KR20080032044A

KR20080032044A - 이의 제조 방법, 이의 집합체 및 조직의 제조 방법

Info

Publication number: KR20080032044A
Application number: KR1020077030600A
Authority: KR
Inventors: 다카시 츠지; 가즈히사 나카오
Original assignee: 도쿄 유니버시티 오브 사이언스 에듀케이셔널 파운데이션 애드미니스트레이티브 오거니제이션
Priority date: 2005-05-30
Filing date: 2006-05-30
Publication date: 2008-04-14
Also published as: CA2610474C; CA2610474A1; WO2006129672A1; US8679755B2; NO20076573L; JP5666490B2; KR101232342B1; US8361709B2; ES2599532T3; CN101189033B; JPWO2006129672A1; RU2428140C2; EP1905459B1; JP2012135313A; AU2006253406B2; US20130109093A1; EP1905459B8; AU2006253406A1; EP1905459A1; US20100021866A1

Abstract

간엽계 세포 및 상피계 세포중 어느 한쪽만으로 실질적으로 이루어진 제1 세포 집합체와, 다른 한쪽만으로 실질적으로 이루어진 제2 세포 집합체를, 세포의 접촉 상태를 유지할 수 있는 지지 담체의 내부에 접촉시켜 배치하고, 배양하여 특유의 세포 배치를 가진 이를 얻는다. 바람직하게는 각각의 세포 집합체를 가진 지지 담체를, 배양 후에, 신장 세포와 함께 배양한다.

Description

이의 제조 방법, 이의 집합체 및 조직의 제조 방법{Method of producing tooth and method of producing teeth and tissue}

본 발명은 이의 제조 방법, 이의 집합체 및 조직의 제조 방법에 관한 것으로, 특히 세포를 이용한 이의 제조 방법, 이의 집합체 및 조직의 제조 방법에 관한 것이다.

이는 최외층에 에나멜질, 그 내층에 상아질이라는 단단한 조직을 가지며, 나아가 그 안쪽에 상아질을 생산하는 상아 아세포, 중심부에 치골을 가지고, 우식이나 치주병 등에 의해 소실될 수 있는 기관이다. 일반적으로 이의 손실에 대해서는, 생명에 대한 두려움이 적다고 생각되고 있기 때문에, 현재는 주로 의치나 임플란트로 보충하는 경우가 많다. 그렇지만, 이의 유무는 외모나 음식물의 미각에 큰 영향을 주고, 또한 건강 유지나 질 높은 생활을 유지한다는 관점에서 이의 재생 기술의 개발에 대한 관심이 높아지고 있다.

이는 태아기의 발생 과정의 유도에 의해 형성되고, 여러 세포종으로 구축된 기능 단위로, 기관이나 장기와 동일하다고 생각되고 있다. 그 때문에 이는 성체 내의 조혈 줄기세포나 간엽계 줄기세포와 같은 줄기세포에서 세포종이 발생하는 줄기세포 시스템에 의해 발생하는게 아니고, 현재 재생 의료에 의해 진행되고 있는 줄 기세포의 이입만(줄기세포 이입 요법)으로는 이를 재생할 수 없다. 또한 이의 발생 과정에서 특이하게 발현하는 유전자를 동정하고, 치배(齒胚, 치아의 싹)의 인위적인 유도에 의한 이의 재생도 생각할 수 있는데, 유전자를 특정한 것만으로는 이의 재생을 완전히 유도할 수 없다.

그래서, 최근 단리된 치배 세포를 이용한 치배를 재구성시키고, 이 재구성 치배의 이식에 의한 이의 재생을 중심으로 한 검토가 이루어지고 있다.

예를 들어, J. Dent. Res., 2002, Vol. 81(10), pp.695-700에는 치배에서 단리된 상피계 세포나 간엽계 치낭세포 등의 세포를 생체 흡수성 담체와 함께 쥐(rat)의 복강 내에 이식함으로써 이 모양의 조직이 재생되는 것이 개시되어 있다.

또한 「이 및 치배 유래 세포를 이용한 재생 의료와 그 가능성」, 재생 의료 일본 재생 의료 학회 잡지, 2005년, Vol. 4(1), pp. 79-83에는 계대 배양 세포에 의한 상피-간엽 상호 작용이 실현가능한 계(系)로서 콜라겐 겔에 의한 공배양이 유효하다고 기재되어 있다.

치배의 재생 방법으로는, 예를 들어, 특개 2004-331557호 공보에는 치배 세포를 섬유아세포(fibroblast) 증식 인자 등의 생리활성물질의 존재하에 배양하는 것이 기재되어 있다. 또한 특개 2004-357567호 공보에는 치배 세포 및 이들 세포로 분화 가능한 세포 중 적어도 1 종류를 피브린을 포함하는 담체와 함께 배양하는 것이 제안되어 있으며, 여기서 피브린을 포함한 담체는 치배의 목적 형상인 것을 사용하여 특유의 형태를 가진 「이」를 형성한다고 기재되어 있다.

미국특허출원공개 제2002/0119180호 공보 및 미국특허출원공개 제2004/0219489호 공보에는 6개월 된 돼지의 하악골로부터 상아질을 형성하는 치수(齒髓)에서 유래한 간엽계 세포와 에나멜 형성에 기여하는 상피계 세포를 포함하는 치배와의 세포 혼합물을 폴리글리콜산-폴리초산 공중합체로 이루어지는 생분해성 중합체를 고화시킨 담체(Scafford)에 파종해서 동물의 체내에 이식하여 이를 형성하는 방법이 개시되어 있다. 여기서, 담체는 치배의 목적 형상인 것을 사용하여 특유의 형태를 가진 「이」를 형성한다고 기재되어 있다.

한편, 국제공개 제2005/014070호 팜플렛에는 뼈의 결손 또는 손상을 입은 환자를 치료하기 위한 이의 재생 방법을 개시하고 있다. 이 방법에 의하면, 폴리글리콜산 메쉬 담체에 간엽계 세포를 파종한 후에 상피계 세포를 콜라겐과 함께 중층하거나, 상피세포 시트로 싸는 것에 의해 뼈가 형성된다. 또한, 국제공개 제2005/014070호에서는 뼈의 형상을 구축하기 위해 담체를 이용하고 있다.

그렇지만, 조직으로서 기능하려면 조직을 구성하는 여러 종류의 세포가 적절한 상대 위치에 배치(세포 배치)되고, 조직으로서의 방향성을 갖는 것이 필수이다. 조직, 예를 들어, 이는 치배에 유래하는 상피계 세포와 두부신경제 세포에 유래하는 간엽계 세포가 분화 발생 과정에서 상호작용하여 발생하는 하나의 「장기」나 「기관」으로, 치배를 그대로 이식하면 정상적인 이를 발생할 수 있는데, 여러 종류의 세포로 구성되어 있는 치배 세포를 단순히 분리하여 배양한 것만으로는 이라고 하는 기능단위로서의 특징적인 세포 배치 및 방향성을 가진 이를 재생할 수 없다.

상기 기술은 모두 세포나 세포 인자 등을 이용하여 치배의 재구축을 하고 있는데, 이로서의 충분한 기능을 발현할 수 있는 특징적인 세포 배치나 방향성을 재현하는 것은 아니다.

또한 조직을 구성하고 있는 여러 세포를 단순히 분리하여 배양한 것만으로는 특유의 세포 배치를 구비한 조직을 재구축하는 것이 어려웠다.

본 발명의 목적은 특유의 세포 배치를 유지한 이의 제조 방법 및 그 방법으로 제조된 이의 집합체 및 치주조직의 제조 방법을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 조직 특유의 세포 배치를 유지한 조직의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명을 해결하기 위한 수단

본 발명의 이의 제조 방법은 지지 담체의 내부에 적어도 어느 한쪽이 치배에서 유래한 간엽계 세포 및 상피계 세포중 어느 한쪽만으로 실질적으로 이루어진 제1 세포 집합체와, 다른 한쪽만으로 실질적으로 이루어진 제2 세포 집합체를 접촉시켜 배치하는 것, 상기 제1 및 제2의 세포 집합체를 상기 지지 담체의 내부에 배양하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하고 있다.

본 발명의 치주조직의 제조 방법은 지지 담체의 내부에 적어도 어느 한쪽이 치배에서유래한 간엽계 세포 및 상피계 세포중 어느 한쪽만으로 실질적으로 이루어진 제1의 세포 집합체와, 다른 한쪽만으로 실질적으로 이루어진 제2 세포 집합체를 접촉시켜 배치하는 것, 상기 제1 및 제2 세포 집합체를, 이와 이것에 연속한 치주조직을 얻을 때까지 배양하는 것, 상기 배양으로 얻어진 치주조직을 단리(單離)하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하고 있다.

지지 담체의 내부에 적어도 어느 한쪽이 치배에서 유래한 간엽계 세포 및 상피계 세포중 어느 한쪽만으로 실질적으로 이루어진 제1 세포 집합체와, 다른 한쪽만으로 실질적으로 이루어진 제2 세포 집합체를 접촉시켜 배치하는 것, 상기 제1 및 제2 세포 집합체를 상기 지지 담체의 내부에서 배양하는 것에 의해 얻어진 이의 집합체인 것을 특징으로 하고 있다.

상기 두 제조 방법 또는 이의 집합체에서는 상기 제1 세포 집합체 및 제2 세포 집합체가 모두 치배 유래인 것이 바람직하다.

또한 여기서, 상기 제1 세포 집합체 및 제2 세포 집합체가 모두 단일 세포 집합물일 수도 있다.

또한 본 발명의 조직의 제조 방법은 간엽계 세포와 상피계 세포의 상호 작용에 의해 구축되는 조직의 제조 방법으로, 지지 담체의 내부에 간엽계 세포 및 상피계 세포중 어느 한쪽만으로 실질적으로 이루어진 제1 세포 집합체와, 다른 한쪽만으로 실질적으로 이루어진 제2 세포 집합체를 접촉시켜 배치하는 것, 상기 제1 및 제2 세포 집합체를 상기 지지 담체의 내부에 배양하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하고 있다.

상기 조직의 제조 방법에 있어서, 상기 간엽계 세포 및 상피계 세포의 적어도 한쪽이 목적이 되는 조직에 유래하는 것임이 바람직하다.

또한 상기 조직은 이, 모발, 신장, 폐, 간장으로 이루어지는 군에서 선택된 것임을 특징으로 하고 있다.

본 발명에서는 간엽계 세포 또는 상피계 세포만으로 실질적으로 이루어진 세포 집합체를 서로 접촉시켜 지지 담체의 내부에 배치하고 배양하므로, 세포 집합체끼리 다른 쪽의 세포 집합체를 구성하는 세포와 서로 섞이지 않고 지지 담체 속에서 서로 접촉한 상태를 유지하면서 생육한다. 이로써, 조직을 형성할 때 필요한 간엽계 세포와 상피계 세포의 양호한 상호 작용을 효과적으로 재현할 수 있다.

그 결과, 목적으로 하는 조직의 특유의 세포 배치를 가진 조직을 제작할 수 있다. 또한 간엽계 세포 및 상피계 세포의 적어도 한쪽을 치배 유래로 함으로써 바깥쪽에 에나멜질을 갖고 안쪽에 상아질을 가지는 특유의 세포 배치를 구비한 이 및 이의 집합체를 제작할 수 있다.

본 발명에 의하면, 특유의 세포 배치를 유지한 이의 제조 방법 및 그 방법에 의해 제조된 이의 집합체 및 치주조직의 제조 방법을 제공할 수 있다.

또한 본 발명에 의하면, 조직 특유의 세포 배치를 유지한 조직의 제조 방법을 제공할 수 있다.

발명을 실시하기 위한 최량의 형태

본 발명의 이의 제조 방법은 지지 담체의 내부에 적어도 어느 한쪽이 치배 유래인 간엽계 세포 및 상피계 세포중 어느 한쪽만으로 실질적으로 이루어진 제1 세포 집합체와 다른 한쪽만으로 실질적으로 이루어진 제2 세포 집합체를 접촉시켜 배치하는 것(배치 공정), 상기 제1 및 제2 세포 집합체를 상기 지지 담체의 내부에서 배양하는 것(배양 공정)을 포함하는 것이다.

본 제조 방법에서는 적어도 어느 한쪽이 치배 유래인 간엽계 세포와 상피계 세포를 세포 집합체로 하여 지지 담체의 내부에서 접촉시켜 성육시키므로, 긴밀한 접촉 상태에 의해 세포간 상호 작용을 효과적으로 재현할 수 있고, 안쪽에 상아질, 바깥쪽에 에나멜질이라는 이에 특유한 세포 배치를 가진 이를 제조할 수 있다.

본 발명에 있어서, 「이」란 안쪽에 상아질 및 바깥쪽에 에나멜질의 층을 연속하여 구비한 조직을 말하며, 바람직하게는 이러한 층구조를 구비하고, 또한 치관이나 치근을 가진 방향성을 구비한 조직을 말한다. 상아질 및 에나멜질은 당업자가 조직 염색 등에 의해 형태적으로 쉽게 특정할 수 있다. 또한 에나멜질은 에나멜 아세포의 존재로 특정할 수 있고, 에나멜 아세포의 존재는 아메로제닌의 유무로 확인할 수 있다. 한편, 상아질은 상아 아세포의 존재로 특정할 수 있고, 상아질 아세포의 존재는 덴틴시아로프로틴의 유무로 확인할 수 있다. 아메로제닌 및 덴틴시아로프로테인의 확인은 이런 분야에서 주지의 방법에 의해 쉽게 실시할 수 있고, 예를 들어, 인 시투(in situ) 혼성화, 항체 염색 등을 들 수 있다.

또한 이의 방향성은 치관(crown)이나 치근(dental root)의 배치에 의해 특정할 수 있다. 치관이나 치근은 형상이나 조직 염색 등에 기초하여 눈으로 보아 확인할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서 「치주조직」이란 이의 주로 외층에 형성된 치조골 및 치근막을 말한다. 치조골 및 치근막은 당업자가 조직 염색 등에 의해 형태적으로 쉽게 특정할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서, 「간엽계 세포」란 간엽(間葉)조직 유래 세포를 의미하고, 「상피계세포」란 상피조직 유래 세포를 의미한다.

본 발명에 있어서, 「치배」 및「치아」는 후술하는 발생 단계에 기초하여 구별된 것에 특별히 언급하는 경우에 사용되는 표현이다. 이 경우의 「치배」란 앞으로 이가 되는 것으로 결정된 이의 초기배로, 이의 발생 단계에서 일반적으로 이용되는 뇌상기(Bud stage)부터 종상기(Bell stage)까지의 단계이며, 특히 이의 단단한 조직으로서의 특징인 상아질, 에나멜질의 축적이 인정되지 않는 조직이고, 「치아」란 본 발명에서 이용되는 「치배」의 단계 이행의 이의 단단한 조직의 특징인 상아질, 에나멜질의 축적이 시작된 단계에서 이가 치육으로부터 나기 시작하여 일반적으로 이로서의 기능을 발현하기 이전 단계의 조직을 말한다.

치배는 도 1에 나타내는 바와 같이 개체 발생 과정에서, 뇌상기, 모상기, 종상전기 및 후기의 각 단계를 거쳐 이루어진다. 여기서, 뇌상기에서는 상피계 세포가 간엽계 세포를 감싸도록 함입(陷入)하고(도 1A 및 도 1B 참조), 종상기 및 종상후기에 이르면, 상피계 세포 부분이 바깥쪽의 에나멜질이 되고, 간엽계 세포 부분이 내부에 상아질을 형성하게 된다( 도 1C 및 도 1D 참조). 따라서, 상피계 세포와 간엽계 세포와의 세포간 상호 작용에 의해 치배가 형성한다.

본 발명에서의 간엽계 세포 및 상피계 세포는 치배를 형성하는 또는 형성할 가능성이 있는 상기 뇌상기에서부터 종상 후기까지의 것(이하, 간단히 「치배」라고 함)이면 되고, 세포의 분화 단계의 유약성과 균질성의 관점에서 뇌상기부터 모상기까지의 것이 바람직하다.

또한 「세포 집합체」란, 세포가 밀집된 상태를 말하며, 조직 상태일 수도 있고, 단일 세포 상태일 수도 있다. 또한 「실질적으로 이루어진다」란, 대상이 되는 세포 이외의 것을 가능한 한 포함하지 않는 것을 의미한다. 각각의 세포 집합체는 조직 자체 또는 일부, 또는 단일 세포의 집합체로 할 수 있기 때문에, 어느 한쪽이 단일 세포로 구성된 세포 집합체일 수도 있고, 함께 단일 세포로 구성된 세포 집합체일 수도 있지만, 본 발명에 의해 조직 재구성을 효율적으로 달성하기 위해서는 함께 단일 세포로 구성되어 있는 것이 바람직하다.

제1 세포 집합체 및 제2 세포 집합체는 어느 하나가 상피계 세포 및 간엽계 세포일 수도 있으며, 이 세포 집합체를 구성하는 세포의 수는 동물의 종류나 지지 담체의 종류, 굳기 및 크기에 따라 다른데, 세포 집합체 1개당 일반적으로 10¹∼10⁸개, 바람직하게는 10³∼10⁸개로 할 수 있다.

배치 공정에서는 지지 담체의 내부에 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체를 접촉시켜 배치한다.

본 발명의 제조 방법에서의 배치 공정에서는 상기 제1 및 제2 세포 집합체를 세포의 접촉 상태를 유지할 수 있는 지지 담체의 내부에 배치하므로, 각각의 세포 집합체를 구성하는 세포가 다른 쪽의 세포 집합체를 구성하는 세포와 서로 섞이지 않는다. 이와 같이, 배치 공정에서는 각 세포 집합체를 혼합하지 않고 배치하므로, 세포 집합체 사이에 경계선이 형성된다. 이와 같은 배치 형태를 본 명세서 속에서는 적당히 「구획화」로 표현한다.

여기서, 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체는 간엽계 세포 및 상피계 세포로 실질적으로 구성되도록 별개의 조제 공정(제1 세포 조제 공정 및 제2 세포 조제 공정)에 의해 조제된다.

본 제조 방법에서 이용되는 간엽계 세포 및 상피계 세포는 생체 내에서의 세포 배치를 재현하여 특유의 구조 및 방향성을 가진 이를 효과적으로 형성하기 위해, 적어도 어느 한쪽이 치배에 유래하는 것이면 되는데, 확실히 이를 형성시키기 위해서는 간엽계 세포 및 상피계 세포 모두 치배 유래인 것이 가장 바람직하다.

치배 이외에 유래하는 간엽계 세포로는 생체 내의 다른 간엽계 조직에 유래하는 세포로, 바람직하게는 혈액 세포를 포함하지 않는 골수 세포나 간엽계 줄기세포, 더 바람직하게는 구강내 간엽계 세포나 악골(顎骨) 내부의 골수 세포, 두부신경제 세포에서 유래하는 간엽계 세포, 상기 간엽계 세포를 만들어 낼 수 있는 간엽계 전구세포나 그 줄기세포 등을 들 수 있다.

또한 치배 이외에 유래하는 상피계 세포로는 생체내의 다른 상피계 조직에 유래하는 세포로, 바람직하게는 피부나 구강내의 점막이나 치육의 상피계 세포, 더 바람직하게는 피부나 점막 등이 분화한, 예를 들어 각화한, 또는 착각화(錯角化)한 상피계 세포를 만들어 낼 수 있는 미숙한 상피계 전구세포, 예를 들어 비각화 상피계 세포나 그 줄기세포 등을 들 수 있다.

치배 및 다른 조직은 포유 동물의 영장류, 예를 들어, 인간, 원숭이 등; 유제류, 예를 들어, 돼지, 소, 말 등; 소형 포유류의 설치류, 예를 들어, 마우스, 쥐, 토끼 등의 다양한 동물의 악골 등에서 채취할 수 있다. 치배 및 조직 채취는 통상 조직 채취에서 이용되는 조건을 그대로 적용하면 되고, 무균 상태에서 꺼내어 적당한 보존액에 저장하면 된다. 또한, 인간의 치배로는 제3 대구치(molar), 소위 사랑니의 치배 외에, 태아 치배를 들 수 있는데, 자가 조직의 이용이라는 관점에서 사랑니 치배를 이용하는 것이 바람직하다.

이 치배로부터 간엽계 세포 및 상피계 세포를 조제하는 것은 우선 주위 조직에서 단리 된 치배를 형상에 따라 치배 간엽조직 및 치배 상피조직으로 나눔으로써 이루어진다. 이때, 치배 조직은 현미경하에서 구조적으로 분별할 수 있기 때문에, 해부용 가위나 핀셋 등으로 절단, 혹은 벗겨냄으로써 쉽게 분리할 수 있다. 또한 치배 조직에서의 치배 간엽조직 및 치배 상피조직의 분리는 그 형상에 따라 주사바늘, 텅스텐 니들, 핀셋 등으로 절단, 혹은 벗겨냄으로써 쉽게 수행할 수 있다.

바람직하게는, 주위 조직에서 치배 세포를 쉽게 분리하기 위하여 및/또는 치배 조직에서 상피조직 및 간엽조직을 분리하기 위하여 효소를 이용할 수도 있다. 이와 같은 용도에 이용되는 효소로는 디스파아제, 콜라게나아제, 트립신 등을 들 수 있다.

간엽계 세포 및 상피계 세포는 각각 간엽 조직 및 상피 조직으로부터 단일 세포 상태로 조제할 수도 있다. 조제 공정에서는 단일 세포로 쉽게 분산할 수 있도록 하기 위해 효소를 이용할 수도 있다. 이와 같은 효소로는 디스파아제, 콜라게나아제, 트립신 등을 들 수 있다. 이 때, 상피조직에서 상피계 세포를 분리하는 것에는 콜라게나아제 처리 후에 트립신 처리와 DNase 처리를 하는 것이 바람직하다. 한편, 간엽 조직으로부터의 간엽계 세포의 분리에는 콜라게나아제와 트립신으로 동시에 처리하고, 최종적으로 DNase 처리를 하는 것이 바람직하다. 이 때, DNase 처리를 하는 것은 효소 처리에 의해 일부의 세포가 손상되고, 세포막이 용해했을 때 용액 중에 방출되는 DNA에 의해 세포가 응집하여 세포의 회수량이 저하되는 것을 막기 위함이다.

또한, 간엽계 세포 및 상피계 세포는 각각 충분한 세포수를 얻기 위해, 배치 공정에 앞서 예비적인 배양을 거친 것일 수도 있다. 간엽계 세포 및 상피계 세포의 배양은 일반적으로 동물 세포의 배양에 이용되는 온도 등의 조건을 그대로 이용할 수 있다.

배양에 이용되는 배지로는 일반적으로 동물 세포의 배양에 이용되는 배지, 예를 들어, 둘베코 변형 이글 배지(DMEM: Dulbecco's Modified Eagle Medium) 등을 이용할 수 있고, 세포의 증식을 촉진하기 위한 혈청을 첨가하거나 혹은 혈청을 대체하는 것으로서, 예를 들어, FGF, EGF, PDGF 등의 세포 증식 인자나 트랜스페린 등의 이미 알려진 혈청 성분을 첨가할 수도 있다. 또한, 혈청을 첨가하는 경우의 농도는 그 때의 배양 상태에 따라 적절히 변경할 수 있는데, 통상 10%로 할 수 있다. 세포의 배양에는 통상의 배양 조건, 예를 들어, 37℃의 온도에서 5% CO₂ 농도의 인큐베이터 내에서의 배양이 적용된다. 또한, 적절히 스트렙토마이신 등의 항생물질을 첨가한 것일 수도 있다.

본 발명에 이용되는 지지 담체로는 세포를 내부에서 배양할 수 있는 것이면 되고, 바람직하게는 상기 배지와의 혼합물이다. 이와 같은 지지 담체로는 콜라겐, 피브린, 라미닌, 세포외 매트릭스 혼합물, 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트산(PLA), 락트산/글리콜산 공중합체(PLGA), 셀 매트릭스(상품명), 메비올겔(상품명), 매트리겔(상품명) 등을 들 수 있다. 이러한 지지 담체는 세포를 내부에 배치했을 때에 배치한 위치를 거의 유지할 수 있을 정도의 경도를 가진 것이면 되고, 겔상, 섬유상, 고체상의 것을 들 수 있다. 여기서, 세포의 위치를 유지할 수 있는 경도란, 통상 3차원 배양으로서 적용되는 경도, 즉, 세포의 배치를 유지할 수 있는 동시에 증식에 의한 비대화를 저해하지 않는 경도이면 되므로 쉽게 결정할 수 있다. 예를 들어, 콜라겐의 경우, 최종 농도 2.4mg/ml 농도에서의 사용이 적절한 경도를 제공한다.

또한 여기서 지지 담체는 제1 및 제2 세포 집합체가 담체 내부에서 성육할 수 있을 정도의 두께를 가지면 되며, 목적으로 하는 조직 크기 등에 따라 적절히 설정할 수 있다.

또한 지지 담체는 세포의 접촉 상태를 유지할 수 있으면 되는데, 여기서 말하는 「접촉 상태」란 각 세포 집합체에서, 또한 세포 집합체 사이에서 확실히 세포 상호 작용시키기 위해 고밀도의 상태인 것이 바람직하다.

고밀도의 상태란, 조직을 구성할 때의 밀도와 동등한 정도를 말하고, 예를 들어, 세포 집합체의 경우, 세포 배치 시에 5×10⁷∼1×10⁹개/ml, 세포의 활성을 손상시키지 않고 확실히 세포 상호 작용시키기 위해, 바람직하게는 1×10⁸∼1×10⁹개/ml, 가장 바람직하게는 2×10⁸∼8×10⁸개/ml의 밀도를 말한다. 이와 같은 세포 밀도로 세포 집합체를 조제하려면, 세포를 원심(遠心)으로 응집시켜 침전화하는 것이 세포의 활성을 손상시키지 않고 간편하게 고밀도화할 수 있기 때문에 바람직하다. 이와 같은 원심은 세포의 생존을 손상하지 않는 300∼1200×g, 바람직하게는 500∼1000×g의 원심력에 해당하는 회전수로 3∼10분간 수행하면 된다. 300×g보다도 낮은 원심에서는, 세포의 침전이 불충분해져서 세포 밀도가 낮아지는 경우가 있고, 한편, 1200×g보다도 높은 원심에서는 세포가 손상되는 경우가 있기 때문에 각각 바람직하지 않다.

원심분리에 의해 고밀도의 세포를 조제하는 경우에는, 통상 세포 원심 분리하기 위해 이용되는 튜브 등의 용기에 단일 세포의 현탁액을 조제한 후에 원심분리하고, 침전물로서의 세포를 남기고 상청액을 가능한 한 없애면 된다. 이 때 사용되는 튜브 등의 용기는 상청액을 완전히 제거하는 관점에서 실리콘 코트된 것인 바람직하다.

원심분리에 의한 침전물로 한 경우에는, 침전물을 그대로 지지 담체의 내부에 배치하면 된다. 이 때, 목적으로 하는 세포 이외의 성분(예를 들어, 배양액, 완충액, 지지 담체 등)은 세포의 용량과 같은 양 이하인 것이 바람직하고, 목적으로 하는 세포 이외의 성분을 포함하지 않는 것이 가장 바람직하다. 이와 같은 고밀도의 세포 집합체에서는 세포가 긴밀하게 접촉하고 있어 세포간 상호 작용이 효과적으로 발휘된다.

조직 상태에서 사용하는 경우에는, 효소 처리 등을 하여 대상이 되는 세포 이외의 결합 조직 등을 제거하는 것이 바람직하다. 목적으로 하는 세포 이외의 성분이 많은 경우, 예를 들어 세포의 용량과 같은 양 이상이 되면, 세포간 상호 작용이 충분히 발휘되지 않기 때문에 바람직하지 않다.

또한 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체의 접촉은 밀접할 수록 바람직하고, 제1 세포 집합체에 대해 제2 세포 집합체를 눌러 배치하는 것이 특히 바람직하다. 또한 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체의 주위를 배양액, 산소 투과를 저해하지 않는 고형물로 감싸는 것도 세포 집합체끼리의 접촉을 밀접히 하는데 유효하며, 점도가 다른 용액에 밀도가 높은 세포 현탁액을 넣어 배치시키고, 용액을 그대로 고화하는 것도 세포의 접촉 유지를 쉽게 달성할 수 있기 때문에 바람직하다. 이 때, 제1 세포 집합체를 치배 간엽계 세포의 단일 세포 집합물로 하고, 제2 세포 집합체를 치배 상피조직으로 한 경우에는, 치배 상피조직의 에나멜 결절이 제1 세포 집합체에 접촉하도록 배치하는 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

지지 담체가 겔상 혹은 용액상 등인 경우에는, 배치 공정 후에 지지 담체를 고화하는 고화 공정을 마련할 수도 있다. 고화 공정에 의해 지지 담체 내부에 배치된 세포가 지지 담체 내부에 고정화된다. 지지 담체의 고화에는 일반적으로 이용한 지지 담체의 고화 조건을 그대로 적용하면 된다. 예를 들어, 지지 담체에 콜라겐 등의 고화가능한 화합물을 이용한 경우에는, 통상 적용되는 조건으로, 예를 들어 배양 온도 하에서 몇 분∼수십 분간 정지시킴으로써 고화할 수 있다. 이로써, 지지 담체 내부에서의 세포간 결합을 고정화할 수 있는 동시에, 강고한 것으로 만들 수 있다.

본 발명의 제조 방법에서의 배양 공정에서는, 제1 세포 집합체 및 제2 세포 집합체를 지지 담체 내부에 배양한다. 이 배양 공정에서는 서로 긴밀하게 접촉된 제1 세포 집합체 및 제2 세포 집합체에 의해 세포간 상호 작용이 효과적으로 이루어지고, 조직, 즉 이가 재구성된다.

배양 공정은 지지 담체에 의해 제1 세포 집합체와 제2 세포 집합체의 접촉 상태가 유지되어 이루어지면 되고, 제1 및 제2 세포 집합체를 가진 지지 담체 단독에 의한 배양일 수도 있고, 다른 동물 세포의 존재 하에서의 배양일 수도 있다.

배양 기간으로는 지지 담체 내부에 배치된 세포수 및 세포 집합체의 상태, 나아가 배양 공정의 실시 조건에 따라 다르지만, 일반적으로 1∼300일, 에나멜질을 바깥쪽에 갖고, 상아질을 안쪽에 가지는 이를 형성하기 위해서는, 바람직하게는 1∼120일, 신속하게 제공할 수 있게 하는 관점에서는, 바람직하게는 1∼60일로 할 수 있다. 나아가 치주조직을 구비한 이로 만들기 위해서는, 일반적으로 1∼300일, 바람직하게는 1∼60일로 할 수 있다.

지지 담체만에 의한 배양으로 하는 경우에는, 동물 세포의 배양에 이용되는 통상의 조건하에서의 배양으로 할 수 있다. 여기서의 배양은 일반적으로 동물 세포에서의 배양 조건을 그대로 적용하면 되고, 전술한 조건을 그대로 적용할 수 있다. 또한 배양에는 포유 동물에서 유래한 혈청을 첨가할 수도 있고, 이들 세포의 증식이나 분화에 유효하다는 것이 이미 알려진 각종 세포 인자를 첨가할 수도 있다. 이와 같은 세포 인자로는 FGF, BMP 등을 들 수 있다.

또한 조직이나 세포 집합체의 가스 교환이나 영양 공급의 관점에서 기관 배양을 이용하는 것이 바람직하다. 기관 배양에서는 일반적으로 동물 세포의 증식에 적합한 배지상에 다공성 막을 부유(float)시키고, 그 막 위에 지지 담체로 포리(包理)된 세포 집합체를 두고 배양을 한다. 여기서 이용되는 다공성 막에는 0.3∼5μm 정도의 공극을 여러 개 가진 막인 것이 바람직하고, 구체적으로는 셀 컬쳐 인서트(상품명), 아이소 포어 필터(상품명)를 들 수 있다.

다른 동물 세포의 존재하에서의 배양인 경우에는, 동물 세포로부터의 각종 사이토카인 등의 작용을 받아 조기에 특유의 세포 배치를 가지는 이를 형성할 수 있으므로 바람직하다. 이와 같은 다른 동물 세포의 존재하에서의 배양은 단리 세포나 배양 세포를 이용하여 생체 외에서의 배양에 의해 수행할 수도 있다.

또한 제1 및 제2 세포 집합체를 가진 지지 담체를 생체에 이식하여 생체내에서 배양하는 것이 이 및/또는 치주조직의 형성을 조기에 할 수 있기 때문에 특히 바람직하다. 이 경우, 지지 담체와 함께 제1 및 제2 세포 집합체가 생체 내에 이식된다.

이 용도로 이용할 수 있는 동물은 포유 동물, 예를 들어, 인간, 돼지, 마우스 등을 바람직하게 들 수 있고, 치배 조직과 동일한 종에서 유래하는 것이 더욱 바람직하다. 인간 치배 조직을 이식하는 경우에는, 인간 또는 면역부전(免疫不全)으로 변형한 인간 이외 다른 포유 동물을 이용하는 것이 바람직하다. 이와 같은 생체내 성육에 적당한 생체 부위로는 동물 세포의 기관이나 조직을 가능한 한 정상적으로 발생시키기 위해서,신장 피막하, 장간막, 피하 이식 등이 바람직하다.

이식에 의한 생육 기간으로는, 이식시의 크기와 발생시키는 이의 크기에 따라 다르지만, 일반적으로 3∼400일로 할 수 있다. 예를 들어, 신장 피막하로의 이식 기간은 이식하는 배양물의 크기와 재생시키는 이의 크기에 따라서도 다르지만, 이의 재생과 이식하는 곳에서 발생시키는 이의 크기의 관점에서 7∼60일간인 것이 바람직하다.

생체에 이식을 하기 전에, 생체외 배양(전배양)을 할 수도 있다. 이 전배양에 의해 세포간의 결합과 제1 및 제2 세포 집합체끼리의 결합을 강고히 하여 세포간 상호 작용을 더욱 강고히 할 수 있기 때문에 바람직하다. 그 결과, 전체 생육 기간을 단축할 수 있다.

전배양 기간은 단기일 수도 있고 장기일 수도 있다. 장기간, 예를 들어, 3일 이상, 바람직하게는 7일 이상으로 한 경우에는 치배에서 치아로 발생시킬 수 있으므로, 이식 후에 이가 생길 때까지의 기간을 단축할 수도 있기 때문에 바람직하다. 전배양 기간으로는, 예를 들어 신장 피막하에 이식을 하는 경우의 기관 배양으로서, 바람직하게는 1∼7일로 하는 것이 효율적으로 이를 재생하기 때문에 바람직하다.

본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 이는 안쪽에 상아질, 바깥쪽에 에나멜질이라는 이로서의 특유의 세포 배치(구조)를 가진 것으로, 또한 바람직하게는 나아가 이의 선단(치관)과 치근이라는 방향성도 구비하고 있는 것이다. 적어도 이와 같은 특유의 세포 배치, 바람직하게는 세포 배치와 함께 방향성을 가짐으로써, 이로서의 기능도 발휘할 수 있는 것이다. 이 때문에, 이의 대체물로 널리 이용할 수 있다. 특히, 자가 치배에서 유래한 간엽계 세포 및 상피계 세포를 이용한 경우에는, 거부반응에 따른 문제를 회피하면서 사용할 수 있다. 또한 일반적으로 이식 항원이 적합한 타인의 치배에서 유래하는 세포를 이용하는 경우에도 거절반응에 따른 문제를 회피할 수 있다.

나아가 본 발명에서는 배양 기간을 연장시킴으로써 이 자체 외에, 이를 악골상에서 지지하고 고정화하는 치조골이나 치근막 등의 치주조직도 형성시킬 수 있다. 그 결과, 이식 후에 실용가능한 이를 제공할 수 있다.

즉, 본 발명의 치주조직의 제조 방법은 상기 배양 공정을 지지 담체에 내부에서, 상기 제1 및 제2 세포 집합체를, 이와 이에 연속하는 치주조직을 얻을 때까지 배양하는 공정(배양 공정)으로 하고, 나아가 상기 배양에 의해 얻어진 치주조직을 단리하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하고 있다.

이 방법에서는 치주조직을 얻을 수 있을 때까지 연장된 배양 기간에 의해, 이에 연속하여 치주조직을 형성시키고 이에서 분리함으로써 치주조직만 얻을 수 있다. 치주조직의 단리는 배양 공정의 과정에서 형성된 치주조직과 이를 분리할 수 있는 임의의 방법에 의해 이루어질 수도 있고, 핀셋 등에 의한 분리나 효소에 의한 부분 소화 등을 들 수 있다.

또한 상기 이의 제조 방법에 있어서 설명한 사항은 배양 기간을 제한하지 않는 한, 모두 본 치주조직의 제조 방법에도 적용할 수 있다.

본 발명의 상기 이의 제조 방법 및 치주조직의 제조 방법에 의해 얻어진 이 및 치주조직은 이식편으로 이용되는 것 외에, 이의 발생 과정을 해명하기 위한 연구에도 바람직하게 이용할 수 있고, 향후의 이에 관련된 조직 발생을 위해 유효한 리서치 도구로 이용할 수 있다.

또한, 얻어진 이 또는 치주조직을 이식편으로 이용하는 경우에는, 제조 방법에서의 배양 공정을 다른 동물 세포와의 접촉 없이 전공정을 in vitro에서 조제할 수 있는 기관 배양으로 한 것이 바람직하다.

본 발명의 이의 집합체는 상기 이의 제조 방법으로 얻어진 이 특유의 세포 배치를 가진 이의 집합체이다.

이와 같은 이의 집합체는 이 특유의 세포 배치를 가진 복수의 이로 구성되어 있기 때문에, 각각의 이를 집합체에서 분리하여 이하에 기술하듯이 하나의 이의 이식편으로 이용할 수 있다. 이와 같이 본 발명의 이의 제조 방법은, 복수의 이를 동시에 제작한 경우에는 복수의 이로 구성된 이의 집합체로서도 이를 제공할 수 있다. 그 결과, 이식편으로서의 이를 효율적으로 제작할 수 있다.

이의 집합체는 상기 이의 제조 방법을 그대로 적용함으로써 쉽게 얻을 수 있다. 특히,상기 제1 및 제2 세포 조제 공정에 있어서, 제1 및 제2 세포 집합체를 각각 조제하고, 배치 공정에서 서로 접촉시켜 지지 담체 내부에 배치시키기 때문에, 지지 담체 내부에 본래 하나의 이를 형성하는 세포군으로부터 복수의 이를 쉽게 형성할 수 있다.

이의 집합체의 제조 방법에 있어서, 제1 및 제2 세포 집합체는 복수개의 이가 발생하기 위한 치배의 재유도를 쉽게 하기 위해 모두 단일 세포로 구성되어 있는 것이 바람직하다. 또한, 배양 공정은 상기와 같이, 기관 배양이라고 하더라도 신장 피막하에서의 배양일 수도 있는데, 얻어진 이를 이식편으로 이용하는 경우에는, 다른 동물 세포와의 접촉이 없이 전 공정을 in vitro에서 조제할 수 있는 기관 배양으로 하는 것이 바람직하다.

또한 본 발명에는 이의 이식 방법이 포함된다. 이 이식 방법에서는 상기 이의 집합체를 얻는 공정과, 이의 집합체로부터 각각의 이를 분리하는 공정과, 분리된 이를 이식 부위에서의 다른 이와 동일한 방향성이 되도록 이식하는 공정을 포함한다.

이로써, 이의 이식을 특유의 세포 배치와 방향성을 구비한 복수의 이를 동시에 얻어 효율적으로 실시할 수 있다.

본 발명에 의한 이는 이의 결손 및 손상을 수반하는 각종 증상, 예를 들어, 우식, 변연성 치주염(치조농루), 치주병에 의한 이의 결손, 사고 등에 의한 절손이나 탈락 등의 치료 또는 처치에 적용할 수도 있다.

즉, 본 발명의 치료 방법은 본 발명에 의한 제조 방법에 의해 얻어진 이 및/또는 치주조직을 결손 및/또는 손상 부위에 이식하는 것을 포함한다. 이로써, 결손 및/또는 손상 부위의 상기 증상을 치료 및/또는 완화할 수 있다.

본 발명의 다른 치료 방법은 본 발명에서의 배양 공정만 혹는 배치 공정 및 배양 공정을 결손 및/또는 손상 부위에서 실시하게 하는 것을 포함한다. 이 경우, 지지 담체로는 상술한 것과 함께 결손 및/또는 손상 부위의 주위 조직 자체를 지지 담체로 적용할 수도 있다. 이로써, 생체 내에서의 주변 조직으로부터의 사이토카인 등에 의해 더욱 신속하게 결손 및/또는 손상 부위의 치료 등을 할 수 있다.

본 발명에서는 간엽계 세포 및 상피계 세포의 세포간 상호 작용에 기초하여 효과적으로 조직을 재구성시킬 수 있으므로, 간엽계 세포와 상피계 세포의 상호 작용에 의해 구축되는 조직의 제조 방법도 제공할 수 있다.

즉, 본 발명의 조직의 제조 방법은 간엽계 세포 및 상피계 세포의 상호 작용에 의해 구축되는 조직의 제조 방법으로, 지지 담체 내부에 간엽계 세포 및 상피계 세포 중 어느 한쪽만으로 실질적으로 이루어진 제1 세포 집합체와, 다른 한쪽만으로 실질적으로 이루어진 제2 세포 집합체를 접촉시켜 배치하는 것, 상기 제1 및 제2 세포 집합체를 상기 지지 담체의 내부에서 배양하는 것을 포함한다.

또한 상기 이의 제조 방법에서 설명한 사항은 달리 기재하지 않는 한 모두 본 발명의 조직의 제조 방법에도 동일하게 적용할 수 있다.

본 조직의 제조 방법에 의해 제조되는 조직으로는, 간엽계 세포 및 상피계 세포의 세포간 상호 작용에 의해 구축되는 조직이 해당하고, 상술한 이와 함께 모발, 신장, 폐, 간장 등을 들 수 있으며, 이들 조직 전체일 수도 있고 일부일 수도 있다.

이 때, 간엽계 세포와 상피계 세포의 적어도 한쪽은 목적으로 하는 조직에서 유래하는 것이 바람직하다. 이로써, 목적으로 하는 조직에 방향성을 이미 가진 세포를 이용하여 쉽게 조직을 형성할 수 있다. 또한 보다 확실히 목적으로 하는 조직을 제조하려면, 둘 다 목적으로 하는 조직에 유래하는 것이 가장 바람직하다.

간엽계 세포 및 상피계 세포로 각각 구성되는 세포 집합체를 조제하기 위해 이용되는 조직으로는, 이의 경우에는 치배나 치수세포, 치근막 세포, 구강내 상피·간엽 세포, 모발의 경우에는 발생 과정의 모포 기관 원기(原基)나 성체의 모포조직(毛胞組織), 신장의 경우에는 발생 과정의 신장 기관 원기나 성체의 신장 조직, 폐의 경우에는 발생 과정의 폐 기관 원기나 성체의 폐 조직, 간장의 경우에는, 발생 과정의 간장 기관 원기나 성체의 간장 조직을 들 수 있다.

이들로부터 각 세포 집합체를 조제하려면, 전술한 바와 같이, 조직에서 간엽계 세포와 상피계 세포를 분리하여 상기와 동일하게 하여 제1 및 제2 세포 집합체를 조제하고, 상기와 동일하게 하여 지지 담체 내부에 배치하고, 배양 및/또는 이식하면 된다.

이로써, 전술한 이와 마찬가지로, 목적으로 하는 조직 특유의 세포 배치를 가진 조직을 얻을 수 있다.

도 1은 치배의 형성을 모식적으로 나타낸 개념도이다.

도 2의 A∼D는 본 발명의 실시예에 관한 치배 유래 간엽계 세포와 상피계 세포를 이용한 치배 재구축의 절차를 개념적으로 나타낸 도면이다.

도 3은 본 발명의 비교예 1에 관한 정상 치배 조직의 위상차 현미경상 및 염색상과 그 정상 치배를 신피막하(腎皮膜下) 이식하여 발생시킨 이의 시간의 흐름에 따른 염색상이다.

도 4는 본 발명의 실시예 1에 관한 치배 유래 상피 조직과 치배 유래 간엽계 세포에 의한 재구성 치배의 위상차 현미경상과 그 재구성 치배를 신피막하 이식하여 발생시킨 이의 시간의 흐름에 따른 염색상이다.

도 5는 본 발명의 실시예 1에 관한 치배 유래 상피 조직과 GFP 마우스 유래의 치배 유래 간엽계 세포에 의한 재구성 치배의 위상차 현미경상과 그 재구성 치배를 신피막하 이식하여 발생시킨 이의 14일째 염색상이다.

도 6는 본 발명의 실시예 2에 관한 GFP 마우스유래 치배 유래 상피계 세포와 치배 유래간엽 조직에 의한 재구성 치배의 위상차 현미경상과 그 재구성 치배를 신피막하 이식하여 발생시킨 이의 14일째 염색상이다.

도 7은 본 발명의 실시예 3에 관한 치배 유래 상피계 세포와 치배 유래 간엽계 세포에 의한 재구성 치배의 위상차 현미경상과 그 재구성 치배를 신피막하 이식하여 발생시킨 이의 14일째 염색상이다.

도 8은 본 발명의 비교예 2에 관한 치배 유래 상피 조직 및 치배 유래 간엽 조직 위상차 현미경상과 그 각각을 단독으로 신피막하 이식했을 때의 14일째 염색상이다.

도 9는 본 발명의 비교예 3에 관한 치배 유래 상피 조직과 치배 유래 간엽계 세포를 이용한 저밀도 재구성 치배의 위상차 현미경상과 그 저밀도 재구성 치배를 신피막하 이식했을 때의 20일째 염색상이다.

도 10은 본 발명의 비교예 4에 관한 치배 유래 상피 조직과 치배 유래 간엽계 세포를 구획화하지 않고 고밀도로 재구성했을 때의 재구성 치배의 위상차 현미경상과 그 저밀도 재구성 치배를 신피막하 이식했을 때의 20일째 염색상이다.

도 11은 본 발명의 실시예 1∼3에 관한 재구성 치배로부터 발생시킨 이의 주위에 생긴 치주조직인 치조골과 치근막의 염색상이다.

도 12는 본 발명의 실시예 2(이식후 17일째)와 비교예 1(이식후 14일째)에 관한 재구성 치배로부터 발생시킨 이의 주위에 생긴 치주조직인 치근막에 특이적인 페리오스틴 mRNA를 검출한 염색상이다.

도 13은 본 발명의 실시예 4 및 5와 비교예 5에 관한 재구성 치배 제작 후에 배양 공정을 연장하여 기관 배양에 의해 발생시킨 이의 위상차 현미경상과 염색상이다.

도 14는 본 발명의 실시예 6에 관한 치배 유래 상피계 세포와 치배 유래 간엽계 세포에 의한 재구성 치배의 위상차 현미경상과 그 재구성 치배를 신피막하 이식하여 발생시킨 이의 14일째 염색상이다.

도 15의 A는 본 발명의 비교예 6에 관한 비이식 마우스의 발치후 14일째의 염색상이고, 도 15의 B는 A 중의 틀 내의 확대도이다.

도 16은 본 발명의 실시예 6에 관한 개별 분리한 치배의 구강내 이식후 14일째 염색상이다.

도 17은 본 발명의 실시예 7에 관한 개별 분리한 이의 구강내 이식후 14일째 염색상이다.

도 18은 본 발명의 실시예 8에 관한 모포(毛胞, trichocyst)조직유래 상피계 세포와 모포조직유래 간엽계 세포에 의한 재구성 모포의 위상차 현미경상과 그 재구성 모포를 신피막하 이식하여 발생시킨 털의 14일째 염색상이다.

도 19는 본 발명의 실시예 8에 관한 모포조직유래 상피계 세포와 모포조직유래 간엽계세포에 의한 재구성 모포를 신피막하 이식하여 발생시킨 모포의 14일째 실태 현미경 사진상이다.

도 20은 본 발명의 비교예 7에 관한 모포조직유래 상피계 세포와 모포조직유래 간엽계세포에 의한 재구성 모포의 위상차 현미경상과 그 재구성 모포를 신피막하 이식하여 발생시킨 모포의 14일째 염색상이다.

* 부호의 설명 *

10 겔 팩(지지 담체)

12 세포 응집 덩어리(제1 세포 집합체)

14 세포 응집 덩어리(제2 세포 집합체)

16 피펫 칩

이하에 본 발명의 실시예에 대해 설명하는데, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 실시예 중 %는 특별히 거절하지 않는 한, 중량(질량) 기준이다.

[실시예 1∼3 및 비교예 1∼4]

(1) 치배 상피계 세포와 치배 간엽계 세포의 조제

이의 형성을 하기 위해 치배를 재구축했다. 이 실험 모델로 마우스(mouse)를 이용했다.

C57BL/6N 마우스(일본 크레아에서 구입) 또는 Green Fluorescence Protein(EGFP) 형질전환 마우스인 C57BL/6-TgN(act- EGFP) OsbC14-Y01-FM131(GFP 마우스: 理硏 바이오 리소스 센터)의 태령 14.5일, 배자로부터 하악 절치의 치배 조직을 현미경하에서 통상적인 방법으로 적출했다. 하악 절치의 치배 조직을 Ca² ⁺, Mg²⁺ 미포함 인산 완충액(PBS(-))으로 세정하고, PBS(-)에 최종 농도 1.2U/ml의 디스파아제 II(Roche, Mannheim, Germany)를 첨가한 효소액으로 실온에서 12.5분간 처리한 후, 10%의 FCS(JRH Biosciences, Lenexa, KS)를 첨가한 DMEM(Sigma, St. Louis, MO)으로 3회 세정했다. 나아가, DNase I 용액(Takara, Siga, Japan)을 최종 농도 70U/ml가 되도록 첨가하고 치배조직을 분산시켜 25G 주사바늘(Terumo, Tokyo, Japan)을 이용하여 외과적으로 치배 상피조직과 치배 간엽조직을 분리했다.

치배 상피계 세포는 상기에 의해 얻어진 치배 상피조직을 PBS(-)로 3회 세정하고, PBS(-)에 최종 농도 100U/ml의 Collagenase I(Worthington, Lakewood, NJ)을 용해한 효소액으로 37℃에서 20분간 처리를 2회 반복했다. 원심분리에 의해 침전 회수한 세포를 다시 0.25%의 Trypsin(Sigma)-PBS(-)로 37℃, 5분간 처리했다. 10%의 FCS 첨가 DMEM에서 세포를 3회 세정한 후, 세포에 최종 농도 70U/ml의 DNase I 용액을 첨가하여 피펫팅에 의해 단일 치배 상피계 세포를 얻었다.

한편, 치배 간엽계 세포는 치배 간엽 조직을 PBS(-)로 3회 세정하고, 0.25%의 Trypsin(Sigma), 50U/ml의 Collagenase I(Worthington)을 포함하는 PBS(-)로 처리했다. 70U/ml의 DNase I(Takara)를 첨가하여 피펫팅에 의해 단일 치배 간엽계 세포를 얻었다.

(2) 재구성 치배의 제작

이어, 상기에서 조제된 치배 상피계 세포 및 치배 간엽계 세포를 이용하여 치배의 재구축을 수해하였다.

실리콘 그리스를 도포한 1.5 mL의 마이크로 튜브(Eppendorf, Hamburg, Germany)에 10%의 FCS(JRH Biosciences)첨가 DMEM(Sigma)으로 현탁한 치배 상피계 세포, 혹은 치배 간엽계 세포를 넣고, 원심분리(580×g)에 의해 세포를 침전으로서 회수했다. 원심분리 후 배양액의 상청액을 가능한 한 제거하고, 다시 한 번 원심분 리 조작을 하여 실체 현미경으로 관찰하면서 세포의 침전 주위에 잔존하는 배양액을 GELoader Tip 0,5-20μL(eppendorf)을 이용하여 완전히 제거하고, 재구성 치배 제작에 이용하는 세포를 준비했다.

실리콘 그리스를 도포한 페트리 디쉬에 2.4mg/ml의 농도로 상기 배양액으로 조제한 Cellmatrix type I-A(Nittagelatin, Osaka, Japan)를 30μL 적하하여 콜라겐 겔 용액의 드롭(겔 드롭)을 제작했다. 이 용액에 상기 치배 상피계 세포, 혹은 치배 간엽계 세포의 원심분리 후의 침전을 0.1-10μL의 페펫 칩(Quality Scientific plastics)을 이용하여 0.2-0.3μL 적용해서 세포 집합체로서의 세포 응집 덩어리를 제작했다.

이것을 도 2를 참조하여 설명한다.

피펫 팁(16)에서 먼저 겔 드롭(10) 내에 배치된 세포 응집 덩이리(12)는 겔 드롭(10)내에서 구체를 구성한다(도 2B 참조). 그 후에 다른 쪽 세포 응집 덩어리(14)를 밀어넣음으로써 구체의 세포 응집 덩어리(12)가 변형되어서 다른 쪽 세포 응집 덩어리(14)를 감싸게 되는 일이 많다(도 2C 참조). 그 후에 겔 드롭(10)을 고화시킴으로써 세포간의 결합이 강고해진다(도 2D 참조).

본 실시예에서는 세포 집합체로서 상피계 세포 또는 간엽계 세포의 단일 세포로 이루어지는 세포 응집 덩어리와, 치배 중 상피계 세포로부터 이루어지는 부분 조직 및 간엽계 세포로부터 이루어지는 부분 조직을 각각 조제하여 이용했다.

본 실시예에 있어서, 세포 응집 덩어리 및 조직에 의한 재구성 치배를 재조합하는 경우(실시예 1 및 2)에는, 치배 상피계 세포 혹은 간엽계 세포로부터 제작 한 세포 응집 덩어리에 상피계 세포 또는 간엽계 세포로 이루어지는 부분 조직을 겔 드롭 중에 옮긴 후, 각각의 조직 치배에서의 조직 경계면쪽을 텅스텐침을 이용하여 세포 응집 덩어리에 밀착시켜 재구성 치배를 제작했다.

한편, 단일 세포로 만든 치배 상피계 세포와 치배 간엽계 세포를 이용한 재구성 치배(실시예 3)에서는, 먼저 제작한 치배 간엽계 세포의 세포 응집 덩어리에 접하도록, 치배 상피계 세포를 동일한 방법으로 적용하여 세포 응집 덩어리를 제작하고, 양자를 서로 밀착시켜 재구성 치배를 제작했다.

겔 드롭 중에서 제작한 재구성 치배는 CO₂ 인큐베이터에 10분간 정치하고Cellmatrix type I-A(Nitta Gelatin)를 고화하여 10%의 FCS(JRH) 첨가 DMEM(Sigma)에 셀 컬쳐 인서트(포어 사이즈가 0.4미크론의 PET 멤브레인; BD, Franklin Lakes, NJ)가 접하도록 세팅한 배양 용기의 셀 컬쳐 인서트의 막 위에 세포 응집 덩어리를 지지 담체인 주위의 겔과 함께 옮겨서 18-24시간 기관 배양했다. 배양 후 주위의 겔마다 태령 8주의 C57BL/6의 신피막하에 이식하여 다른 곳에서의 이의 발생을 진행시키거나, 셀 컬쳐 인서트 상에서의 기관 배양을 계속하여 이의 발생을 분석했다.

또한 비교예로는 치배 조직을 그대로 신피막하에 이식한 것(비교예 1)과, 치배에서 분리한 상피 조직과 간엽 조직을 각각 단독으로 이식한 것(비교예 2), 또한 세포의 용량과 동일한 양의 배양액을 포함하는 저밀도 응집 덩어리를 사용한 것(비교예 3)과, 치배에서 분리하여 상피 세포와 간엽 세포를 혼합하여 상피 세포와 간 엽 세포를 구획화하지 않고 지지 담체 중에서 세포 응집 덩어리를 형성시킨 것(비교예 4)을 각각 상기와 동일하게 하여 조제하고, 동일하게 분석했다. 또한, 비교예 4에 있어서, 상피 세포와 간엽 세포의 혼합은 각각 1대 1의 비율로 조용히 혼합한 후, 실시예 1∼3과 동일하게 하여 재구성 치배 제작에 이용하는 1의 세포 응집 덩어리로서 제조했다.

(3) 조직학적 분석

신피막하에 이식한 경우에는, 이식 후 7일째, 혹은 14일째에 주위의 신조직마다 재구성 치배를 적출하고, 4%의 파라포름 알데히드-인산 완충액으로 6시간 고정한 후, 4.5%의 EDTA(pH 7.2)로 24시간 탈회(脫灰)하고, 통상적인 방법으로 파라핀 포리하여 10μm의 절편을 제작했다. 조직학적 분석을 위해서는 통상적인 방법에 따라 헤마톡시린-에오딘 염색을 수행했다.

재구성 치배에 GFP 마우스 유래의 치배를 이용한 경우는, 50%(w/v) 스크로스-4% 파라포름 알데히드-인산 완충액으로 18시간 고정한 후, 4.5%의 EDTA(pH 7.2)로 24시간 탈회하고, OCT compound(Miles Inc., Naperville, IL)에 포리하여 클리오스태트(Leica, Wetzlar, Germany)로 10μm의 절편을 제작하고, 형광 현미경(Zeiss사 제조)으로 관찰했다.

치배 조직 그대로 배양한 결과를 도 3에, 본 발명의 제조 방법에 따라 배양한 결과를 도 4∼도 7에 나타내었다.

적출된 치배 그대로 신피막하 이식을 수행했던 비교예 1에서는, 도 3에 표시된 바와 같이, 치배를 구성하고 있는 간엽계 세포와 상피계 세포의 세포간 상호 작 용이 손상되지 않기 때문에, 상피계 세포에서 유래하는 에나멜질, 간엽계 세포에서 유래하는 상아질과 치골이 형성되어 있으며, 에나멜질 및 상아질을 소정 위치에 배치하는 동시에, 이 선단부와 치근을 가진 이가 형성되었다.

한편, 도 4∼도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따라 치배로부터 조제된 단일 세포 형태를 이용한 경우, 즉 치배 상피 조직에 치배 간엽계 세포를 조합하여 재구성한 경우(실시예 1, 도 4 및 도 5 참조)와, 치배 상피계 세포에 치배 간엽 조직을 조합하여 재구성한 경우(실시예 2, 도 6 참조)에는, 각각 안쪽에 상아질 및 바깥쪽에 에나멜질을 가진 특유의 세포 배치를 구비한 이를 11∼14일의 기간에 신피막하 이식에 의해 발생시킬 수 있었다. 여기서 얻어진 이는 치배를 그대로 배양하여 얻어진 정상 발생된 것(도 3)과 동일한 이를 재구성할 수 있는 것으로 나타났다.

나아가, 도 4에 도시된 바와 같이, 본 재구성과 신피막하 이식에 의해 이식 후 11일째에는 바깥쪽 에나멜질, 에나멜 아세포, 상아질, 상아 아세포가 쉽게 인정되었다. 치근 부분도 정상 발생과 다르지 않고, 치근 부분의 외주에는 치조골도 인정되었다. 또한 시간의 흐름에 따른 관찰에 의하면, 이식 후 3일째에는 상아질, 상아 아세포가 쉽게 인정되고, 조직 배치상 이의 특징적 구조의 형성이 개시되어 있었다.또한 7일째에는 상아질의 축적과 상아 아세포, 에나멜 아세포도 존재하고 있으며, 그 후 이의 발생이 진행했다(데이터 미도시).

또한, 겔 드롭 내에 배치된 직후에는, 세포 응집 덩어리를 구성하는 세포가 현미경하에서 단독으로 존재하는 것이 인정되지만, 1일의 단기 배양에 의해, 적출 한 정상 치배와 마찬가지로, 세포의 결합이 강고해지고, 하나의 통합된 조직으로 변화했다. 이로부터 이식 전의 단기 배양이 이의 형성에 유효한 것으로 나타났다.

또한, GFP 마우스 유래의 간엽계 세포를 이용한 경우에는, 안쪽의 간엽 세포 유래의 치수 세포와 상아 아세포에 국재해 있으며(도 5), 한편, GFP 마우스 유래의 상피계 세포를 이용한 경우에는 바깥쪽 에나멜 아세포에 국재해 있는 것으로 나타났고, 사용한 세포종과 형광이 일치했다(도 6). 따라서, 정상 발생과 마찬가지로 세포 상호 작용이 이루어지고, 발생에 있어서의 세포의 방향성이 손상되지 않고 조직 재구성이 이루어진 것이 명백했다.

또한, 신피막하에서의 이식을 적용하지 않고 기관 배양을 계속한 경우라도, 배양 개시부터 시간의 흐름에 따라 배양한 재구성 치배는 점차 커지고, 이식 후 16일째에는 상아질, 상아 아세포가 쉽게 인정되며, 조직 배치상 이의 특징적 구조의 형성이 인정되었다(데이터 미도시). 이와 같은 기관 배양에 의한 구축은 한쪽을 조직으로 이용한 경우뿐 아니라, 상피계 세포 및 간엽계 세포 쌍방을 이용한 경우라도 동일하게 인정되었다.

또한 치배 상피계 세포 및 치배 간엽계 세포를 이용한 경우(실시예 3)에는, 도 7에 나타내는 바와 같이, 어느 한쪽을 조직으로 이용한 경우와 마찬가지로, 상아질 및 에나멜질의 존재를 확인할 수 있었다. 치배 상피계 세포 및 치배 간엽계 세포를 이용한 경우에는, 종종 1개의 재구성 치배로부터 복수의 방향성과 구조를 가진 이가 발생하는 것이 인정되며, 발생후의 치아를 분리함으로써 복수의 이를 발생시킬 수 있는 가능성이 시사되었다. 특히, 치배 간엽계 세포를 먼저 겔 드롭 내 에 배치하고, 그 다음부터 치배 상피계 세포를 눌러 배치한 경우에는, 에나멜질 및 상아질이 각각 바깥쪽 및 안쪽에 배치된 특징적인 구조를 더욱 명확하게 구축할 수 있고, 이의 형태를 더 취하기 쉽고, 이의 형성에 유리할 가능성이 시사되었다(데이터 미도시).

또한 본 발명에 의해 상피계 세포와 간엽계 세포를 배치하여 재구성한 치배를 기관 배양함으로써 복수의 치배 및/또는 치아의 형성이 종종 인정되었다. 이것은 이들 복수의 치배 및/또는 치아를 외과적으로 분리함으로써 하나의 재구성 치배로부터 복수의 이를 발생시킬 수 있는 가능성이 시사되었다.

한편, 상피 조직만 또는 간엽 조직만으로 배양한 비교예 2의 경우에는, 도 8에 나타난 바와 같이, 상술한 바와 같은 특정 구조의 이를 구성할 수 없었다. 따라서, 본 발명의 방법에서는, 세포 상호 작용이 이루어져 특정 구조를 가진 조직이 재구성되어 있는 것이 시사되었다.

또한, 저밀도의 세포 응집 덩어리를 이용한 비교예 3의 경우에는, 도 9에 나타난 바와 같이, 콜라겐 겔 드롭 중에서의 배양에서 이미 단일 세포가 분산하고, 신장 피막하에 이식하더라도 이로서의 특정 구조를 재구성하지 않았다. 이것으로부터 세포 상호 작용에 의해 이를 재구성하려면, 가능한 한 고밀도의 세포 응집 덩어리를 이용하는 것이 바람직하다는 것이 시사되었다.

나아가, 치배 상피계 세포와 치배 간엽계 세포를 미리 1대 1로 혼합시키고, 고밀도로 이들 세포를 구획화하지 않고 세포 응집 덩어리를 형성시킨 비교예 4의 경우에는, 도 10에 나타내는 바와 같이, 에나멜질이나 상아질의 단단한 조직은 인 정되지 않았다. 이로부터 치배 상피계 세포의 집합체와 치배 간엽계 세포의 집합체를 별개로 조제한 후, 구획화하여 세포 응집 덩어리를 형성시키는 것이 중요하다는 것이 시사되었다.

(4) 치주조직의 확인

이어, 본 방법에 의해 형성된 이가 치주조직을 구비하고 있는지 확인했다. 치주조직의 확인은 상기한 HE 염색상에 의한 관찰과 함께 하기와 같은 in situ 혼성화를 이용했다.

신피막하 이식한 재구성 치배를 이식 14일째 적출하고, 통상적인 방법으로 파라핀 포리하여 10μm 두께로 절편화했다. 크실렌와 에탄올 희석 계열에 절편을 담가 파라핀을 제거했다. PBS(-) 중의 10μg/ml Protease K(Nacalai tesque, kyoto, Japan)로 3분간 처리하고, 4% 파라포름알데히드(Nacalai tesque) 인산 완충액으로 15 분간 고정했다. PBS(-) 중의 0.1%(v/v) Triton X-100(Sigma)으로 3분간 처리하고, PBS(-)로 3분간 세정했다. 0.2N HCl(Wako)로 10분간 처리하고, PBS(-)와 DEPC(디에틸 피로카보네이트) 수(water)로 각각 5분간 세정했다. DEPC 수 중의1.5%(v/v) 트리에탄올아민(nacalai tesque), 0.33N HCl(Wako), 0.25%(v/v) 무수초산(Nacalai tesque)으로 10분간 처리한 후, 2×SSC로 10분간 2회 세정했다. 페리오스틴(Genbank accession no. NM#015784) 프로브는 센스 프라이머(-7; ggctgaagatggttcctctc, 서열번호 1)과 안티 센스 프라이머(573; gtacattgaaggaataacca, 서열번호 2)를 이용하여 PCR에 의해 취득한 cDNA 단편을 DIG 표식하여 이용했다. 정법에 따라 in situ 혼성화를 하고, 항DIG-AP Fab 프래그 먼트(Roche)와 NBT/BCIP Stock Solution(Roche)에서 발색시켜 Axio Imager A.1(Zeiss)과 AxioCam MRc5(Zeiss)로 분석을 했다.

상기 실시예에서의 치주조직을 치주조직의 유무에 대해 상세히 관찰한 바, 실시예 1∼3의 어느 것에도 도 4에서 도 7에 나타낸 바와 같이, 이식 후 14일째 이의 주위에는 정상적인 치배를 이식한 비교예 1(도 3 참조)과 똑 같은 치조골이 형성되어 있었다.

나아가, 도 11에 나타낸 바와 같이, 개별적인 단일 세포와 조직의 조합과 상관없이, 실시예 1∼3 중 어느 것에서도 얻어진 이의 주위에는 정상적인 치배를 이식한 비교예 1과 동일한 치조골 및 치근막이 형성되었다. 또한 실시예 2의 이에서 확인한 바, 도 12에 나타낸 바와 같이, HE 염색에 의해 치근막 형성이 인정된 영역에는 치근막 특이적인 유전자인 페리오스틴 mRNA의 발현이 인정되었다(실시예 1 및 3에서 동일하다).

이것은 실시예 1∼3에 의해 제작한 치배는 치조골이나 치근막이라는 치주조직을 형성할 수 있음을 나타내고 있다.

[실시예 4 및 5, 비교예 5]

상기와 동일하게 하여 배치 공정을 종료한 후에 배양 공정으로 일반적으로 이용되는 기관 배양을 14일간에 걸쳐 계속해서 실시하고, 이의 발생을 분석했다. 치배 유래 상피조직과 간엽 세포의 조합을 실시예 4로 하고, 치배 유래 상피 세포와 간엽 세포의 조합을 실시예 5로 했다. 또한, 정상 치배를 이용하여 기관 배양한 예를 비교예 5로 했다. 결과를 도 13에 나타내었다.

도 13에 나타낸 바와 같이, 실시예 4 및 5의 어느 것이나 배양 기간이 길어짐에 따라 치배의 크기가 커지고, 신피막하 이식을 실시한 경우와 거의 동일한 특징적인 구조를 가진 이의 발생이 인정되었다.

또한 실시예 4 및 5의 어느 것에서도 기관 배양에 의해 얻어진 이는 복수의 이로 구성된 집합체(예를 들어, 간엽세포와 상피세포를 이용한 경우에는 6개; 도 13의 최하단)를 형성하고 있었다.

[실시예 6 및 7, 비교예 6]

실시예 5에 나타내는 바와 같이, 재구성 치배로부터 얻어진 이는 1개의 재구성 치배로부터 간엽세포 및 상피세포를 조제했음에도 불구하고 복수의 이로 재유도되었다. 이와 같이 재구성 치배에서 동시에 재유도된 각각의 이가 1개의 이로 성장할 수 있는지 없는지 분석했다.

(1) 재구성 치배로부터 발생하는 복수의 치배의 분리와 이로의 발생 능력의 분석

1) 복수개 발생시킨 치배의 개별 분리와 기관 배양

실시예 3과 같이 얻어진 재구성 치배를 2∼5일간 기관 배양하고, 하나의 재구성 치배로부터 복수의 치배를 발생시켰다. 그 후 치배가 복수개 발생하고 있는 재구성 치배를 기관 배양 2∼5일째 실체 현미경하에서 주사바늘과 핀셋을 이용하여 외과적으로 1개의 치배로 분리했다.

실리콘 그리스를 도포한 페트리 디쉬에 실시예 1과 동일하게 하여 Cellmatrix type I-A(Nitta gelatin, Osaka, Japan)을 30μL 적하하여 겔 드롭을 제작했다. 이 겔 드롭에 상기 개별 분리 치배를 넣고, CO₂ 인큐베이터에 10분간 정치하고 Cellmatrix type I-A(Nitta Gelatin)를 고형화하고, 10% FCS(JRH) 첨가 DMEM(Sigma)에 셀 컬쳐 인서트(포어 사이즈가 0.4미크론의 PET 멤브레인; BD, Franklin Lakes, NJ)가 접하도록 세팅한 배양 용기의 셀 컬쳐 인서트의 막 위에 개별 분리 치배를 지지 담체인 주위의 겔과 함께 옮겨 18-24시간 기관 배양했다.

2) 조직학적 분석

배양 후 주위의 겔마다 태령 8주의 C57BL/6의 신피막하에 이식하여 14일째 주위의 신조직마다 개별 분리 치배를 적출했다. 조직을 4% 파라포름 알데히드-인산 완충액으로 6시간 고정한 후, 통상적인 방법으로 파라핀 포리하여 10μm의 절편을 제작했다. 조직학적 분석을 위해서 통상적인 방법에 따라 헤마톡시린-에오딘 염색을 했다.

3) 결과

분리한 치배를 신장 피막하에 이식하여 14일간 발생시키고, 조직학적으로 분석한 결과를 도 14에 나타냈다. 도 14에 나타내는 바와 같이, 이식한 분리 치배는 각각 에나멜질과 상아질, 치수, 치관, 치근이라는 특징을 가진 1개의 「이」로 발생했다. 또한 얻어진 이의 치관부에는 에나멜질과 상아질이 존재하는 것(도 14의 중단 및 하단에서의 a 참조) 및 치근부에서는 치근의 개구부가 존재하는 것(도 14의 중단에서의 b 참조)을 각각 확인할 수 있었다.

이러한 것은 정상 발생한 이와 마찬가지로, 치관부에서 에나멜 아세포와 상 아 아세포가 존재하고, 또 정상 발생한 이와 동일한 형태를 갖는 것을 나타내고 있으며, 이의 집합체로서 동시에 발생한 각각의 이가 모두 정상 발생한 이와 세포 배치 및 방향성에서 동일함을 나타내고 있었다.

(2) 재구성 치배의 구강내 이식에 의한 이의 발생

1) 개별 분리 치배와 개별 분리 치아의 제작

상기와 마찬가지로 하여 기관 배양 2∼5일째에 치배가 복수개 발생해 있는 재구성 치배로부터 개별적으로 분리한 치배를 제작했다. 한편, 신피막하에 이식하여 14일 후에 적출한 재구성 치배로부터 복수개 발생한 이를 실체 현미경하에서 주사바늘과 핀셋을 이용하여 외과적으로 개별 분리했다.

개별 분리 치배의 경우, 상기와 마찬가지로, 실리콘 그리스를 도포한 페트리 디쉬에2.4mg/ml의 농도로 상기 배양액으로 조제한 Cellmatrix type I-A(Nitta gelatin, Osaka, Japan)를 30μL 적하하여 겔 드롭을 제작했다. 이 겔 드롭에 상기 개별 분리 치배를 넣고, CO₂ 인큐베이터에 10분간 가만히 두고 Cellmatrix type I-A(Nitta Gelatin)를 고화했다. 이어, 10%의 FCS(JRH) 첨가 DMEM(Sigma)에 셀 컬쳐 인서트(포어 사이즈가 0.4미크론의 PET 멤브레인; BD, Franklin Lakes, NJ)가 접하도록 세팅한 배양 용기의 셀 컬쳐 인서트의 막 위에 지지 담체인 주위의 겔과 함께 개별 분리 치배를 옮겨 18-24 시간 기관 배양했다.

배양 후, 주위의 겔을 주사바늘과 핀셋으로 외과적으로 제거하고, 태령 8주의 C57BL/6의 하악절치 발치공(拔齒孔)에 이식하여 실시예 6으로 했다. 한편, 신장 피막하에 이식한 재구성 치배로부터 개별적으로 분리한 이의 경우에는, 분리 후 겔에 싸지 않고 그대로 태령 8주의 C57BL/6의 하악절치 발치공에 이식하여 실시예 7로 했다.

2) 절치의 발치와 구강내 이식 방법

구강내 이식 3일전에 디에틸에테르로 흡입 마취한 태령 8주의 C57BL/6에 5mg/ml의 펜토발비탈 나트륨을 포함한 생리 식염수를 체중 20g당 200μl의 비율로 복강주사하였다.통각이 마비된 마우스의 하악절치 맹출부 부근의 하악골을 메스로 벗겨내어 악골에 묻혀 있는 절치 선단부를 노출시켰다. 핀셋을 이용하여 하악에서 절치를 발치하고, 혈액을 탈지면으로 닦아내어 지혈했다. 음식물 섭취를 위해 치발은 한쪽 하악절치만 하고, 분말 형태로 잘게 부순 사육용 먹이를 매일 주었다.

상기 방법에 의해 발치한 태령 8주의 C57BL/6을 디에틸에테르로 흡입 마취하고, 5mg/ml의 펜토발비탈 나트륨을 포함한 생리 식염수를 체중 20g당 200μl의 비율로 복강주사하였다. 통각이 마비된 마우스를 발치한쪽의 턱을 위로 하여 해부대에 고정하고, 발치공 치근부 영역의 두부의 가로면부터 피부와 근육층을 절개하여 하악골을 노출시켰다. 메스를 이용하여 발치공 치근부 영역을 덮는 하악골에 개별 분리 치배의 경우에는 직경 1mm, 개별 분리 치아의 경우는 직경 2mm의 구멍을 내고, 거기에서 개별 분리 치배와 개별 분리 치아를 발치공 치근부 영역으로 이식했다. 이식하는 개별 분리 치배와 개별 분리치의 방향은 정상 발생치의 방향과 일치시키고, 또한 성체 마우스의 하악절치에서 보이는 에나멜질, 치근막의 방향성도 모두 일치시켰다. 절개한 근육층과 피부를 통상적인 방법으로 봉합했다. 구강내 이식 한 태령 8주의 C57BL/6에는 분말 형태로 부순 사육용 먹이를 매일 주었다.

또한, 절치발치 후에 이식을 하지 않았던 마우스를 비교예 6으로 했다.

3) 조직학적 분석

구강내 이식하여 14일째 개별 분리 치배 및 개별 분리치를 이식한 하악골을 적출했다. 4%의 파라포름 알데히드-인산 완충액으로 16 시간 고정시킨 후, 22.5%의 포름산으로 72 시간 탈회하고, 통상적인 방법으로 파라핀 포리하여 10μm의 절편을 제작했다. 탈회액은 하악골 2개당 50ml로 하여 탈회 48시간째에 전량을 교환했다. 조직학적 분석을 위해서는 통상적인 방법에 따라 헤마톡시린-에오딘 염색을 했다.

개별 분리 치배 및 개별 분리 치아에 C57BL/6-TgN(act-EGFP)OsbC14-Y01-FM131 마우스 유래의 치배를 이용한 경우에는, 4%의 파라포름 알데히드-인산 완충액에서 16시간 고정한 후, 22.5%의 포름산으로 72시간 탈회하고, 통상적인 방법으로 OCT compound(Miles Inc., Naperville, IL)에 포리하여 클리오스태트(Leica, Wetzlar, Germany)로 10μm의 절편을 제작하고, 형광 현미경(Zeiss사 제조)으로 관찰했다.

4) 결과

절치 발치후에 이식을 하지 않았던 비교예 6의 마우스의 발치후 14일후의 조직상을 도 15에, 개별 분리한 치배(실시예 6) 및 이(실시예 7)를 절치발치공에 이식한 다음 14 일후의 조직상을 각각 도 16 및 도 17에 나타냈다.

도 15에 나타내는 바와 같이, 비교예 6의 비이식 마우스에서는 절치발치공의 이식부위에 해당하는 위치에 침윤한 세포와 발생한 뼈만 인정되고, 단단한 조직을 가진 이는 인정되지 않았다.

이에 비해, 도 16에 나타내는 바와 같이, 실시예 6으로서 개별 분리한 치배를 이식한 해당 부위에서는, 에나멜질을 바깥쪽에, 상아질을 안쪽에 가진 이가 발생했다. 발생한 이는 이의 선단과 치근이 인정되고, 이의 방향성이 존재하며, 정상 발생하는 이와 동일한 구조를 갖고 있었다.

또한, 신장 피막하에 이식하여 발생시킨 후에 분리한 이를 발치공에 이식한 실시예 7의 마우스에서는, 도 17에 나타낸 바와 같이, 해당 부위에 에나멜질을 바깥쪽에, 상아질을 안쪽에 가진 이가 발생했다. 발생한 이는 이의 선단과 치근을 갖고 있으며, 치수내부에는 혈관이 인정되는 동시에, 이의 주위에는 치근막과 치조골을 갖고 있어 정상 발생하는 이와 동일한 구조를 갖고 있었다.

[실시예 8 및 비교예 7]

(1) 모포의 재구성

본 발명에서 개발한 기술이 치배의 발생에 기여할 뿐만 아니라, 다른 기관 형성에도 유용한 기술임을 나타내기 위해 모포의 재구성을 실시했다. 이 실험 모델로서 마우스를 이용했다.

1) 세포의 분리 방법

C57BL/6N 마우스(일본 크레아로부터 구입) 또는 Green Fluorescence Protein(EGFP) 형질전환 마우스인 C57BL/6-TgN(act-EGFP)OsbC14-Y01-FM131(리켄 바이오 리소스 센터)의 태령 14.5일째의, 배자로부터 상악 수염 모포조직을 현미경하 에서 통상적인 방법으로 적출했다. 상악 수염 모포조직을 Ca² ⁺, Mg² ⁺ 불포함 인산 완충액(PBS(-))으로 세정하고, PBS(-)에 최종농도 1.2 U/ml의 Dispase II(Roche, Mannheim, Germany)를 첨가한 효소액으로 실온에서 60 분간 처리한 후, 10%의 FCS(JRH Biosciences, Lenexa, KS)를 첨가한 DMEM(Sigma, St. Louis, MO)으로 3회 세정했다. 나아가 DNase I 용액(Takara, Siga, Japan)을 최종 농도 70U/ml가 되도록 첨가하여 모포조직을 분산시키고, 25G 주사바늘(Terumo, Tokyo, Japan)을 이용하여 외과적으로 모포 상피조직과 모포 간엽조직을 분리했다.

모포 상피계 세포는 상기에 의해 얻어진 모포 상피조직을 PBS(-)로 3회 세정하고, PBS(-)에 최종 농도 100U/ml의 Collagenase I(Worthington, Lakewood, NJ)을 용해한 효소액으로 37℃에서 20분간의 처리를 2회 반복했다. 원심분리에 의해 침전 회수한 세포를 다시 0.25% Trypsin(Sigma)-PBS(-)로 37℃, 5분간 처리했다. 10%의 FCS 첨가 DMEM으로 세포를 3회 세정한 후, 세포에 최종 농도 70U/ml의 DNase I 용액을 첨가하고, 피펫팅에 의해 단일 모포 상피계 세포를 얻었다.

한편, 모포 간엽계 세포는 모포 간엽조직을 PBS(-)로 3회 세정하고, 0.25%의 Trypsin(Sigma), 50 U/ml의 Collagenase I(Worthington)을 포함한 PBS(-)으로 처리했다. 70U/ml의 DNase I(Takara)을 첨가하여 피펫팅에 의해 단일 모포 간엽계 세포를 얻었다.

2) 재구성 모포의 제작 방법

이어, 상기에서 조제된 모포 상피계 세포 및 모포 간엽계 세포를 이용한 것 이외에는, 실시예 1과 동일하게 하여 재구성 모포 제작에 이용하는 세포를 준비하고, 콜라겐 겔 드롭에 각각 0.2-0.3μL 적용하여 각각의 세포 응집 덩어리를 제작하고, 양자를 서로 밀접시켜 재구성 모포를 제작했다.

3) 신피막하 이식

겔 중에서 제작한 재구성 모포는 실시예 1과 동일하게 하여 배양 용기의 셀 컬쳐 인서트의 막 위에 세포 덩어리를 지지 담체인 주위의 겔과 함께 옮기고 18-48 시간 기관 배양했다. 배양 후 주위의 겔마다 태령 8주의 C57BL/6의 신피막하에 이식하여 이소적(異所的)인 털의 발생을 진행시키고, 털의 발생을 분석했다.

한편, 비교예 7은 모포 상피계 세포 및 모포 간엽계 세포를 이용한 것 이외에는, 비교예 4와 동일하게 하여 생체 밖에서 2 종류의 세포를 혼합하여 하나의 세포 응집체를 제작하고, 실시예 8과 동일하게 하여 신피막하에 이식했다.

4) 조직학적 분석

신피막하에 이식한 경우에는, 이식 후 14일째에 주위의 신조직마다 재구성 모포를 적출했다. 기관 배양의 경우에는, 동일한 일수의 배양 후, 세포 응집 덩어리를 회수했다. 조직 혹은 세포 응집 덩어리를 4%의 파라포름알데히드-인산 완충액에서 6 시간 고정한 후, 통상적인 방법으로 파라핀 포리하여 10μm의 절편을 제작했다. 조직학적 분석을 위해서는 통상적인 방법으로 헤마톡시린-에오딘 염색을 했다.

5) 결과

실시예 8에 관한 모포를 같은 계열 마우스의 신장 피막하에 이식한 결과를 도 18에 나타낸다. 도 18에 나타난 바와 같이, 재구성 모포를 이식하면 초기 모포를 구성하는 상피 세포와 간엽 세포의 세포간 상호작용이 손상되지 않기 때문에, 모포의 종단면(절편 A)에서는 상피 세포에서 유래하는 모포나 내모근초, 외모근초 및 간엽 세포에 유래하는 모유두(毛乳頭)의 세포가 인정되었다. 나아가 절편 A에서는, 털은 조직 염색시에 용해되긴 하지만, 완전히 용해되지 않은 털이 인정되었다. 횡단면(절편 B)에서는 상피 세포가 모공을 둘러싸도록 내모근초나 외모근초 등의 세포 배치가 인정되었다. 털은 조직 염색 시에 용해되기 때문에, 털의 용해 잔존물이 인정되었다.

또한 도 19에 나타난 바와 같이, 재구성 모포를 신장 피막하에 이식하여 14일 후에 적출한 이식편에는 모포에서 발생한 털이 인정되었다.

한편, 상피 및 간엽 세포를 미리 혼합하여 지지 담체 속에서 재구성한 비교예 7의 경우에는, 도 20에 나타난 바와 같이 모포 조직은 인정되지 않았다.

따라서, 실시예 8에 의하면, 실시예 1∼7의 치배를 이용하여 이를 제작하는 경우와 마찬가지로, 모포조직으로부터 털을 제작할 수 있었다.

이와 같이, 본 발명에 의하면, 이나 털 뿐 아니라, 상피계 세포와 간엽계 세포의 세포간 상호 작용이 유효하게 이루어지도록 상피조직·세포 및 간엽조직·세포를 별개로 조제하고, 이들을 구획화하여 고밀도로 접촉시켜 배양함으로써 세포의 분화를 효과적으로 유도할 수 있고, 조직 특유의 세포 배치와 방향성을 구비한 조직을 제작할 수 있는 것으로 나타났다.

따라서, 본 발명에 의하면, 세포간 상호 작용을 손상시키지 않고 많은 종류 의 단일 세포로부터 조직을 재구축할 수 있으므로, 세포 상호 작용에 의해 구축되는 조직을 인위적으로 제작할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Tokyo University of Science <120> Method for preparing tooth and tissue <130> CO-F03193-00 <150> JP2005-157885 <151> 2005-05-30 <150> JP2006-055569 <151> 2006-03-01 <160> 2 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 1 ggctgaagat ggttcctctc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> antisense <400> 2 gtacattgaa ggaataacca 20

Claims

지지 담체의 내부에 적어도 어느 한쪽이 치배 유래인 간엽계 세포 및 상피계 세포중 어느 한쪽만으로 실질적으로 이루어진 제1 세포 집합체와, 다른 한쪽만으로 실질적으로 이루어진 제2 세포 집합체를 접촉시켜 배치하는 것,

상기 제1 및 제2 세포 집합체를 상기 지지 담체의 내부에서 배양하는 것,

을 포함하는 이의 제조 방법.
제1항에 있어서,

상기 간엽계 세포 및 상피계 세포 모두가 함께 치배 유래인 이의 제조 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,

제1 세포 집합체를 조제하는 제1 조제 공정과 제2 세포 집합체를 조정하는 제2 조제 공정을 상기 접촉시켜 배치하기 전에 더 포함하는 이의 제조 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 지지 담체의 내부에서의 성육(成育)을 다른 동물 세포의 존재 하에서 수행하는 것을 포함하는 이의 제조 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 제1 세포 집합체 및 상기 제2 세포 집합체가 함께 단일 세포 집합물인 이의 제조 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 배양을 치주조직이 형성될 때까지 계속하는 것을 특징으로 하는 이의 제조 방법.
지지 담체의 내부에 적어도 어느 한쪽이 치배 유래인 간엽계 세포 및 상피계 세포중 어느 한쪽만으로 실질적으로 이루어진 제1 세포 집합체와, 다른 한쪽만으로 실질적으로 이루어진 제2 세포 집합체를 접촉시켜 배치하는 것,

상기 제1 및 제2 세포 집합체를 상기 지지 담체의 내부에서 이와 이에 연속된 치주조직을 얻을 때까지 배양하는 것,

상기 배양에 의해 얻어진 치주조직을 단리하는 것

을 포함하는 치주 조직의 제조 방법.
지지 담체의 내부에 적어도 어느 한쪽이 치배 유래인 간엽계 세포 및 상피계 세포중 어느 한쪽만으로 실질적으로 이루어진 제1 세포 집합체와 다른 한쪽만으로 실질적으로 이루어진 제2 세포 집합체를 접촉시켜 배치하는 것, 상기 제1 및 제2 세포 집합체를 상기 지지 담체의 내부에서 배양함으로써 얻어진 이의 집합체.
제8항에 있어서,

상기 간엽계 세포 및 상피계 세포 모두가 함께 치배 유래인 이의 집합체.
간엽계 세포와 상피계 세포의 상호 작용에 의해 구축되는 조직 제조 방법으로서,

지지 담체의 내부에 간엽계 세포 및 상피계 세포중 어느 한쪽만으로 실질적으로 이루어진 제1 세포 집합체와 다른 한쪽만으로 실질적으로 이루어진 제2 세포 집합체를 접촉시켜 배치하는 것,

상기 제1 및 제2 세포 집합체를 상기 지지 담체의 내부에서 배양하는 것,

을 포함하는 조직의 제조 방법.
제10항에 있어서,

제1 세포 집합체를 조제하는 제1 조제 공정과 제2 세포 집합체를 조정하는 제2 조제 공정을 상기 접촉시켜 배치하기 전에 더 포함하는 조직의 제조 방법.
제10항 또는 제11항에 있어서,

상기 간엽계 세포 및 상피계 세포중 적어도 한쪽이 목적으로 하는 조직에서 유래하는 세포임을 특징으로 하는 조직의 제조 방법.
제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 조직이 이, 모발, 신장, 폐, 간장으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 조직의 제조 방법.