JP5297676B2 - 複合生体材料 - Google Patents
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Description
〔1〕非コラーゲン性リン酸化タンパク質(A)及びカルボキシル基含有多糖(B)を含む複合生体材料であって、前記非コラーゲン性リン酸化タンパク質(A)が、フォスフォフォリン、フォスビチン及びDMP−1からなる群より選ばれる少なくとも1種であり、前記カルボキシル基含有多糖(B)が、アルギン酸及びその塩並びにヒアルロン酸及びその塩からなる群より選ばれる少なくとも1種である、複合生体材料、
〔2〕非コラーゲン性リン酸化タンパク質(A)及びカルボキシル基含有多糖(B)を、架橋剤を用いて共有結合的に化学架橋する工程を含む複合生体材料の製造方法であって、前記非コラーゲン性リン酸化タンパク質(A)が、フォスフォフォリン、フォスビチン及びDMP−1からなる群より選ばれる少なくとも1種であり、前記カルボキシル基含有多糖(B)が、アルギン酸及びその塩並びにヒアルロン酸及びその塩からなる群より選ばれる少なくとも1種である、複合生体材料の製造方法、
〔3〕非コラーゲン性リン酸化タンパク質(A)及びカルボキシル基含有多糖(B)を、脱水縮合剤を用いて共有結合的に結合する工程を含む複合生体材料の製造方法であって、前記非コラーゲン性リン酸化タンパク質(A)が、フォスフォフォリン、フォスビチン及びDMP−1からなる群より選ばれる少なくとも1種であり、前記カルボキシル基含有多糖(B)が、アルギン酸及びその塩並びにヒアルロン酸及びその塩からなる群より選ばれる少なくとも1種である、複合生体材料の製造方法
に関する。
本発明で用いられる非コラーゲン性リン酸化タンパク質(A)としては、フォスフォフォリン、フォスビチン、DMP−1(Dentin Matrix Protein−1)DSP(Dentin sialoprotein)、BSP(Bone sialoprotein)、OC(Osteocalcin)、ON(Osteonectin)及びOPN(Osteopontin)等が例示されるが、硬組織再生能の観点から、フォスフォフォリン、フォスビチン及びDMP−1からなる群より選ばれる少なくとも1種が好ましく用いられる。
本発明に用いられるカルボキシル基含有多糖(B)は特に限定されるものではないが、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸A、コンドロイチン硫酸C、コンドロイチン硫酸D、コンドロイチン硫酸E、コンドロイチン硫酸K、デルマタン硫酸(コンドロイチン硫酸B)、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸等のグリコサミノグリカン、ペクチン、セロウロン酸、アルギン酸などであることが好ましい。また、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルプルラン、部分スクシニルキトサン、カルボキシメチルキトサン、カルボキシメチルキチンなどの本来カルボキシル基を含有しない多糖類にカルボキシル基を人工的に導入したものなども用いることができる。なお、カルボキシル基含有多糖(B)としては、その一部又は全部が塩を形成しているものも包含され、好ましくは水溶性塩が用いられる。かかるカルボキシル基含有多糖の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩及びアンモニウム塩などが好ましく用いられ、特にナトリウム塩が好ましく用いられる。これらのカルボキシル基含有多糖の中でも、入手の容易性、生体適合性及び生体吸収性の観点から、ヒアルロン酸及びアルギン酸が好ましく用いられ、アルギン酸がさらに好ましく用いられる。カルボキシル基含有多糖の水溶性塩としては、得られる複合生体材料の機械強度を確保する観点から、濃度1重量%の水溶液にしたときに、該水溶液の20℃での粘度が100mPa・S以上であるものが好ましく用いられ、300mPa・S以上であるものがより好ましく用いられる。一方、複合生体材料の製造時におけるハンドリング性の観点からは、粘度の上限は2000mPa・S以下であることが好ましく、1200mPa・S以下であることがより好ましい。なお、粘度は、BL型粘度計により測定することができる。
フォスフォフォリンの精製方法(非コラーゲン性リン酸化タンパク質(A)の調製)
ウシ顎骨から永久歯を抜歯し、前記永久歯から軟組織、歯髄、エナメル質及びセメント質を除去した。続いて、残った象牙質を、タンパク質分解酵素阻害剤(100mM 6−アミノカプロン酸(Sigma社製)、5mM 塩酸ベンズアミジン(Sigma社製)及び1mM フェニルメチルスルフォニルフルオライド(Sigma社製))、0.5M NaCl及び50mM Tris−HClを含有するpH 7.4の緩衝溶液を用いて、4℃で洗浄を行った。次いで、洗浄後の象牙質を液体窒素下にて200メッシュ以下の細粒子に粉砕した。得られた象牙質粉体を、前記タンパク質分解酵素阻害剤、0.5M EDTA及び0.05M Tris−HClを含有するpH 7.4の脱灰溶液を用いて4℃にて脱灰処理を行った。前記脱灰処理後の溶液を、4℃にて脱イオン蒸留水に対し、透析膜(SPECTRUM MWCO 3500,132725)を用いて透析を行った。透析後、得られた溶液を凍結乾燥機(東京理科機械製:EYELA FREEZ DRYER 90500042)を用いて凍結乾燥した。
アルギン酸架橋ゲルの調製方法(カルボキシル基含有多糖(B)の調製)
2.3g(20mmol)のN−ヒドロキシコハク酸イミド(株式会社ペプチド研究所製)を酢酸エチル150mlに溶解し、この溶液に、酢酸エチル10mlに溶解した0.6g(10mmol)のエチレンジアミン(ジアミノエタン:和光純薬株式会社製)を撹拌しながら室温下に滴下した。滴下終了後、さらに1時間撹拌を続けた。析出した結晶を濾取し、減圧下に乾燥してエチレンジアミン2N−ヒドロキシコハク酸イミド塩2.9g(収率100%)を得た。
フォスフォフォリン及びアルギン酸架橋ゲルを含む複合生体材料の調製方法((A)及び(B)を含む複合生体材料の調製)
10mgの上記作製したアルギン酸架橋ゲルスポンジを、0.2mLの0.1M MES〔2−(N−Morpholino)ethanesulfonic Acid、ナカライテスク株式会社製〕を含むpH 4.7の緩衝溶液に浸漬させ、膨潤させた。前記緩衝溶液に膨潤させた前記ゲルに対して、50mg/mLのフォスフォフォリン水溶液を0.2mL添加した後、10mg/mLの1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩水溶液を0.1mL添加し、2時間室温で放置した。上述の手法にしたがって、得られた縮合反応後の溶液を脱イオン蒸留水に対して透析した後に、凍結乾燥することで、フォスフォフォリン−アルギン酸架橋ゲルからなる複合生体材料(スポンジ状シート)を得た。なお、得られた複合生体材料の(A)と(B)の比率は(A):(B)=1:3(重量比)であった。
フォスビチン及びアルギン酸架橋ゲルを含む複合生体材料の調製方法((A)及び(B)を含む複合生体材料の調製)
上述の複合生体材料の調製方法(調製例3−a)において、50mg/mLのフォスフォフォリン水溶液の替わりに50mg/mLのフォスビチン水溶液を0.2mL用いた以外は、前記調製方法(調製例3−a)と同様の手法にしたがって、複合生体材料を調製した。なお、得られた複合生体材料の(A)と(B)の比率は(A):(B)=1:3(重量比)であった。
フォスフォフォリン、アルギン酸架橋ゲル及びBMPを含む複合生体材料の調製方法((A)、(B)及び(C)を含む複合生体材料の調製)
上述の複合生体材料の調製方法(調製例3−a)において、50mg/mLのフォスフォフォリン水溶液を0.2mL添加して得られたものを1×1×1mmに細断し、これに0.5μg/μLのrhBMP−2(ヒトリコンビナントBMP−2;Wurtzburg大学製)を1μL添加した以外は、前記調製方法(調製例3−a)と同様の手法にしたがって、複合生体材料を調製した。なお、得られた複合生体材料の(A)と(B)の比率は(A):(B)=1:3(重量比)であった。
ラットによる象牙質再生試験
(1−1)試料覆髄
以下のプロトコールにて実験的に作製したラット(各々N=3)の露髄面に、上記作製した複合生体材料を充填し、象牙質再生効果を確認した。
8週齢オスWistarラット(体重:約250g)に対し、pentobarbital sodium(ネンブタール;大日本製薬社製)腹腔内全身麻酔下(1.6ml/kg)で開口器にて開口状態を保持した。
オキシドールにて口腔内の消毒を行い、滅菌ダイヤモンドポイント(40SS-S,松風社製)、滅菌ラウンドバー(014,Dentsply社製)にて上顎第一臼歯近心咬頭より人工露髄面を形成した。
露髄面の止血と窩洞の消毒を目的に、10%NaOClと3%H2O2による交互洗浄を行い、上記作製複合生体材料を露髄面において直接覆髄した。
GIC(HY-BOND GLASIONOMER CX,松風社製)、トライエスボンド(クラレメディカル社製),CR(ユニフィル(登録商標)ローフロー,GC社製)を用いて二重仮封した。
対合歯を抜歯してオペを終了した。
以下のプロトコールに従い、移植後の試料をラットより摘出した。
試料覆髄の三週間後に、ジエチルエーテルによる麻酔死の後、メス、歯肉鋏を用いて歯を上顎骨ごと摘出した。その後、直ちに中性ホルマリン溶液にて固定した。
摘出した試料(フォスフォフォリン−コラーゲン複合体及びコラーゲンスポンジ)をヘマトキシリンエオジン染色(HE染色)し、光学顕微鏡にて組織学的観察を行った。
修復象牙質の形態計測
試験例1において取得した試料の修復象牙質の形態計測を光学顕微鏡(ECLIPSE E400, Nikon社製)に接続したNikon DSカメラコントロールユニット DS-L2 にて行った。
なお、(石灰化物面積/髄腔面積)×100から修復象牙質面積(%)を求め、{(石灰化物面積-トンネル状欠損部面積)/石灰化物面積}×100 から修復象牙質の密度(%)を求めた。さらに、修復象牙質による封鎖性、歯髄の炎症の程度を下記に示すとおり評価した。評価結果を表1に示す。
封鎖性
A 完全封鎖
B ほぼ封鎖
C 部分的封鎖
D なし
炎症
A なし、あるいは充血程度
B 軽度炎症
C 中等度炎症
D 強度炎症
試料覆髄に用いる複合生体材料として、上述の調製例3−aの製造方法で調製したフォスフォフォリン−アルギン酸架橋ゲルからなる複合生体材料(スポンジ状シート)を用い、試験例1及び2の評価を行った。
試料覆髄に用いる複合生体材料として、上述の調製例3−bの製造方法で調製したフォスビチン−アルギン酸架橋ゲルからなる複合生体材料(スポンジ状シート)を用い、試験例1の評価を行った。
試料覆髄に用いる複合生体材料として、上述の調製例3−cの製造方法で調製したフォスビチン−アルギン酸架橋ゲル及びBMPからなる複合生体材料(スポンジ状シート)を用い、試験例1及び2の評価を行った。
試料覆髄に用いる複合生体材料として、上述の「調製例2 アルギン酸架橋ゲルの調製方法」で調製したアルギン酸架橋ゲル(スポンジ状シート;非コラーゲン性リン酸化タンパク質(A)を含有していない)を用い、試験例1及び2の評価を行った。
Claims (15)
- 非コラーゲン性リン酸化タンパク質(A)及びカルボキシル基含有多糖(B)を含む複合生体材料であって、前記非コラーゲン性リン酸化タンパク質(A)が、フォスフォフォリン、フォスビチン及びDMP−1からなる群より選ばれる少なくとも1種であり、前記カルボキシル基含有多糖(B)が、アルギン酸及びその塩並びにヒアルロン酸及びその塩からなる群より選ばれる少なくとも1種である、複合生体材料。
- 前記非コラーゲン性リン酸化タンパク質(A)が前記カルボキシル基含有多糖(B)に化学架橋されている請求項1記載の複合生体材料。
- 前記カルボキシル基含有多糖(B)が、架橋多糖である請求項1又は2記載の複合生体材料。
- 前記架橋多糖が、カルボキシル基含有多糖を以下の一般式(I):
R1−NH−(CH2)n−NH−R2 (I)
(式中、R1及びR2はそれぞれ独立して水素原子又は式:−COCH(NH2)−(CH2)4−NH2で表される基を示し、nは2〜18の整数を示す)
で表されるアミン系化合物及びその塩からなる群より選ばれる少なくとも1種からなる架橋剤で架橋してなるものである、請求項3記載の複合生体材料。 - 前記架橋剤が前記一般式(I)で表される化合物のN−ヒドロキシコハク酸イミド塩である請求項4記載の複合生体材料。
- 前記一般式(I)で表される化合物のN−ヒドロキシコハク酸イミド塩が、ジアミノエタンの2N−ヒドロキシコハク酸イミド塩、ジアミノヘキサンの2N−ヒドロキシコハク酸イミド塩、N,N’−ジ(リジル)−ジアミノエタンの4N−ヒドロキシコハク酸イミド塩、及びN−(リジル)−ジアミノヘキサンの3N−ヒドロキシコハク酸イミド塩からなる群より選ばれる少なくとも1種である、請求項5記載の複合生体材料。
- 前記複合生体材料がスポンジ状又はゲル状構造を有している、請求項1〜6のいずれかに記載の複合生体材料。
- さらに増殖因子(C)を含有している請求項1〜7のいずれかに記載の複合生体材料。
- 前記増殖因子(C)が、骨形成因子(BMP)である請求項8記載の複合生体材料。
- さらに、ハイドロキシアパタイト、α−TCP、β−TCP、ポリグリコール酸及びポリ乳酸並びにそれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1種以上を含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の複合生体材料。
- 非コラーゲン性リン酸化タンパク質(A)及びカルボキシル基含有多糖(B)を、架橋剤を用いて共有結合的に化学架橋する工程を含む複合生体材料の製造方法であって、前記非コラーゲン性リン酸化タンパク質(A)が、フォスフォフォリン、フォスビチン及びDMP−1からなる群より選ばれる少なくとも1種であり、前記カルボキシル基含有多糖(B)が、アルギン酸及びその塩並びにヒアルロン酸及びその塩からなる群より選ばれる少なくとも1種である、複合生体材料の製造方法。
- 前記架橋剤がジビニルスルフォンである請求項11記載の製造方法。
- 非コラーゲン性リン酸化タンパク質(A)及びカルボキシル基含有多糖(B)を、脱水縮合剤を用いて共有結合的に結合する工程を含む複合生体材料の製造方法であって、前記非コラーゲン性リン酸化タンパク質(A)が、フォスフォフォリン、フォスビチン及びDMP−1からなる群より選ばれる少なくとも1種であり、前記カルボキシル基含有多糖(B)が、アルギン酸及びその塩並びにヒアルロン酸及びその塩からなる群より選ばれる少なくとも1種である、複合生体材料の製造方法。
- 前記脱水縮合剤が1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドである請求項13記載の製造方法。
- 架橋又は結合後に凍結乾燥又は加熱ゲル化する工程を含む請求項11〜14のいずれかに記載の製造方法。
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