CN106834222A - 一种培育带血管蒂骨瓣的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种培育带血管蒂骨瓣的方法，利用含轴心血管的血管化包膜瓣，在体外，接受免疫缺陷动物或人工灌流系统的血液灌注，作为血管化骨瓣的培育器；原代培养患者骨髓间充干细胞或成骨细胞，接种至多孔骨基质材料上，包裹于血管化骨瓣的培育器内，进行血管化骨瓣的培育。通过本发明方法获得的带血管蒂骨瓣用于骨缺损修复，可最大程度减轻机体损伤下。

Description

一种培育带血管蒂骨瓣的方法
技术领域
本发明涉及一种培育带血管蒂骨瓣的方法，用于外科医学。
背景技术
骨缺损的修复是临床上较棘手的问题，常用的髂骨块、肋骨片、颅骨外板等移植到受区后，因为不能及时重建血运而发生明显坏死，带血管蒂的自体骨瓣如游离腓骨移植后生长快速、骨吸收发生少，但对供区造成严重损伤，且有许多手术禁忌症，因此，预先培育带血管蒂的骨瓣有重大的临床价值。近年来，一些研究为避免牺牲机体固有骨瓣，利用机体固有肌肉、骨膜或肉膜作为带血管蒂骨瓣的培育器，将移植其内的接种有成骨性细胞的骨基质材料培育成血管化骨块，然后以肌肉、骨膜或肉膜的天然滋养血管作为所培育骨的轴心血管，进行游离骨移植[1-4]，取得了初步成功。
参考文献：
1.Hendrik Terheyden, Patrick Warnke, Anton Dunsche. Mandibularreconstruction with prefabricated vascularized bone grafts using recombinanthuman osteogenic protein-1: an experimental study in miniature pigs. Part II:Transplantation. Int. J. Oral Maxillofac. Surg. 2001; 30: 373-379.
2.Warnke PH, Springer IN, Wiltfang J, Growth and transplantation of acustom vascularised bone graft in a man. Lancet. 2004; 364(9436):766-70.
3.Alexander M. Tatara, James D. Kretlow ,Patrick P. Spicer. et al.Autologously Generated Tissue-Engineered Bone Flaps for Reconstruction ofLarge Mandibular Defects in an Ovine Model. Tissue Eng. Part A. 2015;21(10):1520-1528.
4.Oliver Scheufler a, Dirk J. Schaefer a, Claude Jaquiery, et al. Spatialand temporal patterns of bone formation in ectopically pre-fabricated,autologous cell-based engineered bone flaps in rabbits. J. Cell. Mol. Med.2008; 12( 4): 1238-1249.
已报道的带血管蒂骨瓣培育方法具有创新性，但缺点也很明显：首先，需要牺牲患者背阔肌、肋骨膜等机体固有的有重要功能的组织结构，对供区造成很大的损伤；此外，肌肉、骨膜等随所培育的血管化骨块移植至受区后，给受区带来额外的不必要的组织成分，影响治疗效果。
发明内容
本发明目的在于：提供一种培育带血管蒂骨瓣的方法。最大程度减轻机体损伤的前提下，培育带血管蒂的血管化骨瓣，用以治疗节段性骨缺损。
本发明目的通过下述方法实现：一种培育带血管蒂骨瓣的方法，利用含轴心血管的血管化包膜瓣，在体外，接受免疫缺陷动物或人工灌流系统的血液灌注，作为血管化骨瓣的培育器；原代培养患者骨髓间充干细胞或成骨细胞，接种至多孔骨基质材料上，包裹于血管化骨瓣的培育器内，进行血管化骨瓣的培育。
所述的血管化骨瓣的培育器的构建：于骨缺损患者皮下分离腔隙，并显露可进行显微吻合的非主干血管，贴着该血管埋置皮肤扩张器，术后间歇性注水扩张一段时间，扩张囊表面自发形成一薄层包膜，贴着包膜的血管束与包膜内新生小血管相连通，可作为包膜的轴心血管。将轴心血管两旁的血管化包膜掀起，形成矩形包膜瓣，移出体外，包膜瓣的轴心血管与体外人工灌流系统的管道或免疫缺陷动物的股动静脉显微吻合，接受血液灌注，轴型包膜瓣遂成为血管化骨瓣的培育器。
所述的原代培养患者骨髓间充干细胞或成骨细胞通过体外扩增培养：骨髓穿刺针抽取数毫升患者骨髓，密度梯度离心法收集单个核细胞层，低糖DMEM培养基重悬细胞沉淀并接种培养BMSC，或继以成骨细胞诱导液培养，获得OBC，将体外扩增培养的BMSC或OBC均匀接种至市售的多孔骨基质材料上。
在上述方案基础上，接种有细胞的多孔骨基质材料作为骨支架转移至血管化骨瓣培育器内：包裹于血管化骨瓣的培育器内，进行血管化骨瓣的培育，获得带血管蒂骨瓣：成骨性细胞在骨基质材料的诱导下，不断增殖与分化，形成骨细胞与骨基质，同时包膜的血管网不断长入新生骨质内，形成血管化骨块，6-8周后，切断血管吻合口，以包膜内的轴心血管为所培育骨瓣的血管蒂。
本发明提供用于骨缺损修复方面的用途。
本发明的优越性在于：通过本发明方法获得的带血管蒂骨瓣用于骨缺损修复，可最大程度减轻机体损伤下，具有下述特点：
（1）体外构建轴型血管化骨瓣，能彻底避免自体供骨造成的损伤；
（2）包膜血管床培育的血管化骨瓣的表面为薄层包膜结构，随血管化骨瓣一并移植至骨缺损区的包膜不会造成骨缺损区臃肿；
（3）作为血管化骨瓣培育器的包膜并非机体固有结构，利用包膜不会对机体造成损伤。
（4）包膜随血管化骨瓣一并移植至骨缺损区后，会自发降解消失，从而达到带血管蒂自体骨瓣一样的修复效果。
附图说明
图1构建含轴心血管的血管化包膜瓣 图1A：贴着分离出来的知名血管束埋置皮肤扩张器，术后间歇性注水扩张，扩张囊表面形成一薄层包膜；图1B：以走行于包膜内的知名血管为轴心血管，掀起矩形包膜瓣，并移出体外；
图2包膜瓣接受人工灌流系统的血液灌注，成为血管化骨瓣的培育器；
图3包膜瓣接受免疫缺陷动物的血液灌注，成为血管化骨瓣的培育器；
图4接种有BMSC或OBC的多孔骨基质材料转移至血管化包膜的血管床上；
图5包膜瓣包裹接种成骨性细胞的圆柱形多孔骨基质材料，包膜瓣毛糙面的小血管接触支架，包膜瓣外表面再包裹一层半透膜Biobrane Sheath，阻止免疫缺陷动物体内软组织侵入包膜；
图6接种有成骨性细胞的多孔骨基质材料在包膜内培育6-8周，形成血管化骨瓣，切断血管吻合口，以包膜瓣的轴心血管为血管蒂，游离移植血管化骨瓣至骨缺损区；
图中标号说明：
1——扩张器包膜血管床；1’——扩张器包膜血管床
2——人工灌流系统；
21——置换液容器；22——废液收集容器；
23——血液分离器；
24、25、26——血浆泵一、二、三；
3——包膜瓣；3’——扩张器包膜瓣；
4——轴心血管；
5——半透膜；
6——圆柱形多孔骨基质材料；
7——血管化骨瓣。
具体实施方式
实施例
一种培育带血管蒂骨瓣的方法，利用含轴心血管的血管化包膜瓣，在体外，接受免疫缺陷动物或人工灌流系统的血液灌注，作为血管化骨瓣的培育器；原代培养患者骨髓间充干细胞或成骨细胞，接种至多孔骨基质材料上，包裹于血管化骨瓣的培育器内，进行血管化骨瓣的培育，依序有下述步骤：
（1）于患者皮下埋置皮肤扩张器，获得含轴心血管的血管化包膜瓣；
（2）轴型包膜瓣移出体外，接受免疫缺陷动物或人工灌流系统的血液灌注，作为血管化骨瓣的培育器；
（3）原代培养患者骨髓间充干细胞或成骨细胞，接种至多孔骨基质材料上，包裹于骨瓣培育器内，进行血管化骨瓣的培育；
（4）以包膜瓣的轴心血管为血管蒂，将所培育的骨瓣及其表面的包膜一并转移至骨缺损区。
其中：
一）血管化骨瓣的培育器的构建：
如图1构建含轴心血管的血管化包膜瓣所示，图1A：贴着分离出来的知名血管束埋置皮肤扩张器，术后间歇性注水扩张，扩张囊表面形成一薄层包膜；图1B：以走行于包膜内的知名血管为轴心血管，掀起矩形包膜瓣，并移出体外。于骨缺损患者皮下分离腔隙，并显露可进行显微吻合的非主干血管，贴着该血管埋置皮肤扩张器，术后间歇性注水扩张一段时间，扩张囊表面自发形成一薄层包膜，贴着包膜的血管束与包膜内新生小血管相连通，作为包膜的轴心血管，将轴心血管两旁的血管化包膜掀起，形成矩形包膜瓣，移出体外，将移出体外的轴心血管两旁的血管化包膜，包膜瓣的轴心血管与体外人工灌流系统的管道或免疫缺陷动物的股动静脉显微吻合，接受血液灌注，轴型包膜瓣遂成为血管化骨瓣的培育器。
如图2所示，包膜瓣接受人工灌流系统的血液灌注，成为血管化骨瓣的培育器。体外人工灌流系统包括：由管道连接的置换液容器21、废液收集容器22、血浆泵和血液分离器23，包膜瓣3平铺在包膜血管床1上，包膜瓣3的轴心血管4的动静脉断端分别与人工灌流系统2的管道连通，置换液经血浆泵一24泵入血液分离器23的血浆槽231内，血浆槽231内的合格血浆进入轴型包膜瓣3，循环出的血浆被血浆泵二25泵入血液分离器23进行分离，将轴型包膜瓣3的代谢产物经血浆泵三26泵入至废液收集容器21内，分离出的合格血浆调节压力PV、pH值后与置换液容器21内的置换液在血浆槽221内混合后重新灌入包膜瓣3，形成血浆的体外人工灌流系统。或者，
如图3所示，包膜瓣3接受免疫缺陷动物的血液灌注，包膜瓣3的轴心血管4的动静脉断端分别与免疫缺陷动物的股动脉连接，成为血管化骨瓣的培育器。
二）患者骨髓间充质干细胞（BMSC）或成骨细胞（OBC）的培养与接种，即原代培养患者骨髓间充干细胞或成骨细胞通过体外扩增培养方法：
骨髓穿刺针抽取数毫升患者骨髓，密度梯度离心法收集单个核细胞层，低糖DMEM培养基重悬细胞沉淀并接种培养BMSC，或继以成骨细胞诱导液培养，获得OBC，将体外扩增培养的BMSC或OBC均匀接种至市售的多孔骨基质材料上。如图4所示，接种有BMSC或OBC的多孔骨基质材料（如β-TCP/HA）转移至扩张器包膜血管床1上，包膜的轴心血管4由人工灌流系统或免疫缺陷动物血液灌注。
三）接种有细胞的骨支架转移至血管化骨瓣培育器内
将接种有BMSC或OBC的骨基质材料作为骨支架从培养箱中取出，转移至轴型包膜瓣毛糙面（患者体内掀起包膜瓣时的分离面），为使毛糙面的小血管充分接触支架，包膜瓣包裹支架表面，成为扩张器包膜3’，即：接种有细胞的多孔骨基质材料包裹于血管化骨瓣的培育器内，进行血管化骨瓣的培育，获得带血管蒂骨瓣：如果包膜瓣位于免疫缺陷动物皮下，则扩张器包膜瓣3’表面再覆盖一层半透膜5，以免周围组织侵入包膜内。
如图5所示：扩张器包膜3’包裹接种成骨性细胞的圆柱形多孔骨基质材料6，包膜瓣毛糙面的小血管接触支架，扩张器包膜瓣3’外表面再包裹一层半透膜5（BiobraneSheath），阻止免疫缺陷动物体内软组织侵入包膜；
四）带血管蒂骨瓣的收获与移植
成骨性细胞在骨基质材料的诱导下，不断增殖与分化，形成骨细胞与骨基质，同时包膜的血管网不断长入新生骨质内，形成血管化骨块，6-8周后，切断血管吻合口，以包膜内的轴心血管4为所培育骨瓣的血管蒂，将血管化骨块连同其表面的包膜游离移植至骨缺损区，包膜内轴心血管的断端分别与骨缺损区附近的知名动静脉显微吻合。
扩张器包膜3’包裹接种成骨性细胞的圆柱形多孔骨基质材料6，包膜的轴心血管4由人工灌流系统或免疫缺陷动物血液灌注，在包膜内培育6-8周，形成血管化骨瓣7，如图6所示，切断血管吻合口，以包膜瓣的轴心血管4为血管蒂，游离移植血管化骨瓣至骨缺损区。
应用例
. 构建带血管蒂骨瓣的培育器：
麻醉状态下，于骨缺损患者腹股沟区皮下分离腔隙，并将旋髂浅动静脉束（SCI）起始段从腹股沟脂肪垫中分离出来，贴着该血管束埋置皮肤扩张器，缝合皮肤切口。术后每周1-2次向扩张囊内注入生理盐水，扩张4-6周后取出扩张器，扩张囊表面自发形成一薄层包膜，SCI起始段走行于包膜内，且该段血管束两旁包膜内富含新生小血管，掀起SCI起始段两旁的包膜，形成以SCI起始段为轴心血管的矩形包膜瓣，并移出体外，包膜瓣轴心血管的近心断端分别与免疫缺陷动物的股动静脉或人工灌流系统的管道吻合，接受血液灌注，成为带血管蒂骨瓣的培育器。
2. 患者骨髓间充质干细胞的培养与接种：
取出扩张器前一周，骨髓穿刺针抽取数毫升患者骨髓，移至Percoll分离液表面，密度梯度离心，收集单个核细胞层，PBS离心洗涤两遍，低糖DMEM培养基重悬细胞沉淀并接种至培养皿内培养，24小时后去除未贴壁细胞，每两天进行一次细胞换液，当细胞增殖至接近融合时，0.25%胰酶消化传代，通过检测细胞表面标记物进行骨髓间充质干细胞（BMSC）的鉴定。市场上购置多孔骨基质材料如β-TCP/HA，塑成需要的形状，放入注射器内， BMSC重悬于含抑肽酶、凝血酶及纤维蛋白原的DMEM 中，被注射器吸入，封闭注射器口，回抽注射器，利用形成的负压使细胞悬液渗透入多孔材料的空隙内，实现BMSC 在支架材料内的初期均匀分布。
3.接种有BMSC的多孔骨基质支架转移至带血管蒂骨瓣的培育器内：
无菌条件下，将接种有BMSC的β-TCP/HA等支架转移至有血液灌注的轴型包膜瓣的毛糙面，包膜瓣包裹支架使毛糙面的小血管充分接触支架，包膜切缘用6-0可吸收缝合线间断缝合。如果骨瓣培育器在免疫缺陷动物皮下腔隙内，则包膜表面再包裹一层半透膜如市售的Biobrane Sheath。4-6周后，接种BMSC的β-TCP/HA等多孔骨基质支架在培育器内孵化成血管化骨瓣。
4. 带血管蒂骨瓣的获取与应用：
接种BMSC的β-TCP/HA等多孔骨基质支架在培育器内孵化成血管化骨瓣后，切断包膜瓣轴心血管的吻合口，以包膜瓣的轴心血管为血管蒂，将培育的血管化骨瓣及其表面的包膜一并游离移植至患者骨缺损区，钛板及钛钉固定，修复节段性骨缺损，包膜瓣的轴心血管断端分别与骨缺损区附件的知名血管显微吻合，维持血管化骨瓣的及时血液供养。

Claims (6)

1.一种培育带血管蒂骨瓣的方法，利用含轴心血管的血管化包膜瓣，在体外，接受免疫缺陷动物或人工灌流系统的血液灌注，作为血管化骨瓣的培育器；原代培养患者骨髓间充干细胞或成骨细胞，接种至多孔骨基质材料上，包裹于血管化骨瓣的培育器内，进行血管化骨瓣的培育。
2.根据权利要求1所述的一种培育带血管蒂骨瓣的方法，其特征在于，所述的血管化骨瓣的培育器的构建：
贴着包膜的血管束与包膜内新生小血管相连通，作为包膜的轴心血管，将移出体外的轴心血管两旁的血管化包膜，包膜瓣的轴心血管与体外人工灌流系统的管道或免疫缺陷动物的股动静脉显微吻合，接受血液灌注，轴型包膜瓣遂成为血管化骨瓣的培育器。
3.根据权利要求2所述的一种培育带血管蒂骨瓣的方法，其特征在于，包膜瓣接受人工灌流系统的血液灌注，成为血管化骨瓣的培育器，体外人工灌流系统包括：由管道连接的置换液容器、废液收集容器、血浆泵和血液分离器，轴型包膜瓣平铺在包膜血管床上，包膜瓣的轴心血管的动静脉断端分别与人工灌流系统的管道连通，置换液经血浆泵一泵入血液分离器的血浆槽内，血浆槽内的合格血浆进入轴型包膜瓣，循环出的血浆被血浆泵二泵入血液分离器进行分离，将轴型包膜瓣的代谢产物经血浆泵三泵入至废液收集容器内，分离出的合格血浆调节压力PV、pH值后与置换液容器内的置换液在血浆槽内混合后重新灌入轴型包膜瓣，形成血浆的体外人工灌流系统。
4.根据权利要求1所述的一种培育带血管蒂骨瓣的方法，其特征在于，所述的原代培养患者骨髓间充干细胞或成骨细胞通过体外扩增培养：
骨髓穿刺针抽取数毫升患者骨髓，密度梯度离心法收集单个核细胞层，低糖DMEM培养基重悬细胞沉淀并接种培养BMSC，或继以成骨细胞诱导液培养，获得OBC，将体外扩增培养的BMSC或OBC均匀接种至市售的多孔骨基质材料上。
5.根据权利要求1或4所述的一种培育带血管蒂骨瓣的方法，其特征在于，接种有细胞的多孔骨基质材料作为骨支架转移至血管化骨瓣培育器内：包裹于血管化骨瓣的培育器内，进行血管化骨瓣的培育，获得带血管蒂骨瓣：成骨性细胞在骨基质材料的诱导下，不断增殖与分化，形成骨细胞与骨基质，同时包膜的血管网不断长入新生骨质内，形成血管化骨块，6-8周后，切断血管吻合口，以包膜内的轴心血管为所培育骨瓣的血管蒂。
6.根据权利要求1至5任一项所述的一种培育带血管蒂骨瓣的方法获得的带血管蒂骨瓣，用于骨缺损修复。
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