CN107849596B - 高纯度胶原蛋白颗粒及其制备方法与用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种制备胶原蛋白颗粒的方法。每一胶原蛋白颗粒的颗粒尺寸为约10‑250微米,且颗粒中所含的胶原纤维结构相对完整。
Description
本申请主张2015年8月11日申请的美国临时案第62/203,904号的所有权利,其内容整体并入本申请案中。
技术领域
本发明内容是关于一种制备胶原蛋白的方法,特别是制备胶原蛋白颗粒的改良方法,所述胶原蛋白适合作为可供细胞生长的生物性支架,例如,作为整形手术过程(即,整容手术)或软组织填充(例如,平滑脸部线条以及皱纹)所需的注射用皮肤填充剂;或者是作为伤口敷料用以促进伤口愈合。
背景技术
胶原蛋白是一种不溶性纤维蛋白,其存在于脊椎动物中,为结缔组织(如,皮肤)的纤丝的主要成分。传统制备胶原蛋白的方法不仅耗时且效率低,更会破坏胶原蛋白结构的完整性,使其不适合当作生物性支架,因而无法用于整容手术或作为伤口愈合移植物来使用。此外,市面上的胶原蛋白(如,Zyderm和Zyplast)是取自于乳牛皮肤,其无法用于所有的患者,因已知牛胶原蛋白中会在相当多宿主中引发严重的过敏反应,特别是具有自体免疫病史的个体身上。此外,牛胶原蛋白不会长时间存在于注射位置,因此,需定期补充注射。胶原蛋白之所以仅短暂存在于注射部位的原因是,从牛皮萃取胶原蛋白的过程中,胶原蛋白结构受到破坏,导致该些胶原蛋白易被宿主吸收。
本领域目前亦专注于开发源自人类的胶原蛋白(例如,Cosmoderm和Cosmoplast),但其来源有限(例如,取自包皮环切手术后的皮肤),导致人类胶原蛋白价格居高不下。或是,患者亦可通过抽脂手术从身上取得脂肪组织,经处理后形成注射形式的胶原蛋白,再立即回注使用,或是储存起来以备将来使用。然而,此一方式取得的胶原蛋白和前述牛胶原蛋白具有相同的缺陷,亦即,胶原蛋白的完整性会在分离的过程中受到破坏。
因此,本领域需要一种制备胶原蛋白的改良方法,其在分离胶原蛋白的过程中可保留胶原蛋白的天然结构和构型,使得据此制备而成的胶原蛋白可作为三维支架,供宿主细胞生长,且不会诱发宿主细胞出现严重的免疫反应。
发明内容
为解决上述制备胶原蛋白颗粒的问题,本案发明人公开了一种从动物皮肤(例如,牛或猪的皮肤)中制备胶原蛋白颗粒的方法,且该胶原蛋白颗粒能够保留天然胶原蛋白的构型。
再者,本发明内容的第一方面是提供一种制备胶原蛋白颗粒的方法。所述方法包含以下步骤:
(1)对一厚度为0.1-1毫米的动物皮肤施以一去细胞处理;
(2)以一水溶液处理步骤(1)中该经去细胞处理的动物皮肤,其中该水溶液包含一非离子表面活性剂;
(3)以一蛋白酶处理步骤(2)中该经水溶液处理的动物皮肤;
(4)以一核酸酶处理步骤(3)中该经蛋白酶处理的动物皮肤;
(5)对步骤(4)中该经核酸酶处理的动物皮肤施以一去离子化处理;
(6)对步骤(5)中该经去离子化处理的动物皮肤施以一去化学物质处理,以产生一胶原蛋白基质;以及
(7)将步骤(6)中该胶原蛋白基质进行造粒,以产生该胶原蛋白颗粒,其粒径为10-250微米。
依据某些实施方式,在步骤(1)中,将厚度为约0.1-1毫米的动物皮肤,以超临界流体(SCF)在压力100–500巴(par)以及温度30-50℃下,处理约20分钟至5天。
所述SCF是超临界二氧化碳(scCO2)、超临界一氧化二氮(scN2O)、超临界水(scH2O)、超临界烷类、超临界烯类、超临界醇类或超临界丙酮。在一实施例中,所述SCF是scCO2。在其他实施例中,所述SCF是scN2O。
依据一较佳实施方式,所述去细胞处理步骤的处理条件是温度约37℃、压力约350巴,以及处理时间为20分钟。
依据某些实施方式,在步骤(2)中,以含有表面活性剂的水溶液处理步骤(1)中去细胞的动物皮肤,其中所述表面活性剂可选自于以下所组成的群组:辛基酚聚氧乙烯醚(octylphenol ethoxylates)(例如,Triton Xseries)、脱水山梨醇单硬脂酸酯(sorbitanmonostearate)、聚山梨醇酯(polysorbate)、波洛莎姆(poloxomer)、壬苯醇醚(nonoxynols)、十六醇(cetyl alcohol)和烷基聚葡糖苷(alkylpolyglucoside)。在可任选的实施方式中,所述水溶液更包含一阴离子表面活性剂,例如,月桂基磺酸(laurylsulfonic acid)、十二烷基磺酸(dodecyl sulfonic acid)、十二烷基硫酸钠(sodiumdodecyl sulfate,SDS)、十二烷基苯磺酸(dodecyl benzene sulfonic acid)、十三烷基苯磺酸(tridecyl benzene sulfonic acid)、烷基苯氧基苯二磺酸(alkyl-phenoxy benzenedisulfonic acid)、萘磺酸(naphthalene sulfonic acid)、烷基萘磺酸(alkyl-naphthalene sulfonic acid)和烯基萘(alkenyl-naphthalene)。在又一可任选的实施方式中,所述水溶液更包含一盐类,例如,氯化钠和氯化钾等。在一较佳的实施例中,所述阴离子表面活性剂是十二烷基磺酸钠(SDS)。
依据某些实施方式,步骤(3)中的蛋白酶可选自于以下所组成的群组:胃蛋白酶(pepsin)、胰蛋白酶(trypsin)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、木瓜酶(papain)、木瓜凝乳蛋白酶(chymopapain)、凤梨酶(bromelain)、奇异果酶(actinidain)、蛋白酶A(proteinaseA)、蛋白酶K(proteinase K)、肽酶(peptidase)、无花果酶(ficin)、钙蛋白酶(calpain)、半胱天冬酶(caspase)及其组合。
依据某些实施方式,于步骤(4),以核酸酶处理步骤(3)中经蛋白酶处理的动物皮肤,所述核酸酶是DNA核酸酶或RNA核酸酶。
在可任选的实施方式中,步骤(4)中的产物可进一步以步骤(2)中的水溶液处理,所述水溶液包含非离子表面活性剂,其选自于以下群组:辛基酚聚氧乙烯醚(例如,TritonX series)、脱水山梨醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯、波洛莎姆、壬苯醇醚、十六醇和烷基聚葡糖苷。在一较佳实施例中,所述水溶液包含1%Triton X-100。在可任选的实施方式中,所述水溶液更包含一阴离子表面活性剂,例如,月桂基磺酸、十二烷基磺酸、十二烷基苯磺酸、十三烷基苯磺酸、烷基苯氧基苯二磺酸、萘磺酸、烷基萘磺酸和烯基萘。在其他可任选的实施方式中,所述水溶液更包含一盐类,例如氯化钠和氯化钾等。在一较佳实施例中,所述阴离子表面活性剂是十二烷基磺酸(SDS)。
依据某些实施方式,在步骤(5),将步骤(4)中经核酸酶处理的动物皮肤以过氧化氢处理1小时。
依据某些实施方式,在步骤(6),去除化学物质步骤包含将步骤(5)中的去离子产物,以一超临界流体(SCF)于压力100–500巴和温度30-50℃下处理20分钟至5天。
所述超临界流体是超临界二氧化碳(supercritical carbon dioxide,scCO2),超临界一氧化二氮(supercritical nitrous oxide,scN2O)、超临界水(supercriticalwater,scH2O)、超临界烷(supercritical alkane)、超临界烯(supercritical alkene)、超临界醇(supercritical alcohol)或超临界丙酮(supercritical acetone)。在一实施例中,所述SCF是scCO2。在其他实施例中,所述SCF是scN2O。
依据较佳实施方式中,所述去除化学物质步骤是在共溶剂存在下进行,处理条件为温度约37℃和压力约350巴,处理时间为约60分钟。在一实施例中,所述共溶剂是乙醇,且和SCF一并施用,其中共溶剂和SCF的体积比为1:10。
依据又一实施方式,在步骤(7)中,造粒步骤是以切割或研磨步骤(6)中的胶原蛋白基质,形成颗粒尺寸为10-250微米的胶原蛋白颗粒。制备而成的胶原蛋白颗粒是由胶原蛋白所构成,其保留了天然结构和构型,因此,这样的胶原蛋白颗粒可作为三维生物性支架,施用至个体后能够让细胞在胶原蛋白颗粒上生长。
因此,本发明内容第二方面是提供一种治疗个体皮肤状况的方法,其中皮肤状况是指伤口、皮肤上的纹路和/或凹陷。所述方法更包含施用一足够量的以本发明方法制备而成的胶原蛋白颗粒至个体的皮下,以减缓或改善皮肤状况。所述皮肤状况是伤口、皮肤上的纹路和/或凹陷。举例而言,伤口包含,但不限于,手术伤口(如,切口)、溃疡,以及任何身体上的其他损伤,其他损伤中产生了皮肤或其他组织遭破坏、切割、穿刺或撕裂。皮肤上的纹路和/或凹陷(例如,脸部的皮肤)包含,但不限于,眉间纹(frown lines)、嘴边纹(linesaround the mouth)、抬头纹(worry lines)、鱼尾纹(crows feet)、法令纹(smile lines),以及面疱或外伤造成的脸部疤痕。在一较佳的实施方式中,所述胶原蛋白颗粒是作为皮肤填充剂以填充个体的软组织,并经针头(例如,32号或以下的针)注射至个体中。在其他实施方式中,所述胶原蛋白颗粒是作为伤口敷料使用,利用涂敷器将胶原蛋白散布于个体的伤口上。
本发明内容第三方面是提供一种于整容手术过程用于治疗前述皮肤状况的试剂盒。所述试剂盒包含以下组成:一容器、本方法制备而成的胶原蛋白颗粒,其特征在于胶原颗粒中胶原纤维的维整体性相对完整,且每一颗粒的直径为约10–250微米;以及一与容器相关的说明,用以引导使用者使用发明内容的胶原蛋白颗粒。所述说明可以是手册、卡带、CD、VCD或DVD。
在参阅下文实施方式后,本领域技术人员当可轻易了解本发明的基本精神及其他发明目的,以及本发明所采用的技术手段与实施方式。
应当理解的是,前述一般性描述及以下的详细描述是经参考实施例来进行,并且旨在对如权利要求所保护的本发明做进一步解释。
附图说明
为让本发明的上述与其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂,所附图式的说明如下:
图1是依据本发明内容一实施方式所阐示的本发明胶原蛋白颗粒分别在电子显微镜(EM)于放大倍率(A)50X和(B)20,000X倍下所拍摄的照片;以及
图2是依据本发明内容一实施方式所阐示的3T3细胞重新生长(recellularizing)于本发明胶原蛋白颗粒后(A)12小时和(B)72小时,以电子显微镜(electromicroscope,EM)在放大倍率(A)2,000X和(B)4,000X下拍摄本发明胶原蛋白颗粒的照片。
具体实施方式
为了使本发明内容的叙述更加详尽与完备,下文针对了本发明的实施方式与具体实施例提出了说明性的描述;但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。实施方式中涵盖了多个具体实施例的特征以及用以建构与操作这些具体实施例的方法步骤与其顺序。然而,亦可利用其他具体实施例来达成相同或均等的功能与步骤顺序。
在此所示的单数名词“一(a,an)”、即“该”(the)包含复数型,除非另有定义。
虽然用以界定本发明较广范围的数值范围与参数皆是约略的数值,此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而,任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。在此处,“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10%、5%、1%或0.5%之内。或者是,“约”一词代表实际数值落在平均值的可接受标准误差之内,视本领域技术人员的考量而定。除了实验例之外,或除非另有明确的说明,当可理解此处所用的所有范围、数量、数值与百分比(例如用以描述材料用量、时间长短、温度、操作条件、数量比例及其他相似者)均经过“约”的修饰。因此,除非另有相反的说明,本说明书与附随权利要求所揭示的数值参数皆为约略的数值,且可视需求而变动。至少应将这些数值参数理解为所指出的有效位数与运用一般进位法所得到的数值。
本发明内容是关于一种制备胶原蛋白颗粒的新方法、利用该方法所制备而成的新的胶原蛋白颗粒,以及该胶原蛋白颗粒的用途。
本发明内容第一方面是提供一种制备胶原蛋白颗粒的方法,此方法能够保留胶原蛋白天然结构和构型,因此,当注射本发明胶原蛋白颗粒至宿主时,可提供一较佳的微环境,供宿主细胞组织在其上生长。
据此,本发明方法至少包含以下步骤:
(1)对一厚度为0.1-1毫米的动物皮肤施以一去细胞处理;
(2)以一水溶液处理步骤(1)中该经去细胞处理的动物皮肤,其中该水溶液包含一表面活性剂;
(3)以一蛋白酶处理步骤(2)中该经水溶液处理的动物皮肤;
(4)以一核酸酶处理步骤(3)中该经蛋白酶处理的动物皮肤;
(5)对步骤(4)中该经核酸酶处理的动物皮肤施以一去离子化处理;
(6)对步骤(5)中该经去离子化处理的动物皮肤施以一去化学物质处理,以产生一胶原蛋白基质;以及
(7)将步骤(6)中该胶原蛋白基质进行造粒,以产生该胶原蛋白颗粒,其粒径为10-250微米。
在进行本方法之前,较佳是透过剥皮的方式自一动物身上取得其皮肤,再经清洗、除毛和脱脂而获得适合用于本发明方法的动物皮肤。在一较佳实施方式中,适用于本发明内容的动物是经济动物,包含但不限于,猪、牛、乳牛、公牛、绵羊、山羊、驴、兔、鸭、鹅和鸡。可利用公知任一种物理或化学除毛或去脂方法来执行所述除毛和去脂步骤。举例而言,利用酸处理动物皮肤以去除动物皮肤(例如,猪皮)上的毛发,利用酶(例如,脂肪酶)或化学物质(例如,清洁剂)处理动物皮肤以去除其上的脂肪,另外,亦可用刀直接将脂肪切除。
接着,以皮刀去除上述已除毛和去脂的动物皮肤的表层,进而产生一厚度约0.1至1毫米的动物皮肤,例如,动物皮肤的厚度约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9以及1.0毫米;较佳为约0.2至0.6毫米,例如,0.2、0.3、0.4、0.5以及0.6毫米;最佳为约3毫米。由此所得的动物皮肤即可用于本发明内容所述的方法中。
在可任选的实施方式中,以碱试剂于温度0-55℃之间,处理前述厚度约为0.1至1毫米的动物皮肤约0.1-24小时,以去除残留的毛发和/或脂肪。举例而言,适用于本方法的碱试剂包含,但不限于,氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、尿素、硫化钠和硫代乙酸钙等。在较佳实施方式中,所述动物皮肤是猪的皮肤,且厚度为约0.1-0.6毫米,并且在4℃下,以0.1-1N氢氧化钠溶液处理约1小时。
在步骤(1),是对厚度为0.1-1毫米的动物皮肤进行去细胞处理。所述去细胞处理步骤的目的是在去除动物皮肤上的细胞物质的同时,仍能保留胶原蛋白的物理和生物化学特性,使其可作为组织支架。据此,在步骤(1),以超临界流体(SCF)在压力约100–500巴下,处理厚度为0.1-1毫米的动物皮肤,例如在100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490和500巴的压力下;较佳为约150–450巴,例如150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440和450巴;以及更佳为约200-400巴,例如200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390,以及400巴的压力下进行处理。此外,步骤(1)是在30-50℃的温度下进行,例如在30、31、32、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50℃;较佳是35-45℃之间,例如35、36、37、38、39、40、41、42、43、44和45℃;处理约20分钟至5天,例如20、30、40、50,以及60分钟;2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23,以及24小时;2、3、4和5天。在某些实施例中,所述厚度为0.1-1毫米的动物皮肤以SCF处理约1至24小时。在其他实施方式中,所述厚度为0.1-1毫米的动物皮肤以SCF处理2至5天。
所述SCF可以是超临界二氧化碳(scCO2)、超临界一氧化二氮(scN2O)、超临界水(scH2O)、超临界烷类、超临界烯类、超临界醇类或超临界丙酮。在一实施例中,所述SCF是scCO2,scCO2的温和的超临界条件是温度37℃、压力为350巴,因此,可在或接近个体体温(即,37℃)的温度下进行去细胞处理,来移除其中的生物性物质。在另一较佳实施方式中,所述SCF是scN2O。
接着,在步骤(2),以含有非离子表面活性剂的水溶液,来清洗步骤(1)中经去细胞处理的动物皮肤,以移除其上任何残留的细胞物质。举例而言,适用于本发明的非离子表面活性剂包含,但不限于,辛基酚聚氧乙烯醚(例如,Triton X series),脱水山梨醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯、波洛莎姆,壬苯醇醚,十六醇、烷基聚葡糖苷等。在较佳的实施方式中,非离子表面活性剂是辛基酚聚氧乙烯醚,即,Triton X series,其包含但不限于,Triton X-15、Triton X-35、Triton X-45、Triton X-100、Triton X-102、Triton X-114等。依据本发明内容某些实施方式,所述非离子表面活性剂是Triton X-100,其于水溶液中的浓度为0.1–10%(重量%),例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10%(重量%)。在较佳的实施方式中,离子表面活性剂于水溶液的浓度为0.5–5%(重量%),例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4或5%(重量%)。依据一较佳实施方式,所述水溶液含约1%(重量%)的Triton X-100。
在可任选的实施方式中,所述水溶液更包含一阴离子表面活性剂,例如月桂基磺酸、十二烷基磺酸、十二烷基苯磺酸、十三烷基苯磺酸、烷基苯氧基苯二磺酸、萘磺酸、烷基萘磺酸和烯基萘。在又一任选实施方式中,所述水溶液更包含一盐类,例如氯化钠和氯化钾等。在一较佳实施例中,所述阴离子表面活性剂是十二烷基磺酸(SDS)。
接着,在步骤(3)中,以蛋白酶来消化步骤(2)中经水溶液清洗的动物皮肤处理。本步骤采用温和的酶消化,因此能够保留胶原纤维的天然结构和构型。举例而言,适用于步骤(4)的蛋白酶包含、但不限于、胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜酶、木瓜凝乳蛋白酶、凤梨酶、奇异果酶、蛋白酶A、蛋白酶K、肽酶、无花果酶、钙蛋白酶、半胱天冬酶或其组合。在一实施例中,所述蛋白酶是胃蛋白酶。在其他实施例中,所述蛋白酶是胰蛋白酶和以及胰凝乳蛋白酶的混合物。在较佳的实施方式中,所述蛋白酶的浓度为约0.001–0.1%(重量%),例如0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09和0.1%(重量%);在较佳的实施方式中,约0.002–0.05%(重量%),例如0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04和0.05%(重量%)。依据一较佳实施方式,步骤(2)中经水溶液清洗的动物皮肤以约0.05%(重量%)胃蛋白酶处理约8-24小时,例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23和24小时;较佳为约12至20小时,例如12、13、14、15、16、17、18、19和20小时。
在步骤(4)中,以核酸酶处理步骤(3)中的产品,例如,以DNA核酸酶或RNA核酸酶,较佳是非专一性DNA/RNA核酸酶来处理步骤(3)中的产品。依据本发明内容某些实施方式,步骤(3)中的产品在37℃下以核酸酶处理1小时。
在可任选的实施方式中,更包含以糖苷水解酶(例如α-半乳糖苷酶)来处理步骤(4)中的产物,以移除步骤(3)中经核酸酶处理产物上任何残留的半乳糖基部分。
在又一可任选的实施方式中,更包含以上述水溶液来处理步骤(4)中的产物,以移除任何残留的细胞物质。在较佳的实施方式中,所述水溶液含1%Triton X-100,且亦含有阴离子表面活性剂,例如SDS。
在步骤(5)中,将步骤(4)中经核酸酶处理的动物皮肤去离子化,其包含对步骤(4)中经核酸酶处理的动物皮肤,施以过氧化氢溶液处理约0.5-5小时,例如约0.5、1、1.5、2、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5和5小时。在较佳实施方式中,溶液中的过氧化氢浓度为0.1-3%(重量%),例如约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5或3%(重量%)。依据一较佳实施方式,是以1%过氧化氢溶液处理步骤(4)中产物约1小时。
接着,于步骤(6)中,去除步骤(5)产物的化学物质,其包含以超临界流体处理步骤(5)中经去离子化的产物。利用与步骤(1)相似的条件进行处理,本步骤可采用相同或不同的超临界流体,于压力约100–500巴和温度30-50℃下,处理约20分钟至5天。在一实施例中,所述SCF是scCO2。在其他实施例中,所述SCF是scN2O。依据一较佳实施方式,所述SCF是连同一共溶剂一并施用至步骤(5)的产物,且去除化学物质步骤的处理条件为温度约37℃、压力约350巴,处理约60分钟。所述共溶剂是C1-4醇,其包含,但不限于,乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、异丁醇、仲丁醇、叔丁醇和环丁醇。在某些较佳的实施方式中,所述共溶剂是乙醇,可和SCF一并施用,其中共溶剂和SCF的体积比为1:20至1:4,例如,1:20、1:19、1:18、1:17、1:16、1:15、1:14、1:13、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5和1:4。在一较佳实施方式中,所述乙醇和SCF是以体积比约1:19施用。在其他实施方式,所述乙醇和SCF是以体积比约1:10施用。在又一实施方式中,所述乙醇和SCF是以体积比约1:4施用。
在最终步骤(7)中,将步骤(6)产物进行造粒,以产生适合注射施用的胶原蛋白颗粒。所述造粒是在有液态氮的条件下,以切割、研磨或修剪的方式处理步骤(6)中的产物(即,胶原蛋白基质),以便产出尺寸为10-250微米的胶原蛋白颗粒,例如约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、170、175、180、185、190、195、200、205、210、220、225、230、235、240、245和250微米。在一较佳实施方式,所述胶原蛋白颗粒的尺寸为约50-100微米,例如约50、55、60、65、70、75、80、85、90、95,以及100微米。在其他实施方式中,所述胶原蛋白颗粒的尺寸为约100-150微米,例如约100、105、110、115、120、125、130、135、140、145和150微米。在其他实施方式,所述胶原蛋白颗粒的尺寸为约150-250微米,例如约150、155、160、170、175、180、185、190、195、200、205、210、220、225、230、235、240、245和250微米。依据本方法制备而成的胶原蛋白颗粒其特征在于,胶原蛋白中的胶原纤维保留了天然胶原纤维结构和构型,使得本发明的胶原蛋白颗粒可作为生物性支架供细胞生长。
因此,本发明胶原蛋白颗粒可作为皮肤填充剂,并可利用32号或32号以下的针头,来将本发明胶原蛋白颗粒施用至个体中的特定部位(例如,脸部),例如以32、30、29、28、27、26s、26、25、24、23、22s、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8或7号针头来进行注射。在一实施例中,使用30号针头注射本发明胶原蛋白颗粒。在另一实施例中,使用27号针头注射本发明胶原蛋白颗粒。
此外,所述胶原蛋白颗粒是作为伤口敷料使用,利用涂敷器将胶原蛋白均匀散布于至个体的伤口上,所述伤口包含但不限于,手术伤口(如,切口)、溃疡,以及任何身体上的其他损伤,其他损伤中产生了皮肤或其他组织破坏、切割、穿刺或撕裂。脸部皮肤上的纹路和/或凹陷包含,但不限于,眉间纹、嘴边纹、抬头纹、鱼尾纹、法令纹,以及面疱或外伤造成的脸部疤痕。
本发明方法不同于现有技术之处在于,本方法在制备过程中不需使用交联剂或额外添加盐类以稳定胶原蛋白基质,亦不需要从胶原蛋白基质中萃取胶原蛋白纤维;取代而之的是本发明是将完整的胶原蛋白基质进行造粒产生胶原蛋白颗粒,其中每一颗粒的直径约10-250微米。利用本方法制备的胶原蛋白颗粒是由胶原蛋白纤维所构成,其保留天然胶原纤维的完整性,因此,本发明胶原蛋白颗粒适合作为供宿主细胞在其上生长的生物性支架使用。
因此,本发明内容另一方面是提供一种治疗一个体皮肤状况的方法;所述皮肤状况是指伤口、皮肤上的纹路和/或凹陷。所述方法包含以下步骤:施用一足够量的本方法制备的胶原蛋白颗粒至个体的皮肤下,以减缓或改善皮肤状况。本发明胶原蛋白颗粒适用于促进伤口愈合,平滑脸部的线条和/或凹陷,特别是所述伤口包含,但不限于,手术伤口(如,切口)、溃疡,以及任何身体上的其他损伤,其他损伤中产生了皮肤或其他组织破坏、切割、穿刺或撕裂;以及脸部皮肤上的纹路和/或凹陷包含,但不限于,眉间纹、嘴边纹、抬头纹、鱼尾纹、法令纹,以及面疱或外伤造成的脸部疤痕。
为了提供相关工具让本领域技术人员施用本发明,本发明胶原蛋白颗粒可包装成一试剂盒形式,用来治疗上述各种皮肤状况。在一实施方式中,本发明提供一种将本发明的胶原蛋白颗粒应用于脸部整容的试剂盒。在其他实施方式中,本发明提供一种利用本发明胶原蛋白颗粒治疗个体伤口的试剂盒。
所述试剂盒的组成包含:一容器、依据本发明任一实施方式所制备而成的胶原蛋白颗粒,其特征在于胶原纤维的整体性相对完整,且每一颗粒的直径为约10至250微米;以及一与容器附有的说明,记载如何使用本发明胶原蛋白颗粒。所述说明可以是手册、卡带、CD、VCD或DVD。
下文提出多个实验例来说明本发明的某些实施方式,以利本领域技术人员实作本发明,且不应将这些实验例视为对本发明范围的限制。据信技术人员在阅读了此处提出的说明后,可在不需过度解读的情形下,完整利用并实践本发明。此处所引用的所有公开文献,其全文皆视为本说明书的一部分。
实验例
材料与方法
细胞培养
NIH-3T3纤维母细胞培养于高浓度葡萄糖DMEM(含10%胎牛血清(FBS)、100单位/毫升的盘林西林和100毫克/毫升的链霉素)中,置于37℃、5%CO2,潮湿环境下培养。
于胶原蛋白颗粒重新生长(Recellularization)
当3T3细胞生长至约80%满(confluent)时,利用酶(0.25%胰蛋白酶溶于1mMEDTA)让贴附生长的细胞脱离后,在500x g下离心5分钟将脱离的细胞收集起来。将所收集到的细胞重悬于培养基中,并接种至经SCF处理的胶原蛋白颗粒(浓度:1x103细胞/毫升)上,接着将所述颗粒置于24孔培养盘,置于培养箱内培养12、24、48或72小时,确保细胞已贴附至胶原蛋白颗粒表面。接着,将其上有3T3细胞生长的胶原蛋白颗粒分别放入于2.5%戊二醛固定1.5小时和1%四氧化锇(oximum tetraoxide)中1.5小时,再放入酒精中脱水。
动物
采用纽西兰白兔(每只重量大于0.5或2公斤)进行热原试验和皮内刺激试验;采用ICR小鼠(BioLASCO Taiwan Co.,Ltd)(每只重量为约17-23克)和天竺鼠(每只重量为约300-500克)进行皮肤敏感性试验。实验动物培养在动物设施中,以可自由取用饮水和食物的方式饲养所述兔子(每笼一只)、小鼠(每笼5只)和天竺鼠(每笼5只),动物设施中的温度和湿度分别维持在18-26℃和30-75%。每日记录纽西兰白兔的体温,本热原试验所采用的纽西兰白兔其体温不超过39.8℃且体温最高值和最低值间不超过1℃。每次试验前皆会进行动物检疫并让实验动物适应试验环境。
实施例1胶原蛋白颗粒的制备和特性分析
1.1制备胶原蛋白基质
将去除毛发和脂肪的猪皮(0.2-0.4毫米)置于4℃下干燥24小时,接着以二氧化碳超临界流体(scCO2)在350巴,37℃下,处理40-180分钟,去除任何残留的细胞物质。
于室温(约22-28℃),对已经过去细胞处理的猪皮施以下述处理,包含声波降解、清洗、酶消化和清洗。简而言之,将经过去细胞处理的猪皮以声波降解(sonication)(0.1MTris)1小时,持续摇晃22小时(速度:100rpm),再进行音波震荡1小时。接着,依序以下列溶液清洗上述经音波震荡处理过的猪皮,水(10分钟/清洗,清洗二次)、含1%Triton X-100溶液(摇晃速度:100rpm;处理时间:24小时),以及水(10分钟/清洗,清洗二次),以移除任何不纯物,并产生胶原蛋白基质。接着,以胃蛋白酶溶液(0.01%胃蛋白酶溶于0.5M醋酸)处理所述胶原蛋白基质1小时,接着,在摇晃速度100rpm以水清洗(10分钟/清洗,清洗二次)。
于37℃下以DNA核酸酶溶液(0.3U/公分2)处理胶原蛋白基质1小时,接着,在室温下(约22-28℃)以1%Triton X-100(摇晃速度:100rpm,处理时间:24小时),和水清洗(10分钟/清洗,清洗二次)。接着,将胶原蛋白基质置于室温下(约22-28℃)1%H2O2溶液中处理1小时(摇晃速度:65rpm),再以水清洗(10分钟/清洗,清洗二次),接着,于37℃下真空干燥约8-30分钟。接着,再以scCO2于压力350巴和温度37℃、有10%(vol%)乙醇处理60分钟;再以水于25℃处理10分钟进行再水化,最终,于37℃下进行真空干燥约8-30分钟。
1.2制备胶原蛋白颗粒
切割实施例1.1复水的胶原蛋白基质,以及利用Freezer/Mill(6770/6870,5-25循环)研磨产生胶原蛋白颗粒。制备而成的胶原蛋白颗粒以伽玛射线(10-50kGy)照射,储存于无菌环境中备用。
依据电子显微镜(EM)分析结果可知每一本发明制备而成的胶原蛋白颗粒具有相对完整的纤丝(fibril)结构(参见图1)。
1.3实施例1.2胶原蛋白颗粒可支持3T3细胞生长
依据前述“材料与方法”所述的步骤,以实施例1.2胶原蛋白颗粒作为生长支架,测试其支持细胞于其上再次生长的能力。实施例1.2胶原蛋白颗粒的多孔性,使其可作为一良好的生物性支架,用以支持新接种的3T3细胞于该些胶原蛋白颗粒上生长(参见图2,(A)),经培养72小时候,整个胶原蛋白颗粒均被3T3细胞所包覆(参见图2,(B))。
实施例2实施例1胶原蛋白颗粒的过敏试验
为了评估本发明胶原蛋白颗粒是否会造成其他宿主免疫反应的潜在风险,本实验利用从实施例1.1胶原蛋白基质中制备出胶原蛋白萃取物,依照相关核准流程(特别是ISO0993-10和11)进行以下多种过敏性试验,包含热原试验、皮肤致敏化试验、急性全身性注射试验、皮下刺激试验。
2.1制备胶原蛋白萃取物
在50℃下,将实施例1.1的胶原蛋白基质(3x 4公分)浸渍于0.9%生理盐水或棉籽油中72小时,并持续搅拌(150rpm),使其溶出于食盐水或棉花籽油中,进而产生胶原蛋白萃取物。胶原蛋白基质/0.9%食盐水或棉籽油的表面积比约为1平方公分/1毫升。
2.2热原试验
在此,依据美国药典(Pharmacopoeia National Formulary USP36/NF31(151))所规定的步骤进行热原试验。简言之,本试验采用6只公纽西兰白兔(>1.5公斤,对照组:3只兔子,以及试验组:3只兔子),实验过程是将10毫升/公斤实施例2.1的胶原蛋白萃取物(于生理盐水中)注射至兔子的耳静脉中。对照组的兔子仅注射0.9%生理盐水。所述注射需于10分钟内完成。接着,分别于施用胶原蛋白萃取物后的1、1.5、2、2.5和3小时,测量实验动物的体温。
对照组兔子的体温分别为39.1、38.8以及38.8℃(表1);在试验组中的动物,于施用胶原蛋白萃取物(于生理盐水中)后,实验动物的体温有微幅波动,但这样的波动是在可接受范围内的(表2),结果显示从实施例1的胶原蛋白基质中制成的胶原蛋白萃取物基本上没有热原性。
表1胶原蛋白萃取物施用前实验动物的体温
表2胶原蛋白萃取物施用后实验动物的体温
HBT:体温最高值
CT:表1中实验动物的对照温度
2.3皮肤致敏化试验
依据ISO 10993-10所示的步骤进行皮肤致敏化试验。将30只公天竺鼠随机分派至4组,即,对照组-1(N=5)、对照组-2(N=5)、处理组-1(N=10)以及处理组-2(N=10)。于试验前,利用电动刀去除实验动物背部、颈部至肩胛骨区域上的毛,于每一实验动物的左侧上产生三个除毛后的区域,分别为A、B和C,实验的动物右侧也以前述相同的方式,产生三个除毛后的区域分别为A、B和C,每一区域约为2x 2平方公分。
在处理的第一天,依据表3或表4所显示“诱导(I)”的试验条件,以皮内注射的方式将相应的0.1毫升溶液注射至每组实验动物除毛后的区域。一周后,若实验动物没有产生刺激反应,再注射10%十二烷基磺酸(SDS)至该射区域,接着,依据表3或表4所显示的“诱导(II)”的条件,将预先浸泡于0.2毫升相对应溶液的贴片分别覆盖于前述相同的注射区域上。于“诱导(II)”处理的两周后,将实验动物下背部肩胛骨到臀部区域上的毛去除,选定适当的位置并将依据表3或表4所显示“激发期间”的条件,将预先浸泡于0.1毫升相对应处理溶液的贴片,分别覆盖于前述适当的位置上。
表3
FCA:弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant)表4
于激发后24和48小时,观察去除毛发的皮肤区域,是否有产生刺激和/或过敏反应。结果显示,无论是对照组或处理组的动物,在测试区域上皆未出现肉眼可见的刺激症状。因此,本发明胶原蛋白萃取物不会造成试验中的天竺鼠产生迟发性超敏反应。
2.4皮内刺激试验
依据ISO 10993-10所示的步骤进行刺激试验。简言之,本试验采用6只公纽西兰白兔(>2公斤,对照组:3只兔子,以及试验组:3只兔子)。于试验进行前,利用电动刀去除实验动物背部的毛。在处理当天,将0.2毫升的实施例2.1胶原蛋白萃取物(于生理盐水中)注射至每只实验兔左侧的5个区域;以及将0.2毫升的实施例2.1胶原蛋白萃取物(于棉籽油中)注射至每只实验兔右侧的5个区域。对照组的实验兔则分别注射0.2毫升的0.9%生理盐水或棉籽油至相同位置。于施用后24、48和72小时,观察实验动物的处理区域是否产生皮肤反应。
实验结果显示,无论是在对照组或处理组的动物,皆无明显的皮内刺激的临床征状,亦无造成动物死亡。因此,单一局部施用胶原蛋白萃取物不会造成纽西兰白兔皮内刺激。
2.5急性全身性注射试验
在此,依据ISO 10993-11所示的步骤进行急性全身性注射试验。将20只公天竺鼠随机分配至4组中,即,对照组-1(N=5)、对照组-2(N=5)、处理组-1(N=5)以及处理组-2(N=5)。
在处理的第一天,静脉注射单一剂量的胶原蛋白萃取物(溶于生理盐水)(50毫升/公斤)至处理组-1的动物,另,腹腔注射单一剂量的胶原蛋白萃取物(溶于棉籽油)(50毫升/公斤)至处理组-2的动物。将0.9%生理盐水和棉籽油由分别施用至对照组-1和对照组-2的动物。于施用后4,24、48和72小时观察实验小鼠毒性反应。
实验结果显示无论是在对照组或处理组的动物皆无明显的毒性临床征状,且亦无造成动物死亡。因此,单一局部施用胶原蛋白萃取物不会造成实验动物产生毒性反应。
虽然上文实施方式中揭露了本发明的具体实施例,然其并非用以限定本发明,本领域技术人员,在不悖离本发明的原理与精神的情形下,当可对其进行各种更动与修饰,因此本发明的保护范围当以附随权利要求所界定者为准。
Claims (5)
1.一种制备胶原蛋白颗粒的方法,其特征在于,包含:
步骤(1)在压力350巴以及温度37℃下,以一超临界二氧化碳(scCO2)对一去除毛发和脂肪且厚度为0.1-1毫米的猪皮肤去细胞40至180分钟;
步骤(2)以一水溶液处理所述步骤(1)中所述经超临界二氧化碳(scCO2)去细胞的猪皮肤,其中所述水溶液包含一非离子表面活性剂,其选自于以下物质所组成的群组:辛基酚聚氧乙烯醚、脱水山梨醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯、波洛莎姆(poloxomer)、壬苯醇醚、十六醇和烷基聚葡糖苷;
步骤(3)以一蛋白酶处理所述步骤(2)中所述经水溶液处理的猪皮肤,其中所述蛋白酶是选自于以下物质所组成的群组:胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜酶、木瓜凝乳蛋白酶、凤梨酶、奇异果酶、蛋白酶A、蛋白酶K、肽酶、无花果酶、钙蛋白酶、半胱天冬酶或其组合;
步骤(4)以一核酸酶处理所述步骤(3)中所述经蛋白酶处理的猪皮肤,所述核酸酶是一DNA核酸酶或一RNA核酸酶;
步骤(5)对所述步骤(4)中所述经核酸酶处理的猪皮肤施以一过氧化氢溶液处理一小时;
步骤(6)对所述步骤(5)中所述经过氧化氢处理的猪皮肤施以连同一共溶剂的所述超临界二氧化碳(scCO2),于压力350巴和温度37℃下,处理60分钟,以从中移除残留的化学物质,以产生一胶原蛋白基质;以及
步骤(7)将所述步骤(6)中所述胶原蛋白基质在液态氮下切割或研磨进行造粒,以产生所述胶原蛋白颗粒,其粒径为10-250微米,
其中,所述方法的特征在于不使用交联剂或盐类。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,在所述步骤(2)的所述水溶液更包含一阴离子表面活性剂,其选自于以下物质所组成的群组:月桂基磺酸、十二烷基磺酸、十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基苯磺酸、十三烷基苯磺酸、烷基苯氧基苯二磺酸、萘磺酸、烷基萘磺酸和烯基萘。
3.如权利要求1所述的方法,更包含以所述步骤(2)的水溶液处理所述步骤(4)的产物。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述水溶液更包含一阴离子表面活性剂,其是选自于以下物质所组成的群组:月桂基磺酸、十二烷基磺酸、十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基苯磺酸、十三烷基苯磺酸、烷基苯氧基苯二磺酸、萘磺酸、烷基萘磺酸和烯基萘。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述共溶剂是乙醇。
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