要求8或9中任一项所述的单组分酶制剂。

13.如权利要求12所述的复合饲料，其还包含含有淀粉的生物质，特别是谷物或玉米。

14.如权利要求12或13中任一项所述的复合饲料，其中，所述酶制剂的浓度为1mg/kg～500mg/kg，特别是10mg/kg～400mg/kg，更特别是100mg/kg～300mg/kg。

15.如权利要求12～14中任一项所述的复合饲料，其还包含另外的分离酶，所述另外的分离酶选自植酸酶、蛋白酶和/或NSP降解酶，所述另外的分离酶的存在浓度为1mg/kg～500mg/kg，更特别是10mg/kg～400mg/kg，更特别是100mg/kg～300mg/kg。

16.如权利要求12～15中任一项所述的复合饲料在家畜饲养中的用途，其中，所述家畜选自单胃动物，特别是家禽或猪，更特别是选自鸡、鸭和火鸡的家禽。