ITVI20120256A1 - Un processo per la preparazione di materiali biocompatibili da innesto a partire da osso di mammifero ed innesto biocompatibile ottenuto con il processo - Google Patents

Description

D E S C R I Z I O N E

Campo di applicazione

[001] La presente invenzione à ̈ generalmente applicabile al settore tecnico dei materiali per trapianti ossei e riguarda specificamente un processo per la produzione di un materiale biocompatibile per innesto a partire da osso di mammifero.

[002] L’invenzione riguarda altresì innesti ossei ottenuti mediante il processo sopra indicato.

Stato della Tecnica

[003] In ambito medico chirurgico esistono condizioni patologiche in cui il paziente soffre di una perdita di volume osseo. Tale perdita ossea, le cui cause possono essere differenti (trauma, atrofia, altro), comporta frequentemente una perdita di funzionalità, ovvero un disagio più o meno intenso al paziente. Al fine di ridurre il disagio al paziente si eseguono interventi chirurgici ove direttamente o indirettamente si tenta di ricostruire o riparare il volume osseo perduto, oppure rigenerare nuovo tessuto osseo laddove era venuto a mancare.

[004] E’ noto dalla letteratura medico-clinica che queste procedure rigenerative richiedono che nella zona da rigenerare sia innestato un materiale biocompatibile avente la funzione di realizzare un sostegno meccanico per vasi e cellule del paziente che, ancorandosi allo stesso, potranno colonizzare il volume da rigenerare.

[005] Idealmente, al fine di ottenere una rigenerazione ossea in senso stretto, ovvero il completo riempimento del volume oggetto di rigenerazione con tessuto osseo neoformato del paziente senza residui di materiale innestato, il materiale biocompatibile dovrebbe essere non solo completamente riassorbibile ma anche riassorbibile con una cinetica quanto più possibile fisiologica, ovvero allineata ai processi biologici di rimaneggiamento che avvengono nel sito di innesto e che dipendono anche dalle condizioni anatomiche di partenza.

[006] E’ infatti noto che parametri quali il volume del difetto e la superficie di osso vitale che lo circonda sono fattori predicenti ed influenzanti la velocità stessa con cui la rigenerazione avverrà nel sito innestato. Pertanto, il biomateriale dovrebbe essere idealmente metabolizzato attraverso gli stessi meccanismi con il quale avviene la rigenerazione nel sito innestato.

[007] Nel corso della storia della chirurgia rigenerativa ossea sono stati utilizzati differenti materiali da innesto. Il primo fra tutti à ̈ l’osso omologo, prelevato da una sede donatrice dello stesso paziente che viene innestato a distanza di pochi minuti nella sede di intervento. L’utilizzo dell’osso omologo comporta però una riduzione della mobilità per il paziente, con il rischio dell’insorgere e del permanere di effetti collaterali indesiderati a lungo termine.

[008] Si impiegano per questo tipo di innesto biomateriali alternativi, di origine differente: sintetica o naturale (non ossea) quali fosfati, solfati, biovetri, idrossia patiti sintetiche, depositi calcifici corallini.

[009] Questi materiali, tuttavia, pur soddisfacendo al requisito della biocompatibilità, non sembrano soddisfare quello del riassorbimento con cinetica e meccanismo fisiologico, ovvero l’interazione con l’ambiente cellulare osseo del paziente non à ̈ identica a quella dell’osso stesso.

[0010]La ricerca di una materiale esogeno che, tuttavia, possieda queste caratteristiche si à ̈ quindi orientata verso l’osso di mammifero come materiale di partenza, sulla base del fatto che la parte minerale del tessuto osseo di mammiferi appartenenti a specie diverse, in particolare diverso daH’uomo, presenta caratteristiche di estrema similitudine, dovuta al fatto che la composizione chimica à ̈ sostanzialmente identica e la morfologia tridimensionale à ̈ molto simile a quella dell'uomo.

[0011] Ciò fa supporre che processando opportunamente il tessuto osseo di un mammifero diverso dall ’uomo, eliminando tutta la componente antigenica in esso presente (proteine, lipoproteine, lipopolisaccaridi e polisaccaridi) ma lasciando inalterata la parte minerale, questa, una volta innestata, sia biocompatibile ed interagisca con gli elementi cellulari ossei del paziente ricevente in modo fisiologico; ovvero, siano soddisfatte le due caratteristiche precedentemente descritte.

[001 2] L’idea di processare osso di mammifero esiste già, ed esistono processi descritti in letteratura scientifica e brevett .

[001 3] Da US 4 654 464 à ̈ noto un procedimento per la preparazione di un materiale sostitutivo dell’osso che comprende una fase di rimozione dell’albumina, una fase di sgrassatura con solvente organico ed una fase di pirolisi a oltre 400ºC per rimuovere completamente la componente organica senza danneggiare la struttura minerale del materiale. Tuttavia, questo processo non permette di conservare la componente collagenica e quindi riduce le proprietà elastiche e meccaniche del materiale di partenza.

[0014] US 2012/012349 descrive un sostituto osseo mascellare ottenuto mediante un processo chimico-enzimatico il quale comporta l’uso di composti epossidici e amidi per modificare chimicamente i possibili epitopi antigenici.

Inoltre, il processo utilizza idrossido di sodio per la lavorazione del tessuto osseo che porta il pH sopra 10, denaturando così la componente collagenica e riducendo sia la biocompatibilità sia le proprietà meccaniche dell’innesto.

Presentazione dell’invenzione

[0015]Scopo del presente trovato à ̈ quello di superare gli inconvenienti sopra lamentati, mettendo a punto un processo che consenta di ottenere un materiale biocompatibile per innesto osseo che presenti caratteristiche di elevata biocompatibilità e resistenza meccanica.

[001 6] Uno scopo particolare à ̈ quello di concepire un procedimento per la preparazione di un materiale biocompatibile per innesti ossei che possieda specifiche proprietà biologiche favorevoli alla rigenerazione nel sito di innesto.

[0017] Questi scopi, nonché altri che appariranno più chiaramente nel seguito, sono raggiunti da un processo del tipo sopra indicato che, in accordo con la parte caratterizzante della rivendicazione 1 , il quale comprende le fasi di i) estrazione di un materiale osseo di partenza da un mammifero, ii) taglio del materiale estratto secondo forme predeterminate finalizzate all’innesto, iii) rimozione di lipidi dal materiale tagliato, iv) rimozione della componente antigenica, v) perossidazione.

[0018] Secondo l’invenzione, la fase di deantigenazione à ̈ effettuata esclusivamente per via enzimatica e le fasi dalla iii) alla v) sono effettuate a temperature fisiologiche inferiori a circa 60°C per preservare la frazione inorganica ossea e conservare sostanzialmente inalterata la struttura nativa del collagene di Tipo I.

[0019]Grazie questo particolare processo si ottiene la deantigenazione di

[0020]di osso di mammifero, di qualunque specie, al fine di ottenere un materiale da innesto osseo con le caratteristiche sopra indicate.

[0021] Il materiale ottenuto con il processo consente di ottenere caratteristiche tra loro correlate dell’osso di mammifero che sono vantaggiose da un punto di vista clinico e più precisamente:

- la sua resistenza meccanica à ̈ elevata sia nei confronti dei carichi statici che dinamici;

- anche se il biomateriale ottenuto processando osso di mammifero presentasse la stessa resistenza meccanica dell’osso non processato, esso comporterebbe comunque un vantaggio clinico poiché il materiale potrebbe essere modellato meccanicamente per dargli la forma voluta senza rompersi ed una volta innestato sopporterebbe i carichi statici e dinamici presenti nel sito di innesto;

- la presenza di collagene osseo conferisce proprietà meccaniche all’osso di mammifero, possiede inoltre specifiche proprietà biologiche prorigenerative e la sua presenza nel materiale da innesto finito in forma nativa permetterebbe l’esplicarsi nel sito di innesto di queste proprietà.

[0022] Il materiale sostitutivo dell’osso ottenuto con il procedimento secondo l’invenzione a partire da ossa di mammifero di qualunque specie risulta perfettamente biocompatibile e riassorbibile con modalità e tempi fisiologici, contiene collagene osseo preservato nella sua conformazione nativa ed ha le stesse proprietà meccaniche del tessuto non processato.

[0023] Il processo descrive inoltre l’ottenimento di un dispositivo medico finito, e quindi anche operazioni volte a garantirne la sterilità e la conservazione a lungo termine della stessa prima dell’impiego chirurgico.

[0024] Ulteriori forme di realizzazione vantaggiose dell’invenzione sono definite in accordo con le rivendicazioni dipendenti.

[0025] Ulteriori caratteristiche e vantaggi del trovato risulteranno maggiormente evidenti alla luce della descrizione dettagliata di alcuni esempi di realizzazione preferiti ma non esclusivi del processo di preparazione di materiale sostitutivo per innesti ossei.

Descrizione dettagliata di alcuni esempi di realizzazione preferiti [0026] Il processo secondo l’invenzione consente di realizzare innesti ossei che presentano le caratteristiche indicate nelle premesse. L’invenzione riguarda essenzialmente l’uso di enzimi per trattare ossa di animali (mammiferi) al fine di eliminare lipidi, antigeni e selettivamente deproteinizzarli usando un processo enzimatico multifase a bassa temperatura (fisiologica), che preservi la frazione inorganica ossea idrossiapatite - HA e conservi inalterata la struttura nativa del collagene di Tipo I.

[0027] Il processo comprende almeno le seguenti fasi:

i) estrazione dell’osso

ii) rimozione di lipidi;

iii) rimozione di lipidi dal materiale tagliato;

iv) rimozione della componente antigenica;

v) perossidazione.

utti i reagenti impiegati in dette fasi di iii) delipidizzazione e di iv) deantigenazione sono privi di solventi organici.

[0028] Nel seguito vengono esaminate in dettaglio e fasi dalla i) alla v).

[0029] i) Estrazione dell’osso

L’osso viene estratto dal mammifero animale, inizialmente tagliato, formato, lavato e congelato.

[0030] ii) Rimozione di lipidi

L’osso congelato viene tagliato e quindi decongelato, quindi viene trattato in una soluzione contenente lipasi a 37°C. La lipasi idrolizza i lipidi in acidi grassi e alcoli. I prodotti della lipolisi sono più solubili in acqua dei lipidi. L’osso trattato à ̈ quindi lavato con un getto di acqua, additivato con un tensioattivo per rimuovere i prodotti della lipolisi.

[0031] iii) Rimozione della componente antigenica

L’osso delipidizzato viene quindi trattato a 37°C in un bagno enzimatico.

[0032] iv) Rimozione selettiva di peptidi-proteine

Nell’innesto A) i prodotti sono trattati con una miscela proteolitica selettiva per 5 h a 37°C, per tagliare il telopeptide C terminale delle catene al e a2 del collagene di tipo I, ma lasciando le molecole restanti nel loro stato nativo. Le proteine non collageniche sono eliminate. Nell’innesto B) i prodotti sono trattati con una miscela collagenasica per 5 h a 37°C per eliminare sia le proteine collageniche sia quelle non collageniche. Segue un lavaggio per rimuovere i peptidi tagliati.

[0033] v) Perossidazione

Entrambi i composti intermedi sono quindi trattati in perossido di idrogeno (H202) a temperatura ambiente per rompere cellule residue ed inattivare i virus eventualmente presenti. Il perossido di idrogeno à ̈ quindi completamente rimosso dopo reazione usando un trattamento di lavaggio.

[0034] vi) Liofilizzazione

I prodotti perossidati sono sottoposti ad una fase di liofilizzazione a 50°C sotto vuoto

[0035] vii) imballaggio e sterilizzazione

I prodotti liofilizzati sono sottoposti ad una fase di imballaggio e sterilizzazione mediante irraggiamento con raggi beta con dose di 25 kGy.

[0036] Si osserva che tutti i reagenti impiegati nelle fasi di iii) delipidizzazione e iv) deantigenazione sono privi di solventi organici.

[0037] Utilizzando il processo sopra descritto, potranno essere realizzati due tipologie di innesti ossei indicati rispettivamente A e B.

[0038] L’innesto A à ̈ costituito dal 75% di HA e dal 24% di Atelo-collagene di tipo I, mentre l’innesto B à ̈ costituito dal 99% di HA.

[0039] Entrambi gli innesti, quando vengono inseriti nel corpo umano, presentano caratteristiche di elevata biocompatibilità ed una naturale adesione osteoblastica, oltre ad una accresciuta resistenza meccanica che consente sia un rimodellamento fisiologico senza rischio di rottura sia, una volta innestato, una resistenza ai carichi statici e dinamici presenti nel sito di innesto.

[0040] Nel seguito vengono fomiti alcuni esempi specifici di preparazione del materiale per innesti ossei secondo il trovato.

[0041] Esempio I

(Granuli di spongiosa contenenti Collagene nativo di Tipo I)

Femori prossimali/distali congelati, di cavallo di 3-5 anni, sono stati tagliati in sottili fette di 3-7mm di spessore. 250 g di fette sono stati trattati a 37°C con una miscela di lipasi per 5 h.

[0042] Le fette sono state lavate con un getto di acqua a 60°C e tensioattivo.

[0043] Le fette sono quindi state asciugate e le parti di spongiosa ossea sono state ridotte in granuli con granulometria da 0,5 a 1 mm. I granuli sono stati trattati in una soluzione di lipasi 5h a 37°C, e lavati con acqua corrente.

[0044] I granuli di spongiosa delipidizzati sono quindi trattati in una ulteriore soluzione enzimatica a 37°C, pH neutro, per 5h. I granuli sono quindi lavati con acqua corrente a 18°C per 10 minuti.

[0045] I granuli sono poi trattati in una soluzione proteasica a 37°C per 5 h per rimuovere i Telo-peptidi del collagene di tipo I. Dopo il trattamento, i granuli sono lavati con acqua corrente a 18°C per 20 minuti.

[0046] I granuli delipidizzati e deantigenati sono infine trattati con una soluzione di perossido di idrogeno 5 h a temperatura ambiente e lavati con acqua corrente fino a completa rimozione del Perossido. Il prodotto à ̈ infine liofilizzato a -50°C. Il prodotto à ̈ confezionato e sterilizzato con un irraggiamento β a 25 kGy.

[0047] Esempio 2

(Blocchi di spongiosa decollagenati)

Femori distali/prossimali congelati di cavallo di 3-5 anni di età, sono stati decongelati e tagliati in modo da ottenere blocchi con dimensione di circa 10x10x90mm. Dieci blocchi sono stati trattati a 37°C con una soluzione contenente lipasi per 5 h.

[0048] I blocchi sono trattati con un getto d’acqua a 60°C e surfattante. I blocchi sono asciugati e tagliati in pezzi di 10x10x10mm di dimensione e sono quindi trattati nuovamente con una soluzione lipolitica a 37°C per 5h e lavati con acqua corrente a 18°C per 10 min.

[0049] I blocchi sono quindi trattati con un’ulteriore soluzione enzimatica a 37°C, pH neutro, per 5h. I prodotti sono quindi lavati con acqua corrente a 18°C per 10 minuti

[0050] I blocchi sono poi trattati con 2 bagni consecutivi di una soluzione proteolitica a 37°C per 3h;

[0051] Dopo decollagenazione, i blocchi sono lavati in acqua corrente a 18°C per 10 minuti.

[0052] I blocchi delipidizzati e deantigenati sono stati trattati con una soluzione di perossido di idrogeno per 6 h a temperature ambiente e lavati rispettivamente fino a eliminazione del perossido.

[0053] I blocchi lavati sono liofilizzati a -50°C.

[0054] I prodotti sono imballati e sterilizzati con radiazioni β di intensità 25 kGy.

[0055] Esempio 3

(Flex di Spongiosa)

Femori distali congelati di cavallo di 3-5 anni di età, sono stati tagliati per formare fette di circa 50x25x3mm. 250 g di fette decongelate sono stati trattati con una soluzione di lipasi per 5 h e lavati con un getto d’acqua a 60°C con surfattante.

[0056] Le fette di spongiosa delipidizzate sono quindi trattate con una ulteriore soluzione enzimatica a pH neutro, a 37°C, per 5h.

[0057] Le fette sono state lavate con acqua corrente a 18°C per 10 minuti [0058] Le fette sono state trattate in una soluzione proteolitica a 37°C per 5 h per rimuovere i Telo-peptidi del collagene di Tipo I.

[0059] Dopo trattamento i prodotti sono stati lavati due volte con acqua corrente a 18°C per 10 minuti

[0060] Le fette delipizzate e deantigenate sono quindi trattate con una soluzione di perossido di idrogeno 5 h a temperature ambiente e lavate fino a completa eliminazione del perossido.

[0061] Le fette di spongiosa sono parzialmente demineralizzate usando Acido Cloridrico a concentrazioni tali da ottenere la demineralizzazione desiderata.

[0062] Le fette flessibili di spongiosa parzialmente demineralizzate sono lavate con acqua osmotica corrente fino a neutralizzazione del pH.

[0063] I prodotti lavati sono stati liofilizzati a -50°C.

[0064] I prodotti sono imballati e sterilizzati con un irraggiamento β a 25 KGy.

[0065] Il processo e l’innesto secondo il trovato sono suscettibili di numerose modifiche e varianti tutte rientranti nel concetto inventivo espresso nelle rivendicazioni allegate.

Claims (8)

1. RIVENDICAZIONI 1. Un processo per la preparazione di un materiale biocompatibile per innesti ossei a partire da osso di mammifero, comprende le seguenti fasi: i) estrazione di un materiale osseo di partenza da un mammifero; ii) taglio del materiale estratto secondo forme predeterminate finalizzate all’innesto; iii) rimozione di lipidi dal materiale tagliato; iv) rimozione della componente antigenica; v) perossidazione; in cui detta fase di deantigenazione à ̈ effettuata esclusivamente per via enzimatica ed in cui le fasi dalla iii) alla v) sono effettuate a temperature fisiologiche inferiori a circa 60C per preservare la frazione inorganica ossea e conservare sostanzialmente inalterata la struttura nativa del collagene di Tipo I.
2. 2. Processo secondo la rivendicazione 1, in cui il materiale osseo di partenza à ̈ di mammifero non umano.
3. 3. Processo secondo la rivendicazione 1 , in cui il materiale osseo di partenza à ̈ di cavallo.
4. 4. Processo secondo la rivendicazione 1 , in cui il materiale perossidato à ̈ sottoposto ad una fase vii) di liofilizzazione.
5. 5. Processo secondo la rivendicazione 1 , in cui il materiale liofilizzato à ̈ sottoposto ad una fase viii) di imballaggio e sterilizzazione mediante irraggiamento con raggi beta.
6. 6. Processo secondo la rivendicazione 1 , in cui la fase ii) di taglio à ̈ effettuata sul prodotto congelato.
7. 7. Processo secondo la rivendicazione 1 , in cui tutti i reagenti impiegati in dette fasi di iii) delipidizzazione e di iv) deantigenazione sono privi di solventi organici.
8. 8. Un innesto biocompatibile realizzato con materiale base ottenuto con il processo secondo una o più delle rivendicazioni dalla 1 alla 7, in cui il materiale biocompatibile dell’innesto contiene dal 75% al 99% di HA e dal 20 al 25% di collagene-Atelo di tipo I, in cui detto materiale base realizza nel sito dell’innesto una naturale adesione osteoblastica ed una resistenza meccanica che consente un agevole rimodellamento fisiologico.