CN115227873A

CN115227873A - 透明质酸诱导胶原纤维内仿生矿化的方法、材料及其应用

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Publication number: CN115227873A
Application number: CN202210629185.7A
Authority: CN
Inventors: 靳文静; 谢志坚; 吴海艳; 石珏; 胡秭禾; 周焰焰
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2022-06-06
Filing date: 2022-06-06
Publication date: 2022-10-25

Abstract

本发明公开了一种透明质酸诱导胶原纤维内仿生矿化的方法、材料及其应用，属于仿生矿化材料及硬组织工程材料技术领域。方法具体是将表面通过化学键交联有透明质酸的胶原纤维支架材料，在由聚天冬氨酸、钙溶液和磷溶液混合所得的矿化液中诱导使其发生纤维内矿化，得到仿生矿化胶原纤维支架材料。本发明基于氢键构建透明质酸修饰的胶原纤维矿化模板，进一步通过透明质酸对钙离子的螯合作用及对无定形磷酸钙的稳定作用，促进纤维发生内矿化，并获得与天然骨具有类似矿化度的支架材料，且该支架具有良好的生物相容性与骨诱导性，可诱导牙髓干细胞成骨分化，可应用于牙髓牙本质修复。

Description

透明质酸诱导胶原纤维内仿生矿化的方法、材料及其应用

技术领域

本发明属于仿生矿化材料及硬组织工程材料技术领域，尤其涉及一种透明质酸诱导胶原纤维内仿生矿化的方法、材料及其应用。

背景技术

牙本质是构成牙齿的主体部分，由基质和牙本质小管组成，其中基质主要是由大量由I型胶原有机质和分级有序排列纳米羟基磷灰石无机矿物组成，无机约占70％，有机物约占30％；牙本质小管中富含有牙本质细胞的细胞突，藉此以进行营养代射。目前临床上牙本质缺损治疗方法主要为根管治疗，即利用惰性材料将缺损处覆盖。尽管根管治疗被广泛应用与牙体牙髓治疗中，但仍存在牙体因脆性大导致的折断及根尖炎等不足，极大影响了人们的口腔健康。理想的牙本质再生生物材料应与牙本质组织结构与功能完美匹配，并能一定程度促进并恢复牙本质再生与组织生物共功能活性。

天然牙本质矿化的矿化过程是成牙本质细胞在细胞外基质分泌胶原纤维作为矿化的支架结构，同时进一步分泌非胶原蛋白修饰胶原纤维，稳定细胞外基质中的无定形磷酸钙，从而促使ACP渗透到胶原纤维支架内部，进一步相转化为纤维内的羟基磷灰石。但是，以往研究表明，胶原蛋白本身不足以诱导与天然相同的胶原蛋白矿物关系的矿化。高度有序矿化组织的形成过程中，非胶原蛋白作为稳定无定形磷酸钙的介质在生物矿化过程中扮演者重要的角色，诸如骨钙素，牙本质磷酸蛋白等生物纤维分子，这些分子通过介导胶原蛋白矿化，控制矿物晶体的成核，生长和矿物相的方向。

近年来，纤维内仿生矿化胶原支架是一类高度仿生的组织修复材料，因其能充分模拟天然硬组织组成、结构与功能，成为目前组织工程再生与修复领域研究的热点之一。传统的仿生矿化技术利用高分子聚电解质，如天冬氨酸、聚丙烯酸等，作为非胶原蛋白类似物以稳定矿化液中的无定形磷酸钙，从而诱导胶原纤维发生内矿化，充分模拟骨的结晶过程。然而仅有高分子聚电解质的稳定作用，纤维矿化速率较低，制备周期长，矿化效率低。因此，如何运用仿生矿化的方法实现纤维内快速高效率低有序结晶成为现有硬组织工程修复与再生领域研究的难点。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，并提供一种透明质酸诱导胶原纤维内仿生矿化的方法、材料及其应用。本发明中利用天然透明质酸的生物相容性，将其通过化学键交联在胶原纤维表面，经修饰后，胶原纤维表面带有大量的负电荷，能吸附更多的钙离子，促进胶原纤维发生内矿化，所获得的复合支架纤维内高度有序矿化，同时提高胶原纤维支架的表面刚度，有利于细胞的增殖与分化，提高材料的骨诱导性，该透明质酸修饰的胶原纤维内仿生矿化支架可应用在口腔领域中牙髓牙本质再生修复与骨缺损修复领域中。

本发明所采用的具体技术方案如下：

第一方面，本发明提供了一种透明质酸诱导胶原纤维内仿生矿化的方法，即将表面通过化学键交联有透明质酸的胶原纤维支架材料，在由聚天冬氨酸、钙溶液和磷溶液混合所得的矿化液中诱导使其发生纤维内矿化，得到仿生矿化胶原纤维支架材料。

作为优选，方法具体如下：

将胶原液滴利用氨气扩散法形成凝胶，清洗后浸泡于戊二醛溶液中交联，随后再与透明质酸溶液继续反应，得到胶原纤维支架材料；将所述胶原纤维支架材料在矿化液中矿化处理，得到仿生矿化胶原纤维支架材料。

具体的，方法可以通过以下步骤进行：

S1：将干净的封口膜平铺在10cm培养皿中，将150μL胶原溶液液滴在封口膜表面；

S2：随后将步骤S1所得胶原液滴，在干燥器中利用氨气扩散法，扩散4h形成凝胶，取出后用去离子水浸泡30min左右，换水3-4次，直至pH＝7.4。

S3：再将步骤S2形成的凝胶浸泡在戊二醛继续交联2h。将交联后的胶原凝胶与透明质酸溶液继续反应2小时，获得表面交联有透明质酸的胶原纤维支架材料。

S4：最后将表面交联有透明质酸的胶原纤维支架材料，在现配置的矿化液中进行矿化处理3-5d，即得到透明质酸修饰纤维内仿生矿化支架材料。

通过本发明方法所得的支架材料含有85wt％的无机矿物，与天然牙本质矿化度相似。

进一步的，所述透明质酸溶液的浓度为0.3-4.8mg/ml，pH＝6.8。

进一步的，所述戊二醛溶液的质量分数为0.02wt％。

进一步的，所述胶原液滴是由150μL胶原溶液滴加在封口膜表面所得；胶原溶液为鼠尾胶原溶液，浓度为3mg/ml。

进一步的，所述胶原液滴在干燥器中使用体积比为1:1的浓氨气与水进行氨气扩散反应，随后在37℃水溶液中交联过夜以充分形成凝胶，接着用水浸泡清洗至pH＝7.4，随后放入戊二醛溶液中。

进一步的，所述矿化液由钙溶液、磷溶液和聚天冬氨酸以体积比2:2:0.096-1混合所得，其中，钙溶液为CaCl₂溶液，磷溶液为Na₂HPO₄和NaCl的混合溶液。

更进一步的，所述矿化液中，CaCl₂的浓度为3.34mM，Na₂HPO₄的浓度为19mM，NaCl的浓度为300mM，聚天冬氨酸的浓度为10mg/ml。

第二方面，本发明提供了一种利用第一方面8任一所述方法制备得到的仿生矿化胶原纤维支架材料。

第三方面，本发明提供了一种根据第二方面所述仿生矿化胶原纤维支架材料作为修复硬组织的医用仿生材料中的应用。

本发明相对于现有技术而言，具有以下有益效果：

1)本发明采用透明质酸修饰胶原纤维的方法，利用化学键赋予纤维表面大量的羧酸根离子并稳定无定形磷酸钙矿化前驱体，使得胶原纤维内发生有序化矿化，更大程度的模拟了体内硬组织(尤其是牙本质)胶原纤维矿化模式，而这种形式极大增加了材料的仿生度，材料的仿生度是材料的生物活性的关键性因素，这对提升修复后硬组织(尤其是牙本质)的结构与强度具有重要意义。

2)本发明制备的仿生矿化胶原纤维支架材料，利用矿化的方法将羟基磷灰石有序的组装到胶原纤维网络中，同时表面修饰的透明质酸可吸附更多钙离子，快速实现纤维内的仿生矿化，快速提升材料仿生度，解决了现有仿生材料矿化模式中矿化周期长与矿化度低的问题。

3)本发明的制备方法，通过透明质酸对胶原纤维进行化学修饰，利用不仅提升了材料矿化度，同时增强了材料的力学强度，有望增加材料植入体内的基质刚度，并且具有优异的生物相容性与骨诱导性，能够促进细胞的增殖与分化能力，是一种理想的硬组织缺损再生修复材料。

4)传统仿生矿化研究中，透明质酸作为水凝胶材料被广泛应用于组织修复与伤口敷料，然而，透明质酸在胶原矿化分子层面的作用及其机制尚未明确，本研究通过戊二醛将透明质酸修饰到胶原纤维表面，改变其电负性及吸附钙离子的特性，模拟生物矿化过程中非胶原蛋白的功能性，即调控羟基磷灰石的成核、生长及排列取向，从而充分模拟了天然矿物在矿化过程中胶原纤维、非胶原蛋白、矿物三者间的作用关系，为理解天然高分子及非胶原蛋白在生物矿化过程中扮演的角色与调控机制提供了深入的认识。

附图说明

图1为实施例1中未进行改性处理与修饰透明质酸单根胶原纤维的矿化透射电镜图(图a和b)和Mapping图(图c和d)。

图2为实施例1中修饰透明质酸单根胶原纤维的STORM图。

图3为实施例2中未进行改性处理与修饰透明质酸胶原纤维内矿化扫面电镜图与热重分析图。

图4为实施例2中未进行改性处理与修饰透明质酸胶原纤维仿生矿化支架的生物相容性对比图。

图5为实施例2中未进行改性处理与修饰透明质酸胶原纤维仿生矿化支架的诱导人牙髓干细胞成骨向分化的碱性磷酸酶染色图。

图6为实施例2中空白组(未矿化)、未进行改性处理与修饰透明质酸胶原纤维仿生矿化支架牙本质再矿化的CT图。

图7为实施例2的部分流程原理图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步阐述和说明。本发明中各个实施方式的技术特征在没有相互冲突的前提下，均可进行相应组合。

实施例1

由于牙本质矿化本质是I型胶原的矿化，为了进一步探究透明质酸促进胶原纤维内矿化的作用机制，拟选取单一的I型胶原为探究模型。在碱性的甘氨酸缓冲液中诱导原胶原分子自组装形成了I型胶原纤维，通过TEM表征可以观察到单根胶原D-band结构。结果证实原胶原分子可有效组装成胶原纤维。后续选取组装好的胶原纤维验证本发明中透明质酸促进三维支架材料纤维内矿化的效果，具体如下：

单根胶原纤维的组装：吸取8.33μL 3mg/ml的原胶原乙酸溶液于培养皿(室温)中，加入0.5mL的甘氨酸组装液(甘氨酸组装液配制：Gly溶液和KCl溶液混合后浓度分别为50mM、200mM，pH＝9.2)，混匀，室温放置20min。移取3μL上述胶原溶液滴在镍网上，放在充满水汽的培养皿中在37℃过夜。进一步将载有胶原的镍网浸在质量分数为0.05wt％的戊二醛溶液中，37℃反应1h，取出去离子水清洗一次，备用。胶原矿化是利用1mL[Ca]液与1mL[P]液(最终浓度为1.67mM CaCl₂,9.5mM Na₂HPO₄,和150mM NaCl)进行进一步矿化处理，同时添加48μL天冬氨酸作为具有类液态性质的前驱体无定型磷酸钙的稳定剂(即矿化液)，随后在不同浓度的透明质酸中(0、0.3、1.2、2.4、4.8mg/ml)条件下处理负载有胶原纤维的镍网2h，之后将处理后的镍网悬浮在矿化液表面，并在37℃的恒温水浴槽中矿化4h，取出以后分别在水，50％乙醇，100％乙醇中漂洗。

如图1中TEM图所示，本实施例中构建的透明质酸修饰的单根胶原纤维实现了纤维内部羟基磷灰石的有序结晶，并且在衍射图中可以发现(002)晶面属于对称结构，再次证实胶原纤维的矿化高度有序。此外，Mapping图中也进一步证实了未进行透明质酸处理的胶原与1.2mg/ml透明质酸处理后两组胶原都含有Ca与P矿化元素，但是经过透明酸修饰的胶原纤维矿化度较高。

通过STORM进一步证实了通过透明质酸修饰过的I型胶原是纤维内的矿化。具体实验方法如下：

首先将单根胶原纤维组装在氨基甲硅烷基化激光共焦培养皿上，在37℃孵育12h后，进一步用0.05wt％戊二醛封闭2h，继续用1.2mg/ml透明质酸溶液反应2h。胶原蛋白与封闭缓冲液孵育1h，随后用I型胶原抗体(1:50；Proteintech)37℃下处理2h，再用清洗液清洗三次，每次10min，最后用Cy3B在室温下处理胶原纤维1h，胶原纤维使用Cy3B荧光进行标记，发红色荧光，然后将标记了荧光分子的胶原纤维水洗，然后加入含有240μg/mL P-Asp的矿化液中矿化6h，取出水洗三次。将矿化后的胶原浸泡在10μM的钙黄绿素中20min，其中钙黄绿素会特异性的螯合矿化之后的矿物HAP晶体，并发绿色荧光。然后用水缓慢冲洗5次。在Nikon N-Storm显微镜(N-STORM/A1R，Nikon，Japan)上观察到3D STORM图像。通过STORM成像技术，我们得到了三维矿化的胶原纤维荧光图(如图2所示)，可以确定在纤维内部存在着HAP矿物，这也表明透明质酸修饰后的胶原纤维矿化方式为纤维内矿化。

实施例2

本实施例制备了一种仿生矿化胶原纤维支架材料，具体方法如下：

准备一个铺有PE薄膜的细胞6cm培养皿，将150μL的3mg/mL胶原母液滴到PE薄膜上，并放置在密闭的干燥器中，氨气扩散4h，氨气扩散的目的是提高胶原内部的pH值，诱导其自组装。随后将所得胶原凝胶放置在37℃恒温槽中12h继续交联。后续进一步利用0.05wt％的戊二醛交联，用去离子水将胶原凝胶冲洗至pH＝7.4。之后，分别将0、0.3、1.2、2.4、4.8mg/ml的透明质酸溶液对组装好的凝胶进行预处理2h，取出后去离子水清洗3次。同时添加5mL[Ca]溶液、5mL[P]溶液与240μL 10mg/mL p-Asp(聚天冬氨酸)，用移液器反复吹打混合均匀后，转入37℃恒温箱，每隔12h换矿化液，矿化5天后取出后在去离子水中浸泡2h，冷冻干燥后利用热重测量材料中的有机与无机组分比。热重结果表明，修饰透明质酸胶原纤维矿化支架内大约含85％的无机物，而对照组的无机含量仅为65％，再次证实透明质酸不仅能促进单根胶原纤维内矿化，同时能促进胶原凝胶支架内的矿化水平。

如图7所示，为了验证所得支架材料的生物安全性，进行了如下操作：

将胶原纤维支架材料组装到孔板底部，12h后用去离子水冲洗至少3次，去除未组装的胶原蛋白。胶原纤维与0.05wt％戊二醛进一步交联2小时，然后用去离子水轻轻冲洗。加入1.2mg/ml HA或去离子水预处理2h，去离子水冲洗干净。每6h更换一次矿化液以保持过饱和度不变，空白组不进行矿化，24h后终止矿化，洗涤3次。用15kGy辐射剂量对板照射24小时。将5000个细胞/孔人牙髓干细胞铺板，分为c空白组(非矿化)、矿物质组和透明质酸诱导胶原凝胶矿化组，培养基10％FBSα-MEM培养24与48h后，利用live/dead染色计进行染色，并用ImageJ软件计算出其中死细胞与或细胞比例，如图4所示，空白组、未修饰胶原纤维内矿化组、修饰透明质酸胶原纤维内矿化支架组三组细胞存活率均接近于100％，证实该材料均具有良好的生物安全性，可用于后续体内牙髓牙本质再生修复。

与上述细胞毒性的胶原组装方法一致，将胶原纤维支架组装到空白底部，随后5000个细胞/孔人牙髓干细胞铺板，分为空白组(非矿化)、矿物质组和透明质酸诱导胶原凝胶矿化组，同时与成骨/牙源性分化培养基培养(α-MEM、10％FBS、50μg/ml抗坏血酸、10mmol/Lβ-甘油磷酸盐、10nmol/L地塞米松)，每隔一天更换诱导矿化液，并于7、14天时进行ALP染色。如图5结果ALP染色图表明，修饰透明质酸胶原纤维内矿化支架组的碱性磷酸酶表达均明显高于未修饰胶原纤维内矿化组、空白组，证实该支架材料具有良好的促成骨能力。

如图6所示，为了验证所得支架材料的应用效果，还进行了如下操作：

每只犬选取门齿、犬齿、前臼齿24颗，将24颗牙拆分后编号，按随机数字表法随机分成3组，空白对照组；胶原纤维矿化支架材料组；透明质酸修饰胶原纤维矿化支架材料组；每组8颗牙。氯胺酮基础麻醉后。按照1ml/kg静脉注射戊巴比妥钠麻醉动物。常规无菌手术巾，清洁口周及口腔，碘伏消毒实验牙体与牙周。用高速涡轮手机在实验牙唇颊侧距龈缘2mm处制备长宽比2mm×3mm的V类洞，近髓透红时，将支架材料轻置于近髓处，纳米树脂充填。术后一周内动物进软食，抗生素注射1周。术后动物没有异常的日常活动，进食正常。

取材：盖髓术后1个月处死动物取材。麻醉用2％戊巴比妥钠腹腔注射，犬安静后，手术台以仰卧位固定，颈部手术区的毛发用剃毛仪器去除。2％的碘酒、75％的酒精消毒术区。切开颈部皮肤，暴露浅筋膜，钝性分离，触摸胸锁乳突肌前缘，找出有波动感的颈动脉鞘，游离出颈总动脉，在颈总动脉下方的近心端和远心端分别放置一根缝线。开腹暴露胸腔，准备心脏切开。灌注前20min肌肉注射1.5ml肝素钠。止血钳钳住颈总动脉的远心端，结扎颈总动脉近心端，钝角剪剪开颈总动脉，插入输液管，注意事先排好气，开始灌注。结扎远心端缝线固定。同时切开隔肌暴露心包，剪开右心耳。先灌注500-1000ml的生理盐水，灌注速度大概150滴/分；再用4％多聚甲醛灌注，灌注先快后慢，先以150滴/分的速度滴几分钟，后以60滴/分的速度输注，持续3小时左右。将包含实验牙的上，下颌骨取下。组织块立刻固定于4％的多聚甲醛中72h。从图3的CT结果显示，植入后材料4周后，透明质酸修饰胶原纤维矿化支架材料组牙髓内出现弥散的骨样牙本质，而对照组未能展示良好的修复效果。

本发明使用浓度为0.3-4.8mg/ml透明质酸，通过模拟生物体内非胶原蛋白诱导生物矿化的作用，在胶原表面通过氢键修饰上透明质酸分子以形成大量羧基功能性官能团改性胶原纤维，并诱导胶原凝胶纤维内仿生矿化的方法。该方法包括将不同浓度的透明质酸通过化学键修饰到胶原纤维表面，并磷酸钙矿化液进行处理，得到胶原内有序矿化的支架材料。本发明基于氢键构建透明质酸修饰的胶原纤维矿化模板，进一步通过透明质酸对钙离子的螯合作用及对无定形磷酸钙的稳定作用，促进纤维发生内矿化，并获得与天然骨具有类似矿化度的支架材料，且该支架具有良好的生物相容性与骨诱导性，可诱导牙髓干细胞成骨分化，可应用于牙髓牙本质修复。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，然其并非用以限制本发明。有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此凡采取等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种透明质酸诱导胶原纤维内仿生矿化的方法，其特征在于，将表面通过化学键交联有透明质酸的胶原纤维支架材料，在由聚天冬氨酸、钙溶液和磷溶液混合所得的矿化液中诱导使其发生纤维内矿化，得到仿生矿化胶原纤维支架材料。

2.根据权利要求1所述的透明质酸诱导胶原纤维内仿生矿化的方法，其特征在于，具体如下：

3.根据权利要求2所述的透明质酸诱导胶原纤维内仿生矿化的方法，其特征在于，所述透明质酸溶液的浓度为0.3-4.8mg/ml，pH＝6.8。

4.根据权利要求2所述的透明质酸诱导胶原纤维内仿生矿化的方法，其特征在于，所述戊二醛溶液的质量分数为0.02wt％。

5.根据权利要求2所述的透明质酸诱导胶原纤维内仿生矿化的方法，其特征在于，所述胶原液滴是由150μL胶原溶液滴加在封口膜表面所得；胶原溶液为鼠尾胶原溶液，浓度为3mg/ml。

6.根据权利要求2所述的透明质酸诱导胶原纤维内仿生矿化的方法，其特征在于，所述胶原液滴在干燥器中使用体积比为1:1的浓氨气与水进行氨气扩散反应，随后在37℃水溶液中交联过夜以充分形成凝胶，接着用水浸泡清洗至pH＝7.4，随后放入戊二醛溶液中。

7.根据权利要求2所述的透明质酸诱导胶原纤维内仿生矿化的方法，其特征在于，所述矿化液由钙溶液、磷溶液和聚天冬氨酸以体积比20:20:0.96-1混合所得，其中，钙溶液为CaCl₂溶液，磷溶液为Na₂HPO₄和NaCl的混合溶液。

8.根据权利要求7所述的透明质酸诱导胶原纤维内仿生矿化的方法，其特征在于，所述矿化液中，CaCl₂的浓度为3.34mM，Na₂HPO₄的浓度为19mM，NaCl的浓度为300mM，聚天冬氨酸的浓度为10mg/ml。

9.一种利用权利要求1～8任一所述方法制备得到的仿生矿化胶原纤维支架材料。

10.一种根据权利要求9所述仿生矿化胶原纤维支架材料作为修复硬组织的医用仿生材料中的应用。