CN103767807A - 一种新型血管化组织工程骨及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新型血管化组织工程骨，包括圆柱体支架材料、两个内部轴向预制的圆形隧道、动静脉血管蒂；所述圆柱体支架材料为医用可吸收材料，所述两个内部轴向预制的圆形隧道互相平行，在出口处设有出口孔圆形倒角，在圆形隧道内部均匀分布人或动物成骨诱导干细胞；所述动静脉血管蒂包括受体血管蒂上的动脉、静脉及动脉、静脉移植物，动静脉血管蒂在支架材料内并行分开排列，远端血管吻合或结扎。本发明可以实现对组织工程骨的快速充分、安全有效的移植后血管化，有效提高临床疗效，为移植细胞提供良好的营养供应及新陈代谢环境，促进组织工程骨移植后的成骨活性，促进组织工程骨移植物的广泛临床应用。

Description

一种新型血管化组织工程骨及其构建方法

技术领域

本发明涉及组织工程领域，特别涉及一种新型血管化组织工程骨及其构建方法。

背景技术

组织工程学(Tissue Engineering)概念最早由Langer和Vacanti提出，是根据细胞生物学和工程学的原理，将具有特定生物学活性的组织细胞与生物材料相结合，在体外或体内构建组织和器官，以维持、修复、再生或改善损伤组织和器官功能的一门科学。在骨组织工程领域，组织工程骨治疗大段骨缺损逐渐显示出诱人的前景，但同时也面临着一些新的问题。

活体中绝大多数组织细胞由血液供应氧气和养料，受组织中氧气扩散作用的限制，毛细血管的氧气供应范围只限于邻近100～200μm区域。对于组织工程复合物来说，虽然在体外可以通过灌注反应器等方法来加强氧气和养料的供应，一旦植入体内，支架内的种子细胞在早期仍然只能通过临近毛细血管的扩散效应来摄取赖以生存的氧气和养料，严重影响了组织工程复合物的活性与功能。由于骨组织代谢非常旺盛，组织工程骨在体内对周围血液供应的要求更高，而临床对大块组织工程骨的需要也在逐渐增加，为了保证较大尺寸的组织工程骨植入体内后能够成活并发挥有效成骨修复作用，有必要在其构建过程中采取血管化策略。

目前常用的组织工程骨血管化构建方法包括优化支架材料的设计、使用生长因子、联合使用内皮祖细胞及借助外科学血管预置技术等，近些年来血管预置技术已被逐渐应用于构建血管化的组织工程骨。血管预置技术是在组织工程骨复合物的基础上，在植入体内的过程中，借助于带血供的筋膜、血管束或者血管环等，预先构建好机体和组织工程骨之间的血供连接，以期尽快建立起受区与组织工程复合物的血液供应，促使组织工程复合物最大程度的成活并发挥修复作用。其中较受关注的有血管束预置技术（Vascular bundle）及动静脉血管环路预置技术（AV Loop）等。血管束预置技术基于骨组织骨髓腔内轴向血供原理，使用远端结扎的血管束穿过组织工程骨中央部孔洞或凹槽，其血管长入和营养方式为从中央到外周，Lei Cai采用比格犬BMSC接种HA支架，借助预置血管束的血管化方法修复比格犬腓骨骨缺损，Wang将BMSC接种TCP支架，并预置兔的隐动静脉束，构建出血管化组织工程骨并修复兔股骨骨缺损，但由于以上传统的血管束预制技术均采用动静脉一体的血管束放置于大尺寸组织工程骨支架单独的孔洞或凹槽内进行预血管化，血管化面积有限，血管化速度慢，对组织工程骨成骨的促进效果不够理想；而动静脉血管环路预置技术（AV Loop）则是针对这些问题对血管束技术的进一步改进，受Erol和Spira利用动静脉环路构建出大鼠带轴向血管皮瓣模型的启发，Kneser首次将动静脉环路包绕组织工程骨构建血管化组织工程骨，很快这一技术已在小动物体内广泛应用，Beier JP等人则在大动物如山羊模型中应用隐动静脉血管环路包绕组织工程骨构建血管化组织工程骨。动静脉血管环路技术其血管长入和营养方式为从外周到中央，具有血流速度快，促血管生成作用强等优点，但该法仅将血管环路环绕在组织工程骨外面，对血管蒂长度要求高，对支架中央部分血运供应有限，且转移过程中不易操作，易损伤血管，难以投入实际应用。因此，如何提高血管束技术的成血管面积，避免血管环路技术的诸多应用限制，保证移植物整体快速、充分安全的血管化，成为目前血管化组织工程骨临床应用亟需解决的问题。

发明内容

针对上述现有技术存在的缺陷或不足，本发明的目的在于构建一种新型血管化组织工程骨，将动静脉血管蒂分别放置在其内相对独立的隧道内，进行血管远端结扎或吻合的血管预制，其血管长入和营养方式介于外周及中央之间，可以实现对组织工程骨的快速充分、安全有效的移植后血管化，有效提高临床疗效，为移植细胞提供良好的营养供应及新陈代谢环境，促进组织工程骨移植后的成骨活性，促进组织工程骨移植物的广泛临床应用。

本发明的一种新型血管化组织工程骨，包括圆柱体支架材料、两个内部轴向预制的圆形隧道、动静脉血管蒂；所述圆柱体支架材料为医用可吸收材料，所述两个内部轴向预制的圆形隧道互相平行，在出口处设有出口孔圆形倒角，在圆形隧道内部均匀分布人或动物成骨诱导干细胞；所述动静脉血管蒂包括受体血管蒂上的动脉、静脉及动脉、静脉移植物，动静脉血管蒂在支架材料内并行分开排列，远端血管吻合或结扎。

所述人或动物成骨诱导干细胞的密度为2×10⁷个/ml，接种时间为4小时。

所述圆柱体支架材料直径为12mm，高为10mm，选用的材料为β-磷酸三钙（β-TCP）。

所述圆形隧道的主隧道直径为3mm，轴向圆形隧道两端设长2mm直径5mm的出口孔圆形倒角。

所述动静脉血管蒂为哺乳类动物受体知名动静脉，血管直径在1mm以上。

本发明的一种新型血管化组织工程骨的构建方法，包括以下步骤：

1）体外制备支架材料：将医用可吸收材料制备成圆柱体，在圆柱体内部轴向预制两个圆形隧道，两端出口孔圆形倒角；

2）组织工程骨的体外构建：将体外扩增的人或动物成骨诱导干细胞接种在制备好的支架材料上，在体外静态或动态培养，得到组织工程化骨组织；

3）血管环路或血管束的准备：暴露人或动物隐动静脉束，切开血管束膜，分离隐动静脉，远端结扎；

4）血管环路或血管束的嵌入：将分离好的隐动静脉分别导入预制好的圆形隧道内，远端显微外科血管吻合形成动脉环或简单结扎形成血管束。

本发明的新型血管化组织工程骨由于在组织工程骨支架内设计了两个内部轴向预制的圆形隧道供动静脉血管蒂内置，具有如下有益效果：1、由于血管在支架材料的孔洞内走行，避免了血管蒂在转移过程中受损，同时减小了对受区血管蒂长度的要求，更具有临床可行性；2、由于动脉和静脉被分别放置在组织工程骨支架上独立的孔洞内，之间有一定距离，增加了血管蒂的供血营养面积,有利于新生血管的均匀分布及促进整体成骨；3、由于支架的圆形隧道介于支架中心及支架外周之间，其血管长入和营养方式亦介于外周及中央之间，可以实现对组织工程骨的快速充分、安全有效的移植后血管化，有效提高临床疗效，为移植细胞提供良好的营养供应及新陈代谢环境，促进组织工程骨移植后的成骨活性。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：

图1是本发明一种新型血管化组织工程骨为预置血管环路时的三维结构示意图；

图2是本发明一种新型血管化组织工程骨为预置血管束时的三维结构示意图。

图中1、圆柱体支架；2、轴向预制的圆形隧道；3、出口孔圆形倒角；4、动静脉血管蒂。

具体实施方式

实施例1：组织工程骨预置血管环路血管化方法

见图1，取商品化的β-TCP支架，制备成底面直径为12mm高为10mm的圆柱形状，在支架内部小心打出两个直径为3mm的轴向中空通道,两端出口孔圆形倒角，无菌消毒处理后BMSCs接种并体外培养诱导2周。分离比格犬隐动静脉约4cm，在远端分别结扎隐动静脉。BMSCs/β-TCP复合物植入前12小时更换为无血清的培养基，以减少残留的胎牛蛋白作为抗原植入后对受体造成的影响。放置BMSCs/β-TCP细胞支架复合物于原来隐动静脉血管床处，并预留两根缝合线穿过细胞支架复合物的隧道，以便于术后的固定。利用未剪去的结扎线作为牵引，分别将隐动静脉自上而下地穿过细胞支架复合物的中空隧道。调整好隐动静脉和细胞支架复合物的相对位置，以防止近心端血管的迂曲而造成术后近心端血管的相互压迫。将预置的两根固定用缝合线分别在细胞支架复合物的两侧约2～3mm纵向缝合于肌肉床，防止比格犬术后的活动引起细胞支架复合物在肌肉袋的活动。在隐动脉的远心端靠近支架处使用显微血管夹夹闭隐动脉，隐静脉因为压力较小，可不放置血管夹。在手术显微镜下使用带有钝头针的注射器，用肝素生理盐水冲洗剪断结扎部位的血管断端。可见到隐静脉有血回流出，分别在显微镜下修剪隐动静脉的血管断端，剪去血管的外膜。使用11-0显微缝合线对两血管断端进行显微吻合。吻合成功后，反复检查吻合口是否渗漏。如有渗漏，视出血量的大小给予压迫止血或补针缝合。撤去隐动脉的显微血管夹，可以见到隐静脉因为隐动脉的血流立刻充盈。取周围的软组织少许分别在血管和支架隧道处包裹血管，形成套袖样的保护，防止支架隧道的边缘对血管的卡压。血管的近心端、远心端的保护完成后，分离肌肉床两侧的筋膜并缝合，使细胞支架复合物完全地被周围的肌肉以及筋膜包裹，逐层关闭。皮肤采用水平褥式缝合，线结宜短，防止比格犬术后因异物感撕咬，碘伏消毒伤口。术后再次肌肉注射青霉素（80万单位/次，每天2次，连续3天）以预防感染，术后皮下注射低分子肝素钠（1250IU/次，连续3天）。

上文中BMSCs为自体骨髓间充质干细胞。

实施例2：组织工程骨预置血管束血管化方法

见图2，取商品化的β-TCP支架，制备成底面直径为12mm高为10mm的圆柱形状，在支架内部小心打出两个直径为3mm的轴向中空通道，无菌消毒处理后BMSCs接种并体外培养诱导2周。分离比格犬隐动静脉约4cm，在远端分别结扎隐动静脉。BMSCs/β-TCP复合物植入前12小时更换为无血清的培养基，以减少残留的胎牛蛋白作为抗原植入后对受体造成的影响。放置BMSCs/β-TCP细胞支架复合物于原来隐动静脉血管床处，并预留两根缝合线穿过细胞支架复合物的隧道，以便于术后的固定。利用未剪去的结扎线作为牵引，分别将隐动静脉自上而下地穿过细胞支架复合物的中空隧道。调整好隐动静脉和细胞支架复合物的相对位置，以防止近心端血管的迂曲而造成术后近心端血管的相互压迫。将预置的两根固定用缝合线分别在细胞支架复合物的两侧约2～3mm纵向缝合于肌肉床，防止比格犬术后的活动引起细胞支架复合物在肌肉袋的活动。取周围的软组织少许分别在血管和支架隧道处包裹血管，形成套袖样的保护，防止支架隧道的边缘对血管的卡压。血管的近心端、远心端的保护完成后，分离肌肉床两侧的筋膜并缝合，使细胞支架复合物完全地被周围的肌肉以及筋膜包裹，逐层关闭。皮肤采用水平褥式缝合，线结宜短，防止比格犬术后因异物感撕咬，碘伏消毒伤口。术后再次肌肉注射青霉素（80万单位/次，每天2次，连续3天）以预防感染，术后皮下注射低分子肝素钠（1250IU/次，连续3天）。

上文中BMSCs为自体骨髓间充质干细胞。

需要说明的是，上述实施例中，组织工程骨支架材料也可以选用任何医用材料，不限于β-TCP。凡是采用本发明的结构，均应属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种新型血管化组织工程骨，其特征在于：包括圆柱体支架材料、两个内部轴向预制的圆形隧道、动静脉血管蒂；所述圆柱体支架材料为医用可吸收材料，所述两个内部轴向预制的圆形隧道互相平行，在出口处设有出口孔圆形倒角，在圆形隧道内部均匀分布人或动物成骨诱导干细胞；所述动静脉血管蒂包括受体血管蒂上的动脉、静脉及动脉、静脉移植物，动静脉血管蒂在轴向预制的圆形隧道内并行分开排列，远端血管吻合或结扎。

2.根据权利要求1所述的一种新型血管化组织工程骨，其特征在于：所述人或动物成骨诱导干细胞的密度为2×10⁷个/ml，接种时间为4小时。

3.根据权利要求1所述的一种新型血管化组织工程骨，其特征在于：所述圆柱体支架材料直径为12mm，高为10mm，选用的材料为β-磷酸三钙。

4.根据权利要求1所述的一种新型血管化组织工程骨，其特征在于：所述轴向预制的圆形隧道的主隧道直径为3mm，轴向圆形隧道两端设长2mm直径5mm的出口孔圆形倒角。

5.根据权利要求1所示的一种新型血管化组织工程骨，其特征在于：所述动静脉血管蒂为哺乳类动物受体知名动静脉，血管直径在1mm以上。

6.一种新型血管化组织工程骨的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

1）体外制备支架材料：将医用可吸收材料制备成圆柱体，在圆柱体内部轴向预制两个圆形隧道，在出口处设有出口孔圆形倒角；

2）组织工程骨的体外构建：将体外扩增的人或动物成骨诱导干细胞接种在制备好的支架材料上，在体外静态或动态培养，得到组织工程化骨组织；

3）血管环路或血管束的准备：暴露人或动物隐动静脉束，切开血管束膜，分离隐动静脉，远端结扎；

4）血管环路或血管束的嵌入：将分离好的隐动静脉分别导入预制好的圆形隧道内，远端显微外科血管吻合形成动脉环或简单结扎形成血管束。

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