CN101189033B - 牙齿的制造方法、牙齿的集合体及组织的制造方法 - Google Patents

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Abstract

将实质上只由间充质系细胞及上皮系细胞中的任何一方构成的第一细胞集合体、和实质上只由另一方构成的第二细胞集合体，在可保持细胞的接触状态的支撑载体载体的内部接触配置、培养，得到具有特有的细胞配置的牙齿。优选将具有各细胞集合体的支撑载体载体在培养后与肾脏细胞一同培养。

Description

牙齿的制造方法、牙齿的集合体及组织的制造方法
技术领域
本发明涉及牙齿的制造方法、牙齿的集合体及组织的制造方法，尤其涉及采用细胞的牙齿的制造方法、牙齿的集合体及组织的制造方法。
背景技术
牙齿是一种器官，具有在最外层有釉质、在其内层有象牙质这样的硬组织，另外，在其内侧具有产生象牙质的象牙芽细胞，在中心部具有齿髓，有时因龋蚀或牙周病等而失去。一般，关于牙齿的损失，由于认为对生命的危惧小，所以现在主要多通过镶牙或嵌植来弥补。但是，牙齿的有无对外观或食物的味觉有较大影响，此外从维持健康或维持高质量的生活的观点考虑，提高了对开发牙齿再生技術的关心。
牙齿，是通过胎儿期的生成过程的诱导而形成的，由多种细胞种构筑的机能单位，认为与器官或内脏相同。因此，牙齿，如果不通过从成体内的造血干细胞或间充质系干细胞这样的干细胞生成细胞种的干细胞系统生成，而是只通过再生医疗进行的干细胞移入(干细胞移入疗法)，现在还不能再生牙齿。此外，还考虑同定在牙齿的生成过程中特异发现的遗传因子，人为地诱导牙胚的牙齿的再生，但如果只特定遗传因子，不能完全诱导牙齿的再生。
因此，近年来，研究的中心是，再构成采用离析的牙胚细胞的牙胚，然后移植该再构成牙胚，从而再生牙齿。
例如，在非专利文献1中，公开了通过将从牙胚离析的上皮系细胞或间充质系的齿囊细胞等细胞，与生物体吸收性的载体一同移植到老鼠的腹腔内，再生牙齿组织的方法。
此外，在非专利文献2中，记载了作为可实现下一代的培养细胞的上皮-间充质相互作用的系统，利用胶原凝胶的共培养是有效的方法。
作为牙胚的再生方法，例如，在专利文献1中，记载了在纤维芽细胞增殖因子等生理活性物质的存在下培养牙胚细胞。此外，在专利文献2中，提出了与含有血纤维蛋白的载体一同培养牙胚细胞及可在这些细胞中分化的细胞中的至少1种。此处，含有血纤维蛋白的载体，使用牙胚目标形状的载体，形成具有特有形态的“牙齿”形成。
在专利文献3及4中，记载了从6个月的猪的下颚骨，将含有形成象牙质的源自齿髓的间充质系细胞和有助于釉形成的上皮系细胞的牙胚的细胞混合物，播种到由聚乙二醇酸-聚醋酸共聚物构成的使生物分解性聚合物固化的载体(Scafford)中，移植到动物体内，形成牙齿的方法。此处，载体记载为使用牙胚目标形状的载体，形成具有特有形态的“牙齿”。
另一方面，在专利文献5中，公开了用于治疗骨损坏或损伤的患者的牙齿再生方法。根据该方法，在将间充质系细胞播种在聚乙二醇酸网式载体中后，通过与胶原一同重叠或用上皮细胞片包覆上皮系细胞，可形成骨。另外，在专利文献5中，为构筑骨的形状采用了载体。
非专利文献1：J.Dent.Res.，2002，Vol.81(10)，pp.695-700
非专利文献2：“牙齿及采用源自牙胚细胞的再生医疗及其可能性”，再生医疗，日本再生医疗学会杂志，2005年，Vol.4(1)，pp.79-83
专利文献1：特开2004-331557号公报
专利文献2：特开2004-357567号公报
专利文献3：美国专利申请公开第二002/0119180号公报
专利文献4：美国专利申请公开第二004/0219489号公报
专利文献5：国际公开第二005/014070号小册子
但是，要作为组织发挥作用，必须将构成组织的多种细胞配置(细胞配置)在适当的相对位置，具有作为组织的方向性。组织，例如牙齿，是来源自牙胚的上皮系细胞和来源自头部神经堤细胞的间充质系细胞在分化生成过程中相互作用而生成的一个“内脏”或“器官”，如果原状移植牙胚，就能生成正常的牙齿，但只通过单一分离培养由多种细胞构成的牙胚细胞，不能再生具有作为牙齿功能单位的特征的细胞配置及方向性的牙齿。
所述技术都采用细胞或细胞因子等进行牙胚的再构筑，但不能再现可发现作为牙齿的良好功能的特征的细胞配置或方向性。
此外，如果只通过单一地离析培养构成组织的多个细胞，很难再构筑具备特有细胞配置的组织。
发明内容
因此，本发明的目的是，提供一种保持特有的细胞配置的牙齿的制造方法及用此方法制造的牙齿的集合体以及牙周组织的制造方法。
此外，本发明的另一目的是，提供一种保持特有的细胞配置的组织的制造方法。
本发明的牙齿的制造方法，其特征在于，包含以下工序：将实质上只由间充质系细胞及上皮系细胞中的任何一方构成的第一细胞集合体、和实质上只由任何另一方构成的第二细胞集合体接触配置的工序，其中，间充质系细胞及上皮系细胞中的至少任何一方是源自牙胚；和在所述支撑载体载体的内部培养所述第一及第二细胞集合体的工序。
本发明的牙周组织的制造方法，其特征在于，包括以下工序：将实质上只由间充质系细胞及上皮系细胞中的任何一方构成的第一细胞集合体、和实质上只由任何另一方构成的第二细胞集合体接触配置的工序，其中，间充质系细胞及上皮系细胞中的至少任何一方是源自牙胚；在所述支撑载体载体的内部，培养所述第一及第二细胞集合体，直到得到牙齿和与其连续的牙周组织的工序；和离析通过所述培养得到的牙周组织的工序。
一种牙齿的集合体，其特征在于，所述牙齿是通过以下工序得到的，即，在支撑载体载体的内部，将实质上只由间充质系细胞及上皮系细胞中的任何一方构成的第一细胞集合体、和实质上只由任何另一方构成的第二细胞集合体接触配置的工序，其中间充质系细胞及上皮系细胞至少任何一方是源自牙胚；和在所述支撑载体载体的内部培养所述第一及第二细胞集合体的工序。
在所述两制造方法或牙齿的集合体中，优选，所述第一细胞集合体及第二细胞集合体都是源自牙胚。
此外，此处，所述第一细胞集合体及第二细胞集合体也可以都是单一细胞集合体。
此外，本发明的组织的制造方法，是通过间充质系细胞和上皮系细胞的相互作用构筑的组织的制造方法，其特征在于，包括以下工序：在支撑载体载体的内部，将实质上只由间充质系细胞及上皮系细胞中的任何一方构成的第一细胞集合体、和实质上只由任何另一方构成的第二细胞集合体接触配置的工序；和在所述支撑载体载体的内部培养所述第一及第二细胞集合体的工序。
在上述组织的制造方法中，优选，所述间充质系细胞及上皮系细胞中的至少一方，是源自成为目标的组织的细胞。
此外，上述组织，其特征在于，是从由牙齿、毛发、肾脏、肺、肝脏构成的组中选择。
在本发明中，由于相互接触地在支撑载体载体的内部配置、培养实质上只由间充质系细胞及上皮系细胞构成的细胞集合体，所以细胞集合体相互间不会与构成另一方的细胞集合体的细胞混合，在支撑载体载体中一边维持相互接触的状态一边发育。由此，可有效地再现在形成组织时需要的间充质系细胞及上皮系细胞的良好的相互作用。
结果，能够制作目标组织中具有特有的细胞配置的组织。此外，通过将间充质系细胞及上皮系细胞的至少一方规定为源自牙胚，能够制作具备外侧具有釉质、内侧具有象牙质这样的特有的细胞配置的牙齿及牙齿的集合体。
根据本发明，可提供一种保持特有的细胞配置的牙齿的制造方法及用此方法制造的牙齿的集合体以及牙周组织的制造方法。
此外，根据本发明，能够提供一种保持组织特有的细胞配置的组织的制造方法。
附图说明
图1是模式地表示牙胚的形成的概念图。
图2(A)～(D)是概念表示本发明的实施例中的采用源自牙胚的间充质系细胞和上皮系细胞的牙胚再构筑的顺序的图示。
图3是本发明的比较例1的正常牙胚组织的相位差显微镜图像及染色图像、和肾皮膜下移植该正常牙胚时形生成的牙齿的时效染色图像。
图4是由本发明的实施例1的源自牙胚的上皮组织和源自牙胚的间充质系细胞形成的再构成牙胚的相位差显微镜图像、和肾皮膜下移植该再构成牙胚时生成的牙齿的时效染色图像。
图5是由本发明的实施例1的源自牙胚的上皮组织和源自GFP小鼠牙胚的间充质系细胞形成的再构成牙胚的相位差显微镜图像、和肾皮膜下移植该再构成牙胚时生成的牙齿的第十四天的染色图像。
图6是由本发明的实施例2的源自GFP小鼠牙胚的上皮系细胞和源自牙胚的间充质组织形成的再构成牙胚的相位差显微镜图像、和肾皮膜下移植该再构成牙胚时生成的牙齿的第十四天的染色图像。
图7是由本发明的实施例3的源自牙胚的上皮系细胞和源自牙胚的间充质系细胞形成的再构成牙胚的相位差显微镜图像、和肾皮膜下移植该再构成牙胚时生成的牙齿的第十四天的染色图像。
图8是本发明的比较例2的源自牙胚的上皮组织及源自牙胚的间充质组织的相位差显微镜图像、和单独肾皮膜下移植其各自时的第十四天的染色图像。
图9是采用本发明的比较例3的源自牙胚的上皮组织和源自牙胚的间充质系细胞的低密度再构成牙胚的相位差显微镜图像、和肾皮膜下移植该低密度再构成牙胚时生成的牙齿的第二0天的染色图像。
图10是不区分地高密度再构成本发明的比较例4的源自牙胚的上皮组织和源自牙胚的间充质系细胞时的再构成牙胚的相位差显微镜图像、和肾皮膜下移植该低密度再构成牙胚时生成的牙齿的第二0天的染色图像。
图11是在由本发明的实施例1～3的再构成牙胚生成的牙齿的周围形成的牙周组织即牙槽骨和牙根膜的染色图像。
图12是在由本发明的实施例2(移植后第十七天)和比较例1(移植后第十四天)的再构成牙胚生成的牙齿的周围形成的牙周组织即牙根膜中检测出特异的periostinmRNA的染色图像。
图13是在本发明的实施例4及5和比较例5的再构成牙胚制作后延长培养工序，通过器官培养生成的牙齿的相位差显微镜图像和染色图像。
图14是由本发明的实施例6的源自牙胚的上皮系细胞和源自牙胚的间充质系细胞形成的再构成牙胚的相位差显微镜图像、和肾皮膜下移植该再构成牙胚时生成的牙齿的第十四天的染色图像。
图15(A)是本发明的比较例6的非移植小鼠的拔牙后第十四天的染色图像、(B)是(A)中的框内放大图。
图16是本发明的实施例6的单个分离的牙胚移植到口腔内后第十四天的染色图像。
图17是本发明的实施例6的单个分离的牙齿移植到口腔内后第十四天的染色图像。
图18是由本发明的实施例8的源自丝胞组织的上皮系细胞和源自丝胞组织的间充质系细胞形成的再构成丝胞的相位差显微镜图像、和肾皮膜下移植该再构成丝胞时生成的毛的第十四天的染色图像。
图19是肾皮膜下移植由本发明的实施例8的源自丝胞组织的上皮系细胞和源自丝胞组织的间充质系细胞形成的再构成丝胞时生成的毛的第十四天的实态显微镜照片。
图20是由本发明的比较例7的源自丝胞组织的上皮系细胞和源自丝胞组织的间充质系细胞形成的再构成丝胞的相位差显微镜图像、和肾皮膜下移植该再构成丝胞时生成的丝胞的第十四天的染色图像。
图中：10-凝胶部分(支撑载体载体)，12-细胞凝集块(第一细胞集合体)，14-细胞凝集块(第二细胞集合体)，16-吸管。
具体实施方式
本发明的牙齿的制造方法，包括：将实质上只由间充质系细胞及上皮系细胞中的任何一方构成的第一细胞集合体、和实质上只由任何另一方构成的第二细胞集合体接触配置的工序，其中，间充质系细胞及上皮系细胞中的至少任何一方是源自牙胚(配置工序)；在所述支撑载体载体的内部培养所述第一及第二细胞集合体的工序(培养工序)。
在本制造方法中，由于在支撑载体载体的内部，作为细胞集合体，使至少任何一方是源自牙胚的间充质系细胞和上皮系细胞接触地发育，所以能够通过紧密的接触状态有效地再现细胞间相互作用，能够制造具备内侧具有象牙质、外侧具有釉质这样的牙齿特有的细胞配置的牙齿。
在本发明中，所谓“牙齿”，说的是在内侧连接地具备象牙质层、在外侧连接地具备釉质层的组织，具体指的是具备这些层结构且具备具有牙冠或牙根的方向性的组织。象牙质及釉质，对于该行业者，容易通过组织染色等从形式上特定。此外，釉质可通过釉芽细胞的存在特定，釉芽细胞的存在可通过无卵发育的有无确认。另一方面，象牙质可通过象牙芽细胞的存在特定，象牙质芽细胞的存在可通过牙质唾液腺蛋白质的有无确认。无卵发育及牙质唾液腺蛋白质的确认容易用该领域众所周知的方法实施，例如，可列举原地杂交、抗体染色等。
此外，牙齿的方向性可通过牙冠或牙根的配置特定。牙冠或牙根，可基于形状或组织染色等通过目视确认。
此外，在本发明中，所谓“牙周组织”，指的是主要形成于牙齿的外层的牙槽骨及牙根膜。牙槽骨及牙根膜，对于该行业者，容易通过组织染色等从形式上特定。
另外，在本发明中，所谓“间充质系细胞”，指的是原子间充质组织的细胞，所谓“上皮系细胞”，指的是源自上皮组织的细胞。
在本发明中，所谓“牙胚”及“齿芽”，是对于在后述的生成阶段区别的内容特别说明时所用的表示。所谓此时的“牙胚”是决定了将来形成牙齿的牙齿初期胚，是在牙齿的生成阶段从一般所用的蕾状期(Bud stage)到钟状期(Bell stage)的阶段，尤其是未出现作为牙齿硬组织的特征即象牙质、釉质的蓄积的组织，所谓“齿芽”，是本发明所用的“牙胚”的阶段转移，从牙齿硬组织的特征即象牙质、釉质的蓄积开始的阶段，牙齿从齿肉萌芽，一般指的是发现作为牙齿的功能之前的阶段的组织。
牙胚，如图1所示，在个体生成的过程中，经由蕾状期、帽状期、钟状前期及后期的各工序进行。此处，在蕾状期，上皮系细胞为了包覆间充质系细胞而陷入(参照图1(A)及(B))，如果到达钟状前期及钟状后期，上皮系细胞部分成为外侧的釉质，间充质系细胞部分在内部形成象牙质(参照图1(C)及(D))。因此，通过上皮系细胞和间充质系细胞的细胞间相互作用形成牙胚。
本发明中的间充质系细胞及上皮系细胞，只要是形成牙胚或具有形成牙胚的可能性的从所述蕾状期到钟状后期的细胞(以下简称为“牙胚”)就可以，从细胞的分化阶段的幼若性和均质性的观点出发，优选是从蕾状期到帽状期的细胞。
此外，所谓“细胞集合体”，指的是细胞密集的状态，可以是组织的状态，也可以是单一细胞的状态。此外，所谓“实质上”，指的是尽量不含对象细胞以外的细胞。各个细胞集合体，由于可规定为组织本体或其一部、或单一细胞的集合体，因此也可以是任何一方由单一细胞构成的细胞集合体，也可以是都由单一细胞构成的细胞集合体，但为了通过本发明高效率地完成组织的再构成，优选都由单一细胞构成。
第一细胞集合体和第二细胞集合体，也可以都是上皮系细胞及间充质系细胞，构成该细胞集合体的细胞数因动物的种类、或支撑载体载体的种类、硬度及大小而异，但每1个细胞集合体一般为101～108个，优选为103～108个。
在配置工序中，在支撑载体载体的内部，接触配置第一细胞集合体和第二细胞集合体。
在本发明的制造方法的配置工序中，由于在可保持细胞的接触状态的支撑载体载体的内部配置所述第一及第二细胞集合体，因此构成各个细胞集合体的细胞不会与构成另一方的细胞集合体的细胞混合。如此在配置工序中，由于不混合地配置各细胞集合体，所以可在细胞集合体间形成边界线。在本说明书中将如此的配置形态适宜表示为“区分化”。
此处，第一细胞集合体和第二细胞集合体，可通过个别的调制工序(第一细胞调制工序及第二细胞调制工序)调制，以实质上由间充质系细胞及上皮系细胞构成。
本制造方法所用的间充质系细胞及上皮系细胞，为了再现生物体内的细胞配置，有效地形成具有特有的结构及方向性的牙齿，只要至少任何一方是源自牙胚的细胞就可以，但为了确实形成牙齿，更优选间充质系细胞及上皮系细胞都是源自牙胚。
作为源自牙胚以外的间充质系细胞，可列举出源自生物体内的其它间充质系组织的细胞，优选不含血液细胞的骨髓细胞或间充质系干细胞，更优选源自口腔内间充质系细胞或颚骨的内部的骨髓细胞、头部神经堤细胞的间充质系细胞、可生出所述间充质系细胞的间充质系前躯细胞或其干细胞等。
此外，作为源自牙胚以外的上皮系细胞，可列举出源自生物体内的其它上皮系组织的细胞，优选皮肤或口腔内的粘膜或牙肉的上皮系细胞，更优选皮肤或粘膜等可生出分化的，例如角化的、或内错角化的上皮系细胞的未成熟的上皮系前躯细胞，例如非角化上皮系细胞或其干细胞等。
牙胚及其它的组织，可从哺乳动物的灵长类，例如人、猴等，有蹄类，例如猪、牛、马等，小型哺乳类的啃齿类，例如小鼠、鼠、兔子等多种动物的颚骨等采取。牙胚及组织的采取，通常可指直接应用组织采取所用的条件，可以以无菌状态取出，保存在适当的保存液中。另外，作为人的牙胚，除第三大臼齿所谓智齿的牙胚以外，可列举胎儿牙胚，但从利用自家组织的观点考虑，优选采用智齿牙胚。
从该牙胚的间充质系细胞及上皮系细胞的调制，首先可通过根据形状将从周围的组织离析的牙胚分成牙胚间充质组织及牙胚上皮组织来进行。此时，由于牙胚组织可在显微镜下从结构上区分，因此能够容易通过用解剖用剪子或小镊子等切断、或剥离来分离。此外，牙胚间充质组织及牙胚上皮组织从牙胚组织的分离，容易依据其形状，通过用注射针、钨针、小镊子等切断或剥离来进行。
优选，为了易于从周围组织分离牙胚细胞，及/或从牙胚组织分离上皮组织及间充质组织，也可以采用酶。作为用于如此用途的酶，可列举分散酶、胶原酶、胰蛋白酶等。
间充质系细胞及上皮系细胞，也可以分别从间充质组织及上皮组织以单一细胞的状态调制。在调制工序中，为了易于在单一细胞中分散，也可以采用酶。作为此种酶，可列举分出散酶、胶原酶、胰蛋白酶等。此时，优选，在上皮系细胞从上皮组织的分离中，在胶原酶处理后进行胰蛋白酶处理和DNase处理。另外，优选，在间充质系细胞从间充质组织的分离中，同时用胶原酶和胰蛋白酶处理，最终进行DNase处理。之所以此时进行DNase处理，是为了防止酶处理部分细胞受损，防止因细胞膜溶解时向溶液中放出的DNA而使细胞凝集，进而降低细胞的回收量。
另外，间充质系细胞及上皮系细胞，为了得到充分的细胞数，也可以分别在配置工序之前，经过预备培养。间充质系细胞及上皮系细胞的培养，一般可直接采用动物细胞的培养所用的温度等条件。
作为培养所用的培养基，一般可采用动物细胞的培养所用的培养基，例如FCS改良Eagle培养基(DMEM)等，也可以添加用于促进细胞增殖的血清，也可以作为血清的代替物添加例如FGF、EGF、PDGF等细胞增殖因子或铁传递蛋白等已知的血清成分。另外，添加血清时的浓度，可根据此时的培养状态适宜变更，但通常为10％。对于细胞的培养，可采用在通常的培养条件下的，例如在37℃的温度下，在5％CO2浓度的恒温箱内的培养。此外，也可以适宜添加链霉素等抗生物质。
作为本发明所用的支撑载体载体，只要可在内部培养细胞就可以，优选是与所述培养基的混合物。作为如此的支撑载体载体，可列举出胶原、血纤维蛋白、昆布宁、细胞外母质混合物、聚乙二醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、乳酸/乙醇酸共聚物(PLGA)、泡孔母质(商品名)、美比奥尔(メビォ一ル)凝胶(商品名)、马托利(マトリ)凝胶(商品名)等。这些支撑载体载体，只要具有在将细胞配置在内部时可大致维持配置位置的程度的硬度就可以，可列举凝胶状、纤维状、固体状的载体。此处，所谓可维持细胞的位置的硬度，通常，只要是能够保持作为三维培养应用的硬度，即能保持细胞的配置，同时不妨碍增殖形成的肥大化的硬度就可以，很容易确定。例如，在是胶原时，使用最终浓度为2.4mg/ml的浓度就可提供适当的硬度。
另外，此处，支撑载体载体，只要具有能够在载体内部发育第一及第二细胞集合体的程度的厚度就可以，可根据作为目标的组织的尺寸等适宜设定。
此外，支撑载体载体只要可保持细胞的接触状态就可以，但此处所述的“接触状态”，为在各细胞集合体，此外在细胞集合体间确实使细胞相互作用，优选是高密度的状态。
所谓高密度的状态，指的是与构成组织时的密度的同等程度的密度，例如，在细胞集合体时，在配置细胞时为5×107～1×109个/ml，为了不损失细胞的活性，确实使细胞相互作用，优选1×108～1×109个/ml，更优选2×108～8×108个/ml的密度。为了将细胞集合体调制到如此的细胞密度，同时为了不损失细胞活性地简便地进行高密度化，优选通过离心使细胞凝集，实现沉淀化。这样的离心，只要以不有损细胞生存的适合300～1200×g、优选500～1000×g的离心力的旋转数进行3～10分钟就可以。如果离心低于300×g，有时细胞的沉淀不充分，细胞密度降低，另一方面，如果离心高于1200×g，有时细胞受损，因此高低都不优选。
在通过离心分离调制高密度的细胞的情况下，通常，只要在细胞离心分离所用的管等容器内，在调制好单一细胞的悬浊液后进行离心分离，残存作为沉淀物的细胞，尽量除去上清液就可以。此时使用的管等容器，从完全除去上清液的观点出发，优选是涂敷了硅的容器。
在规定为通过离心分离得到的沉淀物的情况下，只要将沉淀物直接配置在支撑载体载体的内部就可以。此时，优选目标细胞以外的成分(例如，培养液、缓冲液、支撑载体载体等)在与细胞容量的等量以下，更优选不含目标细胞以外的成分。如果是如此的高密度的细胞集合体，细胞紧密接触，可有效地发挥细胞间相互作用。
在以组织的状态使用的情况下，优选通过进行酶处理等除去成为对象的细胞以外的结合组织等。在目标细胞以外的成分多的情况下，例如如果达到与细胞容量的等量以上，不能充分发挥细胞间相互作用，因此不优选。
此外，第一细胞集合体和第二细胞集合体的接触越紧密越好，更优选相对于第一细胞集合体压紧第二细胞集合体地配置。此外，由于用不阻碍培养液、氧透过的固形物包围第一细胞集合体和第二细胞集合体的周围，对于使细胞集合体间的接触紧密相接也是有效的，在粘度不同的溶液中加入密度高的细胞悬浊液，然后配置，直接固化溶液，也容易实现细胞接触的保持，因此优选此方法。此时，在以第一细胞集合体作为牙胚间充质系细胞的单一细胞集合物，以第二细胞集合体作为牙胚上皮组织的情况下，优选，牙胚上皮组织的釉连接点与第一细胞集合体接触配置，但也不限定于此。
在支撑载体载体是凝胶状或溶液状等的情况下，也可以在配置工序后设置固化支撑载体载体的固化工序。通过固化工序，可使配置在支撑载体载体内部的细胞在支撑载体载体内部固定化。在支撑载体载体的固化中，也可以直接应用一般所用的支撑载体载体的固化条件。例如，在支撑载体载体采用胶原等可固化的化合物的情况下，能够通过在通常所用的条件下，例如在培养温度下静置几分钟～几十分钟来固化。由此，能够使支撑载体载体内部的细胞间的结合固定化，同时还可形成强固的结合。
在本发明的制造方法的培养工序中，在支撑载体载体内部培养第一细胞集合体及第二细胞集合体。在该培养工序中，通过相互紧密接触的第一细胞集合体及第二细胞集合体可有效地进行细胞间相互作用，可再构成组织，即牙齿。
培养工序，可通过用支撑载体载体维持第一细胞集合体和第二细胞集合体的接触状态来进行，可以是具有第一及第二细胞集合体的只利用支撑载体载体的培养，也可以是其它动物细胞存在下的培养。
作为培养时间，因配置在支撑载体载体内部的细胞数及细胞集合体的状态、以及培养工序的实施条件而异，但一般为1～300天，为了形成在外侧具有釉质、在内侧具有象牙质的牙齿，优选1～120天，从可迅速提供的观点出发，优选为1～60天。另外，为了形成具备牙周组织牙齿，一般规定为1～300天，优选为1～60天。
在只利用支撑载体载体培养的情况下，可规定为在动物细胞培养所用的通常的条件下的培养。此处的培养，一般可直接采用动物细胞的培养条件，也能够直接采用前面所述的条件。此外，在培养中也可以添加源自哺乳动物的血清，此外也可以添加对这些细胞的增殖或分化有效的已知的各种细胞因子。作为这样的细胞因子，可列举FGF、BMP等。
此外，从组织或细胞集合体的气体交换或营养供给的观点出发，优选采用器官培养。在器官培养中，一般，使多孔性的膜浮在适合动物细胞的增殖的培养基上，在该膜上放置用支撑载体载体包埋的细胞集合体，如此进行培养。关于此处所用的多孔性的膜，优选具有多个0.3～5μm左右的孔的膜，具体可列举出泡孔培养嵌件(商品名)、同孔过滤器(商品名)。
在是其它动物细胞的存在下的培养的情况下，由于通过接受来源自动物细胞的各种胞质分裂等的作用，能够早期形成具有特有的细胞配置的牙齿，因此优选此方法。如此的在其它动物细胞存在下的培养，也可以采用离析细胞或培养细胞，通过生物体外的培养进行。
此外，为了能够早期进行牙齿及/或牙周组织的形成，更优选将具有第一及第二细胞集合体的支撑载体载体移植在生物体中，在生物体内进行培养。在此种情况下，可与支撑载体载体一同将第一及第二细胞集合体移植到生物体内。
可用于此用途的动物，可优选列举哺乳动物，例如人、猪、小鼠等，更优选来源自与牙胚组织同一种的哺乳动物。在移植人牙胚组织的情况下，优选采用人、或免疫不全地改变的人以外的其它哺乳动物。作为适合这样的生物体内发育的生物体部位，为了尽量正常生成动物细胞的器官或组织，优选肾脏皮膜下、肠间膜、皮下移植等。
关于利用移植的发育时间，因移植时的尺寸和生成牙齿的尺寸而异，一般可规定为3～400天。例如，肾脏皮膜下移植的时间因移植的培养物的尺寸和再生牙齿的尺寸而异，但从牙齿的再生和移植前生成的牙齿的尺寸方面考虑，优选7～60天。
也可以在进行向生物体移植之前，进行生物体外的培养(预培养)。通过此种预培养，可加强细胞间的结合和第一及第二细胞集合体相互间的结合，能够更加加强细胞间相互作用，因此优选预培养。其结果，能够缩短整体的发育时间。
预培养的时间可以是短的，也可以是长的。长时间，例如在规定为3天以上，优选7天以上的情况下，由于能从牙胚向齿芽生长，进而在移植后还可缩短到生成牙齿的时间，因此优选此时间。作为预培养的时间，例如作为进行肾脏皮膜下移植时的器官培养，优选规定为1～7天，以便高效率地再生牙齿。
用本发明的制造方法制造的牙齿，具有在内侧具有象牙质、外侧具有釉质这样的作为牙齿特有的细胞配置(结构)，此外优选，还具备称为牙齿的顶端(牙冠)和牙根的方向性。通过至少除如此的特有的细胞配置、优选的细胞配置以外还具有方向性，能发挥作为牙齿的功能。因此，可广泛用作牙齿的代替物。尤其，在采用来源自自家牙胚的间充质系细胞及上皮系细胞的情况下，能够回避拒绝反应带来的问题地使用。此外，在一般采用来源自移植抗原适合的他人的牙胚的细胞的情况下，也能够回避拒绝反应带来的问题。
另外，在本发明中，通过延长培养时间，除牙齿本身外，还能够将牙齿支撑载体在颚骨上，形成固定化的牙槽骨或牙根膜等牙周组织。结果，可提供移植后可实用的牙齿。
即，本发明的牙周组织的制造方法，其特征在于，包含以下工序：将所述第一及第二细胞集合体培养到得到牙齿和与之连接的牙周组织的工序(培养工序)、以及离析通过所述培养得到的牙周组织的工序。
在此方法中，通过根据延长到得到牙周组织的培养时间，与牙齿连接地形成牙周组织，从牙齿分离，可只得到牙周组织。牙周组织的离析，也可以通过能够分离在培养工序的过程中形成的牙周组织和牙齿的任何方法进行，可列举出利用小镊子等的分离、或利用酶的部分消化等。
另外，在所述牙齿的制造方法中说明的事项，只要不限制培养时间，都能用于本牙周组织的制造方法。
通过本发明的所述牙齿的制造方法及牙周组织的制造方法得到的牙齿及牙周组织，除用作移植片外，还能有效地用于探讨牙齿生成过程的研究，对于今后的与牙齿相关的组织成长也能用作有效的研究方法。
另外，在作为移植片采用得到的齿或牙周组织的情况下，优选，将制造方法中的培养工序规定为，不与其它动物细胞接触并且可全程在体外调制的器官培养的工序。
本发明的牙齿的集合体，是具有用所述牙齿的制造方法得到的牙齿特有的细胞配置的牙齿的集合体。
这样的牙齿的集合体，由于由具有牙齿特有的细胞配置的多个牙齿构成，因此能够从集合体分离各个牙齿，如下所述可用作1个牙齿的移植片。如此本发明的牙齿的制造方法，在同时制作多个牙齿的情况下，还能够以由多个牙齿构成的牙齿集合体提供牙齿。结果，能够高效率地制作作为移植片的牙齿。
牙齿的集合体，通过直接采用所述牙齿的制造方法能够很容易得到。尤其，由于在所述第一及第二细胞调制工序中，分别调制第一及第二细胞集合体，并在配置工序中相互接触地将其配置在支撑载体载体内部，所以在支撑载体载体内部，能够容易从本来形成1个牙齿的细胞群形成多个牙齿。
在牙齿的集合体的制造方法中，第一及第二细胞集合体，为了易于进行用于生成多个牙齿的牙胚的再诱导，优选都由单一细胞构成。另外，培养工序，与所述同样可以是器官培养，也可以是肾脏皮膜下的培养。但在作为移植片采用得到的牙齿的情况下，优选规定为不与其它动物细胞接触的且全程能够在体外调制的器官培养。
此外，本发明中包含牙齿的移植方法。该移植方法包括：得到所述牙齿的集合体的工序、从牙齿的集合体分离各个牙齿的工序、和与移植部位上的其它牙齿具有相同的方向性地移植对齐分离的牙齿的工序。
由此，能够高效率地实施牙齿的移植，同时得到具备特有的细胞配置和方向性的多个牙齿。
根据本发明的牙齿，还可用于伴有牙齿损坏及损伤的各种症状，例如，龋蚀、边缘性牙周炎(牙槽脓漏)、牙周病造成的牙齿损坏，事故等造成的折损或脱落等的治疗或处置。
即，本发明的治疗方法，包含将用本发明的制造方法得到的牙齿及/或牙周组织移植到损坏及/或损伤部位的伴有。由此，能够治疗及/或缓和损坏及/或损伤部位的所述症状。
本发明的另一治疗方法，包含对损坏及/或损伤部位只实施本发明的培养伴有，或者实施配置伴有及培养伴有。在此种情况下，作为支撑载体载体，除以上所述的以外，也可以作为支撑载体载体采用损坏及/或损伤部位的周围组织本身。由此，通过从生物体内的周边组织的胞质分裂等，能够更迅速地进行损坏及/或损伤部位的治疗等。
在本发明中，由于基于间充质系细胞及上皮系细胞的细胞间相互作用，能够有效地再构成组织，因此可提供通过间充质系细胞和上皮系细胞的相互作用构筑的组织的制造方法。
即，本发明的组织的制造方法，是通过间充质系细胞和上皮系细胞的相互作用构筑的组织的制造方法，其中包括：在支撑载体载体内部接触配置，实质上只由间充质系细胞及上皮系细胞中的任何一方构成的第一细胞集合体、和实质上只由任何另一方构成的第二细胞集合体的工序；和在所述支撑载体载体的内部培养所述第一及第二细胞集合体的工序。
另外，所述牙齿的制造方法中说明的事项，只要不特别说明，都能同样地用于本组织的制造方法。
作为可用由本组织的制造方法制造的组织，通过间充质系细胞及上皮系细胞的细胞间相互作用构筑的组织比较适合，除上述的牙齿外，还可列举毛发、肾脏、肺、肝脏等，可以是这些组织整体，也可以是其一部分。
此时，优选，间充质系细胞和上皮系细胞的至少一方，来源自目标组织。由此，采用已对目标组织进行了方向附加的细胞，能够容易形成组织。此外，为更可靠地制造目标组织，更优选都来源自目标组织。
作为用于调制分别由间充质系细胞及上皮系细胞构成的细胞集合体的组织，在是牙齿时，可列举出牙胚或齿髓细胞、牙根膜细胞、口腔内上皮·间充质细胞，在是毛发时，可列举出生成过程中的丝胞器官原基或成体的丝胞组织，在是肾脏时，可列举出生成过程中的肾内脏官原基或成体的肾脏组织，在是肺时，可列举出生成过程中的肺器官原基或成体的肺组织，在是肝脏时，可列举出生成过程的肝内脏官原基或成体的肝脏组织。
为了从这些组织调制各细胞集合体，如上所述，只要从组织分离间充质系细胞和上皮系细胞，与所述同样地调制第一及第二细胞集合体，与所述同样地配置在支撑载体载体内部，然后进行培养及/或移植就可以。
由此，能够与所述的牙齿同样地，得到目标组织具有特有的细胞配置的组织。
以下，说明本发明的实施例，但也不限定于此。此外，实施例中的％，只要不特别指出，为重量(质量)百分比。
实施例
[实施例1～3及比较例1～4]
(1)牙胚上皮系细胞和牙胚间充质系细胞的调制
为了进行牙齿的形成，进行了牙胚的再构筑。作为此实验标本采用小鼠。
C57BL/6N小鼠(从日本CLEA购入)或Green Fluorescence Protein(EGFP)基因转移小鼠即C57BL/6-TgN(act-EGFP)OsbC14-Y01-FM131(GFP小鼠：理研生物源中心)的胎龄14.5天，在显微镜下利用通常的方法从胚仔摘取下颚切齿牙胚组织。用不含Ca2+、Mg2+的磷酸缓冲液(PBS(-))清洗下颚切齿牙胚组织，用在PBS(-)中添加了最终浓度为1.2U/ml的Dispase II(Roche，Mannheim，Germany)的酶液，室温处理12.5分钟后，用添加了10％FCS(JRH Biosciences，Lenexa，KS)的DMEM(Sigma，St.Louis，MO)清洗3次。另外，以达到最终浓度为70U/ml的方式添加DNaseI溶液(Takara，Siga，Japan)，使牙胚组织分散，采用25G注射针(Terumo，Tokyo，Japan)，用外科分离牙胚上皮组织和牙胚间充质组织。
牙胚上皮系细胞，用PBS(-)3次清洗通过所述得到的牙胚上皮组织，用在PBS(-)中溶解了最终浓度为100U/ml的Collagenase I(Worthington，Lakewood，NJ)的酶液，在37℃2次重复20分钟的处理。将通过离心分离沉淀回收的细胞，再用0.25％Trypsin(Sigma)-PBS(-)，在37℃处理5分钟。在用添加有10％FCS的DMEM，3次清洗细胞后，在细胞中添加最终浓度为70U/ml的DNase I溶液，通过吸取得到单一的牙胚上皮系细胞。
另一方面，牙胚间充质系细胞，通过用PBS(-)3次清洗牙胚间充质组织，用含有0.25％Trypsin(Sigma)、50U/ml的Collagenase I(Worthington)的PBS(-)进行了处理。添加70U/ml的DNase I(Takara)，通过吸取得到了单一的牙胚间充质系细胞。
(2)再构成牙胚的制作
接着，采用按所述调制的牙胚上皮系细胞及牙胚间充质系细胞，进行了牙胚再构筑。
在涂布有硅酮脂膏的1.5mL微型管(Eppendorf，Hamburg，Germany)中，装入用添加有10％FCS(JRH Biosciences)的DMEM(Sigma)悬浊的牙胚上皮系细胞、或牙胚间充质系细胞，通过离心分离(580×g)作为沉淀物回收细胞。尽量除去离心后的培养液的上清液，进行再次离心操作，用实体显微镜观察，同时采用GELoader Tip 0，5-20μL(eppendorf)完全除去残存在细胞沉淀物周围的培养液，准备好用于再构成牙胚制作的细胞。
在涂布有硅酮脂膏的培养盘上，滴下30μL的用所述培养液调制到2.4mg/ml的浓度的Cellmatrix type I-A(Nitta gelatin，Osaka，Japan)，制作胶原凝胶溶液的落滴(凝胶落滴)。在该溶液中，采用0.1-10μL的吸管(Quality Scientific plastics)，应用0.2-0.3μL的所述牙胚上皮系细胞、或牙胚间充质系细胞的离心后的沉淀物，制作了作为细胞集合体的细胞凝集块。
参照图2说明上述过程。
用吸管16先前配置在凝胶落滴10内的细胞凝集块12在凝胶落滴10内构成球体(参照图2(B))。然后多通过推入另一方的细胞凝集块14，压破球体的细胞凝集块12，包覆另一方的细胞凝集块14(参照图2(C))。然后通过使凝胶落滴10固化，加强细胞间的结合(参照图2(D))。
在本实施例中，作为细胞集合体，分别调制由上皮系细胞或间充质系细胞的单一细胞构成的细胞凝集块、和牙胚中的由上皮系细胞构成的部分组织及由间充质系细胞构成的部分组织，然后使用。
在本实施例中，在组合由细胞凝集块和组织形成的再构成牙胚时(实施例1及2)中，在从牙胚上皮系细胞、或间充质系细胞制作的细胞凝集块中，在将由上皮系细胞或间充质系细胞构成的部分组织移到凝胶落滴中后，采用钨针，使各个组织的牙胚上的组织边界面侧密合在细胞凝集块上，制作成再构成牙胚。
另一方面，在采用由单一细胞形成的牙胚上皮系细胞和牙胚间充质系细胞的再构成牙胚(实施例3)中，以接合在先前制作的牙胚间充质系细胞的细胞凝集块上的方式，用同样的方法应用牙胚上皮系细胞，制作细胞凝集块，使两者相互紧密接触，如此制作了再构成牙胚。
将在凝胶落滴中制作的再构成牙胚在CO2恒温箱中静置10分钟，固化Cellmatrix type I-A(Nitta Gelatin)，与支撑载体载体即周围的凝胶一同将细胞凝集块移到培养容器的泡孔培养嵌件的膜上，该培养容器被配置成泡孔培养嵌件(细孔尺寸为0.4微米的PET膜片；BD，Franklin Lakes，NJ)与添加10％FCS(JRH)的DMEM(Sigma)接触，器官培养18-24小时。培养后，连周围的凝胶一齐移植到8周龄C57BL/6的肾皮膜下，进行不同位置的牙齿的生成，或继续泡孔培养嵌件上的器官培养，分析了牙齿的生成。
此外，作为比较例，分别与所述同样地调制了，将牙胚组织直接移植到肾皮膜下的(比较例1)、分别单独移植从牙胚分离的上皮组织和间充质组织的(比较例2)、此外采用含有与细胞容量等量的培养液的低密度凝集块的(比较例3)、从牙胚分离，混合上皮细胞和间充质细胞，不区分上皮细胞和间充质细胞地在支撑载体载体中形成细胞凝集块的(比较例4)，相同地进行了分析。另外，在比较例4中，上皮细胞和间充质细胞的混合，分别在按1对1的比率稳定混合后，与实施例1～3同样地，作为用于再构成牙胚制作的1个细胞凝集块调制。
(3)组织学的解析
在肾皮膜下移植的情况下，在移植后第七天或第十四天，连周围的肾组织一齐摘取再构成牙胚，在用4％多聚甲醛-磷酸缓冲液固定6小时后，用4.5％的EDTA(pH7.2)脱灰24小时，利用通常的方法石蜡包埋，制作10μm的切片。为了进行组织学的分析，用通常的方法进行了苏木精-曙红染色。
在作为再构成牙胚采用源自GFP小鼠的牙胚的时候，在用50％(w/v)蔗糖-4％多聚甲醛-磷酸缓冲液固定18小时后，用4.5％的EDTA(pH7.2)脱灰24小时，包埋在OCT compound(Miles Inc，Naperville，IL)中，用低温恒温器(クリォスタット)(Leica，Wetzlar，Germany)制作10μm的切片，然后用荧光显微镜(Zeiss公司制)观察。
图3示出牙胚组织的原样培养的结果，图4～7示出按本发明的制造方法培养的结果。
在进行了摘取的牙胚的原样肾皮膜下移植的比较例1中，如图3所示，由于构成牙胚的间充质系细胞和上皮系细胞的细胞间相互作用未受损害，因此形成来源自上皮系细胞的釉质、来源自间充质系细胞的象牙质和齿髓，将釉质及象牙质配置在所定的位置，同时形成了具有牙齿前端部和牙根的牙齿。
另一方面，如图4～6所示，按照本发明，在采用从牙胚调制的单一细胞形态时，即，在通过牙胚上皮组织中组合牙胚间充质系细胞再构成时(参照实施例1、图4及图5)、和通过在牙胚上皮系细胞中组合牙胚间充质组织再构成时(参照实施例2、图6)，分别，能够用11～14天的时间，通过肾皮膜下移植，生成内侧具有象牙质及外侧具有釉质的具备特有细胞配置的牙齿。此处得到的牙齿，表示能够再构成与通过直接培养牙胚得到的正常生成的牙齿(图3)同样的牙齿。
另外，如图4所示，通过本再构成和肾皮膜下移植，在移植后第十一天，很容易认出外侧的釉质、釉芽细胞、釉芽细胞、象牙质、象牙芽细胞。还认出牙根部分也与正常生成无变化，在牙根部分的外周还认出牙槽骨。此外，根据经时观察，在移植后第三天很容易认出象牙质、象牙芽细胞，在组织配置上开始形成牙齿特征的结构。此外，在第七天还存在象牙质的蓄积、和象牙芽细胞及釉芽细胞，其后进行牙齿的生成(未示出数据)。
此外，在刚配置在凝胶落滴内后，发现构成细胞凝集块的细胞在显微镜下单独存在，但通过1天的短期培养，与摘取的正常牙胚同样，细胞的结合变得强固，变化成如1个的组织。由此表明，移植前的短期培养对于牙齿的形成是有效的。
此外，在采用源自GFP小鼠的间充质系细胞的情况下，表明局限于源自内侧的间充质细胞的齿髓细胞和象牙芽细胞(图5)，另一方面，在采用源自GFP小鼠的上皮系细胞的情况下，表明局限于外侧的釉芽细胞，使用的细胞种和荧光一致(图6)。因此，说明与正常生成同样地进行了细胞相互作用，不损害生成时的细胞的方向性地进行了组织的再构成。
另外，即使在不采用肾皮膜下的移植，继续器官培养的情况下，从培养开始，经时培养的再构成牙胚也逐渐长大，在移植后第十六天，容易认出象牙质、象牙芽细胞，认出在组织配置上形成牙齿特征的结构(未示出数据)。如此的利用器官培养的构筑，不仅在作为组织采用一方时，即使在采用上皮系细胞及间充质系细胞双方时也同样被认可。
此外，在采用牙胚上皮系细胞及牙胚间充质系细胞时(实施例3)，如图7所示，与作为组织采用任何一方时同样，能够确认象牙质及釉质的存在。在采用牙胚上皮系细胞及牙胚间充质系细胞时，认出屡次发现由1个再构成牙胚生成具有多个方向性和结构的牙齿，暗示有通过分离生成后的齿芽生成多个牙齿的可能性。尤其，在先将牙胚间充质系细胞配置在凝胶落滴内，然后接触配置牙胚上皮系细胞的情况下，能够更明确地构筑釉质及象牙质分别被配置在外侧及内侧的具有特征性的结构，更容易选择牙齿的形态，显示出利于牙齿形成的可能性(未示出数据)。
另外，通过器官培养根据本发明配置上皮系细胞和间充质系细胞，再构成的牙胚，屡次认出多个牙胚及/或齿芽的形成。这暗示通过外科分离这些多个牙胚及/或齿芽，有从1个再构成牙胚生成多个牙齿的可能性。
另一方面，在只用上皮组织或只用间充质组织培养的比较例2的情况下，如图8所示，不能构成上述这样的特定结构的牙齿。因此，在本发明的方法中，暗示通过进行细胞相互作用，再构成了具有特定结构的组织。
此外，在采用低密度的细胞凝集块的比较例3的情况下，如图9所示，在胶原凝胶落滴中的培养中单一细胞已经分散，即使移植到肾脏皮膜下，也不能再构成作为牙齿的特定结构。这暗示，要通过细胞相互作用再构成牙齿，优选尽可能采用高密度的细胞凝集块。
另外，在是事前1对1地混合牙胚上皮系细胞和牙胚间充质系细胞，高密度且不区分这些细胞地形成细胞凝集块的比较例4的情况下，如图10所示，未认出釉质或象牙质的硬组织。这表明，重要的是在个别地调制了牙胚上皮系细胞的集合体和牙胚间充质系细胞的集合体后，区分地形成细胞凝集块。
(4)牙周组织的确认
接着，确认用本方法形成的齿是否具备牙周组织。牙周组织的确认，除利用所述的HE染色图像观察外，还采用了下记的原地杂交。
在移植后的第十四天摘取肾皮膜下移植的再构成牙胚，用通常的方法进行石蜡包埋，形成10μm厚的切片。将切片浸入二甲苯和乙醇稀释系列中，除去石蜡。用含有10μg/ml Protease K(Nacalai tesque，kyoto，Japan)的PBS(-)处理3分钟，用4％多聚甲醛(Nacalai tesque)磷酸缓冲液固定15分钟。用含有0.1％(v/v)Triton X-100(Sigma)的PBS(-)处理3分钟，用PBS(-)清洗3分钟。用0.2N HCl(Wako)处理10分钟，用PBS(-)和DEPC(焦碳酸二乙酯)水分别清洗5分钟。用含有1.5％(v/v)三乙醇胺(nacalaitesque)、0.33N HCl(Wako)、0.25％(v/v)乙酐(Nacalai tesque)的DEPC水处理10分钟后，用2×SSC进行10分钟清洗2次。Periostin(Genbankaccession no.NM#015784)探测器，采用读取最初(-7，ggctgaagatggttcctctc、配列番号1)和反读取最初(573，gtacattgaaggaataacca、配列番号2)，DIG标识通过PCR取得的cDNA断片。按照通用方法进行原地杂交，用抗DIG-AP Fab碎片(Roche)和NBT/BCIP Stock Solution(Roche)使其发色，用Axio Imager A.1(Zeiss)和AxioCam MRc5(Zeiss)进行了分析。
就牙周组织的有无，详细观察了所述实施例中的牙周组织，结果发现，在实施例1～3的所有例中，如图4～图7所示，在移植后第十四天的牙齿的周围，形成了与移植正常牙胚的比较例1(参照图3)同样的牙槽骨。
另外，如图11所示，尽管单一细胞和组织的组合不同，在实施例1～3的所有例中，在得到的牙齿的周围，都形成了与移植了正常牙胚的比较例1同样的牙槽骨及牙根膜。此外，在实施例2的牙齿中确认的地方，如图12所示，在通过HE染色认出牙根膜形成的区域，认出牙根膜特异的遗传因子即periostinmRNA的出现(在实施例1及3中也同样)。
这表明，根据实施例1～3制作的牙胚，能够形成牙槽骨或牙根膜等牙周组织。
[实施例4及5、比较例5]
在与所述同样地结束了配置工序后，作为培养工序，在整个14天中继续实施一般所用的器官培养，分析了牙齿的生成。以源自牙胚的上皮组织和间充质细胞的组合作为实施例4，以源自牙胚的上皮细胞和间充质细胞的组合作为实施例5。另外，将采用正常牙胚器官培养的例子作为比较例5。图13示出其结果。
如图13所示，实施例4及5都随着培养时间的延长而增大牙胚的尺寸，认出生成具有与实施肾皮膜下移植时大致同样的特征结构的牙齿。
此外，在实施例4及5的所有例中，通过器官培养得到的牙齿，形成由多个牙齿构成的集合体(例如，在采用间充质细胞和上皮细胞时为6个，在图13的最下段)。
[实施例6及7、比较例6]
如实施例5所示，从再构成牙胚得到的牙齿，尽管从1个再构成牙胚调制了间充质细胞及上皮细胞，但仍被朝多个牙齿再诱导。如此分析了用再构成牙胚同时再诱导的各个牙齿是否可作为1个牙齿生长。
(1)从再构成牙胚生成的多个牙胚的分离和朝牙齿生成的能力分析
1)多个生成的牙胚的单个分离和器官培养
将与实施例3同样地得到的再构成牙胚器官培养2～5天，从1个再构成牙胚生成多个牙胚。然后，在器官培养第二～5天，在实体显微镜下，用注射针和小镊子，用外科将生成多个牙胚的再构成牙胚分离为1个牙胚。
在涂布有硅酮脂膏的培养盘上，与实施例1同样地，滴下30μL的Cellmatrix type I-A(Nitta gelatin，Osaka，Japan)，制作凝胶落滴。在该凝胶落滴中加入所述单个分离牙胚，在CO2恒温箱中静置10分钟，使Cellmatrix type I-A(Nitta Gelatin)固形化，与支撑载体载体即周围的凝胶一同将单个分离牙胚移入到培养容器的泡孔培养嵌件的膜上，该培养容器被配置成泡孔培养嵌件(细孔尺寸为0.4微米的PET膜片，BD，FranklinLakes，NJ)与添加10％FCS(JRH)的DMEM(Sigma)接触，如此器官培养18-24小时。
2)组织学的分析
培养后，连周围的凝胶一齐移植在8周龄C57BL/6的肾皮膜下，在第十四天连周围的肾组织一齐摘取单个分离牙胚。在用4％多聚甲醛-磷酸缓冲液固定组织6小时后，用通常的方法石蜡包埋，制作10μm的切片。为进行组织学的分析，按照通常的方法，进行勒苏木精-曙红染色。
3)结果
将分离的牙胚移植到肾脏皮膜下，使其生成14天，图14示出组织学上的分析结果。如图14所示，移植的分离牙胚，分别生成在具有釉质和象牙质、齿髓、牙冠、牙根等特征的1个“牙齿”上。此外，分别确认在得到的牙齿的牙冠部存在釉质和象牙质(参照图14中段及下段上的a)、及在牙根部存在牙根的开口部(参照图14中段上的b)。
这些表示，与正常生成的牙齿同样地在牙冠部存在釉芽细胞和象牙芽细胞，此外具有与正常生成的牙齿相同的形态，作为牙齿的集合体同时生成的各个牙齿，在细胞配置及方向性上都与正常生成的牙齿相同。
(2)通过口腔内移植再构成牙胚生成牙齿
1)单个分离牙胚和单个分离牙的制作
与所述同样地，在器官培养第二～5天，从生成多个牙胚的再构成牙胚制作单个分离的牙胚。另一方面，在实体显微镜下，用注射针和小镊子，外科单个分离肾皮膜下移植14天后摘取的、由再构成牙胚多个生成的牙齿。
在是单个分离牙胚时，与所述同样地，在涂布有硅酮脂膏的培养盘上，滴下30μL的用所述培养液调制到2.4mg/ml的浓度的Cellmatrix type I-A(Nitta gelatin，Osaka，Japan)，制作凝胶落滴。在该凝胶落滴中，加入所述单个分离牙胚，在CO2恒温箱中静置10分钟，固化Cellmatrix type I-A(Nitta Gelatin)。接着，与支撑载体载体即周围的凝胶一同将单个分离牙胚移入到培养容器的泡孔培养嵌件的膜上，该培养容器被配置成泡孔培养嵌件(细孔尺寸为0.4微米的PET膜片，BD，Franklin Lakes，NJ)与添加10％FCS(JRH)的DMEM(Sigma)接触，如此器官培养18-24小时。
培养后，用注射针和小镊子，外科除去周围的凝胶，移植到8周龄C57BL/6的下颚切齿拔牙孔内，作为实施例6。另一方面，在是从移植到肾脏皮膜下的再构成牙胚单个分离的牙齿的情况下，分离后不用凝胶包覆，直接移植到8周龄C57BL/6的下颚切齿拔牙孔内，作为实施例7。
2)切齿的拔牙和口腔内移植的方法
在口腔内移植的3天前，对用二乙醚吸引麻醉的8周龄C57BL/6，相对于体重20g，按200μl的比例腹腔注射含有5mg/ml的戊巴比妥钠的生理食盐水。用手术刀剥离痛觉麻痹的小鼠的下颚切齿萌出部附近的下颚骨，露出埋在颚骨内的切齿顶端部。用小镊子从下颚拔掉切齿，用脱脂棉擦拭血液，并止血。为摄取食物，规定拔牙只拔掉单侧的下颚切牙齿，每日供给粉末状粉碎的饲养用饵料。
用二乙醚吸引麻醉用所述方法拔掉牙的8周龄C57BL/6，相对于体重20g，按200μl的比例腹腔注射含有5mg/ml的戊巴比妥钠的生理食塩水。将痛觉麻痹的小鼠，以拔牙的一侧的颚朝上的方式固定在解剖台上，由拔牙孔牙根部区域的头部横面切开皮肤和肌肉层，使下颚骨露出。用手术刀，在覆盖拔牙孔牙根部区域的下颚骨，在是单个分离牙胚时开直径1mm的孔，在是单个分离牙时开直径2mm的孔，从此出将单个分离牙胚和单个分离齿牙移植在拔牙孔牙根部区域。移植的单个分离牙胚和单个分离牙齿的朝向，与正常生成的牙齿的方向一致，此外也与在成体小鼠下颚切齿看到的釉质、牙根膜的方向性一致。用通常的方法缝合切开的肌肉层和皮肤。对进行了口腔内移植的8周龄C57BL/6，每日供给粉末状粉碎的饲养用的饵料。
另外，将切齿拔牙后未移植的小鼠作为比较例6。
3)组织学的分析
在口腔内移植后第十四天，摘取移植了单个分离牙胚、以及单个分离牙齿的下颚骨。在用4％多聚甲醛-磷酸缓冲液固定16小时后，用22.5％的甲酸脱灰72小时，用通常的方法石蜡包埋，制作10μm的切片。脱灰液两个下颚骨为50ml，在脱灰第四8小时时交换了总量。为了进行组织学的分析，按通常的方法进行了苏木精-曙红染色。
在作为单个分离牙胚、以及单个分离齿牙，采用源自C57BL/6-TgN(act-EGFP)OsbC14-Y01-FM131小鼠的牙胚的时候，在用4％多聚甲醛-磷酸缓冲液固定16小时后，用22.5％的甲酸脱灰72小时，用通常的方法包埋在OCT compound(Miles Inc.，Naperville，IL)中，用低温恒温器(クリォスタット)(Leica，Wetzlar，Germany)制作10μm的切片，用荧光显微镜(Zeiss公司制)观察。
4)结果
图15中示出切齿拔牙后不移植的比较例6的小鼠的拔牙14天后的组织图像，图16及图17中分别示出将单个分离的牙胚(实施例6)、以及牙齿(实施例7)移植在切齿拔牙孔内14天后的组织图像。
如图15所示，在比较例6的非移植小鼠上，只认出浸润在切齿拔牙孔的符合移植部位的位置上的细胞和生成的骨，未发现具有硬组织的牙齿。
相反，如图16所示，在作为实施例6移植单个分离的牙胚的适宜部位上，生成外侧具有釉质、内侧具有象牙质的牙齿。在生成的牙齿，认出牙齿的顶端和牙根，存在牙齿的方向性，具有与正常生成的牙齿相同的结构。
此外，对于把肾脏皮膜下移植生成后分离的牙齿移植到拔牙孔的实施例7的小鼠，如图17所示，在适宜部位生成了外侧具有釉质、内侧具有象牙质的牙齿。生成的牙齿，具有牙齿的顶端和牙根，在齿髓内部发现血管，同时牙齿的周围具有牙根膜和牙槽骨，具有与正常生成的牙齿相同的结构。
[实施例8及比较例7]
(1)丝胞(日语：毛胞)的再构成
本发明中开发的技术，由于显示出不仅有助于牙胚的生成，而且还能用于其它器官形成，因此实施了丝胞的再构成。作为该实验标本采用小鼠。
1)细胞的分离方法
在C57BL/6N小鼠(从日本CLEA购入)或Green Fluorescence Protein(EGFP)基因转移小鼠即C57BL/6-TgN(act-EGFP)OsbC14-Y01-FM131(理研生物源中心)的胎龄14.5天，在显微镜下利用通常的方法从胚仔摘取上颚须丝胞组织。用不含Ca2+、Mg2+的磷酸缓冲液(PBS(-))清洗下颚须丝胞组织，用在PBS(-)中添加了最终浓度为1.2U/ml的Dispase II(Roche，Mannheim，Germany)的酶液，室温处理60分钟后，用添加了10％FCS(JRHBiosciences，Lenexa，KS)的DMEM(Sigma，St.Louis，MO)清洗3次。另外，以达到最终浓度70U/ml的方式，添加DNase I溶液(Takara，Siga，Japan)，使丝胞组织分散，采用25G注射针(Terumo，Tokyo，Japan)，外科分离丝胞上皮组织和丝胞间充质组织。
对于丝胞上皮系细胞，用PBS(-)3次清洗按所述得到的丝胞上皮组织，用在PBS(-)中溶解了最终浓度100U/ml的Collagenase I(Worthington，Lakewood，NJ)的酶液，在37℃2次重复20分钟的处理。另外用0.25％Trypsin(Sigma)-PBS(-)，37℃、5分钟处理通过离心分离沉淀回收的细胞。在用添加10％FCS的DMEM 3次清洗细胞后，在细胞中添加最终浓度70U/ml的DNase I溶液，通过吸取得到单一的丝胞上皮系细胞。
另一方面，对于丝胞间充质系细胞，用PBS(-)3次清洗丝胞间充质组织，用含有0.25％Trypsin(Sigma)、50U/ml的Collagenase I(Worthington)的PBS(-)处理。添加70U/ml的DNase I(Takara)，通过吸取得到单一的丝胞间充质系细胞。
2)再构成丝胞的制作方法
接着，除采用按所述调制的丝胞上皮系细胞及丝胞间充质系细胞以外，与实施例1同样地准备用于再构成丝胞制作的细胞，在胶原凝胶落滴中分别应用0.2-0.3μL，制作各自的细胞凝集块，两者相互紧密接触地制作成再构成丝胞。
3)肾皮膜下移植
在凝胶中制作的再构成丝胞，与实施例1同样地，将细胞块与支撑载体载体即周围的凝胶一同移到培养容器的泡孔培养嵌件的膜上，器官培养18-48小时。培养后，连周围的凝胶一齐移植到8周龄C57BL/6的肾皮膜下，进行不同部位的毛的生成，分析了毛的生成。
另一方面，比较例7，除采用丝胞上皮系细胞及丝胞间充质系细胞以外，与比较例4同样地在生物体外混合2种细胞，制作1个细胞凝集体，与实施例8同样地移植到肾皮膜下。
4)组织学的分析
在移植到肾皮膜下的情况下，在移植后第十四天，连周围的肾组织一齐摘取再构成丝胞。在器官培养的情况下，在培养同样的天数后，回收细胞凝集块。在用4％多聚甲醛-磷酸缓冲液6小时固定了组织、或细胞凝集块后，用通常的方法石蜡包埋，制作10μm的切片。为了进行组织学的分析，用通常的方法进行了苏木精-曙红染色。
5)结果
图18示出将实施例8的丝胞移植到同系小鼠的肾脏皮膜下的结果。如图18所示，如果移植再构成丝胞，由于不会损害构成初期丝胞的上皮细胞和间充质细胞的细胞间相互作用，因此在丝胞的纵断面(切片A)，认出来源自上皮细胞的毛包或内毛根鞘、外毛根鞘、以及来源自间充质细胞的毛乳头的细胞。另外，在切片A，尽管毛在组织染色时溶解，但还认出了没有完全溶解的毛。在横断面(切片B)，认出了内毛根鞘或外毛根鞘等细胞以上皮细胞围住毛孔的方式配置。由于毛在组织染色时溶解，因而认出了毛的溶解残存物。
此外，如图19所示，在将再构成丝胞移植在肾脏皮膜下14天后摘取的移植片上，认出了从丝胞生出的毛。
另一方面，在是预先混合上皮以及间充质细胞，在支撑载体载体中再构成的比较例7的情况下，如图20所示，未发现丝胞组织。
因此，根据实施例8，能够与采用实施例1～7的牙胚制作牙齿时同样地，从丝胞组织制作毛。
如此，根据本发明，不局限于牙齿或毛，通过以有效地发挥上皮系细胞和间充质系细胞的细胞间相互作用的方式，单个调制上皮组织·细胞及间充质组织·细胞，并将它们区分化，使其高密度接触地培养，能够有效地诱导细胞的分化，制作具备组织特有的细胞配置和方向性的组织。
因此，根据本发明，可不损害细胞间相互作用地从多种单一细胞再构筑组织，因而能够人为地制作通过细胞相互作用构筑的组织。
1
SEQUENCE LISTING
<110>Tokyo University of Science
<120>Method for prepar ing tooth and tissue
<130>C0-F03193-00
<150>JP2005-157885
<151>2005-05-30
<150>JP2006-055569
<151>2006-03-01
<160>2
<170>Patent In version 3.3
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>1
ggctgaagat ggttcctctc                                         20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>antisense
<400>2
gtacattgaa ggaataacca                                         20

Claims (12)

1.一种牙齿的制造方法，包括：
在支撑载体的内部，将实质上只由间充质系细胞及上皮系细胞中的任何一方构成的第一细胞集合体、和实质上只由任何另一方构成的第二细胞集合体接触配置的工序，其中，间充质系细胞及上皮系细胞中至少任何一方是源自牙胚；
在所述支撑载体的内部，培养所述第一及第二细胞集合体的工序，
其中，所述支撑载体具有在将细胞配置在内部时能够大致维持配置位置的程度的硬度、以及能够在载体内部发育第一及第二细胞集合体的程度的厚度，所述支撑载体能够维持细胞的接触状态，
所述接触是指在各细胞集合体及在细胞集合体间确实使细胞相互作用的接触，
所述第一细胞集合体和第二细胞集合体中的各自细胞数为101～108个。
2.如权利要求1所述的牙齿的制造方法，其中，所述间充质系细胞及上皮系细胞全部都源自牙胚。
3.如权利要求1所述的牙齿的制造方法，其中，在所述接触配置之前还包括调制第一细胞集合体的第一调制工序、和调整第二细胞集合体的第二调制工序。
4.如权利要求1所述的牙齿的制造方法，其中，包括在其它动物细胞存在的情况下进行的在所述支撑载体内部的发育工序。
5.如权利要求1所述的牙齿的制造方法，其中，所述第一细胞集合体及所述第二细胞集合体都是单一细胞集合物。
6.如权利要求1所述的牙齿的制造方法，其中，将所述培养继续到形成牙周组织。
7.一种牙周组织的制造方法，包含：
在支撑载体的内部，将实质上只由间充质系细胞及上皮系细胞中的任何一方构成的第一细胞集合体、和实质上只由任何另一方构成的第二细胞集合体接触配置的工序，其中，间充质系细胞及上皮系细胞中至少任何一方是源自牙胚；
在所述支撑载体的内部，培养所述第一及第二细胞集合体，直到得到牙齿和与其连续的牙周组织的工序；
离析通过所述培养得到的牙周组织的工序，
其中，所述支撑载体具有在将细胞配置在内部时能够大致维持配置位置的程度的硬度、以及能够在载体内部发育第一及第二细胞集合体的程度的厚度，所述支撑载体能够维持细胞的接触状态，
所述接触是指在各细胞集合体及在细胞集合体间确实使细胞相互作用的接触，
所述第一细胞集合体和第二细胞集合体中的各自细胞数为101～108个。
8.一种牙齿的集合体，其中，该牙齿是通过在支撑载体的内部，将实质上只由间充质系细胞及上皮系细胞中的任何一方构成的第一细胞集合体、和实质上只由任何另一方构成的第二细胞集合体接触配置，并且在所述支撑载体的内部培养所述第一及第二细胞集合体而得到的，其中，间充质系细胞及上皮系细胞中的至少任何一方是源自牙胚，
其中，所述支撑载体具有在将细胞配置在内部时能够大致维持配置位置的程度的硬度、以及能够在载体内部发育第一及第二细胞集合体的程度的厚度，所述支撑载体能够维持细胞的接触状态，
所述接触是指在各细胞集合体及在细胞集合体间确实使细胞相互作用的接触，
所述第一细胞集合体和第二细胞集合体中的各自细胞数为101～108个。
9.如权利要求8所述的牙齿的集合体，其中，所述间充质系细胞及上皮系细胞全部都是源自牙胚。
10.一种组织的制造方法，是通过间充质系细胞和上皮系细胞的相互作用而构筑的组织的制造方法，包括：
在支撑载体的内部，将实质上只由间充质系细胞及上皮系细胞中的任何一方构成的第一细胞集合体、和实质上只由任何另一方构成的第二细胞集合体接触配置的工序；
在所述支撑载体的内部培养所述第一及第二细胞集合体的工序，
其中，所述支撑载体具有在将细胞配置在内部时能够大致维持配置位置的程度的硬度、以及能够在载体内部发育第一及第二细胞集合体的程度的厚度，所述支撑载体能够维持细胞的接触状态，
所述接触是指在各细胞集合体及在细胞集合体间确实使细胞相互作用的接触，
所述第一细胞集合体和第二细胞集合体中的各自细胞数为101～108个，
其中，所述组织是从由牙齿、毛发、肾脏、肺以及肝脏构成的组中选择。
11.如权利要求10所述的组织的制造方法，其中，在所述接触配置之前还包括调制第一细胞集合体的第一调制工序、和调整第二细胞集合体的第二调制工序。
12.如权利要求10所述的组织的制造方法，其中，所述间充质系细胞及上皮系细胞中的至少一方是源自成为目标的组织的细胞。
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