CN109453430B - 一种羟基磷灰石涂层的胶原蛋白-氧化石墨烯仿生材料及其制备方法 - Google Patents

一种羟基磷灰石涂层的胶原蛋白-氧化石墨烯仿生材料及其制备方法 Download PDF

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Abstract

一种羟基磷灰石涂层的胶原蛋白‑氧化石墨烯仿生材料，包括Ⅰ型胶原蛋白、氧化石墨烯及羟基磷灰石涂层，其中，Ⅰ型胶原蛋白的重量百分含量为22.5％‑30％，氧化石墨烯的重量百分含量为3％‑4％，HA的重量百分含量为66％‑74.5％；其制备步骤包括：(1)胶原蛋白‑氧化石墨烯材料的制备；(2)模拟体液制备；(3)模拟体液仿生矿化法进行胶原蛋白‑氧化石墨烯材料表面HA涂层；该材料HA涂层的厚度可控，机械性能强，生物相容性和骨传导性好，具有较好的骨修复效果。

Description

一种羟基磷灰石涂层的胶原蛋白-氧化石墨烯仿生材料及其 制备方法
技术领域
本发明属于医药领域，涉及骨缺损修复材料及其制备方法，具体涉及一种羟基磷灰石（HA）涂层的胶原蛋白（Col）-氧化石墨烯（GO）仿生材料及其制备方法。
背景技术
因外伤、感染、肿瘤等导致的大段骨缺损，是临床上的常见难题。自体骨移植是目前治疗的标准，但是可能存在供区并发症、感觉异常、生活质量降低等不足。同种异体骨移植是另一种常用的治疗方法，但是可能存在感染、免疫排斥等缺点。因此，通过生物材料植入的方式，既能避免自体骨移植导致的二次手术，又能避免异体骨移植导致的感染风险，是一种极具前景的方法。
骨组织的修复材料，应该具备良好的骨传导性，即生物材料的表面能够促进新生骨的长入。
Ⅰ型胶原蛋白是生物材料中使用比较广泛的一种天然高分子材料，它是骨组织的主要组成成份，具有良好的生物相容性，常常被用来作为骨组织的修复材料。但是Ⅰ型胶原蛋白存在一些缺点，如机械强度不够、容易变形等。
氧化石墨烯是一种碳基纳米材料，具有良好的机械性能、丰富的功能基团、无生物毒性等特点，它能与天然高分子材料通过酰胺键互相交联，同时氧化石墨烯表面丰富的功能基团，例如羧基、羟基等，为氧化石墨烯的充分交联提供了保障。理论上，氧化石墨烯的添加，可以改善Ⅰ型胶原蛋白机械性能，制备一种性能更加优越的生物材料。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中缺少一种机械性能强，生物相容性和骨传导性好的骨修复材料的问题。
以Ⅰ型胶原蛋白-氧化石墨烯复合材料作为主体支架，在表面用SBF仿生矿化的方法进行HA涂层，可以构建一种新的仿生材料。这种仿生材料在成份上对骨组织进行仿生，而且具有良好的骨传导性，是一种良好的非承重骨修复材料。
本发明采用的技术方案是：一种羟基磷灰石涂层的胶原蛋白-氧化石墨烯仿生材料，包括Ⅰ型胶原蛋白、氧化石墨烯（GO）及羟基磷灰石涂层（HA涂层），Ⅰ型胶原蛋白的重量百分含量为22.5%-30%，氧化石墨烯的重量百分含量为3%-4%，HA的重量百分含量为66%-74.5%。
所述的羟基磷灰石涂层的胶原蛋白-氧化石墨烯仿生材料的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
工序一：胶原蛋白-氧化石墨烯材料的制备
(1)将30-40mg I型胶原蛋白加入1 ml 0.1M 醋酸（0.285ml冰醋酸去离子水定容到50ml）溶液中，得到3%-4% (W/V)的胶原蛋白溶液；
（2）将3-4mg氧化石墨烯粉末在超声辅助下溶解于1 ml 0.1M 醋酸溶液中,得到0.3%-0.4% (W/V)氧化石墨烯溶液；
（3）将本工序步骤（1）和步骤（2）中得到3%-4% (W/V)的胶原蛋白溶液和0.3%-0.4%(W/V)氧化石墨烯溶液等体积进行混合后，获得1.5%-2% (W/V)胶原蛋白和0.15%-0.2% (W/V)氧化石墨烯混合溶液，冰浴搅拌15min，并在超声辅助下得到均质溶液，注入内径5mm、外径7mm、高度2mm的圆形模具中，4℃冰箱放置至无气泡；
（4）将本工序步骤（3）中得到的材料在-20℃冰箱冷冻24h后，再放置在真空冷冻干燥机中（设置参数：-50℃，21Kpa）冻干24h，形成多孔材料；
（5）将本工序步骤（4）中形成的多孔材料，用95%乙醇漂洗2-3次，浸入含EDC/NHS为5mg/ml的95%乙醇中，调PH为5.5，常温浸泡24h，最后用纯水漂洗2-3次；
（6）将本工序步骤（5）中得到的材料再次冻干24h，备用；
工序二：模拟体液制备
（1）加700ml去离子水在1L的塑料烧杯中；
（2）按下表1-8的顺序，依次加入塑料烧杯中溶解，不断搅拌，注意观察溶液状态，若出现浑浊，则按照下表配方重新配制；
Figure DEST_PATH_IMAGE001
（3）将本工序步骤（2）中得到的溶液，用去离子水定量溶液到900ml；
（4）将PH电极插入将本工序步骤（3）中得到的溶液中，观察溶液PH，逐滴加入1.0MHCl溶液或者1.0MNaOH溶液，将溶液的PH调节至2.0±1.0；
（5）在本工序步骤（4）中得到的溶液，缓慢加入三羟甲基氨基甲烷（Tris），待PH稳定之后再继续加，一直到PH刚好低于7.45；
（6）取出PH电极，在本工序步骤（5）中得到的溶液定容到1000ml，待用；
工序三：模拟体液仿生矿化法进行胶原蛋白-氧化石墨烯材料表面HA涂层
（1）在工序一中得到的材料放入20ml 0.2M CaCl2溶液浸泡3min，然后在去离子水中浸泡5s，空气干燥3min；
（2）在本工序步骤（1）中得到的材料放入20ml 0.2M K2HPO4溶液浸泡3min，去离子水中浸泡5s，空气干燥3min；
（3）循环本工序步骤（1）、（2）3次；
（4）取40ml工序二中得到的模拟体液加入到50ml离心管内；
（5）将在本工序步骤（3）中得到的材料，放入离心管内浸泡，确保材料完全浸没，放入37℃恒温培养箱内；
（6）浸泡7天，每天更换一次模拟体液；然后取出材料，用去离子水清洗3遍后冻干6h；
（7）将本工序步骤（6）冻干得到的材料经环氧乙烷消毒，得到成品材料，待用。
优选的，所述HA涂层的厚度为25um~35 um。
进一步的，所述工序一的步骤（2）、步骤（3）中超声辅助的条件为：强度：30%；时间：10min；频率：2/3。
优选的，所述工序一的步骤（6）中EDC和NHS的质量比为5:2。
进一步的，所述工序一的步骤（5）中超声辅助得到均质溶液如果存在大量气泡，采用可低速离心的方法去除气泡。
本发明的有益效果和特点是：（1）用天然骨的主要成分Ⅰ型胶原蛋白作为支架材料的主体部分，具有良好的生物相容性；（2）氧化石墨烯纳米材料与Ⅰ型胶原蛋白通过酰胺键交联构成复合材料，能够增强材料的机械性能，稳定材料的机构；（3）通过仿生矿化法在复合材料表面形成骨样羟基磷灰石，是骨的天然组成成份，能够增加材料生物相容性和骨传导性，增强与宿主骨的结合强度；（4）模拟体液的制备工艺简单，成本低，通过调节模拟体液的温度、PH、离子强度，可以调控HA涂层的厚度；（5）仿生材料的制备过程对仪器要求较低，可操作性大；（6）本发明提供的HA涂层的胶原蛋白-氧化石墨烯仿生材料，具有良好的生物相容性、骨传导性，能与宿主骨紧密结合，解决了传统生物材料生物相容性不足，骨传导性能不佳的缺点；（7）动物实验结果可以看出，仿生材料Col-GO-HA对颅骨具有一定的修复效果，而且比单纯的胶原蛋白材料、胶原蛋白交联氧化石墨烯复合材料的修复效果要好，而且差异具有显著性。
附图说明
图1是单纯材料Col、复合材料Col-GO及仿生材料Col-GO-HA三种材料的外观对比图；
图2是扫描电子显微镜下单纯材料Col、复合材料Col-GO及仿生材料Col-GO-HA三种材料的扫描图；
图3是Micro CT下单纯材料Col、复合材料Col-GO及仿生材料Col-GO-HA三种材料的扫描图；
图4是仿生材料Col-GO-HA的能谱X射线光谱分析图；
图5是仿生材料Col-GO-HA的能谱X射线光谱分析得出的各元素含量分布表；
图6是单纯材料Col、复合材料Col-GO及仿生材料Col-GO-HA三种材料的傅立叶红外转换光谱图；
图7是单纯材料Col、复合材料Col-GO及仿生材料Col-GO-HA三种材料的X射线衍射图；
图8是单纯材料Col、复合材料Col-GO及仿生材料Col-GO-HA三种材料的体外细胞实验中细胞在材料上培养10天和培养14天后的FDA染色；
图9是不同胶原蛋白浓度下复合材料的环境扫描电镜图；
图10是单纯材料Col、复合材料Col-GO及仿生材料Col-GO-HA三种材料放入缺损部位外观照；
图11是单纯材料Col、复合材料Col-GO及仿生材料Col-GO-HA三种材料放入缺损部位，1个月和3个月后Micro CT三维重建图（下面3张为3个月的情况）；
图12是单纯材料Col、复合材料Col-GO及仿生材料Col-GO-HA三种材料放入缺损部位3个月后的颅骨新生骨骨量分析。
附图英文说明：
SEM（scanning electron microscope）：扫描电子显微镜
Optical images：大体照
Micro CT（Micro computed tomography）：微计算机断层扫描技术
EDS（Energy Dispersive Spectrometer）：能谱分析
Transmittance：透光率
Wavenumber：波长
Intensity：强度
FDA（Fluorescein diacetate）：荧光素双醋酸酯
3D reconstruction：3D重建
具体实施方式
下面结合附图对本发明进行进一步说明：
一种羟基磷灰石涂层的胶原蛋白-氧化石墨烯仿生材料，包含Ⅰ型胶原蛋白、氧化石墨烯（GO）、羟基磷灰石涂层（HA涂层），HA涂层的厚度为25um~35 um，羟基磷灰石均匀涂层在材料表面。换算成重量百分含量，Ⅰ型胶原蛋白的重量百分含量为22.5%-30%，氧化石墨烯的重量百分含量为3%-4%，HA的重量百分含量为66%-74.5%。
上述材料制备方法的实施例如下：
实施例1：
制备胶原蛋白浓度为1.5%(W/V)，氧化石墨烯浓度为0.15%(W/V)的复合材料，利用SBF仿生矿化法在材料表面制备出羟基磷灰石仿生涂层。换算成重量百分含量，Ⅰ型胶原蛋白的重量百分含量为22.5%，氧化石墨烯的重量百分含量为3%，HA的重量百分含量为74.5%。
工序一：胶原蛋白-氧化石墨烯复合材料的制备
(1) 将30mg I型胶原蛋白加入1 ml 0.1M 醋酸（0.285ml冰醋酸去离子水定容到50ml）溶液中，得到3% (W/V)的胶原蛋白溶液；
（2）将3mg氧化石墨烯粉末在超声辅助下溶解于1 ml 0.1M 醋酸溶液中,得到0.3%(W/V)氧化石墨烯溶液；
（3）将本工序步骤（1）和步骤（2）中得到3% (W/V)的胶原蛋白溶液和0.3% (W/V)氧化石墨烯溶液等体积进行混合后，获得1.5% (W/V)胶原蛋白和0.15% (W/V)氧化石墨烯混合溶液，冰浴搅拌15min，并在超声辅助下得到均质溶液，注入内径5mm、外径7mm、高度2mm的圆形模具中，4℃冰箱放置至无气泡；
（4）将本工序步骤（3）中得到的材料在-20℃冰箱冷冻24h后，再放置在真空冷冻干燥机中，冻干24h，形成多孔材料；真空冷冻干燥机设置参数：-50℃，21Kpa；
（5）将本工序步骤（4）中形成的多孔材料，用95%乙醇漂洗2-3次，浸入含EDC/NHS为5mg/ml的95%乙醇中，调PH为5.5，常温浸泡24h，最后用纯水漂洗2-3次；
（6）将本工序步骤（5）中得到的材料再次冻干24h，备用；
工序二：模拟体液制备
（1）加700ml去离子水在1L的塑料烧杯中；
（2）按下表1-8的顺序，依次加入塑料烧杯中溶解，不断搅拌，注意观察溶液状态，若出现浑浊，则按照下表配方重新配制；
Figure DEST_PATH_IMAGE002
（3）将本工序步骤（2）中得到的溶液，用去离子水定量溶液到900ml；
（4）将PH电极插入将本工序步骤（3）中得到的溶液中，观察溶液PH，逐滴加入1.0MHCl溶液或者1.0MNaOH溶液，将溶液的PH调节至2.0±1.0；
（5）在本工序步骤（4）中得到的溶液，缓慢加入三羟甲基氨基甲烷（Tris），待PH稳定之后再继续加，一直到PH刚好低于7.45；
（6）取出PH电极，在本工序步骤（5）中得到的溶液定容到1000ml，待用；
工序三：模拟体液仿生矿化法进行胶原蛋白-氧化石墨烯材料表面HA涂层
（1）在工序一中得到的材料放入20ml 0.2M CaCl2溶液浸泡3min，然后在去离子水中浸泡5s，空气干燥3min；
（2）在本工序步骤（1）中得到的材料放入20ml 0.2M K2HPO4溶液浸泡3min，去离子水中浸泡5s，空气干燥3min；
（3）循环本工序步骤（1）、（2）3次；
（4）取40ml工序二中得到的模拟体液加入到50ml离心管内；
（5）将在本工序步骤（3）中得到的材料，放入离心管内浸泡，确保材料完全浸没，放入37℃恒温培养箱内；
（6）浸泡7天，每天更换一次模拟体液；然后取出材料，用去离子水清洗3遍后冻干6h；
第四步：将胶原蛋白-氧化石墨烯-羟基磷灰石涂层仿生材料经环氧乙烷消毒4h后待用。
实施例2
制备胶原蛋白浓度为1.75%(W/V)，氧化石墨烯浓度为0.175%(W/V)的复合材料，利用SBF仿生矿化法在材料表面制备出羟基磷灰石仿生涂层。换算成重量百分含量，Ⅰ型胶原蛋白的重量百分含量为26.25%，氧化石墨烯的重量百分含量为3.5%，HA的重量百分含量为70.25%。
工序一：胶原蛋白-氧化石墨烯复合材料的制备
(1) 将35mg I型胶原蛋白加入1 ml 0.1M 醋酸（0.285ml冰醋酸去离子水定容到50ml）溶液中，得到3.5% (W/V)的胶原蛋白溶液；
（2）将3.5mg氧化石墨烯粉末在超声辅助下溶解于1 ml 0.1M 醋酸溶液中,得到0.35% (W/V)氧化石墨烯溶液；
（3）将本工序步骤（1）和步骤（2）中得到3.5% (W/V)的胶原蛋白溶液和0.35% (W/V)氧化石墨烯溶液等体积进行混合后，获得1.75% (W/V)胶原蛋白和0.175% (W/V)氧化石墨烯混合溶液，冰浴搅拌15min，并在超声辅助下得到均质溶液，注入内径5mm、外径7mm、高度2mm的圆形模具中，4℃冰箱放置至无气泡；
（4）将本工序步骤（3）中得到的材料在-20℃冰箱冷冻24h后放置在真空冷冻干燥机中（设置参数：-50℃，21Kpa）冻干24h，形成多孔材料；
（5）将本工序步骤（4）中形成的多孔材料，用95%乙醇漂洗2-3次，浸入含EDC/NHS为5mg/ml的95%乙醇中，调PH为5.5，常温浸泡24h，最后用纯水漂洗2-3次；
（6）将本工序步骤（5）中得到的材料再次冻干24h，备用；
工序二：模拟体液制备
（1）加700ml去离子水在1L的塑料烧杯中；
（2）按下表1-8的顺序，依次加入塑料烧杯中溶解，不断搅拌，注意观察溶液状态，若出现浑浊，则按照下表配方重新配制；
Figure 895657DEST_PATH_IMAGE001
（3）将本工序步骤（2）中得到的溶液，用去离子水定量溶液到900ml；
（4）将PH电极插入将本工序步骤（3）中得到的溶液中，观察溶液PH，逐滴加入1.0MHCl溶液或者1.0MNaOH溶液，将溶液的PH调节至2.0±1.0；
（5）在本工序步骤（4）中得到的溶液，缓慢加入三羟甲基氨基甲烷（Tris），待PH稳定之后再继续加，一直到PH刚好低于7.45；
（6）取出PH电极，在本工序步骤（5）中得到的溶液定容到1000ml，待用；
工序三：模拟体液仿生矿化法进行胶原蛋白-氧化石墨烯材料表面HA涂层
（1）在工序一中得到的材料放入20ml 0.2M CaCl2溶液浸泡3min，然后在去离子水中浸泡5s，空气干燥3min；
（2）在本工序步骤（1）中得到的材料放入20ml 0.2M K2HPO4溶液浸泡3min，去离子水中浸泡5s，空气干燥3min；
（3）循环本工序步骤（1）、（2）3次；
（4）取40ml工序二中得到的模拟体液加入到50ml离心管内；
（5）将在本工序步骤（3）中得到的材料，放入离心管内浸泡，确保材料完全浸没，放入37℃恒温培养箱内；
（6）浸泡7天，每天更换一次模拟体液；然后取出材料，用去离子水清洗3遍后冻干6h；
（7）将本工序步骤（6）冻干得到的材料经环氧乙烷消毒4h，得到成品材料，待用。
实施例3
制备胶原蛋白浓度为2%(W/V)，氧化石墨烯浓度为2%(W/V)的复合材料，利用SBF仿生矿化法在材料表面制备出羟基磷灰石仿生涂层。换算成重量百分含量，Ⅰ型胶原蛋白的重量百分含量为30%，氧化石墨烯的重量百分含量为4%，HA的重量百分含量为66%。
工序一：胶原蛋白-氧化石墨烯复合材料的制备
(1) 将40mg I型胶原蛋白加入1 ml 0.1M 醋酸（0.285ml冰醋酸去离子水定容到50ml）溶液中，得到4% (W/V)的胶原蛋白溶液；
（2）将4mg氧化石墨烯粉末在超声辅助下溶解于1 ml 0.1M 醋酸溶液中,得到0.4%(W/V)氧化石墨烯溶液；
（3）将本工序步骤（1）和步骤（2）中得到4% (W/V)的胶原蛋白溶液和0.4% (W/V)氧化石墨烯溶液等体积进行混合后，获得2% (W/V)胶原蛋白和0.2% (W/V)氧化石墨烯混合溶液，冰浴搅拌15min，并在超声辅助下得到均质溶液，注入内径5mm、外径7mm、高度2mm的圆形模具中，4℃冰箱放置至无气泡；
（4）将本工序步骤（3）中得到的材料在-20℃冰箱冷冻24h后放置在真空冷冻干燥机中（设置参数：-50℃，21Kpa）冻干24h，形成多孔材料；
（5）将本工序步骤（4）中形成的多孔材料，用95%乙醇漂洗2-3次，浸入含EDC/NHS为5mg/ml的95%乙醇中，调PH为5.5，常温浸泡24h，最后用纯水漂洗2-3次；
（6）将本工序步骤（5）中得到的材料再次冻干24h，备用；
第二步：模拟体液制备
（1）加700ml去离子水在1L的塑料烧杯中；
（2）按下表1-8的顺序，依次加入塑料烧杯中溶解，不断搅拌，注意观察溶液状态，若出现浑浊，则按照下表配方重新配制；
Figure 659187DEST_PATH_IMAGE001
（3）将本工序步骤（2）中得到的溶液，用去离子水定量溶液到900ml；
（4）将PH电极插入将本工序步骤（3）中得到的溶液中，观察溶液PH，逐滴加入1.0MHCl溶液或者1.0MNaOH溶液，将溶液的PH调节至2.0±1.0；
（5）缓慢加入三羟甲基氨基甲烷（Tris），待PH稳定之后再继续加，一直到PH刚好低于7.45；
（6）取出PH电极，在本工序步骤（5）中得到的溶液定容到1000ml，待用；
第三步：模拟体液仿生矿化法进行胶原蛋白-氧化石墨烯材料表面HA涂层
（1）在工序一中得到的材料放入20ml 0.2M CaCl2溶液浸泡3min，然后在去离子水中浸泡5s，空气干燥3min；
（2）在本工序步骤（1）中得到的材料然后20ml 0.2M K2HPO4溶液浸泡3min，去离子水中浸泡5s，空气干燥3min；
（3）循环本工序步骤（1）、（2）3次；
（4）取40ml工序二中得到的模拟体液模拟体液加入到50ml离心管内；
（5）将在本工序步骤（3）中得到的材料，放入离心管内浸泡，确保材料完全浸没，放入37℃恒温培养箱内；
（6）浸泡7天，每天更换一次模拟体液；然后取出材料，用去离子水清洗3遍后冻干6h；
第四步：将胶原蛋白-氧化石墨烯-羟基磷灰石涂层仿生材料经环氧乙烷消毒4h后待用。
实施例4
仿生支架材料修复大鼠颅骨缺损
第一步：胶原蛋白-氧化石墨烯复合材料的制备
(1) 将40mg I型胶原蛋白加入1 ml 0.1M 醋酸（0.285ml冰醋酸去离子水定容到50ml）溶液中，得到4% (W/V)的胶原蛋白溶液；
（2）将4mg氧化石墨烯粉末在超声辅助下溶解于1 ml 0.1M 醋酸溶液中,得到0.4%(W/V)氧化石墨烯溶液；
（3）将本工序步骤（1）和步骤（2）中得到4% (W/V)的胶原蛋白溶液和0.4% (W/V)氧化石墨烯溶液等体积进行混合后，获得2% (W/V)胶原蛋白和0.2% (W/V)氧化石墨烯混合溶液，冰浴搅拌15min，并在超声辅助下得到均质溶液，注入内径5mm、外径7mm、高度2mm的圆形模具中，4℃冰箱放置至无气泡；
（4）-20℃冰箱冷冻24h后放置在真空冷冻干燥机中（设置参数：-50℃，21Kpa）冻干24h，形成多孔材料；
（5）将本工序步骤（4）中形成的多孔材料，用95%乙醇漂洗2-3次，浸入含EDC/NHS为5mg/ml的95%乙醇中，调PH为5.5，常温浸泡24h，最后用纯水漂洗2-3次；
（6）再次冻干24h，备用；
第二步：模拟体液制备
（1）加700ml去离子水在1L的塑料烧杯中；
（2）按下表1-8的顺序，依次溶解，不断搅拌，注意观察溶液状态，若出现浑浊，则按照配方重新配制；
Figure 766820DEST_PATH_IMAGE001
（3）用去离子水定量溶液到900ml；
（4）将PH电极插入溶液中，观察溶液PH，逐滴加入1.0MHCl溶液或者1.0MNaOH溶液，将溶液的PH调节至2.0±1.0；
（5）缓慢加入三羟甲基氨基甲烷（Tris），待PH稳定之后再继续加，一直到PH刚好低于7.45；
（6）取出PH电极，定容到1000ml，待用；
第三步：模拟体液仿生矿化法进行胶原蛋白-氧化石墨烯材料表面HA涂层
（1）20ml 0.2M CaCl2溶液浸泡3min，然后在去离子水中浸泡5s，空气干燥3min；
（2）然后20ml 0.2M K2HPO4溶液浸泡3min，去离子水中浸泡5s，空气干燥3min；
（3）循环3次；
（4）取40ml模拟体液加入到50ml离心管内；
（5）将处理后的材料放入离心管内浸泡，确保材料完全浸没，放入37℃恒温培养箱内；
（6）浸泡7天，每天更换一次模拟体液；然后取出材料，用去离子水清洗3遍后冻干6h；
第四步：将胶原蛋白-氧化石墨烯-羟基磷灰石涂层仿生材料经环氧乙烷消毒4h后待用。
第五步：将材料放入SD大鼠颅骨缺损部位。
（1）选用5周-6周龄雄性SD大鼠，无菌状态下使用10%水合氯醛（剂量为0.4ml/100g）行腹腔麻醉。
（2）使用75%酒精消毒大鼠颅骨皮肤，并做1.0cm纵向切口，依次切开皮肤、皮下组织、肌肉、骨膜层，钝性分离骨膜，暴露颅骨组织。
（3）用外径5mm的环形钻在大鼠颅骨上制作直径5mm的圆形全层骨膜骨质缺损，然后仔细冲洗创面，去除残留碎骨。
（4）严密止血后，将上述Col-GO-HA仿生材料填充于缺损区，使用5-0缝线逐层缝合骨膜和皮肤。
第六步：SD大鼠颅骨取材
（1）分别在术后第4周和第12周，经腹腔注射过量水合氯醛以处死大鼠，取出大鼠整块颅骨。
（2）标本使用4%多聚甲醛固定24h。
（3）将各组样本行Micro CT检测，并进行三维重构，通过CTAn软件分析新生骨体积。
本发明工艺试验：
1. 材料检测
1.1扫描电镜（SEM）
按照实验方法，制得胶原蛋白浓度分别为1%（W/V）、1.5%（W/V）、2%（W/V）和4%（W/V）的胶原蛋白-氧化石墨烯复合材料，4种材料的氧化石墨烯浓度均为0.2%（W/V），将样本表面进行喷金处理1分钟，用环境扫描电镜ESEM 10KV下进行观察。
结果分析：如图9，可以看出1%（W/V）Col-GO和4%（W/V）Col-GO材料表面部分区域有孔隙结构，且孔径均比较小，分布不均匀。1.5%（W/V）Col-GO 和2%（W/V）Col-GO材料表面有均匀分布的多孔结构，孔径比较均已。因此，1.5%-2%（W/V）Col-GO既可以保持良好的形态，又可以得到均匀的微观孔结构，是最优的胶原蛋白浓度范围。
试验证明，Ⅰ型胶原蛋白的含量低于1.5% (W/V)，影响材料的生物相容性；含量高于2% (W/V)，容易导致材料的孔隙不均匀；氧化石墨烯的含量低于0.3% (W/V)，达不到交联效果；含量高于0.4% (W/V)，可能引起一系列副作用；HA均匀致密分布在Col-GO复合材料表面，占有大部分的重量，为66%-74.5%。
1.2扫描电镜（SEM）、微计算机断层扫描（Micro CT）
将样本表面进行喷金处理1分钟，用环境扫描电镜ESEM 10KV下进行观察。微计算机断层扫描（Micro CT）用来检测材料表面HA涂层的量，样本在仪器内进行断层扫描，通过软件对扫描数据进行3维重建以及分析HA涂层的量。
结果分析：如图1显示，单纯胶原蛋白（Col）3D支架为白色固体；添加氧化石墨烯形成复合材料（Col-GO）之后，支架颜色加深，为棕色固体；对复合材料进行仿生矿化（Col-GO-HA）之后，在材料表面可以形成均匀涂层的白色的结晶。如图2显示，Micro CT能够分析HA的沉积以及3维分布，可见单纯Col和复合材料Col-GO不显影，无HA沉积，而仿生材料Col-GO-HA周围可见均匀覆盖的HA，表明成功在材料表面均匀涂层了HA。如图3显示，扫描电镜能放大1000倍观察材料的表面拓扑结构，可见Col和Col-GO的多孔结构，表面比较光滑；仿生材料Col-GO-HA表面则有均匀分布的结晶，与Micro CT的分析结果相符。
1.3 能谱X射线光谱分析（EDS）
用能谱X射线光谱EDS观察矿化材料表面的Ca、P元素比例。
结果分析：能谱分析能够对仿生材料Col-GO-HA表面的结晶成份进行Ca/P比分析，羟基磷灰石的Ca/P比范围为1.33-1.67。如图4、图5所示，仿生材料Col-GO-HA表面矿物结晶的Ca/P比为1.41±0.18，在羟基磷灰石的范围内，对结晶的性质进行了表征，表明仿生矿化法成功在材料表面涂层了HA。
1.4 傅立叶红外转换光谱（FTIR）、X射线衍射（XRD）
傅立叶红外转换光谱FTIR（VERTEX 70，德国Bruker公司）用来检测材料的化学基团，扫描范围为500cm-1-4000cm-1，分辨率为0.4cm-1。X射线衍射XRD用来检测材料表面沉积的磷灰石相，CuKα辐射（k=1.540598），参数设定扫描范围为5-40°，步长为0.013°，扫描速率为0.78°/min。
结果分析：傅立叶红外转换光谱能够分析材料中的化学组成，如图6所示，仿生材料Col-GO-HA在1037cm-1、562cm-1和606cm-1波长处出现了PO4 3-的特征峰，而其它两个材料没有出现。X射线衍射图谱，如图7所示，可见仿生材料Col-GO-HA在25.5°和31.7°处出现HA的特征峰。因此，FTIR和XRD图谱分析，间接证明了HA存在于仿生材料Col-GO-HA上，与前面结果相符。
2.体外细胞实验
将消毒好的材料放在六孔板内，将骨髓间充质干细胞（BMSC）按1×106个/mL浓度种植在3个组的材料上，每个材料种植20-40μL体积。分别在第10天和第14天对材料进行FDA染色，观察材料上存活的细胞量。
结果分析：材料上具有活性的细胞，能够被FDA染料染成绿色，绿色数量越多，代表材料上存活的细胞越多，即材料的细胞相容性更好。如图8所示，第10天和第14天，3个组的材料上均有细胞，其中仿生材料Col-GO-HA上的细胞最多，而且从第10天到第14天，仿生材料Col-GO-HA上的细胞有所增加，表明仿生材料更适于细胞粘附、生长，具有良好的生物相容性。
3.实际修复实验
3个组的材料放入缺损部位，如图10所示，材料均处于缺损部位上；如图11所示，1个月后每个组取材2只进行分析， Micro CT三维重建后，可见3个组均有新生骨的形成，3个月后每个组取材2只进行分析； Micro CT三维重建后，可见新生骨的量明显较1个月多，从图12的定量分析可以得出，仿生材料Col-GO-HA组新生骨骨量最多，修复效果最好。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的结构关系及原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (3)

1.一种羟基磷灰石涂层的胶原蛋白-氧化石墨烯仿生材料，包括Ⅰ型胶原蛋白、氧化石墨烯及羟基磷灰石涂层，Ⅰ型胶原蛋白的重量百分含量为22.5％-30％，氧化石墨烯的重量百分含量为3％-4％，HA的重量百分含量为66％-74.5％，所述HA涂层的厚度为25um～35um；
该羟基磷灰石涂层的胶原蛋白-氧化石墨烯仿生材料的制备方法如下：
工序一：胶原蛋白-氧化石墨烯材料的制备
(1)将30-40mg I型胶原蛋白加入1ml 0.1M醋酸溶液中，得到3％-4％(W/V)的胶原蛋白溶液；
(2)将3-4mg氧化石墨烯粉末在超声辅助下溶解于1ml 0.1M醋酸溶液中,得到0.3％-0.4％(W/V)氧化石墨烯溶液；
(3)将本工序步骤(1)和步骤(2)中得到3％-4％(W/V)的胶原蛋白溶液和0.3％-0.4％(W/V)氧化石墨烯溶液等体积进行混合后，获得1.5％-2％(W/V)胶原蛋白和0.15％-0.2％(W/V)氧化石墨烯混合溶液，冰浴搅拌15min，并在超声辅助下得到均质溶液，注入内径5mm、外径7mm、高度2mm的圆形模具中，4℃冰箱放置至无气泡；
(4)将本工序步骤(3)中得到的材料在-20℃冰箱冷冻24h后，再放置在真空冷冻干燥机中，冻干24h，形成多孔材料；真空冷冻干燥机设置参数：-50℃，21Kpa；
(5)将本工序步骤(4)中形成的多孔材料，用95％乙醇漂洗2-3次，浸入含EDC/NHS为5mg/ml的95％乙醇中，调PH为5.5，常温浸泡24h，最后用纯水漂洗2-3次；
(6)将本工序步骤(5)中得到的材料再次冻干24h，备用；
工序二：模拟体液制备
(1)加700ml去离子水在1L的塑料烧杯中；
(2)按下表1-8的顺序，依次加入塑料烧杯中溶解，不断搅拌，注意观察溶液状态，若出现浑浊，则按照下表配方重新配制；
Figure FDA0003353189060000011
(3)将本工序步骤(2)中得到的溶液，用去离子水定量溶液到900ml；
(4)将PH电极插入将本工序步骤(3)中得到的溶液中，观察溶液PH，逐滴加入1.0MHCl溶液或者1.0MNaOH溶液，将溶液的PH调节至2.0±1.0；
(5)在本工序步骤(4)中得到的溶液，缓慢加入三羟甲基氨基甲烷(Tris)，待PH稳定之后再继续加，一直到PH刚好低于7.45；
(6)取出PH电极，在本工序步骤(5)中得到的溶液定容到1000ml，待用；
工序三：模拟体液仿生矿化法进行胶原蛋白-氧化石墨烯材料表面HA涂层
(1)在工序一中得到的材料放入20ml 0.2M CaCl 2溶液浸泡3min，然后在去离子水中浸泡5s，空气干燥3min；
(2)在本工序步骤(1)中得到的材料放入20ml 0.2M K 2HPO 4溶液浸泡3min，去离子水中浸泡5s，空气干燥3min；
(3)循环本工序步骤(1)、(2)3次；
(4)取40ml工序二中得到的模拟体液加入到50ml离心管内；
(5)将在本工序步骤(3)中得到的材料，放入离心管内浸泡，确保材料完全浸没，放入37℃恒温培养箱内；
(6)浸泡7天，每天更换一次模拟体液；然后取出材料，用去离子水清洗3遍后冻干6h；
(7)将本工序步骤(6)冻干得到的材料经环氧乙烷消毒4h，得到成品材料，待用。
2.如权利要求1所述的羟基磷灰石涂层的胶原蛋白-氧化石墨烯仿生材料，其特征在于：所述工序一的步骤(5)中EDC和NHS的质量比为5:2。
3.如权利要求1所述的羟基磷灰石涂层的胶原蛋白-氧化石墨烯仿生材料，其特征在于：所述工序一的步骤(3)中超声辅助得到均质溶液如果存在大量气泡，采用低速离心的方法去除气泡。
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CN110950333B (zh) * 2019-12-16 2021-09-14 天新福（北京）医疗器材股份有限公司 一种制备氧化石墨烯材料的方法
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CN114621484B (zh) * 2022-04-01 2023-06-09 华中科技大学同济医学院附属协和医院 一种仿生矿化骨修复支架的制备方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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