WO2005079728A1

WO2005079728A1 - 象牙質再生方法

Info

Publication number: WO2005079728A1
Application number: PCT/JP2005/003408
Authority: WO
Inventors: Toshimasa Uemura; Takashi Saito; Takeo Fujii
Original assignee: National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology
Priority date: 2004-02-23
Filing date: 2005-02-23
Publication date: 2005-09-01
Also published as: JPWO2005079728A1

Abstract

　本発明は、低廉かつ安全な象牙質再生方法とそのための材料を提供する。すなわち、非コラーゲン性リン酸化蛋白質とコラーゲンを含む複合材料を足場として歯髄細胞を培養することを特徴とする象牙質の再生方法、および非コラーゲン性リン酸化蛋白質とコラーゲンを、ジビニルスルフォンまたは１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジアミドを用いて架橋後、凍結乾燥あるいは加熱ゲル化して作製される象牙質修復用材料を提供する。

Description

明細書象牙質再生方法技術分野

本発明は、象牙質の再生方法とそのための複合材料に関する。より詳しくは、非コラーゲン性リン酸化蛋白質とコラーゲンを含む複合材料と、これを利用した象牙質の再生方法に関する。背景技術

近年、歯科領域における象牙質の修復には、人工材料の移植が行われることが多い。こうした人工材料には、生体材料としての生体適合性に加えて、石灰化誘導性一すなわち、移植後、石灰質を誘導しつつ、材料自らは吸収される性質一が求められる。

象牙質再生用材料としては、セラミックス系材料などが考案されているが、石灰化誘導能の点からは、 BMP (bone morphogenic pro te in)とコラーゲンとの複合材料のほうが有力と考えられており、これ以外に十分な石灰化能が期待できる材料はない。.しかし、 BMP は強い石灰化能を有するが、水に溶解しにくいこと、最適な担体が見出されていないこと、マウス、ラッ卜などの小動物では高い石灰化能が認められても、ヒトへの臨床応用では 0. 4 mg/ml 程度の高濃度を必要とすることから、現状では高額医療に利用が限定されると予想される。したがって、 BMP に代る、安全かつ安価な、石灰化能を有する生体吸収性材料の開発が望まれている。

発明者らは、これまで、歯に含まれるフォスフオフオリンゃフォスビチンが単独で骨形成能を有していることを見出しているが（Sai to e t a l. Bone 21 (4) 305-31 1 (1997) )、これらが実際に象牙質再生に応用されたという報告はない。また、発明者らは、フォスフオフオリンをコラーゲンに架橋させた骨再生用複合生体材料について報告しているが（特開 2003-235953号）、骨再生の結果から象牙質の再生効果を予測することはできない。一方、象牙質再生用材料には、生体吸収性であること、歯槽骨や象牙質の歯周病や欠損部位を適切に補填するために、成形が容易でしなやかな力学的特性を有することが望まれる。これに関して、コラーゲンタイプ Iは、元来、歯槽骨や象牙質の主な有機成分であり、石灰化の核となることが知られており、スポンジ状、ゲル状と様々な形態のものを作製することができる。しかしながら、コラーゲンタイプ Iの石灰化能は極めて低く、単独で象牙質再生を促すことはできない。発明の開示

本発明の課題は、低廉かつ安全な象牙質再生方法とそのための材料を提供することにある。

上記課題を解決するために鋭意検討した結果、本発明者らはフォスフォフォリン、フォスビチンまたは DMP- 1 (Dentin Matrix Protein-1) 等の非コラーゲン製リン酸化蛋白質に石灰化能が認められることに着目した。そして、これらをコラーゲンに架橋した複合材料を足場として歯髄細胞を象牙芽細胞に分化させれば、優れた象牙質再生が期待できると考えた。

すなわち、本発明は以下の（1) ~ (1 1) に関する。

(1) 非コラーゲン性リン酸化蛋白質とコラーゲンを含む複合材料を足場として歯髄細胞を培養することを特徴とする、象牙質の再生方法。

(2) 前記非コラーゲン性リン酸化蛋白質が、フォスフオフオリン、フォスビチンまたは DM 1、あるいはそれらの混合物である、上記（1) 記載の方法。

( 3 ) 前記非コラーゲン性リン酸化蛋白質がコラーゲンに化学架橋されていることを特徴とする、上記（1) または（2) に記載の方法。

(4) 前記複合材料が、非コラーゲン性リン酸化蛋白質とコラーゲンを、ジビニルスルフォンまたは 1ーェチルー 3— （3—ジメチルァミノプロピル）カルポジアミドを用いて架橋して作製される、スポンジ状あるいはゲル状複合材料である、上記（1) または（2) に記載の方法。

(5)増殖因子を添加して培養を行うことを特徴とする、上記（1 )〜（4) のいずれか 1に記載の方法 (6) 前記増殖因子が骨形成因子（BMP)である、上記（5) 記載の方法。

(7) 前記コラーゲンがコラーゲンタイプ Iである、上記（1) 〜（6) のいずれか 1に記載の方法。

(8) さらに、前記複合材料が、ハイドロキシアパタイト、 /3— TC P、， α— TC P、ポリグリコール酸、およびポリ乳酸ならびにそれらの誘導体から選ばれる少なくとも 1以上を含む、上記（1) 〜（7) のいずれか 1 に記載の方法。

(9) 上記（1) 〜（8) のいずれか 1に記載の方法によって再生された象牙質を前記複合材料とともに含む、象牙質修復用材料。

( 10) 非コラーゲン性リン酸化蛋白質とコラーゲンを、ジビニルスルフオンまたは 1一ェチル _ 3— (3—ジメチルァミノプロピル）カルボジァミドを用いて架橋後、凍結乾燥あるいは加熱ゲル化して作製される、スポンジ状あるいはゲル状複合材料からなる象牙質修復用材料。

(1 1) さらに歯髄細胞を含む、上記（1 0) 記載の象牙質修復用材料。本発明によれば、欠損した象牙質の効果的な再生が可能となる。本発明の象牙質再生方法や象牙質修復用材料は、低廉かつ安全であるため、歯科医療一般における保存的治療手段として有用である。図面の簡単な説明

図 1は、ラット覆髄（移植）後 1週間目の HE染色像を示す写真である。図 2は、ラット覆髄（移植）後 2週間目の HE染色像を示す写真である。図 3は、ラット覆髄（移植）後 3週間目の HE染色像を示す写真である。上記図 1〜 3において、上の 2つの染色像はフォスフオフオリン—コラ一ゲン複合体移植群（左： X40 右： χ100)、下の 2つの染色像はコラーゲンスポンジ移植群（左： x40 右： xlOO) の結果を示す。また、写真中の記号は、 D:象牙質、 P:歯髄、 ND :新生（再生）象牙質を示す。本明細書は、本願の優先権の基礎である特願 2004— 456 58号の明細書に記載された内容を包含する。発明を実施するための最良の形態

本発明は、非コラーゲン性リン酸化蛋白質とコラーゲンを含む複合材料を足場として歯髄細胞を培養することを特徴とする、象牙質の再生方法に関する。以下、本発明の方法について詳述する。

1 . 非コラーゲン性リン酸化蛋白質

本発明で使用される「非コラーゲン性リン酸化蛋白質」は、石灰化能を有するコラーゲン以外のリン酸化蛋白質であって、例えば、フォスフオフォリン、フォスビチン、 DMP- 1 (Dent in Matr ix Pro te in- 1) 等が挙げられる。

(1) フォスフオフォリンの調製

フォスフオフオリンは、哺乳類の歯に含まれるリン酸化タンパク質で、単独で骨形成能を有することが知られている（ Bone. 1997 Oct : 21 (4) : 305-11)。フォスフオフオリンは、市販のもの（和光純薬社製等）を用いてもよい力、例えば以下のようにして得ることができる。哺乳類（例えば、ゥシゃプタ等）の歯を抜歯し、軟組織、歯髄、エナメル質、セメント質を除去する。残った象牙質を細かく粉砕し、これを、蛋白質分解酵素を含む適当な緩衝液（例えば、 0. 5M EDTA, 0. 05M Tris-HCl, pH 7. 4) を用いて脱灰し、透析した後に凍結乾燥する。次に、得られた凍結乾燥物を緩衝液（例えば 20mM Tris-HCl, pH 7. 4 〔蛋白質分解酵素含有〕）に溶解し、塩化カルシウムを添加する。生じた沈殿物を緩衝液（例えば、 0. 5M EDTA, 0. 05M Tr is-HCl, pH T. 4 〔蛋白質分解酵素含有〕）に溶解し、透析後、再び凍結乾燥する。最後に、前記凍結乾燥物を尿素溶液（例えば、 4M Urea, 0. 01M Tr is-HC l, pH 8. 0) に溶解後、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、 DEAE- Sepharose等）等により分離する。目的とするフォスフオフオリンは、リン酸分析およびアミノ酸分析により同定することができる。

(2)フォスビチン

フォスビチンはフォスフオビチン、ホスビチンあるいはホスホビチンともいい、脊椎動物卵黄タンパク質の主成分で、卵黄顆粒に含まれるリン酸化蛋白質である。鶏卵フォスビチンは分子量約 10万、約 10%のリン酸を含み、アミノ酸の約半分がセリンでそのほとんどがホスホセリン残基になつている。フォスビチンについてもフォスフオフオリン同様、単独で骨形成能を有することが知られている（Bone. 1997 0ct;21 (4) :305-11)。フォスビチンは、市販のもの（Sigma Chem. Co. ) 等）を用いてもよいが、既報 (Shainkin R, Perlmann GE. , Phosvitin, a p osphoglycoprotein. I. Isolation and characterization of a glycopeptide from phosvitin. J Biol Chem. 1971 Apr 10 ;246 (7) :2278-84. ) に従い容易に調製することができる。

(3) DMP-1 (Dentin Matrix Protein-1)

DMP-1は、歯の象牙質 cDNA ライブラリーから同定された分泌性の非コラ一ゲン性酸性リン酸化蛋白質で、骨や象牙質などの細胞外マトリックスにおいてその石灰化に関与する（George A. et al. , J Biol Chem. 1993 Jim 15;268 (17) :12624-30. ) ₀ DMP-1遺伝子はヒ卜染色体では 4Q21 に位置し、その近傍に位置するォステオボンチン、 MEPE、骨シァロタンパク質遺伝子などとともにファミリーを形成する。 DMP-1 は、そのアミノ酸配列から組織中で負に荷電し、カルシウムイオンと結合するため、石灰化に深く関連すると考えられている。実際、 DMP- 1 の骨芽細胞株への遺伝子導入実験では石灰化の促進が認められること（Feng JQ, et al. , J Dent Res. 2003 0ct;82 (10) :776-80) や、 DMP-1遺伝子の欠損が象牙質形成異常や低石灰化を伴う歯の形成阻害をもたらすこと（YeL. et al. J Biol Chem. (2004) Feb 13 [Epub ahead of print] ) が報告されている。以上のとおり、 DMP- 1 は骨や歯の石灰化（特に象牙質形成）に重要な分子であると考えられている。本発明で用いられる DMP-1は、周知の方法（George A. et al. , J Biol Chem. 1993 Jun 15:268 (17) :12624-30.) に従い、遺伝子工学的に生産したり、骨や歯の象牙質から抽出、精製することにより調製することができる。

2. コラーゲン

本発明で用いられるコラーゲンとしては、骨や歯の有機質の大部分を占め、生体親和性が高いコラーゲンタイプ Iが好ましい。前記コラーゲン夕イブ Iは、市販のものを用いても、公知の方法に従って調製してもよい。例えば、適当な材料（例えば、ゥシゃブ夕の皮膚等の動物の結合組織）から、公知の方法に従ってコラーゲンを抽出 ·精製する。精製したコラーゲンは凍結乾燥後、酢酸溶液に溶解し、 NaC l、 NaOH、 Hepes 等を添加してィンキュベー卜することにより、再構成コラーゲンタイプ I線維として得ることができる。

3 . 非コラーゲン性リン酸化蛋白質とコラーゲンからなる複合材料

本発明にかかる複合材料は、非コラーゲン性リン酸化蛋白質とコラーゲンを含む。前記複合材料において、非コラーゲン性リン酸化蛋白質とコラ一ゲンの配合比（質量比）は、 1 ： 10〜1 ： 50 であることが好ましく、 1 : 20〜 40 であることがより好ましい。また、複合材料総量（合計質量）に対し、非コラーゲン性リン酸化蛋白質は 2〜10質量％ (以下、単に「質量％」を％と記載する。）配合されることが好ましく、 2. 5〜5. 0%配合されることがより好ましい。非コラーゲン性りン酸化蛋白質の量が少なすぎると石灰化能が不十分となり、一方、非コラーゲン性リン酸化蛋白質の量が多すぎると複合材料のコス卜が高くなるからである。

前記複合材料において、非コラーゲン性リン酸化蛋白質はコラーゲン線維に化学架橋していることが好ましい。架橋剤としては、ジビニルスルフオンまたは 1 —ェチル— 3— ( 3 —ジメチルァミノプロピル）カルポジァミド等を用いることができる。

例えば、まずコラーゲン線維を炭酸カリウム、炭酸ナトリウム等の炭酸塩水溶液に溶かして室温でィンキュベー卜する。該炭酸塩水溶液の濃度は、好ましくは 0. 1M〜0. 2M、より好ましくは 0. 4M〜0. 5Mである。これに、架橋剤、例えば、ジビニルスルフォン、 1ーェチルー 3— ( 3—ジメチルァミノプロピル）カルポジアミド等を加え、予めコラーゲン繊維上に架橋鎖を導入する。添加する該架橋剤の量は、ジビニルスルフォンであれば 5. 0 質量％程度が好ましい。

次に、非コラーゲン性リン酸化蛋白質を添加してインキュべ一卜し、コラーゲンと架橋させる。添加する非コラーゲン性リン酸化蛋白質の量は、コラーゲンに対して ΙΖ ΐΟ ΙΖδΟが好ましく、 l/^O l ^Oがより好ましい（質量比）。これを、蒸留水、続いて重炭酸塩（例えば、重炭酸ナ卜リゥム、重炭酸カリウム等）溶液で洗浄し、余剰の非コラーゲン性リン酸化蛋白質や架橋剤を除去する。最後に、重炭酸ナトリウムとメルカプトエタノールを添加して架橋反応を止め、蒸留水でよく洗浄する。

架橋後の複合材料は、そのまま加熱してゲル化させゲル状構造物として用いてもよいし、凍結乾燥してスポンジ状構造物として用いてもよい。このゲル状あるいはスポンジ状の構造は、後述する歯髄細胞培養や歯の欠損部補填に適した特性を与える。

スポンジ状構造物を得る場合、凍結乾燥の条件（例えば、温度、凍結時間、水中での凍結乾燥等）は、所望の複合材料の構造、すなわち比表面積、空隙率、孔（空隙）の大きさ等に応じて、適宜調整することができる。また、得られた凍結乾燥物は、必要に応じて成形し、例えば後述する歯科用インプラント等として利用することができる。なお、「スポンジ状構造」とは、柔軟性を有する微小多孔質構造（数 m〜数 lO m程度の無数の孔（空隙）が存在する構造）を意味するものとする。本発明のスポンジ状構造を有する複合材料においては、その空隙率は好ましくは 40〜90%、より好ましくは 60〜90%である。この範囲を超えると、細胞の侵入が不十分となり石灰化能が低下するとともに、複合材料自体の強度が低下するからである。前記スポンジ状構造を有する複合材料は、必須の成分である非コラーゲン性リン酸化蛋白質およびコラーゲンに加えて、本発明の目的 ·効果を損なわない範囲で、さらに八イド口キシァパタイ卜、 ]3 TC P、 aTCP、ポリダリコール酸、ボリ乳酸またはその誘導体（例えば、 PLLA (poly-卜 lactic acid)と PDLA (poly- d- lactic acid)の重合体) 等の多孔質の硬材料を含んでいてもよい。

4. 象牙質の再生

本発明の複合材料を足場として歯髄細胞を播種して、適当な条件下で培養すれば、効果的に歯髄細胞を象牙質芽細胞に分化させることができる。歯髄細胞としては、患者自身から単離された歯髄細胞を好適に用いることができる。

細胞の播種は、足場である複合材料に単に播種するだけでもよいし、あるいは、緩衝液、生理食塩水、注射用溶媒、コラーゲン溶液等の液体とともに混合して播種してもよい。また、材料によって、細胞が複合材料の孔にスムーズに入らない場合は、引圧条件下で播種してもよい。播種する細胞の数（播種密度）は象牙質再生をより効率よく行わせるため、適宜調整することが望ましい。

細胞培養に用いられる培地としては、 M E M培地、ひ- M E M培地、 D M E M培地等、公知の培地を細胞に合わせて適宜選んで用いることができる。また、該培地には、 F B S (S igma社製）、 Ant ibio t ic-Ant imycot ic (GIBCO BRL 社製）等の抗生物質や抗菌剤、増殖因子、転写因子等を添加しても良レ特に石灰化を促進させる増殖因子である骨形成蛋白質（BMP) を添加することが好ましい。培養は、通常 3〜10%C0₂、 30〜40°C、特に 5 C0₂、 37°C の条件下で行われるが、これに限定されるものではない。培養期間は、少なくとも 3 日以上行うことが望ましい力これに限定されるものではなく、状況に応じて適宜決定される。

こうして歯髄細胞から分化誘導された象牙質芽細胞は、さらに増殖させ、足場である複合材料とともに、欠損部に埋入あるいは注入することで、歯の象牙質を効果的に再生することができる。

5 . 象牙質修復用複合材料（歯科用インプラント）

本発明により得られる複合材料は、水を吸うとスポンジのような弾性を有し、優れた生体親和性、石灰化能を有する。また、成形が容易で、しなやかな力学的特性を有するため、歯の欠損部のような小さな隙間を適切に充填することができる。すなわち、本発明の複合材料を歯の欠損部に埋入すると、速やかに周囲組織と結合し、ドナー側組織と複合材料との界面は完全に一体化しうる。したがって、本発明の複合材料は、それ自体、歯の象牙質欠損部を修復 ·再生させるためのィンプラントとして利用できる。インプラントとして利用する場合、複合材料は、スポンジ状構造物であつても、ゲル状構造物であってもよい。スポンジの形状やゲルの硬度は補填すべき欠損部や操作性に合わせて自由に調整できる。さらに、複合材料には他の生理活性物質や薬剤等を含浸させて使用することもできる。例えば、抗炎症剤を含浸させて徐放させれば、歯髄欠損部の術後炎症を効果的に防止することができる。

前記象牙質修復用インプラントは、複合材料中に歯髄細胞を播種し、これを in vi t roで象牙質芽細胞に分化 ·増殖させてから、足場である複合材料とともに、欠損部に埋入するものであってもよい。歯髄細胞として、患者由来の細胞を用いれば、それはより理想的な象牙質修復用インプラン卜となる。実施例

以下、参考例および試験例により本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

〔参考例〕フォスフオフオリン /コラーゲン複合材料の製造

(1) フォスフオフォリンの精製

まず、ゥシ顎骨から永久歯を抜歯し、軟組織、歯髄、エナメル質、セメント質を除去する。残った象牙質を液体窒素下にて 200メッシュ以下の細粒子に粉砕する。象牙質粉を 0.5M EDTA, 0.05M Tris-HCl, H 7.4 [蛋白質分解酵素： lOOmM 6-aminohexanoic acid (和光純薬社製）， 5mM benzamidine-HCl, ImM p enylmethylsul fonyl fluoride含有] で 4。Cにて脱灰する。

つぎに、 EDTA脱灰液を、 4°Cにて脱イオン蒸留水に対し、透析膜（SPECTRUM MWC03500, 132725)を用いて透析して、凍結乾燥（東京理科機械製： EYELA FREEZ DRYER 90500042) する。 EDTA抽出物は 20mM Tris-HCl, pH 7.4 (蛋白質分解酵素含有）に溶解し、最終濃度が 1Mになるように CaCl₂を添加する。沈殿物を遠心分離（日立ェ機製： HIMAC CENTRIFUGE345043) により回収し、再び 0.5M EDTA, 0.05M Tris-HCl, pH 7.4 (蛋白質分解酵素を含有）に溶解し、脱イオン蒸留水に対して透析して、凍結乾燥する。凍結乾燥物を 4M Urea, 0.01M Tris-HCl, pH 8.0に溶解して DEAE - Sepharose (Sigma Chem. Co. 製） Column Chromatographyにて、 0-1M NaCl直線勾配により溶出させる。

最後に、リン酸分析およびアミノ酸分析によりフォスフオフオリンを同定する。

(2)コラーゲンタイプ Iの精製

ゥシ皮膚を細切し、 4"Cにて蒸留水、 20% NaCl, 0.05M Tris-HCl, pH 7.4 にて洗浄する。次に、 1M NaCL 0.05M Tris-HCl, pH 7.4 にて overnight で抽出し、遠心分離により上清を回収し、 0.5M 酢酸、 1M NaCl を加え overnightで撹拌する。

遠心分離により残渣を回収し、 0.5M 酢酸に溶かして、さらに遠心分離を行う。上清を 5M NaOH, 4.4M NaClで中和し、 overnightで撹拌し、遠心分離する。この残渣に 4.4MNaCl, 0.05M Tr is - ΗΠ, pH 7.4を添加し overnight で撹拌し、遠心分離する。

残渣に 2.4M NaCl, 0.05M Tris-HCl, H 7.4を添加し overnightで撹拌し、遠心分離する。残渣に 1.7M NaCl, 0.05M Tris-HCl, pH 7.4を添加し overnightで撹拌し、遠心分離する。得られた上清を 0.1M 酢酸に対して透祈し、凍結乾燥する。

凍結乾燥したコラーゲンと 50mM 酢酸を用いて、 0.3%コラーゲン酢酸溶液を作成する。 0.15M NaCl に続き、 0.6N NaOH, 0.1M Hepes (和光純薬社製）を添加して 37 にてインキュベートすることにより、再構成コラーゲンタイプ I線維が得られる。

(3) フォスフオフォリンのコラーゲンへの架橋結合

(2)で得られたコラーゲン線維を 0.5M 炭酸ナトリゥムで室温にて overnightでィンキュベー卜する。さらにジビニルスルフォン（Sigma Cheni. Co. 製）を添加し、 2時間インキュベートする。 0.5M炭酸ナトリウムでコラーゲン線維をよく洗浄後、フォスフオフオリンを添加し、 overnight でインキュベートして架橋させる。これを蒸留水で洗い、さらに 0.5M 重炭酸ナトリウムでよく洗浄して、過剰なフォスフオフオリンとジビニルスルフォンを除去する。

次いで、 0.5M 重炭酸ナ卜リゥムとメルカプトエタノールを添加し、 overnight でインキュベートして架橋反応を止める。得られた複合体は蒸留水で洗い、さらに 0.5M NaCl, 0.05M Tris-HCl, pH 7.4および蒸留水で洗浄する。

以上の工程によって得られた複合体を凍結乾燥し、コラーゲン一フォスフオフオリン複合体（スポンジ状シート）を作製した。また、フォスフォフォリンを加えないコラーゲン線維のみを、蒸留水でよく洗った後、凍結乾燥し、フォスフオフオリンを含まないコラーゲン複合体（スポンジ状シ一卜）を作製した。

〔試験例〕ラットによる象牙質再生試験

1 . 試料覆髄

以下のプロトコールにて、実験的に作製したラット（各々 N=3) の歯髄欠損部を参考例 1で作製したフォスフオフオリンーコラーゲン複合体またはコラーゲンスポンジ）で補填し、象牙質再生効果を確認した。

1) 硫酸アト口ピン 2 ml筋注

2) ホリゾン（ジァゼパム製剤） 4 ml筋注

3) ケ夕ラール（塩酸ケタミン） 10 ml筋注

4) 静脈確保のため脚をバリカンにて剃毛

5) 翼状針にて静脈路を確保し固定

6) ラボナール（チォペンタールナトリウム） 2- 3 ml を投与

(術中は覚醒し始めたら卜 2 mlを投与する）

7) ポ夕コール（ビクシリン 250 mg含有）（電解液）を術中点滴

もしくは生食水にビクシリン（アンピシリンナトリウム）を投与し点滴

8) 2 キシロカイン.（塩酸リドカインェピネフリン含有）にて実験歯部位に局所麻酔を施す。

9) 窩洞形成

実験歯 .

上顎：切歯 2, 3番、犬歯、小臼歯 2, 3番

下顎：切歯 3番、犬歯、小臼歯 2, 3番

実験歯に、エアータービンダイヤモンドボイントにて直径 2-3匪程度の窩洞を形成する。また、生食水注水下で、 2 mmのスチールラウンドバーにて 1 mm程度の露髄面を形成する。

10) 洗浄および止血。

11) 各試料（フォスフオフオリン—コラーゲン複合体、およびコントロールとしてコラーゲンスポンジ）を窩洞面に置く。

12) グラスアイオノマ一セメントにて仮封。

13) さらにコンポジットレジンにて修復。 14) 炎症防止のためボルタレン座薬（ジクロフェナクナトリウム）を投与してオペを終了。

2 . 試料摘出

以下のプロ卜コールに従い、移植後の試料をラットより摘出した。

1) 試料覆髄時と同様の方法で静脈確保まで行う。

2) 三倍量のラボナール（チォペンタールナトリウム）にて麻酔死させる。

3) 実験歯をヘーベル、鉗子にて抜去後直ちに中性ホルマリン溶液にて固定する。

3 . 評価

摘出した試料（フォスフオフオリンーコラーゲン複合体及びコラーゲンスポンジ）をへマトキシリンェォジン染色（HE染色）し、光学顕微鏡にて組織学的観察を行った。さらに象牙質の形態計測を行うことにより、象牙質再生効果を評価した。

4 . 結果

フォスフオフオリン一コラーゲン複合体を移植した場合、コラーゲンスポンジ（コントロール）に比べて極めて早い（2週間）象牙質再生が観察できた。移植 3週間後では、旺盛な象牙質再生がフォスフオフオリンーコラーゲン複合体群で観察できた。一方、コラーゲンスポンジでは 3週間まで殆ど象牙質の再生は観察できなかった。上記参考例および試験例はフォスフオフオリンーコラーゲン複合体についての実験プロトコ一ルであるが、同様にして、フォスビチンーコラーゲン複合体、 DMP-1—コラーゲン複合体を作製し、象牙質再生効果を確認することができる。本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。産業上の利用の可能性

本発明の象牙質再生方法や象牙質修復用材料は、低廉かつ安全であるため、高額医療に限定されない、歯科医療一般における保存的治療手段として利用できる。

Claims

I . 非コラーゲン性リン酸化蛋白質とコラーゲンを含む複合材料を足場として歯髄細胞を培養することを特徴とする、象牙質の再生方法。

2. 前記非コラーゲン性リン酸化蛋白質が、フォスフオフオリン、フォスビチンまたは DMP- 1、あるいはそれらの混合物である、請求項 1記載の方法。

3. 前記非コラーゲン性リン酸化蛋白質がコラーゲンに化学架橋されてい

一ロ

ることを特徴とする、請求項 1または 2記載の方法。

4. 前記複合材料が、非コラーゲン性リン酸化蛋白質とコラーゲンを、ジビニルスルフォンまたは 1ーェチルー 3—（3—ジメチルァミノプロピル）カルポジアミドを用いて架橋して作製される、スポンジ状あるいはゲル状複合材料である、請求項 1または 2記載の方法。

囲

5. 増殖因子を添加して培養を行うことを特徴とする、請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の方法。

6. 前記増殖因子が骨形成因子（BMP)である、請求項 5記載の方法。

7. 前記コラーゲンがコラーゲンタイプ Iである、請求項 1〜6のいずれか 1項に記載の方法。

8. さらに、前記複合材料が、ハイドロキシアパタイト、 ]3—TCP、 -TCP, ポリグリコール酸、およびポリ乳酸ならびにそれらの誘導体から選ばれる少なくとも 1以上を含む、請求項 1 ~7のいずれか 1項に記載の方法。

9. 請求項 1 ~8のいずれか 1項に記載の方法によって再生された象牙質を前記複合材料とともに含む、象牙質修復用材料。

10. 非コラーゲン性リン酸化蛋白質とコラーゲンを、ジビニルスルフォンまたは 1一ェチル— 3— （3—ジメチルァミノプロピル）カルポジアミドを用いて架橋後、凍結乾燥あるいは加熱ゲル化して作製される、スポンジ状あるいはゲル状複合材料からなる象牙質修復用材料。

II. さらに歯髄細胞を含む、請求項 10記載の象牙質修復用材料。