WO2017115320A1 - Constructo para evitar el rechazo inmunológico producido cuando se usa en trasplante, método para producir colágeno en estado de gel en forma de moldeados esponjosos liofilizados secos y matrices 3-d - Google Patents

Constructo para evitar el rechazo inmunológico producido cuando se usa en trasplante, método para producir colágeno en estado de gel en forma de moldeados esponjosos liofilizados secos y matrices 3-d Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to the biomedicine industry, tissue engineering and tooth regeneration.
  • the present invention relates to a construct to prevent immune rejection produced when used in transplantation in the treatment of diseases (without the use of immunosuppressive drugs), either xenotransplantation or allogeneic transplantation.
  • the present invention also relates to the method of obtaining said construct. Additionally, a method for producing collagen in a gel state is described, either in 3-D form or as molds of dry lyophilized spongy collagen with the shape of the element to be transplanted. Finally, the present invention relates to the use of the construct to avoid the immunological rejection produced during the transplant thereof.
  • stem cells when transplanted in the presence of hydroxyapatite and tricalcium phosphate (HA / TCP) in the subcutaneous back of immunosuppressed mice, showed the formation of an octopus / dentin complex, with blood vessels, dentin secretion and ordered odontoblasts.
  • stem cells derived from adult dental pulp have adipogenic and neurogenic, chondrogenic and myogenic potential confirming the plasticity and heterogeneity of this population of mesenchymal stem cells in vitro.
  • its use has not yet been demonstrated in vivo in the absence of immunosuppression to prevent its immune rejection.
  • SHEDs are not a good source of tissue to regenerate a dental germ because they do not form the octopus / dentinal complex and are only bone inducers, because they do not differentiate to osteoblasts.
  • the third type of dental tissue stem cells is the SCAP (Stem Cells from Apical Papilla), obtained from the third molar apical papilla included in early stages of development (Nolla, CDE); which, could be considered the source of the cells of the root pulp (coronal dentine-producing odontoblasts) and it is believed to think that these same SCAPs give rise to the DPSCs, but it has not been shown that the SCAPs constitute as DPSCs in the Future pulp of the adult tooth and several differences between these two types of MSCs have been demonstrated.
  • SCAP Ste Cells from Apical Papilla
  • the fourth dental tissue in which a group of MSCs was characterized is the dental follicle; which, can be obtained from third molars including humans in early development, separating the ectomesenchyme that surrounds the enamel organ in the dental papilla.
  • This tissue contains clonogenic stem cells (Dental Follicle Precursor Cells, DFPCs) that in culture show myogenic, neurogenic, adipogenic, chondrogenic multipotentiality, in addition to the cementogenic and odontogenic potential; which, transplanted in vivo give rise to fibrous tissue similar to the periodontal ligament, but do not form dentin, cement, or bone.
  • immortalized cells of the dental follicle are capable of forming the entire periodontal ligament when they are transplanted in vivo, however the complexity of this immortalization technique makes them difficult to use in clinical practice. From the background described above, it is clear that the regeneration of the dental organ requires more than one type of stem cell given its epithelio-mesenchymal origin and despite recent advances in the properties of the stem cells, a biological solution is still lacking. allow the tooth to be anchored to the alveolar niche and return the functionality to the individual's masticatory system from a type of stem cell.
  • the periodontal ligament contains cells capable of differentiating with cementblasts and osteoblasts; however, it also contains a reservoir of stem cells with the characteristics of the MSCs called periodontal ligament stem cells (Periodontal Ligament Stem cells, PDLSCs), these isolated cells in culture are characterized by responding to induction with the corresponding means to differentiate themselves from adipocytes, chondrocytes and osteoblasts. In addition, its ability to differentiate to neuronal precursors was demonstrated.
  • PDLSCs Periodontal ligament stem cells
  • PDLSCs transplantation in immunosuppressed mice demonstrated the formation of periodontal ligament containing cement-bound Sharpey fibers formed by these cells similar to that observed in physiological conditions in an individual; Moreover, the transplantation of these cells to the periodontal region of rats with surgically induced damage showed that the periodontal tissue formed adheres to the alveolar surface and the tooth surface.
  • all publications indicate that transplants of dental stem cells have been performed with immunosuppression of the animal and only using a repair model in rats or pigs.
  • the present invention shows a construct that can contain adult stem cells of periodontal ligament of teeth extracted in dental clinics and that prevents immunological rejection when used in the treatment of diseases or conditions related to human dentures, without the use of immunosuppression.
  • Dental implants currently in commerce are composed of a metal base usually made of titanium. These metals are implanted in the alveolar bone without regenerating the periodontal complex, so they do not have a natural relationship due to the lack of dissipation and transmission of forces, lack of proprioception and lack of stereognosis. These are properties that only the natural or biological tooth possesses, because only cells can be structured to form blood vessels, innervations and extracellular matrix rich in fibers in addition to producing nutrients, chemical and electrical signals that inform the brain of proprioception, dimension three-dimensional volumetric, transmission and dispersion of masticatory forces that ultimately help maintain bone homeostasis alveolar and the signal of life of the tooth that prolongs the competitive age of the individual and prevents premature aging.
  • titanium implants are susceptible to loosening or causing infections such as gingivitis or periodontitis, due to the unnatural relationship between the bone and the metallic implant.
  • the world market for metal dental implants for the year 2010 was approximately 3.2 billion dollars. By 2015 there was an annual growth rate of 6%, reaching a value of 4.2 billion dollars. If the Latin American market is considered to be 10%, there is a potential market of 420 million dollars for 2015.
  • the present application presents a collagen-containing construct that serves as a support for the implantation of biological-based parts, which appears as an alternative to the implants currently used, and which also improves biocompatibility by drastically reducing rejection levels up to practically zero
  • the present application comprises products such as a construct to prevent immune rejection produced when used in transplantation in the treatment of diseases (without the use of immunosuppressive drugs), either xenotransplantation or allogeneic transplant, a method of obtaining this construct, a method to produce collagen in gel state, either in form 3-D or as molds of dry lyophilized spongy collagen with the shape of the element to be transplanted, and the use thereof.
  • EP1920788A1 is related to a matrix containing mesenchymal stem cells and platelet-rich plasma, for use in the preparation of implants for the treatment of periodontal or bone pathologies, wherein said matrix may contain collagen, however the present invention. does not teach or suggest that the product contains platelet rich plasma. On the other hand, this document neither teaches nor suggests the construct with the particular elements of the present invention nor the steps to obtain it. Additionally, there are scientific publications that describe the use of stem cells in the implantation of dental pieces with appropriate matrices, such as Zhou Y. et al. Periodontal healing by periodontal ligament cell sheets in a teeth replantation model. Arch. Of Oral Biology 57 (2012) 169-176, and Zhao et al.
  • a construct that avoids the immune rejection produced when used in transplantation in the treatment of diseases (without the use of immunosuppressive drugs), either xenotransplant or allogeneic transplant; a method of obtaining said construct; a method for producing collagen in the gel state, either in 3-D form or as molds of dry lyophilized spongy collagen with the shape of the element to be transplanted; and finally, the use of the construct to avoid the immunological rejection produced during its transplantation.
  • One of the advantages of the present invention is the independence of the cell source, where this independence brings technical benefits (for example ease in cell culture, without relying on a fixed or defined source) and economic benefits (for example, lower maintenance requirements cell culture compared to obtaining cells from the same patient)
  • FIG. 1 The results of the optimization of the culture medium used in stem cell cultures of the periodontal ligament are shown.
  • the a-MEM medium standard for stem cell culture, was selected because the dubbing time is optimal by reducing the time to less than half for this cell type compared to the high glucose D-MEM medium.
  • FIG. 2 The results of the characterization of dental stem cells by flow cytometry are shown. According to the results obtained it was established that it is advisable to use frozen dental stem cells up to the seventh passage to make the constructs of the present invention with the maximum potential of the cells. The figure shows that the markers for stem cells remain present as expected for CD90, CD29 and STRO-1; in as much, that always absent for CD34. They are also negative for CD-14 (not shown).
  • Figure 3 The microbiological control of tissue to obtain the collagen product is shown, using the methodology described in the present application. Corresponds to CFU / plaque in pig tissue treated with povidone iodine or peracetic acid.
  • the photographs of the culture plates show the initial growth of bacterial colonies at the beginning (time 0), and the decrease of CFU at 5 minutes, 30 minutes, 1 hour and 3 hours of exposure to the disinfectant; in the upper panel povidone iodine (PY) and in the lower panel peracetic acid (AP). Povidone iodine was more effective and eliminates totally the formation of bacterial colonies at 3 hours, while with the peracetic acid the presence of a colony still persists.
  • PY povidone iodine
  • AP peracetic acid
  • FIG. 1 Photographs of the stem cell cultures obtained from periodontal ligament, grown in (A) a-MEM and (B) medium grown in the same medium on the collagen product (specifically the 3-D matrix of collagen), obtained according to the present invention.
  • the SDS-Page gel shows the electrophoretic migration of the collagen extract at concentrations of 3.0 ⁇ g, 15.0 ⁇ g and 30 ⁇ g obtained from the analysis of the components of the collagen product obtained from pig skin with the method described here.
  • the typical collagen pattern is observed, in which the ⁇ 1, a2 and ⁇ chains are distinguished; and more clearly with greater concentration of the extract between 15 ⁇ g and 30 ⁇ g total.
  • FIG. 7 Histological section of the 3-D matrix is shown containing the human dental ligament stem cells growing in the 3-D collagen matrix, showing their nuclei stained with the DAPI fluorescent compound.
  • the collagen product produced to maintain stem cells of the periodontal ligament in culture is observed.
  • the presence of the cells in the fixed matrix, included in paraffin and cut with a microtome, is shown by immunofluorescence of the nuclei with DAPI staining (40X). The nuclei distributed throughout the matrix are observed, showing that the cells are integrated into the collagen mesh. This product with cells is used to cover the element to be transplanted.
  • Figure 8 An example of the human biodient with regenerated periodontal ligament strongly adhered to the tooth matrix is shown, so that it is possible to hold it with a clamp when it is extracted from the back of the mouse (Figure A); in figure B) and C) of the center and bottom, histological sections of this tooth are shown after demineralization, where the structure of dentinal tubules of dentin (D) cut transversely and sagittally is observed, with a clear presence of cement (C) and periodontal ligament fibers (PDL) in intimate association with the dentin surface.
  • C cement
  • PDL periodontal ligament fibers
  • the present invention relates to a construct for transplantation, either xenotransplant or allogeneic transplant, which does not generate immunological rejection, comprising: a) cells with regenerative capacity; b) 3-D gel state collagen, or also called 3-D collagen matrix, obtained from pig's head cheeks; c) culture medium; d) an element intended for transplantation; and e) dry lyophilized spongy collagen molded in the shape of the element to be transplanted.
  • the construct is shaped so that the cells with regenerative capacity (a) are cultured on the collagen in a 3-D gel state (b), and the culture medium (c) is on the cells with regenerative capacity (a) ; said culture medium with cells and collagen in a 3-D gel state is wrapping the element intended for transplantation (d); the element to be transplanted wrapped with cells and the 3-D collagen is inside the molded dry lyophilized spongy collagen (e), such that the resulting product is immersed and surrounded by a second layer of dry lyophilized collagen.
  • cells with regenerative capacity are selected from the group comprising: allogeneic or autologous stem cells, or induced stem cells or progenitor cells of cell lines leading to specific tissues, or fragments of organ tissues kept alive or in developing. More specifically, the stem cells are cells that are selected from the group comprising: mesenchymal cells of adipose origin, bone marrow, umbilical cord, dental pulp, dental papilla, dental follicle, periodontal ligament, oral epithelium, condylar ligament, heart muscle, epithelia covering, maxillofacial or cranial flat bones, bone progenitor cells, endothelial. These stem cells are allogeneic or autologous.
  • the element to be transplanted (d) is selected from the group comprising: tooth, cranial bone, maxillary facial bone, iliac bone, long bones, developing dental organ, kidney, liver, heart, tracheal tube, lung, cornea, motor nerves, ligaments, cartilage, skin.
  • the element to be transplanted is a human adult mineralized tooth. If it is a tooth, the transplant construct can be called a bio-tooth.
  • a method for producing the transplant construct comprising the steps of: a) preparing an element intended to transplant fresh at room temperature between 20 to 25 ° C, or previously kept cold between 4 e C to 10 e C or frozen (-20 e C to -170 e C in cryopreservation); b) coating culture plates with the 3-D gel collagen in the form of a sheet on the plate, then depositing the cells with regenerative capacity, such as allogeneic or autologous stem cells, or induced stem cells or progenitor stem cells.
  • regenerative capacity such as allogeneic or autologous stem cells, or induced stem cells or progenitor stem cells.
  • step (c) dispose of molded dry lyophilized spongy collagen with the shape of the element to be transplanted; d) take the culture sheet with stem cells from step (b), remove excess culture medium by contact on absorbent paper and completely roll over the element to be transplanted; e) cover or submerge the construct obtained from step d), which consists of the element to be transplanted incorporated into the 3-D collagen matrix, in the collagen moldings of step (c); such that, the three-dimensional gel-type collagen 3-D construct is immersed and surrounded by a second layer of dry lyophilized spongy collagen (spongy mold type with or without cross-linking, described in the specification for the tooth) and molded according to the shape of the implant and f) store frozen at a temperature between -80 and
  • the element to be transplanted from stage a) is selected from the group comprising: tooth, cranial bone, maxillary facial bone, iliac bone, long bones, developing dental organ, kidney, liver, heart, tracheal tube, lung, cornea, motor nerves, ligaments, cartilage, skin.
  • the element to be transplanted is a human adult mineralized tooth. If it is a tooth, the transplant construct can be called a bio-tooth.
  • the following method is considered to treat the tooth prior to step a): i) decellularize, by rinsing with ultrafiltered water, immersed in a solution of 17 % EDTA between 5 to 15 minutes at neutral pH (7.0 to 7.2) at room temperature (20 to 25 ° C) and then maintained for 30 seconds to 5 minutes in a solution of 10 to 30% citric acid and Wash with ultrapure water.
  • root apices are closed, they can be opened to perform root and cameral cleaning using conventional endodontic techniques with a type H or K file, prior to decellularization, leaving the dental piece with its cell-free channel and root, keeping the mineral and organic part.
  • the stem cells of stage b) are stem cells that are selected from the group comprising: mesenchymal cells of adipose origin, bone marrow, umbilical cord, dental pulp, dental papilla, dental follicle, periodontal ligament, oral epithelium , condylar ligament, heart muscle, covering epithelia, maxillofacial or cranial flat bones, bone progenitor cells, endothelial. These stem cells are allogeneic or autologous.
  • stem cells are cultured under the following conditions: Extract periodontal ligament from the inferior root third of a dental piece, being able to be an erupted third molar or any erupted tooth, obtained from the patient or donor, or from an animal dental piece (pig, dog or other); triturated in saline solution (PBS), transferred to dishes covered with a 3-D collagen matrix and a-MEM culture medium with FBS (10% to 15%) or autologous human serum (10% to 15%) is added %) to obtain the stem cells.
  • PBS saline solution
  • the cell selection process allows to obtain stem cells characterized by flow cytometry or a mixture of stem cells with other types of cells in differentiation pathways.
  • the cells prior to use can be obtained directly in culture dishes without collagen by enzymatic extraction and culture in a-MEM medium with 10% or 15% FBS or with 10% to 15% autologous human serum until they reach an optimal confluence (60% to 75%) to expand and freeze until use.
  • they are grown on the 3-D collagen matrix as described above and the sheet with cells is used to completely roll over the element to be transplanted from step a) of the method to produce a transplant construct.
  • the pulp cavity of the mineralized and decellularized matrix of the tooth to be transplanted is filled with dental pulp stem cells (DPSCs) of erupted teeth extracted by orthodontic indication or apex cells of a developing third molar (SCAPs) or DPSCs of this type of tooth, allogeneic or autologous grown and maintained by the standard method of expanding mesenchymal stem cells of dental origin preferably using the a-MEM medium in the 3-D collagen matrix described herein, with or without VEG (blood vessel growth factor) or alternatively,
  • DPSCs dental pulp stem cells
  • SCAPs developing third molar
  • DPSCs developing third molar
  • allogeneic or autologous grown and maintained by the standard method of expanding mesenchymal stem cells of dental origin preferably using the a-MEM medium in the 3-D collagen matrix described herein, with or without VEG (blood vessel growth factor) or alternatively
  • VEG blood vessel growth factor
  • cells in differentiation pathways are introduced by a short induction in a standard
  • This procedure is performed with the help of a syringe in such a way that the collagen gel containing the cells completely fills the pulp cavity; then, proceed as described in this section from (d) onwards to complete the construct with the gel sheet containing stem cells of the periodontal ligament and spongy molding that will allow dental implantation in alveolar niche.
  • the element to be transplanted is maxillofacial bone, it is subjected to the steps of: i) cleaning annexed tissues, immersion in Tris-NaCI or PBS buffer for 30 seconds to 5 minutes or 70% ethanol for 1 to 5 minutes, and then rinse in ultrapure water to coat with the 3-D collagen matrix seeded with mesenchymal stem cells or precursor cells; ii) alternatively, after cleaning described in (i) it is subjected to decellularization following the same steps as for the tooth.
  • Decellularization is performed by applying the same principles previously described for the mineralized matrix of a dental piece, (except for the endodontic process) a diluted acid (for example hydrochloric acid) is used for 15 minutes or more, depending on the size of the bone fragment, and it is decellularized for a range of 15 minutes to several hours (3 to 8 hours depending on the size of the bone fragment) with acetone or a dilute nitric acid solution. Finally, it is rinsed in sterile ultrapure water for 24 hours and immersed in ethanol between 60% and 90% until use.
  • a diluted acid for example hydrochloric acid
  • the decellularized bone is coated with the mixture of 3-D matrix of collagen-mesenchymal stem cells or osteoblast precursors, containing the standard a-MEM culture medium supplemented with 10% FBS, dexamethasone, ascorbic acid, glycerophosphate. These elements are inserted into a collagen molding undergoing crosslinking as described above and transplanted into the body without immunosuppression.
  • a method for producing the collagen in a gel state is described, either in a 3-D gel state where the cells with regenerative capacity are cultured or as molds of dry lyophilized spongy collagen in the form of the element to be transplanted, which comprises: a) Disinfecting a segment of pig skin (specifically pig head cheek) by immersing it in a commercial solution of povidone iodine in a concentration between 1% and 30%, for a period of 3 to 6 hours , and then brushed vigorously on both sides and rinsed with ultra-pure quality water; b) extract and crush the dermis from the skin segment obtained from step a), and then mix with a solution between 1 and 10 M sodium acetate, and the pH is raised between 10 to 14 with a solution of sodium hydroxide between 10 to 15 M for a period of time between 30 minutes and
  • step b) wash the mixture resulting from step b) 2 to 7 times with a solution of sodium acetate between 1 M and 10M, collecting the proteins by centrifugation at equal to or more than 9,000 rpm in cold between 0 and 10 e C; followed by 2 to 7 washes with ultra-pure quality water by the same centrifugation method; then the sediment is solubilized in a solution of acetic acid diluted between 0.01 N and 0.5 N in a proportion of 1 It per 1.5 g of the solid, by stirring between 0 and 10 e C; d) recovering by centrifugation from 0 to 10 and C to equal to or more than 9,000 rpm, and then separating suspended solid particles from the solution by filtration and gauze; subsequently, the solution is frozen (-20 e C to -30 e C) and subjected to a lyophilization process to remove water; and e) keep the
  • the disinfected pig skin obtained in step a) is frozen between -80 ° C to -196 ° C to keep it stored until use.
  • the collagen obtained by the method described above from steps a) to e) can be presented in the form of dry lyophilized spongy moldings to wind the elements to be transplanted following the following additional steps: f) massage the lyophilisate from step e) and dissolve in acetic acid (0.5N or higher concentration) at 4 e C ( ⁇ 1.0 e C), until a concentration of 20 to 30 mg / ml is obtained; g) introduce the dissolved product of step f) into sterile plastic molds according to the size and shape of the implant, h) freeze at a temperature between -20 and C to -24 and C for at least 24 hours; i) lyophilize the frozen product from step h) and j) detach the product from the plastic molds using a spatula to be stored in a dry place at room temperature (20 to 25 ° C) until the time of use (it can be stored for at least 12 months).
  • the molds of step g) can be thin or thick sheets, or cones of varied thickness, or tubules of varied thickness, or other shape as appropriate to the tissue to be transplanted.
  • the spongy collagen moldings obtained according to steps f) to j) are treated by means of cross-linking procedures with non-toxic (harmless) material, controlling the density of the molded collagen, through the following steps: i. immerse and incubate the collagen (spongy molded) at room temperature (20 e C to 25 e C) in a solution based on 2.3% w / v N-hydroxysuccinimide (NHS) and 3.83% w / v N - (3 - dimethylaminopropyl) -N '- ethylcarbodiimide hydrochloride) (EDC) in a volume of between 1 and 40 ml of 70% ethanol and subsequently washed perform this collagen in sterile ultrapure water; I. freeze the collagen at a temperature between -50 and -5 ° C between 12 and 36 hours and then freeze-dry under the same conditions as before, which will be called sponge molding due to its new consistency, firmer than the gel of stage e
  • the collagen obtained after stage e) can be presented as a 3-D matrix of collagen in a gel state for cell culture with the following additional steps: i) massaging the lyophilized product obtained from stage e) and dissolve in acetic acid (0.01 N to 0.05 N) in cold 4 e C ( ⁇ 1.0 e C) until a final required concentration between 2.0 mg / ml to 5.0 mg / ml is obtained; ii) take the completely dissolved product from step k) and dialyze in chloroform at a concentration between 0.5% and 5% to remove impurities, followed by dialysis in dilute acetic acid (0.01 N to 0.05 N) in cold 4 e C ( ⁇ 1.0 e C); iii) obtain a 3-D biological matrix of gel-type or gel-like collagen that provides three-dimensional environment to cells in culture; and iv) store the product cold without freezing at a temperature between 4 e C to 10 e C.
  • the present invention relates to the use of said construct to avoid the immunological rejection produced during the transplantation thereof.
  • the final construct is a biodient, it is used for any of the 32 human teeth, or pets or animals with dental roots.
  • Example 1 Obtaining pig skin collagen and manufacturing the 3-D matrix of collagen i. Sterilization and frozen tissue: Pigskin cheek skin 175 to 190 days old was used. Which, immersed for 3.5 hours in a commercial solution of povidone iodine 10% (Brand: Centrovet) and brushed on both sides every 30 minutes, in a sterile environment, and rinsed with ultra-pure quality water.
  • Table 1 and Figures 3 and 4 show the results of the effectiveness analysis of the povidone iodine (PY) used in the present invention, compared with the effectiveness of peracetic acid (AP); demonstrating that povidone is more effective, since it eliminates 100% of microbial growth at 3 hours post treatment and maintains the integrity of the collagen obtained later, while peracetic acid damages the quality of the collagen by altering the viscosity of the final product, in such a way that it does not acquire the consistency necessary to be used in implants.
  • the disinfected tissue is placed in bags and sealed to freeze at -80 ° C ( ⁇ 2.0 e C) in a freezer (Thermoline brand).
  • Table 1 Treatment of pig tissue with disinfectants.
  • Frozen tissue is placed on a cold surface (4 ° C), in a sterile environment to remove adipose and epithelial tissue with the help of a scalpel.
  • the dermis thus obtained, was cut into pieces approximately 1 cm 2 , and was milled in 200 ml_ of a solution of 5M sodium acetate (Brand: JT Baker) with a food crusher in short pulses of less than 5 seconds each to avoid temperature rise.
  • the elimination of possible pathogens at this stage was carried out by adjusting the pH of the solution to pH14 with a 12 M NaOH solution for 1 hour and 10 minutes at room temperature (20 e C to 25 e C).
  • Collagen purification and freezing The collagen solution obtained was cleaned of impurities by centrifugation at 9,500 rpm for 20 minutes in a Hettich brand centrifuge at 4 ° C and 100 ml volumes were filtered in hydrophilic gauze (sterile for therapeutic use) folded in 10 folds over sterile jar. These extracts were frozen at -20 and C for 48 hours to proceed to the lyophilization stage.
  • Lyophilization 100 ml volumes of frozen extract were lyophilized at -85 e C with constant pressure in Labconco brand lyophilizer for approximately 48 hours until the samples dried.
  • the obtained product (dry collagen) was masó and dissolved in proportion of 90 mg per 30 ml of sterile 0.02 N acetic acid, 4 and C with occasional stirring until complete dissolution.
  • This solution was introduced in dialysis membranes ((SnakeSkin Dialysis Tubing, Thermoscientific brand) and was dialyzed against 1% chloroform for one hour and then, against 0.02 N acetic acid making changes to the solution until the chloroform was eliminated.
  • the gel obtained was removed from the dialysis bag and stored at 4 e C in sterile container.
  • the collagen obtained at a concentration of 3.0 mg / ml (+/- 0.1 mg, approximately) was used to cover cell culture plates and to mix with solution of cells obtained from fresh dental or bone tissues; This collagen gives a three-dimensional (3-D) environment to cells in culture.
  • Example 2 Method of manufacturing dry lyophilized spongy molding of collagen.
  • the spongy collagen matrix used for biodient or bone transplants, or allogeneic tooth germs was prepared from the lyophilized collagen obtained according to the procedure in example 1 to point (v).
  • a minimum of 200 mg of the dried collagen was mashed, dissolved in a solution of 10 mL 0.5 N acetic acid and introduced with the help of a spatula to sterile plastic molds and then, once solidified, introduce the element to be transplanted .
  • the molding for tooth construction is shaped like a cylinder covered by one of its ends with walls 2 mm thick and a depth of approximately 2 cm, so that the tooth to be transplanted was completely inserted inside. These moldings were frozen at -20 and C for at least 48 hours and then, they were subjected to the sublimation process of the water by lyophilization in freeze-dried Labconco brand.
  • the cross-linking of the collagen fibers of these moldings was carried out for six hours in 70% ethanol solution containing 0.230 g of NHS and 0.383 g of EDC at room temperature (20 e C-25 ° C).
  • Example 3 Method of manufacturing the biodiente or construct to transplant.
  • Matrices of human teeth were obtained, decellularized and cleaned as described in the present application, the pulp chamber and roots were cleaned, treated for 10 minutes with 17% EDTA and 1 minute with citric acid and then disinfect with povidone iodine and NaOH and finally, after rinsing, they were kept in 70% ethanol until use.
  • Periodontal ligament stem cell culture was performed as described above, specifically Nunc brand 60 mm diameter disposable plates and a-MEM (Invitrogen) culture medium with 15% bovine fetal serum (FBS, Invitrogen), were used on a layer of 3-D collagen prepared according to our method described here.
  • FIG. 1 shows the results of the optimization of the culture medium used in our periodontal ligament stem cell cultures, for which the cultured, frozen and expanded cells were used until the fifth transfer in this medium.
  • Figure 2 shows the results of flow cytometry for cells cultured under these conditions.
  • FIG 5 Example of expansion of the stem cells of the periodontal ligament cultured in a-MEM medium directly on culture dishes is shown in Figure 5 (A); while in Figure 5 (B) an example of the expansion of these cells in 3-D collagen medium using the same medium is shown.
  • Figure 7 shows histological section of the 3-D matrix containing the human dental ligament stem cells growing in the 3-D collagen matrix, showing their nuclei stained with the DAPI fluorescent compound.
  • the 3- D collagen sheet containing the stem cells of the periodontal ligament was taken and rolled over the root section of the decellularized dental matrix, prepared and dried in a sterile environment for 5 minutes (i) , building a three-dimensional matrix of five layers (at least) of cells on this dental matrix.
  • the biodiente constructed with dental matrices of human teeth and the 3-D collagen containing the stem cells of the periodontal ligament was introduced into a crosslinked collagen molding as described herein and transplanted under anesthesia in vivo to mice without immunosuppression, in regions such as , intraperitoneal or on the back under the skin to incubate for 2 months.
  • An implant was performed per animal, completing a total of twenty implants with the human biodient constructs with collagen as described herein, without the use of immunosuppression.
  • Control animals received implants of human constructs with stem cells without collagen.
  • the protocols for animal use and care were approved by the Committee Institutional of the ADG l + D center, the surgeries were performed by a veterinarian and researcher with more than 30 years of experience in experimental studies in laboratory rodents. Animals treated with analgesics were left with water and food ad libitum and were monitored the first hours to ensure their well-being; then, with daily observation, and routine care until they are sacrificed painlessly by cervical dislocation.
  • constructs were removed, using a clamp. They were fixed in 4% formaldehyde in PBS buffer, for a week with gentle agitation. The constructs were demineralized in 10% EDTA until soft touch consistency was obtained with tweezers and were included in paraffin for the routine histology process with microtome cuts.
  • the 20 transplants of biodientes constructed and implanted with collagen moldings that were maintained in animals without immunosuppression showed growth of the periodontal ligament highly adhered to the dental root matrix, while the control constructs without collagen showed no tissue development in their matrix showing destruction and loss of human stem cells.
  • Figure 8 shows an example of the human biodient with regenerated periodontal ligament strongly adhered to the tooth matrix, in such a way that it is possible to hold it with a clamp when it is extracted from the back of the mouse (upper photo);
  • FIG. 8 shows histological sections of this tooth after demineralization, where the structure of the dentinal tubules of the dentin (D) cut transversely and sagittally, with clear presence of cement (C) and ligament fibers is observed Periodontal (PDL) in intimate association with the dentin surface.
  • PDL Periodontal

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Abstract

La presente invención se refiere a un constructo para evitar el rechazo inmunológico producido cuando se usa en trasplante, ya sea xenotrasplante o alotrasplante, que comprende: a) células con capacidad regenerativa; b) colágeno en estado de gel 3-D, o también llamado matriz 3-D de colágeno, obtenido de mejillas de cabeza de cerdo; c) medio de cultivo; d) un elemento destinado a trasplantar; y e) colágeno esponjoso liofilizado seco moldeado con la forma del elemento a trasplantar. También se refiere a un método para producir colágeno en estado de gel en forma de moldeados esponjosos liofilizados secos y matriz 3-D.

Description

CONSTRUCTO PARA EVITAR EL RECHAZO INMUNOLÓGICO PRODUCIDO CUANDO SE USA EN TRASPLANTE, MÉTODO PARA PRODUCIR COLÁGENO EN ESTADO DE GEL EN FORMA DE MOLDEADOS ESPONJOSOS LIOFILIZADOS SECOS Y MATRICES 3-D.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se relaciona con la industria de la biomedicina, la ingeniería de tejidos y regeneración de dientes. En particular, la presente invención se relaciona con un constructo para evitar el rechazo inmunológico producido cuando se usa en trasplante en el tratamiento de enfermedades (sin el uso de drogas inmunosupresoras), ya sea xenotrasplante o alotrasplante. La presente invención también se relaciona con el método de obtención de dicho constructo. Adicionalmente, se describe un método para producir colágeno en estado de gel, ya sea en forma 3-D o como moldeados de colágeno esponjoso liofilizado seco con la forma del elemento a trasplantar. Por último, la presente invención se relaciona con el uso del constructo para evitar el rechazo inmunológico producido durante el trasplante del mismo.
ESTADO DEL ARTE
Los procedimientos de regeneración de tejido dental tienen su origen desde alrededor de 1952, cuando se reportó la regeneración de células pulpares mediante la aplicación de hidróxido de calcio en un caso clínico de amputación de una pulpa vital. A partir de esa evidencia se realizaron numerosos avances usando estímulos locales durante la endodoncia siempre dependiendo de tejido pre-existente sano; sin embargo, se desconocía la naturaleza de estas regeneraciones parciales hasta que se descubrió que en la pulpa del diente había células madres mesenquimales adultas. La pulpa de dientes permanentes contiene células madres (Human Dental Pulp Stem Cells, DPSCs), que forman diferentes tipos de colonias clonogénicas en cultivos con mayor frecuencia (22 a 70 colonias /104 células sembradas) y mayor proliferación celular
i (72% vs. 42%) que similar número de células sembradas de médula ósea, pero en menos proporción que la pulpa de dientes exfoliados primarios de niños de 7 a 8 años de edad (Stem cells from human exfoliated deciduous teeth, SHED); cuando se mantienen por largo tiempo en cultivos con medio osteogénico las DPSCs secretan matriz que mineraliza (nodos de mineralización) demostrando altos niveles de calcio, sin embargo en cultivos no se pudo demostrar presencia de dentina debido a la naturaleza del cultivo in vitro. Estas células madres al ser trasplantadas en presencia de hidroxiapatita y fosfato tricálcico (HA/TCP) en el dorso subcutáneo de ratones inmunosuprimidos, mostraron la formación de un complejo pulpo/dentina, con vasos sanguíneos, secreción de dentina y ordenados odontoblastos. Además de su potencial dentinogénico, las células madres derivadas de pulpa dental adulta, poseen potencial adipogénico y neurogénico, condrogénico y miogénico confirmando la plasticidad y heterogeneidad de esta población de células madres mesenquimales in vitro. Sin embargo, no se ha demostrado aún su uso in vivo en ausencia de inmunosupresión para evitar su rechazo inmunológico. Al comparar las SHED con las DPSC, se concluye que los dientes primarios de niños son una fuente de células madres muy diferentes a las células madres presentes en la pulpa de dientes permanentes, el potencial neurogénico de las SHED las hace muy interesantes para regeneración neuronal y más aún porque se logró aislar las células con características de células madres embrionarias (ES-cells) partir de estos tejidos; sin embargo, esta última característica podría constituir un riesgo de malignidad debido al potencial infinito de multiplicaciones que poseen las células madres embrionarias. Por otro lado, las SHED no constituyen una buena fuente de tejido para regenerar un germen dentario debido a que no forman el complejo pulpo/dentinario y son solo inductoras de hueso, porque no se diferencian a osteoblastos. El tercer tipo de células madres de tejido dental lo constituyen las SCAP (Stem Cells from Apical Papila), obtenidas desde la papila apical de tercer molar incluido en estadios tempranos de desarrollo (Nolla, C-D-E); las cuales, se podrían considerar la fuente de las células de la pulpa radicular (odontoblastos productores de dentina coronal) y es tentador pensar que estas mismas SCAP dan origen a las DPSCs, pero no se ha demostrado que las SCAP se constituyen como DPSCs en la futura pulpa del diente adulto y se han demostrado varias diferencias entre estos dos tipos de MSCs. El trasplante de colonias SCAP in vivo, al igual que se realizó con las DPSCs en ratón inmunosuprimido, demostró que forman el complejo pulpo/dentinario, lo que le da ventajas por su potencial de desarrollo; por otro lado, otro tipo de estudios en el que se extrajo la papila apical a dientes en desarrollo, demostró que este tejido tiene un rol importante en la formación de la raíz porque aunque se mantuvo intacta la pulpa, el germen sin la papila no fue capaz de formar raíz. Así, se concluye que en el germen dental las células SCAP son fundamentales para el desarrollo de la raíz dental. El cuarto tejido dental en el que se caracterizó un grupo de MSCs, es el folículo dental; el cual, se puede obtener desde terceros molares incluidos humanos en desarrollo temprano, separando el ectomesénquima que rodea al órgano del esmalte en la papila dental. Este tejido contiene células madres clonogénicas (Dental Follicle Precursor Cells, DFPCs) que en cultivo muestran multipotencialidad miogénica, neurogénica, adipogénica, condrogénica, además del potencial cementogénico y odontogénico; las que, transplantadas in vivo dan origen a tejido fibroso similar al ligamento periodontal, pero no forman dentina, cemento, ni hueso. Por otro lado, células inmortalizadas del folículo dental si son capaces de formar el ligamento periodontal completo cuando son trasplantadas in vivo, sin embargo la complejidad de esta técnica de inmortalización las hace difíciles de usar en clínica. A partir de los antecedentes descritos anteriormente, queda claro que la regeneración del órgano dental requiere más de un tipo de células madres dado su origen epitelio- mesenquimal y a pesar de los avances recientes en las propiedades de las células madres, aún falta una solución biológica que permita anclar el diente al nicho alveolar y devuelva la funcionalidad al sistema masticatorio del individuo a partir de un tipo de células madres. El ligamento periodontal contiene células capaces de diferenciarse a cementoblastos y osteoblastos; sin embargo, también contiene un reservorio de células madres con las características de las MSC denominadas células madres del ligamento periodontal (Periodontal Ligament Stem cells, PDLSCs), estas células aisladas en cultivo se caracterizan por responder a la inducción con los correspondientes medios para diferenciarse a adipocitos, condrocitos y osteoblastos. Además, se demostró su capacidad de diferenciación a precursores neuronales. El trasplante de PDLSCs, en ratones inmunosuprimidos demostró la formación de ligamento periodontal conteniendo fibras de Sharpey unidas al cemento formado por estas células similares a lo observado en condiciones fisiológicas en un individuo; más aún, el trasplante de estas células a la región periodontal de ratas con daño inducido quirúrgicamente, mostró que el tejido periodontal formado se adhiere a la superficie alveolar y a la superficie del diente. Hasta la actualidad todas las publicaciones indican que los transplantes de células madres dentales se han realizado con inmunosupresión del animal y solo usando modelo reparativo en ratas o en cerdo. La presente invención muestra un constructo que puede contener células madres adultas de ligamento periodontal de dientes extraídos en clínicas dentales y que evita el rechazo inmunológico al ser usadas en el tratamiento de enfermedades o condiciones relacionadas con la dentadura humana, sin el uso de inmunosupresión. El intento de regenerar un diente completo lo iniciaron grupos de investigación experimentando mediante recombinación heterotípica de tejidos dentales que tiene la complejidad de requerir la formación de cuatro tipos de tejidos distintos: pulpa, dentina, cemento (estos dos últimos de origen mesenquimático), y finalmente, esmalte, tejido mineralizado de origen epitelial, el más duro del cuerpo humano. Este esmalte es secretado por los ameloblastos que existen sólo durante el desarrollo, una vez erupcionado el diente los ameloblastos mueren. El proceso de mineralización toma más de seis años, desde la sexta semana de vida intrauterina hasta la infancia en que ocurre el recambio de los dientes primarios, que no poseen raíz dental, por los dientes definitivos que si no son dañados permanecerán en boca hasta la muerte del individuo debido a que poseen raíz dental. Estos tejidos mineralizados, se unen desde la raíz al nicho alveolar óseo mediante el ligamento periodontal, que también debe ser regenerado si se pierde por razones patológicas o traumáticas. Sin embargo, esta regeneración del ligamento periodontal solo tomará un par de meses comparado con los años que normalmente tomaría regenerar los tejidos mineralizados. Sin el descubrimiento de las células madres, la odontología se enfocó en reemplazar la raíz dental para recuperar la función de oclusión mediante prótesis artificiales denominadas implantes dentales.
Los implantes dentales existentes en la actualidad en el comercio se componen de una base metálica generalmente de titanio. Estos metales son implantados en el hueso alveolar sin lograr regenerar el complejo periodontal, por lo que no tienen una relación natural debido a la falta de disipación y transmisión de fuerzas, falta de propiocepción y falta de estereognosis. Estas son propiedades que posee sólo el diente natural o biológico, debido a que sólo las células pueden estructurarse para formar vasos sanguíneos, inervaciones y matriz extracelular rica en fibras además de producir nutrientes, señales químicas y eléctricas que informen al cerebro de la propiocepción, dimensión tridimensional volumétrica, transmisión y dispersión de fuerzas masticatorias que finalmente ayudan a mantener la homeostasis del hueso alveolar y la señal de vida del diente que prolonga la edad competitiva del individuo y evita el envejecimiento prematuro.
Por otro lado, los implantes de titanio son susceptibles de aflojarse o de producir infecciones como gingivitis o periodontitis, debido a la relación no natural entre el hueso y el implante metálico.
El mercado mundial de los implantes dentales metálicos para el año 2010 fue de 3.200 millones de dólares aproximadamente. Al año 2015 hubo una tasa de crecimiento anual de un 6%, alcanzando un valor de 4.200 millones de dólares. Si se considera que el mercado latinoamericano es de un 10%, se tiene un mercado potencial de 420 millones de dólares para el año 2015.
Por lo tanto, se hace fundamental desarrollar un producto que permita el implante o desarrollo de piezas dentales de base biológica para la regeneración dental, que eviten el envejecimiento prematuro de tejidos dentales, que proporcionen mayor bienestar y calidad de vida, y que tengan mayor biocompatibilidad a la vez que reduzca los problemas generados por la relación no natural entre el hueso y el implante metálico. Ante tal problemática, la presente solicitud presenta un constructo que contiene colágeno que sirve de soporte para el implante de piezas de base biológica, que aparece como una alternativa a los implantes actualmente utilizados, y que además mejora la biocompatibilidad reduciendo drásticamente los niveles de rechazo hasta prácticamente cero. De este modo, la presente solicitud comprende productos tales como un constructo para evitar el rechazo inmunológico producido cuando se usa en trasplante en el tratamiento de enfermedades (sin el uso de drogas inmunosupresoras), ya sea xenotrasplante o alotrasplante, un método de obtención de este constructo, un método para producir colágeno en estado de gel, ya sea en forma 3-D o como moldeados de colágeno esponjoso liofilizado seco con la forma del elemento a trasplantar, y el uso del mismo.
En el arte previo existe la publicación US 20100196854 que describe un método de reconstrucción de dientes utilizando un portador de un material bio-compatible que puede incluir hidroxiapatita cargado con células madres Stem cells of apical papilla (SCAPs), Periodontal Ligament Stem Cells (PDLSC) y Dental Pulp Stem Cells (DPSC), que podría ser usado especialmente como reconstructor de la raíz. Sin embargo este documento no hace referencia a que el material bio-compatible es colágeno ni menos se especifican las etapas específicas y componentes necesarios para producir el constructo de la presente invención. Por lo cual, tampoco expone el uso de un producto en base a colágeno para evitar el rechazo inmunológico de un implante de origen alogénico.
El documento EP1920788A1 está relacionado con una matriz que contiene células madre mesenquimales y plasma rico en plaquetas, para su uso en la preparación de implantes para el tratamiento de patologías periodontales o de hueso, en donde dicha matriz puede contener colágeno, sin embargo la presente invención no enseña ni sugiere que el producto contiene plasma rico en plaquetas. Por otro lado, este documento tampoco enseña ni sugiere el constructo con los elementos particulares de la presente invención ni los pasos para obtenerlo. Adicionalmente, existen publicaciones científicas que describen el uso de células madres en el implante de piezas dentales con matrices apropiadas, tales como Zhou Y. et al. Periodontal healing by periodontal ligament cell sheets in a teeth replantation model. Arch. Of Oral Biology 57 (2012) 169-176, y Zhao et al. The combined use of cell sheet fragments of periodontal ligament stem cells and platelet-rich fibrin granules for avulsed tooth reimplantation. Biomaterials 34 (2013) 5506-5520; sin embargo, ninguno de estos documentos describen el constructo de la presente invención con los elementos particulares descritos, así como tampoco el método para fabricarlo, ni menos el uso de células madres alogénicas o heterólogas para crear constructos que evitan el rechazo inmunológico, como sí lo hace la invención presente. Por lo tanto, es necesario contar con productos útiles en trasplante, ya sean alotrasplantes o xenotrasplante y métodos que los produzcan que no presenten rechazo inmunológico cuando son trasplantados, y que no haya infección de xenovirus durante el trasplante. Para resolver este problema técnico, se presenta un constructo que evitar el rechazo inmunológico producido cuando se usa en trasplante en el tratamiento de enfermedades (sin el uso de drogas inmunosupresoras), ya sea xenotrasplante o alotrasplante; un método de obtención de dicho constructo; un método para producir colágeno en estado de gel, ya sea en forma 3-D o como moldeados de colágeno esponjoso liofilizado seco con la forma del elemento a trasplantar; y por último, el uso del constructo para evitar el rechazo inmunológico producido durante el trasplante del mismo.
Una de las ventajas de la presente invención es la independencia de la fuente de células, donde esta independencia acarrea beneficios técnicos (por ejemplo facilidad en cultivo de células, sin depender de una fuente fija o definida) y económicos (por ejemplo menores requisitos para mantención de cultivo celular en comparación a obtención de células desde el mismo paciente)
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1 . Se muestra los resultados de la optimización del medio de cultivo usado en cultivos de células madres del ligamento periodontal. En la presente solicitud se seleccionó el medio a-MEM, estándar para cultivo de células madres, debido a que el tiempo de doblaje es el óptimo reduciendo el tiempo a menos de la mitad para este tipo celular comparado con el medio D-MEM alto en glucosa.
Figura 2. Se muestra los resultados de la caracterización de células madres dentales mediante citometría de flujo. De acuerdo a los resultados obtenidos se estableció que es recomendable usar hasta el séptimo pasaje las células madres dentales congeladas para realizar los constructos de la presente invención con el máximo potencial de las células. La figura muestra que los marcadores para células madres permanecen presentes según lo esperado para CD90, CD29 y STRO-1 ; en tanto, que siempre ausentes para CD34. Además son negativas para CD-14 (no mostrado). Figura 3. Se muestra el control microbiológico de tejido para obtención del producto de colágeno, mediante la metodología descrita en la presente solicitud. Corresponde a UFC/placa en tejido de cerdo tratado con povidona yodada o ácido peracético. Se ensayó varios desinfectantes usados en la literatura y se compararon con el procedimiento descrito en la presente invención (povidona yodada); los resultados en triplicado demostraron que la povidona yodada fue el único 100 % efectivo para desinfección de la piel de cerdo, previo a someterla a la extracción. En la gráfica se muestra la comparación con el ácido peracético, como ejemplo. Abreviaturas: PY - Povidona Yodada, AP - Ácido Peracético, UFC - unidades formadoras de colonias, CC - control de campana de trabajo. Figura 4. Se muestran resultados del control microbiológico. Las fotografías de las placas de cultivo muestran el crecimiento inicial de colonias bacterianas al inicio (tiempo 0), y la disminución de UFC a los 5 minutos, 30 minutos, 1 hora y 3 horas de exposición al desinfectante; en el panel superior povidona yodada (PY) y en el panel inferior ácido peracético (AP). La povidona yodada resultó más efectiva y elimina totalmente la formación de colonias bacterianas a las 3 horas, mientras que con el ácido peracético aún persiste la presencia de una colonia.
Figura 5. Se muestran fotografías de los cultivos de células madres obtenidas a partir de ligamento periodontal, cultivadas en (A) medio a-MEM y (B) cultivadas en el mismo medio sobre el producto de colágeno (específicamente la matriz 3-D de colágeno), obtenido según la presente invención.
Figura 6. Se muestra en gel de SDS-Page, la migración electroforética del extracto de colágeno a concentraciones de 3,0 μg, 15,0 μg y 30 μg obtenido del análisis de los componentes del producto de colágeno obtenido desde la piel de cerdo con el método aquí descrito. Se observan el patrón típico de colágeno, en el cual se distinguen las cadenas α1 , a2 y β; y con mayor claridad con mayor concentración del extracto entre 15 μg y 30 μg total.
Figura 7. Se muestra corte histológico de la matriz 3-D conteniendo las células madres del ligamento dental humano creciendo en la matriz de colágeno 3-D, mostrando sus núcleos teñidos con el compuesto fluorescente DAPI. Se observa el producto de colágeno producido para mantener células madres del ligamento periodontal en cultivo. La presencia de las células en la matriz fijada, incluida en parafina y cortada con micrótomo se muestra mediante inmunofluorescencia de los núcleos con tinción DAPI (40X). Se observan los núcleos distribuidos a lo largo de la matriz evidenciando que las células se integran en la malla de colágeno. Este producto con células es usada para cubrir el elemento a trasplantar.
Figura 8. Se muestra un ejemplo del biodiente humano con ligamento periodontal regenerado fuertemente adherido a la matriz del diente, de tal manera que es posible sostenerlo con una pinza al extraerlo del dorso del ratón (figura A); en la figura B) y C) del centro e inferior se muestran cortes histológicos de este diente después de desmineralización, donde se observa la estructura de los túbulos dentinarios de la dentina (D) cortados transversalmente y sagitalmente, con clara presencia de cemento (C) y fibras del ligamento periodontal (PDL) en íntima asociación con la superficie de la dentina. Por otro lado, el mareaje con anticuerpos contra las mitocondrias humanas confirma claramente la presencia de las células humanas diferenciadas a partir de las células madres humanas en el constructo implantado en ratón sin inmunosupresión.
DESCRIPCION DE LA INVENCIÓN
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un constructo para trasplante, ya sea xenotrasplante o alotrasplante, que no genera rechazo inmunológico, que comprende: a) células con capacidad regenerativa; b) colágeno en estado de gel 3-D, o también llamado matriz 3-D de colágeno, obtenido de mejillas de cabeza de cerdo; c) medio de cultivo; d) un elemento destinado a trasplantar; y e) colágeno esponjoso liofilizado seco moldeado con la forma del elemento a trasplantar.
El constructo está conformado de forma que las células con capacidad regenerativa (a) están cultivadas sobre el colágeno en estado de gel 3-D (b), y el medio de cultivo (c) se encuentra sobre las células con capacidad regenerativa (a); dicho medio de cultivo con células y colágeno en estado de gel 3-D está envolviendo el elemento destinado a trasplantar (d); el elemento a trasplantar envuelto con células y el colágeno 3-D está dentro del colágeno esponjoso liofilizado seco moldeado (e), de tal manera que el producto resultante queda inmerso y rodeado de una segunda capa de colágeno liofilizado seco.
En una realización específica, las células con capacidad regenerativa (a) se seleccionan del grupo que comprende: células madres alogénicas o autólogas, o células madres inducidas o células progenitoras de líneas celulares conducentes a tejidos específicos, o fragmentos de tejidos de órganos mantenidos vivos o en desarrollo. Más específicamente, las células madre son células que se seleccionan del grupo que comprende: células mesenquimales de origen adiposo, médula ósea, cordón umbilical, pulpa dental, papila dental, folículo dental, ligamento periodontal, epitelio bucal, ligamento condilar, músculo cardíaco, epitelios de recubrimiento, huesos planos maxilofaciales o craneales, células progenitoras óseas, endoteliales. Estas células madres son alogénicas o autólogas.
En una realización específica, el elemento a trasplantar (d) se selecciona del grupo que comprende: diente, hueso craneal, hueso maxilo facial, hueso iliaco, huesos largos, órgano dental en desarrollo, riñon, hígado, corazón, tubo traqueal, pulmón, cornea, nervios motores, ligamentos, cartílago, piel. Específicamente, el elemento a trasplantar es diente mineralizado adulto humano. En caso de que sea diente, el constructo para trasplante puede llamarse bio-diente.
En un segundo aspecto de la presente invención, se describe un método para producir el constructo para trasplante, ya sea xenotrasplante o alotrasplante, que no genera rechazo inmunológico, que comprende las etapas de: a) preparar un elemento destinado a trasplantar fresco a temperatura ambiente entre 20 a 25°C, o previamente mantenido en frío entre 4eC a 10eC o congelado (-20eC hasta -170eC en criopreservación); b) recubrir placas de cultivo con el colágeno en estado de gel 3-D en forma de una lámina sobre la placa, luego depositar las células con capacidad regenerativa, tal como, células madres alogénicas o autólogas, o células madres inducidas o células progenitoras de líneas celulares conducentes a tejidos específicos, o fragmentos de tejidos de órganos mantenidos vivos o en desarrollo, y cubrir con el medio de cultivo según el tipo celular e incubar hasta evidenciar por observación microscópica la incorporación de las células a la matriz tridimensional desde 4 horas a 24 horas; c) disponer de colágeno esponjoso liofilizado seco moldeado con la forma del elemento a trasplantar; d) tomar la lámina de cultivo con células madres de la etapa (b), eliminar el exceso de medio de cultivo por contacto sobre papel absorbente y enrollar completamente sobre el elemento a trasplantar; e) cubrir o sumergir el constructo obtenido de la etapa d), que consta del elemento a trasplantar incorporado en la matriz 3-D de colágeno, en los moldeados de colágeno de la etapa (c); de tal manera que, el constructo tridimensional de colágeno 3-D tipo gel queda inmerso y rodeado de una segunda capa de colágeno esponjoso liofilizado seco (tipo molde esponjoso con o sin entrecruzamiento, descrito en la especificación para el diente) y moldeado de acuerdo a la forma del implante y f) almacenar congelado a una temperatura entre -80eC a -150°C hasta su uso.
En una realización específica, el elemento a trasplantar de la etapa a) se selecciona del grupo que comprende: diente, hueso craneal, hueso maxilo facial, hueso iliaco, huesos largos, órgano dental en desarrollo, riñon, hígado, corazón, tubo traqueal, pulmón, cornea, nervios motores, ligamentos, cartílago, piel. Específicamente, el elemento a trasplantar es diente mineralizado adulto humano. En caso de que sea diente, el constructo para trasplante puede llamarse bio-diente. En una realización particular, en el caso de que el tejido a trasplantar sea un diente, se considera el siguiente método para tratar el diente previo a la etapa a): i) descelularizar, mediante enjuague con agua ultrafiltrada, sumergido en una solución de 17% EDTA entre 5 a 15 minutos a pH neutro (7,0 a 7,2) a temperatura ambiente (20 a 25°C) y luego mantenidos entre 30 segundos a 5 minutos en una solución de entre 10 a 30% ácido cítrico y se lava con agua ultrapura. ii) desinfectar, sumergiendo en povidona yodada entre 30 a 90 minutos con agitación, se enjuaga y se desinfecta con una solución de NaOH a pH 14 en buffer por un período de tiempo entre 5 a 15 minutos para finalmente enjuagar en agua ultrapura hasta llevar a pH entre 5 a 9 y se mantiene en solución salina o buffer fosfato salino (PBS) estéril, en frío, o en etanol 70%, o se mantiene en seco en envase estéril hasta su uso.
Adicionalmente, si los ápices radiculares están cerrados se pueden abrir para realizar una limpieza radicular y cameral usando las técnicas convencionales de endodoncia con una lima tipo H o K, previo a la descelularización, quedando la pieza dental con su canal y raíz libre de células, manteniendo la parte mineral y orgánica.
En otra realización específica, las células madre de la etapa b) son células madre que se seleccionan del grupo que comprende: células mesenquimales de origen adiposo, médula ósea, cordón umbilical, pulpa dental, papila dental, folículo dental, ligamento periodontal, epitelio bucal, ligamento condilar, músculo cardíaco, epitelios de recubrimiento, huesos planos maxilofaciales o craneales, células progenitoras óseas, endoteliales. Estas células madres son alogénicas o autólogas.
Estas células madres son cultivadas en las siguientes condiciones: Extraer ligamento periodontal desde el tercio inferior radicular de una pieza dental, pudiendo ser un tercer molar erupcionado o cualquier diente erupcionado, obtenido del paciente o donante, o de una pieza dental animal (cerdo, perro u otro); se tritura en solución salina (PBS), se traspasa a platillos cubiertos de una matriz 3-D de colágeno y se agrega medio de cultivo a-MEM con FBS (10% a 15%) o con suero humano autólogo (10% a 15%) para obtener las células madres. Una vez alcanzada la confluencia de 60% a 75% se digiere con enzimas colagénicas, y a continuación, se expanden en medio a-MEM con FBS o con suero humano autólogo, pudiendo ser usadas para implantes desde la primera expansión hasta el séptimo pasaje, fresco o después de congelar y descongelar; durante el cultivo el proceso de selección celular permite obtener células madres caracterizadas por citometría de flujo o una mezcla de células madres con otros tipos de células en vías de diferenciación.
Alternativamente, previo a su uso las células se pueden obtener directamente en platillos de cultivos sin colágeno mediante extracción enzimática y cultivo en medio a- MEM con 10% o 15% FBS o con 10% a 15% suero humano autólogo hasta que lleguen a una confluencia óptima (60% a 75%) para expandir y congelar hasta su uso. Al momento de su uso se cultivan sobre la matriz de colágeno 3-D como se describen anteriormente y se usa la lámina con células para enrollar completamente sobre el elemento a trasplantar de la etapa a) del método para producir un constructo para trasplante.
Además, previo a cubrir el diente con la matriz de colágeno 3-D y células madres, se rellena la cavidad pulpar de la matriz mineralizada y descelularizada del diente a trasplantar con células madres de la pulpa dental (DPSCs) de dientes erupcionados y extraídos por indicación ortodóncica o las células del ápice de un tercer molar en desarrollo (SCAPs) o las DPSCs de este tipo de diente, alogénicas o autólogas crecidas y mantenidas por el método estándar de expansión de células madres mesenquimales de origen dental usando de preferencia el medio a-MEM en la matriz 3-D de colágeno descrita aquí, con o sin VEG (factor de crecimiento de vasos sanguíneos) o alternativamente, en lugar de células madres dentales se introducen células en vías de diferenciación mediante una corta inducción en un medio estándar para diferenciación odontoblástica que contiene de preferencia el medio de cultivo a- MEM, suplementado con 10% FBS (o suero autólogo) junto a ácido ascórbico, glicerol fosfato. Este procedimiento se realiza con la ayuda de una jeringa de tal manera que el gel de colágeno conteniendo las células llena completamente la cavidad pulpar; luego, se procede como lo descrito en esta sección desde (d) en adelante para completar el constructo con la lámina de gel conteniendo células madres del ligamento periodontal y el moldeado esponjoso que permitirá el implante dental en nicho alveolar.
En caso de que el elemento a trasplantar sea hueso maxilofacial, se somete a las etapas de: i) limpiar tejidos anexos, inmersión en buffer Tris-NaCI o PBS entre 30 segundos a 5 minutos o en 70% etanol entre 1 y 5 minutos, y luego enjuague en agua ultrapura para recubrir con la matriz de colágeno 3-D sembrado con células madres mesenquimales o células precursoras; ii) alternativamente, luego de la limpieza descrita en (i) se somete a descelularización siguiendo los mismos pasos que para el diente.
La descelularización se realiza aplicando los mismos principios descritos previamente para la matriz mineralizada de una pieza dental, (exceptuando el proceso endodóntico) se usa un ácido diluido (por ejemplo ácido clorhídrico) por 15 minutos o más, dependiendo del tamaño del fragmento de hueso, y se descelulariza por un rango de 15 minutos a varias horas (3 a 8 horas según el tamaño del fragmento de hueso) con acetona o una solución de ácido nítrico diluido. Finalmente, se enjuaga en agua ultrapura estéril por 24 horas y se sumerge en etanol entre 60% y 90% hasta su uso.
El hueso descelularizado se recubre con la mezcla de matriz 3-D de colágeno-células madres mesenquimales o precursores osteoblásticos, conteniendo el medio estándar de cultivo a-MEM suplementado con 10% FBS, dexametasona, ácido ascórbico, glicerofosfato. Estos elementos son insertados en un moldeado de colágeno sometido a entrecruzamiento según lo ya descrito anteriormente y se trasplanta en el organismo sin inmunosupresión.
En un tercer aspecto de la presente invención, se describe un método para producir el colágeno en estado de gel, ya sea en estado gel 3-D donde se cultivan las células con capacidad regenerativa o como moldeados de colágeno esponjoso liofilizado seco con la forma del elemento a trasplantar, que comprende: a) Desinfectar un segmento de piel de cerdo (específicamente mejilla de cabeza de cerdo) sumergiéndolo en una solución comercial de povidona yodada en una concentración entre 1 % y 30%, por un período de 3 a 6 horas, y posteriormente se cepilla vigorosamente por ambas caras y se enjuaga con agua calidad ultra-pura; b) extraer y triturar la dermis del segmento de piel obtenido de la etapa a), y posteriormente mezclar con una solución entre 1 y 10 M de acetato de sodio, y se eleva el pH entre 10 a 14 con una solución de hidróxido de sodio entre 10 a 15 M durante un período de tiempo entre 30 minutos y
2 horas a temperatura ambiente (20 i!eC a 25eC) para esterilizar la solución y extraer las proteínas; c) lavar la mezcla resultante de la etapa b) 2 a 7 veces con una solución de acetato de sodio entre 1 M y 10M, colectando las proteínas mediante centrifugación a igual o más de 9.000 rpm en frío entre 0 y 10eC; seguido de 2 a 7 lavados con agua calidad ultra-pura mediante el mismo método de centrifugación; luego el sedimento se solubiliza en una solución de ácido acético diluido entre 0,01 N y 0,5N en una proporción de 1 It por 1 ,5 gr del sólido, mediante agitación entre 0 y 10eC; d) recuperar mediante centrifugación entre 0 y 10eC a igual o más de 9.000 rpm, y después separar las partículas sólidas en suspensión de la solución mediante filtración en gasa y; posteriormente, la solución se congela (-20eC a -30eC) y se somete a un proceso de liofilización para eliminar el agua; y e) mantener congelado el producto de la liofilización hasta su uso, obteniendo el colágeno en forma de gel.
Alternativamente, la piel de cerdo desinfectada obtenida en la etapa a) se congela entre -80°C a -196°C para mantenerlo almacenado hasta su uso.
Método de preparación de moldeados de colágeno
Adicionalmente, el colágeno obtenido por el método descrito anteriormente desde las etapas a) a e) puede presentarse en la forma de moldeados esponjosos liofilizado seco para enrollar los elementos a trasplantar siguiendo las siguientes etapas adicionales: f) masar el liofilizado de la etapa e) y disolver en ácido acético (0,5N o mayor concentración) a 4eC (±1 ,0eC), hasta obtener una concentración de 20 a 30 mg/ml; g) introducir el producto disuelto de la etapa f) en moldes plásticos estériles de acuerdo al tamaño y forma del implante, h) congelar a una temperatura entre -20eC a -24eC al menos 24 horas; i) liofilizar el producto congelado de la etapa h) y j) desprender el producto de los moldes de plástico usando una espátula para ser almacenada en un lugar seco a temperatura ambiente (20 a 25°C) hasta el momento de su uso (puede ser almacenada por al menos 12 meses).
Los moldes de la etapa g) pueden ser láminas delgadas o gruesas, o conos de variado grosor, o túbulos de variado grosor, u otra forma según convenga al tejido a trasplantar.
Adicionalmente, los moldeados de colágeno esponjoso obtenidos según las etapas f) a la j) se tratan mediante procedimientos propios de entrecruzamiento con material no tóxico (inocuo), controlando la densidad del colágeno moldeado, a través de las siguientes etapas: i. sumergir e incubar el colágeno (moldeados esponjosos) a temperatura ambiente (20eC a 25eC) en una solución a base de 2,3% p/v de N- hidroxisuccinimida (NHS) y 3,83% p/v N-(3Dimetilaminopropil)-N'- etilcarbodiimida clorohidrato) (EDC) en un volumen entre 1 y 40 mi de etanol 70%, y posteriormente realizar lavados de este colágeno en agua ultra pura estéril; ¡i. congelar el colágeno a una temperatura entre -50 y -5 °C entre 12 y 36 horas y luego se liofilizan en las mismas condiciones anteriores, lo cual se denominará moldeados tipo esponja por su nueva consistencia, más firme que el gel de la etapa e).
Método de preparación de matriz 3-D de colágeno
Opcionalmente, el colágeno obtenido después de la etapa e), puede ser presentado como una matriz 3-D de colágeno en estado de gel para el cultivo de células con las siguientes etapas adicionales: i) masar el producto liofilizado obtenido de la etapa e) y disolver en ácido acético (0,01 N a 0,05 N) en frío 4eC (±1 ,0eC) hasta obtener una concentración final requerida entre 2,0 mg/ml a 5,0 mg/ml; ii) tomar el producto completamente disuelto de la etapa k) y dializar en cloroformo en una concentración entre 0,5% y 5% para eliminar impurezas, seguido de diálisis en ácido acético diluido (0,01 N a 0,05 N) en frío 4eC (±1 ,0eC); iii) obtener una matriz biológica 3-D de colágeno tipo gel o en estado de gel que proporciona ambiente tridimensional a las células en cultivo; y iv) almacenar el producto en frío sin congelar a temperatura entre 4eC a 10eC.
En un último aspecto, la presente invención se refiere al uso de dicho constructo para evitar el rechazo inmunológico producido durante el trasplante del mismo.
En el caso de que el constructo final sea un biodiente, éste se utiliza para cualquiera de los 32 dientes humanos, o de mascotas o animales con raíz dental. EJEMPLOS DE APLICACIÓN
Ejemplo 1 : Obtención del colágeno de piel de cerdo y fabricación de la matriz 3-D de colágeno i. Esterilización y congelado del tejido: Se usó piel de la mejilla de cabezas de cerdo de 175 a 190 días de edad. La cual, se sumergió durante 3,5 horas en una solución comercial de povidona yodada 10% (Marca: Centrovet) y cepillada por ambas caras cada 30 minutos, en ambiente estéril, y se enjuaga con agua calidad ultra-pura. La tabla 1 y las figuras 3 y 4, muestran los resultados de análisis de efectividad de la povidona yodada (PY) usada en la presente invención, comparada con la efectividad de ácido peracético (AP); demostrando que la povidona es más efectiva, dado que elimina el 100% del crecimiento microbiano a las 3 horas post tratamiento y mantiene la integridad del colágeno obtenido más adelante, mientras que el ácido peracético daña la calidad del colágeno alterando la viscosidad del producto final, de tal manera que no adquiere la consistencia necesaria para ser usado en los implantes. El tejido desinfectado se introduce en bolsas y sella para congelar a -80°C (±2,0eC) en ultracongelador (marca Thermoline).
Tabla 1 . Tratamiento del tejido de cerdo con desinfectantes.
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Descongelación y limpieza del tejido: El tejido congelado se pone sobre superficie fría (4°C), en ambiente estéril para retirar el tejido adiposo y el epitelial con la ayuda de un bisturí. La dermis, así obtenida, se cortó en trozos de 1 cm2 aproximadamente, y se molió en 200 ml_ de una solución de 5M acetato de sodio (Marca: JT Baker) con una trituradora de alimentos en pulsos cortos de menos de 5 segundos cada uno para evitar elevación de la temperatura. La eliminación de posibles patógenos en esta etapa se realizó ajusfando el pH de la solución a pH14 con una solución 12 M NaOH por 1 hora y 10 minutos a temperatura ambiente (20eC a 25eC).
Extracción y solubilización de colágeno: La mezcla de tejido molido y desinfectado se lavó 5 veces con 5M acetato de sodio estéril, mediante centrifugación a 9500 rpm por 20 minutos en frío en centrífuga marca Hettich a 4°C. Seguido de 5 lavados con agua ultrapura estéril mediante el mismo método de centrifugación. El sedimento final se extrajo en 2 litros de 0,02 N ácido acético por cada 3,0-3,2 gr de sedimento usando una licuadora de acero inoxidable con pulsos de 45 segundos en condiciones de esterilidad. Seguido de agitación en frío por 50 horas.
Purificación y congelado de colágeno: La solución de colágeno obtenida se limpió de impurezas mediante centrifugación a 9500 rpm por 20 minutos en centrifuga marca Hettich a 4°C y se filtró volúmenes de 100 mi en gasa hidrófila (estéril de uso terapeútico) doblada en 10 pliegues sobre frasco estéril. Estos extractos se congelaron a -20eC por 48 horas para proceder a la etapa de liofilización.
Liofilización: Se liofilizaron volúmenes de 100 mi de extracto congelado a -85eC con presión constante en liofilizador marca Labconco por aproximadamente 48 horas hasta sequedad de las muestras.
Obtención de matriz 3-D de colágeno: Se masó el producto obtenido (colágeno seco) y se disolvió en proporción de 90 mg por 30 mi de 0,02 N ácido acético estéril, a 4eC con agitación ocasional hasta su completa disolución. Esta solución se introdujo en membranas de diálisis ((SnakeSkin Dialysis Tubing, Marca Thermoscientific) y se dializó contra 1 % cloroformo por una hora y luego, contra 0,02 N ácido acético realizando cambios de la solución hasta eliminar el cloroformo. El gel obtenido se retiró de la bolsa de diálisis y se guardó a 4eC en envase estéril.
vi. Prueba de esterilidad y análisis: se tomaron alícuotas del colágeno obtenido en forma gel y se incubaron a 37eC en la incubadora con 5% C02 por 48 horas para monitorear su esterilidad. También se analizó su composición proteica mediante electroforesis en geles de poliacrilamida SDS-Page; lo cual, mostró el patrón típico de colágeno tipo-1 . En la figura 6, a concentración de 3,0 mg se distinguen las cadenas α1 , a2 y β; las que se observan con mayor claridad al aumentar la cantidad a 15mg y 30mg del extracto de colágeno obtenido, vii. El colágeno obtenido a una concentración de 3,0 mg/ml (+/-0,1 mg, aproximadamente) se usó para cubrir placas de cultivo celular y para mezclar con solución de células obtenidas desde tejidos frescos dentales u óseos; este colágeno le da un ambiente tridimensional (3-D) a las células en cultivo.
Ejemplo 2: Método de fabricación de los moldeados esponjosos liofilizado seco de colágeno.
La matriz de colágeno esponjosa usada para trasplantes del biodiente o de hueso, o gérmenes de dientes alogénicos se preparó a partir del colágeno liofilizado obtenido según el procedimiento en el ejemplo 1 hasta el punto (v). Se masó un mínimo de 200 mg del colágeno seco, se disolvió en una solución de 10 mL 0,5 N ácido acético y se introdujo con la ayuda de una espátula a moldes plásticos estériles para luego, una vez solidificado, introducir el elemento a trasplantar. El moldeado para constructo de dientes tiene forma de cilindro tapado por uno de sus extremos con paredes de 2 mm de grosor y una profundidad de 2 cm aproximadamente, de tal manera que la pieza dental a trasplantar se introdujo totalmente en su interior. Estos moldeados se congelaron a -20eC por al menos 48 horas y luego, se sometieron al proceso de sublimación del agua mediante liofilización en liofilizador marca labconco.
El entrecruzamiento de las fibras de colágeno de estos moldeados se realizó por seis horas en solución de 70% etanol conteniendo 0,230 gr de NHS y 0,383 gr de EDC a temperatura ambiente (20eC-25°C).
Luego, se enjuagaron por seis horas estos moldeados en agua ultrapura, se congelaron a -20eC y se sometieron al proceso de liofilización en las mismas condiciones anteriormente descritas aquí.
Ejemplo 3: Método de fabricación del biodiente o constructo para trasplantar.
Se obtuvo matrices de dientes humanos (premolar de jóvenes menores de 21 años de edad), se descelularizaron y limpiaron según lo descrito en la presente solicitud, se limpió la cámara pulpar y raíces, se trató por 10 minutos con 17% EDTA y por 1 minuto con ácido cítrico para luego desinfectar con povidona yodada y NaOH y finalmente, después del enjuague se mantuvieron en 70% etanol hasta su uso. Se realizó el cultivo de células madres del ligamento periodontal según descrito anteriormente, específicamente se usó placas desechables de 60 mm de diámetro marca Nunc y el medio de cultivo a-MEM (Invitrogen) con 15% suero fetal bovino (FBS, Invitrogen), sobre una capa de colágeno 3-D preparado de acuerdo a nuestro método descrito aquí. Se esperó llegar a confluencia del 70% aproximadamente, se retiraron los residuos de tejidos de ligamento y se extrajo las células desde el colágeno mediante tratamiento con 3,0 mg/ml colagenasa tipo-1 (Invitrogen) por 5 minutos a 37eC, dispersando con pipeta varias veces, y colectando por centrifugación, 3 veces. Se expandió el cultivo en proporción de 1 :3, en platillos de 100 mm cubiertos de la matriz 3-D de colágeno. La figura 1 , muestra los resultados de la optimización del medio de cultivo usado en nuestros cultivos de células madres del ligamento periodontal, por lo cual, se usó las células cultivadas, congeladas y expandidas hasta el quinto traspaso en este medio. La figura 2, muestra los resultados de la citometría de flujo para las células cultivadas en estas condiciones. Ejemplo de expansión de las células madres del ligamento periodontal cultivado en medio a-MEM directamente sobre platillos de cultivo se muestra en la figura 5 (A); mientras que en la figura 5(B) se muestra un ejemplo de la expansión de estas células en medio 3-D de colágeno usando el mismo medio. La figura 7, muestra corte histológico de la matriz 3-D conteniendo las células madres del ligamento dental humano creciendo en la matriz de colágeno 3-D, mostrando sus núcleos teñidos con el compuesto fluorescente DAPI.
Una vez obtenida la confluencia aproximada del 70% se tomó la lámina de colágeno 3- D conteniendo las células madres del ligamento periodontal y se enrolló sobre la sección radicular de la matriz dental descelularizada, preparada y secada en ambiente estéril por 5 minutos (i), construyendo una matriz tridimensional de cinco capas (al menos) de células sobre esta matriz dental.
Ejemplo 4: Uso del biodiente, resultados obtenidos.
El biodiente construido con matrices dentales de dientes humanos y el colágeno 3-D conteniendo las células madres del ligamento periodontal se introdujo en un moldeado de colágeno entrecruzado según lo descrito aquí y se trasplantó bajo anestesia in vivo a ratones sin inmunosupresión, en regiones tales como, intraperitoneal o en el dorso bajo la piel para incubarlo durante 2 meses. Se realizó un implante por animal completando un total de veinte implantes con los constructos de biodientes humanos con colágeno según lo descrito aquí, sin uso de inmunosupresión. Los animales controles recibieron implantes de constructos humanos con células madres sin colágeno. Los protocolos de uso y cuidado animal fueron aprobado por el Comité Institucional del centro ADG l+D, las cirugías estuvieron a cargo de un veterinario e investigador con más de 30 años de experiencia en estudios experimentales en roedores de laboratorio. Los animales tratados con analgésicos, se les dejó con agua y comida ad libitum y fueron monitoreados las primeras horas para asegurar su bienestar; luego, con observación diaria, y cuidado de rutina hasta el momento en que se los sacrifica sin dolor mediante dislocación cervical.
Luego, se extrajeron los constructos, mediante una pinza. Se fijaron en 4% formaldehido en buffer PBS, durante una semana con agitación suave. Se desmineralizaron los constructos en 10% EDTA hasta obtener consistencia blanda al tacto con pinzas y se incluyeron en parafina para el proceso de histología de rutina con cortes en micrótomo. Los 20 trasplantes de biodientes construidos e implantados con moldeados de colágeno que se mantuvieron en animales sin inmunosupresión mostraron crecimiento del ligamento periodontal altamente adherido a la matriz de la raíz dental, en tanto que los constructos controles sin colágeno no mostraron desarrollo de tejido en su matriz mostrando destrucción y pérdida de las células madres humanas.
La figura 8 muestra un ejemplo del biodiente humano con ligamento periodontal regenerado fuertemente adherido a la matriz del diente, de tal manera que es posible sostenerlo con una pinza al extraerlo del dorso del ratón (fotografía superior); en la fotografía del centro e inferior se muestran cortes histológicos de este diente después de desmineralización, donde se observa la estructura de los túbulos dentinarios de la dentina (D) cortados transversalmente y sagitalmente, con clara presencia de cemento (C) y fibras del ligamento periodontal (PDL) en íntima asociación con la superficie de la dentina. Por otro lado, el mareaje con anticuerpos contra las mitocondrias humanas confirma claramente la presencia de las células humanas diferenciadas a partir de las células madres humanas en el constructo implantado en ratón sin inmunosupresión.

Claims

REIVINDICACIONES
1 . Un constructo para trasplante, ya sea xenotrasplante o alotrasplante, que no genera rechazo inmunológico, CARACTERIZADO porque comprende: a) células con capacidad regenerativa; b) colágeno en estado de gel 3-D, o también llamado matriz 3-D de colágeno, obtenido de mejillas de cabeza de cerdo; c) medio de cultivo; d) un elemento destinado a trasplantar; y e) colágeno esponjoso liofilizado seco moldeado con la forma del elemento a trasplantar.
2. El constructo de acuerdo con la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque está conformado de forma que las células con capacidad regenerativa (a) están cultivadas sobre el colágeno en estado de gel 3-D (b), y el medio de cultivo (c) se encuentra sobre las células con capacidad regenerativa (a); dicho medio de cultivo con células y colágeno en estado de gel 3-D está envolviendo el elemento destinado a trasplantar (d); el elemento a trasplantar envuelto con células y el colágeno 3-D está dentro del colágeno esponjoso liofilizado seco moldeado (e), de tal manera que el producto resultante queda inmerso y rodeado de una segunda capa de colágeno liofilizado seco.
3. El constructo de acuerdo con la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque las células con capacidad regenerativa (a) se seleccionan del grupo que comprende: células madres alogénicas o autólogas, o células madres inducidas o células progenitoras de líneas celulares conducentes a tejidos específicos, o fragmentos de tejidos de órganos mantenidos vivos o en desarrollo.
El constructo de acuerdo con la reivindicación 3, CARACTERIZADO porque las células madre son células alogénicas o autólogas que se seleccionan del grupo que comprende: células mesenquimales de origen adiposo, médula ósea, cordón umbilical, pulpa dental, papila dental, folículo dental, ligamento periodontal, epitelio bucal, ligamento condilar, músculo cardíaco, epitelios de recubrimiento, huesos planos maxilofaciales o craneales, células progenitoras óseas, endoteliales.
El constructo de acuerdo con la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque el elemento a trasplantar (d) se selecciona del grupo que comprende: diente, hueso craneal, hueso maxilo facial, hueso iliaco, huesos largos, órgano dental en desarrollo, riñon, hígado, corazón, tubo traqueal, pulmón, cornea, nervios motores, ligamentos, cartílago, piel.
Un método para producir un constructo para trasplante, ya sea xenotrasplante o alotrasplante, que no genera rechazo inmunologico, CARACTERIZADO porque comprende las etapas de: a) preparar un elemento destinado a trasplantar fresco a temperatura ambiente entre 20 a 25°C, o previamente mantenido en frío entre 4eC a 10eC o congelado a una temperatura entre -20eC hasta -170eC en criopreservación; b) recubrir placas de cultivo con el colágeno en estado de gel 3-D en forma de una lámina sobre la placa, luego depositar las células con capacidad regenerativa, tal como, células madres alogénicas o autólogas, o células madres inducidas o células progenitoras de líneas celulares conducentes a tejidos específicos, o fragmentos de tejidos de órganos mantenidos vivos o en desarrollo, y cubrir con el medio de cultivo según el tipo celular e incubar hasta evidenciar por observación microscópica la incorporación de las células a la matriz tridimensional desde 4 horas a 24 horas; c) disponer de colágeno esponjoso liofilizado seco moldeado con la forma del elemento a trasplantar; d) tomar la lámina de cultivo con células madres de la etapa (b), eliminar el exceso de medio de cultivo por contacto sobre papel absorbente y enrollar completamente sobre el elemento a trasplantar; e) cubrir o sumergir el constructo obtenido de la etapa d), que consta del elemento a trasplantar incorporado en la matriz 3-D de colágeno, en los moldeados de colágeno de la etapa (c); de tal manera que, el constructo tridimensional de colágeno 3-D tipo gel queda inmerso y rodeado de una segunda capa de colágeno esponjoso liofilizado seco y moldeado de acuerdo a la forma del implante y f) almacenar congelado a una temperatura entre -80eC a -150°C hasta su uso.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, CARACTERIZADO porque el elemento a trasplantar de la etapa a) se selecciona del grupo que comprende: diente, hueso craneal, hueso maxilo facial, hueso iliaco, huesos largos, órgano dental en desarrollo, riñon, hígado, corazón, tubo traqueal, pulmón, cornea, nervios motores, ligamentos, cartílago, piel.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7, CARACTERIZADO porque el elemento a trasplantar es diente mineralizado adulto humano.
9. El método de acuerdo con la reivindicación 6, 7 u 8, CARACTERIZADO porque previo a la etapa a), el diente mineralizado humano se trata de la siguiente manera: i) descelularizar, mediante enjuague con agua ultrafiltrada, sumergido en una solución de 17% EDTA entre 5 a 15 minutos a pH neutro entre 7,0 a 7,2 a temperatura ambiente entre 20 a 25°C y luego mantenidos entre 30 segundos a 5 minutos en una solución de entre 10 a 30% ácido cítrico y se lava con agua ultrapura; ii) desinfectar, sumergiendo en povidona yodada entre 30 a 90 minutos con agitación, se enjuaga y se desinfecta con una solución de NaOH a pH 14 en buffer por un período de tiempo entre 5 a 15 minutos para finalmente enjuagar en agua ultrapura hasta llevar a pH entre 5 a 9 y se mantiene en solución salina o buffer fosfato salino (PBS) estéril, en frío, o en etanol 70%, o se mantiene en seco en envase estéril hasta su uso.
10. El método de acuerdo con la reivindicación 6, CARACTERIZADO porque las células madre de la etapa b) son células madre alogénicas o autólogas que se seleccionan del grupo que comprende: células mesenquimales de origen adiposo, médula ósea, cordón umbilical, pulpa dental, papila dental, folículo dental, ligamento periodontal, epitelio bucal, ligamento condilar, músculo cardíaco, epitelios de recubrimiento, huesos planos maxilofaciales o craneales, células progenitoras óseas, endoteliales.
1 1 . El método de acuerdo con la reivindicación 10, CARACTERIZADO porque las células madres son cultivadas en las siguientes condiciones: i. extraer ligamento periodontal desde el tercio inferior radicular de una pieza dental, pudiendo ser un tercer molar erupcionado o cualquier diente erupcionado, o de una pieza dental animal; triturar en solución salina (PBS), traspasar a platillos cubiertos de una matriz 3-D de colágeno y se agrega medio de cultivo a-MEM con FBS en una concentración del 10% a 15% o con suero humano autólogo en la misma concentración para obtener las células madres; y
¡i. digerir con enzimas colagénicas una vez alcanzada la confluencia de 60% a 75%, y a continuación, se expanden en medio a-MEM con FBS o con suero humano autólogo.
12. El método de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7, CARACTERIZADO porque el elemento a trasplantar es hueso maxilofacial.
13. El método de acuerdo con la reivindicación 6, 7 ó 12, CARACTERIZADO porque el hueso maxilofacial se somete a las etapas de: i) limpiar tejidos anexos, inmersión en buffer Tris-NaCI o PBS entre 30 segundos a 5 minutos o en 70% etanol entre 1 y 5 minutos, y luego enjuague en agua ultrapura para recubrir con la matriz de colágeno 3-D sembrado con células madres mesenquimales o células precursoras; ii) alternativamente, luego de la limpieza descrita en (i) se somete a descelularización.
14. Un método para producir el colágeno en estado de gel, CARACTERIZADO porque comprende las siguientes etapas: a) Desinfectar un segmento de mejilla de cabeza de cerdo; b) extraer y triturar la dermis del segmento de piel obtenido de la etapa a), y posteriormente mezclar con una solución entre 1 y 10 M de acetato de sodio, y se eleva el pH entre 10 a 14 con una solución de hidróxido de sodio; c) lavar la mezcla resultante de la etapa b) 2 a 7 veces con una solución de acetato de sodio; seguido de 2 a 7 lavados con agua calidad ultra- pura; luego el sedimento se solubiliza en una solución de ácido acético diluido; d) recuperar mediante centrifugación entre 0 y 10eC a igual o más de 9.000 rpm, y después separar las partículas sólidas en suspensión de la solución; posteriormente, la solución se congela y se somete a un proceso de liofilización; y e) mantener congelado el producto de la liofilización hasta su uso, obteniendo el colágeno en forma de gel.
15. El método de acuerdo con la reivindicación 14, CARACTERIZADO porque la desinfección del segmento de piel de cerdo de la etapa a) se realiza sumergiéndolo en una solución comercial de povidona yodada en una concentración entre 1 % y 30%, por un período de 3 a 6 horas, y posteriormente se cepilla vigorosamente por ambas caras y se enjuaga con agua calidad ultra- pura.
16. El método de acuerdo con la reivindicación 14, CARACTERIZADO porque alternativamente, la piel de cerdo desinfectada obtenida en la etapa a) se congela entre -80°C a -196°C para mantenerlo almacenado hasta su uso.
17. El método de acuerdo con la reivindicación 14, CARACTERIZADO porque en la etapa b), la solución de hidróxido de sodio de encuentra en una concentración entre 10 a 15 M y se mantiene en contacto con la mezcla durante un período de tiempo entre 30 minutos y 2 horas a temperatura ambiente 20eC a 25eC para esterilizar la solución y extraer las proteínas.
18. El método de acuerdo con la reivindicación 14, CARACTERIZADO porque en la etapa c), el primer lavado se realiza con acetato de sodio entre 1 M y 10M, colectando las proteínas mediante centrifugación a igual o más de 9.000 rpm en frío entre 0 y 10eC.
19. El método de acuerdo con la reivindicación 14, CARACTERIZADO porque en la etapa c), después del segundo lavado, el sedimento se solubiliza en una solución de ácido acético diluido entre 0,01 N y 0,5N en una proporción de 1 It por 1 ,5 gr del sólido, mediante agitación entre 0 y 10eC.
20. El método de acuerdo con la reivindicación 14, CARACTERIZADO porque en la etapa d), la separación de las partículas sólidas en suspensión se realiza mediante filtración en gasa.
21 . El método de acuerdo con la reivindicación 14, CARACTERIZADO porque el colágeno obtenido en forma de gel en la etapa e) se presenta en forma de moldeados esponjosos liofilizado seco para enrollar los elementos a trasplantar siguiendo las siguientes etapas adicionales: f) masar el liofilizado de la etapa e) y disolver en ácido acético con una concentración mayor o igual a 0,5N a 4eC ±1 ,0eC, hasta obtener una concentración de 20 a 30 mg/ml; g) introducir el producto disuelto de la etapa f) en moldes plásticos estériles de acuerdo al tamaño y forma del implante, h) congelar a una temperatura entre -20eC a -24eC al menos 24 horas; i) liofilizar el producto congelado de la etapa h) y j) desprender el producto de los moldes de plástico usando una espátula para ser almacenada en un lugar seco a temperatura ambiente entre 20 a 25°C hasta el momento de su uso.
22. El método de acuerdo con la reivindicación 21 , CARACTERIZADO porque los moldes de la etapa g) pueden ser láminas delgadas o gruesas, o conos de variado grosor, o túbulos de variado grosor, u otra forma según convenga al tejido a trasplantar.
23. El método de acuerdo con la reivindicación 21 , CARACTERIZADO porque los moldeados de colágeno esponjoso obtenidos según las etapas f) a la j) se tratan mediante procedimientos propios de entrecruzamiento con material no tóxico (inocuo), controlando la densidad del colágeno moldeado, a través de las siguientes etapas: i. sumergir e incubar los moldeados esponjosos de colágeno a temperatura ambiente entre 20eC a 25eC en una solución a base de 2,3% p/v de N-hidroxisuccinimida (NHS) y 3,83% p/v N- (3Dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida clorohidrato) (EDC) en ) en un volumen entre 1 y 40 mi de etanol 70%, y posteriormente realizar lavados de este colágeno en agua ultra pura estéril;
¡i. congelar el colágeno a una temperatura entre -50 y -5 °C entre 12 y 36 horas y luego se liofilizan en las mismas condiciones anteriores.
24. El método de acuerdo con la reivindicación 14, CARACTERIZADO porque el colágeno obtenido después de la etapa e), se presenta como un colágeno en estado de gel 3-D, o matriz 3-D, para el cultivo de células con las siguientes etapas adicionales: i) masar el producto liofilizado obtenido de la etapa e) y disolver en ácido acético a una concentración entre 0,01 N a 0,05 N en frío 4eC ±1 ,0eC hasta obtener una concentración final requerida entre 2,0 mg/ml a 5,0 mg/ml; ii) tomar el producto completamente disuelto de la etapa i) y dializar en cloroformo en una concentración entre 0,5% y 5% para eliminar impurezas, seguido de diálisis en ácido acético diluido a una concentración entre 0,01 N a 0,05 N en frío 4eC ±1 ,0eC; iii) obtener una matriz biológica 3-D de colágeno tipo gel o en estado de gel que proporciona ambiente tridimensional a las células en cultivo; y iv) almacenar el producto en frío sin congelar a temperatura entre 4eC a 10eC.
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