CN108486061A

CN108486061A - 一种贴壁细胞的悬浮培养化方法及其应用

Info

Publication number: CN108486061A
Application number: CN201810218597.5A
Authority: CN
Inventors: 李军涛; 赵金红
Original assignee: Individual
Current assignee: Guangzhou Chuangrui Health Technology Co ltd
Priority date: 2018-03-16
Filing date: 2018-03-16
Publication date: 2018-09-04
Anticipated expiration: 2038-03-16
Also published as: CN108486061B

Abstract

本发明公开了一种贴壁细胞的悬浮培养化方法及其应用。本发明通过将与细胞悬浮化培养相关的转化调控介质类物质在贴壁细胞中进行高表达，得到改造后的贴壁细胞；再用悬浮培养方法培养改造后的贴壁细胞。本发明的发明人发现，将与细胞悬浮化培养相关的转化调控介质类物质在贴壁细胞中进行较高水平表达，得到的改造后的贴壁细胞在悬浮化培养中不易聚团，有利于提高细胞的存活率，从而有利于外源蛋白的表达或病毒疫苗的制备，提高生产效率。因此，本发明提供的悬浮培养化方法特别适合用于生产重组蛋白或病毒疫苗。

Description

一种贴壁细胞的悬浮培养化方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种细胞培养方法，特别涉及一种贴壁细胞的悬浮培养化方法及其应用。

背景技术

悬浮细胞培养主要在一些病毒性抗原大规模生产和特定蛋白表达等场合使用，其特点是细胞扩增培养方法简单，可实现大规模培养，如1吨到10吨生物反应器，细胞生长密度可达到5×10⁷个细胞/ml，并且不使用微载体，使细胞培养成本降低到微载体培养的40-70％。

通常分离的可传代细胞如MDCK、VERO细胞，PK-15等都是贴壁细胞，实现悬浮培养方法可以采用逐渐降低培养基中血清含量，直至实现悬浮化。但是这样适应后获得的细胞株在低血清培养时通常带有聚团性特点，容易在大规模培养时如1吨以上罐培养时出现聚团，细胞团内部由于缺氧而坏死，细胞凋亡，导致细胞培养环境变差，细胞密度不理想，影响后续抗原和蛋白质生产。另外，还有一种无血清培养基悬浮方法，因其成本太高，不适合大规模培养。

因此，急需一种更有利于贴壁细胞生长的悬浮培养化方法。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种贴壁细胞的悬浮培养化方法。

本发明的另一目的在于提供所述贴壁细胞的悬浮培养化方法的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种贴壁细胞的悬浮培养化方法，包括如下步骤：

(1)对贴壁细胞进行改造：将与细胞悬浮化培养相关的转化调控介质类物质在贴壁细胞中进行高表达，得到改造后的贴壁细胞；

(2)悬浮培养：用悬浮培养方法培养改造后的贴壁细胞。

所述的与细胞悬浮化培养相关的转化调控介质类物质指细胞本身所具有的可分泌性蛋白酶，如基质金属蛋白酶(matrix metalloprotein,MMPs)家族，其中优选为MMP1、MMP3和MMP10中的一种或至少两种。

所述的贴壁细胞包括转基因前的动物贴壁细胞或转基因后的动物贴壁细胞。

所述的动物贴壁细胞包括MDCK、VERO细胞和PK-15细胞等。

所述的高表达可通过基因工程上通用的细胞蛋白表达方式，如将编码与细胞悬浮化培养相关的转化调控介质类物质的基因转入细胞中，或是在细胞自身的与细胞悬浮培养相关的蛋白酶类物质的基因上增加增强表达的元件。

所述的将编码与细胞悬浮培养相关的蛋白酶类物质的基因转入细胞中包括将编码与细胞悬浮化培养相关的转化调控介质类物质的基因整合到细胞基因组上的方式和非整合到细胞基因组上的方式。

所述的改造后的贴壁细胞优选通过如下步骤得到：将编码与细胞悬浮化培养相关的转化调控介质类物质的基因克隆入哺乳动物细胞表达载体中，得到重组载体转入贴壁细胞中，用选择压力筛选所需的细胞克隆，得到改造后的贴壁细胞。

所述的哺乳动物细胞表达载体，具备常用的元件如高表达启动子、polyA信号、插入位点、增强子、以及可选的筛选基因、KOZAK序列等实现。

所述的哺乳动物细胞表达载体优选为pCDNA3.1(+)。

所述的悬浮培养方法指的是采用逐渐降低培养基中血清含量，直至实现悬浮化的培养方法；优选为包括如下步骤的方法：

A、用胰酶溶液消化贴壁细胞；

B、去除胰酶溶液；

C、在消化后的细胞中加入培养基，得到细胞悬液；

D、将细胞悬液加入到悬浮培养装置中，留下足够的空间以便进行气体交换，进行悬浮培养。

步骤A中所述的胰酶溶液优选为含0.05(w/v)％胰酶、0.53mM EDTA-4Na的溶液。

步骤B中所述的去除胰酶溶液优选为通过离心方式去除。

步骤C中所述的培养基优选为含浓度为0.1～5(w/w)％血清，10～100mg/LMgCl₂的培养基；更优选为含浓度为0.1～5(w/w)％血清的DMEM培养基。

所述的血清的浓度优选为0.1～2(w/w)％。

所述的血清优选为小牛血清或胎牛血清。

步骤D中所述的悬浮培养装置优选为转瓶或搅拌瓶。

当所述的悬浮培养装置为转瓶时，优选于37℃潮湿空气，含5～10％CO₂、转速为125～135rpm的条件下进行培养。

当所述的悬浮培养装置为转瓶时，优选于37℃潮湿空气，含5～10％CO₂、搅拌机速度为75～95rpm的条件下进行培养。

所述贴壁细胞的悬浮培养化方法在生产重组蛋白或病毒疫苗中的应用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明发明人发现，将与细胞悬浮培养相关的蛋白酶类物质在贴壁细胞中进行较高水平表达，得到的改造后的贴壁细胞在悬浮化培养中不易聚团，有利于提高细胞的存活率，从而有利于外源蛋白的表达或病毒疫苗的制备，提高生产效率。

附图说明

图1是PCR产物切胶回收时照片图；其中，泳道M为1kb DNA Marker、泳道1为HMMPPCR扩增产物(1434bp)。

图2是阳性克隆筛选的琼脂糖凝胶电泳照片图；其中，泳道M1为1kb DNAMarker，泳道1为PHMMP质粒，泳道2为PHMMP质粒酶切后的产物，泳道M2为DL2000 DNA Marker。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

一、人mmp3基因克隆：

(1)合成引物如下：

引物PHMMPF3：5’-TCGACCACCATGAAGAGTCTTCCAATCCT-3’；

引物PHMMPR3：5’-TCAACAATTAAGCCAGCTGT-3’。

(2)模板cDNA制备

I、总RNA抽提

A、在人外周血中加入白细胞分离液，以1500rpm的转速离心收集人血白细胞，加入1ml Trizol(Invitrogen)溶液，吹打混匀，使细胞充分裂解，静置5min；

B、加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置15min；

C、4℃下，10,000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase free EP管；

D、沉淀RNA：加入0.5ml异丙醇，轻柔地充分混匀，室温静置10min；

E、4℃下，10,000g离心10min，收集RNA沉淀，去上清；

F、用75％乙醇洗涤两次，超净台风干；

G、加入15～50μl DEPC水溶解沉淀。

II、总RNA纯度和完整性检测

A、纯度检测：取1μl RNA样品50倍稀释，在Beckman Coulter520UV/VisSpectrophotometer上测定OD值，OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值大于1.8，说明制备的RNA较纯，无蛋白质污染。

B、总RNA完整性检测：取RNA样品1μl，1％琼脂糖凝胶电泳80V×20min，EB染色10min后用凝胶成像系统观察总RNA的5s rRNA，18s rRNA和28s rRNA条带，三条条带完整的话即可证明总RNA抽提比较完整。

III、逆转录

A、在RNase free的PCR管中配制下列溶液：总RNA 0.75μg、无RNase的水补足至12μl。

B、将上述溶液吹打均匀，置65℃保温5min，使RNA变性。随后立即冰上致冷，以防止RNA复性；

C、在该PCR管中加入下列试剂(Promega)：

D、将上述20μl反应溶液30℃保温10min；

E、42℃保温60min；

F、72℃保温10mn。

(3)PCR反应体系

在0.2mL EP管中配制以下体系，cDNA模板原液稀释20倍后取0.5μL扩增PCHMMP：

注：KOD plus neo DNA Polymerase购于ToYoBo公司，货号:KOD 401；

(4)扩增条件

混匀后，置于GeneAmp PCR System 2400型PCR扩增仪扩增。

PCHMMP基因的扩增条件：94℃、3min；98℃、15sec，58℃、15sec、68℃、2min，30个循环；68℃、5min，16℃、保存。

(5)PCR产物回收(DNA凝胶回收试剂盒，DONGSHENG BIOTECH)

1)PCR产物经1％凝胶电泳后，在紫外灯下，用手术刀切取含目的基因片段的凝胶条带至干净1.5mL EP管中，称重后，按100mg凝胶对应100μL溶液BD的比例向离心管中加入溶液BD。

2)60℃水浴10min至凝胶完全溶化，水浴期间振荡混合3次。

3)将溶液转移至DNA纯化柱中，静置2min，室温12 000rpm离心1min，弃滤液。

4)向柱上加入500μL溶液PE，室温12 000rpm离心1min，弃滤液。

5)重复上一操作一次。

6)室温空柱12 000rpm离心1min以彻底去除纯化柱中残留的液体。

7)将柱子置于新的1.5mL EP管上，向柱中央加入30μL 60℃预热的无菌水，13400g离心1min以洗脱出DNA，得到PCHMMP PCR回收产物。

PCR产物通过琼脂糖凝胶回收时的电泳图如图1所示。图1表明，MMP用cDNA模板已扩增出来，大小与预测一致(扩增条带大概在Marker1500的位置)；证明PCHMMP目的基因已扩增出来。

(6)PCR回收产物及载体双酶切

在2个无菌的0.2mL EP反应管，分别取PCHMMP PCR回收产物15μL和pCDNA3.1(+)(Thermofisher)载体各15μL，用BamHI与XhoI双酶切，酶切体系如下：

混匀后，37℃反应3h。

(7)酶切产物回收(DNA凝胶回收试剂盒，DONGSHENG BIOTECH)

1)酶切产物经1％凝胶电泳后，在紫外灯下，用手术刀分别切取含目的片段和载体的凝胶条带至干净的1.5mL EP管中，按100mg凝胶对应100μL溶液BD的比例向离心管中加入溶液BD。

2)60℃水浴10min至凝胶完全溶化，水浴期间振荡混合3次。

4)向柱上加入500μL溶液PE，室温12 000rpm离心1min，弃滤液。

5)重复上一操作一次。

6)空柱12 000rpm离心1min以彻底去除纯化柱中残留的液体。

7)将柱子置于新的1.5mL EP管上，向柱中央加入30μL 60℃预热的无菌水，13400g离心1min以洗脱出DNA。

(8)表达载体构建：

向0.2mL EP管中加入以下试剂(T4 DNA连接酶购于TaKaRa公司，货号：D2011A)，接着16℃连接2h。

(9)连接产物的转化

A、冰浴中将5μL连接产物分别加入至50μL大肠杆菌DH5α感受态细胞(购自TakaraBio)中。轻轻旋转混匀，冰浴30min。

B、42℃水浴热休克90s。

C、快速将管转移至冰浴中，冰浴2min。

D、分别加入200μL LB培养基，混匀，37℃、200rpm振荡培养1h。

E、于超净工作台中，将菌液均匀涂布于含氨苄青霉素(Amp)(100μg/mL)的LB平板上，室温下放置，至液体吸收。

F、倒置平板，转移入37℃生化培养箱过夜培养。

(10)质粒酶切鉴定阳性克隆

1)从平板上挑取若干个单克隆于3mL LB管中摇床过夜培养；

2)质粒提取，(高纯质粒小量提取试剂盒，G-SHUN)

A、用1.5mL EP管收集3μL菌液，12 000rpm离心1min，去上清。

B、加入250μL溶液I/RNase A混合液，重悬菌体。

C、加入250μL溶液II，温和反复颠倒混匀6次，室温放置2min。

D、加入350μL溶液III，温和反复颠倒混匀6次。

E、12 000rpm离心10min，小心吸去上清至DNA纯化柱中，静置2min。

F、12 000rpm离心1min，弃滤液。

G、加入500μL溶液PB至柱中，12 000rpm离心1min，弃滤液。

H、加入500μL溶液W至柱中，12 000rpm离心1min，弃滤液。重复一次。

I、空柱12 000rpm离心3min。

J、将柱取出置于新的1.5mL EP管中，加入50μL无菌水(60℃预热)，静置2min，13400rpm离心1min以洗脱出质粒。

3)酶切鉴定所提取质粒

酶切反应体系如下：

37℃酶切2h。

酶切产物以含溴化乙锭(EB)的1％琼脂糖凝胶电泳分离，UVP凝胶成像系统成像。

结果如图2所示，图2表明已成功获得阳性克隆。将该克隆进行测序，结果如下所示，显示获得MMP3编码基因。

ATGAAGAGTCTTCCAATCCTACTGTTGCTGTGCGTGGCAGTTTGCTCAGCCTATCCATTGGATGGAGCTGCAAGGGGTGAGGACACCAGCATGAACCTTGTTCAGAAATATCTAGAAAACTACTACGACCTCAAAAAAGATGTGAAACAGTTTGTTAGGAGAAAGGACAGTGGTCCTGTTGTTAAAAAAATCCGAGAAATGCAGAAGTTCCTTGGATTGGAGGTGACGGGGAAGCTGGACTCCGACACTCTGGAGGTGATGCGCAAGCCCAGGTGTGGAGTTCCTGATGTTGGTCACTTCAGAACCTTTCCTGGCATCCCGAAGTGGAGGAAAACCCACCTTACATACAGGATTGTGAATTATACACCAGATTTGCCAAAAGATGCTGTTGATTCTGCTGTTGAGAAAGCTCTGAAAGTCTGGGAAGAGGTGACTCCACTCACATTCTCCAGGCTGTATGAAGGAGAGGCTGATATAATGATCTCTTTTGCAGTTAGAGAACATGGAGACTTTTACCCTTTTGATGGACCTGGAAATGTTTTGGCCCATGCCTATGCCCCTGGGCCAGGGATTAATGGAGATGCCCACTTTGATGATGATGAACAATGGACAAAGGATACAACAGGGACCAATTTATTTCTCGTTGCTGCTCATGAAATTGGCCACTCCCTGGGTCTCTTTCACTCAGCCAACACTGAAGCTTTGATGTACCCACTCTATCACTCACTCACAGACCTGACTCGGTTCCGCCTGTCTCAAGATGATATAAATGGCATTCAGTCCCTCTATGGACCTCCCCCTGACTCCCCTGAGACCCCCCTGGTACCCACGGAACCTGTCCCTCCAGAACCTGGGACGCCAGCCAACTGTGATCCTGCTTTGTCCTTTGATGCTGTCAGCACTCTGAGGGGAGAAATCCTGATCTTTAAAGACAGGCACTTTTGGCGCAAATCCCTCAGGAAGCTTGAACCTGAATTGCATTTGATCTCTTCATTTTGGCCATCTCTTCCTTCAGGCGTGGATGCCGCATATGAAGTTACTAGCAAGGACCTCGTTTTCATTTTTAAAGGAAATCAATTCTGGGCTATCAGAGGAAATGAGGTACGAGCTGGATACCCAAGAGGCATCCACACCCTAGGTTTCCCTCCAACCGTGAGGAAAATCGATGCAGCCATTTCTGATAAGGAAAAGAACAAAACATATTTCTTTGTAGAGGACAAATACTGGAGATTTGATGAGAAGAGAAATTCCATGGAGCCAGGCTTTCCCAAGCAAATAGCTGAAGACTTTCCAGGGATTGACTCAAAGATTGATGCTGTTTTTGAAGAATTTGGGTTCTTTTATTTCTTTACTGGATCTTCACAGTTGGAGTTTGACCCAAATGCAAAGAAAGTGACACACACTTTGAAGAGTAACAGCTGGCTTAATTGTTGA。

二、转染MDCK细胞

1、转染前一天接种MDCK细胞(ATCC CCL-34)于6孔板，(0.5～2)×10⁵个细胞/孔，无抗生素DMEM培养基(含10％胎牛血清)2ml/孔，第二天转染时细胞丰度达到90-95％。

2、转染前半小时换MEM无血清培养基1.5ml，使用脂质体法进行转染。

①转染液的配制(1孔的量)：A液：5μg DNA加入245μl MEM无血清培养基，轻轻混匀；B液：脂质体使用前轻轻混匀，10μl脂质体加入245μl MEM无血清培养基，轻轻混匀，室温静止5min。B液加入A液，用移液器轻轻混匀，室温静止20min，得到转染液。

②将转染液均匀分散慢慢滴加到6孔板细胞中，边滴加边前后左右十字交叉摇晃。孵箱37℃培养4h后加入2mL完全培养基培养恢复。

③孵箱37℃培养48h。同时设立细胞对照组，空白转染组(即按步骤①配制转染液，但是不含DNA)。

3、筛选阳性克隆

①用浓度为0.25％的胰酶溶液消化细胞并传入96孔细胞培养板；细胞计数，每孔加2×10⁴个细胞；

②加入含G418(700μg/mL)的F12完全培养基(即含10％FBS的F12完全培养基)培养进行筛选；

③15天后换液，含G418的F12完全培养基；

④一个月后获得具有G418抗性的单克隆细胞株，经过细胞形态学观察和生长速度实验，选择与未转染的MDCK细胞形态无区别、且生长速率基本相同的单克隆细胞株，将其命名为PHMMP-MDCK细胞。

同时，以pCDNA3.1(+)空载体作为对照，按上面的步骤，获得pCDNA-MDCK细胞。

三、悬浮培养

1、T25瓶中倒出培养基，并用3ml无钙镁D-PBS冲洗(5ml-T75)。此时细胞丰度应为50～80％，以确保细胞处于快速分裂期。

2、倒掉PBS，加入3ml EDTA-胰酶(0.05％胰酶，0.53mM EDTA-4Na)，轻摇并倒掉大多数，留一小部分能覆盖细胞单层的液体。在显微镜下观察细胞，当细胞变圆，拍击细胞瓶使细胞脱落。

3、加6ml DMEM培养基到细胞悬液中，离心100×g，4min，稀释的胰酶和上清一块吸出。

4、倒掉上清并重复步骤3。

5、倒掉上清并重悬细胞到5ml DMEM培养基中。计数活细胞。

6、计算出5×10⁵活细胞/ml对应的体积，加入适当的含体积百分比5％小牛血清的DMEM培养基。

7、细胞悬到一个灭菌的转瓶或搅拌瓶中，留下足够的空以便进行气体交换(如：100ml培养基放到250ml转瓶中，或者75～100ml放到250ml摇瓶中)。

8、拧松盖子以进行气体交换，放置37℃于潮湿空气，含5～10％CO₂。设置搅拌机速度为75～95rpm，摇瓶速度为125～135rpm。

9、每天确认活细胞密度，建立悬浮培养生长动力学曲线。

10、当活细胞密度达到1×10⁶个细胞/ml(或在接种后第4天)，把细胞按5×10⁵个细胞/ml传代。所用的培养基在每次传代时，小牛血清浓度依次降低。

11、一旦第3天细胞密度达到至少1×10⁶个细胞/ml，并且活细胞率高于90％，细胞可认为是适应了悬浮培养。接种密度可降低到2×10⁵～3×10⁵个细胞/ml。继续用含浓度为0.1％小牛血清的DMEM培养3d。

按上述步骤，对PHMMP-MDCK细胞、pCDNA-MDCK细胞、未转染的MDCK细胞进行悬浮培养。

四、悬浮培养效果

(1)经20×光学显微镜下计数，未转染的MDCK细胞细胞团比例(3个以上细胞)为31％，pcDNA3.1-MDCK细胞细胞团比例35％，PHMMP-MDCK细胞细胞团比例为3％。

(2)PHMMP-MDCK细胞在血清浓度为2％以下时，就呈现悬浮状态。

实施例2

操作步骤大体与实施例1相同，区别仅在于：所用的细胞株为VERO细胞(ATCC-81)，克隆人的MMP10基因，重组到pcDNA3.1(+)载体上。

其中，所用的引物序列如下：

引物PHMMPF10：5’-CTGGCTAGCCACCATGGAGCCACTGGCCATCCT-3’；

引物PHMMPR10：5’-AGACTCGAGTCAGCAGAGGAGCCAGCTGT-3’。

阳性克隆的MMP10基因的测序序列如下：

ATGGAGCCACTGGCCATCCTGGTGCTTCTGTGCCTGCCAGTCTCTTCAGCATATCCTCTGCATGGAGCAGTGAGGCAAGACCACCCAAGCATGGATCTTGCTCAGCAATATCTAGAAAAGTACTACAACTTTGAAAAAAATGAGAAACAAGTATTTAGAAGAAAGGACAGTAGTCCCATTGTCAAAAAAATCCAAGAAATGCAGAAGTTCCTCGGGCTGGAGGTGACAGGGAGGCTGGACTCCAGCACTATGGATGTGATGCTCAAGCCCAGGTGTGGCGTCCCCGATGTCGGTGGCTTCACCACCTTTCCAGGTTCACCAAAGTGGAGGGAAACAAACCTCACCTACAGGATTGTGAATTATACACCAGATTTACCGAAAGAGAGTGTGGACTCTGCTATTGAGAAAGCACTGAAAGTCTGGGAAGAGGTGACCCCACTCACATTCTCCAGGCGCTCTGAAGGAGAGGCTGACATAATGATCTCCTTCGCAGCTGGAGAACATGGAGACTTTTACCCTTTTGATGGACCAGGACAGAGTCTGGCTCATGCCTACCCACCTGGGCCTGGATTTTATGGAGATGTTCACTTCGATGATGATGAGAAATGGACACTTGGACCATCAGGGACCAACTTATTCCTGGTTGCAGCTCATGAGCTTGGCCACTCCCTGGGACTCTTTCACTCAGACAAAAAAGAAGCTCTGATGTACCCCGTCTACAGGTTGTCCACCAGCCCGGCACAGTTCCAGCTTTCTCAAGATGATATAGATGGCATTCAGTCCCTCTATGGACCACATCCGTCCTCTGATGCCACAGTGGTACCCATGTCCTCTGTCTCTCCAAGACCTGAGACCCCAGCCAAGTGTGATCCTGCTTTGTCCTTTGATGCAGTCAGCACCCTGCGAGGGGAACTGCTGTTCTTTAAAGACAGGTACTTTTGGCGCATATCCCGCTGGAATCCTGAGCCTGAAGTCAATTTGATTTCGGCATTTTGGCCCTCTCTTCCTTCACACTTAGATGCTGCCTATGAAGCTCATAGCAGAGATAGCGTTTTCATTTTTAAAGGAAATCAGTTCTGGGCAGTCCGAGGAAATGAGGTCCAAGCAGGTTATCCAAAAGCACTTCACACTCTGGGTTTCCCTCCCACTGTGAAGAAGATCGATGCAGCTGTTAGTGATAAGGAGAAGAAGACCACGTACTTCTTTGTTGAGGACAAATACTGGAGATTTGACGAGAAAAGACGTCTTATGGATAAAGGCTTCCCCAGGCTGATAAAAGATGACTTTCCAGGAATCGAGCCACAAATTGATGCGGTGTTGCAGGCATTTGGGTTTTTTTATTTCTTCCATGGATCATCACAGTTTGAGTTTGACCCCAATGCCAGGACGGTGACACACACCCTGAAGAGTAACAGCTGGCTCCTCTGCTGA。

悬浮培养效果如下：

(1)经20×光学显微镜下计数，未转染的VERO细胞细胞团比例(3个以上细胞)为45％，pcDNA3.1-VERO细胞细胞团比例42％，PHMMP-VERO细胞细胞团比例为12％。

(2)PHMMP-VERO细胞在血清浓度为2％以下时，就呈现悬浮状态。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 李军涛

赵金红

<120> 一种贴壁细胞的悬浮培养化方法及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物PHMMPF3

<400> 1

tcgaccacca tgaagagtct tccaatcct 29

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物PHMMPR3

<400> 2

tcaacaatta agccagctgt 20

<210> 3

<211> 1434

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<220>

<223> MMP3编码基因

<400> 3

atgaagagtc ttccaatcct actgttgctg tgcgtggcag tttgctcagc ctatccattg 60

gatggagctg caaggggtga ggacaccagc atgaaccttg ttcagaaata tctagaaaac 120

tactacgacc tcaaaaaaga tgtgaaacag tttgttagga gaaaggacag tggtcctgtt 180

gttaaaaaaa tccgagaaat gcagaagttc cttggattgg aggtgacggg gaagctggac 240

tccgacactc tggaggtgat gcgcaagccc aggtgtggag ttcctgatgt tggtcacttc 300

agaacctttc ctggcatccc gaagtggagg aaaacccacc ttacatacag gattgtgaat 360

tatacaccag atttgccaaa agatgctgtt gattctgctg ttgagaaagc tctgaaagtc 420

tgggaagagg tgactccact cacattctcc aggctgtatg aaggagaggc tgatataatg 480

atctcttttg cagttagaga acatggagac ttttaccctt ttgatggacc tggaaatgtt 540

ttggcccatg cctatgcccc tgggccaggg attaatggag atgcccactt tgatgatgat 600

gaacaatgga caaaggatac aacagggacc aatttatttc tcgttgctgc tcatgaaatt 660

ggccactccc tgggtctctt tcactcagcc aacactgaag ctttgatgta cccactctat 720

cactcactca cagacctgac tcggttccgc ctgtctcaag atgatataaa tggcattcag 780

tccctctatg gacctccccc tgactcccct gagacccccc tggtacccac ggaacctgtc 840

cctccagaac ctgggacgcc agccaactgt gatcctgctt tgtcctttga tgctgtcagc 900

actctgaggg gagaaatcct gatctttaaa gacaggcact tttggcgcaa atccctcagg 960

aagcttgaac ctgaattgca tttgatctct tcattttggc catctcttcc ttcaggcgtg 1020

gatgccgcat atgaagttac tagcaaggac ctcgttttca tttttaaagg aaatcaattc 1080

tgggctatca gaggaaatga ggtacgagct ggatacccaa gaggcatcca caccctaggt 1140

ttccctccaa ccgtgaggaa aatcgatgca gccatttctg ataaggaaaa gaacaaaaca 1200

tatttctttg tagaggacaa atactggaga tttgatgaga agagaaattc catggagcca 1260

ggctttccca agcaaatagc tgaagacttt ccagggattg actcaaagat tgatgctgtt 1320

tttgaagaat ttgggttctt ttatttcttt actggatctt cacagttgga gtttgaccca 1380

aatgcaaaga aagtgacaca cactttgaag agtaacagct ggcttaattg ttga 1434

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物PHMMPF10

<400> 4

ctggctagcc accatggagc cactggccat cct 33

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物PHMMPR10

<400> 5

agactcgagt cagcagagga gccagctgt 29

<210> 6

<211> 1431

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<220>

<223> MMP10基因

<400> 6

atggagccac tggccatcct ggtgcttctg tgcctgccag tctcttcagc atatcctctg 60

catggagcag tgaggcaaga ccacccaagc atggatcttg ctcagcaata tctagaaaag 120

tactacaact ttgaaaaaaa tgagaaacaa gtatttagaa gaaaggacag tagtcccatt 180

gtcaaaaaaa tccaagaaat gcagaagttc ctcgggctgg aggtgacagg gaggctggac 240

tccagcacta tggatgtgat gctcaagccc aggtgtggcg tccccgatgt cggtggcttc 300

accacctttc caggttcacc aaagtggagg gaaacaaacc tcacctacag gattgtgaat 360

tatacaccag atttaccgaa agagagtgtg gactctgcta ttgagaaagc actgaaagtc 420

tgggaagagg tgaccccact cacattctcc aggcgctctg aaggagaggc tgacataatg 480

atctccttcg cagctggaga acatggagac ttttaccctt ttgatggacc aggacagagt 540

ctggctcatg cctacccacc tgggcctgga ttttatggag atgttcactt cgatgatgat 600

gagaaatgga cacttggacc atcagggacc aacttattcc tggttgcagc tcatgagctt 660

ggccactccc tgggactctt tcactcagac aaaaaagaag ctctgatgta ccccgtctac 720

aggttgtcca ccagcccggc acagttccag ctttctcaag atgatataga tggcattcag 780

tccctctatg gaccacatcc gtcctctgat gccacagtgg tacccatgtc ctctgtctct 840

ccaagacctg agaccccagc caagtgtgat cctgctttgt cctttgatgc agtcagcacc 900

ctgcgagggg aactgctgtt ctttaaagac aggtactttt ggcgcatatc ccgctggaat 960

cctgagcctg aagtcaattt gatttcggca ttttggccct ctcttccttc acacttagat 1020

gctgcctatg aagctcatag cagagatagc gttttcattt ttaaaggaaa tcagttctgg 1080

gcagtccgag gaaatgaggt ccaagcaggt tatccaaaag cacttcacac tctgggtttc 1140

cctcccactg tgaagaagat cgatgcagct gttagtgata aggagaagaa gaccacgtac 1200

ttctttgttg aggacaaata ctggagattt gacgagaaaa gacgtcttat ggataaaggc 1260

ttccccaggc tgataaaaga tgactttcca ggaatcgagc cacaaattga tgcggtgttg 1320

caggcatttg ggttttttta tttcttccat ggatcatcac agtttgagtt tgaccccaat 1380

gccaggacgg tgacacacac cctgaagagt aacagctggc tcctctgctg a 1431

Claims

1.一种贴壁细胞的悬浮培养化方法，其特征在于包括如下步骤：

(2)悬浮培养：用悬浮培养方法培养改造后的贴壁细胞。

2.根据权利要求1所述的贴壁细胞的悬浮培养化方法，其特征在于：所述的与细胞悬浮化培养相关的转化调控介质类物质为基质金属蛋白酶。

3.根据权利要求2所述的贴壁细胞的悬浮培养化方法，其特征在于：所述的基质金属蛋白酶为MMP1、MMP3和MMP10中的一种或至少两种。

4.根据权利要求1所述的贴壁细胞的悬浮培养化方法，其特征在于：所述的贴壁细胞为转基因前的动物贴壁细胞或转基因后的动物贴壁细胞。

5.根据权利要求4所述的贴壁细胞的悬浮培养化方法，其特征在于：所述的动物贴壁细胞为MDCK、VERO细胞或PK-15细胞。

6.根据权利要求1所述的贴壁细胞的悬浮培养化方法，其特征在于：所述的高表达是将编码与细胞悬浮化培养相关的转化调控介质类物质的基因转入细胞中，或是在细胞自身的与细胞悬浮化培养相关的转化调控介质类物质的基因上增加增强表达的元件。

7.根据权利要求1所述的贴壁细胞的悬浮培养化方法，其特征在于：所述的改造后的贴壁细胞通过如下步骤得到：将编码与细胞悬浮化培养相关的转化调控介质类物质的基因克隆入哺乳动物细胞表达载体中，得到重组载体转入贴壁细胞中，用选择压力筛选所需的细胞克隆，得到改造后的贴壁细胞。

8.根据权利要求1所述的贴壁细胞的悬浮培养化方法，其特征在于：所述的悬浮培养方法包括如下步骤：

A、用胰酶溶液消化贴壁细胞；

B、去除胰酶溶液；

C、在消化后的细胞中加入培养基，得到细胞悬液；

9.根据权利要求1所述的贴壁细胞的悬浮培养化方法，其特征在于：

步骤A中所述的胰酶溶液为含0.05(w/v)％胰酶、0.53mM EDTA-4Na的溶液；

步骤C中所述的培养基的基础培养基为含Mg²⁺的培养基；

步骤D中所述的悬浮培养装置为转瓶或搅拌瓶。

10.权利要求1～9任一项所述贴壁细胞的悬浮培养化方法在生产重组蛋白或病毒疫苗中的应用。