CN112206359A - 一种自矿化胶原膜、制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种自矿化胶原膜、制备方法与应用,自矿化胶原膜包括GBR胶原膜,在GBR胶原膜上交联聚阴离子。自矿化胶原膜通过下述方法制备得到:(1)浓度为2~10mg/mL的聚阴离子的聚电解质溶液,调节溶液的pH=6.0;(2)化学交联剂溶解于(1)的溶液中,常温下静置1~15min,调节pH=7.0得到待交联聚电解质溶液;(3)GBR胶原膜置于(2)的待交联聚电解质溶液中,常温下反应1~15min即得自矿化胶原膜。本发明的自矿化胶原膜用于制备骨修复材料、成骨材料或骨材料的应用。本发明的自矿化膜植入体内后,能够自发地富集体液中的钙、磷离子并逐步诱导纤维内矿化,实现胶原膜从韧性材料向刚性材料的体内转化。
Description
技术领域
本发明属于引导骨组织再生技术领域,具体涉及一种自矿化胶原膜、制备方法与应用。
背景技术
炎症、外伤等原因导致的牙槽骨缺损在口腔临床实践中十分常见,其直接后果是牙齿的脱落及种植术前的骨量不足。
引导骨组织再生(guided bone regeneration,GBR)技术是治疗牙周病引起的骨丢失及种植术前骨增量的常用手段。由此可见,GBR技术的核心在于性能优越的引导骨再生膜的应用。但是这种胶原膜仍然存在以下问题亟待改进:①易受特异性酶的影响而水解,物理屏障功能易遭到破坏;②机械强度不足,空间维持能力较差;③缺乏细胞可识别的位点,在软硬组织愈合方面无明显促进作用。因此构建兼具屏障功能、空间维持功能、骨传导性和骨诱导性的GBR膜是扩大其适应症并提高其临床成功率的关键。
为了解决GBR膜机械性能差、降解速度快的问题,有学者使用物理,化学交联及羟基磷灰石等无机填料与胶原共混的方法处理胶原膜,但这些方法对机械强度,耐酶解性能及骨传导性能的提升效果有限。
同时,随着刚度的提高,往往导致材料韧性的下降。纤维内矿化以后,胶原膜的脆性增大、塑形性降低,在植入时无法实现与骨缺损区的贴合。如何改进纤维内矿化技术,在保持GBR膜植入时有良好的韧性及操作性的同时,又能够在植入后增加膜的强度、控制其降解,持续良好的成骨空间,成为解决这一问题的关键。在前期研究中,我们模拟天然矿化过程,使用高分子量聚丙烯酸(High molecular weight polyacrylic acid,HPAA)模拟成骨过程中非胶原蛋白的调控作用,与Ca2+、HPO4 2-聚集形成无定形矿物质纳米前体;诱导矿化前体在胶原纤维内部间隙定向沉积、晶化,形成了羟基磷灰石在胶原内部有序沉积的纤维内矿化模式,我们将其称为纤维内仿生矿化技术。
那么如何通过结合体内外矿化研究,评价改性胶原膜的自矿化潜能及其与机械性能及耐酶解性能间的相关关系,并确定自矿化的具体机制等问题亟待解决。
本项目的完成将有望通过一种简单可行的交联技术形成兼具物理屏障功能、自矿化功能和骨诱导功能的生物化功能性膜材料,以扩大GBR技术的适应症,提高其成功率。针对该问题的探索也必将为生理性及病理性矿化的本质提供参考和借鉴。
发明内容
针对现有技术的缺陷或不足,本发明的目的在于提供一种自矿化胶原膜、制备方法与应用,本发明的自矿化膜植入体内后,能够自发地富集体液中的钙、磷离子并逐步诱导纤维内矿化,实现胶原膜从韧性材料向刚性材料的体内转化。
为达到上述目的,本发明采取的技术方案包括:
一种自矿化胶原膜,包括GBR胶原膜,在GBR胶原膜上交联聚阴离子。
可选的,所述的聚阴离子通过羧基交联在GBR胶原膜的胶原分子上。
可选的,所述的聚阴离子为聚丙烯酸,分子量为450kDa。
可选的,所述自矿化胶原膜通过下述方法制备得到:
(1)浓度为2~10mg/mL的聚阴离子的聚电解质溶液,调节溶液的pH=6.0;
(2)化学交联剂溶解于(1)的溶液中,常温下静置1~15min,调节pH=7.0得到待交联聚电解质溶液;
(3)GBR胶原膜置于(2)的待交联聚电解质溶液中,常温下反应1~15min即得自矿化胶原膜。
可选的,所述化学交联剂选自1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺中的一种或两种。
可选的,所述的聚电解质溶液为0.1M的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液。
一种自矿化胶原膜的制备方法,包括:
(1)浓度为2~10mg/mL的聚阴离子的聚电解质溶液,调节溶液的pH=6.0;
(2)化学交联剂溶解于(1)的溶液中,常温下静置1~15min,调节pH=7.0得到待交联聚电解质溶液;
(3)GBR胶原膜置于(2)的待交联聚电解质溶液中,常温下反应1~15min即得自矿化胶原膜。
可选的,所述的聚阴离子为聚丙烯酸,分子量为450kDa。
可选的,所述化学交联剂选自1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺中的一种或两种;
所述的聚电解质溶液为0.1M的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液。
本发明所述的自矿化胶原膜或本发明所述的自矿化胶原膜的制备方法制备得到的自矿化膜用于制备骨修复材料、成骨材料或骨材料的应用。
与现有技术相比,本发明的优点在于:
本发明将聚电解质锚定在胶原膜的特定位点上,通过化学交联及表面改性的方式极大地提高了胶原膜的机械强度、耐酶解性能,从而赋予其更好的物理屏障功能和空间维持能力。锚定在胶原膜特定位点上的聚电解质能够模拟天然骨组织中非胶原蛋白与胶原纤维的特异性结合,从而模拟非胶原蛋白稳定超饱和钙磷溶液、提供成核位点、调控晶体取向、并在晶体和胶原之间提供架桥等作用,诱导改性胶原纤维发生自矿化。韧性的胶原膜植入体内后,能够自发地富集体液中的钙、磷离子并逐步诱导纤维内矿化,实现胶原膜从韧性材料向刚性材料的体内转化。这一方式创新性地改革了引导骨再生技术,使GBR膜在植入时保持良好的韧性及塑形性的同时,又能够在植入后通过纤维内矿化增加膜的强度,控制其降解,持续的维持成骨空间。
附图说明
附图是用来提供对本公开的进一步理解,并且构成说明书的一部分,与下面的具体实施方式一起用于解释本公开,但并不构成对本公开的限制。在附图中:
图1为在钙磷超饱和矿化液中矿化情况;图A为扫描电镜图,BG代表实施例1中未矿化胶原GBR膜;HBG代表实施例1中改性自矿化的HPAA-GBR胶原膜;图B为透射电镜图;
图2为在成骨培养液中矿化情况;图A为扫描电镜图;图B为透射电镜图;
图3为不同胶原膜材料的生物相容性对比图;图A为不同胶原膜与骨髓间充质干细胞的生物相容性评价图,图B为不同胶原膜与小鼠成纤维细胞的生物相容性评价图;
图4为不同胶原膜材料的成骨性能对比分析,图A为共培养第3天各组胶原膜对骨髓间充质干细胞体外成骨分化相关成骨基因表达情况;图B为共培养第7天各组胶原膜对骨髓间充质干细胞体外成骨分化相关成骨基因表达情况;图C为共培养第14天各组胶原膜对骨髓间充质干细胞体外成骨分化相关成骨基因表达情况;图D为共培养3、7天后各组胶原膜与对骨髓间充质干细胞体外成骨分化相关成骨蛋白表达情况;图E为共培养3、7天后各组胶原膜与对骨髓间充质干细胞体外成骨分化相关成骨蛋白表达定量情况;图F为第3、7、14天各组胶原膜与对骨髓间充质干细胞体外成骨分化的碱性磷酸酶表达情况;图G为衰减全反射-傅立叶变换红外光谱(ATR-FTIR)连续21天记录材料中磷酸根与酰胺I键的比值,表征矿化;图H为GBR膜(BG)及改性自矿化的HPAA-GBR胶原膜(HBG)的原子力-纳米压痕检测的机械性能对比分析图;图I为细胞在不同材料上培养的伸展情况;
图5为实施例1的不同胶原膜修复小鼠颅骨缺损模型3个月后的体内成骨情况,A图为各组Micro-CT重建图像;B图为各组新生骨矿物密度;C为骨组织体积与组织体积比值;
图6为实施例1的不同胶原膜修复小鼠颅骨缺损模型后的体内矿化情况,GBR胶原膜BG及改性自矿化胶原膜HPAA-GBR胶原膜体内TEM纤维内矿化对比图;
图7为实施例1的不同胶原膜修复小鼠颅骨缺损模型后的机械性能情况,GBR胶原膜BG及改性自矿化胶原膜HPAA-GBR胶原膜体内植入小鼠颅骨缺损修复1周及1月后机械性能对比图;
图8为HPAA-GBR胶原自矿化胶原膜激活体外骨髓间充质干细胞的相关通路变化,该图显示,改性膜可通过激活体外骨髓间充质干细胞HIPPO通路;A-E图中的左图为GBR胶原膜(BG)及HPAA-GBR胶原膜(HBG)与骨髓间充质干细胞共培养7天后的HIPPO通路的活化蛋白免疫荧光结果图,其中DAPI为细胞核染料,Merged为各目的蛋白染料的融合图片;代表蛋白分别为FAK、F-actin、RAP2、RHOA、LATS1蛋白及YAP/TAZ胞核定位情况;A-E图中的右图为FAK、F-actin、RAP2及LATS1蛋白在两种材料上的表达定量图;F图为YAP/TAZ在胞浆及胞核的定量比例结果及RHOA荧光表达定量图;
图9为HPAA-GBR胶原自矿化胶原膜激活体内骨髓间充质干细胞的相关通路变化该图显示,改性膜可通过激活体内骨髓间充质干细胞HIPPO通路;A-E图中的左图为GBR胶原膜(BG)及HPAA-GBR胶原膜(HBG)与颅骨缺损中用Leptin R定位骨髓间充质干细胞后的HIPPO通路的活化蛋白免疫荧光结果图,其中DAPI为细胞核染料,Merged为各目的蛋白染料的融合图片;代表蛋白分别为FAK、F-actin、RAP2、RHOA、LATS1蛋白及YAP/TAZ胞核定位情况;A-E图中的右图为上述蛋白在两种材料上的表达定量图。
具体实施方式
本研究首先利用聚电解质改性GBR胶原膜,通过交联在胶原表面的聚电质HPAA对超饱和磷酸钙溶液的稳定作用,稳定并引导纳米级的磷酸钙无定形液相前体渗透进入胶原纤维内,在纤维内有序沉积并逐步转化为磷灰石晶体,形成了仿生胶原纤维内钙化胶原膜材料。从仿生矿化机制研究领域而言,胶原/聚电解质复合体高度模拟了骨组织中胶原有机质和非胶原蛋白的位置关系和相互作用关系,为体外探讨生物矿化的本质提供了一种更加仿生的模型;从矿化模型向临床应用的转化应用而言,可用以上矿化模式改善目前骨组织再生(GBR)膜应用的空间维持能力和骨诱导能力不足。前期研究发现纤维内仿生矿化技术可以诱导羟基磷灰石晶体在胶原纤维内部沉积,而显著提高其机械性能、耐酶解性和骨传导能力。本课题拟采用聚电解质来改性胶原膜,综合利用引导组织再生理念和纤维内仿生矿化技术形成一种兼具良好的操作性能、屏障功能、空间维持功能和成骨诱导功能的智能化GBR膜,并探索改性胶原发生自矿化的机制及材料机械学信号协同引导骨再生修复的机制,以期实现GBR膜从被动屏障到主动成骨的功能转变这种改性方法,为临床广泛应用的GBR胶原膜赋予了其更好的机械性能及耐酶解性能。
其次,从组织工程支架材料领域而言,我们通过以上方式改性的GBR胶原膜具有自发诱导纤维内矿化作用,解决了非胶原蛋白类似物原位输送困难的问题,为临床骨缺损的修复奠定了理论基础并提供了新方向。本发明不仅在体外矿化液中实现了改性GBR膜的自矿化,同时体现在改性膜在体外构建的培养液中实现自矿化,从而通过膜硬度变化调控干细胞向成骨方向分化;还发现其在小鼠颅骨缺损环境中也能实现自矿化。
最后,本发明进一步通过免疫荧光染色,蛋白质免疫印记反复推导、验证,证明了小鼠骨髓间充质干细胞通过感受自矿化膜的机械力学变化后,HIPPO通路作为参与此过程的机械学信号,从而诱导干细胞向成骨分化的命运。这极大地丰富了生物矿化机制的理论基础。
本发明的自矿化胶原膜材料可采用下述方法制备:
(1)将聚阴离子溶解于聚电解质溶剂中形成浓度为2~10mg/mL的聚电解质溶液,调节聚电解质溶液的pH=6.0;
(2)将化学交联剂溶解于上述聚电解质溶液中,常温下静置1~15min,以使所述聚阴离子上的羧基在交联剂的作用下形成酯活化,调节pH=7.0得到待交联聚电解质溶液;化学交联的方法中所用的交联剂选自1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)中的一种或两种。
(3)将胶原膜置于待交联聚电解质溶液中,常温下反应30min以使聚阴离子上的羧基通过共价键结合的方式牢固交联在GBR胶原膜的胶原分子上;去除胶原膜材料表面游离的聚阴离子,获得表面交联有聚阴离子的具有骨诱导活性的聚电解质改性自矿化胶原膜材料。
本发明的制备方法主要先溶解聚丙烯酸,然后加入交联剂成分进行活化后再在胶原膜上完成交联过程。具体可以为:
预先配置10ml的0.1 M 2-(N-吗啉)乙磺酸(2-(N-morpholino)ethane sulfonicacid,MES,PH=5.5)缓冲液,将本发明所用的聚阴离子为100 mg高分子量聚丙烯酸highmolecular weight polyacrylic acid(HPAA,Mw:450 kDa)放入其中。再用0.1 M的NaOH缓冲液调节溶液pH值至6,向上述溶液中添加123.5mg碳二亚胺盐酸盐(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide,EDC-HCl)和150mg N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide,NHS),磁力搅拌器充分搅拌溶解。静置30 min以使聚丙烯酸分子链上的羧基在EDC-HCl和NHS作用下充分的活化。再用0.1 M的NaOH缓冲液调节溶液PH值至7.0,得到不同分子量的聚丙烯酸交联反应溶液。本发明中提到的GBR胶原膜为Geistlich胶原膜。
传统GBR胶原膜存在机械强度不足,空间维持能力较差,易受体内特异性酶的影响而水解的问题,本发明将聚电解质锚定在胶原膜的特定位点上,通过化学交联及表面改性的方式极大地提高了胶原膜的机械强度、耐酶解性能,从而赋予其更好的物理屏障功能和空间维持能力。
锚定在胶原膜特定位点上的聚电解质能够模拟天然骨组织中非胶原蛋白与胶原纤维的特异性结合,从而模拟非胶原蛋白稳定超饱和钙磷溶液、提供成核位点、调控晶体取向、并在晶体和胶原之间提供架桥等作用,诱导改性胶原纤维发生自矿化。韧性的胶原膜植入体内后,能够自发地富集体液中的钙、磷离子并逐步诱导纤维内矿化,实现胶原膜从韧性材料向刚性材料的体内转化。这一方式创新性地改革了引导骨再生技术,使GBR膜在植入时保持良好的韧性及塑形性的同时,又能够在植入后通过纤维内矿化增加膜的强度,控制其降解,持续的维持成骨空间。
对自矿化胶原膜的机械信号诱导骨缺损修复再生的机制的探讨,为胶原膜的性能的改进提供作用靶点。传统的GBR胶原膜的主要作用在于被动地提供物理屏障,阻止纤维结缔组织进入缺损区,由于没有细胞可识别的位点而缺乏骨传导性和骨诱导性。因此如何实现GBR膜从被动屏障到主动成骨的功能转变,构建功能性膜材料是目前该领域研究的热点问题。本发明通过将非胶原蛋白类似物——高分子量聚电解质锚定在胶原膜的特定位点上,从而赋予其在体内自矿化的能力,改变了胶原膜材料的机械学信号和形貌特征,这种纤维内矿化的胶原膜材料能够提供更加类似天然骨组织的内环境,植入动物体内后可以促进BMSC的粘附、增殖和成骨分化,从而赋予其良好的骨诱导活性,发挥材料在体内促成骨的作用。
探讨机械信号诱导骨缺损修复再生的机制,为通过体外体内联合实验研究材料自身性能与细胞、组织反应间的相关关系提供了很好的模型。
如无特殊说明,以下实施例中所用实验试剂、生物材料均为市售产品。
如无特殊说明,以下实施例中所采用实验方法为现有技术公开方法。
实施例1:
该实施例的聚电解质改性自矿化胶原膜材料构建方法,按照如下步骤:
(1)将高分子量聚阴离子电解质聚丙烯酸(分子量450kDa)溶解于2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液中,具体为0.1M 2-(N-吗啉)乙磺酸(2-(N-morpholino)ethane sulfonicacid,MES,PH=5.5)缓冲液,形成浓度为10mg/mL的聚电解质溶液,用0.1M的NaOH溶液将聚电解质溶液的pH值调至6;
(3)将1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)分别以10mg/mL、15mg/mL的浓度溶解于上述聚电解质溶液中,在磁力搅拌器作用下充分搅拌使其均匀溶解;
(4)常温下静置30min以使上述长链聚阴离子电解质上的羧基在EDC和NHS的作用下形成酯活化;
(5)用低浓度0.1M的NaOH溶液将上述聚电解质溶液的pH值调至7.0,得到聚丙烯酸交联反应液;
(7)将GBR胶原膜从聚电解质溶液中取出,去离子水反复冲洗,每次10min,重复6次。再置于震荡器上震荡20min,以彻底去除材料表面游离的聚电解质分子,最后放在滤纸上干燥后获得聚电解质改性自矿化胶原膜材料。
(8)将上述聚电解质改性自矿化胶原膜材料置于超饱和钙磷液或者成骨诱导培养基中,使胶原纤维在聚电解质的诱导下发生自矿化,每天更换超饱和钙磷液或者成骨诱导培养基。3-7天后将材料取出,蒸馏水反复冲洗后,置于37℃恒温箱中干燥24小时,获得纤维内矿化的胶原膜材料。或者将上述聚电解质改性自矿化胶原膜材料植入小鼠颅骨缺损处,使其在体内诱导自矿化,1周及1个月后将材料取出,蒸馏水反复冲洗后,置于37℃恒温箱中干燥24小时,获得纤维内矿化的胶原膜材料。
(9)使用25kGy的γ-射线对步骤(6)所得的改性GBR胶原膜材料进行灭菌。
将实施例1中的自矿化胶原膜对小鼠骨髓间充质干细胞促成骨作用和对骨缺损修复的实验:
(1)体外钙磷液中自矿化胶原膜的矿化性能检测
将上述聚电解质改性自矿化胶原膜材料置于钙磷液中,使胶原纤维在聚电解质的诱导下发生自矿化,每天更换新鲜的钙磷液。3-7天后将材料取出,蒸馏水反复冲洗后,置于37℃恒温箱中干燥24小时,获得纤维内矿化的胶原膜材料。
检测结果见附图1:
A扫描电镜观察钙磷超饱和溶液体系中第7天BG及HBG的微观形貌:未矿化胶原在扫描电镜下可见明显的特征性横纹结构,同时由于纤维内部缺乏矿物质支撑和制样过程中的脱水,胶原形貌呈现塌陷和萎缩。而HBG组在磷酸钙溶液中矿化7天后,胶原形貌明显更为饱满,断端处可见胶原内部充填了大量板层状矿物质。
B透射电镜观察矿化胶原微观形貌:BG组在单纯磷酸钙溶液中矿化7天后,透射电镜结果显示大量针状的羟基磷灰石晶体附着在胶原表面,胶原内部未见矿物质沉积,仅发生了纤维外的矿化。HBG组纤维在7天后则呈现出重度、广泛的纤维内矿化,高倍下可见晶体沿长轴有序排列。
(2)体外成骨诱导培养基中自矿化胶原膜的矿化性能检测
将上述聚电解质改性自矿化胶原膜材料置于α-MEM培养基中,使胶原纤维在聚电解质的诱导下发生自矿化,每天更换新鲜的α-MEM培养基。3-7天后将材料取出,蒸馏水反复冲洗后,置于37℃恒温箱中干燥24小时,获得纤维内矿化的胶原膜材料。
检测结果见附图2:
A扫描电镜及B透射电镜观察成骨诱导基体系中BG及HBG的微观形貌:BG组未矿化胶原在高倍下可见明显的特征性横纹结构,同时纤维外有明显的矿物质沉积而纤维内没有矿物沉积。而HBG组在成骨诱导基中矿化7天后,胶原形貌明显更为饱满,可见胶原内部充填了矿物质横纹结构消失。
(3)生物相容性试验
采用CCK8法检测自矿化胶原支架对小鼠骨髓间充质干细胞活性以及小鼠成纤维细胞的影响。分别制备直径5mm,厚度2mm的GBR胶原膜(Geistlich)和改性自矿化GBR胶原膜,置于10%α-MEM中孵育2天。直接在材料上接种100μl密度为3×104/mL的细胞悬液;两种细胞与材料分别共培养0天,1天,3天,7天后,加入cck8试剂后37℃培养箱中静置2h后,用酶标仪测量450nm处的吸光度。
检测结果见附图3:
A图是材料与小鼠骨髓间充质干细胞的生物相容性评价检测,B图为材料与小鼠的成纤维细胞的生物相容性检测;生物相容性检测(CCK8)用来分析了改性前后材料对小鼠骨髓间充质干细胞及小鼠成纤维细胞的毒性作用表明:对于BMSCs与非共培养的BMSCs(对照)和与BG共同培养的MSC相比,在整个7天的孵育期中,HBG组的BMSC的增殖更为显著。双因素重复测量方差分析表明,因素“组”和“时间”以及它们之间的相互作用存在显著差异(p<0.001)。除第一天的3组间比较以及第3天的BG和HBG组之间的比较外,对比均具有显著差异(p<0.05)。对于成纤维细胞而言,在整个7天的潜伏期中,与3T3-L1小鼠成纤维细胞(对照)和BG与3T3-L1小鼠成纤维细胞组相比,与HBG共培养3T3-L1小鼠成纤维细胞的增殖没有明显变化。双因素重复测量方差分析表明因素“时间”之间存在显著差异(p<0.05)。从第1天到第7天,所有成对比较均无显著差异(p>0.05)。
(4)体外促成骨特性试验
(4.1)RT-PCR检测成骨相关基因变化:细胞培养同上,于成骨诱导7天后采用Trizol法提取细胞总RNA,Takara反转录体系(DRR036A)获得cDNA,SYBR法(Takara,DRR820A)扩增,ABI7500检测待测基因拷贝数。成骨相关基因包括:I型胶原(Type ICollagen)、骨涎蛋白(BSP)、骨桥蛋白(OPN)。
检测结果见附图4中的A-C:
改性前后的GBR膜与MSC的成骨分化相关的基因表达通过RT-PCR检测可知:从第7天开始,与HBG膜共培养的MSC表现出COL I(I型胶原),BSP(骨唾液蛋白)和OPN(骨桥蛋白)的显著上调,且在第14天的差异最大(p<0.05)。
(4.2)Western blot技术验证相关蛋白的变化:同上细胞与材料共培养后,冰浴条件下用细胞裂解液消化细胞,离心取上清,蛋白定量;配胶,上样,电泳,转膜;封闭3h,加一抗4℃孵育过夜,荧光二抗孵育1h,Odyssey红外成像系统观察拍照;Image Pro Plus 6.0图象分析软件分析结果。检测分子为COLA-1,BSP和OPN。
检测结果见附图4中的D-E:
Western blot实验证实:HBG组表达相关成骨蛋白检测证明细胞与材料经过7天共培养,COL 1,BSP和OPN表达显著上调(p<0.05),与上述基因结果一致。
(4.3)碱性磷酸酶活性检测:同上分别在GBR胶原膜和改性自矿化GBR胶原膜上接种100μl密度为5×105/mL的细胞悬液,在普通培养基中共培养48h后,采用成骨诱导培养基(RAFMX-90021,上海晶旷生物科技有限公司)体外诱导成骨,分别于成骨诱导7及14天后使用ALP染色试剂盒(博士德公司,武汉)检测碱性磷酸酶的活性;
检测结果见附图4中的F:
动态观察BMSs的碱性磷酸酶(ALP)定量结果同样支持上述分子生物学测定的结果。HBG组在第7天和第14天记录的ALP活性显著高于BG组(p<0.05)。
(4.4)利用衰减全反射-傅立叶变换红外光谱(ATR-FTIR)连续21天记录材料中磷酸根与酰胺I键的比值,表征矿化;
检测结果见附图4中的G:
用ATR-FTIR监测了与干细胞培养后,BG及HBG膜21天的矿化进程。从这些红外光谱得出的磷灰石/胶原比例的分析表明:在观测时期的任何时间点,HBG的矿化程度都更高。
(4.5)利用原子力显微镜(AFM)从微观角度检测胶原纤维的杨氏模量;
检测结果见附图4中的H:
与干细胞培养后,脱细胞处理检测材料力学性能采用原子力显微镜(AFM)-纳米压痕检测表明:HBG组的机械性能(杨氏模量)随时间逐渐增加较明显。从第7天开始,HBG的杨氏模量相对于BG组明显更高(p<0.05)。
(4.6)利用扫描电镜(SEM)观察BG与HBG在成骨诱导培养基中与BMSCs共培养后,细胞的形态变化。
检测结果见附图4中的I:
共培养7天后,BMSCs散布良好,并通过多个丝状伪足牢固地粘附在BG和HBG膜上。同时发现与BG膜共培养的MSC是圆形的,而与HBG膜共培养的MSC分布良好并呈纺锤形。
(5)体内促骨形成特性试验
(5.1)在完成小鼠颅骨缺损模型的建立以及GBR胶原膜及改性自矿化HPAA-GBR胶原膜植入修复后,每组小鼠选取12只,在术后的3个月,分别使用micro-CT活体成像技术对其头部进行扫描。小鼠首先使用1%戊巴比妥钠注射麻醉(10ml/公斤用量)。待麻醉完全后,将其固定在扫描装置上,进行CT扫描(精度为10um)。扫描参数:80KeV,500mA。扫描完成后,图片数据通过SiemensInveonAnalyzsis分析软件对其进行数据分析。以直径3.5mm,高2mm为分析区域,确定阈值后,测定新骨形成面积(bonevolume/totalvolume,BV/TV)和骨密度(bonemineraldensity,BMD),观察骨修复情况。
检测结果见附图5:
Micro-CT检测BG及HBG膜材料修复小鼠颅骨缺损(3mm)3个月后的成骨情况,结果显示:在HBG组中,缺损区域形成了完整的骨结构,而BG组的骨密度要明显低于HBG组;阴性空白对照组中的缺损区域内则无明显矿化结构生成。本实验证明HBG组能够完全的修复小鼠颅骨缺损,效果明显优于BG组。
(5.2)通过透射电镜观察胶原修复小鼠颅骨1月后,胶原矿化情况对比。
检测结果见附图6:
透射电镜实验证明:膜的光滑面和粗糙面高度矿化。同时可在粗糙的面确定募集细胞的感知情况以及新形成的胶原蛋白基质在矿化膜上的沉积。这种高度矿化的基质的刚度可能为将募集的细胞分化为骨形成细胞提供了机械提示。大量的原纤维内矿物质掩盖了来自HBG组的矿化胶原纤维中的条带。
(5.3)通过原子力显微镜检测材料植入体内后力学性能变化。
检测结果见附图7:
体内植入的HBG膜的刚度(弹性模量)在1周后大于0.05GPa,在1个月后接近0.1GPa。明显高于BG膜组。从统计学上讲,膜类型(BG与HBG)和收获时间(1周与1个月)对GBR膜的弹性模量的影响均存在显著差异(p<0.01)。这两个因素的相互作用也很显著(p<0.001)。所有成对比较均存在显著差异(p<0.05)。
(6)仿生自矿化GBR胶原膜体内、外促干细胞成骨机制分析
(6.1)仿生自矿化GBR胶原膜体外促干细胞成骨机制分析
将在BG或HBG上培养7天的MSC固定在4%多聚甲醛中,与蛋白封闭的无血清溶液(Invitrogen)孵育,并暴露于一抗,每组6个样本。使用的抗体是YAP/TAZ(1:200,#8418,Cell Signaling Technology),LATS1(1:100,sc-398560,Santa Cruz),RHOA(1:200,ab219371,Abcam),RAP2(1:200,610215,BD Biosciences,),FAK(1:200,MA5-15588,ThermoFisher Scientific)和F-Actin。将细胞固定在抗淬灭固定剂中,并用DAPI染色以进行共聚焦扫描激光显微镜检查。使用Image Pro Plus软件计算积分荧光强度。
检测结果见附图8中的A-F:
免疫荧光染色实验证实:共培养7天共染的YAP/TAZ与Hippo途径分子(FAK,RHOA,F-Actin,RAP2,LATS1)的免疫荧光显示HBG组YAP/TAZ在细胞核内显著增加。在HBG组中,FAK、F-Actin和RHOA的强度也显著增加,而RAP2和LATS1的显著降低(p<0.05)。免疫荧光的结果支持Hippo-YAP/TAZ信号级联参与体外HBG介导的MSCs成骨分化过程。
(6.2)仿生自矿化GBR胶原膜体内促干细胞成骨机制分析
在完成小鼠颅骨缺损模型的建立以及GBR胶原膜及改性自矿化HPAA-GBR胶原膜植入修复后,每组小鼠选取6只,在术后的1周后取颅骨固定,脱钙后冰冻切片,与蛋白封闭的无血清溶液(Invitrogen)孵育,并暴露于一抗。使用的抗体是YAP/TAZ(1:200,#8418,CellSignaling Technology),LATS1(1:100,sc-398560,Santa Cruz),RHOA(1:200,ab219371,Abcam),RAP2(1:200,610215,BD Biosciences,),FAK(1:200,MA5-15588,ThermoFisherScientific),Leptin R(1:200,ab92615,Abcam)和F-Actin。将细胞固定在抗淬灭固定剂中,并用DAPI染色以进行共聚焦扫描激光显微镜检查。使用Image Pro Plus软件计算积分荧光强度。
检测结果见附图9中的A-E:
免疫荧光染色实验证实:共染的Leptin R(标记干细胞)与Hippo途径分子(FAK,RHOA,F-Actin,RAP2,LATS1)的免疫荧光显示HBG组YAP/TAZ在细胞核内显著增加。在HBG组中,FAK、F-Actin和RHOA的强度也显著增加,而RAP2和LATS1的显著降低(p<0.05)。免疫荧光的结果支持Hippo-YAP/TAZ信号级联参与体外HBG介导的MSCs成骨分化过程。
以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式,但是,本公开并不限于上述实施方式中的具体细节,在本公开的技术构思范围内,可以对本公开的技术方案进行多种简单变型,这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是,在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征,在不矛盾的情况下,可以通过任何合适的方式进行组合,为了避免不必要的重复,本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外,本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合,只要其不违背本公开的思想,其同样应当视为本公开所公开的内容。
Claims (10)
1.一种自矿化胶原膜,其特征在于,包括GBR胶原膜,在GBR胶原膜上交联聚阴离子。
2.根据权利要求1所述的自矿化胶原膜,其特征在于,所述的聚阴离子通过羧基交联在GBR胶原膜的胶原分子上。
3.根据权利要求1或2所述的自矿化胶原膜,其特征在于,所述的聚阴离子为聚丙烯酸,分子量为450kDa。
4.根据权利要求1或2所述的自矿化胶原膜,其特征在于,所述自矿化胶原膜通过下述方法制备得到:
(1)浓度为2~10mg/mL的聚阴离子的聚电解质溶液,调节溶液的pH=6.0;
(2)化学交联剂溶解于(1)的溶液中,常温下静置1~15min,调节pH=7.0得到待交联聚电解质溶液;
(3)GBR胶原膜置于(2)的待交联聚电解质溶液中,常温下反应1~15min即得自矿化胶原膜。
5.根据权利要求4所述的自矿化胶原膜,其特征在于,所述化学交联剂选自1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺中的一种或两种。
6.根据权利要求4所述的自矿化胶原膜,其特征在于,所述的聚电解质溶液为0.1M的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液。
7.一种自矿化胶原膜的制备方法,其特征在于,包括:
(1)浓度为2~10mg/mL的聚阴离子的聚电解质溶液,调节溶液的pH=6.0;
(2)化学交联剂溶解于(1)的溶液中,常温下静置1~15min,调节pH=7.0得到待交联聚电解质溶液;
(3)GBR胶原膜置于(2)的待交联聚电解质溶液中,常温下反应1~15min即得自矿化胶原膜。
8.根据权利要求7所述的自矿化胶原膜的制备方法,其特征在于,所述的聚阴离子为聚丙烯酸,分子量为450kDa。
9.根据权利要求7所述的自矿化胶原膜的制备方法,其特征在于,所述化学交联剂选自1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺中的一种或两种;
所述的聚电解质溶液为0.1M的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液。
10.权利要求1-6任一所述的自矿化胶原膜或权利要求7-9任一所述的自矿化胶原膜的制备方法制备得到的自矿化膜用于制备骨修复材料、成骨材料或骨材料的应用。
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