JPH11501502A - 熱安定酵素の飼料添加物としての使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 熱安定キシラナーゼを動物飼料用添加物として提供する。このキシラナーゼは活性を実質的に損失しないで95℃に設定した水浴中１分間の加熱に耐え得るものである。このようなキシラナーゼはミクロテトロスポラフレキスオサ又はサーモモノスポラフスカから得ることができる。このような熱安定キシラナーゼを含有する飼料添加物はまた、穀物又は穀物性であることができる生理学的に許容可能な担体と組み合わせても提供される。少なくとも20重量％の穀物及び飼料１kg当たり0.00001〜10ｇの熱安定キシラナーゼタンパク質を含有する穀物性飼料も提供される。穀物は小麦、大麦、トウモロコシ、モロコシ、ライムギ、オートムギ、トリチカル及び米のうちの任意のものであることができる。穀物性飼料は家畜、そして特に家禽及びブタに与えることができる。

Description

【発明の詳細な説明】 熱安定酵素の飼料添加物としての使用 本発明は動物飼料用添加物としての酵素の使用、そして特に比較的高温での飼 料加工中に酵素活性が顕著に低下しないように酵素が熱に安定であるような使用 に関するものである。本発明はまた、このような熱安定酵素を含有する飼料添加 物や穀物性飼料も提供する。 動物が飼料をより効率的に消化できるように動物飼料を改善することが常に求 められている。主要な関心事の１つは単位重量当たりの飼料の費用を増加させな いで飼料転換率（ＦＣＲ）を改善することである。飼料のＦＣＲは動物の体重増 加に関して消費された飼料量の比率である。ＦＣＲが低いことは、一定量の飼料 が成長中の動物において比例してより多くの体重増加をもたらすことを示す。こ れは動物が飼料をより効率的に利用できることを意味する。ＦＣＲを低下させる ことができる１つの方法は動物による飼料消化性を改善し、そしてそれによって 動物が飼料から誘導できる栄養的利益を増加させることである。 澱粉、脂肪、タンパク質及びアミノ酸内容物のような飼料の栄養成分の消化性 には種々の制約がある。これらの制約には次のものが含まれる： （ｉ） 動物の腸に存在する物質の粘性。このような粘性は、少なくとも一部に は、混合架橋β−グルカンやアラビノキシランのような可溶性の非澱粉多糖によ るものである； （ii） 飼料の細胞壁、特に穀物のアリューロン層の細胞壁内における栄養素の 閉じ込め。このような閉じ込めは、動物の消化器系による分解作用に比較的耐性 である穀物細胞壁内の非澱粉多糖が高レベルであることによって生じる。これが 、細胞内に閉じ込められた栄養素を動物が栄養的に利用できないようにしている ；及び （iii） 動物及び特に幼若動物の腸内微生物集団の両者の内在性酵素活性の欠乏 。 消化性を妨げる上記問題は穀物性飼料、例えば小麦含有量の高い飼料の場合に は特に注目に値する。 飼料から得られる栄養素の消化性が悪いという問題の故に、動物の栄養需要を 満たすためにはより高いレベルのエネルギー及びタンパク質を提供する物質を含 有するように飼料を処方することが通常必要である。 今や、穀物性動物飼料に或る種の（補充）酵素を導入することが動物の腸に存 在する物質の粘度を低下させるのに有益であるという十分な証拠がある。この低 下は、可溶性キシランを加水分解しそれによって消化過程における重要な制約で ある消化対象物(digesta)の粘度を低下させるキシラナーゼのような酵素によっ て達成することができる。 補充物として添加されるキシラナーゼは標的動物の胃腸（ＧＩ）管内に見られ るｐＨ及び温度条件で安定且つ活性でなければならない。このようなインビボ条 件に暴露したときキシラナーゼが安定且つ活性でない場合には、消化対象物の粘 度を十分な程度に低下させることはできないであろう。動物飼料中の補充物とし てトリコデルマロンギブラキアタム(longibrachiatum)、アスペルギルスニガー( niger)及びフミコラインソレンス（insolens）のような真菌から誘導されるキシ ラナーゼを含めることが現在知られている。 ベッドフォード(Bedford)及びクラッセン(Classen)（The Journal of Nutriti on、122 巻、560 〜569 頁）はブロイラー鶏の場合にはインビボで測定した消化 対象物の粘度と体重増加及びＦＣＲ値との間に有意な関係があることを開示して いる。小麦及びライムギに基づく食餌を家禽に与えた場合、体重増加とＦＣＲに おける70〜80％ほども高い変動は腸での粘度の差異だけに基づいていることが示 された。これが高レベルの可溶性アラビノキシランを含有する穀物性飼料の消化 対象物の粘度の重要性に脚光を当てている。消化対象物の粘度が上昇すると、膵 臓酵素、基質及び消化過程の最終生成物の拡散が妨げられて全栄養素の消化性が 低下する。 動物飼料中にキシラナーゼを加えると家畜における消化対象物の粘度の低下を 助成することが見い出された。この結果、動物の飼料消化能力が高められ、消費 した単位飼料量当たりの動物の体重増加率が高められるので飼料のＦＣＲは低下 する。 キシラナーゼのような酵素補充物を、穀物のような生理学的に許容可能な担体 に酵素を注入して動物飼料中に含有させることは慣用である。この注入担体は他 の飼料成分と混合され、そしてその後動物に直接給餌されるキューブ又はペレッ トに圧縮される。 種々の飼料成分をキューブやペレットのような形態に加工する点には最近多く の進展があった。開発された方法は比較的高温を使用する。これは第一には製造 方法の効率を改善するためであり、そして第二には有害な細菌、特にサルモネラ を含有しない飼料を製造するためである。加えて、高温を使用すると得られるキ ューブやペレットの品質や耐久性が改善され、効率的に取り扱い得る成分の範囲 が増加し、そしてまた飼料中に加えることができる脂肪や糖蜜のような液体成分 のレベルも増加する。 現在使用されている加工技術は飼料成分混合物に比較的高温を比較的長期間適 用する。更に、混合物は加工中に比較的高圧に付され、そしてこれは形成される キューブ又はペレットの耐久性の上昇を助成する。 飼料の栄養特性を改善するために開発された加工方法の１つは蒸気ペレット形 成である。この方法は複合飼料を蒸気で処理してその温度及び水分含量を高める 工程を含んでいる。この工程は調節と称される。調節は飼料のタイプ及び処方に 依存して２〜３秒から数分継続する。調節器中の温度は100℃まで上昇させるこ とができる。その後、飼料はペレット形成金型を通過させられ、そしてそこでは 摩擦によって温度が急速に上昇する。 最近、伸張器と呼ばれる飼料の前処理又は調節用の新しい器具が導入された。 これによって圧力下で調節を持続し、続いてペレット形成が可能になる。この技 術によれば、前以て蒸気調節に付された種々の飼料成分はより多い蒸気が注入さ れる圧縮スクリュー中に供給され、そして次にこの集合体にかかる圧力が高めら れそして剪断作用に付され、そしてその後可変性の出口間隙から押し出される。 粒子サイズに縮小された後の圧縮生成物は標準的なペレット形成プレスに供給さ れる。 伸張器中での飼料成分の滞留時間は約５〜20秒であり、そして到達温度は145 ℃ほども高い可能性がある。約3.5ＭＰaの圧縮圧に達するが、温度と圧力の上昇 は共に非常に急速でありそしてこれらは共に製品が出口間隙から放出されると 急速に低下する。 伸張器を使用すると、伸張器が有害な細菌、特にサルモネラが効果的に除去さ れるので有益である。更に、ペレット形成前に混合物中に比較的高レベルの脂肪 や他の液体成分を含有させることが可能である。加えて、調理及び圧力／剪断作 用によってより大きい澱粉ゼラチン化がもたらされる。 残念なことに、これらの高温及び高圧加工条件は、特に、ペレット形成中に通 常遭遇する湿潤条件下で適用するとき、潜在的に或る飼料成分を破壊する。これ は特に、キシラナーゼを含む存在している全ゆる酵素について当てはまる。 良く知られているように、酵素はタンパク質であるので、アミノ酸から構成さ れている。アミノ酸の特別の配列、「一次構造」はタンパク質の性質を決定する 。次にアミノ酸鎖をシートや螺旋のような多数の「二次構造」に配列させること ができる。これらの構造はまた「三次構造」を与えるように互いに組織化もなさ れる：例えば、新聞の頁とかなり類似するようにシートを互いに平行に置くこと ができる。最後に、特別の酵素では幾つかのサブユニットが一緒に結合している ことがあり、そしてこれが「四次構造」を生じさせる。 機能するためには、酵素は特別の基質の反応を触媒し得る活性部位を有してい なければならない。この活性部位はしばしば非常に特異的な形状を有しており、 そしてこれは酵素の一次、二次、三次及び四次構造によって決定される。触媒部 位の形状を変えると酵素は不活性化されることがある。 熱、圧力及びｐＨを含む幾つかのファクターがあり、そしてこれらは酵素の形 状を変化させそしてそれ故その活性部位も変化させる可能性がある。飼料の加工 中に、混合物中に既に存在している酵素は、酵素を少なくとも部分的に変性しそ してその結果その活性を幾らか又は全て喪失させる可能性のある温度及び圧力に 付されるであろう。加工中に酵素が暴露される温度が高くなればなるほど、その 活性はより低下するであろう。典型的には、好中温性のキシラナーゼは65℃まで の温度では安定であるが、少なくとも水溶液中では95℃の温度に暴露された場合 全ての活性を喪失する。 このような温度介在性の変性が飼料加工中に生じている場合には、これは、酵 素は期待されて添加された効果をもたらさないか又はこのような効果をある程度 しかもたらさないので、勿論非常に不都合である。この問題を克服する１つの可 能性は、ある割合の不活性化を相殺するために顕著により多い相対量の酵素を飼 料に含有させることであろう。しかし乍ら、動物飼料に加えられる酵素は比較的 高価であるので、このような追加量を添加することは経済的見地から不利である 。 酵素を特別の担体上に被覆するか又は特別の被覆技術を使用して酵素を被覆す ることによって酵素を安定化することも研究されてきた。しかし乍ら、このよう な方法では高温蒸気ペレット形成、伸張器又は押出し器中で遭遇する比較的苛酷 な加工条件に効果的に対処することはできなかった。 別の解決法は、既に加熱処理され予め形成されたペレットにキシラナーゼのよ うな酵素を添加することであろう。しかし乍らこれは、先ず第一には、ペレット に酵素を精密に被覆して所望の相対量を含有させるためには複雑で高価な機械が 必要であるので、理想的な解決法ではない。第二に、このような被覆方法で使用 される酵素溶液は貯蔵安定性が限定されておりそして細菌によって汚染される可 能性がある。 従って、飼料加工中の酵素安定性の問題に対する部分的な解決法が利用できる としても、これら解決法はどれも問題を全体的に効果的な態様では解決しない。 以下の説明及び請求の範囲では、キシラナーゼ活性の単位に言及している。本 発明で使用されるときこの活性は以下のアッセイ方法で測定される。キシラナーゼ活性のアッセイ方法 キシラナーゼ活性の１単位は、記載された条件下で１分で基質から１μmolの 還元糖（キシロース相当物として示される）を放出する酵素の量である。 試薬 １．１％（ｗ／ｖ）のキシラン基質 キシラン（Fluka 95590）1.0ｇに 0.5Ｍ水酸化ナトリウム10ml を加える。磁石撹拌機で30分間混合する。0.05Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ 6 .5を約40ml加える。１Ｍ酢酸でｐＨを 6.5に調節する。0.05Ｍ酢酸ナトリウム緩 衝液、ｐＨ 6.5で 100mlまで満たす。基質は使用時にその間ずっと混合しなけれ ばならない。 ２．１Ｍ酢酸 氷酢酸5.7mlをピペットで容量フラスコに入れそして蒸留水で1 00mlまで満たす。 ３．0.05Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ 6.5 Ａ．酢酸ナトリウム4.1ｇを蒸留水に溶解しそして蒸留水で100 0mlまで満たす。 Ｂ．氷酢酸3.0ｇを蒸留水に溶解しそして蒸留水で1000mlまで 満たす。 溶液Ｂを用いて溶液ＡのｐＨをｐＨ 6.5に調節する。 ４．ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）試薬 3,5−ジニトロサリチル酸20.0ｇを蒸留水約800mlに懸濁する。 連続して撹拌し乍ら、水酸化ナトリウム溶液（蒸留水300ml中ＮaＯＨ32.0ｇ）30 0mlを徐々に加える。懸濁液は溶液が清明になるまで撹拌し乍ら水浴中で加温す る（温度は＋48℃を超えてはならない）。酒石酸カリウムナトリウム600ｇを徐 々に加える。必要な場合には、溶液が清明になるまで溶液を加温する（温度は＋ 48℃を超えてはならない）。 蒸留水で2000mlまで満たしそして粗い焼結ガラスフィルターで ろ過する。 暗色瓶中室温で貯蔵する。試薬は最高６ヶ月間安定である。 方法 １．酵素試料 酵素希釈物（0.05Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ 6.5中）１ml を＋50℃で平衡化する。キシラン基質１mlを加え、撹拌しそして＋50℃で正確に 30分間インキュベートする。ＤＮＳ試薬３mlを加え、撹拌しそして反応混合物を 正確に５分間煮沸する。反応混合 物を冷水浴中で室温にまで冷却しそして蒸留水に対して540nmで吸光度を測定す る。 ２．酵素ブランク キシラン基質１mlを＋50℃で30分間インキュベートする。ＤＮ Ｓ溶液３mlを加えそして撹拌する。酵素希釈物（0.05Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、 ｐＨ 6.5中）１mlを加えそして撹拌する。混合物を正確に５分間煮沸する。反応 混合物を冷水浴中で室温にまで冷却しそして蒸留水に対して540nmで吸光度を測 定する。 酵素試料と酵素ブランク間の吸光度の差異は 0.3〜0.5 でなけ ればならない。 ３．標準曲線 標準溶液は0.05Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ 6.5中で無水キ シロースから調製する。標準溶液中のキシロース濃度は0.05〜0.5 mg／mlでなけ ればならない。標準溶液１ml、キシラン基質１ml及びＤＮＳ試薬３mlをピペット で試験管に入れる。撹拌しそして正確に５分間煮沸する。冷水浴中で室温にまで 冷却しそして標準ブランクに対して540nmで吸光度を測定する。標準ブランクで は、キシロース溶液が0.05Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ 6.5、１mlに置換され ている。それ以外は標準ブランクをキシロース標準溶液と同様に処理する。 キシロース濃度を吸光度の関数としてプロットする。新たなＤ ＮＳ試薬毎に新たな標準曲線を作成する。 計算 試料のキシラナーゼ活性は次の等式に従って計算する： 式中、 Ａ(Ｘ) ＝ 酵素試料の吸光度 Ａ(Ｏ) ＝ 酵素ブランクの吸光度 ｋ ＝ 標準曲線の傾斜 Ｃ_c ＝ キシロース標準曲線の切片 1000 ＝ 係数、mmol→μmol Ｄf ＝ 希釈係数（ml／ｇ） ＭＷ_xy1 ＝ キシロースの分子量（150.13mg／mmol） ｔ ＝ 反応時間（30分） 上記考察に基づいて、本発明の１つの目的は、動物飼料が比較的高温に暴露さ れる加工技術に付されるとき、キシラナーゼの実質的に全活性を保持する動物飼 料用添加物としてキシラナーゼを提供することである。 従って、本発明は動物飼料用添加物として熱安定キシラナーゼの使用を提供し 、そして該キシラナーゼは、ｐＨ 6.5及び40℃の温度で１％小麦アラビノキシラ ン溶液の粘度を非加熱対照と同じ最終粘度±0.001パスカル秒にまで低下させる 能力で測定するとき、活性を実質的に損失しないで95℃に設定した水浴中１分間 の加熱に耐え得ることを特徴としている。 好ましくは、上記キシラナーゼはpＨ6.5及び40℃の温度で１％小麦アラビノキ シラン溶液の粘度を非加熱対照と同じ最終粘度±0.0005パスカル秒にまで低下さ せることができる。 上記で概略したキシラナーゼ活性のアッセイは、動物のＧＩ管に見られる状態 を模擬した条件下で粘性基質として小麦アラビノキシランを使用するインビトロ 粘度低下アッセイである。このようなインビトロアッセイは、１つのキシラナー ゼ（又は複数のキシラナーゼの混合物）が動物飼料中で補充物として使用された 場合消化対象物の粘度を低下させる所望の効果を有しているかどうかに関する指 針としての役目を果たす。 キシラナーゼが粘度を低下させる能力を測定するために使用される粘度低下ア ッセイの十分な詳細は次のとおりである。このアッセイは全ての場合に重複して 実施される。 アッセイすべきキシラナーゼ酵素は、得られる溶液が１ml当たり1.0単位のキ シラナーゼ活性を有するようにキシラナーゼ濃度を調節するために、6.5のｐＨ を有する0.1Ｍリン酸ナトリウム緩衝液で希釈する。このようなキシラナーゼ活 性は上記で詳細に記載したキシラナーゼ活性のアッセイ方法に従って測定する。 酵素溶液100μlをガラス試験管中の小麦アラビノキシラン（Megazyme Ptyから 入手した）の0.1Ｍリン酸ナトリウム溶液、ｐＨ 6.5、400μlに加え、その結果 得られた溶液中の最終酵素濃度は0.2Ｕ/mlにそして小麦アラビノキシランの最終 濃度は1.0％（ｗ／ｗ）になった。 次に、上記溶液を含有する試験管を密封しそして95℃に設定した水浴に一定時 間、典型的には１分又は５分間入れた。この加熱処理後、試験管を氷−水浴中で 冷却した。20分後、得られた溶液の粘度は、粘度を１秒当たり１回測定するよう にプログラミングされたブルックフィールドＤＶ−II、ＣＰ 40 粘度計を使用し て40℃の温度で測定した。 本発明に従って熱安定キシラナーゼを動物飼料用添加物として使用すると、こ れを他の飼料成分と組み合わせ、そして例えば伸張器又は押出し器を使用する慣 用の飼料加工に付した後でもキシラナーゼの活性が実質的に低下しないという利 点を有している。 本発明で使用される熱安定キシラナーゼは任意の適当な供給源から得ることが できる。一般的には熱安定キシラナーゼは微生物、好ましくは真菌から得られる 。本発明で使用される熱安定キシラナーゼを産生する細菌生物にはアルキバクテ リア種、バシラス種、特にバシラスステアロサーモフィラス(stearothermophilu s);カルドセラム種、特にカルドセラムサッカロリチカム(saccharolyticum);セ ルロモナス種; クロストリジウム種、特にクロストリジウムアセトブチリカム(a cetobutylicum);ジクチオグロムス種; ユウバクテリウム種、特にユウバクテリ ウムサーモトガ(thermotoga);フミコラグリセア（grisea）変種サーモイディア; マルブランキア種、特にマルブランキアシナモンメア（cinnamonmea）及びマル ブランキア変種スルフレア(sulfurea);ミセリオプトラ種、特にミセリオプトラ サーモフィラム(thermophilum);ロドサームス種、特にロドサームスマリヌ ス(marinus); スキゾフィラム種、スコトサームス種; サッカロモノスポラ種; スポロトリクム種; ストレプトミセス種; サームス種; サーモアナエアロバクタ ー種、特にサーモアナエアロバクターサッカリチカス(saccharlyticus);サーモ アスカス種、特にサーモアスカスオーランチカス(auranticus);サーモミセス種 、特にサーモアスカスラヌギノサス(lanuginosus); サーモモノスポラ種; 及び アクチノマズラ種が含まれる。真菌生物も本発明によるキシラナーゼの好ましい 供給源である。特に、本発明による熱安定キシラナーゼを産生する真菌にはアス ペルギルスアワモリ(awamori); アスペルギルスフミガーツス(fumigatus); 及び アスペルギルスニデュランス(nidulans)が含まれる。特に好ましいものはサーモ モノスポラフスカ（fusca）及びミクロテトラスポラフレキスオサ（flexuosa） から誘導されるキシラナーゼである。サーモモノスポラフスカから得られるキシ ラナーゼは特徴が決定されておりそしてそのアミノ酸配列はアービン（Irwin） 等、アプライドアンドエンバイロンメンタルマイクロバイオロジー(Applied and Environmental Microbiology)、60巻、763〜770頁（1994年）で提供されている 。本発明で有用な熱安定キシラナーゼを産生するような条件下でのサーモモノス ポラフスカの発酵は当該技術で認められている方法に従って実施することができ る。例えば、適当な発酵方法はロスリスバーガー（Rothlisberger）等、アプラ イドマイクロバイオロジカルバイオテクノロジー(Applied Microbiological Bio technology)、37巻、416〜419頁（1992年）及びＥＰ−Ａ−0 473 545に記載され ている。産生された熱安定キシラナーゼの精製は、文献に記載されたサーモモノ スポラフスカから誘導されるキシラナーゼの生化学的特徴を酵素が備えていると き、この酵素を単離するために当該技術で認められている任意の方法に従って当 該技術分野の熟練者が実施することができる。 ミクロテトラスポラフレキスオサから得られる熱安定キシラナーゼの単離は以 下で詳細に記載する。ミクロテトラスポラフレキスオサから５つの異なる熱安定 キシラナーゼを単離できることが見い出されている。これらのキシラナーゼは以 下でそれぞれキシラナーゼ１〜５と称する。これらのキシラナーゼは、銀染色等 電点電気泳動ゲルで測定するとき均質にまで精製されている。これらのキシラナ ーゼはイオン交換クロマトグラフィーと疎水的相互作用クロマトグラフィーを 組み合わせて精製されている。各精製キシラナーゼは広いｐＨ範囲で熱安定であ ると特徴付けられている。具体的には、各キシラナーゼは６〜９のｐＨ範囲で80 ％以上の活性を保持している。 キシラナーゼは更に次のように特徴付けることができる。キシラナーゼ１は約 33,100ダルトンの分子量、約8.5のpＩを有しており、そして7.0〜7.5の範囲のｐ Ｈ及び70℃の温度で最大活性を有している。キシラナーゼ２は約13,300ダルトン の分子量、約7.5のpＩを有しており、そして7.0〜7.5の範囲のｐＨ及び約65℃の 温度で最大活性を有している。キシラナーゼ３は約31,000ダルトンの分子量、約 6.2のpＩを有しており、そして約7.5のｐＨ及び約65℃の温度で最大活性を有し ている。キシラナーゼ４は約50,000ダルトンの分子量、約5.8のpＩを有しており 、そして約7.5のｐＨ及び約65℃の温度で最大活性を有している。キシラナーゼ ５は約35,000ダルトンの分子量、約5.3のpＩを有しており、そして約7.5のｐＨ 及び約70℃の温度で最大活性を有している。 ミクロテトラスポラフレキスオサのキシラナーゼは、本発明に従って５種のキ シラナーゼの全ての混合物として、即ちキシラナーゼ上清液全体として、個々に 、又はそれらの任意の組合せとして使用することができる。同じことが、他の任 意の真菌又は細菌源から得ることができ本発明で使用できる他の熱安定キシラナ ーゼにも当てはまる。本発明で使用されるキシラナーゼの別の製造方法は、所望 の熱安定キシラナーゼを産生する適当な宿主微生物を組換えＤＮＡ技術によって 構築するものである。かくしてキシラナーゼは、熱安定キシラナーゼをコードす る遺伝子を宿主細菌又は真菌株内に挿入するような遺伝子操作に付されている宿 主から取得することができる。 ミクロテトラスポラフレキスオサから得られるキシラナーゼ１〜５は、米国ノ ースダコタ州ベセスダのＡＴＣＣにＡＴＣＣ 35864として寄託されそしてそこか ら容易に入手できる株から誘導することができる。新規なキシラナーゼの単離は 、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）と疎水的相互作用クロマトグラフィ ー（ＨＩＣ）を精製すべきキシラナーゼに依存して任意の順序で組み合わせたも のによる細胞外キシラナーゼの精製に係わっている。 ミクロテトラスポラフレキスオサから誘導される５種の化学的に異なるキシラ ナーゼを単離しそして特徴付ける２つの精製方法は次のとおりである。両方法に おいて、ミクロテトラスポラフレキスオサの細胞は遠心によって除去しそして培 養ブイヨンは限外ろ過を使用して濃縮する。最初の方法で、キシラナーゼ１(pＩ 8.5)、キシラナーゼ２（pＩ 7.5）及びキシラナーゼ４（pＩ 5.8）を分離しそ して精製する。細胞不含の全培養ブイヨン調製物を陰イオン交換カラムに適用し 、洗浄しそして増加する塩（ＮaＣl）傾斜で溶出する。フラクションを集めた後 、レマゾール（remazol）ブリリアントブルー染色カバの木キシランアッセイ（ ＲＢＢ−キシランアッセイ）を使用してキシラナーゼ活性を測定する。キシラナ ーゼ１及びキシラナーゼ２はカラム通過物中に溶出する。流出通過物を集めそし て再度疎水的相互作用カラム（フェニルセファロース）に入れる。キシラナーゼ １とキシラナーゼ２はエチレングリコールの濃度を増加させてカラムから溶出さ せることによって互いに分離される。キシラナーゼ４は陰イオン交換カラムに結 合しそして塩傾斜で他の結合キシラナーゼ（キシラナーゼ３及び５）と共に溶出 する。キシラナーゼ４はＨＩＣで他のキシラナーゼから分離された。これは以下 の実施例１で更に十分に記載する。精製されたキシラナーゼ１、２及び４は等電 点電気泳動及びマススペクトロホトメトリー（ＭＳ）又はドデシル硫酸ナトリウ ムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で更に分析した。 ２番目の方法では、第１段階として上記した細胞不含の全培養ブイヨンをＨＩ Ｃに付してキシラナーゼ３（pＩ 6.2）及びキシラナーゼ５（pＩ 5.3）を精製し た。両キシラナーゼは同じ濃度の硫酸アンモニウムで同時に溶出する。キシラナ ーゼ３とキシラナーゼ５を互いに分離するために、集めた溶出活性酵素物質でＩ ＥＣを実施した。キシラナーゼ３はキシラナーゼ５より低い塩濃度で陰イオン交 換カラムから溶出する。両精製キシラナーゼは先ず等電点電気泳動及びＭＳ又は ＳＤＳ−ＰＡＧＥで特徴付けた。 各キシラナーゼはその特有の生化学的特徴、例えば分子量、pＩ、最適温度及 びｐＨ、疎水的特性並びに温度安定性によって他のキシラナーゼと区別されてい る。５種のキシラナーゼは全て90℃までの高温及びｐＨ 7.0〜10.0の範囲内のア ルカリ性条件に耐えることができる。５種の精製キシラナーゼは80℃で30分から 110分までの範囲の半減期を有している。精製して均質にした５種のキシラナー ゼの各々の更なる特徴付けは以下の参考例２に記載する。 本発明の更なる特徴によれば、生理学的に許容可能な担体及び熱安定キシラナ ーゼを含む飼料添加物が提供され、そして該キシラナーゼは、ｐＨ 6.5及び40℃ の温度で１％小麦アラビノキシラン溶液の粘度を非加熱対照と同じ最終粘度±0. 001パスカル秒にまで低下させる能力で測定するとき、活性を実質的に損失しな いで95℃に設定した水浴中１分間の加熱に耐え得ることを特徴としている。 この特徴によれば、熱安定キシラナーゼは上記したキシラナーゼの任意の１つ 又は任意の混合物であることができる。かくして、キシラナーゼは好ましくはミ クロテトラスポラフレキスオサ又はサーモモノスポラフスカから得ることができ る。 本発明のこの特徴の生理学的に許容可能な担体は好ましくは穀物であるか又は 穀物から誘導される。このような穀物には粉砕した小麦、トウモロコシ、大豆、 糖類、澱粉又はこれらのいずれかの副産物が含まれる。このような担体はこの技 術分野で慣用であるので、更に詳細には記載しない。 本発明のこの特徴による飼料添加物は穀物性飼料を製造するために他の飼料成 分と組み合わせられる。このような他の飼料成分には１つ又はそれより多い他の （好ましくは熱安定）酵素補充物、ビタミン飼料添加剤、ミネラル飼料添加剤及 びアミノ酸飼料添加剤が含まれる。次に、多分幾つかの異なるタイプの化合物を 含有する得られた（組み合わせられた）飼料添加物を穀物やタンパク質補充物の ような他の飼料成分と適当な量で混合して動物飼料を形成することができる。こ れらの成分から動物飼料への加工は、二重ペレット形成機、蒸気ペレット形成器 、伸張器又は押出し器のような現在使用されている加工装置のどれかを使用して 実施することができる。 得られた穀物性飼料中に熱安定キシラナーゼが存在すると飼料のＦＣＲを低下 させる効果がある。キシラナーゼは選択的にか又は追加的に穀物性飼料の消化性 を高めることができる。更に、キシラナーゼを加えると、動物が消費する飼料の 単位量当たりの動物の体重増加率を追加的にか又は選択的に高めることができる 。 本発明は更なる特徴において、少なくとも20重量％の穀物及び飼料１kg当たり 0.00001ｇ〜10ｇの熱安定キシラナーゼタンパク質を含む穀物性飼料を提供し、 そして該キシラナーゼは、ｐＨ 6.5及び40℃の温度で１％小麦アラビノキシラン 溶液の粘度を非加熱対照と同じ最終粘度±0.001パスカル秒にまで低下させる能 力で測定するとき、活性を実質的に損失しないで95℃に設定した水浴中１分間の 加熱に耐え得ることを特徴としている。 本発明のこの特徴においては、再度、熱安定キシラナーゼは上記した熱安定キ シラナーゼの任意の１つ又は任意の混合物であることができる。特に、キシラナ ーゼはミクロテトラスポラフレキスオサ又はサーモモノスポラフスカから得るこ とができる。このような穀物性飼料においては、穀物は好ましくは小麦、大麦、 トウモロコシ、モロコシ、ライムギ、オートムギ、トリチカル（triticale）及 び米のうちの少なくとも１つである。穀物は小麦であることが特に好ましい。 本発明による穀物性飼料は七面鳥、ガチョウ、アヒル、ヒツジ及びウシのよう な動物に与えることができる。しかし乍ら、この飼料はブタ又は家禽、そして特 にブロイラー鶏に与えることが特に好ましい。 穀物性飼料は、好ましくは飼料１キロ当たり0.0001〜１ｇ、そして最も好まし くは0.001〜0.1ｇ／kgのキシラナーゼタンパク質を含有する。 穀物性飼料は少なくとも20重量％の穀物を含んでいる。更に好ましくは穀物性 飼料は少なくとも30重量％の穀物、そして最も好ましくは少なくとも50重量％の 穀物を含有すべきである。穀物は上記したもののいずれであることもでき、そし て小麦が特に好ましい。 穀物性飼料の穀物成分はタンパク質源を構成するが、魚粉、獣肉粉又は植物か ら誘導されるような飼料中には通常、補充タンパク質源が含有されていなければ ならない。植物タンパク質源は、全脂大豆、菜種、カノラ(canola)、大豆粉、菜 種粉及びカノラ粉のうち少なくとも１つを含有する。慣用の飼料と比較すると、 本発明の教示を採用することによって魚粉、獣肉粉又は植物タンパク質のような 追加的なタンパク質源の相対量を減少させて、費用をかなり節約することができ る。これは穀物の相対的費用が慣用のタンパク質補充物の相対的費用よりかなり 低いためである。これを考慮して、本発明の教示に従って、利用可能なエネルギ ー、アミノ酸及びタンパク質に関して慣用の飼料と同じ栄養価値を有するが、穀 物の相対比をより多くそしてタンパク質補充物の相対比をより少なく含有する飼 料を調製することができる。動物飼料に熱安定キシラナーゼを加えると、あるレ ベルの性能を有する飼料を達成するために含有させなければならない脂肪や油の ようなエネルギー補充物のレベルが減少させられるという効果を有することも見 られる。 本発明に従って動物飼料に熱安定キシラナーゼを加えると飼料の粗タンパク質 値及び／又は消化性及び／又はアミノ酸含量及び／又は消化係数を高めることが でき、そしてこれまでは動物飼料に含有されていなければならなかった選択的タ ンパク質源及び／又はアミノ酸補充物の量を減少させることができる。熱安定キ シラナーゼの添加によって小麦のタンパク質消化係数及び／又は利用可能な粗タ ンパク質含量が増加するとき、主要な節約は、慣用的に添加されていなければな らないタンパク質及び／又はエネルギー補充物のレベルの減少に見ることができ る。或いは、熱安定キシラナーゼの添加によってアミノ酸含量又は消化係数の値 しか増加しないとき、主要な節約は、慣用的に飼料に添加されていなければなら ないアミノ酸補充物のレベルの減少に見ることができる。 本発明によって提供される飼料はβ−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、マン ナーゼ、α−ガラクトシダーゼ、フィターゼ、リパーゼ、α−アラビノフラノシ ダーゼ、プロテアーゼ、α−アミラーゼ及びペクチナーゼのような１つ又はそれ より多い他の酵素補充物を含有することもできる。更なる酵素補充物としてバシ ラス属から誘導されるサブチリシンのようなプロテアーゼを含有することが特に 好ましい。このようなサブチリシンは例えばＵＳ−Ａ−4 760 025に詳細に記載 されている。 本発明による適当な飼料は、生理学的に許容可能な担体及び熱安定キシラナー ゼを含む飼料添加物を調製し、そしてその後この添加物を動物飼料を構成する他 の成分（穀物及び他のタンパク質補充物源を含む）と１キロ当たり0.01〜50ｇ、 更に好ましくは0.1〜10ｇ／kg、そして最も好ましくは約１ｇ／kgの量で混合す ることによって得ることができる、 本明細書に含まれる３つの図面の各々の簡単な説明を以下で提供する。 図１は、ミクロテトラスポラフレキスオサから得られる５種の精製キシラナー ゼの活性ｐＨプロフィールを示す。 図２は、ミクロテトラスポラフレキスオサから得られる５種の精製キシラナー ゼの活性温度プロフィールを示す。 図３は、ミクロテトラスポラフレキスオサから得られる５種の精製キシラナー ゼの温度安定性プロフィールを示す。 本発明をここで以下の参考例及び実施例によって更に説明する。 参考例１ ミクロテトラスポラフレキスオサによって 産生される５種のキシラナーゼの精製キシラナーゼアッセイ キシラナーゼの存在はレマゾールブリリアントブルー染色カバの木キシラン（ ＲＢＢ−キシラン）基質（オーストラリアのMegazymeはこの基質の商業的供給者 である）を使用して測定した。試料200μlを基質溶液（50mＭのクエン酸ナトリ ウム、ｐＨ 6.5、中２％［ｗ／ｖ］のＲＢＢ−キシラン）250μlと混合し、そし て37℃で10分間インキュベートする。95％エタノール１mlを添加して未消化キシ ランを沈殿させ、そして遠心して除去する。溶液中に残存する放出染料はエタノ ールをブランクとして分光光度計法（ＯＤ₅₉₀）で定量し、そしてこれはキシラ ナーゼ活性に比例する。活性は標準曲線を使用して定量することができ、そして ＸＡＵ／ml（１ミリリットル当たりのキシラナーゼ活性単位）として報告する。 多数のキシラナーゼの存在を検出しそしてそれらの等電点（pＩ）を測定する ゲル上積法もＲＢＢ−キシラン基質を使用して開発された。等電点電気泳動（Ｉ ＥＦ）ゲル（ｐＨ傾斜３〜９）に溶融アガロース／基質懸濁物（50mＭクエン酸 ナトリウム、ｐＨ 6.5中４％［ｗ／ｖ］のアガロース、７mg／mlのＲＢＢ−キシ ラン、0.5％［ｖ／ｖ］のグリセリン）を上積みしそして37℃でインキュベート する。約１時間後、キシラナーゼ活性は領域を清明にするので明白である。ゲル は完全に乾燥させそして貯蔵することができる。キシラナーゼのpＩは銀染色pＩ 標準を含有し同じように移動するＩＥＦゲルと比較して測定する。試料 限外ろ過（Amicon stir−cell、350ml、ＰＭ−10膜）を使用してミクロテトラ スポラフレキスオサＡＴＣＣ 35864発酵ブイヨンの細胞不含上清液（約14ＸＡＵ ／ml）を５倍に濃縮した。試料は全てフィルター滅菌した。タンパク質濃度はＢ ＣＡ法（Pierce）で12.5mg／mlであった。ゲル上積み分析によって５種のキシラ ナーゼの存在、pＩ 8.5、7.5、6.2、5.8及び5.3を測定した。これらの５種のキ シラナーゼは本明細書をとおしてそれぞれキシラナーゼ１〜５と称する。精製方法 イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）と疎水的相互作用クロマトグラフィ ーの組合せ（それぞれ、ＩＥＣ及びＨＩＣ）を使用して全５種のキシラナーゼを 次のようにして精製した： キシラナーゼ１及び２の精製 第１段階として、ＩＥＣを使用してキシラナーゼ１及び２を精製した。濃縮し た試料を10mＭトリス−ＨＣl、ｐＨ 9.0（緩衝液Ａ）で完全に透析した。50mlを 、緩衝液Ａで平衡化した72mlのＱ−セファロースＨＰ（Pharmacia）を充填した 標準的なクロマトグラフィーカラム（Pharmacia Ｃ 16／40）にファルマシア（P harmacia）ＦＰＬＣ系を使用して１ml／分で適用した。カラムを緩衝液Ａ 50ml で洗浄し、その後緩衝液Ａから緩衝液Ａ中0.25ＭのＮaＣlの直線的増加塩傾斜40 0mlで溶出した。緩衝液Ａ中２ＭのＮaＣlを用いて残存する結合タンパク質をカ ラムから洗い流した。フラクション10mlを集めそして上記したようにしてアッセ イした。 キシラナーゼ１及び２は最初の流出でカラムから一緒に溶出したが、多量の残 りのタンパク質はカラムに結合していた。（キシラナーゼ１及び２は非結合カラ ムフラクションに相当する）。 疎水的相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を第２段階として使用してキシ ラナーゼ１及び２を精製しそして単離した。活性フラクションを集めそして２Ｍ 硫酸アンモニウムを添加して最終硫酸アンモニウム濃度を0.2Ｍにした。50mＭク エン酸ナトリウム、pＨ6.5を加えて最終濃度を10mＭとしそしてこの材料（約100 ml）を、0.2Ｍ硫酸アンモニウム−10mＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ 6.5（緩衝液 Ｂ）で平衡化した36mlのフェニルセファロースＣＬ−４Ｂ（Pharmacia）を充填 した標準的なクロマトグラフィーカラム（Pharmacia Ｃ 16／20）に0.5ml／分で 適用した。カラムを緩衝液Ｂ 60mlで洗浄し、その後70mlについては塩濃度を10m Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ 6.5（緩衝液Ｃ）にまで段階的に低下させ、50mlに ついては緩衝液Ｃ中10％（ｖ／ｖ）のエチレングリコール（ＥＧ）にまで段階的 に低下させ、10−32％のＥＧ直線的傾斜 200mlを適用し、80mlについては32％Ｅ Ｇで洗浄し、32−38％のＥＧ傾斜 150mlを適用しそして70mlについては最終的に 50％ＥＧにまで段階的に高めて溶出してカラムを完全に洗浄した。フラクション 10mlを集めそして上記したようにしてアッセイした。これらの条件下で、32％Ｅ Ｇ洗浄で均質なキシラナーゼ２が溶出し、一方均質なキシラナーゼ１は32−38％ のＥＧ傾斜の最後に溶出する。 キシラナーゼ４の精製 キシラナーゼ１及び２の精製について上記した第１段階（ＩＥＣ）を使用する と、キシラナーゼ４及び５は緩衝液Ａ中約0.16ＭのＮaＣlで一緒に溶出する。活 性フラクションを集めそして上記したようにして0.4Ｍ硫酸アンモニウム−10mＭ クエン酸ナトリウム、ｐＨ 6.5（緩衝液Ｄ）にした。約100mlの材料を緩衝液Ｄ で平衡化した上記ＨＩＣカラムに１ml／分で適用した。カラムを緩衝液Ｄ 50ml で洗浄し、緩衝液Ｄから緩衝液Ｃへの130mlの直線的傾斜で溶出し、そしてその すぐ後に緩衝液Ｃから50％ＥＧへの200mlの直線的傾斜で溶出した。フラクショ ン10mlを集めそして上記したようにしてアッセイした。キシラナーゼ４は約20％ のＥＧで溶出する。 キシラナーゼ３及び５の精製 キシラナーゼ３及び５の場合には、ＨＩＣを第１段階として使用した。濃縮し た試料は、２Ｍ硫酸アンモニウムを添加して緩衝液Ｃ中0.5Ｍの硫酸アンモニウ ムにしそして50mＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ 6.5にした(上記のようにして)。 材料をろ過して痕跡量の沈殿を除去しそして50ml容量を、緩衝液Ｃ中0.5Ｍの硫 酸アンモニウム（緩衝液Ｅ）で平衡化した上記ＨＩＣカラムに１ml／分で適用し た。次に、カラムを緩衝液Ｅ 87.5mlで洗浄し、その後緩衝液Ｅから緩衝液Ｃへ の147mlの直線的傾斜で溶出した。フラクション10mlを集めそして上記したよう にしてアッセイした。キシラナーゼ３及び５は約0.05Ｍ硫酸アンモニウムで一緒 に溶出した。 ＩＥＣを使用してキシラナーゼ３及び５を単離しそして精製した。活性ＨＩＣ フラクションを集め(70ml)、10mＭトリス−ＨＣl、ｐＨ 8.0（緩衝液Ｆ）で完全 に透析し、そして上記した方法で約20mlに濃縮した。材料は緩衝液Ｆで平衡化し た上記ＩＥＣカラムに１ml／分で適用した。カラムを緩衝液Ｆ 150mlで洗浄し、 そして緩衝液Ｆから緩衝液Ｆ中0.25ＭのＮaＣlへの150mlの直線的傾斜で溶出し た。フラクション10mlを集めそして上記したようにしてアッセイした。キシラナ ーゼ３は約0.05ＭのＮaＣlで溶出し、一方キシラナーゼ５は約0.15ＭのＮaＣlで 溶出した。 参考例２ ミクロテトラスポラフレキスオサによって 産生される５種のキシラナーゼの特徴決定 精製した後、各キシラナーゼを以下の方法に従って等電点電気泳動及び分子量 測定に付した。キシラナーゼの生化学的特徴決定の結果は表１に示す。 等電点電気泳動技術はファストシステム（PhastSystem）(Pharmacia Biotech) を使用して製造者の指示どおりに実施した。pＩ測定用に使用したマーカーはｐ Ｈ 3.5〜9.3の広範囲pＩキット（Pharmacia Biotech）であった。タンパク質の 視覚化は、指示されたとおりに、ファストシステム発色銀染色によるものである 。 分子量測定は２つの方法: ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル 電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及びマススペクトロスコーピー（ＭＳ）によって 達成された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びそれに続く銀染色による視覚化は上記したよ うにしてファストシステムを使用して実施した。使用した分子量マーカーはシグ マケミカルカンパニー(Sigma Chemical Co.)（ミズーリー州セントルイス）から 得た。マススペクトロスコーピーはチャールズエバンスアンドアソシエート（Ch arles Evans and Associates）（94063 カリフォルニア州レッドウッドシティチ ェサピークドライブ 301）によって実施した。 最適ｐＨは、測定したｐＨ範囲、即ちｐＨ 4.5〜12.0に依存して緩衝液が変動 することを除いて、上記したＲＢＢアッセイを使用して測定する(図１参照)。選 択したアッセイのｐＨに対して適当な緩衝液を調製することは熟練技術者の能力 の範囲内である。 温度安定性は、示された一定温度で活性の半分が残存している時間を示す。活 性は概ね18〜37℃で測定する。試料を示された温度でインキュベートしそしてそ の活性はＲＢＢアッセイを使用して測定する。半減期は活性の半分が喪失する時 間（分）である。（図３参照） 最適温度は最高の活性が見られる温度である。図２は、ＲＢＢアッセイを使用 して測定したキシラナーゼ１〜５の温度プロフィールを示す。図１と２の両方で 、 最大活性（％）は100％の値を与えられる最高活性測定に関係付けられており、 そして他の数字は全て上記標準化に相対して測定されている。実施例１ ミクロテトラスポラフレキスオサから得られるキシラナーゼ１〜５、サーモモ ノスポラフスカから得られるキシラナーゼＴfxＡ、並びにトリコデルマビリデ（ viride）及びアスペルギルスニガーから得られるキシラナーゼは、上記で詳細に 記載した粘度低下アッセイに従って試験してこれらが小麦アラビノキシラン基質 の粘度を低下させる相対的能力を測定した。酵素組成物の各々について、加熱処 理しないで（対照）そして95℃に設定した水浴中でそれぞれ１分間及び５分間加 熱処理した後に粘度を測定した。これらの実験の結果は表２に要約する。 上記結果から、全ゆるキシラナーゼ又はキシラナーゼ混合物は95℃の温度に５ 分間暴露すると、粘度低下アッセイによって測定するときキシラナーゼ活性を顕 著に低下させたことが分かる。しかし乍ら、95℃に１分間暴露した後の最初及び ２番目のキシラナーゼについて測定した粘度は対照と顕著には異なっておらず、 そして±0.001Ｐa.sの範囲内であったということにも注目しなければならない。 他方、Ｔ．ビリデ及びＡ．ニガーから得られるキシラナーゼが本発明で使用され る熱安定キシラナーゼと比較して熱の影響をはるかに受け易いことは明白である 。実施例２ マイクロテトラスポラフレキスオサから得られる個々のキシラナーゼ１及び２ の熱安定性を実施例１に使用した粘度低下アッセイに従ってアッセイした。実施 例１と共通して、各キシラナーゼについて加熱処理に付されていない対照を実施 した。再度、酵素を95℃に設定した水浴中で１分間及び５分間加熱することによ る２種の加熱処理を実施した。この実験の結果は表３に要約する。 表３に述べた結果から、95℃に１分間暴露した後のキシラナーゼ１とキシラナ ーゼ２の両方について測定した粘度が対照の粘度から0.00006Ｐa.s以内であるこ とが分かる。従って、これら２つのキシラナーゼは95℃で１分間加熱処理しても それらの活性が実質的に消失しないことが明白である。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９６年４月４日 【補正内容】 請求の範囲 １．ミクロテトロスポラフレキスオサから得られる熱安定キシラナーゼの動物 飼料用添加物としての使用であって、該キシラナーゼは、ｐＨ 6.5及び40℃の温 度で１％小麦アラビノキシラン溶液の粘度を非加熱対照と同じ最終粘度±0.001 パスカル秒にまで低下させる能力で測定するとき、活性を実質的に損失しないで 95℃に設定した水浴中１分間の加熱に耐え得ることを特徴としている。 ２．上記キシラナーゼが次の特徴（ｉ）〜（ｖ）のセット： （ｉ）約33,100ダルトンの分子量、約8.5のpＩ、並びに7.0〜7.5の範囲のｐＨ 及び約70℃の温度で最大活性を有していること； （ii）約13,300ダルトンの分子量、約7.5のpＩ、並びに7.0〜7.5の範囲のｐＨ 及び約65℃の温度で最大活性を有していること； （iii）約31,000ダルトンの分子量、約6.2のpＩ、並びに約7.5のｐＨ及び約65 ℃の温度で最大活性を有していること； （iv）約50,000ダルトンの分子量、約5.8のpＩ、並びに約7.5のｐＨ及び約65 ℃の温度で最大活性を有していること； （ｖ）約35,000ダルトンの分子量、約5.3のpＩ、並びに約7.5のｐＨ及び約70 ℃の温度で最大活性を有していること、 の１つ又はそれより多くを有している請求項１に記載の使用。 ３．生理学的に許容可能な担体及びミクロテトロスポラフレキスオサから得ら れる熱安定キシラナーゼを含む飼料添加物であって、該キシラナーゼは、ｐＨ 6 .5及び40℃の温度で１％小麦アラビノキシラン溶液の粘度を非加熱対照と同じ最 終粘度±0.001パスカル秒にまで低下させる能力で測定するとき、活性を実質的 に損失しないで95℃に設定した水浴中１分間の加熱に耐え得ることを特徴として いる。 ４．上記担体が穀物であるか又は穀物から誘導される請求項３に記載の飼料添 加物。 ５．上記担体が粉砕した小麦、トウモロコシ、大豆又はこれらの副産物である 請求項４に記載の飼料添加物。 ６．飼料の飼料転換率を改善するため及び／又は飼料の消化性を高めるため及 び／又は消費した飼料の単位量当たりの動物の体重増加率を高めるために穀物性 飼料に添加するための請求項３〜５のいずれか１項に記載の飼料添加物の使用。 ７．少なくとも20重量％の穀物及び飼料１kg当たり0.00001〜10ｇの熱安定キ シラナーゼタンパク質を含む穀物性飼料であって、該キシラナーゼはミクロテト ロスポラフレキスオサから得られ、そしてｐＨ 6.5及び40℃の温度で１％小麦ア ラビノキシラン溶液の粘度を非加熱対照と同じ最終粘度±0.001パスカル秒にま で低下させる能力で測定するとき、活性を実質的に損失しないで95℃に設定した 水浴中１分間の加熱に耐え得ることを特徴としている。 ８．上記穀物が小麦、大麦、トウモロコシ、モロコシ、ライムギ、オートムギ 、トリチカル及び米のうちの少なくとも１つである請求項７に記載の穀物性飼料 。 ９．家禽飼料又はブタ飼料としての請求項７又は請求項８に記載の穀物性飼料 の使用。 【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９６年４月２２日 【補正内容】 式中、 Ａ(Ｘ) ＝ 酵素試料の吸光度 Ａ(Ｏ) ＝ 酵素ブランクの吸光度 ｋ ＝ 標準曲線の傾斜 Ｃ_e ＝ キシロース標準曲線の切片 1000 ＝ 係数、mmol→μmol Ｄf ＝ 希釈係数（ml／ｇ） ＭＷ_xy1 ＝ キシロースの分子量（150.13mg／mmol） ｔ ＝ 反応時間（30分） 上記考察に基づいて、本発明の１つの目的は、動物飼料が比較的高温に暴露さ れる加工技術に付されるとき、キシラナーゼの実質的に全活性を保持する動物飼 料用添加物としてキシラナーゼを提供することである。 従って、本発明はミクロテトラスポラフレキスオサから得られる熱安定キシラ ナーゼの動物飼料用添加物としての使用を提供し、そして該キシラナーゼは、ｐ Ｈ 6.5及び40℃の温度で１％小麦アラビノキシラン溶液の粘度を非加熱対照と同 じ最終粘度±0.001パスカル秒にまで低下させる能力で測定するとき、活性を実 質的に損失しないで95℃に設定した水浴中１分間の加熱に耐え得ることを特徴と している。 好ましくは、上記キシラナーゼはpＨ6.5及び40℃の温度で１％小麦アラビノキ シラン溶液の粘度を非加熱対照と同じ最終粘度±0.0005パスカル秒にまで低下さ せることができる。 上記で概略したキシラナーゼ活性のアッセイは、動物のＧＩ管に見られる状態 模擬した条件下で粘性基質として小麦アラビノキシランを使用するインビトロ 粘度低下アッセイである。このようなインビトロアッセイは、１つのキシラナー （又は複数のキシラナーゼの混合物）が動物飼料中で補充物として使用された場 合消化対象物の粘度を低下させる所望の効果を有しているかどうかに関する指針 としての役目を果たす。 キシラナーゼが粘度を低下させる能力を測定するために使用される粘度低下ア ッセイの十分な詳細は次のとおりである。このアッセイは全ての場合に重複して 実施される。 アッセイすべきキシラナーゼ酵素は、得られる溶液が１ml当たり1.0単位のキ シラナーゼ活性を有するようにキシラナーゼ濃度を調整するために、6.5のｐＨ を有する0.1Ｍリン酸ナトリウム緩衝液で希釈する。このようなキシラナーゼ活 性は上記で詳細に記載したキシラナーゼ活性のアッセイ方法に従って測定する。 酵素溶液100 μl をガラス試験管中の小麦アラビノキシラン（Megazyme Ptyか ら入手した）の0.1Ｍリン酸ナトリウム溶液、ｐＨ 6.5、400μlに加え、その結 果得られた溶液中の最終酵素濃度は0.2Ｕ/mlにそして小麦アラビノキシランの最 終濃度は1.0％（ｗ／ｗ）になった。 次に、上記溶液を含有する試験管を密封しそして95℃に設定した水浴に一定時 間、典型的には１分又は５分間入れた。この加熱処理後、試験管を氷−水浴中で 冷却した。得られた溶液の粘度は、粘度を１秒当たり１回測定するようにプログ ラミングされたブルックフィールドＤＶ−II、ＣＰ 40 粘度計を使用して40℃の 温度で20分後に測定した。 本発明に従って熱安定キシラナーゼを動物飼料用添加物として使用すると、こ れを他の飼料成分と組み合わせ、そして例えば伸張器又は押出し器を使用する慣 用の飼料加工に付した後でもキシラナーゼの活性が実質的に低下しないという利 点を有している。 本発明で使用される熱安定キシラナーゼはミクロテトラスポラフレキスオサか ら得ることができる。 ミクロテトラスポラフレキスオサから得られる熱安定キシラナーゼの単離は以 下で詳細に記載する。ミクロテトラスポラフレキスオサから５つの異なる熱安定 キシラナーゼを単離できることが見い出されている。これらのキシラナーゼは以 下でそれぞれキシラナーゼ１〜５と称する。これらのキシラナーゼは、銀染色等 電点電気泳動ゲルで測定するとき均質にまで精製されている。これらのキシラナ ーゼはイオン交換クロマトグラフィーと疎水的相互作用クロマトグラフィーを組 み合わせて精製されている。各精製キシラナーゼは広いｐＨ範囲で熱安定である と特徴付けられている。具体的には、各キシラナーゼは６〜９のｐＨ範囲で80％ 以上の活性を保持している。 キシラナーゼは更に次のように特徴付けることができる。キシラナーゼ１は約 33,100ダルトンの分子量、約8.5のpＩを有しており、そして7.0〜7.5の範囲のｐ Ｈ及び70℃の温度で最大活性を有している。キシラナーゼ２は約13,300ダルトン の分子量、約7.5のpＩを有しており、そして7.0〜7.5の範囲のｐＨ及び約65℃の 温度で最大活性を有している。キシラナーゼ３は約31,000ダルトンの分子量、約 6.2のpＩを有しており、そして約7.5のｐＨ及び約65℃の温度で最大活性を有し ている。キシラナーゼ４は約50,000ダルトンの分子量、約5.8のpＩを有しており 、そして約7.5のｐＨ及び約65℃の温度で最大活性を有している。キシラナーゼ ５は約35,000ダルトンの分子量、約5.3のpＩを有しており、そして約7.5のｐＨ 及び約70℃の温度で最大活性を有している。 ミクロテトラスポラフレキスオサのキシラナーゼは、本発明に従って５種のキ シラナーゼの全ての混合物として、即ちキシラナーゼ上清液全体として、個々に 、又はそれらの任意の組合せとして使用することができる。本発明で使用される キシラナーゼの別の製造方法は、所望の熱安定キシラナーゼを産生する適当な宿 主微生物を組換えＤＮＡ技術によって構築するものである。かくしてキシラナー ゼは、ミクロテトラスポラフレキスオサから得られ熱安定キシラナーゼをコード する遺伝子を宿主細菌又は真菌株内に挿入するような遺伝子操作に付されている 宿主から取得することができる。 ミクロテトラスポラフレキスオサから得られるキシラナーゼ１〜５は、米国ノ ースダコタ州ベセスダのＡＴＣＣにＡＴＣＣ 35864として寄託されそしてそこか ら容易に入手できる株から誘導することができる。新規なキシラナーゼの単離は 、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）と疎水的相互作用クロマトグラフィ ー（ＨＩＣ）を精製すべきキシラナーゼに依存して任意の順序で組み合わせたも のによる細胞外キシラナーゼの精製に係わっている。 ミクロテトラスポラフレキスオサから誘導される５種の化学的に異なるキシラ ゼの各々の更なる特徴付けは以下の参考例２に記載する。 本発明の更なる特徴によれば、生理学的に許容可能な担体及びミクロテトラス ポラフレキスオサから得られる熱安定キシラナーゼを含む飼料添加物が提供され 、そして該キシラナーゼは、ｐＨ 6.5及び40℃の温度で１％小麦アラビノキシラ ン溶液の粘度を非加熱対照と同じ最終粘度±0.001パスカル秒にまで低下させる 能力で測定するとき、活性を実質的に損失しないで95℃に設定した水浴中１分間 の加熱に耐え得ることを特徴としている。 この特徴によれば、熱安定キシラナーゼは上記したキシラナーゼの任意の１つ 又は任意の混合物であることができる。 本発明のこの特徴の生理学的に許容可能な担体は好ましくは穀物であるか又は 穀物から誘導される。このような穀物には粉砕した小麦、トウモロコシ、大豆、 糖類、澱粉又はこれらのいずれかの副産物が含まれる。このような担体はこの技 術分野で慣用であるので、更に詳細には記載しない。 本発明のこの特徴による飼料添加物は穀物性飼料を製造するために他の飼料成 分と組み合わせられる。このような他の飼料成分には１つ又はそれより多い他の （好ましくは熱安定）酵素補充物、ビタミン飼料添加剤、ミネラル飼料添加剤及 びアミノ酸飼料添加剤が含まれる。次に、多分幾つかの異なるタイプの化合物を 含有する得られた（組み合わせられた）飼料添加物を穀物やタンパク質補充物の ような他の飼料成分と適当な量で混合して動物飼料を形成することができる。こ れらの成分から動物飼料への加工は、二重ペレット形成機、蒸気ペレット形成器 、伸張器又は押出し器のような現在使用されている加工装置のどれかを使用して 実施することができる。 得られた穀物性飼料中に熱安定キシラナーゼが存在すると飼料のＦＣＲを低下 させる効果がある。キシラナーゼは選択的にか又は追加的に穀物性飼料の消化性 を高めることができる。更に、キシラナーゼを加えると、動物が消費する飼料の 単位量当たりの動物の体重増加率を追加的にか又は選択的に高めることができる 。 本発明は更なる特徴において、少なくとも20重量％の穀物及び飼料１kg当たり 0.00001ｇ〜10ｇの熱安定キシラナーゼタンパク質を含む穀物性飼料を提供し、 そして該キシラナーゼはミクロテトラスポラフレキスオサから得ることができ、 そしてｐＨ 6.5及び40℃の温度で１％小麦アラビノキシラン溶液の粘度を非加熱 対照と同じ最終粘度±0.001パスカル秒にまで低下させる能力で測定するとき、 活性を実質的に損失しないで95℃に設定した水浴中１分間の加熱に耐え得ること を特徴としている。 本発明のこの特徴においては、再度、熱安定キシラナーゼは上記した熱安定キ シラナーゼの任意の１つ又は任意の混合物であることができる。このような穀物 性飼料においては、穀物は好ましくは小麦、大麦、トウモロコシ、モロコシ、ラ イムギ、オートムギ、トリチカル（triticale）及び米のうちの少なくとも１つ である。穀物は小麦であることが特に好ましい。 本発明による穀物性飼料は七面鳥、ガチョウ、アヒル、ヒツジ及びウシのよう な動物に与えることができる。しかし乍ら、この飼料はブタ又は家禽、そして特 にブロイラー鶏に与えることが特に好ましい。 穀物性飼料は、好ましくは飼料１キロ当たり0.0001〜１ｇ、そして最も好まし くは0.001〜0.1ｇ／kgのキシラナーゼタンパク質を含有する。 穀物性飼料は少なくとも20重量％の穀物を含んでいる。更に好ましくは穀物性 飼料は少なくとも30重量％の穀物、そして最も好ましくは少なくとも50重量％の 穀物を含有すべきである。穀物は上記したもののいずれであることもでき、そし て小麦が特に好ましい。 穀物性飼料の穀物成分はタンパク質源を構成するが、魚粉、獣肉粉又は植物か ら誘導されるような飼料中には通常、補充タンパク質源が含有されていなければ ならない。植物タンパク質源は、全脂大豆、菜種、カノラ(canola)、大豆粉、菜 種粉及びカノラ粉のうち少なくとも１つを含有する。慣用の飼料と比較すると、 本発明の教示を採用することによって魚粉、獣肉粉又は植物タンパク質のような 追加的なタンパク質源の相対量を減少させて、費用をかなり節約することができ る。これは穀物の相対的費用が慣用のタンパク質補充物の相対的費用よりかなり 低いためである。これを考慮して、本発明の教示に従って、利用可能なエネルギ ー、アミノ酸及びタンパク質に関して慣用の飼料と同じ栄養価値を有するが、穀 物の相対比をより多くそしてタンパク質補充物の相対比をより少なく含有する飼 最大活性（％）は100％の値を与えられる最高活性測定に関係付けられており、 そして他の数字は全て上記標準化に相対して測定されている。実施例１ ミクロテトラスポラフレキスオサから得られるキシラナーゼ１〜５、サーモモ ノスポラフスカから得られるキシラナーゼＴfxＡ、並びにトリコデルマビリデ（ viride）及びアスペルギルスニガーから得られるキシラナーゼは、上記で詳細に 記載した粘度低下アッセイに従って試験してこれらが小麦アラビノキシラン基質 の粘度を低下させる相対的能力を測定した。酵素組成物の各々について、加熱処 理しないで（対照）そして95℃に設定した水浴中でそれぞれ１分間及び５分間加 熱処理した後に粘度を測定した。これらの実験の結果は表２に要約する。 上記結果から、全ゆるキシラナーゼ又はキシラナーゼ混合物は95℃の温度に５ 分間暴露すると、粘度低下アッセイによって測定するときキシラナーゼ活性を顕 著に低下させたことが分かる。しかし乍ら、95℃に１分間暴露した後の最初のキ シラナーゼについて測定した粘度は対照と顕著には異なっておらずそして±0.00 1Ｐa.ｓの範囲内であったということにも注目しなければならない。他方、Ｔ． ビリデ及びＡ．ニガーから得られるキシラナーゼが本発明で使用される熱安定キ シラナーゼと比較して熱の影響をはるかに受け易いことは明白である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 クラクソン，キャスリーン・エー アメリカ合衆国 カリフォルニア、サン・ フランシスコ、トゥエンティエイス・スト リート 53 (72)発明者 ボディ，エリザベス・エー アメリカ合衆国 カリフォルニア、ベルモ ント、ベアズフォード 3422 (72)発明者 キューヴァス、ウィリアム・エー アメリカ合衆国 カリフォルニア、サン・ フランシスコ、チャーチ・ストリート 1354

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．熱安定キシラナーゼの動物飼料用添加物としての使用であって、該キシラ ナーゼは、ｐＨ 6.5及び40℃の温度で１％小麦アラビノキシラン溶液の粘度を非 加熱対照と同じ最終粘度±0.001パスカル秒にまで低下させる能力で測定すると き、活性を実質的に損失しないで95℃に設定した水浴中１分間の加熱に耐え得る ことを特徴としている。 ２．上記キシラナーゼがミクロテトラスポラフレキスオサ又はサーモモノスポ ラフスカから得ることができる請求項１に記載の使用。 ３．上記キシラナーゼがミクロテトラスポラフレキスオサから得られそして次 の特徴（ｉ）〜（ｖ）のセット： （ｉ） 約33,100ダルトンの分子量、約8.5のpＩ、並びに7.0〜7.5の範囲のｐ Ｈ及び約70℃の温度で最大活性を有していること； （ii） 約13,300ダルトンの分子量、約7.5のpＩ、並びに7.0〜7.5の範囲のｐ Ｈ及び約65℃の温度で最大活性を有していること； （iii）約31,000ダルトンの分子量、約6.2のpＩ、並びに約7.5のｐＨ及び約65 ℃の温度で最大活性を有していること； （iv） 約50,000ダルトンの分子量、約5.8のpＩ、並びに約7.5のｐＨ及び約65 ℃の温度で最大活性を有していること； （ｖ） 約35,000ダルトンの分子量、約5.3のpＩ、並びに約7.5のｐＨ及び約70 ℃の温度で最大活性を有していること、 の１つ又はそれより多くを有している請求項１又は請求項２に記載の使用。 ４．生理学的に許容可能な担体及び熱安定キシラナーゼを含む飼料添加物であ って、該キシラナーゼは、ｐＨ 6.5及び40℃の温度で１％小麦アラビノキシラン 溶液の粘度を非加熱対照と同じ最終粘度±0.001パスカル秒にまで低下させる能 力で測定するとき、活性を実質的に損失しないで95℃に設定した水浴中１分間の 加熱に耐え得ることを特徴としている。 ５．上記キシラナーゼがミクロテトラスポラフレキスオサ又はサーモモノスポ ラフスカから得られる請求項４に記載の飼料添加物。 ６．上記担体が穀物であるか又は穀物から誘導される請求項４又は請求項５に 記載の飼料添加物。 ７．上記担体が粉砕した小麦、トウモロコシ、大豆又はこれらの副産物である 請求項６に記載の飼料添加物。 ８．飼料の飼料転換率を改善するため及び／又は飼料の消化性を高めるため及 び／又は消費した飼料の単位量当たりの動物の体重増加率を高めるために穀物性 飼料に添加するための請求項４〜７のいずれか１項に記載の飼料添加物の使用。 ９．少なくとも20重量％の穀物及び飼料１kg当たり0.00001〜10ｇの熱安定キ シラナーゼタンパク質を含む穀物性飼料であって、該キシラナーゼは、ｐＨ 6.5 及び40℃の温度で１％小麦アラビノキシラン溶液の粘度を非加熱対照と同じ最終 粘度±0.001パスカル秒にまで低下させる能力で測定するとき、活性を実質的に 損失しないで95℃に設定した水浴中１分間の加熱に耐え得ることを特徴としてい る。 １０．上記キシラナーゼがミクロテトラスポラフレキスオサ又はサーモモノス ポラフスカから得られる請求項９に記載の穀物性飼料。 １１．上記穀物が小麦、大麦、トウモロコシ、モロコシ、ライムギ、オートム ギ、トリチカル及び米のうちの少なくとも１つである請求項９及び請求項１０に 記載の穀物性飼料。 １２．家禽飼料又はブタ飼料としての請求項９〜１１のいずれか１項に記載の 穀物性飼料の使用。