CN105561395B - 一种共轴式血管化组织工程骨的构建及其应用 - Google Patents

一种共轴式血管化组织工程骨的构建及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105561395B
CN105561395B CN201610001763.7A CN201610001763A CN105561395B CN 105561395 B CN105561395 B CN 105561395B CN 201610001763 A CN201610001763 A CN 201610001763A CN 105561395 B CN105561395 B CN 105561395B
Authority
CN
China
Prior art keywords
bone
cell
holder
close coupled
coupled type
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201610001763.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105561395A (zh
Inventor
王簕
林启旺
娄爱菊
郭元
杨逸禧
何可人
蔡梓红
杨波
金丹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Original Assignee
Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University filed Critical Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Priority to CN201610001763.7A priority Critical patent/CN105561395B/zh
Publication of CN105561395A publication Critical patent/CN105561395A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105561395B publication Critical patent/CN105561395B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3834—Cells able to produce different cell types, e.g. hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, marrow stromal cells, embryonic stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
    • A61F2/00—Filters implantable into blood vessels; Prostheses, i.e. artificial substitutes or replacements for parts of the body; Appliances for connecting them with the body; Devices providing patency to, or preventing collapsing of, tubular structures of the body, e.g. stents
    • A61F2/02—Prostheses implantable into the body
    • A61F2/28—Bones
    • A61F2/2846—Support means for bone substitute or for bone graft implants, e.g. membranes or plates for covering bone defects
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/02—Inorganic materials
    • A61L27/12—Phosphorus-containing materials, e.g. apatite
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3808—Endothelial cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/52—Hydrogels or hydrocolloids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
    • A61F2/00—Filters implantable into blood vessels; Prostheses, i.e. artificial substitutes or replacements for parts of the body; Appliances for connecting them with the body; Devices providing patency to, or preventing collapsing of, tubular structures of the body, e.g. stents
    • A61F2/02—Prostheses implantable into the body
    • A61F2/28—Bones
    • A61F2002/2817—Bone stimulation by chemical reactions or by osteogenic or biological products for enhancing ossification, e.g. by bone morphogenetic or morphogenic proteins [BMP] or by transforming growth factors [TGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
    • A61F2/00—Filters implantable into blood vessels; Prostheses, i.e. artificial substitutes or replacements for parts of the body; Appliances for connecting them with the body; Devices providing patency to, or preventing collapsing of, tubular structures of the body, e.g. stents
    • A61F2/02—Prostheses implantable into the body
    • A61F2/28—Bones
    • A61F2002/2825—Femur
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
    • A61F2/00—Filters implantable into blood vessels; Prostheses, i.e. artificial substitutes or replacements for parts of the body; Appliances for connecting them with the body; Devices providing patency to, or preventing collapsing of, tubular structures of the body, e.g. stents
    • A61F2/02—Prostheses implantable into the body
    • A61F2/28—Bones
    • A61F2002/2835—Bone graft implants for filling a bony defect or an endoprosthesis cavity, e.g. by synthetic material or biological material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
    • A61F2310/00—Prostheses classified in A61F2/28 or A61F2/30 - A61F2/44 being constructed from or coated with a particular material
    • A61F2310/00005—The prosthesis being constructed from a particular material
    • A61F2310/00179—Ceramics or ceramic-like structures
    • A61F2310/00293—Ceramics or ceramic-like structures containing a phosphorus-containing compound, e.g. apatite
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
    • A61F2310/00—Prostheses classified in A61F2/28 or A61F2/30 - A61F2/44 being constructed from or coated with a particular material
    • A61F2310/00005—The prosthesis being constructed from a particular material
    • A61F2310/00359—Bone or bony tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/02—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Prostheses (AREA)

Abstract

一种共轴式血管化组织工程骨的构建及其应用，本发明涉及组织工程骨技术领域，特别涉及一种用于骨缺损修复的共轴式血管化组织工程骨的构建方法及应用。（1）外周区成骨化支架的构建；（2）轴心区三维血管网的构建；（3）共轴式组织工程骨的组装。本发明所述构建的共轴式血管化组织工程骨可以作为骨移植物用于修复大段负重骨缺损，在动物试验中已经证明了能很好的修复大段负重骨缺损。本发明的有益效果在于：目前大体积组织工程骨的构建仍充满挑战，主要是由于其轴心区无法实现早期充分血管化，而本发明提供的共轴式组织工程骨构建方案能够很好的解决轴心区早期充分血管化这一难题，实现血管化组织工程骨的构建。

Description

一种共轴式血管化组织工程骨的构建及其应用
技术领域
本发明涉及组织工程骨技术领域，特别涉及一种用于骨缺损修复的共轴式血管化组织工程骨的构建方法及应用。
背景技术
创伤、感染、肿瘤切除等各种原因造成的大体积骨缺损一直是临床治疗的难点，骨移植为解决该问题提供了可能。目前自体骨仍是骨移植来源的首选，但是其供给有限，应用时呈现“拆东墙补西墙”的困境，难以满足临床需求。因此，找寻一种合适的骨移植替代物已成为研究和修复大体积骨缺损的首要问题。
组织工程骨技术借助种子细胞，生长因子，支架材料已成功构建出具有良好成骨活性的小体积组织工程骨，这不但为骨移植物的来源提供了新的选择，还为骨缺损的修复提供了新的思路。但是在现有基础上，构建大体积的组织工程骨仍充满挑战，这也是制约组织工程骨由基础研究向临床应用过渡的关键所在。
要获得大体积的组织工程骨，首先要实现其充分再血管化，这是由骨组织自身特点决定的。事实上，组织工程骨在与宿主建立充分血供之前，其只能依靠周围组织液的浸润和渗透来维持营养供应，而这种范围极其有限，只有100到200微米。而宿主的新生血管通常以每天不足1毫米的速度长入组织工程骨中，而且其只能侵入材料的周边部分，轴心区长入的血管甚少，这时轴心区的种子细胞由于长时间的缺血缺氧已经坏死、凋亡，继而成骨不全，最终导致骨修复失败。由此可见，在组织工程骨移植后的转归过程中，早期建立及时、充分的血供，尽早实现移植物血管网与宿主血管的及时吻合，是影响组织工程骨构建成功与否的关键。
对于如何促进组织工程骨的充分血管化，目前主要有以下尝试：一种是通过改进材料的特性，如增大材料孔隙的直径和孔隙间的连通性，以利于宿主血管长入，但是由于传统组织工程骨支架通常具备特定的框架结构和较强的力学强度，往往导致材料轴心区无法与宿主内环境直接接触，影响了其成血管活性的构建；另一种是在组织工程骨中加入促血管化细胞因子（如VEGF因子），但是细胞因子半衰期短，作用时间有限，特别是材料轴心区的细胞因子代谢后不能及时从周围环境中获得补充；再者，将具有成血管活性的种子细胞载荷在组织工程骨支架材料中，但是轴心区细胞可能由于长时间缺血缺氧而发生凋亡，导致血管化失败。根据这些尝试获得的经验看来，只有实现组织工程骨轴心区的早期充分再血管化，才有可能突破大体积组织工程骨构建的瓶颈问题。
发明内容
本发明的目的在于针对目前组织工程骨构建过程中面临由于轴心区无法早期实现血管化，而导致大体积组织工程骨构建失败的这一难题，提供一种共轴式血管化组织工程骨的构建方案。该方法可以实现组织工程骨轴心区的早期、及时再血管化，提高组织工程骨的成骨效果，促进大段负重骨缺损的修复。
本发明所述的共轴式血管化组织工程骨包括轴心区和外周区两大部分，其中轴心区由水凝胶载荷血管化种子细胞构成，外周区由组织工程骨支架载荷成骨化种子细胞构成，借助外周区的开槽结构，实现共轴式组织工程骨轴心区与体内环境的直接接触，促进轴心区的微血管网与体内宿主血管间形成“夹心效应”，即从内、外向支架外周区提供全面的血供，以实现整个支架的充分再血管化，从而进一步促进外周区的成骨效果。
该共轴式组织工程骨构建方法包括如下步骤：（1）外周区成骨化支架的构建；（2）轴心区三维血管网的构建；（3）共轴式组织工程骨的组装。
步骤（1）外周区成骨化支架的构建，是获取机体自身具有成骨分化能力的种子细胞，将该种子细胞载荷于成骨化支架材料中，完成外周区成骨化支架的构建。
优选的，所述具有成骨分化能力的种子细胞为间充质干细胞，包括骨髓间充质干细胞、外周血间充质干细胞、脐血间充质干细胞、脂肪间充质干细胞或脐带间充质干细胞。
更优选的，所述具有成骨分化能力的种子细胞为骨髓间充质干细胞。
优选的，所述成骨化支架材料为具有良好成骨能力的组织工程骨支架，包括β-三磷酸钙支架，羟基磷灰石支架，脱钙骨基质支架。
更优选的，所述成骨化支架材料为β-三磷酸钙支架。该支架通过预先设计的特殊模具，借助高温烧结技术，获得具有开槽结构的中空圆柱状支架。支架的中空区为轴心区，支架的外周壁为外周区，外周区具有多孔结构，孔隙相互连通。该支架孔隙率为75%，微孔呈圆形，孔径为500μm。该支架材料在构建前用促成骨诱导分化培养基浸泡24小时，后将3代的自体骨髓间充质干细胞通过负压吸引和灌洗技术接种于支架的微孔中，于体外成骨诱导分化培养基中共培养24小时。
步骤（2）轴心区三维血管网的构建，是获取机体自身具有成血管网能力的种子细胞，根据微血管网构建要求，将血管化种子细胞与水凝胶混合，控制适宜的温度，保证载荷有血管化种子细胞的水凝胶处于液态，以便下一步完成共轴式组织工程骨的体外组装。
优选的，所述血管化种子细胞为血管内皮祖细胞和间充质干细胞，其中血管内皮细胞包括骨髓血管内皮祖细胞、外周血血管内皮祖细胞；其中间充质干细胞包括骨髓间充质干细胞、外周血间充质干细胞、脐血间充质干细胞、脂肪间充质干细胞或脐带间充质干细胞。
更优选的，所述血管化种子细胞为骨髓血管内皮祖细胞和骨髓间充质干细胞。
优选的，所述水凝胶为具有良好生物相容性，可供血管化种子细胞生长的温敏水凝胶。
更优选的，所述水凝胶为Ι型胶原与纤连蛋白构成的温敏水凝胶。在4℃条件下将液态Ι型胶原（1.5mg/ml）和液态纤连蛋白（90mg/ml）按1:1充分混匀，用2M NaOH调整pH值至7.4，该条件下水凝胶可保持液态。将3代的自体骨髓血管内皮祖细胞和3代的自体骨髓间充质干细胞悬液按4:1与该液态水凝胶充分混合，细胞的接种总浓度为1 x 106/ml，整个操作保持无菌。
步骤（3）共轴式血管化组织工程骨的组装，根据步骤（1）获得成骨化支架，通过支架外周区的侧槽结构，将步骤（2）获得的载荷有血管化种子细胞的水凝胶灌入支架的轴心区，为保持水凝胶为液态，温度控制在4℃。待水凝胶填充支架轴心区后，将温度提升至37℃，促进水凝胶转变成胶冻状，后在细胞培养箱中继续孵育1小时，以备体内植入应用。
本发明的有益效果在于：目前大体积组织工程骨的构建仍充满挑战，主要是由于其轴心区无法实现早期充分血管化，而本发明提供的共轴式组织工程骨构建方案能够很好的解决轴心区早期充分血管化这一难题，实现血管化组织工程骨的构建。本发明主要基于如下理由：1）血管内皮祖细胞与间充质干细胞共培养时，两者可分别分化为血管内皮细胞和血管壁外周细胞，能在体外或体内相互作用，快速形成具有功能的微血管网；2）水凝胶是构建三维微血管网的理想载体，其与细胞外基质结构相似，有利于新生血管长入；3）水凝胶虽然能快速构建微血管网，但是不能直接用于血管化组织工程骨的构建，因为其缺乏足够的力学强度，借助β-三磷酸钙的骨诱导活性和力学强度，可以弥补水凝胶的缺点并发挥其优点；4）为进一步借助体内环境优势，支架外周区建立了侧槽结构，更好的促进轴心区的水凝胶与体内环境直接接触，实现快速血管化。体内研究结果显示，用本发明的共轴式血管化组织工程骨不但能早期实现轴心区血管化，而且轴心区与体内环境能建立直接的血运联系，并且能提高骨缺损的修复能力。因此，本发明在血管化组织工程骨的构建及骨缺损的修复中有良好的应用前景。
本发明所述构建的共轴式血管化组织工程骨可以作为骨移植物用于修复大段负重骨缺损，在动物试验中已经证明了能很好的修复大段负重骨缺损。
附图说明
图1 共轴式组织工程骨的构建方案流程示意图；
图2 血管化种子细胞的获取和鉴定（实施例1）；
图3体外实验中，不同比例血管化种子细胞在水凝胶构建的三维培养体系中相互作用效果（实施例1），以及载荷血管化种子细胞水凝胶在裸鼠体内5天时成血管情况（实施例1）；
图4 植入后1个月时，micro-CT检测非共轴式组织工程骨与共轴式组织工程骨轴心区血管形成效果（实施例2）；
图5 X线检测各组成骨情况（实施例2）；
图6 HE和Masson检测各组骨修复情况（实施例2）；
图7 micro-CT检测各组骨修复情况（实施例2）；
图8 生物力学检测各组骨修复的力学强度（实施例2）；
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照试剂制造厂商所建议的条件进行。
实施例1：载荷血管化种子细胞水凝胶的体内快速成血管网实验研究
（1）种子细胞的获取：
1）骨髓血管内皮祖细胞（EPCs）的获取：抽取骨髓5ml，通过梯度离心法分离获得骨髓中的单核细胞，以内皮细胞培养液培养，2-3 天换液一次，培养2-4周后，通过形态学观察，流式细胞学检测鉴定细胞性质，记数后接种于培养瓶传代培养，取3代细胞备用（见图2）；
2）骨髓间充质干细胞（BMSCs）的获取：按骨髓培养法进行，抽取红骨髓，500u/mL肝素溶液抗凝，混匀后1000r/min离心10min弃上清，加入DMEM完全培养基，记数后接种于培养瓶传代培养，取3代细胞备用（见图2）。
（2）载荷血管化种子细胞水凝胶复合体的构建
在4℃条件下将液态Ι型胶原（1.5mg/ml）和液态纤连蛋白（90mg/ml）按1:1充分混匀，用2M NaOH调整pH值至7.4，获得液态水凝胶。将上述获得的血管内皮祖细胞与骨髓间充质干细胞悬液按4:1与该液态水凝胶充分混合，细胞的接种总浓度为1 x 106/ml，用2ml注射器抽取1.5ml液态载荷血管化种子细胞水凝胶复合体备用，整个操作保持无菌并且温度条件在4℃。
（3）载荷血管化种子细胞水凝胶复合体的体内成血管网检测
以裸鼠作为实验动物，将按上述方法（2）获得的载荷血管化种子细胞水凝胶复合体注入裸鼠背部皮下，实验分为两组：A组为单纯水凝胶组，B组为载荷血管化种子细胞水凝胶复合体组。分别于注射后3、5、7天取材，通过免疫组化技术检测血管网的形成效果。
（4）载荷血管化种子细胞水凝胶复合体的体内成血管网结果
图3可见，体外实验时，血管内皮祖细胞与骨髓间充质干细胞在4:1条件下在水凝胶中共培养时，有良好的相互作用效果，在3天时即有一定的成血管网效果，而且4:1条件下细胞间相互作用形成管样结构明显优于其他比例组（p<0.05）；图3可见，在体内实验时，载荷血管化种子细胞水凝胶复合体在体内共培养7天时，凝胶内微血管网的形成和计数明显高于单纯水凝胶组（p<0.05），并且以血管内皮祖细胞与骨髓间充质干细胞在4:1条件下共培养时成血管效果最佳。
实施例2：共轴式组织工程骨修复负重骨缺损的实验研究
（1）种子细胞的获取：
1）骨髓血管内皮祖细胞（EPCs）的获取：抽取骨髓5ml，通过梯度离心法分离获得骨髓中的单核细胞，以内皮细胞培养液培养，2-3 天 换液一次，培养2-4周后，通过形态学观察，流式细胞学检测鉴定细胞性质，记数后接种于培养瓶传代培养，取3代细胞备用；
2）骨髓间充质干细胞（BMSCs）的获取：按骨髓培养法进行，抽取红骨髓，500u/mL肝素溶液抗凝，混匀后1000r/min离心10min弃上清，加入DMEM完全培养基，记数后接种于培养瓶传代培养，取3代细胞备用。
（2）共轴式血管化组织工程骨的轴心区构建：
在4℃条件下将液态Ι型胶原（1.5mg/ml）和液态纤连蛋白（90mg/ml）按1:1充分混匀，用2M NaOH调整pH值至7.4，获得液态水凝胶。将上述获得的血管内皮祖细胞与骨髓间充质干细胞悬液按4:1与该液态水凝胶充分混合，细胞的接种总浓度为1 x 106/ml，整个操作保持无菌并且温度条件在4℃。
（3）共轴式血管化组织工程骨的外周区构建：
以β-三磷酸钙（β-TCP）作为组织工程骨支架外壁的构建原料，根据我们设计的特殊支架外形，通过高温烧结技术，合成一种高为15mm，直径为8mm的中空圆柱状支架材料。该支架的轴心区高15mm，直径4mm，有一侧槽结构与支架的外部直接联系。该支架的外周壁厚2mm，由β-三磷酸钙合成，具备多孔微观结构，孔间相互连通，整个支架具有良好的通透性。该支架孔隙率为75%，微孔呈圆形，孔径为500μm。
（4）共轴式血管化组织工程骨的构建：
首先，按上述（3）方法获取β-三磷酸钙组织工程骨支架后，通过反复灌洗和负压抽吸技术，将骨髓间充质干细胞载荷至β-三磷酸钙支架的外周区中。其次，根据上述（2）方法，在4℃条件下将载荷有一定比例的血管化种子细胞与水凝胶复合体缓慢灌入β-三磷酸钙组织工程骨支架的轴心区中。然后，调节温度至37℃，促进水凝胶固化成胶冻状，充分填充于支架的轴心区，最终实现共轴式组织工程骨的体外构建。
（5）兔股骨极限骨缺损模型的制备：
制备兔股骨干中部长约15mm的极限骨缺损模型，该模型制备已在各类文献中报道很多，即在无菌条件下，作兔大腿外侧长约6cm切口，依次切开皮肤、筋膜，通过肌间隙显露股骨，用尺子量出长约15mm的骨缺损范围，用线锯制备骨缺损。然后用1块6孔指骨钢板和4枚锁定螺钉分别固定股骨缺损的两断段。取出按上述方法（4）中获得的共轴式组织工程骨并植入股骨缺损区，完成兔负重骨极限骨缺损修复模型的建立，实验分为五组：A组：空白对照组；B组：单纯β-三磷酸钙支架组；C组：支架外周区复合成骨细胞，轴心区无血管化种子细胞组；D组：支架外周区复合成骨细胞，轴心区复合血管化种子细胞组；
（6）共轴式组织工程骨轴心区血管化检测：
在组织工程骨植入后的1个月，通过microfil灌注兔下肢股动脉，然后采用micro-CT检测微血管网形成，图4可见，共轴式组织工程骨的轴心区在术后早期即有大量新生血管形成，并且新生血管借助材料的侧槽结构与体内环境直接沟通。而在轴心区无载荷血管化种子细胞水凝胶组中，轴心区的血管网形成匮乏，无明显血管网生成（p<0.05）。
（7）共轴式组织工程骨骨修复效果检测：
在组织工程骨修复骨缺损模型的1、2、3个月，分别通过HE和Masson染色，影像学，micro-CT检测组织工程骨的修复效果提示（见图5-7），轴心区载荷有血管化种子细胞组成骨修复效果明显优于轴心区无血管化种子细胞组和单纯材料组，其中修复效果最佳为共轴式血管化组织工程骨组（p<0.05）。
（8）修复后股骨的力学强度
建立骨修复模型3个月后，采用四点弯曲实验检测股骨修复的力学强度（见图8），可见共轴式组织工程骨的刚度明显强于其他修复组（p<0.05），其刚度约占正常兔股骨刚度82.17%。

Claims (7)

1.一种共轴式血管化组织工程骨的构建，其特征是包括如下步骤：（1）外周区成骨化支架的构建；（2）轴心区三维血管网的构建；（3）共轴式组织工程骨的组装：
步骤（1）外周区成骨化支架的构建，是获取机体自身具有成骨分化能力的种子细胞，将该种子细胞载荷于成骨化支架材料中，完成外周区成骨化支架的构建，所述具有成骨分化能力的种子细胞为骨髓间充质干细胞、外周血间充质干细胞、脐血间充质干细胞、脂肪间充质干细胞或脐带间充质干细胞；
步骤（2）轴心区三维血管网的构建，是获取机体自身具有成血管网能力的种子细胞，根据微血管网构建要求，将血管化种子细胞与水凝胶混合，控制适宜的温度，保证载荷有血管化种子细胞的水凝胶处于液态，以便下一步完成共轴式组织工程骨的体外组装，所述血管化种子细胞为血管内皮祖细胞和间充质干细胞，其中血管内皮祖细胞是骨髓血管内皮祖细胞、外周血血管内皮祖细胞；其中间充质干细胞是骨髓间充质干细胞、外周血间充质干细胞、脐血间充质干细胞、脂肪间充质干细胞或脐带间充质干细胞；
步骤（3）共轴式血管化组织工程骨的组装，根据步骤（1）获得成骨化支架，通过支架外周区的侧槽结构，将步骤（2）获得的载荷有血管化种子细胞的水凝胶灌入支架的轴心区，为保持水凝胶为液态，温度控制在4℃，待水凝胶填充支架轴心区后，将温度提升至37℃，促进水凝胶转变成胶冻状，后在细胞培养箱中继续孵育1小时，以备体内植入应用。
2.根据权利要求1所述的共轴式血管化组织工程骨的构建，其特征是所述具有成骨分化能力的种子细胞为骨髓间充质干细胞。
3.根据权利要求1所述的共轴式血管化组织工程骨的构建，其特征是，所述成骨化支架材料为具有良好成骨能力的β-三磷酸钙支架，羟基磷灰石支架，脱钙骨基质支架。
4.根据权利要求1所述的共轴式血管化组织工程骨的构建，其特征是，所述成骨化支架材料为β-三磷酸钙支架，该支架通过预先设计的特殊模具，借助高温烧结技术，获得具有开槽结构的中空圆柱状支架，支架的中空区为轴心区，支架的外周壁为外周区，外周区具有多孔结构，孔隙相互连通，该支架孔隙率为75%，微孔呈圆形，孔径为500μm，该支架材料在构建前用促成骨诱导分化培养基浸泡24小时，后将3代的自体骨髓间充质干细胞通过负压吸引和灌洗技术接种于支架的微孔中，于体外成骨诱导分化培养基中共培养24小时。
5.根据权利要求1所述的共轴式血管化组织工程骨的构建，其特征是，所述血管化种子细胞为骨髓血管内皮祖细胞和骨髓间充质干细胞。
6.根据权利要求1所述的共轴式血管化组织工程骨的构建，其特征是，所述水凝胶为具有良好生物相容性，可供血管化种子细胞生长的温敏水凝胶。
7.根据权利要求1所述的共轴式血管化组织工程骨的构建，其特征是，所述水凝胶为Ι型胶原与纤连蛋白构成的温敏水凝胶，在4℃条件下将液态1.5mg/ml的Ι型胶原和90mg/ml的液态纤连蛋白按1:1充分混匀，用2M NaOH调整pH值至7.4，该条件下水凝胶可保持液态，将3代的自体骨髓血管内皮祖细胞和3代的自体骨髓间充质干细胞悬液按4:1与该液态水凝胶充分混合，细胞的接种总浓度为1× 106/ml，整个操作保持无菌。
CN201610001763.7A 2016-01-05 2016-01-05 一种共轴式血管化组织工程骨的构建及其应用 Expired - Fee Related CN105561395B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610001763.7A CN105561395B (zh) 2016-01-05 2016-01-05 一种共轴式血管化组织工程骨的构建及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610001763.7A CN105561395B (zh) 2016-01-05 2016-01-05 一种共轴式血管化组织工程骨的构建及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105561395A CN105561395A (zh) 2016-05-11
CN105561395B true CN105561395B (zh) 2018-08-21

Family

ID=55872385

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610001763.7A Expired - Fee Related CN105561395B (zh) 2016-01-05 2016-01-05 一种共轴式血管化组织工程骨的构建及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105561395B (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106834222A (zh) * 2017-01-22 2017-06-13 复旦大学附属华山医院 一种培育带血管蒂骨瓣的方法
WO2019018737A1 (en) * 2017-07-21 2019-01-24 President And Fellows Of Harvard College METHODS FOR PRODUCING MULTILAYER TUBULAR TISSUE CONSTRUCTIONS
CN111821518B (zh) * 2019-04-15 2023-01-10 弗元(上海)生物科技有限公司 一种具有再生能力的组织工程骨的制备方法
CN110101914A (zh) * 2019-05-04 2019-08-09 西北工业大学 一种预血管化的双相人工骨支架及其制备方法
CN111249528B (zh) * 2020-01-20 2021-07-16 浙江大学 一种基于复层细胞网格的组织工程骨及其制备方法
CN114292103B (zh) * 2021-12-24 2023-11-10 中国科学院上海硅酸盐研究所 一种具有齿轮沟槽状结构的生物活性支架及其制备方法和应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1631455A (zh) * 2005-01-19 2005-06-29 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 促血管化的组织工程骨及其体外构建方法
CN1846793A (zh) * 2005-04-14 2006-10-18 南方医院 一种组织工程骨及其构建与应用
CN101085374A (zh) * 2007-07-09 2007-12-12 山东大学 一种组织工程化骨复合体及应用
CN104740686A (zh) * 2015-04-01 2015-07-01 上海交通大学医学院附属第九人民医院 一种分步式组织工程骨构建方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1631455A (zh) * 2005-01-19 2005-06-29 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 促血管化的组织工程骨及其体外构建方法
CN1846793A (zh) * 2005-04-14 2006-10-18 南方医院 一种组织工程骨及其构建与应用
CN101085374A (zh) * 2007-07-09 2007-12-12 山东大学 一种组织工程化骨复合体及应用
CN104740686A (zh) * 2015-04-01 2015-07-01 上海交通大学医学院附属第九人民医院 一种分步式组织工程骨构建方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
大块血管化组织工程骨修复的骨缺损;李耀华;《中国组织工程研究》;20140212;第18卷(第7期);第994页-995页 *
组织工程骨的血管化策略;郑晓晖等;《中国组织工程研究》;20130409;第17卷(第15期);第2788页-2789页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN105561395A (zh) 2016-05-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105561395B (zh) 一种共轴式血管化组织工程骨的构建及其应用
US10463770B2 (en) Bone tissue engineering by ex vivo stem cells ongrowth into three-dimensional trabecular metal
Cordonnier et al. Biomimetic materials for bone tissue engineering–state of the art and future trends
Bian et al. Design and fabrication of a novel porous implant with pre-set channels based on ceramic stereolithography for vascular implantation
Xie et al. Three-dimensional flow perfusion culture system for stem cell proliferation inside the critical-size β-tricalcium phosphate scaffold
CN105327401B (zh) 丝素蛋白双层仿骨膜材料的制备方法
CN103480040B (zh) 含有脐带间充质干细胞分泌的多种蛋白的骨基质材料及制备方法
CN105250052B (zh) 一种髋关节假体及制备方法
CN105521525B (zh) 一种骨组织工程用多孔复合支架及其制备方法
CN107137763B (zh) 一种血管化组织工程骨及其制备方法
CN112791239B (zh) 一种超仿生软硬组织复合支架的制备方法
CN101979105A (zh) 一种用于软骨缺损修复的组织工程支架材料及其制备方法
CN104056304B (zh) 负载生长因子壳聚糖微球的dbm支架修复关节软骨材料
CN104984393A (zh) 一种骨组织工程支架材料及其制备方法
CN104707176B (zh) 一种复合支架材料
CN219133250U (zh) 一种基于类骨器官的3d生物打印类骨组织工程支架
CN105670990B (zh) 一种用于促进骨髓间充质干细胞定向分化的组织工程材料的制备方法与应用
CN106963986A (zh) 脂肪干细胞‑ecm修饰sis复合工程骨及其制备方法
CN113416690A (zh) 一种快速血管化的组织工程皮肤及其构建方法
Hu et al. Method for novel 3d bioprinting of gradient scaffold for osteochondral regeneration using a coaxial multi-nozzle and software
CN106075585A (zh) 一种基于人工肌腱支架材料的组织工程化人工肌腱移植物的制备方法
CN110038158A (zh) 光固化3d打印哈弗氏系统人工骨支架的配方及其制备方法
CN100406071C (zh) 生物结构HAP/β-TCP组织工程化骨的制备方法
CN116271222B (zh) 一种骨组织工程支架及其制备方法和应用
CN111714698A (zh) 含有细胞的生物凝胶组合物、其制备方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20180821

Termination date: 20190105

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee