CN114340686B - 含有软骨成分的软骨再生用组合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含有软骨成分的软骨再生用组合物及其制备方法。在本发明中通过提供软骨再生用组合物来，增加手术时在软骨损伤部位的形状维持力和使用便利性。上述软骨再生用组合物是通过将微粉化软骨粉末，与生物相容性高分子或化学交联的生物相容性高分子以物理方式进行混合的软骨再生用组合物。

Description

含有软骨成分的软骨再生用组合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及含有软骨成分的软骨再生用组合物及其制备方法。
背景技术
骨关节炎(Osteoarthritis)是以软骨及周边组织损伤导致的疼痛、僵硬和功能丧失为特征的慢性疾病，随着高龄人口的增加，发病率也在增加。软骨是无神经、无血管组织，一旦受损很难再生，而且进行范围广，因此需要手术治疗。
目前所适用的手术治疗方法有：微细穿孔术(microfracture)、自体骨软骨移植术(osteochoondral auttraft transplantation system)或自体软骨细胞移植术(autoologous chondrocyte implation)等，改善软骨损伤病变的方法。但是，作为首选的手术方法的微细穿孔术很容易使软骨被猾液或清洗液清洗掉，从而导致软骨再生不完整，由于体重或关节运动，可以使血凝块(blood clot)容易发生脱落或磨损。另外，微细穿孔术限制性地只适用于小软骨损伤部位，且由于所生成的是作为原本关节软骨成分的纤维性软骨(fibrous cartilage)并非透明软骨(hyaline cartilage)，因此对完整的软骨再生示出了有限的效果。一方面，自体骨软骨移植术或自体软骨细胞移植术适用于更大的软骨损伤部位，并表现出较高的成功率，但需要进行通过第一次手术采集自体软骨或自体软骨细胞后，需要通过第二次手术进行自体移植的两次手术，并且在采集过程中经常伴随着软骨周边正常组织的损伤问题。
最近备受关注的以干细胞为基础的软骨治疗剂是将从自体或同种异体组织中采集和分离的干细胞注入软骨损伤部位，并通过干细胞分化成软骨细胞来诱导软骨生成的方法，且病变部位的适用面积不受限制。但是，对于这种自体干细胞，具有如下限制要求：为了移植必须要采集自体细胞，而且成本高。另外，并不能完全保障注入的干细胞分化为正常软骨细胞，而且手术后需要长期住院和康复。
为了解决上述现有治疗方法的局限性，正在适用将人源性软骨成分直接在软骨损伤部位进行手术的方法。这种手术方法是将从死亡后的捐赠者软骨组织中采集的软骨加工成粒子(particle)和颗粒(granule)或微粉化粉末(micronized powder)形状后，与灭菌生理盐水或患者自己的血液-血小板丰富的血浆(platelet-rich plasma，与PRP)混合，并注入到软骨损伤部位来提高软骨再生。
在这种手术法中使用的常用产品中，DeNovo-
Figure BDA0003459050920000021
(Zimer Biomet公司)是将从婴儿到未满13岁的死后捐赠者的大腿关节区中获得的软骨组织加工成平均粒度为500～1000μm，并在灭菌生理盐水中以浸泡状态包装的人体组织产品。根据在先临床研究，对有髌骨外侧软骨4度(outerbridge grade IV)关节软骨缺陷的患者组，适用DeNovo-/>
Figure BDA0003459050920000022
其结果，生成了正常软骨或与其类似的软骨。
另一种常用产品为
Figure BDA0003459050920000023
(Artherex公司)，是将捐赠者的软骨组织加工成平均粒度为100～300μm的微粉化粉末的人体组织产品。据在先临床动物模型研究结果显示，在微细穿孔术后与PRP混合用于全层软骨损伤部位时，与单独使用微细穿孔术相比，不仅安全性和生物相容性得以提高，还呈现出更优异的软骨再生性。
如上述两个案例一，将人源性软骨直接用于患者软骨损伤部位的方法与现有的治疗方法相比，具有以下优点：
①在软骨损伤部位补充作为原本关节软骨成分的人源性透明软骨成分，并可以通过同种成分来诱导快速的软骨再生。
②当单独进行微细穿孔术时，可以克服在手术部位生成纤维软骨的局限性。
③无需从患者采集自体软骨组织、自体细胞及自体骨膜的手术步骤。
④相比使用现有干细胞的软骨治疗方法更加便宜。
一方面，上述两种事例的人源性软骨治疗材料中，DeNovo-
Figure BDA0003459050920000024
是从婴儿至未满13岁的死后捐赠者获得的治疗材料，因此具有限制性。另外，治疗材料本身就含有活人软骨细胞，因此手术后有可能引起免疫反应。治疗材料的储存期限非常短仅为数周以内，因此流通方法也非常局限。另外，由于软骨颗粒是单纯地在灭菌生理盐水中以水合的状态来提供，因此，在手术时很难在软骨损伤部位维持形状，从而具有使用者的相似性也有非常局限的缺点。
上述两种事例中另一种人源性软骨治疗材料
Figure BDA0003459050920000031
由于最终剂型是通过脱水的软骨粉末来提供的，因此不能直接适用于软骨损伤部位，从而在手术时专业医生通过额外的手工作业与患者的血液或PRP混合，确保粘性后才能使用，因此带来不便。
专利文献
1.美国公开专利2012-0239146
2.美国公开专利2013-0338792
非专利文献
1.Tompkins M.et al.,Preliminary results of a novel single-stagecartilage restoration technique:Particulated juvenile articular cartilageallograft for chondral defects of the patella.Arthroscopy,2013,29(10),pp.1661-1670。
2.Fortier L.A.et al.,BioCartilage improves cartilage repair comparedwith microfracture alone in an equine model of full-thickness cartilageloss.Am J Sports Med,2016,44(9),pp.2366-2374。
发明内容
本发明的目的在于提供一种通过对软骨进行粉碎及筛分离制备的微粉化软骨粉末的制备方法。
另外，在本发明的目的在于提供一种用于软骨再生的组合物，当根据本发明微粉化软骨粉末移植到体内时，能够以很好地凝集状态移植到软骨损伤部位而不以微粉化粉末、粒子或颗粒状态分散，从而使得软骨再生效果达到极大化。
本发明提供一种微粉化软骨粉末的制备方法，其包括以下步骤：冷冻干燥步骤，将软骨冷冻干燥；粉碎步骤，将上述已冷冻干燥的软骨进行粉碎；筛分离步骤，将上述已粉碎的软骨进行筛分离。
此外，本发明提供一种用于软骨再生的组合物，其包含按照上述的制备方法制备的微粉化软骨粉末，及生物相容性高分子或生物相容性高分子的交联物。
此外，本发明提供一种用于软骨再生的组合物的制备方法，该方法包括混合步骤，混合按照上述的制备方法制备的微粉化软骨粉末及生物相容性高分子或生物相容性高分子的交联物。
发明效果
在本发明中，在将同种或异种源性的软骨粉碎及筛分离后，使用通过脱脂肪化及脱细胞化制备的微粉化软骨粉末，可以将免疫反应诱发因子的残留降低到最小，并且可以提供能够诱导同质软骨组织安全有效地再生的软骨治疗用组合物。
另外，在本发明中通过提供软骨再生用组合物来，增加手术时在软骨损伤部位的形状维持力和使用便利性。上述软骨再生用组合物是通过将微粉化软骨粉末，与生物相容性高分子或化学交联的生物相容性高分子以物理方式进行混合的软骨再生用组合物。
具体来说，根据本发明的软骨再生用组合物是将微粉化软骨粉末与水凝胶(hydrogel)状的赋形材料混合而制成，因此能够以很好地凝集状态移植到软骨损伤部位而不以微粉化粉末、粒子或颗粒状态分散，从而能够使软骨再生效果最大化。
附图说明
图1a是示出通过粉碎和筛分离制备微粉化软骨粉末的过程的图，及图1b为测量微粉化软骨粉末的粒度分布的图表。
图2是对在微粉化软骨粉末中测量的胶原蛋白和硫酸化糖胺聚糖(sulfatedGlycosaminoglycan,sGAG)的含量进行定量的图表。
图3a示出根据微粉碎软骨粉末和HA-CMC赋形材料的混合比例测量的组合物的复数粘度的结果，及图3b是示出按照最大复数粘度的混合比例制备的软骨再生用组合物经注射器输出后的性状和通过手握后的形状保持力的图。
图4是示出将软骨再生用组合物进行移植后，在兔子膝盖关节软骨损伤部位的上述组合物的图。
图5a是示出在移植软骨再生用组合物的12周后，兔子的膝盖关节软骨损伤部位和摘除后组合物的图，及图5b是示出为组织学分析而进行H&E染色、番红O/固绿染色(Safranin-O/Fastgreen)和马松三色染色(Masson’s trichrome)的图。
具体实施方式
本发明涉及微粉化软骨粉末的制备方法，包括以下步骤：
冷冻干燥步骤，将软骨进行冷冻干燥的步骤；
粉碎步骤，将上述冷冻干燥的软骨进行粉碎的步骤；
筛分离步骤，将已粉碎的上述软骨进行筛分离的步骤。
在本发明的实施例中，通过制备微粉化软骨粉末，并制备包括上述微粉化软骨粉末和生物相容性高分子的交联物(HA-CMC构件)的软骨再生用组合物，确认到上述软骨再生用组合物具有优秀的粘弹性特性。另外，通过对上述软骨再生用组合物进行体内(In vivo)实验，确认到与传统的只进行微细穿孔术的情况相比，具有优秀的软骨再生效果。
以下，更加详细说明根据本发明的微粉化软骨粉末的制备方法。
本发明中微粉化软骨粉末(以下简称软骨粉末)，是指通过根据本发明制备工艺制备的数微米大小的软骨。上述软骨粉末不仅是指词典意义上的粉末(powder)，还可以在包括粒子(particle)和颗粒(granule)的意义上使用。
本发明的微粉化软骨粉末的制备方法包括以下步骤：冷冻干燥步骤、粉碎步骤、及筛分离步骤。
在一具体例中，软骨可以是同种或异种源性的软骨。上述同种源性软骨是指人源性软骨；异种可以指，人类以外的动物，即猪、牛、马等哺乳类动物的软骨。在本发明中，可以使用死后捐赠的人源性软骨。
本发明在实施冷冻干燥步骤之前，可以进行清洗步骤。作为清洗溶剂可以使用灭菌蒸馏水。通过上述步骤可以去除软骨内杂质。
此外，在本发明中，在实施冷冻干燥步骤之前，可以进行从软骨中去除软组织及软骨膜的步骤。
在一具体例中，可以使用刀片(blade)和骨钳(rongeur)来去除软骨组织和软骨膜。具体来说，用刀片将软骨和软骨的边界面以垂直的方式切断后，在使用灭菌蒸馏水浸湿组织表面使其不干燥的状态下，通过使用骨钳咬住并拽拉切断面的边角的方法去除软骨膜。
本发明中，冷冻干燥步骤是冷冻干燥软骨的步骤。
在一具体例中，上述软骨可以是上述清洗的、及去除软骨组织及软骨膜的软骨。
在一具体例中，冷冻干燥是在组织(软骨)冷冻的状态下，将其快速冷却后通过真空吸收水分的方法，可以通过上述冷冻干燥，调节软骨内水分。
在一具体例中，冷冻干燥可以在-50至-80℃下进行24至96小时。
在本发明中，粉碎步骤是粉碎上述冷冻干燥的软骨的步骤。
在一具体例中，粉碎可以用组织粉碎机来进行。这时，粉碎时间可以是30秒至5小时。在一具体例中，粉碎后的软骨的粒径可以是1到1000μm。
上述粉碎可以进行一次以上。
在本发明中，筛分离步骤是将在上述粉碎步骤中粉碎的软骨进行筛分离的步骤。
在一具体例中，可以使用刻度为100至1000μm之筛来实施筛分离。
上述筛分离可以进行一次以上。
在本发明中，在实施筛分离步骤后，可以进一步进行对微粉化软骨粉末进行脱脂肪化的脱脂肪化步骤；以及对微粉化软骨粉末进行脱细胞化的脱细胞化步骤。
在本发明中，脱脂肪化步骤是从脂肪组织中去除脂质成分的步骤。
在一具体例中，脱脂肪化(delipidation)是指从组织中去除脂质成分。
上述脂质成分的去除可以通过化学处理来进行。
在一具体例中，对于化学处理的种类没有特别限制，并且可以使用脱脂溶液来实施。上述脱脂溶液可以包含极性溶剂、非极性溶剂或它们的混合溶剂。上述极性溶剂可以使用水、醇或它们的混合溶液，上述醇可以使用甲醇、乙醇或异丙醇。非极性溶剂可以使用己烷、庚烷、辛烷或它们的混合溶液。具体而言，在本发明中，作为脱脂溶液可以使用异丙醇和己烷的混合溶液。在这里，异丙醇与己烷的混合比可以为40:60至60:40。
上述脱脂溶液的处理时间可以为1至30小时、1至20小时或10至20小时。
在本发明中，脱细胞化步骤是从已通过上述脱脂肪化步骤去除脂质成分的软骨粉末中去除细胞的步骤。
在一具体例中，脱细胞化(decellularization)是指在组织中去除除了细胞外基质以外的其他细胞成分，如核、细胞膜和核酸等。
在一具体例中，可以使用碱性溶液来进行脱细胞化，作为上述碱性溶液可以使用选自由氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、碳酸钙、氢氧化镁、氢氧化钙和氨组成的组的一个以上。本发明中，作为碱性溶液可以使用氢氧化钠(NaOH)。
在一具体例中，碱性溶液的浓度可以为0.01至1N、0.06至0.45N、0.06至0.2N或0.08至1.02N。在上述浓度范围内容易去除细胞。
此外，在一具体例中，脱细胞化步骤可以实施40至60分钟、70至200分钟或90至150分钟。在上述时间范围内很容易去除细胞。
在本发明中进行脱细胞化步骤之后，根据需要，可以进一步进行选自由以下步骤组成的组中的一种以上步骤：
用酸性溶液进行中和的中和步骤；
清洗已完成上述中和的软骨粉末的清洗步骤；
离心分离已完成上述清洗的软骨粉末的离心分离步骤；以及进行冷冻干燥的步骤。
在一具体例中，通过离心分离步骤可以去除脱脂肪化步骤及脱细胞化步骤中产生的杂质，并且可以获得高纯度微粉化的软骨粉末(沉淀物)。
另外，在清洗步骤中，作为清洗溶液可以使用灭菌蒸馏水及/或70％乙醇。
在一具体例中，离心分离可以在4000至10000rpm，或者8000rpm下实施5分钟至30分钟、5分钟至20分钟、或者10分钟。
在一具体例中，冷冻干燥可以在-50至-80℃下进行24至96小时。
此外，本发明是涉及按照上述的微粉化软骨粉末的制备方法制备的微粉化软骨粉末。
在一具体例中，微粉化软骨粉末的平均粒径可以为100μm至900μm、300μm至800μm、或者400μm至700μm，平均粒度可以为100μm至900μm。
本发明的微粉化软骨粉末可以包含作为关节软骨细胞外基质的主要构成因素的胶原蛋白(collagen)和糖胺聚糖(glycosaminoglycan(GAG))。相对于微粉碎后软骨粉末总重量(100重量％)，上述胶原蛋白的含量可以为30重量％以上、40至90重量％、50至80重量％或者60至80重量％；糖胺聚糖((glycosaminoglycan(GAG))的含量可以为5重量％以上、5至40重量％或者10至30重量％。
此外，本发明涉及含有按照上述的制备方法制备的微粉化软骨粉末的软骨再生用组合物。
根据本发明的软骨再生用组合物不仅可以包含上述微粉化软骨粉末之外，还可以包含生物相容性高分子或生物相容性高分子的交联物。
在一具体例中，微粉化软骨粉末可以使用通过上述制备方法制备的软骨粉末，其平均粒径为100μm至900μm。在上述粒径范围内，适用于注入生物体内，可以通过注射器进行注入。此外，微粉化软骨粉末含有作为关节软骨细胞外基质的主要构成因素的胶原蛋白(collagen)和糖胺聚糖((glycosaminoglycan(GAG))，因此，软骨再生效果非常优异。
在一具体例中，相对于组合物总重量(100重量份)，微粉化软骨粉末的含量可以为10至90重量份、10至30重量份、或者20至30重量份。在上述范围内，可以使用注射器注入，并且具有优异的软骨再生能力。
在本发明中，生物相容性高分子或生物相容性高分子的交联物可以提高用于软骨再生的组合物的粘弹性特性，并可以提高体内体积保持力。在本发明中，可以将这些生物相容性高分子或生物相容性高分子的交联物表示为赋形剂。
在一具体例中，生物相容性高分子或生物相容性高分子的交联物在组合物内可以以水凝胶态存在，并且将其表示为水凝胶赋形剂。
在一具体例中，生物相容性高分子的交联物是指，通过化学方式交联的一种以上生物相容性高分子。
在一具体例中，生物相容性高分子或生物相容性高分子的交联物的分子量可以为10kDa至2MDa。
在一具体例中，作为生物相容性高分子可以使用选自由胶原蛋白(collagen)、透明质酸(hyaluronic acid)、壳聚糖(chitosan)、羧甲基纤维素(carboxymethylcellulose)、海藻酸盐(alginate)、明胶(gelatin)组成的组中一个以上。
在一具体例中，生物相容性高分子的交联物可以是选自由胶原蛋白(collagen)、透明质酸(hyaluronic acid)、壳聚糖(chitosan)、羧甲基纤维素(carboxymethylcellulose)、海藻酸盐(alginate)及明胶(gelatin)组成的组中一个以上的生物相容性高分子的交联物。具体而言，在本发明中，可以使用透明质酸(hyaluronicacid，HA)和羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose，CMC)的交联物。
在一具体例中，生物相容性高分子是通过交联剂交联，上述交联剂可以选自由1,4-丁二醇二缩水甘油醚(1,4-butandiol diglycidyl ether，BDDE)、乙二醇二缩水甘油醚(ethylene glycol diglycidyl ether，EGDGE)、1,6-己二醇二缩水甘油醚(1,6-hexanediol diglycidyl ether)、丙二醇二缩水甘油醚(propylene glycol diglycidylether)、聚丙二醇二缩水甘油醚(polypropylene glycol diglycidyl ether)、聚四亚甲基二醇二缩水甘油醚(polytetramethylene glycol diglycidyl ether)、新戊二醇二缩水甘油醚(neopentyl glycol diglycidyl ether)、聚甘油聚缩水甘油醚(polyglycerolpolyglycidyl ether)、双甘油聚缩水甘油醚(diglycerol polyglycidyl ether)、甘油聚缩水甘油醚(glycerol polyglycidyl ether)、三甲基丙烷聚缩水甘油醚(tri-methylpropane polyglycidyl ether)、1,2-(双(2,3-环氧丙氧基)乙烯(1,2-(bis(2,3-epoxypropoxy)ethylene)、季戊四醇聚缩水甘油醚(pentaerythritol polyglycidylether)及山梨醇聚缩水甘油醚(sorbitol polyglycidyl ether)组成的组中一个以上。
在一具体例中，相对于组合物总重量(100重量份)，生物相容性高分子或生物相容性高分子的交联物的含量可以为10至90重量份、20至80重量份、或者50至80重量份。在上述范围内，可以提高生物相容性高分子的物性，此外，可以提高体内体积的保持力。
在一具体例中，软骨再生用组合物的复数粘度可以为5000～100000Pa·s。上述复数粘度是通过旋转流变仪(Rotary Lheometer Analyzer)(频率：0.1～10Hz；温度：25℃，变形率：1％)进行测量的结果值。
复数粘度(complex visciosity)作为在频率测量法中计算得到的频率依赖性粘度，上述数值是G”(粘性系数(损失弹性系数)、viscous modulus)、G'(弹性系数(储存弹性系数)、elastic modulus)和所测量的频率值所反映的数值。在本发明中，上述软骨再生用组合物的复数粘度可以为20000-5000Pa·s或35000至45000Pa·s。
在一具体例中，本发明的软骨再生用组合物可以通过注射器的注入等方法实现向体内注入或插入。这种软骨再生用组合物可以用作常规的医疗用材料。
此外，本发明涉及上述软骨再生用组合物的制备方法。
上述软骨再生用组合物的制备方法包括以下步骤：混合微粉化软骨粉末；及生物相容性高分子或生物相容性高分子的交联物的步骤。
在本发明中，微粉化软骨粉末可以使用按照上述制备方法制备的软骨粉末。
具体而言，微粉化软骨粉末可以通过以下步骤进行制备：
冷冻干燥步骤，将软骨冷冻干燥的步骤；
粉碎步骤，将上述冷冻干燥的软骨进行粉碎的步骤；
筛分离步骤，将上述粉碎的软骨进行筛分离的步骤；
脱脂肪化步骤，对微粉化软骨粉末实施脱脂肪化的步骤，及脱细胞化步骤，实施脱细胞化的步骤。
在本发明中，作为生物相容性高分子或生物相容性高分子的交联物可以使用市售的产品。此外，上述交联物可以通过在实验室等中利用生物相容性高分子来制备并使用。
上述生物相容性高分子的交联物可以通过以下方法制备：
交联步骤，利用交联剂对生物相容性高分子实施交联的步骤；及
冷冻干燥步骤，对上述已交联的交联物实施冷冻干燥的步骤。
在本发明中，交联步骤是利用交联剂对生物相容性高分子实施交联的步骤。上述步骤中，作为生物相容性高分子及交联剂可以采用上述的种类。
在一具体例中，生物相容性高分子可以通过酰胺键(amide bond)来结合。
在一具体例中，相对于生物相容性高分子，交联剂的含量可以为0.5至10重量份。
在本发明中，在实施冷冻干燥之前，可以进一步进行对交联的反应物实施清洗的步骤。在这里，作为清洗溶液可以使用磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate-buffered saline(PBS))和/或灭菌蒸馏水。
在本发明中，冷冻干燥步骤是对上述交联的交联物实施冷冻干燥的步骤。
在一具体例中，冷冻干燥可以在-50至-80℃下进行24至96小时。
在本发明中，将上述冷冻干燥的交联物与软骨粉末进行混合之前，可以将上述交联物与灭菌生理盐水等溶剂混合，以形成水凝胶。
在本发明中，微粉化软骨粉末；与生物相容性高分子或生物相容性高分子的交联物可以通过物理混合的方式混合。
在这里，生物相容性高分子或生物相容性高分子的交联物可以为水凝胶状态。
在一具体例中，上述物理混合的混合物内，微粉化软骨粉末的含量可以为10至90重量份、10至30重量份或者20至30重量份。
此外，在混合物内生物相容性高分子或生物相容性高分子的交联物的含量可以为10至90重量份、20至80重量份或者50至80重量份。
在一具体例中，可以通过将冷冻干燥的，生物相容性高分子的交联物溶解在溶剂中，然后与微粉化软骨粉末进行混合的方式制备上述混合物。在这里，作为溶剂可以使用生理盐水。
本发明，进一步可包括上述混合物的灭菌步骤。
通过上述灭菌步骤，可以除去软骨再生用组合物内的免疫性，可以有效破坏细菌等。
在一具体例中，可以通过照射放射线来实施上述灭菌步骤，并且放射线照射范围可以是10到30kGy。
在本发明中所制备得到的软骨再生用组合物为膏状。
此外，本发明涉及软骨再生用组合物的应用。
根据本发明的软骨再生用组合物，在体内移植后可诱导软骨再生，此外，使粘弹性特性提高，从而使体内体积保持力具有优异的效果。
因此，在一具体例中，本发明的软骨再生用组合物通过注射器的注入等方法能够实现向体内注入或插入。
最佳实施方式
通过以下实施例，对本发明进行更具体地说明。但是，本发明的范畴不限于以下实施例，本领域的技术人员可以理解，在不脱离通过记载于权利要求的思想而导出的技术思想的范围内，可进行多种变形、修改或者应用。
实施例
实施例1.制备微粉化软骨粉末
将人源性软骨用灭菌蒸馏水清洗，去除并切断软组织及软骨膜后，通过冷冻干燥(lyophilization)工艺进行预处理。将完成冷冻干燥的软骨用组织粉碎机(强力切割研磨机(power cutting mill)，粉末率(Pulverisette)25，FRITSCH，德国)粉碎30秒至5小时，通过刻度为100至1000μm的筛(sieve)来实施筛分离。通过进行数次上述粉碎及筛分离过程来，获得了人源性微粉化软骨粉末(参见图1a)。
实验例1.微粉化软骨粉末的平均粒度分析
(1)方法
对通过实施例1制备的微粉化软骨粉末进行粒度分析。
每1g上述微粉化软骨粉末加入40mL的灭菌蒸馏水，并进行2分钟的震荡分散后，使用粒度分析器(激光粒度分析仪(particle size analyzer)，LS 13 320，贝克曼库尔特(Beckman Coulter))，以湿式模式在0.017～2000μm的范围内测量了平均粒度。
(2)结果
结果示于图1b上。
如上述图1b所示，微粉化软骨粉末分布在尺寸为1μm以上到1000μm的范围，平均粒度为100至900μm的范围内。
实验例2.微粉化软骨粉末的成分分析
(1)方法
为了确认通过实施例1制备的微粉化软骨粉末中含有的关节软骨细胞外基质的主要成分和含量，而测定了胶原蛋白和GAG的含量。
首先，为了测定胶原蛋白的含量，使用蛋白质分解酵(Proteinase K)处理了微粉化软骨粉末，且用12.1N盐酸(Hydrochloric acid，HCl，35.0-37.0％，JUNSEI化学)溶液在110℃下进行反应16小时以上后，通过羟脯氨酸(hydroxyproline)分析法定量胶原蛋白含量。
另外，为了测量GAG含量，将微粉化软骨粉末用蛋白酶K(Proteinase K)在60℃下反应16小时后，通过使用DMMB(1,9-二甲基亚甲蓝)分析法进行定量。
(2)结果
结果显示在图2中。
如图2所示，可以确认，在微粉化软骨粉末中，相对于总重量，胶原蛋白和硫酸化糖胺聚糖(sGAG)含量分别为73.95重量％和19.39重量％。
实施例2.含有微粉化软骨粉末及化学交联的生物相容性高分子的软骨再生用组合物的制备
(1)微粉化软骨粉末的脱脂肪化及脱细胞化
首先，对在实施例1中制备的微粉化软骨粉末实施了脱脂肪化及脱细胞化。
使用40％至60％的异丙醇和40％至60％的己烷，进行了1到20小时的脱脂肪化过程。通过使用0.1N氢氧化钠对去除脂肪的组织进行处理的方式去除细胞。
(2)制备化学交联的生物相容性高分子
通过将由N-乙酰葡糖胺和葡萄糖醛酸组成的生物源性高分子透明质酸(SodiumHyaluronate，HA)和植物性高分子羧甲基纤维素钠(Sodium carboxymethyl cellulose，CMC)与作为交联剂的BDDE(1,4-丁二醇二缩水甘油醚，Sigma-Aldrich)进行混合来，制备了HA-CMC赋形材料。
通过在每100mL的浓度为0.1N～1N的NaOH溶液中，加入1mL～5mL的BDDE(1体积％至5体积％)来，准备反应溶剂。在准备好的反应溶剂中分别加入1重量％至10重量％的HA和CMC后，均匀混合并准备混合溶液。将上述混合溶液在50℃下进行3小时的加温反应后进行交联。将完成交联反应的反应物放入透析膜，用5L的PBS在常温下透析。2小时后，替换成5L的50％EtOH，并在常温下透析1小时。此后，用灭菌蒸馏水在常温下透析72小时，并进行冷冻干燥，最终获得HA-CMC赋形材料。
(3)膏状的软骨再生用组合物的制备
将膏状的软骨再生用组合物进行混合，以便能够包含相对于上述组合物总重量的10重量％至90重量％的微粉碎软骨成分。
将完成冷冻干燥的HA-CMC赋形剂与灭菌生理盐水混合，并进行凝胶化。通过最终将微粉化软骨成分和上述凝胶化的HA-CMC赋形材料进行混合来，制备出膏状的软骨再生用组合物。
将上述软骨再生用组合物填充到预充式注射器后，用伽玛射线(γ射线)灭菌。
实验例3.根据微粉化软骨粉末和HA-CMC赋形材料的混合比例来测定复数粘度
(1)方法
对按照实施例2的(1)中所制备的微粉化软骨粉末和实施例2的(2)中所制备的凝胶化的HA-CMC赋形材料的混合比例，制备的软骨再生用组合物的粘性进行了比较。
具体而言，采用旋转流变仪(rotational rheometer,DHR-1,TA仪器)，在频率：0.1～10 0Hz；变形率：1％；温度：25℃条件下，测定了1Hz下的复数粘度。
(2)结果
测定结果示于图3a及下述表1中。
表1
Figure BDA0003459050920000151
如上述图3a及表1所示，软骨再生用组合物的复数粘度在10:90到25:75的混合比例下增加，之后，随着微粉化软骨粉末的增加HA-CMC赋形剂的减少，可以确认到上述复数粘度降低。
因此，将表示最大的复数粘度的比例25:75选定为软骨再生用组合物的最终混合比例。
图3b是将按照选定的混合比例(25:75)制作的软骨再生用组合物从注射器输出的结果，其结果可以确认，上述组合物保持膏状，当手握时很好地凝聚在一起，并保持形态。
实验例4.体内性能验证
(1)方法
验证了在实施例2中制备的软骨再生用组合物(混合比例25:75)的体内(in vivo)性能。
在这里，作为对比组使用了在软骨损伤部位未移植任何东西的软骨缺陷组(Defect组)和仅实施微细穿孔术的组(microfracture组)。
上述验证是通过使用新西兰大白兔(雄性，18周龄,2.5千克)的实验来进行的。
实验动物的左、右膝盖关节区表面髌骨偏离股骨滑车沟(trochlear groove)生成直径5mm、深度2mm的全层骨软骨损伤(full-thickness osteochoondral defect)后，使用克氏针(K-wire)进行了微细穿孔术。将软骨再生用组合物膏移植到进行微细穿孔术的部位，并用纤维蛋白胶进行涂布。为了确认软骨修复及再生效果，在移植12周后牺牲实验动物，然后进行组织染色，分析结果。
(2-1)验证软骨损伤部位的形状保持力
图4是示出移植软骨再生用组合物后，兔子膝盖关节软骨损伤部位的组合物的图。上述图4中，移植软骨再生用组合物后，通过肉眼检查软骨损伤部位，可以确认软骨再生用组合物的形状保持力。
如图4所示，通过肉眼检查，可以确认膏状的软骨再生用组合物填充并维持在软骨损伤部位。
(2-2)修复软骨及再生效果验证
图5a是示出在移植软骨再生用组合物的12周后，兔子的膝盖关节软骨损伤部位和摘除后组合物的图。在图5a中可以对移植部位进行肉眼检查，并从外观上观察与邻接的正常软骨的连续性。
如上述图5a所示，肉眼检查结果显示，移植软骨再生用组合物的损伤部位与对照组相比，从外观上与邻接的正常软骨的连续性更为优异。
一方面，图5b是示出为了组织学分析而进行H&E染色、番红O/固绿染色(Safranin-O/Fastgreen)和马松三色染色(Masson’s trichrome)的图。在图5b中可以通过对摘除的样品进行H&E染色、番红O/固绿染色(Safranin-O/Fastgreen)和马松三色染色(Masson’strichrome)来，确认软骨修复效果。
如上述图5b所示，可以确认，软骨再生用组合物与对照组相比，显示出与正常膝盖关节软骨相似的细胞、GAG和胶原蛋白的生成。因此，可以确认根据本发明的软骨再生用组合物的软骨再生效果相对优秀。
产业利用性
在本发明中，在将同种或异种源性的软骨进行粉碎及筛分离后，使用通过脱脂肪化及脱细胞化制备的微粉化软骨粉末，可以将免疫反应诱发因子的残留降低到最小，并且可以提供能够诱导同质软骨组织更安全有效地再生的用于软骨治疗的组合物。

Claims (9)

1.一种软骨再生用组合物，其特征在于，包括：
微粉化软骨粉末；及
透明质酸和羧甲基纤维素的交联物，
相对于组合物总重量，上述微粉化软骨粉末的含量为10至30重量份，
相对于组合物总重量，上述透明质酸和羧甲基纤维素的交联物的含量为50至80重量份，
上述透明质酸和羧甲基纤维素的交联物通过利用如下交联剂实施交联，上述交联剂选自由1,4-丁二醇二缩水甘油醚、乙二醇二缩水甘油醚、1,6-己二醇二缩水甘油醚、丙二醇二缩水甘油醚、聚丙二醇二缩水甘油醚、聚四亚甲基二缩水甘油醚、新戊二醇二缩水甘油醚、聚甘油聚缩水甘油醚、双甘油聚缩水甘油醚、甘油聚缩水甘油醚、三甲基丙烷聚缩水甘油醚、1,2-双(2,3-环氧丙氧基)乙烯、季戊四醇聚缩水甘油醚及山梨醇聚缩水甘油醚组成的组中的一个以上，
上述软骨再生用组合物的复数粘度为35000至45000Pa·s。
2.根据权利要求1所述的软骨再生用组合物，其特征在于，上述微粉化软骨粉末通过以下步骤来制备：
冷冻干燥步骤，将软骨进行冷冻干燥；
粉碎步骤，将上述冷冻干燥的软骨进行粉碎；
筛分离步骤，将上述粉碎的软骨进行筛分离的步骤。
3.根据权利要求2所述的软骨再生用组合物，其特征在于：
使用组织粉碎机进行30秒到5小时的粉碎。
4.根据权利要求2所述的软骨再生用组合物，其特征在于：
使用刻度为100至1000μm的筛来实施筛分离。
5.根据权利要求2所述的软骨再生用组合物，其特征在于，还包括如下步骤：
脱脂肪化步骤，在实施筛分离步骤后，对微粉化软骨粉末实施脱脂肪化；及
脱细胞化步骤，实施脱细胞化。
6.根据权利要求1所述的软骨再生用组合物，其特征在于：
微粉化软骨粉末的平均粒径为100μm至900μm。
7.根据权利要求1所述的软骨再生用组合物，其特征在于：
微粉化软骨粉末含有30重量％以上的胶原蛋白和5重量％以上的糖胺聚糖。
8.一种软骨再生用组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
混合微粉化软骨粉末；及透明质酸和羧甲基纤维素的交联物的步骤，
相对于组合物总重量，上述微粉化软骨粉末的含量为10至30重量份，
相对于组合物总重量，上述透明质酸和羧甲基纤维素的交联物的含量为50至80重量份，
上述透明质酸和羧甲基纤维素的交联物通过利用如下交联剂实施交联的交联步骤来制备，上述交联剂选自由1,4-丁二醇二缩水甘油醚、乙二醇二缩水甘油醚、1,6-己二醇二缩水甘油醚、丙二醇二缩水甘油醚、聚丙二醇二缩水甘油醚、聚四亚甲基二缩水甘油醚、新戊二醇二缩水甘油醚、聚甘油聚缩水甘油醚、双甘油聚缩水甘油醚、甘油聚缩水甘油醚、三甲基丙烷聚缩水甘油醚、1,2-双(2,3-环氧丙氧基)乙烯、季戊四醇聚缩水甘油醚及山梨醇聚缩水甘油醚组成的组中的一个以上，
上述软骨再生用组合物的复数粘度为35000至45000Pa·s。
9.根据权利要求8所述的软骨再生用组合物的制备方法，其特征在于，透明质酸和羧甲基纤维素的交联物通过如下方法来制备：
冷冻干燥步骤，实施上述交联步骤之后，将上述交联的交联物实施冷冻干燥的步骤。
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