CN112618795A

CN112618795A - 一种仿生矿化胶原凝胶及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN112618795A
Application number: CN202110046774.8A
Authority: CN
Inventors: 茵梓; 陈晓; 雷庭筠; 张涛; 赵艳艳
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2021-01-14
Filing date: 2021-01-14
Publication date: 2021-04-09
Anticipated expiration: 2041-01-14
Also published as: CN112618795B

Abstract

本发明提供了一种仿生矿化胶原凝胶及其制备方法和应用，属于仿生材料技术领域。本发明通过采用以聚天冬氨酸为稳定剂，含有钙离子和磷酸根离子的矿化液，会形成不定型磷酸钙纳米簇，将胶原水凝胶与其混合后，不定型磷酸钙纳米簇可以进入胶原水凝胶中的胶原原纤维的内部，与游离的羧基结合，进而成核、相变成为羟基磷灰石，并沿胶原原纤维长轴方向有序生长，实现胶原凝胶中胶原纤维内矿化。

Description

一种仿生矿化胶原凝胶及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及仿生材料技术领域，尤其涉及一种仿生矿化胶原凝胶及其制备方法和应用。

背景技术

骨骼作为运动系统中的硬组织，可为肌肉收缩提供坚强杠杆，从而实现运动功能。当患者伴有严重创伤、机体紊乱、骨质疏松症、原发性或转移性骨肿瘤、血供不足或感染等情况时，骨组织再生将发生异常。同时，全世界每年新增骨愈合异常患者约890万，且该数字随着人口老龄化的进展不断上升。目前临床上，提高骨再生能力的金标准为自体骨移植和同种异体骨移植，但可用资源有限，且存在供体部位疼痛、感觉异常等并发症。

近年来，组织工程的发展为骨再生修复带来新的希望，然而其修复效果参差不齐。骨的基本单元是纳米尺寸上结构有序的磷酸钙矿化的胶原蛋白，但是目前的磷酸钙材料大多是数十乃至数百纳米的大尺寸材料，无法实现纳米级骨组织仿生。

仿生矿化是利用生物矿化原理在体外制备类似生物矿物的有机-无机复合结构材料。利用仿生矿化重现天然骨中胶原纤维内羟基磷灰石的有序排列和多层次结构，实现精确仿生对于骨组织再生修复至关重要。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种仿生矿化胶原凝胶及其制备方法和应用。本发明制得的矿化胶原凝胶成分高度仿生，有利于骨组织再生修复。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种仿生矿化胶原凝胶的制备方法，包括以下步骤；

将I型胶原酸溶液形成胶原凝胶；

将所述胶原凝胶进行交联得到交联胶原凝胶；

将钙盐溶液、聚天冬氨酸溶液和磷酸盐溶液混合制得矿化液；

将所述交联胶原凝胶浸入矿化液进行矿化，得到所述仿生矿化胶原凝胶。

优选地，所述I型胶原酸溶液的浓度≥0.1mg/mL。

优选地，所述形成胶原凝胶环境为碱性环境。

优选地，所述碱性环境为氨气环境。

优选地，所述形成胶原凝胶的时间≥1h。

6、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述矿化液中钙离子的浓度为0.2～20mmol/L，磷酸根离子的浓度为0.3～30mmol/L，聚天冬氨酸的浓度为100～400μg/mL。

优选地，所述矿化液与交联胶原凝胶的体积比≥0.1。

优选地，所述矿化的时间≥2h。

本发明还提供了上述技术方案所述制备方法制得的仿生矿化胶原凝胶。

本发明还提供了上述技术方案所述的仿生矿化胶原凝胶在骨组织修复领域中的应用。

本发明提供了一种仿生矿化胶原凝胶的制备方法，包括以下步骤：将I型胶原酸溶液形成胶原凝胶；将所述胶原凝胶进行交联得到交联胶原凝胶；将钙盐溶液、聚天冬氨酸溶液和磷酸盐溶液混合制得矿化液；将所述交联胶原凝胶浸入矿化液进行矿化，得到所述仿生矿化胶原凝胶。本发明通过采用以聚天冬氨酸为稳定剂，含有钙离子和磷酸根离子的矿化液，会形成不定型磷酸钙纳米簇，将胶原水凝胶与其混合后，不定型磷酸钙纳米簇可以进入胶原水凝胶中的胶原原纤维的内部，与游离的羧基结合，进而成核、相变成为羟基磷灰石，并沿胶原原纤维长轴方向有序生长，最终形成多层、有序的矿化胶原原纤维，实现胶原凝胶中胶原纤维内矿化。

进一步地，本发明通过限定了稳定剂聚天冬氨酸的浓度，避免了当稳定剂浓度过低时，发生胶原纤维外矿化，当稳定剂浓度过高时，难以发生胶原纤维矿化的问题，本发明通过限定稳定剂的浓度，可实现高效的仿生矿化。实施例的数据表明，本发明制得的仿生矿化胶原凝胶具有I型、II型酰胺腱(I型胶原蛋白的特征)，胶原原纤维具有67nm D-banding周期结构，矿化胶原原纤维中无机物具有磷酸根键及磷酸根结晶相特征，且羟基磷灰石晶体沿胶原原纤维长轴分布，实现了胶原纤维内矿化。

附图说明

图1为未矿化的胶原凝胶(0D)的透射电镜图；

图2为实施例1制得的仿生矿化胶原凝胶的透射电镜图；

图3为未矿化的胶原凝胶(0D)以及实施例1制得的仿生矿化胶原凝胶(6D)的扫描电镜图；

图4为未矿化的胶原凝胶以及实施例1制得的仿生矿化胶原凝胶的能谱图，其中(a)为未矿化的胶原凝胶的能谱分析图，(b)为本实施例制得的仿生矿化胶原凝胶的能谱分析图；

图5为实施例1制得的仿生矿化胶原凝胶的透射电镜图及选区电子衍射图，其中(a)为实施例1制得的仿生矿化胶原凝胶的透射电镜图，(b)为选区电子衍射图；

图6为未矿化的水凝胶(0D)、实施例1制得的仿生矿化胶原凝胶(6D)和骨组织(Native Bone)的红外光谱图；

图7为未矿化的水凝胶(0D)、实施例1制得的仿生矿化胶原凝胶(6D)和骨组织(Native Bone)的热重曲线；

图8为未矿化的水凝胶(0D)、实施例1制得的仿生矿化胶原凝胶(6D)和骨组织(Native Bone)的热重统计结果。

具体实施方式

本发明提供了一种仿生矿化胶原凝胶的制备方法，包括以下步骤：

(1)将I型胶原酸溶液形成胶原凝胶；

(2)将所述胶原凝胶进行交联得到交联胶原凝胶；

(3)将钙盐溶液、聚天冬氨酸溶液和磷酸盐溶液混合制得矿化液；

(4)将所述交联胶原凝胶浸入矿化液进行矿化，得到所述仿生矿化胶原凝胶。

本发明将I型胶原酸溶液形成胶原凝胶。

本发明对所述I型胶原酸溶液的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的方式即可。在本发明的具体实施方式中，所述I型胶原酸溶液优选将I型胶原酸溶液溶于乙酸溶液中制得，所述I型胶原蛋白为由包括以下步骤的方法制得：取样：取猪蹄筋50g，双抗水浸泡15～20分钟，剪碎至肉糜状，溶于500mL Tris缓冲液，4℃过夜；纱布过滤，蒸馏水洗5遍，定容至1.5L，加入45mL乙酸，5g胃蛋白酶，4℃搅拌3天；离心及过滤：4℃，4000rpm，离心25分钟，回收胶原，0.5M乙酸稀释后，再次纱布过滤；盐析：0.9M氯化钠溶液盐析，4℃搅拌过夜；离心：4℃，4000rpm，离心25分钟，0.5M乙酸溶解，4℃过夜；透析：将胶原装至透析袋中，置于2L去离子水中，4℃搅拌3天，期间每8小时换水一次；冷冻干燥：将透析袋中的胶原分装，-80℃过夜，转移至冷冻干燥机，干燥3天，得到所述I型胶原蛋白。

在本发明中，所述乙酸溶液的pH值优选为3。

在本发明中，所述I型胶原酸溶液的浓度优选为≥0.1mg/mL，更优选为≥3mg/mL，最优选为8～10mg/mL。

在本发明中，所述形成胶原凝胶过程优选在碱性环境中进行，更优选在氨气环境中进行。

在本发明中，所述形成胶原凝胶的时间优选≥1h，更优选为2～4h。

在本发明中，优选将所得产物用去离子水清洗使pH值为中性，得到所述胶原凝胶。

得到胶原凝胶后，本发明将所述胶原凝胶进行交联，得到交联胶原凝胶。

在本发明中，所述交联后得到的交联胶原凝胶为稳定胶原结构。

在本发明中，所述交联剂优选使用戊二醛固定液，所述戊二醛固定液中戊二醛的质量浓度优选≤0.3％，更优选为0.2～0.3％，所述戊二醛溶液与胶原凝胶的体积比优选≥100。在本发明中，所述戊二醛的用量过高会阻止矿化，过低会导致凝胶力学强度下降。

在本发明中，所述交联优选在37℃下进行2小时。

所述交联完成后，本发明优选将所得交联产物取出后用去离子水清洗，得到所述交联胶原凝胶。

本发明将钙盐溶液、聚天冬氨酸溶液和磷酸盐溶液混合制得矿化液，更优选由氯化钙溶液、聚天冬氨酸溶液以及磷酸氢二钠和氯化钠的混合溶液制得矿化液。

在本发明中，所述矿化液中钙离子的浓度优选为0.2～20mmol/L，进一步优选为0.5～4mmol/L，更优选为1～2mmol/L；所述磷酸根离子的浓度优选为0.3～30mmol/L，进一步优选为4.5～20mmol/L，更优选为9～10mmol/L；所述聚天冬氨酸的浓度优选为100～400μg/mL，进一步优选为200～300μg/mL，更优选为240μg/mL。

在本发明中，所述矿化液中钙离子和磷酸根离子在上述范围时能够进一步保证交联胶原凝胶在矿化时间内的完全矿化。

在本发明中，所述矿化液的配制方法优选为将钙盐溶液与聚天冬氨酸溶液混合后，再与磷酸盐溶液混合，更优选为将氯化钙溶液与聚天冬氨酸溶液混合后，再与磷酸氢二钠和氯化钠的混合溶液混合。在本发明中，所述矿化液的配制方法采用上述方法能够使得聚天冬氨酸先稳定钙离子，再与磷酸氢二钠和氯化钠的混合溶液混合后能够让钙离子缓慢释放，形成不定型磷酸钙纳米簇。

得到交联胶原凝胶和矿化液后，本发明将所述交联胶原凝胶浸入矿化液中进行矿化，得到所述仿生矿化胶原凝胶。

在本发明中，矿化液与交联胶原凝胶的体积比优选≥0.1，进一步优选≥100，更优选为(100～200)：1。在本发明中，所述矿化液与所述交联胶原凝胶的体积比在上述范围内时能够保证矿化液的量足够，进而保证得到的产物中无机物含量能够达到仿生的成分要求。

在本发明中，所述矿化的时间优选≥2h，更优选为≥3天。

在本发明中，所述矿化时，优选至少每12h更换一次矿化液。

所述矿化完成后，本发明优选将所得矿化产物用去离子水清洗，得到所述仿生矿化胶原凝胶。

本发明还提供了上述技术方案所述制备方法制得的仿生矿化胶原凝胶。本发明制得的仿生矿化胶原凝胶具有I型、II型酰胺腱(I型胶原蛋白的特征)，胶原原纤维具有67nmD-banding周期结构，矿化胶原原纤维中无机物具有磷酸根键及磷酸根结晶相特征，且羟基磷灰石晶体沿胶原原纤维长轴分布，实现了胶原纤维内矿化。

为了进一步说明本发明，下面结合实例对本发明提供的仿生矿化胶原凝胶及其制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

I型胶原蛋白的提取：取样：取猪蹄筋50g，双抗水浸泡15分钟，剪碎至肉糜状，溶于500mL Tris缓冲液，4℃过夜。纱布过滤，蒸馏水洗5遍，定容至1.5L，加入45mL乙酸，5g胃蛋白酶，4℃搅拌3天。离心及过滤：4℃，4000rpm，离心25分钟，回收胶原，0.5M乙酸稀释后，再次纱布过滤。盐析：0.9M氯化钠溶液盐析，4℃搅拌过夜。离心：4℃，4000rpm，离心25分钟，0.5M乙酸溶解，4℃过夜。透析：将胶原分装至透析袋中，置于2L去离子水中，4℃搅拌3天，期间每8小时换水一次。冷冻干燥：将透析袋中的胶原分装，-80℃过夜，转移至冷冻干燥机，干燥3天，得到I型胶原蛋白。

胶原凝胶的制备：将I型胶原溶于乙酸溶液(pH值＝3)，配制为3mg/mL I型胶原溶液，吸取100μL加入圆柱体模具中，在室温密闭氨气环境中扩散4h形成凝胶，取出后用去离子水清洗3次，10min/次，使其pH值为7。

胶原凝胶的交联：取胶原凝胶浸于10mL 0.3％(质量分数)的戊二醛溶液，于37℃反应2小时，取出后用去离子水清洗3遍，10min/次，备用。

矿化液的配置：将5mL CaCl₂溶液(浓度为3.34mM)、240μL 10mg/mL的聚天冬氨酸溶液混匀后加入5mL Na₂HPO₄和NaCl混合溶液混合均匀，备用，混合溶液中Na₂HPO₄的浓度为19mM，NaCl的浓度为300mM。

胶原凝胶的矿化：将交联胶原凝胶浸于10mL矿化液中，转入37℃恒温箱，每12h换一次矿化液，持续矿化6天，矿化结束后，用去离子水清洗3遍，10min/次，得到仿生矿化胶原凝胶。

实验结果测定

1.胶原原纤维具有天然结构：

方法：将未矿化的胶原凝胶(0D)切碎，浸入0.1M NH₄HCO₃溶液(pH值＝7.8)中，使用匀浆机将水凝胶打碎，取匀浆2μL，滴至镍网，风干，使用乙酸双氧铀染色，通过Hitachi H-1010(120kV)透射电镜观察。结果如图1所示，可以看出，自组装形成的胶原原纤维具有67nm明暗交替的周期性横纹(D-banding)，胶原原纤维直径60.6±12.0nm(N＝50)，与天然胶原原纤维类似。

2.胶原原纤维内矿化：

方法：将矿化6天的胶原凝胶切碎(即本实施例制得的仿生矿化胶原凝胶)，浸入0.1MNH₄HCO₃溶液(pH值＝7.8)中，使用匀浆机将水凝胶打碎，取匀浆2μL，滴至镍网，风干，通过Hitachi H-1010(120kV)透射电镜观察。结果如图2所示，可以看出，矿化6天后，I型胶原蛋白纤维D-banding结构消失，胶原原纤维内形成羟基磷灰石晶体，形成有机-无机复合结构，矿化胶原原纤维直径增大至171.5±49.2nm(N＝50)。

3.胶原凝胶表面形态及矿物质元素

方法：未矿化的胶原凝胶以及本实施例制得的仿生矿化胶原凝胶使用2.5wt％戊二醛固定1小时，去离子水洗三次，10min/次，使用体积分数分别为30％、50％、70％、80％、90％、95％、100％的乙醇溶液进行梯度脱水，临界点干燥后，使用ZEISS GEMINI 300进行扫描电子显微镜成像。结果如图3所示，图3为未矿化的胶原凝胶(0D)以及本实施例制得的仿生矿化胶原凝胶(6D)的扫描电镜图，并通过检测器(INCA，Oxford Instruments)进行能谱分析，结果如图4所示，图4中(a)为未矿化的胶原凝胶的能谱分析图，(b)为本实施例制得的仿生矿化胶原凝胶的能谱分析图，由图3～4可知，未矿化胶原原纤维表面光滑，矿化6天胶原原纤维表面粗糙，且含有Ca、P元素。

4.矿物质晶型：

方法：将本实施例制得的仿生矿化胶原凝胶切碎，浸入0.1M NH₄HCO₃溶液(pH值＝7.8)中，使用匀浆机将水凝胶打碎，取匀浆2μL，滴至镍网，风干，最后使用JEM-2100(200kV)进行透射电子显微镜及选区电子衍射观察。结果如图5所示，图5中(a)为透射电镜图，(b)为选区电子衍射图，可以看出，矿化胶原原纤维内可见延长轴排列的晶体(图5中(a))，且显示羟基磷灰石002、211、004特征性衍射环(图5中(b))。

5.矿物质化学键：

方法：将未矿化的水凝胶(0D)、本实施例制得的仿生矿化胶原凝胶(6D)和骨组织(Native Bone)于37℃烘干3天后，通过傅里叶红外光谱AVA TAR370分析。结果如图6所示，可以看出，胶原凝胶均具有胶原特征峰I型(1720～1590cm^-1)、II型(1590～1492cm^-1)酰胺键，矿化6天胶原凝胶出现磷酸根峰(1030cm^-1)、磷酸根结晶相峰(565cm^-1、605cm^-1)，接近天然骨的矿化特征。

6.胶原凝胶矿化程度：

方法：将未矿化的水凝胶(0D)、本实施例制得的仿生矿化胶原凝胶(6D)和骨组织(Native Bone)于37℃烘干3天后，进行热重分析。结果如图7～8所示，图7为未矿化的水凝胶(0D)、本实施例制得的仿生矿化胶原凝胶(6D)和骨组织(Native Bone)的热重曲线，图8为热重分析结果(**,p＜0.01)，可知，本实施例制得的仿生矿化胶原凝胶(6D)的无机物质量百分比约为61％，接近天然骨组织的无机物质量百分比67％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并非对本发明作任何形式上的限制。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种仿生矿化胶原凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤；

将I型胶原酸溶液形成胶原凝胶；

将所述胶原凝胶进行交联得到交联胶原凝胶；

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述I型胶原酸溶液的浓度≥0.1mg/mL。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述形成胶原凝胶环境为碱性环境。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述碱性环境为氨气环境。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述形成胶原凝胶的时间≥1h。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述矿化液中钙离子的浓度为0.2～20mmol/L，磷酸根离子的浓度为0.3～30mmol/L，聚天冬氨酸的浓度为100～400μg/mL。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述矿化液与交联胶原凝胶的体积比≥0.1。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述矿化的时间≥2h。

9.权利要求1～8任一项所述制备方法制得的仿生矿化胶原凝胶。

10.权利要求9所述的仿生矿化胶原凝胶在骨组织修复领域中的应用。