ES2599532T3

ES2599532T3 - Método para producir un diente, conjunto de dientes, y método para producir un tejido

Info

Publication number: ES2599532T3
Application number: ES06756753.7T
Authority: ES
Inventors: Takashi Tsuji; Kazuhisa Nakao
Original assignee: Organ Technologies Inc
Current assignee: Organ Technologies Inc
Priority date: 2005-05-30
Filing date: 2006-05-30
Publication date: 2017-02-02
Anticipated expiration: 2026-05-30
Also published as: AU2006253406A1; JPWO2006129672A1; US20100021866A1; KR20080032044A; WO2006129672A1; CA2610474A1; CA2610474C; JP4991531B2; JP2012135313A; JP5666490B2; AU2006253406B2; EP1905459B8; RU2007148138A; EP1905459A4; NO20076573L; CN101189033A; RU2428140C2; EP1905459B1; US20130109093A1; US8679755B2

Abstract

Un método in vitro de producción de un diente, que comprende: posicionar una primera masa celular que contiene sustancialmente únicamente una de las células mesenquimales o células epiteliales, en el que al menos una de las células mesenquimales o las células epiteliales se obtiene a partir de un germen dentario, y una segunda masa celular que contiene sustancialmente únicamente la otra de las células mesenquimales o las células epiteliales, en el interior de un vehículo de soporte y en estado de contacto estrecho entre sí sin mezclar entre las masas celulares; y cultivar la primera y la segunda masas celulares en el interior del vehículo de soporte.

Description

DESCRIPCION

Metodo para producir un diente, conjunto de dientes, y metodo para producir un tejido.

5 Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a un metodo in vitro de produccion de un diente, un conjunto de dientes, y un metodo para producir un tejido y, especificamente, a un metodo de produccion de un diente, un conjunto de dientes, y un metodo de produccion de tejido periodontal y tejido de foliculos pilosos usando celulas.

10

Tecnica antecedente

El diente es un organo, que puede perderse por caries dentales, enfermedades periodontales o similares, y que tiene los tejidos duros, tales como el esmalte en la capa mas externa y la dentina en la capa interna, y tiene ademas 15 un odontoblasto que forma la dentina en la capa mas profunda del diente y de la pulpa dental en el nucleo. Generalmente, la perdida de dientes hoy se compensa, principalmente, por las protesis y los implantes en muchos casos, ya que se cree que esto es poco amenazante para la vida. Sin embargo, hay un interes creciente en el desarrollo de la tecnologia de regeneracion de dientes en vista de la influencia significativa que la presencia o ausencia de dientes tiene en la apariencia personal y en el sabor de la comida, y desde la perspectiva del 20 mantenimiento de la salud y una alta calidad de vida.

Los dientes son unidades funcionales que se forman por induccion durante el proceso de desarrollo de la etapa fetal y se construyen con varios tipos de celulas, y se cree que son las mismas que para los organos o los organos internos. Por lo tanto, los dientes no se producen por el sistema de celulas madre en el que los tipos de celulas se 25 producen a partir de celulas madre, tales como las celulas madre hematopoyeticas y celulas madre mesenquimales en el cuerpo de un adulto, y los dientes no pueden regenerarse unicamente por la implantacion de celulas madre (terapia de implante de celulas madre) que actualmente se encuentra en fase de desarrollo por la medicina regenerativa. Ademas, aunque se esta considerando la regeneracion de los dientes mediante la identificacion del gen que se expresa especificamente en el proceso de desarrollo de los dientes y que induce artificialmente un 30 germen dentario, la regeneracion dental no puede inducirse por completo simplemente mediante la identificacion del gen.

Por lo tanto, recientemente se han realizado estudios enfocandose principalmente en la regeneracion de los dientes mediante el trasplante de un germen dentario reconstituido obtenido mediante la reconstitucion de un germen 35 dentario usando celulas de germen dentario aisladas.

Por ejemplo, en el Documento no perteneciente a Patente 1, se desvela que un tejido tipo diente se regenera mediante el trasplante de celulas, tales como celulas epiteliales aisladas de un germen dentario y celulas del foliculo dentario mesenquimales, con un vehiculo bioabsorbible en una cavidad abdominal de una rata.

40

En el Documento no perteneciente a Patente 2, se describe que el co-cultivo por gel de colageno es eficaz como un sistema en el que puede realizarse una interaccion epitelio/mesenquimal por celulas subcultivadas.

Como un metodo para regenerar un germen dentario, se describe, por ejemplo, en el Documento de Patente 1, que 45 las celulas de germen dentario se cultivan en presencia de sustancias fisiologicamente activas tales como factores de crecimiento de fibroblastos y similares. En el Documento de Patente 2, se propone que al menos un tipo de celulas seleccionadas entre celulas de germen dentario y celulas que pueden diferenciarse en estas celulas de germen dentario se cultivan junto con un vehiculo que contiene fibrina, y se describe que un "diente" que tiene una forma especifica se forma usando un vehiculo que contiene fibrina que tiene la forma deseada para el germen 50 dentario.

En los Documentos de Patente 3 y 4, se desvela un metodo para formar dientes que incluye sembrar una mezcla celular de una dentina que contiene germen dentario que forma celulas mesenquimales obtenidas de pulpa dental y celulas epiteliales que contribuyen a la formacion de esmalte, de la mandibula de un cerdo de 6 meses, en una 55 estructura que es un polimero biodegradable solidificado que contiene un copolimero de acido poliglicolico/acido poliacetico; y transplantandola a un cuerpo animal. Aqui, se describe que un "diente" que tiene una forma especifica se forma usando una estructura que tiene la forma deseada para el germen dentario.

Adicionalmente, en el Documento de Patente 5, se desvela un metodo de regeneracion dental para tratar un

paciente con perdida o dano oseo. De acuerdo con este metodo, se forma un hueco sembrando celulas mesenquimales en un vehiculo de malla de acido poliglicolico y despues laminando el vehiculo con celulas epiteliales y colageno, o envolviendolo con una lamina de celulas epiteliales. Adicionalmente, en el Documento de Patente 5, se usa un vehiculo para construir la forma de un hueso.

5

El Journal of Investigative Dermatology, 1998, vol. 111 (5), pags. 767-775 desvela la formacion de pelo transplantando una masa celular de celulas mesenquimales que esta en contacto con celulas epiteliales. Despues, las celulas se transplantan en una capsula renal.

10 Documento no perteneciente a Patente 1: J. Dent. Res., 2002, Vol. 81 (10), pags. 695-700

Documento no perteneciente a Patente 2: "Regenerative medicine using teeth and cells derived from a tooth germ and the possibility of the same", Regenerative Medicine, Journal of the Japanese Society for Regenerative Medicine, 2005, Vol. 4(1), pags. 79-83

Documento de Patente 1: Solicitud de Patente Japonesa Abierta a Inspeccion Publica n.° 2004-331557 15 Documento de Patente 2: Solicitud de Patente Japonesa Abierta a Inspeccion Publica n.° 2004-357567

Documento de Patente 3: Publicacion de Solicitud de Patente de Estados Unidos n.° 2002/0119180

Documento de Patente 4: Publicacion de Solicitud de Patente de Estados Unidos n.° 2004/0219489

Documento de Patente 5: Publicacion Internacional (WO) n.° 2005/014070

20 Divulgacion de la invencion

Problemas a resolver por la invencion

Sin embargo, con el fin de funcionar como un tejido, es esencial que una pluralidad de tipos de celulas que 25 constituyen un tejido se coloquen en una posicion relativa apropiada (emplazamiento celular) y tengan direccionalidad como un tejido. El tejido, por ejemplo, un diente, es un "organo interno" o un "organo" producido por una interaccion entre las celulas epiteliales derivadas de un germen dentario y celulas mesenquimales derivadas de celulas de la cresta neural craneal durante los procesos de diferenciacion-desarrollo. Es posible producir dientes normales mediante el trasplante de un germen dentario tal como es; sin embargo, los dientes que tienen el

30 emplazamiento celular especifico y la direccionalidad de la unidad funcional que es un diente no se pueden

regenerar solamente mediante el aislamiento y el cultivo de celulas de germen dentario constituidas por la pluralidad de tipos de celulas.

Aunque un germen dentario se reconstruye utilizando celulas, los factores celulares y similares, en las tecnicas que 35 se han mencionado anteriormente, el emplazamiento celular especifico y la direccionalidad suficiente para expresar las funciones de un diente, no se regeneran.

Ademas, ha sido dificil de reconstruir el tejido que tiene el emplazamiento celular especifico simplemente mediante el aislamiento y el cultivo de una pluralidad de celulas que constituyen el tejido.

40

Por lo tanto, un objeto de la presente invencion es proporcionar un metodo in vitro de produccion de un diente que tenga un emplazamiento celular especifico, un conjunto de dientes preparado por este metodo, y un metodo de produccion de tejido periodontal.

45 Ademas, otro objeto de la presente invencion es proporcionar un metodo in vitro para producir un foliculo piloso que tenga un emplazamiento celular especifico de tejido.

Medios para resolver el problema

50 Un metodo de produccion de un diente de la presente invencion incluye un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1.

Un metodo de produccion de tejido periodontal de la presente invencion incluye un metodo de acuerdo con la reivindicacion 7.

55

Un conjunto de dientes de la presente invencion, embebido en un vehiculo de soporte, se obtiene por el metodo desvelado en la reivindicacion 8 de acuerdo con la reivindicacion 8.

En ambos de los metodos que se han mencionado anteriormente o el conjunto de dientes, es preferible que cada

una de la primera masa celular y la segunda masa celular que se han mencionado anteriormente se obtenga a partir de un germen dentario. Ademas, cada una de la primera masa celular y la segunda masa celular que se han mencionado anteriormente puede ser una masa de celulas individuales.

5 Adicionalmente, un metodo de acuerdo con la invencion es un metodo para producir tejido de foliculo piloso como se desvela en la reivindicacion 11.

En la presente invencion, dado que las masas celulares que contienen sustancialmente unicamente celulas mesenquimales o celulas epiteliales se situan en el interior de un vehiculo de soporte en contacto entre si y se 10 cultivan, cada masa celular crece en el interior del vehiculo de soporte sin mezclarse con las celulas que constituyen la otra masa celular, mientras que el estado de contacto entre las masas se mantiene. Esto hace que sea posible reproducir eficazmente la excelente interaccion entre las celulas mesenquimales y las celulas epiteliales requeridas en la formacion del tejido.

15 Como resultado, puede prepararse un tejido que tiene el emplazamiento celular especifico para el tejido diana. Ademas, un diente o un conjunto de dientes que tiene un emplazamiento celular especifico, en el que hay esmalte fuera y dentina dentro, puede prepararse cuando al menos una de las celulas mesenquimales y las celulas epiteliales se obtiene a partir de un germen dentario.

20 Efecto, o efectos, de la invencion

De acuerdo con la presente invencion, puede proporcionarse un metodo de produccion de un diente que tiene un emplazamiento celular especifico, un conjunto de dientes preparado por este metodo, y un metodo de produccion de tejido periodontal.

25

Ademas, de acuerdo con la presente invencion, puede proporcionarse un metodo de produccion de foliculos pilosos que tiene un emplazamiento celular especifico para el tejido de foliculo piloso.

Breve explicacion de los dibujos 30

[Figura 1 ] La figura 1 es un diagrama esquematico que muestra la formacion del germen dentario.

[Figura 2] (A) a (D) son vistas esquematicas que muestran conceptualmente un procedimiento para la reconstruccion de un germen dentario usando celulas mesenquimales y celulas epiteliales que se obtienen a partir de un germen dentario, de acuerdo con los Ejemplos de la presente invencion.

35 [Figura 3] La figura 3 muestra imagenes de contraste de fases e imagenes de tincion de tejidos de germen

dentario normal e imagenes de tincion de transcurso temporal del diente producido por el trasplante de la capsula subrenal del germen dentario normal, de acuerdo con el Ejemplo Comparativo 1 de la presente invencion.

[Figura 4] La figura 4 muestra imagenes de contraste de fases de un germen dentario reconstituido por los 40 tejidos epiteliales derivados de un germen dentario y celulas mesenquimales derivadas de un germen

dentario e imagenes de tincion de transcurso temporal de un diente producido por el trasplante de la capsula subrenal del germen dentario reconstituido, de acuerdo con el Ejemplo 1 de la presente invencion. [Figura 5] La figura 5 muestra imagenes de contraste de fases de un germen dentario reconstituido por tejido epitelial derivado de un germen dentario y celulas mesenquimales derivadas de un germen dentario 45 de un raton GFP y una imagen de tincion del 14° dia del diente producido por el trasplante de la capsula

subrenal del germen dentario reconstituido, de acuerdo con el Ejemplo 1 de la presente invencion.

[Figura 6] La figura 6 muestra imagenes de contraste de fases de un germen dentario reconstituido por celulas epiteliales derivadas de un germen dentario de un raton GFP y tejidos mesenquimales derivados de un germen dentario y una imagen de tincion del 14° dia del diente producido por el trasplante de la capsula 50 subrenal del germen dentario reconstituido, de acuerdo con el Ejemplo 2 de la presente invencion.

[Figura 7] La figura 7 muestra imagenes de contraste de fases de un germen dentario reconstituido por celulas epiteliales derivadas de un germen dentario y celulas mesenquimales derivadas de un germen dentario y una imagen de tincion del 14° dia del diente producido por el trasplante de la capsula subrenal del germen dentario reconstituido, de acuerdo con el Ejemplo 3 de la presente invencion.

55 [Figura 8] La figura 8 muestra imagenes de contraste de fases de tejidos epiteliales derivados de un germen

dentario y tejidos mesenquimales derivados de un germen dentario y figuras cromaticas del 14° dia del trasplante individual de la capsula subrenal de cada uno de los tejidos anteriores, de acuerdo con el Ejemplo Comparativo 2 de la presente invencion.

[Figura 9] La figura 9 muestra imagenes de contraste de fases de un germen dentario de baja densidad

reconstituido usando tejidos epiteliales derivados de un germen dentario y celulas mesenquimales derivadas de un germen dentario e imagenes de tincion del 20° dia del trasplante de la capsula subrenal del germen dentario de baja densidad reconstituido, de acuerdo con el Ejemplo Comparativo 3 de la presente invencion.

5 [Figura 10] La figura 10 muestra imagenes de contraste de fases de un germen dentario reconstituido

reconstituyendo tejidos epiteliales derivados de un germen dentario y celulas mesenquimales derivadas de un germen dentario en alta densidad y sin compartimentacion, e imagenes de tincion del 20° dia del trasplante de la capsula subrenal del germen dentario de baja densidad reconstituido de acuerdo con el Ejemplo Comparativo 4 de la presente invencion.

10 [Figura 11] La figura 11 muestra imagenes de tincion del hueso alveolar y la membrana periodontal que son

tejidos periodontales formados alrededor del diente producido a partir del germen dentario reconstituido de acuerdo con los Ejemplos 1 a 3 de la presente invencion.

[Figura 12] La figura 12 muestra imagenes de tincion de ARNm de periostatina detectado especifico de una membrana periodontal que es un tejido periodontal formado alrededor del diente producido a partir del 15 germen dentario reconstituido de acuerdo con el Ejemplo 2 de la presente invencion (17° dia despues del

trasplante) y el Ejemplo Comparativo 1 (14° dia despues del trasplante).

[Figura 13] La figura 13 muestra imagenes de contraste de fases e imagenes de tincion del diente producido por un cultivo de organo extendiendo el proceso de cultivo despues de preparar el germen dentario reconstituido de acuerdo con los Ejemplos 4 y 5 de la presente invencion y el Ejemplo Comparativo 5.

20 [Figura 14] La figura 14 muestra imagenes de contraste de fases de un germen dentario reconstituido por

celulas epiteliales derivadas de un germen dentario y celulas mesenquimales derivadas de un germen dentario e imagenes de tincion del 14° dia del diente producido por el trasplante de la capsula subrenal del germen dentario reconstituido, de acuerdo con el Ejemplo 6 de la presente invencion.

[Figura 15] (A) es una imagen de tincion de un raton no candidato a trasplante el 14° dia despues de la 25 extraccion dental de la presente invencion, y (B) es una vista ampliada del area delimitada por el cuadro de

(A), de acuerdo con el Ejemplo Comparativo 6.

[Figura 16] La figura 16 muestra imagenes de tincion del 14° dia despues del trasplante de un germen dentario separado individualmente en la cavidad oral, de acuerdo con el Ejemplo 6 de la presente invencion. [Figura 17] La figura 17 muestra imagenes de tincion del 14° dia despues del trasplante de un diente 30 separado individualmente en la cavidad oral, de acuerdo con el Ejemplo 7 de la presente invencion.

[Figura 18] La figura 18 muestra imagenes de contraste de fases de un foliculo piloso reconstituido por celulas epiteliales derivadas de tejido de foliculo piloso y celulas mesenquimales derivadas de tejido de foliculo piloso e imagenes de tincion del 14° dia del pelo producido por el trasplante de la capsula subrenal del foliculo piloso reconstituido, de acuerdo con el Ejemplo 8 de la presente invencion.

35 [Figura 19] La figura 19 muestra imagenes de microscopio estereoscopico del 14° dia del foliculo piloso

producido por el trasplante de la capsula subrenal del foliculo piloso reconstituido a partir de celulas epiteliales derivadas de tejido de foliculo piloso y celulas mesenquimales derivadas de tejido de foliculo piloso de acuerdo con el Ejemplo 8 de la presente invencion.

[Figura 20] La figura 20 muestra imagenes de contraste de fases de un foliculo piloso reconstituido por 40 celulas epiteliales derivadas de tejido de foliculo piloso y celulas mesenquimales derivadas de tejido de

foliculo piloso de acuerdo con el Ejemplo Comparativo 7 de la presente invencion e imagenes de tincion del 14° dia del foliculo piloso por el trasplante de la capsula subrenal del foliculo piloso reconstituido.

Mejor modo de realizar la invencion 45

Un metodo in vitro de produccion de un diente de la presente invencion incluye: posicionar una primera masa celular que contiene sustancialmente unicamente una de las celulas mesenquimales o celulas epiteliales en la que al menos una de las celulas mesenquimales o las celulas epiteliales se obtiene a partir de un germen dentario, y una segunda masa celular que contiene sustancialmente unicamente la otra de las celulas mesenquimales o las celulas 50 epiteliales, en el interior de un vehiculo de soporte y en contacto entre si (proceso de emplazamiento); y cultivar la primera y segunda masas celulares que se han mencionado anteriormente en el interior del vehiculo de soporte que se ha mencionado anteriormente (proceso de cultivo).

En el presente metodo de produccion de un diente, puesto que las celulas mesenquimales y las celulas epiteliales, 55 obteniendose al menos una de las celulas mesenquimales o las celulas epiteliales de un germen dentario, se cultivan como masas celulares en un vehiculo de soporte mientras que estan en contacto entre si, la interaccion entre las celulas puede realizarse eficazmente debido al estado de estrecho contacto entre las mismas y puede producirse un diente que tiene un emplazamiento celular especifico para los dientes, en el que hay dentina en el interior y esmalte en el exterior.

En la presente invencion, el termino "diente" se refiere a un tejido que tiene una capa de dentina en el interior y una capa de esmalte exterior de forma contigua, y preferiblemente a un tejido que tiene estas estructuras estratificadas y tambien una direccionalidad que tiene una corona y una raiz. Los expertos en la tecnica pueden identificar 5 facilmente la dentina y el esmalte morfologicamente por la tincion de tejidos y similares. Ademas, el esmalte se puede identificar por la presencia de ameloblastos, y la presencia de ameloblastos puede confirmarse por la presencia de amelogenina. Por otro lado, la dentina se puede identificar por la presencia de odontoblastos, y la presencia de odontoblastos puede confirmarse por la presencia de sialoproteina de dentina. La presencia de amelogenina y sialoproteina de dentina se puede confirmar facilmente por un metodo ya conocido en la tecnica; por 10 ejemplo, hibridacion in situ, tincion de anticuerpos o similares.

Ademas, la direccionalidad de un diente puede identificarse por el emplazamiento de una corona y la raiz. La corona y la raiz se pueden confirmar en base a la forma visualmente observada y la tincion tisular.

15 Ademas, en la presente invencion, la expresion "tejido periodontal" se refiere a un hueso alveolar y una membrana periodontal formados principalmente en la capa exterior de un diente. El hueso alveolar y la membrana periodontal pueden ser facilmente identificados morfologicamente por los expertos en la tecnica mediante tincion tisular o similares.

20 Ademas, en la presente invencion, la expresion "celulas mesenquimales" se refiere a celulas derivadas de tejido mesenquimal y "celulas epiteliales" se refiere a celulas derivadas de tejido epitelial.

En la presente invencion, la expresiones "germen dentario" y "brote dentario" son expresiones utilizadas para referirse especificamente al germen dentario y el brote dentario que son distinguibles de otro tejido basado en la 25 fase de desarrollo que se describe mas adelante. En este caso, "germen dentario" se refiere a un embrion en fase inicial de un diente, que esta destinado a convertirse en un diente en el futuro, y al tejido del estadio de brote al estadio de campana en las fases de desarrollo tipicos de un diente y, especificamente, al tejido en el que no se identifica ninguna acumulacion de dentina y esmalte, que son las caracteristicas de los dientes como un tejido duro. Un "brote dentario" se refiere a un tejido en cuanto a la transicion de las fases del "germen dentario" que se usa en 30 la presente invencion, y a un tejido entre la fase en la que se inicia la acumulacion de dentina y esmalte, que son las caracteristicas del tejido duro de un diente, y la fase antes de que el diente germine de la encia para manifestar las funciones tipicas del diente.

Un germen dentario, como se muestra en la figura 1, se desarrolla a traves de cada fase de un estadio de brote, un 35 estadio de casquete, un estadio de campana temprano y un estadio de campana tardio en el proceso ontogenico. En el estadio de brote, las celulas epiteliales se invaginan para envolverse alrededor de las celulas mesenquimales (vease (A) y (B) de la figura 1), y la porcion de celulas epiteliales se convierte en el esmalte exterior y la porcion de las celulas mesenquimales comienza a formar la dentina internamente (vease (C) y (D) de la figura 1) segun se mueve al estadio de campana temprano y el estadio de campana tardio. Por lo tanto, se forma un germen dentario 40 por la interaccion entre las celulas epiteliales y las celulas mesenquimales.

Las celulas mesenquimales y las celulas epiteliales en la presente invencion pueden ser aquellas en las fases del estadio de brote que se ha mencionado anteriormente al estadio de campana tardio, donde se forma, o puede formarse, un germen dentario (en lo sucesivo en el presente documento, simplemente denominado como un 45 "germen dentario"), y desde el punto de vista del nivel de inmadurez y la homogeneidad en las fases de diferenciacion de las celulas, es preferible que esten en los estadios del estadio de brote al estadio de casquete.

Ademas, la expresion "masa celular" se refiere a un estado en el que las celulas estan estrechamente empaquetadas y puede referirse a la condicion del tejido o la condicion de las celulas individuales. Ademas, la 50 expresion "que contiene sustancialmente" significa que cualquier otra cosa que no sean las celulas diana se excluye en la mayor medida posible. Dado que cada masa celular puede ser un tejido en si o una parte del mismo, o una masa de celulas individuales, una cualquiera de las masas de celulas puede ser una masa celular constituida por celulas individuales o ambas de las masas celulares pueden ser masas celulares constituidas por celulas individuales; sin embargo, a fin de lograr eficazmente la reconstruccion de tejido de acuerdo con la presente 55 invencion, es preferible que ambas masas celulares esten constituidas por celulas individuales.

Una primera masa celular o una segunda masa celular pueden ser celulas epiteliales o celulas mesenquimales, y el numero celulas que constituyen la masa celular puede variar dependiendo de la especie animal, y del tipo, dureza y tamano del vehiculo de soporte, pero puede ser generalmente de 101 a 108 celulas por masa celular, y

preferiblemente de 103 a 108 celulas por masa celular.

En el proceso de posicionamiento, una primera masa celular y una segunda masa celular se situan en el interior de un vehiculo de soporte en contacto entre si.

5

En el proceso de posicionamiento del metodo de produccion de la presente invencion, dado que la primera y segunda masas celulares que se han mencionado anteriormente se situan en el interior de un vehiculo de soporte que puede mantener el estado de contacto de las celulas, las celulas que constituyen cada masa celular no se mezclan con las celulas que constituyen la otra masa celular. Por lo tanto, en el proceso de posicionamiento, cada 10 masa celular se situa sin mezclarse entre si, y se forma una superficie limite entre las masas celulares. Tal modo de posicionamiento se expresa adecuadamente como "compartimentacion" en la presente memoria descriptiva.

En este caso, una primera masa celular y una segunda masa celular se preparan en procesos de preparacion independientes (primer proceso de preparacion de celulas y segundo proceso de preparacion de celulas), de manera 15 que cada una de las masas celulares pueda constituirse sustancialmente por celulas mesenquimales o celulas epiteliales.

Al menos una cualquiera de las celulas mesenquimales o las celulas epiteliales usadas en el presente metodo de produccion puede derivarse de un germen dentario para reproducir el emplazamiento celular in vivo para formar un 20 diente que tenga una estructura y direccionalidad especificas; sin embargo, con el fin de asegurar la produccion dentaria, mucho mas preferiblemente, tanto las celulas mesenquimales como las celulas epiteliales se obtienen a partir de un germen dentario.

Los ejemplos de celulas mesenquimales derivadas de otros que no sean un germen dentario incluyen celulas 25 derivadas de otros tejidos mesenquimales in vivo; preferiblemente, celulas de medula osea, incluyendo celulas no sanguineas, o celulas madre mesenquimaticas; mas preferiblemente, celulas mesenquimales en la cavidad oral y celulas de la medula osea en el interior del hueso de la mandibula, y celulas mesenquimales derivadas de celulas de la cresta neural craneal; y celulas precursoras mesenquimatosas, que pueden generar las celulas mesenquimales anteriormente mencionadas, celulas madre de las mismas, y similares.

30

Ademas, los ejemplos de las celulas epiteliales derivadas de tejidos distintos de un germen dentario incluyen celulas derivadas de otros tejidos epiteliales in vivo; preferentemente, celulas epiteliales de la piel, membrana mucosa o encia en la cavidad oral; y mas preferiblemente, celulas precursoras epiteliales inmaduras que pueden producir celulas epiteliales diferenciadas, por ejemplo, celulas epiteliales queratinizadas o paraqueratinizadas de la piel y la 35 membrana mucosa; por ejemplo, celulas epiteliales no queratinizadas y las celulas madre de las mismas, y similares.

El germen dentario y otros tejidos pueden recogerse del hueso de la mandibula de diversos animales, tales como mamiferos primates, tales como seres humanos y monos; ungulados, tales como cerdos, vacas y caballos; pequenos mamiferos roedores, tales como ratones, ratas y conejos. En la recogida del germen dentario y el tejido, 40 las condiciones utilizadas generalmente en la recogida de tejido pueden aplicarse sin modificacion, y el germen dentario y el tejido pueden extraerse en condiciones esteriles y almacenarse en una solucion conservante apropiada. Ademas, los ejemplos de un germen dentario humano incluyen un germen dentario fetal, asi como el tercer molar, o la denominada muela del juicio, pero es preferible utilizar el germen dentario de una muela del juicio desde el punto de vista de la utilizacion de tejidos autogenos.

45

La preparacion de celulas mesenquimales y celulas epiteliales a partir de tal germen dentario se inicia mediante la separacion de un germen dentario, que se ha aislado del tejido circundante, en un tejido mesenquimal de germen dentario y un tejido epitelial de germen dentario de acuerdo con las respectivas formas de los mismos. Los tejidos de germen dentario se pueden separar facilmente por corte o desgarro usando tijeras de diseccion, pinzas o similares, 50 ya que es posible identificar los tejidos de germen dentario estructuralmente bajo un microscopio. Ademas, la separacion del tejido mesenquimatoso de germen dentario y el tejido epitelial de germen dentario del germen dentario se puede hacer facilmente mediante corte o rasgado utilizando agujas de inyeccion, agujas de tungsteno, pinzas o similares, de acuerdo con las respectivas formas de los mismos.

55 Preferiblemente, pueden usarse facilmente enzimas para separar las celulas de germen dentario del tejido circundante y/o para separar un tejido epitelial y un tejido mesenquimatoso de un tejido de germen dentario. Los ejemplos de las enzimas usadas en tales aplicaciones incluyen dispasa, colagenasa, tripsina y similares.

Las celulas mesenquimales y las celulas epiteliales se pueden preparar en un unico estado celular a partir de un

tejido mesenquimal y un tejido epitelial, respectivamente. En el proceso de preparacion, pueden usarse enzimas para hacer que las celulas sean facilmente dispersables como celulas individuales. Los ejemplos de tales enzimas incluyen dispasa, colagenasa, tripsina y similares. En este caso, para la separacion de las celulas epiteliales del tejido epitelial, es preferible realizar el tratamiento con tripsina y DNasa tratamiento despues del tratamiento con 5 colagenasa. Por otra parte, para la separacion de las celulas mesenquimales del tejido mesenquimal, es preferible realizar un tratamiento con colagenasa y un tratamiento con tripsina simultaneamente, y por ultimo, realizar un tratamiento con DNasa. En este caso, el tratamiento con DNasa se realiza con el fin de evitar una disminucion en la cantidad de celulas recuperadas resultantes de la agregacion celular causada por el ADN liberado en la solucion cuando se lisa la membrana celular, despues de que algunas de las celulas se danen por los tratamientos 10 enzimaticos.

Ademas, las celulas mesenquimales y celulas epiteliales pueden ser aquellas que se han sometido a un cultivo preliminar antes del proceso de posicionamiento con el fin de obtener un numero suficientemente grande de cada clase de las celulas. En el cultivo de celulas mesenquimales y celulas epiteliales, las condiciones habituales, tales 15 como la temperatura, que se usan en el cultivo de celulas animales pueden aplicarse sin modificacion.

Como medio utilizado en el cultivo, puede usarse un medio utilizado generalmente para el cultivo celular animal, tal como medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM). Puede anadirse suero para promover la proliferacion celular, o como alternativas al suero, se pueden anadir factores de crecimiento celular tales como FGF, EGF, PDGF y 20 similares, o componentes de suero ya conocidos, tales como transferrina. Ademas, cuando se anade suero, la concentracion del suero puede cambiarse apropiadamente dependiendo de las condiciones de cultivo, pero por lo general puede ser del 10 %. Para el cultivo celular, pueden aplicarse las condiciones de cultivo usadas generalmente en el cultivo, tales como el cultivo en una incubadora en una concentracion de CO2 al 5 % a 37 °C. Ademas, pueden anadirse antibioticos, tal como estreptomicina, segun sea apropiado 25

Como un vehiculo de soporte utilizado en la presente invencion, puede usarse un vehiculo de soporte en el que las celulas pueden ser cultivadas, y es preferible una mezcla con el medio de cultivo que se ha mencionado anteriormente. Los ejemplos de tales vehiculos de soporte incluyen colageno, fibrina, laminina, una mezcla de matriz extra-celular, acido poliglicolico (PGA), acido polilactico (PLA), copolimero de acido lactico/acido glicolico (PLGA), 30 Cellmatrix (nombre comercial), Mebiol Gel (nombre comercial), y Matrigel (nombre comercial). Estos vehiculos de soporte pueden ser de una dureza que practicamente puede mantener la ubicacion aproximada en la que se colocan las celulas en el interior de los mismos, y los ejemplos de los mismos incluyen vehiculos de tipo gel, de tipo de fibra, y de tipo solido. En este caso, el nivel de dureza que puede mantener la ubicacion de las celulas puede ser el nivel de dureza generalmente aplicado en un cultivo tridimensional; en otras palabras, un nivel de dureza que no inhiba la 35 hipertrofia de las celulas debido a la proliferacion mientras que se mantiene el posicionamiento de las celulas, y el nivel de dureza se determina facilmente. Por ejemplo, en el caso del colageno, el uso a una concentracion final de 2,4 mg/ml proporciona un nivel apropiado de dureza.

Ademas, en este caso, el vehiculo de soporte puede ser de un espesor suficiente para que la primera y segunda 40 masas de celulas crezcan en el interior del vehiculo y se ajusta apropiadamente en base al tamano de los tejidos diana.

Ademas, el vehiculo de soporte puede ser uno que pueda mantener el estado de contacto entre las celulas. El "estado de contacto" al que se hace referencia en el presente documento es preferiblemente un estado de alta 45 densidad con el fin de garantizar la interaccion celular dentro de cada masa de celulas o entre las masas celulares.

Un estado de alta densidad se refiere a una densidad similar a la del momento en el que el tejido esta constituido tal como, en el caso de las masas de celulas, 5 x 107 a 1 x 109/ml en el momento del emplazamiento celular, preferiblemente 1 x 108 a 1 x 109/ml para asegurar la interaccion celular sin sacrificar la actividad celular, y mucho 50 mas preferiblemente 2 x 108 a 8 x 108/ml. Con el fin de preparar una masa de celulas a tal densidad celular, es preferible agregar las celulas por centrifugacion y haber precipitado estas, ya que esto permite convenientemente una alta densidad sin sacrificar la actividad celular. La centrifugacion se puede realizar a una velocidad de revolucion equivalente a una fuerza centrifuga de 300 a 1.200 x g, que no impedira la supervivencia celular, y preferiblemente de 500 a 1000 x g, durante 3 a 10 minutos. La centrifugacion a menos de 300 x g puede dar lugar a una 55 precipitacion celular insuficiente y la densidad celular puede llegar a ser baja, mientras que la centrifugacion a mas de 1200 x g puede conducir a dano celular y, por lo tanto, ninguno de estos casos es preferible.

Cuando las celulas de alta densidad se preparan por centrifugacion, centrifugacion se realiza generalmente despues de preparar una suspension de celulas individuales en recipientes tales como tubos utilizados para la centrifugacion

de celulas, y el sobrenadante se elimina en la mayor medida posible, dejando a las celulas como el precipitado. Es preferible que los recipientes, tales como tubos esten revestidos de silicio desde el punto de vista de eliminar por completo el sobrenadante.

5 Cuando se preparan precipitados por centrifugacion, los precipitados se pueden colocar directamente en el interior del vehiculo de soporte. Aqui, los componentes distintos de las celulas diana (por ejemplo, una solucion de cultivo, una solucion de tampon, el vehiculo de soporte, y similares) son, preferiblemente, igual a o menor en volumen que las celulas, y mucho mas preferiblemente, se excluyen los componentes distintos de las celulas diana. En tal masa celular de alta densidad, las celulas estan en estrecho contacto entre si y la interaccion entre las celulas puede 10 conseguirse de manera eficaz.

Al usarse en un estado de tejido, es preferible eliminar los componentes distintos de las celulas diana, tales como tejidos conectivos, realizando un tratamiento enzimatico o similar. Cuando hay muchos componentes distintos de las celulas diana, por ejemplo, cuando el volumen de los otros componentes es igual o mayor que el de las celulas, la 15 interaccion entre las celulas no puede conseguirse de manera suficiente, y esto no es preferible.

Ademas, es mas preferible cuando una primera masa de celulas y una segunda masa de celulas estan en contacto muy estrecho, y es especialmente preferible posicionar la segunda masa de celulas para presionar contra la primera masa celular. Ademas, abarcar los alrededores de la primera masa celular y la segunda masa celular con una 20 solucion de cultivo o solido que no inhibe la permeacion de oxigeno es tambien eficaz en la toma de contacto entre las masas celulares mas cercanas, y tambien es preferible anadir y posicionar una suspension celular a alta densidad en una solucion con una viscosidad diferente para solidificar la solucion tal cual, ya que el contacto celular se puede mantener facilmente de esta manera. Aqui, es preferible poner el nudo del esmalte de un tejido epitelial de germen dentario en contacto con la primera masa celular cuando la primera masa celular es la masa de celulas 25 individuales de celulas mesenquimales de germen dentario y la segunda masa de celulas es un tejido epitelial de germen dentario, pero la invencion no se limita a esto.

Cuando el vehiculo de soporte esta en un estado de gel, un estado en solucion o similares, el proceso de solidificacion por el cual se solidifica un vehiculo de soporte puede disponerse de manera que siga despues del 30 proceso de posicionamiento. Las celulas situadas en el interior del vehiculo de soporte se pueden fijar en el interior del vehiculo de soporte por el proceso de solidificacion. Para la solidificacion del vehiculo de soporte, las condiciones usadas generalmente para la solidificacion de los vehiculos de soporte pueden aplicarse sin modificacion. Por ejemplo, cuando se utilizan compuestos solidificables tales como el colageno para el vehiculo de soporte, se pueden solidificar en condiciones generalmente aplicadas, por ejemplo, manteniendose todavia durante 35 varios minutos a varias decenas de minutos a la temperatura del cultivo. De esta manera, la union entre las celulas en el interior del vehiculo de soporte puede ser fija y robusta.

En el proceso de cultivo del metodo de produccion de la presente invencion, una primera masa celular y una segunda masa celular se cultivan en el interior del vehiculo de soporte. En este proceso de cultivo, la interaccion 40 entre las celulas se realizar eficazmente por la primera masa celular y la segunda masa celular que estan en estrecho contacto entre si, para reconstituir un tejido, es decir, un diente.

El proceso de cultivo se puede realizar de tal manera que el estado de contacto entre la primera masa celular y la segunda masa celular se mantenga por el vehiculo de soporte y el proceso puede ser un cultivo en un vehiculo de 45 soporte que simplemente tiene la primera y segunda masas celulares, o un cultivo en presencia de otras celulas de animales.

El periodo de cultivo varia en funcion del numero de celulas colocadas en el vehiculo de soporte y el estado de la masa celular y, ademas, en las condiciones en que se realiza el proceso de cultivo; sin embargo, por lo general tarda 50 de 1 a 300 dias, y preferiblemente de 1 a 120 dias, en formar un diente que tenga esmalte en el exterior y dentina en el interior, y preferiblemente de 1 a 60 dias desde el punto de vista de proporcionar resultados rapidos. Ademas, tipicamente tarda de 1 a 300 dias, y preferiblemente de 1 a 60 dias, en formar un diente que tenga tejido periodontal.

Cuando el cultivo se realiza solo en el vehiculo de soporte, el cultivo se puede realizar en las condiciones generales 55 usadas para el cultivo de celulas animales. Aqui, las condiciones de cultivo usadas generalmente para celulas animales pueden aplicarse sin modificacion, y las condiciones que se han mencionado anteriormente se pueden aplicar sin modificacion. Ademas, el suero derivado de mamiferos y diversos factores celulares que se sabe que es eficaz en la proliferacion y diferenciacion de estas celulas, se puede anadir al cultivo. Los ejemplos de estos factores celulares incluyen FGF y BMP.

Ademas, es preferible usar el cultivo de organos desde la perspectiva del intercambio de gases y el suministro de nutrientes para los tejidos y las masas celulares. En el cultivo de organos, por lo general, el cultivo se realiza haciendo flotar una membrana porosa en un medio de cultivo adecuado para la proliferacion de las celulas animales 5 y poniendo las masas celulares embebidas en un vehiculo de soporte en la membrana. La membrana porosa usada en el presente documento es, preferiblemente, una membrana que tiene muchos poros de 0,3 a 5 pm de diametro y los ejemplos especificos incluyen un Cell Culture Insert (nombre comercial) y un filtro Isopore (nombre comercial).

La realizacion del cultivo en presencia de otras celulas de animales es preferible porque un diente que tiene un 10 emplazamiento celular especifico se puede formar en la fase temprana en respuesta a las acciones de diversas citocinas y similares, a partir de celulas animales. Tal cultivo en presencia de otras celulas de animales puede realizarse ex vivo usando celulas aisladas y celulas cultivadas.

Ademas, es especialmente preferible realizar un cultivo in vivo (diferente de la presente invencion) mediante el 15 trasplante del vehiculo de soporte que tiene la primera y segunda masas celulares en un cuerpo vivo, ya que un diente y/o un tejido periodontal se puede formar en una fase temprana. En este caso, la primera y la segunda masas celulares se trasplantan con el vehiculo de soporte en el cuerpo vivo.

Los animales que se pueden utilizar para esta solicitud incluyen, preferiblemente, mamiferos, por ejemplo, seres 20 humanos, cerdos, ratones y similares, y mas preferiblemente animales procedentes de la misma especie que la del tejido de germen dentario. Cuando se trasplanta un tejido de germen dentario humano, es preferible utilizar un ser humano o de mamiferos distintos de seres humanos que han sido alterados para ser inmunodeficientes. En cuanto a los sitios en un cuerpo vivo adecuados para tal crecimiento in vivo, son preferibles un trasplante de la capsula subrenal, mesenterico, y subcutaneo para el trasplante con el fin de generar organos o tejidos de las celulas 25 animales lo mas normalmente posible.

El periodo de crecimiento de acuerdo con el trasplante varia dependiendo del tamano del explante en el momento del trasplante y el tamano del diente que se va a producir, pero es tipicamente de 3 a 400 dias. Por ejemplo, el periodo de trasplante de la capsula subrenal es preferiblemente de 7 a 60 dias desde el punto de vista de la 30 regeneracion dentaria y el tamano del diente que se va a producir en el lugar del trasplante, aunque varia dependiendo del tamano del explante a trasplantar y el tamano del diente a regenerar.

El cultivo ex vivo (precultivo) puede realizarse antes del trasplante al cuerpo vivo. El precultivo es preferible ya que los enlaces entre las celulas y el enlace entre la primera y la segunda masas celulares pueden hacerse mas fuerte 35 para hacer que la interaccion entre las celulas sea mas fuerte. Como resultado, el periodo de crecimiento total se puede acortar.

El periodo de precultivo puede ser corto o largo. Es deseable tener un periodo mas largo, por ejemplo, 3 dias o mas, y preferiblemente de 7 dias o mas, ya que un brote dentario puede producirse a partir de un germen dentario y, por 40 lo tanto, el periodo hasta que un diente se forma despues del trasplante se puede acortar. El periodo de precultivo, por ejemplo, del cultivo de organos para trasplante debajo de una capsula subrenal, es preferiblemente de 1 a 7 dias con el fin de regenerar eficazmente un diente.

Un diente producido de acuerdo con el metodo de produccion de la presente invencion tiene un emplazamiento 45 celular especifico del diente (estructura) que tiene dentina en el interior y esmalte en el exterior, y preferiblemente tiene direccionalidad, es decir, tiene una punta (corona) y una raiz de un diente. Al tener al menos este emplazamiento celular especifico, y al tener preferiblemente direccionalidad ademas del emplazamiento celular, las funciones de un diente pueden manifestarse. Por lo tanto, puede usarse ampliamente un diente de este tipo extensamente como un reemplazo de un diente. Particularmente, cuando se usan las celulas mesenquimales y las 50 celulas epiteliales derivadas de un germen dentario autogeno, pueden evitarse los problemas causados por el rechazo. Generalmente, tambien es posible evitar los problemas causados por el rechazo cuando las celulas se derivan del germen dentario de otro ser humano que tiene un antigeno de trasplante correspondiente.

Ademas, en la presente invencion, es posible formar el tejido periodontal, ademas del propio diente, tales como el 55 hueso alveolar y la membrana periodontal, que soportan y estabilizan los dientes en el hueso de la mandibula, extendiendo el periodo de cultivo. Como resultado, puede proporcionarse un diente viable despues del trasplante.

Es decir, el metodo de produccion de tejido periodontal de la presente invencion se caracteriza por que contiene el proceso de cultivo que se ha mencionado anteriormente como una etapa para el cultivo de la primera y segunda

masas celulares que se han mencionado anteriormente en el interior de un vehiculo de soporte hasta que pueden obtenerse un diente y un tejido periodontal contiguo al diente (proceso de cultivo), y que contiene ademas una etapa para aislar el tejido periodontal obtenido por el cultivo que se ha mencionado anteriormente.

5 En este metodo, un tejido periodontal puede estar formado de forma contigua al diente mediante la extension del periodo de cultivo hasta que se obtiene el tejido periodontal, y el tejido periodontal puede obtenerse en aislamiento separandolo del diente. El aislamiento del tejido periodontal se puede realizar de acuerdo con cualquier metodo, en el que el tejido periodontal formado durante el proceso de cultivo se puede separar de un diente, por ejemplo, separacion por pinzas o similares, digestion parcial por enzimas, o similar.

10

Ademas, cualquier cosa descrita en el metodo de produccion de un diente que se ha mencionado anteriormente se puede aplicar al presente metodo de produccion de un tejido periodontal, siempre que el periodo de cultivo no se limite.

15 El diente y el tejido periodontal obtenidos por el metodo de produccion de un diente y el metodo de produccion de tejido periodontal que se han mencionado anteriormente de la presente invencion se pueden utilizar como una herramienta de investigacion eficaz para la produccion de tejido en relacion con los dientes en el futuro ya que, ademas de usarse como un explante, pueden aplicarse a estudios de investigacion de los procesos de desarrollo de los dientes.

20

Ademas, cuando el diente o tejido periodontal obtenido se utiliza como un explante, el proceso de cultivo de acuerdo con el metodo de produccion se realiza preferiblemente en un cultivo de organos en el que no hay contacto con otras celulas de animales y todo el procedimiento se puede procesar in vitro.

25 Un conjunto de dientes de la presente invencion es un conjunto de dientes que tiene un emplazamiento celular especifico del diente obtenido por el metodo de produccion de un diente que se ha mencionado anteriormente.

Dado que tal conjunto de dientes esta constituido por una pluralidad de dientes que tienen un emplazamiento celular especifico del diente, cada diente individual se puede separar del conjunto de los dientes y usarse como un explante 30 de un unico diente, como se describe a continuacion. Por lo tanto, en el metodo de produccion de un diente de la presente invencion, cuando se produce una pluralidad de dientes simultaneamente, los dientes pueden proporcionarse como un conjunto de dientes constituido por una pluralidad de dientes. Como resultado, pueden producirse de forma eficiente dientes para explantes.

35 El conjunto de dientes se puede obtener facilmente mediante la aplicacion del metodo de produccion de un diente que se ha mencionado anteriormente sin modificacion. En particular, en el primer y segundo procesos de preparacion de celulas que se han mencionado anteriormente, cada una de una primera y una segunda masa celular se prepara por separado y despues se situan en el interior de un vehiculo de soporte en contacto entre si en el proceso de emplazamiento y, por lo tanto, puede formarse facilmente una pluralidad de dientes a partir de un grupo 40 de celulas que normalmente forma solamente un unico diente.

En el metodo de produccion de un conjunto de dientes, es preferible que ambas de una primera y una segunda masas celulares esten constituidas por celulas individuales para facilitar la reinduccion de germenes dentarios para producir una pluralidad de dientes. Ademas, el proceso de cultivo puede ser un cultivo de organo o un cultivo de 45 capsula subrenal como se ha mencionado anteriormente, y cuando el diente obtenido se usa como un explante, es preferible realizar un cultivo de organo en el que no hay contacto con otras celulas de animales y todo el procedimiento puede procesarse in vitro.

Ademas, un metodo de trasplante de diente se describe en la presente invencion. Este metodo de trasplante incluye: 50 un proceso para obtener el conjunto de dientes que se ha mencionado anteriormente; un proceso en el que cada diente se separa de un conjunto de dientes; y un proceso en el que un diente separado se alinea para tener la misma direccionalidad que otros dientes en el sitio de trasplante, y se trasplanta.

De este modo, se puede obtener de forma simultanea una pluralidad de dientes que tiene un emplazamiento celular 55 especifico y direccionalidad, y el trasplante de dientes puede realizarse de manera eficiente.

El diente de acuerdo con la presente invencion se puede aplicar a los tratamientos o procedimientos para la perdida de dientes causada por diversos sintomas acompanados por la perdida o dano de los dientes: por ejemplo, caries dental, periodontitis marginal (piorrea alveolar), y enfermedades periodontales, rotura del diente o arrancamiento

causado por accidentes, y similares.

En otras palabras, un metodo de tratamiento descrito en el presente documento incluye el trasplante del diente y/o el tejido periodontal obtenido por el metodo de produccion de la presente invencion en el sitio de la perdida y/o danos 5 de los dientes. De esta manera, los sintomas que se han mencionado anteriormente en el sitio de la perdida y/o danos dentales pueden tratarse y/o aliviarse.

Otro metodo de tratamiento descrito en el presente documento incluye la realizacion de solo el proceso de cultivo de la presente invencion, o realizar el proceso de posicionamiento y el proceso de cultivo en el sitio de la perdida y/o 10 dano dental. En este caso, el tejido circundante en el sitio de la perdida y/o dano dental en si se puede aplicar como un vehiculo de soporte, ademas de los vehiculos de soporte que se han mencionado anteriormente. Por lo tanto, el sitio de la perdida y/o dano dental puede tratarse mas rapido por citocinas y similares, de los tejidos circundantes en el cuerpo vivo.

15 En la presente invencion, ya que el tejido se puede reconstituir de manera eficaz por una interaccion entre las celulas mesenquimales y celulas epiteliales, tambien puede proporcionarse un metodo in vitro de produccion de foliculos pilosos que estan construidos por una interaccion entre las celulas mesenquimales y las celulas epiteliales.

En otras palabras, el metodo de produccion de un tejido de la presente invencion es un metodo de produccion de 20 foliculos pilosos construidos por una interaccion entre las celulas mesenquimales y las celulas epiteliales, e incluye: posicionar una primera masa celular que contiene sustancialmente unicamente una de las celulas mesenquimales o celulas epiteliales y una segunda masa celular que contiene sustancialmente unicamente la otra de las celulas mesenquimales o las celulas epiteliales en el interior de un vehiculo de soporte en contacto entre si; y cultivar la primera y segunda masas celulares que se han mencionado anteriormente en el interior del vehiculo de soporte que 25 se ha mencionado anteriormente.

Ademas, los elementos descritos en el metodo de produccion de un diente que se ha mencionado anteriormente se pueden aplicar de manera similar al presente metodo de produccion de foliculos pilosos, a menos que se indique otra cosa.

30

Como tejidos producidos por el presente metodo de produccion de tejido, son relevantes los construidos por la interaccion entre las celulas mesenquimales y celulas epiteliales, y los ejemplos de estos incluyen un pelo, rinon (distinto de la invencion), pulmon (no forma parte de la invencion), higado (no forma parte de la invencion) o similares, ademas del diente que se ha mencionado anteriormente, y puede incluir todo el tejido o una parte del 35 mismo.

En este caso, es preferible que al menos una de las celulas mesenquimales y las celulas epiteliales se obtenida a partir del tejido diana. De esta manera, un tejido se puede formar facilmente mediante el uso de celulas que ya han sido dirigidas al tejido diana. Ademas, con el fin de producir un tejido diana de manera mas fiable, es mas preferible 40 que ambas de las celulas mesenquimales y las celulas epiteliales se obtengan a partir del tejido diana.

Los ejemplos de tejidos utilizados para preparar una masa celular constituida respectivamente por celulas mesenquimales o celulas epiteliales incluyen: en el caso de un diente, un germen de diente y las celulas de la pulpa dental, celulas de la membrana periodontal, y las celulas epiteliales/mesenquimatosas en la cavidad oral; en el caso 45 de pelo, un foliculo piloso original en el proceso de desarrollo y un tejido foliculo piloso de un adulto; en el caso de un rinon, un rinon original en el proceso de desarrollo y un tejido de rinon de un adulto (no forma parte de la invencion); en el caso de un pulmon, un pulmon original en el proceso de desarrollo y un tejido pulmonar de un adulto (no forma parte de la invencion); y en el caso de un higado, un higado primordial en el proceso de desarrollo y un tejido hepatico de un adulto (no forma parte de la invencion).

50

Con el fin de preparar cada masa celular de estos tejidos, se puede preparar una primera y una segunda masa de celulas como se ha descrito anteriormente mediante la separacion de celulas mesenquimales y celulas epiteliales de un tejido, su posicionamiento en el interior de un vehiculo de soporte, y el cultivo y/o el trasplante como se ha descrito anteriormente.

55

De esta manera, como con el diente que se ha mencionado anteriormente, puede obtenerse un tejido que tiene un emplazamiento celular especifico para el tejido diana.

Los siguientes son explicaciones de los Ejemplos de la presente invencion, pero la presente invencion no se limita a

estos. "%" como se usa en los Ejemplos, se basa en el peso (masa), a menos que se indique otra cosa.

Ejemplos

5 [Ejemplos 1 a 3 y Ejemplos Comparativos 1 a 4]

(1) Preparacion de celulas epiteliales de germen dentario y celulas mesenquimales de germen dentario

Se reconstruyo un germen dentario para formar un diente. Se usaron ratones como el modelo para este 10 experimento.

Un tejido de germen dentario de un incisivo mandibular se extirpo de un embrion, que tenia una edad embrionaria de 14,5 dias, de un raton C57BL/6N (adquirido en CLEA Japan, Inc.) o un C57BL/6-TgN (act-EGFP) OsbC14-Y01- FM131 (raton GFP: RIKEN Bioresource Center) que es un raton transgenico de proteina verde fluorescente (EGFP), 15 mediante el metodo convencional bajo un microscopio. El tejido de germen dentario de incisivo mandibular se lavo con una solucion de tampon fosfato (PBS (-)) que no contenia Ca2+ ni Mg2+, se trato con una solucion enzimatica, en la que se anadio Dispasa II (Roche, Mannheim, Alemania) a PBS (-) a una concentracion final de 1,2 U/ml, a temperatura ambiente durante 12,5 minutos, y despues se lavo tres veces con DMEM (Sigma, St. Louis, MO) al que se le habia anadido un 10 % de FCS (JRH Biosciences, Lenexa, KS). Ademas, se anadio una solucion de DNasa I 20 (Takara, Shiga, Japon) para hacer la concentracion final 70 U/ml y el tejido de germen dentario se disperso, y los tejidos epiteliales de germen dentario y los tejidos mesenquimales de germen dentario se separaron quirurgicamente usando una aguja de inyeccion de 25G (Terumo, Tokio, Japon).

Para las celulas epiteliales de germen dentario, el tejido epitelial de germen dentario que se ha obtenido 25 anteriormente se lavo tres veces con PBS (-), y se trato dos veces con una solucion enzimatica, en la que se disolvio Colagenasa I (Worthington, Lakewood, NJ) a una concentracion final de 100 U/ml en PBS (-), a 37 °C durante 20 minutos. Las celulas precipitadas y recuperadas por centrifugacion se trataron adicionalmente con tripsina al 0,25 % (Sigma) - PBS (-) a 37 °C durante 5 minutos. Despues de lavar las celulas tres veces con DMEM complementado con FCS al 10 %, a las celulas se les anadio una solucion de DNasa I a una concentracion final de 30 70 U/ml, y se obtuvieron por adicion con pipeta celulas epiteliales de germen dentario individuales.

Por otra parte, para las celulas mesenquimales de germen dentario, el tejido mesenquimal de germen dentario se lavo tres veces con PBS (-) y se trato con PBS (-) que contenia tripsina al 0,25 % (Sigma) y 50 U/ml de Colagenasa I (Worthington). Se anadieron 70 U/ml de DNasa I (Takara) y se obtuvieron por adicion con pipeta celulas 35 mesenquimales de germen dentario individuales.

(2) Preparacion de germen dentario reconstituido

A continuacion, un germen dentario se reconstruyo usando celulas epiteliales de germen dentario y celulas 40 mesenquimales de germen dentario preparadas como anteriormente.

Se anadieron celulas epiteliales de germen dentario o celulas mesenquimales de germen dentario suspendidas con DMEM (Sigma) complementado por FCS al 10 % (JRH Biosciences), en un microtubo de 1,5 ml recubierto con grasa de silicio (Eppendorf, Hamburgo, Alemania), y las celulas se recuperaron como precipitados por centrifugacion (580 45 x g). El sobrenadante de la solucion de cultivo despues de la centrifugacion se elimino en la mayor medida posible, la centrifugacion se realizo de nuevo, y la solucion de cultivo restante alrededor de los precipitados celulares se elimino completamente usando una punta GELoader de 0,5 a 20 pl (Eppendorf) mientras que se observo bajo un estereomicroscopio para preparar celulas para usar en la generacion de un germen dentario reconstituido.

50 Se anadieron por goteo 30 pl de Cellmatrix tipo I-A (Nitta Gelatin, Osaka, Japon) preparada con la solucion de cultivo que se ha mencionado anteriormente a una concentracion de 2,4 mg/ml sobre una placa de Petri recubierta con grasa de silicio para generar una gota (gota de gel) de solucion de colageno. Se aplicaron a esta solucion de 0,2 a 0,3 pl de los precipitados de la centrifugacion de las celulas epiteliales de germen dentario o las celulas mesenquimales de germen dentario que se han mencionado anteriormente usando una punta de pipeta (Quality 55 Scientific Plastics) de 0,1 a 10 pl para generara agregados celulares como masas celulares.

Esto se explicara con referencia a la figura 2.

El agregado celular 12, que se puso en primer lugar en el interior de la gota de gel 10 usando la punta de pipeta 16,

configura una esfera en el interior de la gota de gel 10 (vease la figura 2 (B)). Cuando se inserta despues otro agregado celular 14, el agregado celular esferico 12 se tritura y envuelve el agregado celular 14 en muchos casos (vease la figura 2 (C)). Despues, mediante la solidificacion de la gota de gel 10, las uniones entre las celulas se refuerzan.

5

En el presente Ejemplo, se prepararon un agregado celular que contenia celulas individuales de las celulas epiteliales o las celulas mesenquimales, y un tejido parcial que contenia celulas epiteliales y un tejido parcial que contenia celulas mesenquimales de un germen dentario, respectivamente, como masas celulares, y se usaron.

10 En el presente Ejemplo, al combinar los germenes dentarios reconstituidos obtenidos de un agregado celular y un tejido (Ejemplos 1 y 2), despues de transferir el tejido parcial que contenia celulas epiteliales o celulas mesenquimales en una gota de gel, una superficie limite del germen dentario de cada tejido se puso en estrecho contacto con un agregado celular generado a partir de celulas epiteliales o celulas mesenquimales de germen dentario usando una aguja de tungsteno para generar un germen dentario reconstituido.

15

Ademas, para el germen dentario reconstituido (Ejemplo 3) usando celulas epiteliales de germen dentario y celulas mesenquimales de germen dentario que se hicieron como celulas individuales, se preparo un agregado celular aplicando las celulas epiteliales de germen dentario de una manera similar a la anterior para el contacto con el agregado celular de las celulas mesenquimales de germen dentario preparadas de antemano, y se preparo un 20 germen dentario reconstituido de tal forma que ambos estuvieran en contacto estrecho entre si.

Un germen dentario reconstituido preparado en el interior de una gota de gel se puso en una incubadora de CO2 durante 10 minutos para solidificar la Cellmatrix tipo I-A (Nitta Gelatin), y un agregado celular junto con el gel circundante como un vehiculo de soporte, se transfirieron sobre una membrana de un inserto de cultivo celular en un 25 recipiente de cultivo que se dispuso de tal forma que el inserto de cultivo celular (membrana de PET con un tamano de poro de 0,4 micrometros; bD, Franklin Lakes, NJ) estuviese en contacto con DMEM (Sigma) complementado por FCS al 10 % (JRH), y el organo se cultivo durante 18 a 24 horas. Despues del cultivo del organo, la generacion del diente se analizo promoviendo la generacion de dientes ectopicos despues del trasplante del explante junto con el gen circundante bajo una capsula subrenal de un raton C57BL/6 de 8 semanas de edad, o continuando el cultivo del 30 organo en el inserto de cultivo celular.

Como ejemplos comparativos, cada uno de los siguientes se preparo y se analizo de la misma manera que anteriormente: un explante trasplantado con un tejido de germen dentario completo bajo una capsula subrenal (Ejemplo Comparativo 1); un explante trasplantado respectivamente con cada uno del tejido epitelial y el tejido 35 mesenquimal separados individualmente de un germen dentario (Ejemplo Comparativo 2); un explante que usa un agregado de baja densidad que contiene una cantidad de una solucion de cultivo igual al volumen de las celulas (Ejemplo Comparativo 3); y un explante formado a partir de un agregado celular en el interior de un vehiculo de soporte mezclando las celulas epiteliales y las celulas mesenquimales separadas de un germen dentario sin compartimentacion entre las celulas epiteliales y las celulas mesenquimales (Ejemplo Comparativo 4). Ademas, en el 40 Ejemplo Comparativo 4, despues de mezclar suavemente las celulas epiteliales y las celulas mesenquimales a la relacion de 1:1, se preparo un agregado celular usado para la generacion de un germen dentario reconstituido de la misma manera que en los Ejemplos 1 a 3.

(3) Analisis histologico 45

En el caso de un trasplante de la capsula subrenal, un germen dentario reconstituido junto con un tejido renal circundante se extirpo el 7° dia o el 14° dia despues del trasplante, se descalcifico con EDTA al 4,5 % (pH 7,2) durante 24 horas despues de fijarse con una solucion de paraformaldehido al 4 %- tampon fosfato durante 6 horas, y se incluyo en parafina mediante un metodo convencional para producir una seccion de 10 pm de un germen dentario 50 reconstituido. Para el analisis histologico, se realizo una tincion de hematoxilina-eosina de acuerdo con un metodo convencional.

Cuando se uso un germen dentario obtenido de un raton GFP para un germen dentario reconstituido, el germen dentario se descalcifico con EDTA al 4,5 % (pH 7,2) durante 24 horas despues de fijarse en una solucion al 50 % 55 (p/v) de sacarosa-paraformaldehido al 4 %-tampon fosfato durante 18 horas, se incluyo en un compuesto OCT (Miles Inc., Naperville, IL), y se hicieron secciones de 10 pm con criostato (Leica, Wetzlar, Alemania) a observar bajo un microscopio de fluorescencia (fabricado por Zeiss).

Los resultados del cultivo de todo el tejido de germen dentario se muestran en la figura 3 y los resultados del cultivo

de acuerdo con el metodo de generacion de la presente invencion se muestran en las figuras 4 a 7.

En el Ejemplo Comparativo 1, todo el germen dentario extirpado se trasplanto bajo una capsula subrenal. Como se muestra en la figura 3, dado que la interaccion entre las celulas mesenquimales y las celulas epiteliales que 5 constituyen el germen dentario no se ve afectada, se formaron el esmalte derivado de las celulas epiteliales y la dentina y la pulpa dental derivadas de las celulas mesenquimales, y se formo un diente que tenia una punta y una raiz ademas de esmalte y dentina dispuestos en las posiciones determinadas.

Por otra parte, como se muestra en las figuras 4 a 6, cuando se uso una forma celular individual preparada a partir 10 de un germen dentario de acuerdo con la presente invencion, en otras palabras, cuando se reconstitucion se realizo combinando celulas mesenquimales de germen dentario con tejido epitelial de germen dentario (Ejemplo 1, veanse las figuras 4 y 5) y combinando el tejido mesenquimal de germen dentario con las celulas epiteliales de germen dentario (Ejemplo 2, vease la figura 6), se genero un diente que tenia un emplazamiento celular especifico con dentina en el interior y esmalte en el exterior mediante un trasplante de la capsula subrenal en un periodo de 11 a 15 14 dias. El diente obtenido de esta manera demostro que es posible reconstituir el mismo tipo de diente que el generado normalmente cultivando un germen dentario en su totalidad (figura 3).

Ademas, como se muestra en la figura 4, con la presente reconstitucion y trasplante de la capsula subrenal, se identificaron facilmente el esmalte externo, el ameloblasto, la dentina y el odontoblasto el 11° dia despues del 20 trasplante. La porcion de raiz tambien fue la misma que la de la generacion normal y el hueso alveolar se identifico en la circunferencia externa de la porcion de raiz. Ademas, a partir de la observacion temporal, se identificaron facilmente la dentina y el odontoblasto el 3er dia despues del trasplante, y habia comenzado a formarse una estructura especifica de diente en el emplazamiento del tejido. Ademas, el 7° dia, la acumulacion de dentina, odontoblasto y ameloblasto fue evidente, y la generacion del diente avanzo a partir de entonces (datos no 25 mostrados).

Ademas, inmediatamente despues del posicionamiento en el interior de una gota de gel, se observo bajo el microscopio que las celulas que constituian un agregado celular estaban presentes individualmente, y despues de un unico dia de cultivo corto, las celulas estaban unidas fuertemente y habian cambiado a un tejido cohesivo 30 individual como en el caso de un germen dentario extirpado normal. Esto indico que el cultivo corto antes del trasplante es eficaz en la formacion del diente.

Ademas, cuando se usaron celulas mesenquimales obtenidas de un raton GFP, las celulas se localizaron en las celulas de la pulpa dental y los odontoblastos obtenidos de celulas mesenquimales en el lado interno (figura 5). Por 35 otra parte, cuando se usaron celulas epiteliales obtenidas de un raton GFP, las celulas se localizaron en los ameloblastos en el lado exterior, y las imagenes fluorescentes eran congruentes con las de los tipos de celulas usados (figura 6). Por lo tanto, era obvio que se realizo la misma interaccion celular que en la generacion normal y que la reconstitucion del tejido se realizo sin sacrificar la direccionalidad de las celulas durante la generacion.

40 Ademas, cuando el cultivo de organo continuo aplicando un trasplante de la capsula subrenal, se identificaron facilmente un germen dentario reconstituido que se cultivo en el transcurso temporal desde el comienzo del cultivo, que se volvio gradualmente mayor, la dentina y el odontoblasto el 16° dia despues del trasplante, y la formacion de una estructura especifica de diente se identifico en el emplazamiento tisular (datos no mostrados). Este tipo de construccion por medio del cultivo de organos se identifico no solo cuando una o las otras de las celulas epiteliales y 45 las celulas mesenquimales se usaron como tejido, pero tambien cuando se usaron ambas.

Ademas, cuando se usaron celulas epiteliales de germen dentario y celulas mesenquimales de germen dentario (Ejemplo 3), como se muestra en la figura 7, la presencia de dentina y esmalte se confirmo, como cuando unicamente una de las celulas epiteliales de germen dentario y las celulas mesenquimales de germen dentario se 50 uso como tejido. Cuando se usaron celulas epiteliales de germen dentario y celulas mesenquimales de germen dentario, se observo que la pluralidad de dientes que tenia direccionalidad y estructura se genero con frecuencia a partir de un unico germen dentario reconstituido, sugiriendo la posibilidad de generar una pluralidad de dientes separando un brote dentario despues de la generacion. En particular, cuando las celulas mesenquimales de germen dentario se situaron en primer lugar en el interior de una gota de gel y despues las celulas epiteliales de germen 55 dentario se situaron para presionar contra las celulas mesenquimales de germen dentario, la estructura especifica, en la que el esmalte y la dentina se pusieron fuera y dentro, respectivamente, se construyo con mas precision y la forma del diente se formo mas facilmente, y se demostro que puede ser ventajoso en la formacion de dientes (datos no mostrados).

Ademas, cuando un germen dentario reconstituido disponiendo celulas epiteliales y celulas mesenquimales de acuerdo con la presente invencion se cultivo en organo, se observo con frecuencia la formacion de la pluralidad de germenes dentarios y/o brotes dentarios. Esto sugiere la posibilidad de generar una pluralidad de dientes a partir de un unico germen dentario reconstituido separando quirurgicamente esta pluralidad de germenes dentarios y/o brotes 5 dentarios.

Por otra parte, en el caso del Ejemplo Comparativo 2, cuando se realizo un cultivo con un tejido epitelial en solitario o un tejido mesenquimal en solitario, como se muestra en la figura 8, un diente con la estructura especifica que se ha mencionado anteriormente no pudo construirse. Por lo tanto, esto sugiere que el tejido que tiene la estructura 10 especifica esta reconstituido realizando una interaccion celular mediante el metodo de la presente invencion.

Ademas, en el caso del Ejemplo Comparativo 3, cuando se uso un agregado celular de baja densidad, como se muestra en la figura 9, las celulas individuales ya se habian dispersado en una gota de gel de colageno durante el cultivo y la estructura especifica del diente no se reconstituyo ni siquiera mediante el trasplante de las celulas bajo 15 una capsula subrenal. Esto sugiere que es preferible usar celulares a una densidad lo mas alta posible para reconstituir un diente por interaccion celular.

Ademas, en el caso del Ejemplo Comparativo 4, cuando se formo un agregado celular a una alta densidad mezclando las celulas epiteliales de germen dentario y las celulas mesenquimales de germen dentario por 20 adelantado en la relacion de 1:1 sin compartimentacion, como se muestra en la figura 10, no se identifico tejido duro, tal como esmalte ni dentina. Esto sugiere que es importante formar un agregado celular compartimentando la masa de las celulas epiteliales de germen dentario y la masa de las celulas mesenquimales de germen dentario, despues de preparar por separado las masas respectivas.

25 (4) Confirmacion del tejido periodontal

A continuacion, se comprobo si un diente formado de acuerdo con el presente metodo tenia o no tejido periodontal. Se uso hibridacion in situ como se describe a continuacion para confirmar la presencia de tejido periodontal, ademas de la observacion que se ha mencionado anteriormente usando imagenes de tincion de HE.

30

Un germen dentario reconstituido trasplantado bajo una capsula subrenal se extirpo el 14° dia despues del trasplante, se incluyo en parafina mediante un metodo convencional, y se corto en secciones de 10 pm de espesor. La parafina se elimino impregnando las secciones en una serie de dilucion de xileno/etanol. Las secciones se trataron con 10 pg/ml de Proteasa K (Nacalai Tesque, Kyoto, Japon) en PBS (-) durante 3 minutos y se fijaron con 35 una solucion de paraformaldehido al 4 % (Nacalai Tesque)-tampon fosfato durante 15 minutos. Se trato Triton X-100 al 0,1 % (v/v) (Sigma) en PBS (-) durante 3 minutos y se lavo con PBS (-) durante 3 minutos. Despues, se trataron con HCl 0,2 N (Wako) durante 10 minutos y se lavaron con PBS (-) y DEPC (pirocarbonato de dietilo) y agua respectivamente durante 5 minutos cada vez. Despues del tratamiento con trietanol amina al 1,5 % (v/v) (Nacalai Tesque), HCl 0,33 N (Wako), y anhidrido acetico al 0,25 % (v/v) (Nacalai Tesque) en DEPC y agua durante 40 10 minutos, las secciones se lavaron dos veces con 2 X SSC durante 10 minutos. Se uso una sonda de periostina (Genbank n.° de acceso NM#015784) marcando con DIG la seccion de ADNc obtenida con PCR usando un cebador de sentido (-7; ggctgaagatggttcctctc, SEQ NO: 1) y un cebador antisentido (573; gtacattgaaggaataacca, SEQ NO: 2). Se realizo una hibridacion in situ de acuerdo con un metodo convencional, se realizo la colorizacion con un fragmento de Fab anti-DIG-Ap (Roche) y una solucion madre de NBT/BCIP (Roche), y el analisis se realizo con un 45 Axio Imager A. 1 (Zeiss) y un AxioCam Mrc5 (Zeiss).

Cuando el tejido periodontal en los Ejemplos que se han mencionado anteriormente se examino en detalle para determinar la presencia o ausencia de tejido periodontal, se formo hueso alveolar similar al del trasplante de germen dentario normal del Ejemplo Comparativo 1 (vease la figura 3) alrededor del diente el 14° dia despues del trasplante 50 en cada uno de los Ejemplos 1 a 3, como se muestra en las figuras 4 a 7.

Ademas, como se muestra en la figura 11, a pesar de la combinacion de celulas individuales y tejido, se formaron hueso alveolar y membrana periodontal, que eran similares a lo del trasplante de germen dentario normal del Ejemplo Comparativo 1, alrededor del diente obtenido en cada uno de los Ejemplos 1 a 3. Ademas, cuando se 55 observo el diente del Ejemplo 2, como se muestra en la figura 12, la expresion de ARNm de periostina, que es un gen especifico de la membrana periodontal, se identifico en una region en la que la formacion de la membrana periodontal se identifico por tincion de HE (lo mismo se identifico en los Ejemplos 1 y 3).

Esto indica que un germen dentario preparado como en los Ejemplos 1 a 3 puede formar tejidos periodontales, tales

como hueso alveolar y membrana periodontal.

[Ejemplos 4 y 5, Ejemplo Comparativo 5]

5 Despues de completar el proceso de posicionamiento como se ha descrito anteriormente, el cultivo de organos comunmente utilizado en procesos de cultivo se realizo de forma continua durante 14 dias para analizar la generacion dental. Se uso una combinacion de tejido epitelial y celulas mesenquimales derivadas de un germen dentario en el Ejemplo 4, y se utilizo una combinacion de celulas epiteliales y celulas mesenquimatosas derivadas de un germen dentario en el Ejemplo 5. Ademas, el cultivo de organos que usaba un germen dentario normal se aplico 10 en el Ejemplo Comparativo 5. Los resultados se muestran en la figura 13.

Como se muestra en la figura 13, tanto en el Ejemplo 4 como 5, el tamano del germen dentario aumento segun el periodo de cultivo se alargo, y se observo la generacion de un diente que tenia una estructura especifica aproximadamente igual que la obtenida realizando el trasplante de la capsula subrenal.

15

Ademas, tanto en el Ejemplo 4 como 5, los dientes obtenidos del cultivo de organos formaron un conjunto constituido por una pluralidad de dientes (por ejemplo, seis dientes cuando se usaron celulas mesenquimales y celulas epiteliales; figura 13, fila inferior).

20 [Ejemplos 6 y 7, Ejemplo Comparativo 6]

Como se muestra en el Ejemplo 5, un diente obtenido a partir de un germen dentario reconstituido se indujo de nuevo para formar una pluralidad de dientes, a pesar del hecho de que las celulas mesenquimales y las celulas epiteliales se prepararon a partir de un unico germen dentario reconstituido. El analisis se realizo para observar si 25 cada diente inducido de nuevo simultaneamente por el germen dentario reconstituido puede crecer en un unico diente.

(1) Analisis de separacion de una pluralidad de germenes dentarios generados a partir de germenes dentarios reconstituidos y potencial de generacion de dientes 30

1) Separacion individual y cultivo de organos de una pluralidad de germenes dentarios generados

Un germen dentario reconstituido obtenido de una manera similar a la del Ejemplo 3 se cultivo en organo durante 2 a 5 dias, y se genero una pluralidad de germenes dentarios a partir de un unico germen dentario reconstituido. 35 Despues, del 2° dia al 5° dia del cultivo de organo, los germenes dentarios individuales se separaron quirurgicamente del germen dentario reconstituido que habia generado una pluralidad de germenes dentarios usando una aguja de inyeccion y pinzas bajo un estereomicroscopio.

Las gotas de gel se prepararon anadiendo por goteo 30 pl de Cellmatrix tipo I-A (Nitta gelatin, Osaka, Japon) sobre 40 una plata de Petri recubierta con grasa de silicio de la misma manera que en el Ejemplo 1. Cada uno de los germenes dentarios separados individualmente que se han mencionado anteriormente se puso en el interior de una gota de gel, y se dejo en una incubadora de CO2 durante 10 minutos para solidificar la Cellmatrix tipo I-A (Nitta Gelatin). Cada uno de los germenes dentarios separados individualmente, junto con el gel circundante, que era un vehiculo de soporte, se transfirio sobre la membrana de un inserto de cultivo celular en un recipiente de cultivo, en el 45 que el inserto de cultivo celular (membrana de PET de un tamano de poro de 0,4 micrometros; BD, Franklin Lakes, NJ) se ajusto para entrar en contacto con DMEM (Sigma) complementado por FCS al 10 % (JRH), y se cultivo en organo durante 18 a 24 horas.

2) Analisis histologico 50

Despues del cultivo, cada uno de los germenes dentarios separados individualmente junto con el gel circundante, se trasplanto bajo una capsula subrenal de un raton C57BL/6 de 8 semanas de edad, y los germenes dentarios separados individualmente se extirparon el 14° dia despues del trasplante junto con el tejido de rinon circundante. Despues de fijar el tejido con una solucion de paraformaldehido al 4 %-tampon fosfato durante 6 horas, el tejido se 55 incluyo en parafina mediante un metodo convencional para hacer una seccion de 10 pm. Para el analisis histologico, se realizo una tincion de hematoxilina-eosina de acuerdo con un metodo convencional.

3) Resultados

Los resultados del analisis histologico de los germenes dentarios separados, que se trasplantaron bajo una capsula subrenal que se generara durante 14 dias, se muestran en la figura 14. Como se muestra en la figura 14, cada uno de los germenes dentarios separados trasplantados se desarrollo en un unico diente caracterizado por esmalte, dentina, pulpa dental, una corona y una raiz. Ademas, en los dientes obtenidos, se observo la presencia de esmalte 5 y dentina en la porcion de corona (vease "a" en las filas central e inferior de la figura 14) y una abertura de la raiz en la porcion de raiz (vease "b" en la fila central de la figura 14).

Estas observaciones indican que: estan presentes ameloblastos y odontoblastos en la porcion de corona como en un diente generado normalmente; el diente tiene la misma configuracion que la de un diente generado normalmente; 10 y cada diente generado al mismo tiempo como uno de un conjunto de dientes es el mismo que un diente generado normalmente en cuanto al emplazamiento celular y la direccionalidad.

(2) Generacion de diente por trasplante de un germen dentario reconstituido en una cavidad oral (no forma parte de la invencion)

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1) Generacion de germenes dentarios separados individualmente y dientes separados individualmente

Los germenes dentarios separados individualmente se prepararon a partir de un germen dentario reconstituido, a partir del cual se genero una pluralidad de germenes dentarios, del 2° dia al 5° dia del cultivo de organo como se ha 20 descrito anteriormente. Ademas, una pluralidad de dientes generados a partir del germen dentario reconstituido, que se trasplanto bajo una capsula subrenal y se extirpo despues de 14 dias del trasplante, se separaron quirurgicamente de forma individual usando una aguja de inyeccion y unas pinzas bajo un estereomicroscopio.

En el caso de un germen dentario separado individualmente, se preparo una gota de gel mediante la adicion por 25 goteo de 30 pl de Cellmatrix de tipo I-A (Nitta gelatin, Osaka, Japon), que se preparo a una concentracion de 2,4 mg/ml en la solucion de cultivo que se ha mencionado anteriormente, sobre una placa de Petri recubierta por grasa de silicio como se ha descrito anteriormente. El germen dentario separado individualmente que se ha descrito anteriormente se puso en el interior de esta gota de gel, se puso en una incubadora de CO2 durante 10 minutos para solidificar la Cellmatrix de tipo I-A (Nitta Gelatin). A continuacion, el germen dentario separado individualmente junto 30 con el gel circundante como un vehiculo de soporte, se transfirio sobre la membrana de un inserto de cultivo celular en un recipiente de cultivo, en el que el inserto de cultivo celular (membrana de PET de un tamano de poro de 0,4 micrometros; BD, Franklin Lakes, NJ) se ajusto para estar en contacto con DMEM (Sigma) complementado por FCS al 10 % (JRH), y se cultivo en organo durante 18 a 24 horas.

35 Despues del cultivo, el gel circundante se elimino quirurgicamente con una aguja de inyeccion y unas pinzas, y el germen dentario separado individualmente se trasplanto en un orificio de extraccion de incisivo mandibular de un raton C57BL/6 de 8 semanas de edad; y esto se designo como Ejemplo 6. Ademas, un diente separado individualmente del germen dentario reconstituido que se habia trasplantado bajo una capsula subrenal se trasplanto en un orificio de extraccion de incisivo mandibular de un raton C57BL/6 de 8 semanas de edad sin incluirse en un gel 40 despues de la separacion; y esto se designo como Ejemplo 7.

2) Metodos de extraccion dental de un incisivo y trasplante en una cavidad oral (no forma parte de la invencion).

3 dias antes del trasplante en una cavidad oral, a un raton C57BL/6 de 8 semanas de edad anestesiado con eter 45 dietilico inhalado se le inyecto por via intraperitoneal una solucion salina fisiologica que contenia 5 mg/ml de pentobarbital sodico a una relacion de 200 pl con respecto a cada 20 g de peso corporal. Una mandibula cerca del sitio de erupcion de un incisivo mandibular del raton, cuyo sentido del dolor se habia adormecido, se exfolio con un bisturi y se expuso una punta del incisivo incrustado en el hueso de la mandibula. Se extrajo un incisivo de la mandibula usando unas pinzas, la sangre se limpio con algodon absorbente, y el sangrado se detuvo. En aras de la 50 ingestion de alimentos, solamente se extrajo el incisivo mandibular en un lado y recibio alimento triturado para cria cada dia.

Un raton C57BL/6 de 8 semanas de edad, cuyo diente se habia extraido por el metodo que se ha mencionado anteriormente, se anestesio con eter dietilico inhalado y se inyecto por via intraperitoneal una solucion salina 55 fisiologica que contenia 5 mg/ml de pentobarbital sodico en una relacion de 200 pl con respecto a cada 20 g de peso corporal. El raton, cuyo sentido del dolor se adormilo, se fijo en una mesa de diseccion, de tal forma que el lado de la mandibula, del cual se extrajo el diente, estuviera de frente, y la mandibula se expuso cortando la piel y la capa muscular del lado de la cabeza en el area de la porcion de raiz del orificio dejado por el diente extraido. Se hizo un orificio con un diametro de 1 mm en el caso de un germen dentario separado individualmente y un orificio con un

diametro de 2 mm en el caso de un diente separado individualmente con un bisturi en la mandibula que cubria el area de la porcion de raiz del orificio dejado por el diente extraido, despues el germen dentario separado individualmente o el diente separado individualmente se trasplanto al area de la porcion de raiz del orificio dejado por el diente extraido a traves del orificio hecho con el bisturi. La orientacion del germen dentario separado 5 individualmente o el diente separado individualmente a trasplantar se alineo con la de un diente generado normalmente y tambien con la direccionalidad del esmalte y la membrana periodontal que se observa en los incisivos mandibulares de ratones adultos. La capa muscular cortada y la piel se suturaron mediante un metodo convencional. El raton C57BL/6 de 8 semanas de edad que habia recibido el trasplante en la cavidad oral se alimento con comida triturada para cria cada dia.

10

Ademas, el Ejemplo Comparativo 6 se designo como un ejemplo en el que el trasplante no se realizo en un raton que no habia sido trasplantado.

3) Analisis histologico 15

Las mandibulas a las que se habia trasplantado un germen dentario separado individualmente y un diente separado individualmente se extirparon el 14° dia despues del trasplante en la cavidad oral. El hueso se descalcifico con acido formico al 22,5 % durante 72 horas despues de fijarse con una solucion de paraformaldehido al 4 %-tampon fosfato durante 16 horas; despues se incluyo en parafina mediante un metodo convencional para hacer secciones de 10 pm. 20 Se usaron 50 ml de solucion de descalcificacion para cada dos mandibulas y toda la cantidad se reemplazo a las 48 horas de la descalcificacion. Para el analisis histologico, se realizo una tincion de hematoxilina-eosina de acuerdo con un metodo convencional.

Cuando se uso un germen dentario obtenido de un raton C57BL/6 TgN (act-EGFP) OsbC14-Y01-FM131 para un 25 germen dentario separado individualmente y un diente separado individualmente, se descalcifico con acido formico al 22,5 % durante 72 horas despues de fijarse con una solucion de paraformaldehido al 4 %-tampon fosfato durante 16 horas, se incluyo en un compuesto OCT (Miles Inc., Naperville, iL) de acuerdo con un metodo convencional, y se hicieron secciones de 10 pm con criostato (Leica, Wetzlar, Alemania) a observar bajo un microscopio de fluorescencia (Zeiss).

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4) Resultados

Las imagenes histologicas el 14° dia despues de la extraccion dental de un raton en el Ejemplo Comparativo 6, en el que el trasplante no se realizo en el raton despues de la extraccion del incisivo, se muestran en la figura 15, y las 35 imagenes histologicas de un germen dentario separado individualmente (Ejemplo 6) y un diente separado individualmente (Ejemplo 7) el 14° dia despues del trasplante en el orificio dejado por un incisivo extraido, se muestran en las figuras 16 y 17, respectivamente.

Como se muestra en la figura 15, en el raton no trasplantado del Ejemplo Comparativo 6, unicamente se identificar 40 celulares infiltradas y hueso generado y no se identifico un diente que tuviese tejido duro en un lugar correspondiente al sitio de trasplante en el orificio dejado por el incisivo extraido.

Por otra parte, como se muestra en la figura 16, en el sitio que se ha mencionado anteriormente donde se trasplanto un germen dentario separado individualmente en el Ejemplo 6, se genero un diente que tenia esmalte en el exterior 45 y dentina en el interior. El diente generado tenia una punta y raiz de diente, la direccionalidad de un diente, y la misma estructura que la de un diente generado normalmente.

Ademas, en el raton del Ejemplo 7, en el que un diente separado despues de la generacion debido al trasplante de la capsula subrenal se trasplanto en un orificio dejado por un diente extraido, como se muestra en la figura 17, se 50 genero un diente que tenia esmalte en el exterior y dentina en el interior en el sitio que se ha mencionado anteriormente. El diente generado tenia una punta y raiz de diente, vasos sanguineos en el interior de la pulpa dental, asi como membrana periodontal y hueso alveolar alrededor del diente, y la misma estructura que la de un diente generado normalmente.

55 [Ejemplo 8 y el Ejemplo Comparativo 7]

(1) Reconstitucion del foliculo piloso

Con el fin de demostrar que la tecnologia desarrollada en la presente invencion es util en la formacion de otros

organos, ademas de contribuir a la generacion de un germen dentario, se realizo la reconstitucion de un foliculo piloso. Se usaron ratones como modelos para este experimento.

1) Metodo de separacion de celulas 5

Un tejido de foliculo piloso de un bigote maxilar se extirpo de un embrion de una edad de 14,5 dias de un raton C57BL/6N (adquirido en CLEA Japan, Inc.) o un raton C57BL/6-TgN (act-EGFP) OsbC14-Y01-FM131 (RIKEN Bioresource Center) que es un raton transgenico de proteina verde fluorescente (EGFP), bajo un microscopio mediante un metodo convencional. El tejido de foliculo piloso del bigote maxilar se lavo con una solucion de tampon 10 fosfato (PBS (-)) que no contenia Ca2+ ni Mg2+, se trato con una solucion enzimatica en la que se habia anadido Dispasa II (Roche, Mannheim, Alemania) a una concentracion final de 1,2 U/ml al PBS (-), a temperatura ambiente durante 60 minutos, y despues se lavo tres veces con DMEM (Sigma, St. Louis, MO), a la que se habia anadido un 10 % de FCS (JRH Biosciences, Lenexa, KS). Ademas, se anadio una solucion de DNasa I (Takara, Shiga, Japon) para hacer una concentracion final de 70 U/ml para dispersar el tejido de foliculo piloso, y el tejido epitelial de foliculo 15 piloso y el tejido mesenquimal de foliculo piloso se separaron quirurgicamente, usando una aguja de inyeccion de 25G (Terumo, Tokio, Japon).

Para las celulas epiteliales de foliculo piloso, el tejido epitelial de foliculo piloso que se ha obtenido anteriormente se lavo tres veces con PBS (-), y se trato dos veces con una solucion enzimatica en la que se disolvio Colagenasa I 20 (Worthington, Lakewood, NJ) a una concentracion final de 100 U/ml en PBS (-), a 37 °C durante 20 minutos. Las celulas precipitadas y recuperadas por centrifugacion se trataron adicionalmente con tripsina al 0,25 % (Sigma) - PBS (-) a 37 °C durante 5 minutos. Despues de lavar las celulas tres veces con DMEM complementado por FCS al 10 %, a las celulas se les anadio una solucion de DNasa I a una concentracion final de 70 U/ml, y se obtuvieron por adicion con pipeta celulas epiteliales de foliculo piloso individuales.

25

Por otra parte, para las celulas mesenquimales de foliculo piloso, el tejido mesenquimal de foliculo piloso se lavo tres veces con PBS (-) y se trato con PBS (-) que contenia tripsina al 0,25 % (Sigma) y 50 U/ml de Colagenasa I (Worthington). Se anadieron 70 U/ml de DNasa I (Takara) y se obtuvieron por adicion con pipeta celulas mesenquimales de foliculo piloso individuales.

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2) Metodo de generacion de foliculo piloso reconstituido

A continuacion, las celulas usadas en la generacion de un foliculo piloso reconstituido se prepararon de la misma manera que en el Ejemplo 1, excepto que se usaron las celulas epiteliales de foliculo piloso y las celulas 35 mesenquimales de foliculo piloso que se han preparado anteriormente; se aplicaron de 0,2 a 0,3 pl de cada una de las celulas a una gota de gel de colageno para preparar los agregados celulares respectivos; y se genero un foliculo piloso reconstituido situando ambos agregados celulares en estrecho contacto entre si.

3) Trasplante de capsula subrenal 40

Para el foliculo piloso reconstituido generado en un gel, como en el Ejemplo 1, los agregados celulares, junto con el gen circundante como un vehiculo de soporte, se transfirieron sobre una membrana de un inserto de cultivo celular en un recipiente de cultivo y se cultivaron en organo durante 18 a 48 horas. Despues del cultivo de organo, estos se trasplantaron bajo una capsula subrenal de un raton C57BL/6 de 8 semanas de edad para promover el crecimiento 45 de pelo ectopico, y el crecimiento del pelo se analizo.

Por otra parte, en el Ejemplo Comparativo 7, se preparo un unico agregado celular mezclado dos tipos de celulas ex vivo de la misma manera que en el Ejemplo Comparativo 4, excepto que se usaron las celulas epiteliales de foliculo piloso y las celulas mesenquimales de foliculo piloso, y se trasplanto bajo una capsula subrenal como en el Ejemplo 50 8.

4) Analisis histologico

En el caso de un trasplante de la capsula subrenal, un foliculo piloso reconstituido se extirpo junto con el tejido de 55 rinon circundante el 14° dia despues del trasplante. En el cultivo de organo, el agregado celular se recupero el 14° dia del cultivo. Despues, el tejido o agregado celular se fijo con una solucion de paraformaldehido al 4 %-tampon fosfato durante 6 horas, y se incluyo en parafina mediante un metodo convencional para hacer secciones de 10 pm. Para el analisis histologico, se realizo una tincion de hematoxilina-eosina de acuerdo con un metodo convencional.

5) Resultados

Los resultados del trasplante de la capsula subrenal de un foliculo piloso en el mismo tipo de raton de acuerdo con el Ejemplo 8 se muestran en la figura 18. Como se muestra en la figura 18, un foliculo, una vaina de raiz interna, y una 5 vaina de raiz externa de las celulas epiteliales y las celulas de la papila pilosa obtenidas de celulas mesenquimales se identificaron en una seccion longitudinal de un foliculo piloso (seccion A), ya que la interaccion celular entre las celulas epiteliales y las celulas mesenquimales que constituyen el foliculo piloso inicial no se afecto cuando se trasplanto el foliculo piloso reconstituido. Ademas, en la seccion A, aunque el pelo se disolvio en el momento de la tincion tisular, se identifico pelo que no se habia disuelto por completo. En la seccion transversal (seccion B), el 10 emplazamiento celular de una vaina de raiz interna y una vaina de raiz externa se identifico de tal forma que las celulas epiteliales podian incluir poros. Dado que el pelo se disolvio en el momento de la tincion tisular, se identifico el residuo de la disolucion del pelo.

Ademas, como se muestra en la figura 19, en un explante que se extirpo el 14° dia despues del trasplante de la 15 capsula subrenal de un foliculo piloso reconstituido, se identifico un pelo crecido a partir de un foliculo piloso.

Por otra parte, en el caso del Ejemplo Comparativo 7, cuando las celulas epiteliales y las celulas mesenquimales se mezclaron de antemano y se reconstituyeron en un vehiculo de soporte, no se identifico un tejido de foliculo piloso, como se muestra en la figura 20.

20

Por lo tanto, de acuerdo con el Ejemplo 8, el pelo pudo generarse a partir de tejido de foliculo piloso de forma similar a los casos en los que se genero un diente usando un germen dentario en los Ejemplos 1 a 7.

Por lo tanto, de acuerdo con la presente invencion, se muestra que la diferenciacion celular puede inducirse 25 eficazmente y puede generarse un tejido que tenga un emplazamiento celular especifico de tejido y direccionalidad, mediante la preparacion de tejido/celulas epiteliales y tejido/celulas mesenquimales por separado, de manera que la interaccion entre las celulas epiteliales y las celulas mesenquimales pueda realizarse eficazmente, y mediante la compartimentacion del tejido/celulas y su cultivo en contacto entre si a alta densidad, y no unicamente para los dientes y el pelo.

30

Por lo tanto, de acuerdo con la presente invencion, es posible producir artificialmente tejido construido por interaccion celular, ya que el tejido puede reconstruirse a partir de diversas celulas individuales sin alterar la interaccion celular.

35 Explicacion de letras y numeros

10 compresa de gel (vehiculo de soporte)

12 agregado celular (una primera masa celular)

14 agregado celular (una segunda masa celular)

40 16 punta de pipeta

<110> Tokyo University of Science Educational Foundation Administrative Organization

<120> Metodo para producir diente, conjunto de dientes, y metodo de produccion de tejido 45

<130> CO-F03193-00

<140> PCT/JP2006/310805 <141 > .

50

<150> JP2005-157885 <151 > .

<150> JP2006-055569 55 <151 >

<160>2

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1 <211> 20 <212> ADN

5 <213> Artificial

<220>

<223> cebador

10 <400> 1

ggctgaagat ggttcctctc 20

<210>2 <211> 20

15 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> antisentido

20

<400> 2

gtacattgaa ggaataacca 20

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un metodo in vitro de produccion de un diente, que comprende:

5 posicionar una primera masa celular que contiene sustancialmente unicamente una de las celulas

mesenquimales o celulas epiteliales, en el que al menos una de las celulas mesenquimales o las celulas epiteliales se obtiene a partir de un germen dentario, y una segunda masa celular que contiene sustancialmente unicamente la otra de las celulas mesenquimales o las celulas epiteliales, en el interior de un vehiculo de soporte y en estado de contacto estrecho entre si sin mezclar entre las masas celulares; y 10 cultivar la primera y la segunda masas celulares en el interior del vehiculo de soporte.
2. El metodo de produccion de un diente de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que tanto las celulas

mesenquimales como las celulas epiteliales se obtienen a partir de un germen dentario.

15 3. El metodo de produccion de un diente de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, que comprende

adicionalmente un primer proceso de preparacion para preparar la primera masa celular y un segundo proceso de preparacion para preparar la segunda masa celular antes de poner las masas celulares en contacto entre si.
4. El metodo de produccion de un diente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, 20 que comprende realizar el crecimiento en el interior del vehiculo de soporte en presencia de otras celulas de

animales.
5. El metodo de produccion de un diente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en

el que cada una de la primera masa celular y la segunda masa celular es una masa celular de celulas individuales.

25
6. El metodo de produccion de un diente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende continuar el cultivo hasta que se forme el tejido periodontal.
7. Un metodo in vitro de produccion de tejido periodontal, que comprende:

30

posicionar una primera masa celular que contiene sustancialmente unicamente una de las celulas mesenquimales o celulas epiteliales, en el que al menos una de las celulas mesenquimales o las celulas epiteliales se obtiene a partir de un germen dentario, y una segunda masa celular que contiene sustancialmente unicamente la otra de las celulas mesenquimales o las celulas epiteliales, en el interior de 35 un vehiculo de soporte y en estado de contacto estrecho entre si sin mezclar entre las masas celulares;

cultivar la primera y la segunda masas celulares en el interior del vehiculo de soporte hasta que se obtienen un diente y tejido periodontal contiguo al diente; y aislar el tejido periodontal obtenido por el cultivo.

40 8. Un conjunto de dientes embebidos en un vehiculo de soporte, obtenido

posicionando in vitro una primera masa celular que contiene sustancialmente unicamente una de las celulas mesenquimales o celulas epiteliales, en el que al menos una de las celulas mesenquimales o las celulas epiteliales se obtiene a partir de un germen dentario, y una segunda masa celular que contiene 45 sustancialmente unicamente la otra de las celulas mesenquimales o las celulas epiteliales, en el interior de

un vehiculo de soporte y en estado de contacto estrecho entre si sin mezclar entre las masas celulares; y cultivar in vitro la primera y la segunda masas celulares en el interior del vehiculo de soporte.
9. El conjunto de dientes de acuerdo con la reivindicacion 8, en el que tanto las celulas mesenquimales 50 como las celulas epiteliales se obtienen a partir de un germen dentario.
10. El conjunto de dientes de acuerdo con la reivindicacion 8 o 9, en el que el vehiculo de soporte es un gel.

55 11. Un metodo in vitro para producir un foliculo piloso que esta construido por una interaccion entre las

celulas mesenquimales y las celulas epiteliales, comprendiendo el metodo:

posicionar una primera masa celular que contiene sustancialmente unicamente una de las celulas mesenquimales o celulas epiteliales y una segunda masa celular que contiene sustancialmente unicamente

la otra de las celulas mesenquimales o las celulas epiteliales, en el interior de un vehiculo de soporte y en estado de contacto estrecho entre si sin mezclar entre las masas celulares; y

cultivar la primera y la segunda masas celulares en el interior del vehiculo de soporte, en el que al menos una de las celulas mesenquimales y las celulas epiteliales se obtiene a partir de un tejido de foliculo piloso.

5
12. El metodo de produccion de un tejido de acuerdo con la reivindicacion 11, que comprende

adicionalmente un primer proceso de preparacion para preparar la primera masa celular y un segundo proceso de preparacion para preparar la segunda masa celular antes de poner las masas celulares en contacto entre si.