CN108715892A - 一种珍稀物种dna信息获取方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种珍稀物种DNA信息获取方法，属于包含酶或微生物的测定或检测方法技术领域。获得华南虎的组织后，纯化DNA，并使DNA发生随机片段化，将DNA进行分离、回收，将回收的DNA进行加A催化反应，并与T‑载体进行连接反应，对连接产物进行转化，筛选出阳性菌落，过夜培养，进行质粒回收，测序，并进行特异性引物设计、合成，再次实施PCR及对PCR产物进行测序，并与引物设计时使用的序列进行比对，如果一致就表明该DNA片段的确是目标物种的DNA。将本申请应用于珍稀物种的DNA信息获取，具有操作简便、获取率高、成本低廉等优点。

Description

一种珍稀物种DNA信息获取方法
技术领域
本申请涉及一种珍稀物种DNA信息获取方法，属于包含酶或微生物的测定或检测方法技术领域。
背景技术
华南虎（Panthera tigris Amoyensis）是我国特有的虎的亚种，于1981年被列入CITES公约附录Ⅰ保护名单，亦称“中国虎”，目前认为已在自然界中灭绝，仅在几个有限的动物园中圈养供游客观赏。世界上有很多此类的濒危动物。随着组学研究技术的发展，获取任何生物的DNA信息并非难事，只是成本太高，在没有一定前期工作基础的情况下，难以获得任何级别的经费支持。因此，如何在经费有限的情况下获得一些DNA信息并开展一些工作，为今后争取国家经费做好前期工作，打下良好基础就显得尤为重要。
基于此，做出本申请。
发明内容
针对现有珍稀动物DNA获取所存在的上述缺陷，本申请提供一种操作便捷、获取率高、成本低廉的珍稀物种DNA信息获取方法。
为实现上述目的，本申请采取的技术方案如下：
一种珍稀物种DNA信息获取方法，包括以下步骤：（1）取对应物种的组织，以酚/氯仿提取法纯化DNA，并对DNA样品进行涡旋震荡处理，使DNA发生随机性片段化；（2）对DNA片段进行分离，回收特定分子量的DNA，对回收得到的DNA进行Taq DNA聚合酶催化反应；（3）对催化产物进行T-载体进行连接反应；（4）对连接产物进行转化；（5）对转化获得的菌落进行阳性菌落筛选，选出阳性菌落；（6）对筛选出来的阳性菌落进行过夜培养、质粒回收，对DNA片段进行测序，并进行特异性引物设计；（7）以步骤（1）中纯化得到的DNA为模板，以步骤（6）中得到的引物实施PCR并对PCR产物再次测序，并与步骤（6）中的DNA测序进行比较，两者一致，即可确认其为对应物种的DNA。
进一步的，作为优选：
步骤（1）中，所述涡旋震荡处理采用间歇方式，其振荡频率为50HZ，每次震荡的时长为2s，两个震荡周期之间的间隔时间为2 s。
步骤（2）中，DNA分离采用琼脂糖凝胶电泳，更优选的，回收的DNA分子量为500-1000 bp。
步骤（3）中，T-载体与目的基因片段的摩尔质量比在1:2-8。
步骤（4）中，转化的具体操作为：将大肠杆菌Top 10感受态细胞与连接产物冰浴，然后升温热处理，再冰浴；随后加入预热至设定温度的LB培养液，恒温振荡培养后涂布于蓝白班筛选用的LB琼脂培养基上，当转化液全部被吸收后，将琼脂盘倒置并恒温培养，即可。更优选的，所述LB琼脂培养基含100 μg/mL 氨苄青霉素，40μg/mL X-gal以及24μg/mLIPTG。
步骤（5）中，所述阳性菌落筛选方法为：将白色单菌落悬浮于LB液体培养基中，使用T-载体上、下游通用引物实施PCR，PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳检测，选出符合标准的菌落即为阳性菌落；其中上、下游通用引物分别为M13F：5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'、M13R：5'-AGCGGATAACAA TTTCACACAGGA-3'。更优选的，所述阳性菌落的判定标准为：PCR产物比500-1 000 bp长出134 bp的菌落判定为阳性菌落。
步骤（7）中，PCR程序为：95℃变性/20 s，58℃退火/20 s，72℃延伸反应/ 30 s，40个循环。
本申请的工作原理和有益效果分析如下：
（1）在上述方案中，将待处理珍稀物种的组织进行DNA随机片段化，是信息获取的第一个关键点，首先对组织进行提取并纯化获取DNA样品，然后再对该DNA样品进行随机片段化，对DNA样品进行间歇性的涡旋振荡处理，使DNA发生随机片段化，利用DNA具有刚性的特点，当受剪切力的作用时，DNA双螺旋结构易断裂形成片段。
（2）凝胶回收的DNA进行聚合酶催化反应，是本申请DNA信息获取的第二个关键点。Taq DNA聚合酶催化反应对DNA进行处理，不仅可单独使PCR产物的3′-末端添加一个碱基A，还可以使黏性末端亦或是随机断裂的非规则性的DNA末端按照碱基互补原则补齐的同时，在3′-末端也加一个碱基A，本申请将Taq DNA聚合酶应用在DNA的获取过程中，不仅实现了聚合酶理论知识与产品的进一步拓展和应用，还实现了任何非PCR产物的DNA片段在3′-末端也加一个碱基A，使其TA克隆成为可能。
（3）阳性菌落的确认是本申请的第三个关键点。以上述方法催化连接形成的产物在转化时，会产生至少两种颜色的菌落：蓝色或白色；阳性菌落呈白色，但是白色菌落中所含有的重组质粒中，其基因片段是否为目的基因仍需菌落PCR进行筛选。本申请以获取的PCR产物与回收的DNA分子量进行比对，从而确认为目的基因的阳性菌落，方法简便，结果直接，确认精确。
附图说明
图1为本申请的流程示意图。
具体实施方式
本实施例以华南虎为例，尝试了如下的方法，并获得了成功。
（1）获得华南虎的组织后，通过酚/氯仿抽提法纯化DNA，对DNA样品进行间歇性的涡旋振荡处理20 s，使DNA发生随机片段化。
（2）通过0.8%的琼脂糖凝胶电泳（在100 mL 1×TAE缓冲液中加入0.8 g琼脂糖，用微波炉加热使其完全融化，待温度降到50℃前后时加入微量溴化乙锭混匀，倒入制胶模具中）将DNA进行分离，将分子量介于500-1 000bp的DNA进行回收。具体方法如下：
准备离心管称重，在紫外灯下切割含有DNA样品的胶放入离心管中称重，算出胶的质量，然后按照DNA凝胶回收试剂盒说明纯化DNA，最终将DNA溶于26μL纯水中。
（3）将凝胶回收的DNA进行加A反应处理。
TaqDNA聚合酶催化反应的一个特点就是在PCR产物的3′-末端添加一个碱基A。不仅仅如此，Taq能够使任何DNA，不仅使平末端DNA的3′-末端加上一个A，还可以使黏性末端亦或是随机断裂的非规则性的DNA末端按照碱基互补原则补齐同时在3′-末端加一个碱基A。具体操作如下：
在回收的DNA样品26 μL中，加入Taq PCR试剂盒中的10×缓冲液3 μL，dNTPs 0.8 μL，Taq 0.2 μL，混匀后，72℃处理10 min。
（4）将加A处理的DNA样品与T-载体进行连接反应（使用T-载体连接试剂盒），具体操作如下：
在0.5 mL离心管中加纯水5 μL，10×Buffer 1 μL，T-载体1.0 μL，T4 连接酶1.0 μL，加A处理的DNA样品2 μL（载体与目的基因片段的摩尔质量比在1:5左右），充分混匀后16 ℃过夜孵育。
（5）对连接产物进行转化，具体操作如下：
将装有40 μL大肠杆菌Top 10感受态细胞的离心管置于冰上，加入2 μL连接产物冰浴30 min，然后42℃热处理90 s，再冰浴2 min。随后加入37℃预热的LB培养液200 μL并将所有溶液转移至10 mL离心管中，37℃恒温振荡培养45 min后涂布于蓝白班筛选用的LB琼脂培养基上（含100 μg/mL 氨苄青霉素，40μg/mL X-gal，24μg/mL IPTG）。在转化液全部被吸收后，将琼脂盘倒置于37℃恒温培养箱培养15 h。
（6）菌落PCR进行阳性菌落筛选。转化成功的菌落呈蓝色或白色，阳性菌落呈白色，但其中含有的重组质粒中的基因片段是否为目的基因需菌落PCR进行筛选。具体操作如下：
将白色单菌落悬浮于10 μL LB液体培养基中，取0.5 μL作为菌落PCR的模板，使用T-载体上、下游通用引物（M13F：5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'、M13R：5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3'）实施PCR。PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳检测，将PCR产物比500-1 000 bp长出134 bp的菌落判定为阳性菌落。
（7）对阳性菌落进行LB过夜培养。具体操作如下：
从确定为阳性菌落的悬浮液中取菌液1μL接种于2 mL LB液体培养基中（含100 μg/mL氨苄青霉素）37℃恒温振荡培养15 h。
（8）质粒回收。具体操作遵从质粒回收试剂盒说明书实施即可。
（9）将阳性克隆委托公司进行DNA测序。
（10）对DNA测序结果通过NCBI的Blast功能进行同源性分析。
（11）根据已获得的DNA序列进行特异性引物设计，并委托公司合成。
（12）使用步骤（1）中纯化的DNA为模板和步骤（12）中的引物实施PCR。具体操作如下：
PCR反应体系为30μL，其中10×Buffer：3μL，10 mmol/L dNTPS 1.5μL，12中设计的上、下游引物各1.5μL，1中纯化的DNA 0.2μL，Taq 0.3μL（5 U/μL），加纯水至30 μL。
PCR程序：95℃变性/20 s，58℃退火/20 s，72℃延伸反应/ 30 s，40个循环。
（14）委托公司对PCR产物进行测序，并与引物设计时使用的序列进行比对，如果一致就表明该DNA片段的确是华南虎的DNA。
以上内容是结合本发明创造的优选实施方式对所提供技术方案所作的进一步详细说明，不能认定本发明创造具体实施只局限于上述这些说明，对于本发明创造所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明创造的保护范围。

Claims (10)

1.一种珍稀物种DNA信息获取方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）取对应物种的组织，以酚/氯仿提取法纯化DNA，并对DNA样品进行涡旋震荡处理，使DNA发生随机性片段化；（2）对DNA片段进行分离，回收特定分子量的DNA，对回收得到的DNA进行TaqDNA聚合酶催化反应；（3）对催化产物进行T-载体连接反应；（4）对连接产物进行转化；（5）对转化获得的菌落进行阳性菌落筛选，选出阳性菌落；（6）对筛选出来的阳性菌落进行过夜培养、质粒回收，对DNA片段进行测序，并进行特异性引物设计；（7）以步骤（1）中纯化得到的DNA为模板，以步骤（6）中得到的引物实施PCR以及对PCR产物再次测序，并与步骤（6）中的DNA测序进行比较，两者一致，即可确认其为对应物种的DNA。
2.如权利要求1所述的一种珍稀物种DNA信息获取方法，其特征在于：步骤（1）中，所述涡旋震荡处理采用间歇方式，其振荡频率为50HZ，每次震荡的时长为2 s，两个震荡周期之间的间隔时间为2 s，重复10次。
3.如权利要求1所述的一种珍稀物种DNA信息获取方法，其特征在于：步骤（2）中，DNA分离采用琼脂糖凝胶电泳。
4.如权利要求3所述的一种珍稀物种DNA信息获取方法，其特征在于：所述回收的DNA分子量为500-1 000 bp。
5.如权利要求1所述的一种珍稀物种DNA信息获取方法，其特征在于：步骤（3）中，T-载体与目的基因片段的摩尔质量比在1:2-8。
6.如权利要求1所述的一种珍稀物种DNA信息获取方法，其特征在于，步骤（4）中，转化的具体操作为：将大肠杆菌Top 10感受态细胞与连接产物冰浴，然后升温热处理，再冰浴；随后加入预热至设定温度的LB培养液，恒温振荡培养后涂布于蓝白班筛选用的LB琼脂培养基上，当转化液全部被吸收后，将琼脂盘倒置并恒温培养，即可。
7.如权利要求6所述的一种珍稀物种DNA信息获取方法，其特征在于：所述LB琼脂培养基含100 μg/mL 氨苄青霉素，40μg/mL X-gal以及24μg/mL IPTG。
8.如权利要求1所述的一种珍稀物种DNA信息获取方法，其特征在于，步骤（5）中，所述阳性菌落筛选方法为：将白色单菌落悬浮于LB液体培养基中，使用T-载体上、下游通用引物实施PCR，PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳检测，选出符合标准的菌落即为阳性菌落；其中上、下游通用引物分别为M13F：5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'、M13R：5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3'。
9.如权利要求1所述的一种珍稀物种DNA信息获取方法，其特征在于，所述阳性菌落的判定标准为：PCR产物比500-1 000 bp长出134 bp的菌落判定为阳性菌落。
10.如权利要求1所述的一种珍稀物种DNA信息获取方法，其特征在于，步骤（7）中，PCR程序为：95℃变性/20 s，58℃退火/20 s，72℃延伸反应/ 30 s，40 个循环。
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