CN115040692A - 一种快速生物矿化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物矿化技术领域，提供了一种快速生物矿化方法。本发明先使用碳二亚胺和N‑羟基琥珀酰亚胺的混合溶液对生物组织进行第一浸泡，再用钙溶液和磷溶液对生物组织进行第二浸泡和第三浸泡，重复第二浸泡和第三浸泡的过程，实现生物组织的快速矿化。本发明的方法可在0.5～4小时内实现生物矿化，与现有生物矿化技术相比，生物矿化效率提升了100～200倍，且终产物能够达到骨矿化程度；采用本发明的方法对生物组织进行快速矿化，能够扩充骨移植替代物来源，革新骨再生方法，改变临床上骨缺损移植物选择的格局，提高患者治疗效果及生存时间，具有广阔的应用前景。

Description

一种快速生物矿化方法
技术领域
本发明涉及生物矿化技术领域，尤其涉及一种快速生物矿化方法。
背景技术
自体骨移植被认为是骨替代的“黄金标准”，但可用性有限，存在潜在的相容性问题。目前有许多骨替代材料，如骨水泥、多孔支架、合成复合材料、水凝胶材料等，但是这些骨替代材料不能通过再矿化骨胶原纤维来再生骨。
磷酸钙纳米材料是一类可吸收的骨诱导生物医学材料，目前已被广泛开发并应用于骨缺损修复。在大动物模型中，磷酸钙展现出促进骨整合的能力；但在临床研究中，与对照组相比，实验组仅发现股骨隧道横截面积缩小，而多项功能评分和专科检查测试在术后2年内并未得到显著改善。其原因是目前采用的多为生物涂层等将肌腱与磷酸钙材料简单混合的方法，无法实现胶原纤维仿生矿化。
骨和牙本质主要由羟基磷灰石(HAP)纳米晶体矿化的I型胶原纤维组成，基于自组装胶原纤维的体外仿生模型已广泛应用于I型胶原矿化机制的研究。软组织主要由胶原构成，骨组织的基质则是由内矿化的I型胶原组成。胶原纤维由三股螺旋链聚合组成，留下1.8～4nm的曲折通道，而这是绝大多数磷酸钙纳米材料都难以企及的尺寸。
磷酸钙聚合物诱导的液体前驱体是一种通过电荷聚合物实现稳定的液体状矿化物前驱体，其直径约为1nm，可经过胶原的狭小曲折通道渗透入胶原纤维内部，实现真正意义上的胶原内仿生矿化。现有研究证实磷酸钙聚合物诱导的液体前驱体可实现重组胶原的胶原内仿生矿化。但是当前的磷酸钙聚合物诱导的液体前驱体在矿化效率上仍有所不足，需要数天才能诱导胶原矿化。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种快速生物矿化方法。本发明提供的方法极大地加快了生物组织矿化的速率，矿化时间从原本的数天缩短至数小时，效率提升几十倍。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种快速生物矿化方法，包括以下步骤：
(1)将生物组织在碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液中进行第一浸泡；所述第一浸泡的时间为0.5～4小时；
(2)将所述第二浸泡后的生物组织在钙溶液中进行第二浸泡；所述第二浸泡的时间为1～5分钟；
(3)将所述第二浸泡后的生物组织在磷溶液中进行第三浸泡；所述第三浸泡的时间为1～5分钟；
(4)重复步骤(2)～(3)，以重复步骤(2)和步骤(3)各一次记为重复一次，所述重复的次数为20～80次，得到矿化后的生物组织。
优选的，所述碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液中，碳二亚胺的浓度为0.1～2mol/L，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为0.005～0.2mol/L；所述第一浸泡的温度为室温。
优选的，所述钙溶液的成分包括含钙化合物、聚电解质或蛋白和水；所述钙溶液中钙离子的浓度为10～1000mmol/L，聚电解质或蛋白的浓度为0.1～1mmol/L。
优选的，所述聚电解质或蛋白包括聚丙烯酸、聚天冬氨酸、聚甲基丙烯酸、聚苯乙烯磺酸、聚乙烯磺酸、聚乙烯磷酸、三偏磷酸钠、骨钙素、骨涎蛋白、骨桥蛋白、胎球蛋白和牙本质磷蛋白中的一种或几种。
优选的，所述含钙化合物包括碳酸钙、氧化钙、氢氧化钙、过氧化钙、氢化钙、氯化钙、氟化钙、氰氨化钙、碳化钙、次氯酸钙和硫酸钙中的一种或几种。
优选的，所述第二浸泡的温度为30～50℃。
优选的，所述磷溶液的成分包括含磷化合物、聚电解质或蛋白和水。
优选的，所述含磷化合物包括磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐和过磷酸盐中的一种或几种。
优选的，所述磷溶液中磷离子的浓度为50～500mmol/L，聚电解质或蛋白的浓度为0.1～1mmol/L。
优选的，所述第三浸泡的温度为30～50℃。
本发明提供了一种快速生物矿化方法，包括以下步骤：(1)将生物组织在碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液中进行第一浸泡；所述第一浸泡的时间为0.5～4小时；(2)将所述第二浸泡后的生物组织在钙溶液中进行第二浸泡；所述第二浸泡的时间为1～5分钟；(3)将所述第二浸泡后的生物组织在磷溶液中进行第三浸泡；所述第三浸泡的时间为1～5分钟；(4)重复步骤(2)～(3)，以重复步骤(2)和步骤(3)各一次记为重复一次，所述重复的次数为20～80次，得到矿化后的生物组织。本发明先使用碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液对生物组织进行第一浸泡，在生物组织中引入碳二亚胺和-NHS基团，在碳二亚胺存在时，-NHS与羧基或磺基反应，形成稳定的羧基-NHS酯或磺基-NHS酯，并继续与伯胺反应形成酰胺键，从而稳固生物组织的化学结构；本发明采用钙溶液和磷溶液对生物组织进行第二浸泡和第三浸泡，并且重复第二浸泡和第三浸泡的过程，通过钙和磷在反应不同阶段的渗透压差和静电吸附，使得在胶原内部会同时出现钙和磷，从而在胶原内部形成结晶，并以此为基础定向生长晶体，而不是在胶原外部形成无序的晶体结构，并且这种方式可以通过高渗透压差促进离子的运动和迁移，从而加快反应速度，实现生物组织的快速矿化。
本发明提供的方法可快速(几小时内)实现生物矿化，将生物矿化效率提升了100～200倍，并且终产物能够达到骨矿化程度，实现软组织到硬组织的快速转变；采用本发明的方法对生物组织进行快速矿化，能够扩充骨移植替代物来源，革新骨再生方法，改变临床上骨缺损移植物选择的格局，最终提高患者治疗效果及生存时间，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为矿化后的肌腱组织的透射电镜图；
图2为矿化后的皮肤组织的透射电镜图；
图3为矿化后的脂肪组织的透射电镜图；
图4为矿化后的重组胶原的透射电镜图；
图5为骨组织的透射电镜图；
图6为矿化后的肌腱组织的矿物含量测试结果；
图7为矿化后的皮肤组织的矿物含量测试结果；
图8为矿化后的脂肪组织的矿物含量测试结果；
图9为矿化后的重组胶原的矿物含量测试结果；
图10为骨组织的矿物含量测试结果。
具体实施方式
本发明提供了一种快速生物矿化方法，包括以下步骤：
(1)将生物组织在碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液中进行第一浸泡；所述第一浸泡的时间为0.5～4小时；
(2)将所述第二浸泡后的生物组织在钙溶液中进行第二浸泡；所述第二浸泡的时间为1～5分钟；
(3)将所述第二浸泡后的生物组织在磷溶液中进行第三浸泡；所述第三浸泡的时间为1～5分钟；
(4)重复步骤(2)～(3)，以重复步骤(2)和步骤(3)各一次记为重复一次，所述重复的次数为20～80次，得到矿化后的生物组织。
本发明将生物组织在碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液中进行第一浸泡；所述第一浸泡的时间为0.5～4小时，优选为1～2小时。在本发明中，所述生物组织优选为本领域常见的软组织或组织胶原，所述软组织具体优选为肌腱组织、皮肤组织或脂肪组织，所述组织胶原具体为重组胶原纤维、软组织胶原纤维或脱钙组织胶原纤维；本发明优选将所述生物组织洗涤后再进行第一浸泡，所述洗涤用试剂优选为水。在本发明中，所述碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液中，碳二亚胺的浓度优选为0.1～2mol/L，更优选为0.5～1.5mol/L，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度优选为0.005～0.2mol/L，更优选为0.01～0.1mol/L，所述碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液的溶剂为水；所述第一浸泡的温度优选为室温；本发明对所述碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液的用量没有特殊要求，能够将生物组织完全浸泡即可。本发明优选在搅拌条件下进行第一浸泡，以使生物组织和混合溶液充分接触。
第一浸泡完成后，本发明优选将所述第一浸泡后的生物组织取出后进行洗涤，所述洗涤用试剂优选为水；本发明对洗涤的具体操作方法没有特殊要求，以充分洗涤为准。
洗涤后，本发明将生物组织在钙溶液中进行第二浸泡；所述第二浸泡的时间为1～5分钟，优选为2～4分钟。在本发明中，所述钙溶液的成分优选包括含钙化合物、聚电解质或蛋白和水；所述钙溶液中钙离子的浓度优选为10～1000mmol/L，更优选为50～600mmol/L，进一步优选为100～500mmol/L，聚电解质或蛋白的浓度优选为0.1～1mmol/L，更优选为0.2～0.5mmol/L。在本发明中，所述含钙化合物优选包括碳酸钙、氧化钙、氢氧化钙、过氧化钙、氢化钙、氯化钙、氟化钙、氰氨化钙、碳化钙、次氯酸钙和硫酸钙中的一种或几种；所述聚电解质或蛋白优选包括聚丙烯酸、聚天冬氨酸、聚甲基丙烯酸、聚苯乙烯磺酸、聚乙烯磺酸、聚乙烯磷酸、三偏磷酸钠、骨钙素、骨涎蛋白、骨桥蛋白、胎球蛋白和牙本质磷蛋白中的一种或几种；本发明在钙溶液中加入聚电解质或蛋白，能够稳定离子并促进离子进入胶原内部，提升矿化效率。本发明对所述钙溶液的配制方法没有特殊要求，将含钙化合物和聚电解质或蛋白溶解于水中即可。本发明对所述钙溶液的用量没有特殊要求，能够将生物组织完全浸泡即可。
在本发明中，所述第二浸泡的温度优选为30～50℃，更优选为35～45℃；在本发明的具体实施例中，优选在水浴条件下进行第二浸泡。在第二浸泡过程中，钙离子进入胶原内部结合位点。
第二浸泡完成后，本发明优选将第二浸泡后的生物组织取出后进行洗涤；所述洗涤用试剂优选为水；本发明对所述洗涤的具体操作方法没有特殊要求，以充分洗涤为准。
洗涤后，本发明将生物组织在磷溶液中进行第三浸泡；所述第三浸泡的时间为1～5分钟，优选为2～4分钟。在本发明中，所述磷溶液的成分优选包括含磷化合物、聚电解质或蛋白和水；所述磷溶液中磷离子的浓度优选为50～500mmol/L，更优选为80～320mmol/L，进一步优选为85～280mmol/L，聚电解质或蛋白的浓度优选为0.1～1mmol/L，更优选为0.2～0.5mmol/L。在本发明中，所述含磷化合物优选包括磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐和过磷酸盐中的一种或几种；所述磷酸盐优选为磷酸钙，所述磷酸氢盐优选为磷酸氢钾或其水合物、磷酸氢二钾或其水合物以及磷酸氢二钠或其水合物中的一种或几种，所述磷酸二氢盐优选为磷酸二氢钠或其水合物；所述偏磷酸盐优选为六偏磷酸钠；所述过磷酸盐优选为重过磷酸钙；所述聚电解质或蛋白的具体种类和上述方案一致，在此不再赘述。本发明对所述磷溶液的用量没有特殊要求，能够将生物组织完全浸泡即可。
在本发明中，所述第三浸泡的温度优选为30～50℃，更优选为35～45℃；在本发明的具体实施例中，优选在水浴条件下进行第三浸泡。在第三浸泡过程中，磷进入胶原内部与钙形成初始结晶核。
第三浸泡完成后，本发明优选将生物组织取出后进行洗涤；所述洗涤用试剂优选为水；本发明对所述洗涤的具体操作方法没有特殊要求，以充分洗涤为准。
洗涤后，本发明将所得生物组织重复进行第二浸泡和第三浸泡，以重复第二浸泡和第三浸泡各一次记为重复一次，所述重复的次数为20～80次，优选为30～60次，更优选为40～50次；上述重复过程中，第二浸泡和第三浸泡的具体操作方法和上述方案一致，在此不再赘述，每次浸泡后都将生物组织取出进行洗涤，再进行下一次浸泡。在重复第二浸泡和第三浸泡的过程中，钙和磷不断进入胶原内部，并以初始结晶核为基础定向生长晶体，从而在胶原内部原位生成磷酸钙结晶，实现组织或胶原的生物矿化。
重复完毕后，即可得到生物组织矿化产物，矿化后的生物组织能够达到骨矿化程度，实现软组织到硬组织的快速转变。
采用本发明的方法能够实现生物组织的快速矿化，在本发明的具体实施例中，在进行骨移植/骨再生的临床治疗时，可以取自体组织，采用本发明的方法进行生物矿化，之后再回植，从而实现自体骨移植的替代，改变现有骨移植/骨再生临床治疗方法。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
(1)将肌腱组织洗涤后，浸泡在碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液中4小时，室温搅拌使其充分接触，以稳固肌腱组织结构；浸泡完成后，取出进行充分水洗；所述碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液的溶剂为水，碳二亚胺的浓度为2mol/L，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为0.2mol/L。
(2)将步骤(1)中处理好的肌腱组织浸没于钙溶液中，放置于37℃水浴孵育5分钟，取出水洗1分钟，再浸没于磷溶液中，放置于37℃水浴孵育5分钟，取出水洗1分钟，重复以上钙溶液浸泡和磷溶液浸泡的步骤80次，得到生物矿化后的肌腱组织；所述钙溶液的成分为碳酸钙、胎球蛋白和水，其中，钙离子的浓度为822mmol/L，胎球蛋白的浓度为0.28mmol/L；所述磷溶液的成分为磷酸氢钠、胎球蛋白和水，磷溶液中磷离子的浓度为500mmol/L，胎球蛋白的浓度为0.28mmol/L。
实施例2
(1)将皮肤组织洗涤后，浸泡在碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液中1小时，室温搅拌使其充分接触，以稳固皮肤组织结构；浸泡完成后，取出进行充分水洗；所述碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液的溶剂为水，碳二亚胺的浓度为1.2mol/L，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为0.1mol/L。
(2)将步骤(1)中处理好的皮肤组织浸没于钙溶液中，放置于37℃水浴孵育4分钟，取出水洗1分钟，再浸没于磷溶液中，放置于37℃水浴孵育4分钟，取出水洗1分钟，重复以上钙溶液浸泡和磷溶液浸泡的步骤40次，得到生物矿化后的皮肤组织；所述钙溶液的成分为氯化钙、骨桥蛋白和水，其中，钙离子的浓度为381mmol/L，骨桥蛋白的浓度为0.5mmol/L；所述磷溶液的成分为磷酸钠、骨桥蛋白和水，磷溶液中磷离子的浓度为262mmol/L，骨桥蛋白的浓度为0.5mmol/L。
实施例3
(1)将脂肪组织洗涤后，浸泡在碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液中1小时，室温搅拌使其充分接触，以稳固脂肪组织结构；浸泡完成后，取出进行充分水洗；所述碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液的溶剂为水，碳二亚胺的浓度为0.1mol/L，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为0.005mol/L。
(2)将步骤(1)中处理好的脂肪组织浸没于钙溶液中，放置于37℃水浴孵育1分钟，取出水洗1分钟，再浸没于磷溶液中，放置于37℃水浴孵育1分钟，取出水洗1分钟，重复以上钙溶液浸泡和磷溶液浸泡的步骤20次，得到生物矿化后的脂肪组织；所述钙溶液的成分为碳酸钙、聚丙烯酸和水，其中，钙离子的浓度为320mmol/L，聚丙烯酸的浓度为0.2mmol/L；所述磷溶液的成分为磷酸二氢钠、聚丙烯酸和水，磷溶液中磷离子的浓度为188mmol/L，聚丙烯酸的浓度为0.2mmol/L。
实施例4
(1)将胶原纤维重组装后，浸泡在碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液中1小时，室温搅拌使其充分接触，以稳固胶原纤维结构；浸泡完成后，取出进行充分水洗；所述碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液的溶剂为水，碳二亚胺的浓度为0.5mol/L，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为0.01mol/L。
(2)将步骤(1)中水洗后的重组胶原浸没于钙溶液中，放置于37℃水浴孵育2分钟，取出水洗1分钟，再浸没于磷溶液中，放置于37℃水浴孵育2分钟，取出水洗1分钟，重复以上钙溶液浸泡和磷溶液浸泡的步骤20次，得到生物矿化后的脂肪组织；所述钙溶液的成分为碳酸钙、聚天冬氨酸和水，其中，钙离子的浓度为135mmol/L，聚天冬氨酸的浓度为0.1mmol/L；所述磷溶液的成分为磷酸二氢钠、聚天冬氨酸和水，磷溶液中磷离子的浓度为85mmol/L，聚天冬氨酸的浓度为0.1mmol/L。
对实施例1～实施例4生物矿化后的生物组织进行透射电镜测试，并与骨组织进行对比，结果如图1～4所示，图1～4依次为矿化后的肌腱组织、皮肤组织、脂肪组织和重组胶原的透射电镜图，图5为骨组织的透射电镜图。根据图1～5可以看出，矿化后的生物组织具有与骨相同的纳米结构，说明本发明的方法实现了有效的生物矿化。
对实施例1～实施例4生物矿化后的生物组织的矿物含量进行测试，并与骨组织的矿物含量进行对比，所得结果如图6～9所示，图6～9依次为矿化后的肌腱组织、皮肤组织、脂肪组织和重组胶原的矿物含量测试结果，图10为骨组织的矿物含量测试结果。根据图6～10可以看出，矿化后的生物组织具有与骨组织相当的矿物含量，说明采用本发明的方法矿化后的终产物能够达到骨矿化程度，实现软组织到硬组织的快速转变。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种快速生物矿化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将生物组织在碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液中进行第一浸泡；所述第一浸泡的时间为0.5～4小时；
(2)将所述第二浸泡后的生物组织在钙溶液中进行第二浸泡；所述第二浸泡的时间为1～5分钟；
(3)将所述第二浸泡后的生物组织在磷溶液中进行第三浸泡；所述第三浸泡的时间为1～5分钟；
(4)重复步骤(2)～(3)，以重复步骤(2)和步骤(3)各一次记为重复一次，所述重复的次数为20～80次，得到矿化后的生物组织。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液中，碳二亚胺的浓度为0.1～2mol/L，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为0.005～0.2mol/L；所述第一浸泡的温度为室温。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述钙溶液的成分包括含钙化合物、聚电解质或蛋白和水；所述钙溶液中钙离子的浓度为10～1000mmol/L，聚电解质或蛋白的浓度为0.1～1mmol/L。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述聚电解质或蛋白包括聚丙烯酸、聚天冬氨酸、聚甲基丙烯酸、聚苯乙烯磺酸、聚乙烯磺酸、聚乙烯磷酸、三偏磷酸钠、骨钙素、骨涎蛋白、骨桥蛋白、胎球蛋白和牙本质磷蛋白中的一种或几种。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述含钙化合物包括碳酸钙、氧化钙、氢氧化钙、过氧化钙、氢化钙、氯化钙、氟化钙、氰氨化钙、碳化钙、次氯酸钙和硫酸钙中的一种或几种。
6.根据权利要求1、3、4或5所述的方法，其特征在于，所述第二浸泡的温度为30～50℃。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷溶液的成分包括含磷化合物、聚电解质或蛋白和水。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述含磷化合物包括磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐和过磷酸盐中的一种或几种。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述磷溶液中磷离子的浓度为50～500mmol/L，聚电解质或蛋白的浓度为0.1～1mmol/L。
10.根据权利要求1或7所述的方法，其特征在于，所述第三浸泡的温度为30～50℃。
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