CN109758609A - 一种复合骨组织工程支架材料的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种复合骨组织工程支架材料的制备方法，包括如下步骤：步骤1），锌离子缓释的羟基磷灰石的制备；步骤2），将步骤1）中获得的锌离子缓释的羟基磷灰石加入壳聚糖溶液中，搅拌混合均匀并调节pH值，得到，壳聚糖/羟基磷灰石混悬液；步骤3），将步骤2）获得的混悬液缓慢加入到丝素蛋白溶液中，得混合物；步骤4），将步骤3）中获得的混合物注入模具，冷冻干燥，浸入无水甲醇和氢氧化钠溶液h，结束后去离子水冲洗,再次冷冻干燥,得到最终的复合支架材料。本发明所得的复合骨组织工程支架材料，具备良好的生物相容性，降解可调控性及较好的成型性，可以作为用于治疗骨缺损的组织工程支架材料。

Description

一种复合骨组织工程支架材料的制备方法

技术领域

本发明涉及一种骨组织工程支架材料，尤其涉及一种复合锌离子的壳聚糖/丝素蛋白/羟基磷灰石骨组织工程支架材料的制备方法，属于医学领域骨组织工程。

背景技术

骨组织破坏在牙周疾病中十分常见，为了骨的重建以及愈合，常常需要进行骨移植。理想的骨移植材料能够快速促进新骨的形成，又不会对周围组织及全身造成明显不良反应。目前骨移植材料可分为自体骨移植、异体骨移植和非骨材料移植。自体骨移植被誉为“黄金标准”，患者的自体骨可来自患者拔牙创或者无牙区牙槽嵴等处，无免疫排斥反应，但取骨量有限，会给患者造成二次创伤，甚至增加患者的感染风险，因此，自体骨移植不能视为理想的骨缺损的修复方法；异体骨移植包括同种异体骨和异种骨移植，同种异体骨来自同一物种的不同个体，优点是骨源丰富，但可能存在免疫原性，需要特殊处理后才可移植，增加了移植成本和风险。异种骨一般是对动物骨如小牛骨进行特殊处理，去除有机成分，保留无机支架结构，现已广泛的应用于临床，但仍存在成本较高的问题。非骨移植材料为自然存在或人工合成的有生物活性或功能的一类材料，这类材料往往取材和制作简单，又有良好的生物相容性，是近年来研究的热点，如羟基磷灰石可促进成骨细胞的增殖和分化，提高支架的成骨能力。但这类材料单纯使用往往存在机械强度不足，降解速率难以控制等缺点而无法满足骨缺损修复的需求。因此，有必要寻找一种新的骨缺损的修复手段。

近年来，组织工程的发展为骨缺损的修复提供了新的可能，骨组织工程是应用生命科学和工程学的原理及技术，建立细胞与生物材料的三维空间复合体，从而构建、培育骨的生物替代物，以修复或重建骨的天然结构、维持或改善其功能。

骨组织工程包括支架、细胞和生长因子这三要素。支架为细胞提供生存的三维空间，利于细胞获得足够的营养物质，进行气体交换，排除废料，使细胞在预制形态的三维支架上生长；种子细胞增殖分化后形成新生组织；生长因子诱导和刺激细胞增殖、控制细胞分化，其对促进细胞增殖、组织或器官的再生修复都具有重要的作用。三者相互依存，缺一不可。

组织工程支架是骨组织工程的核心环节之一。这种生物材料支架可为细胞提供生存的三维空间，有利于细胞获得足够的营养物质，为细胞的生长，营养和气体交换、废物排泄和生长代谢提供场所。使细胞在预制形态的三维支架上生长，支架不仅影响细胞的附着、增殖和分化，而且在移植后，该生物材料应该逐步降解，同时种植的骨细胞不断增殖，从而达到修复骨组织缺损的目的。

良好的骨组织工程支架材料应满足以下条件：(1)良好的骨传导性；(2)保证可塑性和一定的力学性能；(3)良好的生物相容性；(4)多孔泡沫状，平均孔径在200－400μm；(5)良好的生物降解性，降解速率容易控制，不易太快或难以降解；(6)良好的骨诱导性；(7)可用于不规则骨缺损，手术也容易操作；(8)容易消毒和保存。

目前骨组织工程支架材料包括无机材料和有机材料两大类。无机材料主要包括生物活性陶瓷(如磷酸三钙，羟基磷灰石和珊瑚礁)，可吸收金属(如镁)；有机材料主要包括胶原，壳聚糖以及人工合成的可吸收高分子材料等。作为支架的无机材料和有机材料都具有良好的生物相容性，骨引导性和无毒性，但同时存在无机材料力学性能不佳，脆性较大以及有机材料存在机械强度较低等缺点。因此，单一的材料已经无法满足骨组织工程支架材料的要求，需要将不同性质的材料复合在一起，取长补短，得到性能更佳的复合材料。

发明内容

本发明针对上述现有技术中存在的问题，提供了一种复合骨组织工程支架材料的制备方法，解决了现有技术中单一的支架材料无法满足要求的问题；而且本发明制备方法反应条件温和，工艺简单，成本低廉。

为实现本发明的目的，采用了以下技术方案：

一种复合骨组织工程支架材料的制备方法，包括如下步骤：

步骤1)，锌离子缓释的羟基磷灰石的制备：

取0.1-0.5克的氯化钙与0.01-0.03克的氯化锌溶于20-30毫升的去离子水中，以40-60滴/min的速度缓慢加入质量浓度为2.5％的磷酸肌酸溶液10-20毫升，期间搅拌混匀，微波100度，加热10分钟，以150-220r/min室温搅拌2-3h，搅拌结束后调节反应溶液pH值为9-10，在反应温度水浴中沉化24-48h，真空抽滤，用去离子水漂洗三次，即得到锌离子缓释羟基磷灰石；

步骤2)，将步骤1)中获得的锌离子缓释的羟基磷灰石加入壳聚糖溶液中，搅拌混合均匀并调节pH值至8.0，得到，壳聚糖/羟基磷灰石混悬液，其中，壳聚糖与羟基磷灰石的质量比例为2-5:3-6；

步骤3)，将步骤2)获得的混悬液缓慢加入到丝素蛋白溶液中，调整体系温度为10-20度，壳聚糖/丝素蛋白/羟基磷灰石的质量比为20-40:20-40:30-50，磁力搅拌16-24h后4℃静置24h使气泡排出，得混合物；

步骤4)，将步骤3)中获得的混合物注入模具，在-20℃预冻12h，立即放入真空冷冻干燥机，冷冻干燥48h，将冷冻干燥后的样品从模具中取出，先后浸入无水甲醇24h和质量浓度4％氢氧化钠溶液6h，结束后去离子水冲洗,直至pH为中性，再次放入冷冻干燥机内冻干48h后取出,得到最终的复合支架材料。

所述的步骤2中，壳聚糖溶液的制备方法为：将纯化后的壳聚糖溶解于0.2M的醋酸溶液中，配成浓度为2-3％(W/V)的壳聚糖溶液；

所述的步骤3中，丝素蛋白溶液的制备方法为：将25g蚕丝放入质量浓度为0.25％的Na₂CO₃溶液中，100℃煮沸脱胶30min，流水清洗后再次煮沸脱胶30分钟，可见蚕丝颜色变白，形状从丝状变成粘稠的团状，脱胶后用去离子水不断冲洗1-2h，50℃干燥箱干燥12h，取脱胶干燥的丝素15g溶解于氯化钙3元溶解体系，氯化钙3元溶解体系中氯化钙133.2g、乙醇138ml、水172.5ml，80℃的水浴中不断搅拌至丝素蛋白完全溶解，5000rpm/min离心10min，将离心后的丝素蛋白溶液装入截留分子为10000-14000Da的纤维素膜透析袋中透析后冻干，溶解于去离子水中，配成浓度为8-15mg/ml的丝素蛋白溶液。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)利用微波水热法制备含锌离子的多孔羟基磷灰石微球，锌结合效率高，且随着支架的降解逐步释放，起到了缓释的效果。

(2)根据仿生原理将羟基磷灰石沉聚于壳聚糖上，合成了壳聚糖/羟基磷灰石，将壳聚糖/羟基磷灰石引入丝素蛋白中，制备出骨组织工程支架材料，同时赋予该支架材料诱导骨细胞长入的功能，该支架材料的骨诱导性源于仿生人体中胶原/羟基磷灰石，因此诱导骨生长性更优。

(3)本发明所得的复合锌离子的壳聚糖/丝素蛋白/羟基磷灰石骨组织工程支架材料，具备良好的生物相容性，降解可调控性及较好的成型性，可以作为用于治疗骨缺损的组织工程支架材料。

(4)本发明所得的复合锌离子的壳聚糖/丝素蛋白/羟基磷灰石骨组织工程支架材料在任意模具中经预冷冻、冷冻干燥，在这个过程中，形成力学性能优异的组织工程支架材料。并且其力学性能可通过调整加入壳聚糖/羟基磷灰石的量和丝素蛋白溶液之间的比例进行调控。

(5)锌在在骨代谢中，是ALP、胶原酶的辅助因子，能增强成骨细胞的吸附和ALP活性。促进成骨细胞分化、矿化，并通过抑制破骨细胞从而抑制骨吸收过程，能够促进成骨，缩短病人的康复时间，加快临床治疗的过程，降低病人的痛苦。

(6)本发明的制备方法反应条件温和，工艺简单，原料成本低廉，适于放大生产；而且可根据需要调节物料配比从而调解材料力学性能和降解时间等，得到满足相应性能的组织工程支架材料。

附图说明

图1为复合锌离子的壳聚糖/丝素蛋白/羟基磷灰石骨组织工程支架的电镜图。

图2为利用X射线能谱仪对支架材料成分元素种类与含量进行分析的图谱。

图3为细胞完全覆盖满材料的表面和内部空腔的电镜图。

具体实施方式

实施例1

一种复合骨组织工程支架材料的制备方法，包括如下步骤：

步骤1)，锌离子缓释的羟基磷灰石的制备：

取0.2109克的氯化钙与0.0136克的氯化锌溶于25毫升的去离子水中，以40-60滴/min的速度缓慢加入质量浓度为2.5％的磷酸肌酸溶液15毫升，期间搅拌混匀，微波100度，加热10分钟，以150-220r/min室温搅拌2-3h，搅拌结束后调节反应溶液pH值为9-10，在反应温度水浴中沉化24-48h，真空抽滤，用去离子水漂洗三次，即得到锌离子缓释羟基磷灰石；

步骤2)，将步骤1)中获得的锌离子缓释的羟基磷灰石加入壳聚糖溶液中，搅拌混合均匀并调节pH值至8.0，得到，壳聚糖/羟基磷灰石混悬液，其中，壳聚糖与羟基磷灰石的质量比例为3:4；

步骤3)，将步骤2)获得的混悬液缓慢加入到丝素蛋白溶液中，调整体系温度为15度，壳聚糖/丝素蛋白/羟基磷灰石的质量比为30:30:40，磁力搅拌16-24h后4℃静置24h使气泡排出，得混合物；

步骤4)，将步骤3)中获得的混合物注入模具，在-20℃预冻12h，立即放入真空冷冻干燥机，冷冻干燥48h，将冷冻干燥后的样品从模具中取出，先后浸入无水甲醇24h和4％氢氧化钠溶液6h，结束后去离子水冲洗,直至pH为中性，再次放入冷冻干燥机内冻干48h后取出,得到最终的复合支架材料。

所述的步骤2中，壳聚糖溶液的制备方法为：将纯化后的壳聚糖溶解于0.2M的醋酸溶液中，配成浓度为2-3％(W/V)的壳聚糖溶液；

所述的步骤3中，丝素蛋白溶液的制备方法为：将25g蚕丝放入质量浓度为0.25％的Na₂CO₃溶液中，100℃煮沸脱胶30min，流水清洗后再次煮沸脱胶30分钟，可见蚕丝颜色变白，形状从丝状变成粘稠的团状，脱胶后用去离子水不断冲洗1-2h，50℃干燥箱干燥12h，取脱胶干燥的丝素15g溶解于氯化钙3元溶解体系，氯化钙3元溶解体系中氯化钙133.2g、乙醇138ml、水172.5ml，80℃的水浴中不断搅拌至丝素蛋白完全溶解，5000rpm/min离心10min，将离心后的丝素蛋白溶液装入截留分子为10000-14000Da的纤维素膜透析袋中透析后冻干，溶解于去离子水中，配成浓度为8-15mg/ml的丝素蛋白溶液。

实施例2

一种复合骨组织工程支架材料的制备方法，包括如下步骤：

步骤1)，锌离子缓释的羟基磷灰石的制备：

取0.1克的氯化钙与0.01克的氯化锌溶于20毫升的去离子水中，以40滴/min的速度缓慢加入质量浓度为2.5％的磷酸肌酸溶液10毫升，期间搅拌混匀，微波100度，加热10分钟，以150-220r/min室温搅拌2h，搅拌结束后调节反应溶液pH值为9-10，在反应温度水浴中沉化24-48h，真空抽滤，用去离子水漂洗三次，即得到锌离子缓释羟基磷灰石；

步骤2)，将步骤1)中获得的锌离子缓释的羟基磷灰石加入壳聚糖溶液中，搅拌混合均匀并调节pH值至8.0，得到，壳聚糖/羟基磷灰石混悬液，其中，壳聚糖与羟基磷灰石的质量比例为2:3；

步骤3)，将步骤2)获得的混悬液缓慢加入到丝素蛋白溶液中，调整体系温度为10度，壳聚糖/丝素蛋白/羟基磷灰石的质量比为20:20:30，磁力搅拌16-24h后4℃静置24h使气泡排出，得混合物；

步骤4)，将步骤3)中获得的混合物注入模具，在-20℃预冻12h，立即放入真空冷冻干燥机，冷冻干燥48h，将冷冻干燥后的样品从模具中取出，先后浸入无水甲醇24h和质量浓度4％氢氧化钠溶液6h，结束后去离子水冲洗,直至pH为中性，再次放入冷冻干燥机内冻干48h后取出,得到最终的复合支架材料。

其它步骤同实施例1。

实施例3

一种复合骨组织工程支架材料的制备方法，包括如下步骤：

步骤1)，锌离子缓释的羟基磷灰石的制备：

取0.5克的氯化钙与0.03克的氯化锌溶于30毫升的去离子水中，以60滴/min的速度缓慢加入质量浓度为2.5％的磷酸肌酸溶液20毫升，期间搅拌混匀，微波100度，加热10分钟，以150-220r/min室温搅拌3h，搅拌结束后调节反应溶液pH值为9-10，在反应温度水浴中沉化24-48h，真空抽滤，用去离子水漂洗三次，即得到锌离子缓释羟基磷灰石；

步骤2)，将步骤1)中获得的锌离子缓释的羟基磷灰石加入壳聚糖溶液中，搅拌混合均匀并调节pH值至8.0，得到，壳聚糖/羟基磷灰石混悬液，其中，壳聚糖与羟基磷灰石的质量比例为5:6；

步骤3)，将步骤2)获得的混悬液缓慢加入到丝素蛋白溶液中，调整体系温度为10-20度，壳聚糖/丝素蛋白/羟基磷灰石的质量比为40:40:50，磁力搅拌16-24h后4℃静置24h使气泡排出，得混合物；

步骤4)，将步骤3)中获得的混合物注入模具，在-20℃预冻12h，立即放入真空冷冻干燥机，冷冻干燥48h，将冷冻干燥后的样品从模具中取出，先后浸入无水甲醇24h和质量浓度4％氢氧化钠溶液6h，结束后去离子水冲洗,直至pH为中性，再次放入冷冻干燥机内冻干48h后取出,得到最终的复合支架材料。

其它步骤同实施例1。

将实施例的仿生材料进行检测，具体检测如下：

选用日立S4800型扫描电镜检测支架的孔径和细胞在材料上的粘附增殖情况。

通过在电镜扫描图像中随机选10个区域求平均值计算孔径大小。孔径大小为142.00±1.43μm，孔隙大致均匀，孔与孔之间连通性较好。

利用X射线能谱仪来对支架材料成分元素种类与含量进行分析，结果显示如图2，材料Ca：P为1.62。

在生物相容性测试中，细胞培养24h后，开始粘附于支架的表面，随着培养时间的增加，细胞的数量不断增加，最终完全覆盖满材料的表面和内部空腔，见图3。由此表明，该支架材料具有优异的生物相容性，能够促进成骨细胞的黏附、增殖与分化。

壳聚糖(chitosan,CS)是甲壳素脱去乙酰基后的产物，其降解产物为β-D-葡糖胺。壳聚糖有良好的亲水性，降解性和可塑性也较为优良，又有良好的生物相容性，降解产物对人体无毒，而且有利于细胞的附着，生长和繁殖。另外,壳聚糖具有抗菌作用，能有效抑制两种牙周致病菌--伴放线聚合杆菌和牙龈卟啉单胞菌的生长。

丝素蛋白(silk fibroin，SF)是一种来源充足，应用广泛的天然纤维结构蛋白，由一条轻链和一条重链通过化学键S-S键连接组成，含多种氨基酸，以Ser，Gly和Ala较多。丝素蛋白有良好的生物相容性，可诱导多种细胞黏附生长。另外，丝素蛋白有良好的物理性能，降解速率容易控制，是一种优良的骨组织工程材料。

羟基磷灰石组成人体骨骼中重要的无机成分，具有良好的生物相容性、骨引导性、骨传导性及较高的机械强度。

骨骼是锌存储的主要器官。人体内约有50％的锌沉积在骨组织中，锌在骨组织主要存在于细胞外基质和骨的无机成分内。骨锌主要集中在钙化前的类骨质中，矿化开始后锌逐渐增多，结合到骨前组织中，并保留在钙化的组织中，骨被吸收后锌从钙化的组织中释放出。

锌是维持机体正常生理功能和内环境代谢所必需的微量元素。在骨代谢中，锌是ALP、胶原酶的辅助因子，能增强成骨细胞的吸附和ALP活性。锌可以促进成骨细胞分化、矿化，并通过抑制破骨细胞从而抑制骨吸收过程，并且锌参与羟基磷灰石的组成。

因此，通过制备含锌离子的多孔羟基磷灰石微球，将其与壳聚糖/丝素蛋白复合，获得了复合锌离子的壳聚糖/丝素蛋白/羟基磷灰石骨组织工程支架。通过锌离子的缓释促进骨组织的再生。

相对目前的骨缺损修复方法，复合锌离子的壳聚糖/丝素蛋白/羟基磷灰石骨组织工程支架可以提供一定的机械强度，同时其提供的空间可以形成血管，促进代谢，增强新骨内部再血管化程度，有助于骨骼的形成和重建从而提高骨缺损部位新骨的成活率及与周围骨组织的结合。

Claims (3)

1.一种复合骨组织工程支架材料的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

步骤1），锌离子缓释的羟基磷灰石的制备：

取0.1-0.5克的氯化钙与0.01-0.03克的氯化锌溶于20-30毫升的去离子水中，以40-60滴/min 的速度缓慢加入质量浓度为2.5%的磷酸肌酸溶液10-20毫升，期间搅拌混匀，微波100度，加热10分钟，以150-220r/min 室温搅拌2-3h，搅拌结束后调节反应溶液pH值为9-10，在反应温度水浴中沉化24-48h，真空抽滤，用去离子水漂洗三次，即得到锌离子缓释羟基磷灰石；

步骤2），将步骤1）中获得的锌离子缓释的羟基磷灰石加入壳聚糖溶液中，搅拌混合均匀并调节pH值至8.0，得到，壳聚糖/羟基磷灰石混悬液，其中，壳聚糖与羟基磷灰石的质量比例为2-5:3-6；

步骤3），将步骤2）获得的混悬液缓慢加入到丝素蛋白溶液中，调整体系温度为10-20度，壳聚糖/丝素蛋白/羟基磷灰石的质量比为20-40: 20-40: 30-50，磁力搅拌16-24h后4℃静置24 h使气泡排出，得混合物；

步骤4），将步骤3）中获得的混合物注入模具，在-20 ℃预冻12h，立即放入真空冷冻干燥机，冷冻干燥48 h，将冷冻干燥后的样品从模具中取出，先后浸入无水甲醇24h和质量浓度4%氢氧化钠溶液6h，结束后去离子水冲洗,直至pH为中性，再次放入冷冻干燥机内冻干48h后取出,得到最终的复合支架材料。

2.根据权利要求1所述的一种复合骨组织工程支架材料的制备方法，其特征在于所述的步骤2中，壳聚糖溶液的制备方法为：将纯化后的壳聚糖溶解于0.2M的醋酸溶液中，配成浓度为2-3%(W/V) 的壳聚糖溶液。

3.根据权利要求1所述的一种复合骨组织工程支架材料的制备方法，其特征在于所述的步骤3中，丝素蛋白溶液的制备方法为：将25g蚕丝放入质量浓度为0.25%的Na₂CO₃溶液中，100℃煮沸脱胶30min，流水清洗后再次煮沸脱胶30分钟，可见蚕丝颜色变白，形状从丝状变成粘稠的团状，脱胶后用去离子水不断冲洗1-2h，50℃干燥箱干燥12h，取脱胶干燥的丝素15g溶解于氯化钙3元溶解体系，氯化钙3元溶解体系中氯化钙133.2g、乙醇138ml、水172.5ml，80℃的水浴中不断搅拌至丝素蛋白完全溶解，5000rpm/min离心10min，将离心后的丝素蛋白溶液装入截留分子为10000-14000Da的纤维素膜透析袋中透析后冻干，溶解于去离子水中，配成浓度为8-15mg/ml 的丝素蛋白溶液。