CN101948801A - 一种无血清培养基添加物及其制备方法 - Google Patents

一种无血清培养基添加物及其制备方法 Download PDF

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魏斯溧
高宏
王丽
胡建霞
张学峰
张美荣
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Abstract

本发明涉及一种用于干细胞培养的培养基添加物及其制备方法。该添加物制备成本低廉、价格便宜、原材料丰富，可作为无血清培养基添加物，用于培养干细胞，特别是间充质干细胞。

Description

一种无血清培养基添加物及其制备方法
技术领域
本发明属生物技术领域，具体涉及一种用于干细胞培养的培养基添加物及其制备方法。
技术背景
干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，有望来修复那些被疾病和创伤所破坏的各种各样的细胞和组织，从而为多种慢性疾病的治疗带来希望。干细胞根据细胞来源的不同，可分为胚胎干细胞和成体干细胞两大类。胚胎干细胞具有全能性，可以自我更新并具有分化为体内所有组织的能力。进一步说，胚胎干细胞是一种高度未分化细胞。它具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。成体干细胞是指存在于组织中的未分化细胞，这种细胞能够自我更新并能够分化形成组成该类组织的细胞，包括间充质细胞、造血干细胞、神经干细胞等。成年动物的许多组织和器官，比如表皮和造血系统，具有修复和再生的能力，成体干细胞在其中起着关键的作用。然而与胚胎干细胞不同的是，这种干细胞在培养时生存时间有限制并且只能分化成有限的几种细胞类型。
目前干细胞有几百种之多，而且它们的培养特性也各异，就重复性而言，干细胞培养领域还面临着极大的困难。为干细胞提供一个最佳的培养条件，尤其是保证细胞处于未分化状态或者在需要的时候使细胞向专一的方向分化，是干细胞研究中最大的挑战。
间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cell，MSC)是干细胞的一种，因能分化为间质组织而得名，具备干细胞的两个重要特征，即很强的自我增殖能力和多向分化潜能，在体内外特定环境下，能够分化为骨、软骨、肌肉、脂肪等间质组织，还可以被诱导分化为非间质组织细胞，如神经元、星形胶质细胞等。间充质干细胞广泛分布于胎儿和成体的骨髓、骨膜、松质骨、脂肪、滑膜、骨骼肌、胎肝、乳牙、脐带、脐带血中。
间充质干细胞的培养通常是在有血清的培养基中进行的，血清的成分十分复杂，目前尚未完全弄清。血清中的未知物质和可变因素往往影响研究结果的准确性和重复性，特别是现代应用高纯度基因重组生长因子进行细胞体外调控研究时，需要一个精确度更高的细胞培养体系。
间充质干细胞因其具有高度的自我更新能力和多向分化潜能，以及取材方便、体内植入后不良反应较弱等优点而备受关注，将成为细胞替代治疗的理想种子细胞。现在的有血清培养体系，多是采用胎牛血清等动物血清，动物源血清蛋白进入人体后可引发多种不良反应及疾病，这就为将来间充质干细胞临床移植埋下隐患。
市场上首个针对间充质干细胞的无血清培养基是2008年6月Invitrogen公司推出一种无血清培养基-STEMPRO MSC SFM，专门用于间充质干细胞(MSC)或来源于骨髓的干细胞的培养。但由于其价格昂贵且必须配套使用其公司其他试剂，使得广大干细胞研究者及细胞移植工作者望而却步。
发明内容
为了制备成本低廉、价格便宜、原材料丰富的无血清培养基添加物，用于培养干细胞，特别是间充质干细胞，本发明采用以下技术方案：
1、干细胞无血清培养基添加物的制备
1)将血液充分混匀后在380-400g条件下离心13-15分钟，将上层血浆挤压到另一空白收集袋中。
2)混匀，取样检测血小板密度及红细胞密度、白细胞密度。若红细胞密度＜0.02×1012/L，白细胞密度＜0.3×109/L以及血小板＞250×109/L，在800rpm-1000rpm条件下离心10分钟，以去除红细胞和白细胞。
3)吸取上层血浆层，密封后转入-80℃保存备用。
4)将冰冻的血浆从-80℃冰箱取出迅速置于37℃水浴快速融化，重复冰冻和融化步骤2次。
5)在8000g条件下离心30分钟，去除血小板碎片。吸取上清，得血小板裂解溶液，用孔径0.22um的滤器过滤，即得干细胞无血清培养基添加物。置于-20℃冰箱保存备用。
2干细胞无血清培养基的配制
上述干细胞无血清培养基添加物制备完成后，与DMEM培养基(生物学通用培养基，非发明人自配，购自Gibco公司，美国)配制无血清培养基，无血清培养基添加物的含量为1％-10％(体积比)，配制过程应在符合GMP条件的实验室内完成。配制好的无血清培养基在4℃下保存，须在2周内使用完。
附图说明
图1：间充质干细胞生长状态(A、B、C、D分别为培养第1、2、3、4天，10倍镜下观察结果)
图2：间充质干细胞细胞表面标志检测结果
图3：间充质干细胞向脂肪细胞分化
图4：间充质干细胞向成骨细胞分化
技术效果
1.无血清培养基添加物制备原材料来源于血液，取材及制备方便。
2.用于细胞培养时，使用浓度低，成本低。
3.适用范围广，可用于其他成体干细胞的培养。
4.不含动物血清，所培养的干细胞用于临床治疗时可以避免异种蛋白引起的不良反应。
具体实施方式
1、干细胞无血清培养基添加物的制备
①将血液充分混匀后留取血样检测血小板密度，计算血小板数量I。
②在380g条件下离心13分钟，上层为富含血小板血浆。用血浆分浆夹手工分离富含血小板血浆，将上层血浆挤压到另一空白收集袋中。
③混匀，记录血浆体积数，取样检测血小板密度及红细胞密度、白细胞密度。若红细胞密度＜0.02×1012/L，白细胞密度＜0.3×109/L，血小板＞250×109/L，血浆在800rpm-1000rpm条件下离心10分钟，以去除红细胞和白细胞。
④吸取上层血浆层，取样检测血小板密度，计算血小板数量II。根据血小板数量I、血小板数量II计算血小板回收率(回收率＝血小板数量II/血小板数量I×100％)。留取少量血浆用于病毒检测。
⑤标记样本，封口膜封口后，转入-80℃保存备用。共收集样本25份。
⑥将冰冻的血浆(血小板悬液)从-80℃冰箱取出迅速置于37℃水浴快速融化，重复冰冻和融化步骤2次。
⑦在8000g条件下离心30分钟，去除血小板碎片。吸取上清，得血小板裂解溶液，转入容量为1000ml的无菌瓶中，将获得的10-20份样本进行混合。
⑧将上述获得的血小板裂解溶液用孔径0.22um的滤器过滤(Millipore公司，一次性滤器)，即得到更加纯净的血小板裂解溶液终产品-干细胞无血清培养基添加物。置于-20℃冰箱保存备用。
⑨每一批产品均取少量样本，用于需氧菌、厌氧菌及真菌检测。
2间充质干细胞无血清培养基的配制
上述干细胞无血清培养基添加物制备完成后，与DMEM培养基(生物学通用培养基，非发明人自配，购自Gibco公司，美国)配制无血清培养基，无血清培养基添加物的含量为1％-10％(体积比)，配制过程应在符合GMP条件的实验室内完成。配制好的无血清培养基在4℃下保存，须在2周内使用完。
3间充质干细胞在无血清培养基中的生长状态及特征
将无菌取得的脐带充分洗涤去血渍后，剪碎成约1mm3大小的组织块后在干细胞无血清培养基中种植培养，原代细胞在种植5d(天)后换液，去除未贴壁细胞，细胞已形成散在的细胞集落。细胞呈长的、扁平的梭形，大约7d出现较大的克隆，10d左右细胞生长达80％-90％融合。每100ml培养瓶单层融合的间充质干细胞用胰蛋白酶消化后平均可获得10×105-20×105个细胞。传代培养后，24h(小时)即可贴壁，细胞呈较均一的长梭形，3d左右细胞可铺满整个培养瓶底面，可继续传代扩增。传代后的细胞形态无明显变化，性质稳定，见图1。
流式细胞术检测结果表明，人脐带间充质干细胞阳性表达CD44，CD105，CD29，CD90等细胞黏附分子，而阴性表达造血细胞CD45，CD34等标志物。结果表明从脐带来源的间充质干细胞与骨髓间充质干细胞有相同的细胞表面标志，见图2。
脂肪诱导7d，倒置显微镜下即可见细胞质内脂滴形成，第14d(天)油红o染色呈强阳性(见图3)。
成骨诱导第14d(天)，茜素红染色可见细胞间布满黑色颗粒，颗粒大小不均一，提示有矿化基质沉积(见图4)。
这证实了间充质干细胞在无血清培养基中具有多向分化能力。

Claims (6)

1.一种干细胞无血清培养基添加物的制备方法，其特征包括以下步骤：
1)将血液充分混匀后在380-400g条件下离心13-15分钟，将上层血浆挤压到另一空白收集袋中；
2)混匀，取样检测血小板密度及红细胞密度、白细胞密度，若红细胞密度＜0.02×1012/L，白细胞密度＜0.3×109/L以及血小板＞250×109/L，则在800rpm-1000rpm条件下离心10分钟；
3)吸取上层血浆层，密封后转入-80℃保存；
4)将冰冻的血浆从-80℃冰箱取出迅速置于37℃水浴快速融化，重复冰冻和融化步骤2次；
5)在8000g条件下离心30分钟，吸取上清，得血小板裂解溶液，用孔径0.22um的滤器过滤，即得干细胞无血清培养基添加物。
2.一种如权利要求1所述的方法制备的干细胞无血清培养基添加物。
3.一种干细胞无血清培养基的制备方法，其特征在于：将权利要求2所述的干细胞无血清培养基添加物与DMEM培养基混合配制干细胞无血清培养基，无血清培养基添加物的含量为体积比1％-10％。
4.一种如权利要求3所述的方法制备的干细胞无血清培养基。
5.权利要求2所述的干细胞无血清培养基添加物的用途，其特征在于用于间充质干细胞的培养。
6.权利要求4所述的干细胞无血清培养基的用途，其特征在于用于间充质干细胞的培养。
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