CN112915262B - 一种具有引导骨组织再生的壳聚糖凹凸棒石膜材料的制备方法 - Google Patents

一种具有引导骨组织再生的壳聚糖凹凸棒石膜材料的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种具有引导骨组织再生的壳聚糖凹凸棒石膜材料的制备方法。制备步骤如下：壳聚糖溶于乙酸溶液，得壳聚糖乙酸溶液；加入凹凸棒石混匀，得壳聚糖/凹凸棒石混合液；置容器中成膜后通过梯度温度降温直至冷冻，加入乙醇/氢氧化钠混合液继续冷冻数小时。缓冲液洗涤，梯度酒精脱水，甘油/水溶液洗膜，室温自然干燥，得具有引导骨组织再生的壳聚糖凹凸棒石膜材料。本发明制备的纳米纤维膜材料具有良好的柔韧性、降解性、生物相容性和引导骨再生功能，且无毒副作用，符合组织工程材料要求。

Description

一种具有引导骨组织再生的壳聚糖凹凸棒石膜材料的制备 方法
技术领域
本发明涉及骨组织再生、修复生物材料领域，具体涉及一种具有引导骨组织再生的壳聚糖凹凸棒石膜材料的制备方法。
背景技术
每年我国骨缺损或功能障碍患者超过300万人。骨损伤或骨缺损临床上十分常见，目前临床上主要采用自体骨或异体骨移植方法促进骨的再生和修复。虽然自体骨移植的修复效果明显优于异体骨移植，但是自体骨移植在材料来源有限，不能满足临床需求；异体骨尽管来源丰富，但是存在诸多不足：①易产生免疫排斥反应；②可能携带异源病原体，存在人畜共患病风险；③存在一定的伦理问题。为了克服自体骨和异体骨移植存在的缺陷，组织工程化骨是未来发展和应用的重要方向之一。
理想的骨修复材料应具有：⑴良好的骨诱导性和骨传导性；⑵良好的组织相容性；⑶降解速度与骨再生同步化；⑷骨的血管化；⑸有利于营养物交换的多孔性。基于这一要求，随着组织工程技术的发展和进步，组织工程化骨的研究和应用取得长足进步。
引导骨再生膜材料是一类具有促进骨再生和抑制非骨组织过度生长的组织工程化材料。近年来，骨再生膜材料的研究和开发已取得显著进步，可吸收膜材料逐步代替了传统的不可吸收膜材料。利用高分子材料制备的可吸收膜，其主要的缺陷是材料缺乏生物活性，影响骨的再生。天然材料如胶原蛋白虽然具有一定的生物活性，但是其主要来源于异种动物，存在一定的潜在疾病风险。壳聚糖是一种天然生物材料，具有可吸收性、低免疫性和抗菌性等生物活性功能，是一类理想的天然生物材料。凹凸棒石(Attapulgite,ATP)是一种具链层状结构的含硅酸盐天然纳米材料，其结构属2：1型粘土矿物。ATP的独特性能表现为：①纳米棒状结构；②粘性高和可塑性强；③吸水性强；④内部多孔道，比表面积大；⑤吸附性强，大部分的阳离子、水分子和一定大小的有机分子均可直接被吸附；⑥富含多种微量元素。我们前期研究表明，ATP具有良好的成骨性和骨诱导性，是一类具有潜在应用价值的无机生物材料。
膜材料的制备有多种方法，其中高压静电纺丝技术是最常用的方法之一，尽管该技术设备相对低廉、操作简单和可电纺材料多等优点，但是电纺纳米材料存在孔隙小，不利于细胞的迁入和组织形成。低温凝胶成膜技术具有操作简单、无需特殊的设备和能形成较不同大小的孔隙结构，是制备引导骨再生膜材料的理想方法之一。
发明内容
要解决的技术问题：本发明的目的是提供一种具有引导骨组织再生的壳聚糖凹凸棒石膜材料的制备方法，利用冷冻凝胶方法制备壳聚糖/凹凸棒石膜材料，将不同比例的壳聚糖/凹凸棒石混合，通过梯度冷冻方法使壳聚糖/凹凸棒石成膜，加入一定量的乙醇/氢氧化钠混合液继续冷冻数小时；缓冲液洗膜，梯度酒精脱水；甘油/水混合液洗膜，自然干燥后成膜，制备出具有三层结构、多孔的壳聚糖/凹凸棒石膜材料，具有较好的生物相容性、生物降解性和引导骨生长性能，同时具有较好的生物机械强度，满足骨损伤修复的要求。
技术方案：一种具有引导骨组织再生的壳聚糖凹凸棒石膜材料的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：分别取壳聚糖和凹凸棒石，将壳聚糖溶于质量百分比0.1～1％乙酸溶液，充分混匀后加入凹凸棒石，混合液以转速100～500r/min搅拌12～24h，得混合液；
步骤2：将步骤1得到的混合液缓慢加入体积为10～50cm3塑料模具中，置于4℃环境下预冷4～12h，再置于-20℃环境下冷冻12～48h；
步骤3：缓慢加入摩尔数0.1～3M NaOH和质量百分比80～100％乙醇混合液，置-20℃环境下冷冻12～48h得膜材料；
步骤4：步骤3得到的膜材料用质量摩尔数0.01～1M PBS洗3～5次/30min，再用质量百分比50～100％乙醇溶液分别依次梯度脱水，最后用质量比为1～10:1的甘油：水洗5～10min；步骤5：室温环境下自然干燥，即得本发明的具有引导骨组织再生的壳聚糖凹凸棒石膜材料。
进一步的，所述步骤中1中壳聚糖和凹凸棒石的质量比为100～20︰60～10。
进一步的，所述步骤3中NaOH溶液和乙醇溶液的质量比为1:1。
进一步的，所述步骤4中PBS的pH＝7.4。
有益效果：
1、本发明制备的壳聚糖/凹凸棒石膜材料具有制备工艺简单、无需特殊设备、尺寸可控、重复性好，易于根据需要制备具有不同尺寸的膜材料，满足不同的需求。
2、壳聚糖/凹凸棒石膜材料具有三层结构，且具有大小不等的孔隙结构，有利于细胞迁入和组织的形成。同时，能有效促进营养物质的供给和代谢物的排除。
3、壳聚糖/凹凸棒石膜具有一定的柔韧性和力学强度；良好的降解性、生物相容性和无毒副作用，符合组织工程材料的要求。
4、本发明制备的壳聚糖/凹凸棒石膜具有引导骨再生的作用。
附图说明
图1是实施例1构建的壳聚糖/凹凸棒石膜材料的实物图。
图2是实施例1壳聚糖/凹凸棒石膜材料表面扫描电镜图。
图3是实施例1壳聚糖/凹凸棒石膜材料纵切面扫描电镜图。
图4是实施例1壳聚糖/凹凸棒石膜材料纵切面扫描电镜图。
图5是实施例1壳聚糖/凹凸棒石膜红外光谱图。
图6是实施例1构建的壳聚糖/凹凸棒石膜材料与细胞复合培养的扫描电镜图。
图7是实施例1的壳聚糖/凹凸棒石膜材料植入动物骨缺损处3个月后的组织染色图。
具体实施方式
实施例1
一种具有引导骨组织再生的壳聚糖凹凸棒石膜材料的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：按质量比90︰10，分别取壳聚糖和凹凸棒石，将壳聚糖溶于质量百分比0.2％乙酸溶液，充分混匀后加入凹凸棒石，混合液以转速250r/min搅拌24h，得混合液；
步骤2：将步骤1得到的混合液缓慢加入体积为50cm3塑料模具中，置4℃环境下预冷12h，再置入-20℃环境下冷冻24h；
步骤3：缓慢加入按照1:1质量摩尔数2M NaOH和质量百分比100％乙醇混合液，置-20℃环境下冷冻24h得膜材料；
步骤4：将步骤3得到的膜材料用质量摩尔数0.2M PBS(pH＝7.4)洗3～5次/30min,再用质量百分比50、70、80、90、95和100％乙醇溶液分别依次梯度脱水，最后再用质量比为10:1的甘油:水混合液洗10min；
步骤5：室温环境下自然干燥，即得本发明的具有引导骨组织再生的壳聚糖凹凸棒石膜材料。
实施例2
一种具有引导骨组织再生的壳聚糖凹凸棒石膜材料的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：按质量比80︰20，分别取壳聚糖和凹凸棒石，将壳聚糖溶于质量百分比0.2％乙酸溶液，充分混匀后加入凹凸棒石，混合液以转速250r/min搅拌24h，得混合液；
步骤2：将步骤1得到的混合液缓慢加入体积为50cm3塑料模具中，置4℃环境下预冷12h，再置入-20℃环境下冷冻24h；
步骤3：缓慢加入按照1:1质量摩尔数2M NaOH和质量百分比100％乙醇混合液，置-20℃环境下冷冻24h得膜材料；
步骤4：步骤:3得到的膜材料用质量摩尔数0.2M PBS(pH＝7.4)洗3～5次/30min，再用质量百分比50、70、80、90、95和100％乙醇溶液分别依次梯度脱水，最后再用质量比为10:1的甘油:水混合液洗10min；
步骤5：室温环境下自然干燥，即得本发明的具有引导骨组织再生的壳聚糖凹凸棒石膜材料。
实施例3
一种具有引导骨组织再生的壳聚糖凹凸棒石膜材料的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：按质量比70︰30，分别取壳聚糖和凹凸棒石，将壳聚糖溶于质量百分比0.2％乙酸溶液，充分混匀后加入凹凸棒石，混合液以转速250r/min搅拌24h，得混合液；
步骤2：将步骤1得到的混合液缓慢加入体积为50cm3塑料模具中，置4℃环境下预冷12h，再置入-20℃环境下冷冻24h；
步骤3：缓慢加入按照1:1质量摩尔数2M NaOH和质量百分比100％乙醇混合液，置-20℃环境下冷冻24h得膜材料；
步骤4：步骤3得到的膜材料用质量摩尔数0.2M PBS(pH＝7.4)洗3～5次/30min，再用质量百分比50、70、80、90、95和100％乙醇溶液分别依次梯度脱水，最后再用质量比为10:1的甘油:水混合液洗10min；
步骤5：室温环境下自然干燥，即得本发明的具有引导骨组织再生的壳聚糖凹凸棒石膜材料。根据不同要求可获得不同尺寸大小的膜材料。实施例1如图1所示肉眼观察膜结构均一，手感质地松软，拉伸有一定弹性。图2为膜表面扫描电镜图，可见膜表面有一定孔隙，且凹凸棒石均匀分布；图3为纵切面扫描电镜图，可见膜为三层结构，外层结构相对致密，中间层结构呈蜂窝状且有大小不同的孔隙；随着凹凸棒石含量的增加膜结构呈片层结构，且有大小不同的孔隙，如图4示。
分别利用红外光谱表征；测试材料的孔隙率、吸水膨胀率、透气性；生物力学测试机检测膜材料的力学性能。图5为不同含量凹凸棒石膜红外光谱图，从图中可看出凹凸棒石成功掺入膜材料中；膜吸水性随凹凸棒石的增加明显增加；同时，膜的孔隙率、透气性和力学性能随着掺入凹凸棒石量的增加而显著增加。
对所制备膜材料与间充质干细胞进行共培养，进行组织学评价生物相容性，通过细胞增殖实验、扫描电镜观察和细胞免疫荧光染色(HE)方法分别评价材料的组织相容性，该扫描电镜图如图6所示，结果显示，细胞能在材料中生长、增殖，且随着时间的延长细胞数量明显增加，该结果提示，膜材料与细胞无免疫反应和毒副作用，细胞与该材料具有良好生物相容性。下面通过复制大鼠颅骨缺损模型，利用缺损模型的新骨生成情况评价复合支架材料的修复效果。
1、对于材料的结构：
1)采用扫描电镜和红外光谱仪技术膜表征；质量法和体积变化测定法分别测定膜材料的含水率和膨胀率；液体交换法测定材料的孔隙率；拉伸应变机评价材料的力学特征；
2)将膜材料置于DMEM/F12培养基中，与小鼠骨髓间充质干细胞在37℃CO2培养箱进行共培养，在培养3d、7d、14d和21d后，分别进行组织学评价观察细胞与材料的复合情况；试验表明：细胞在材料表面生长、增殖，材料无毒副作用，符合组织工程支架材料的要求。
动物学实验
采用清洁级雄性Wastar大鼠60只，体重(200±20)g，随机分为3组，即实验组(采用本发明3种膜材料)、对照组(不掺和凹凸棒石膜材料)和自体缺损修复组，每组12只。按每千克体重注射质量百分比10％水合氯醛行腹腔注射麻醉。无菌环境下复制大鼠头盖骨缺损模型，骨缺损孔洞规格为直径×长度：5mm×3mm，按照预先设计植入膜材料后，逐层缝合伤口，碘伏涂抹伤口，利用消毒灭菌的纱布、绷带包扎固定伤口。术后清洁级环境下饲养，分别于4周、8周和12周时，通过Micro-CT扫描、组织染色方法(HE)、Masson染色方法和免疫组织化学方法，观察并综合评价膜材料对骨损伤的再生修复效果。
1)Micro-CT扫描
分别于术后4周、8周和12周时行Micro-CT扫描缺损区的愈合情况、并与周围正常骨组织结合情况，比较进行观察分析，结果显示实验组的新骨生成明显多于其他组，材料与周围骨组织密切结合。
2)组织学分析
取材，常规石蜡包被，HE染色，Masson染色光学显微镜下观察分析宿主组织/材料的生物相容性、炎性反应程度和宿主/材料界面形成的组织结构特征，如图7结果显示：宿主/材料界面无炎性细胞，并随着时间延长骨修复生物材料逐步被降解吸收；
3)免疫组织化学染色分析
免疫组织化学方法检测新生骨中COL-Ⅰ、OCN和OPN的表达，实验组COL-Ⅰ、OCN和OPN呈明显阳性表达。
通过上述动物实验证实：本发明骨膜材料具有引导新骨再生的功能，实现了具有组织诱导性骨修复的组织工程支架材料，以期用于临床。
本发明膜材料的原材料为壳聚糖，已广泛用于组织工程材料的研究和应用，是美国FDA批准用于人体的生物材料。凹凸棒石为天然无机材料，来源丰富，加工工艺成熟、规范、流程简单；无需特殊仪器，所用材料无毒、具有良好的生物相容性。

Claims (4)

1.一种具有引导骨组织再生的壳聚糖凹凸棒石膜材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：分别取壳聚糖和凹凸棒石，将壳聚糖溶于质量百分比0.1～1%乙酸溶液，充分混匀后加入凹凸棒石，混合液以转速100～500r/min搅拌12～24 h，得混合液；
步骤2：将步骤1得到的混合液缓慢加入体积为10～50cm3塑料模具中，置于4℃环境下预冷4～12h，再置于-20℃环境下冷冻12～48h；
步骤3：缓慢加入摩尔数0.1～3M NaOH和质量百分比80～100%乙醇混合液，置-20℃环境下冷冻12～48h得膜材料；
步骤4：步骤3得到的膜材料用质量摩尔数0.01～1M PBS 洗3～5次/30min，再用质量百分比50%、70%、80%、90%、95%和100%乙醇溶液分别依次梯度脱水，最后用质量比为1～10:1的甘油：水洗5～10 min；
步骤5：室温环境下自然干燥，即得具有引导骨组织再生的壳聚糖凹凸棒石膜材料。
2.根据权利要求1所述的一种具有引导骨组织再生的壳聚糖凹凸棒石膜材料的制备方法，其特征在于，所述步骤中1中壳聚糖和凹凸棒石的质量比为100～20︰60～10。
3.根据权利要求1所述的一种具有引导骨组织再生的壳聚糖凹凸棒石膜材料的制备方法，其特征在于，所述步骤3中 NaOH溶液和乙醇溶液的质量比为1:1。
4.根据权利要求1所述的一种具有引导骨组织再生的壳聚糖凹凸棒石膜材料的制备方法，其特征在于，所述步骤4中PBS的pH=7.4。
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