CN102498129A - 使用bv8拮抗剂或g-csf拮抗剂抑制肿瘤转移 - Google Patents

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Abstract

总体而言，本发明涉及对血管发生和肿瘤转移的抑制。具体而言，本发明关注使用G-CSF拮抗剂，诸如G-CSF抗体和Bv8拮抗剂，诸如抗Bv8抗体和抗PKR1抗体来预防或治疗肿瘤转移。

Description

使用BV8拮抗剂或G-CSF拮抗剂抑制肿瘤转移
相关申请
本申请是依据37 CFR 1.53(b)(1)提交的非临时申请，依据35 USC 119(e)要求2009年7月31日提交的临时申请No.61/230,571和2010年6月2日提交的临时申请No.61/350,558的优先权，通过述及将其内容收入本文。
发明领域
一般而言，本发明涉及可用于治疗与血管发生和肿瘤转移有关的状况和疾病的组合物和方法。具体而言，本发明关注使用G-CSF拮抗剂和/或Bv8拮抗剂来预防或治疗肿瘤转移。
发明背景
完全确立了血管发生在肿瘤进展和转移中发挥重要作用，而且抗血管发生代表一种经过临床验证的抗癌策略(Folkman，Nat Med 1，27-31(1995)；Ferrara and Kerbel，Nature 438，967-974(2005)；Carmeliet，Nat Med 9，653-660(2003))。
在过去几年里，各种骨髓(BM)衍生细胞类型对肿瘤血管发生的贡献成为深入调查的对象(Coussens and Werb，Nature 420，860-867(2002)；Rafii et al.，Nat Rev Cancer 2：826-35(2002)；De Palma et al.，Trends Immunol 28：519-524(2007)；Shojaei et al.，Trends Cell Biol 18：372-378 2008))。在这些细胞类型中，CD11b+Gr1+细胞在肿瘤中及在携带肿瘤的动物的外周血(PB)中频繁增多，而且显示出促进肿瘤血管发生(Yang et al.，Cancer Cell 6，409-421(2004))及遏制免疫功能，因此命名为髓样衍生抑制细胞(MDSC)(Bronte et al.，Blood96：3838-3846(200))。然而，负责外周动员、肿瘤归巢、和CD11b+Gr1+细胞获取促血管发生特性的启动机制仍然有待阐明。
CD11b+Gr1+细胞生成数种血管发生因子，包括Bv8，即一种先前表征为特定内皮细胞类型的丝裂原、造血祖细胞的生长因子(LeCouter et al.，ProcNatl Acad Sci USA 100，2685-2690(2003)；LeCouter et al.，Proc Natl Acad SciUSA 101，16813-16818(2004))、和神经调质(Cheng et al.，Nature 417，405-410(2002)；Matsumoto et al.，Proc Natl Acad Sci USA 103：4140-4145(2006))的分泌蛋白。对数种异种移植物以及转基因癌症模型(RIP-Tag)的分析提示Bv8经由提高髓样细胞的外周动员和血管发生的局部刺激来促进肿瘤血管发生(Shojaei et al.，Nature 450：825-831(2007)；Shojaei et al.，Proc Natl Acad SciUSA 105：2640-2645(2008))。报告了粒细胞集落刺激因子(G-CSF)在体外及在体内都是Bv8表达的一种强诱导物(Shojaei et al.，Proc Natl Acad Sci USA106(16)：6742-7(2009))。在生理学上，G-CSF在造血干细胞、祖细胞、和成熟细胞，特别是嗜中性细胞动员入血液循环中具有重要作用(Rapoport et al.，Blood Rev 6：43-57(1992)；Lieschke et al.，Blood 84：1737-1746(1994))。G-CSF也是祖细胞分化成粒细胞谱系的细胞，诸如嗜中性细胞、嗜曙红细胞和嗜碱性细胞必需的。虽然少数报告提出G-CSF施用增强肿瘤血管发生和生长(Natori et.al.，Biochem Biophys Res Commun 297：1058-1061(2002)；Okazaki，T.et al.，Int Immunol 18，1-9(2006))，但是暗示肿瘤发生中此因子的证据远非决定性的。
转移是一系列复杂的步骤，其中癌细胞离开初始肿瘤部位并经血流或淋巴系统迁移至身体的其它部分。转移性肿瘤在癌症晚期中是非常常见的。转移是实体瘤所致死亡的一个主要原因。不幸地，当前可得的治疗选项很少能够治愈转移性癌症。
如此，需要发现和了解如何能有效抑制、预防和治疗血管发生和肿瘤转移进展。本发明解决这些和其它需要，正如在阅读下述公开内容后会显然的。
发明概述
本发明至少部分基于G-CSF和Bv8涉及血管发生和肿瘤转移的发现。
在一个方面，本发明提供抑制或降低肿瘤转移的方法，包括对受试者施用有效量的G-CSF拮抗剂。在某些实施方案中，所述方法进一步包括对所述受试者施用有效量的Bv8拮抗剂。在某些实施方案中，所述G-CSF拮抗剂抑制或降低原发性肿瘤扩散至所述受试者的转移前器官(pre-metastatic organ)。在某些实施方案中，降低肿瘤转移包括缩小肺转移的大小或减少肺转移的数目。在某些实施方案中，抑制或降低肿瘤转移包括降低一种或多种下述分子的表达水平：G-CSF，Bv8，PKR1，MMP-9，S100A8或S100A9。在某些实施方案中，抑制或降低肿瘤转移包括降低G-CSF和PKR1的表达水平。在某些实施方案中，抑制或降低肿瘤转移包括降低MMP-9、S100A8和S100A9的表达水平。在某些实施方案中，抑制或降低肿瘤转移包括降低Bv8、MMP-9、S100A8和S100A9的表达水平。在某些实施方案中，抑制或降低肿瘤转移包括降低G-CSF、Bv8和PKR1的表达水平。在某些实施方案中，所述表达水平是mRNA表达水平。在某些实施方案中，所述表达水平是蛋白质表达水平。在某些实施方案中，所述受试者的转移前器官中一种或多种这些分子的表达水平降低。在某些实施方案中，所述转移前器官是肺。在某些实施方案中，所述转移前器官是肝。
在某些实施方案中，所述方法进一步包括对所述受试者施用有效量的VEGF拮抗剂。在某些实施方案中，所述受试者先前已经用VEGF拮抗剂治疗过。在某些实施方案中，所述VEGF拮抗剂是抗VEGF抗体或其片段。在某些实施方案中，所述抗VEGF抗体是贝伐单抗(bevacizumab)或其片段或变体。在某些实施方案中，所述方法进一步包括对所述受试者施用有效量的化疗剂。
在一个方面，本发明提供降低转移前器官中G-CSF、Bv8、PKR1、MMP-9、S100A8或S100A9的表达水平的方法，包括对受试者施用有效量的G-CSF拮抗剂和/或Bv8拮抗剂。在另一个方面，本发明提供降低转移前器官中一种或多种下述分子的表达水平的方法：G-CSF，Bv8，PKR1，MMP-9，S100A8或S100A9，包括对受试者施用有效量的G-CSF拮抗剂和/或Bv8拮抗剂。在某些实施方案中，当将G-CSF拮抗剂施用于所述受试者时，所述受试者的转移前器官中PKR1、MMP-9、S100A8和/或S100A9的表达水平降低。在某些实施方案中，当将Bv8拮抗剂施用于所述受试者时，所述受试者的转移前器官中PKR1、MMP-9、S100A8和/或S100A9的表达水平降低。在某些实施方案中，当将G-CSF拮抗剂施用于所述受试者时，所述受试者的转移前器官中Bv8、MMP-9、S100A8和/或S100A9的表达水平降低。在某些实施方案中，当将Bv8拮抗剂施用于所述受试者时，所述受试者的转移前器官中Bv8、MMP-9、S100A8和/或S100A9的表达水平降低。在某些实施方案中，当将G-CSF拮抗剂施用于所述受试者时，所述受试者的转移前器官中MMP-9、S100A8和S100A9的表达水平降低。在某些实施方案中，当将Bv8拮抗剂施用于所述受试者时，所述受试者的转移前器官中MMP-9、S100A8和S100A9的表达水平降低。在某些实施方案中，当将G-CSF拮抗剂施用于所述受试者时，所述受试者的转移前器官中G-CSF和PKR1的表达水平降低。在某些实施方案中，当将G-CSF拮抗剂施用于所述受试者时，所述受试者的转移前器官中G-CSF、PKR1和MMP-9的表达水平降低。
在一个方面，本发明提供抑制转移性肿瘤细胞迁移至转移前器官的方法，包括对受试者施用有效量的G-CSF拮抗剂或Bv8拮抗剂。在另一个方面，本发明提供抑制嗜中性细胞迁移至转移前器官的方法，包括对受试者施用有效量的G-CSF拮抗剂或Bv8拮抗剂。在某些实施方案中，所述方法包括对所述受试者施用有效量的G-CSF拮抗剂和有效量的Bv8拮抗剂。
在某些实施方案中，所述受试者的转移前器官是肺、肝、脑、骨或淋巴结。在某些实施方案中，所述受试者的转移前器官是肺或肝。在某些实施方案中，所述受试者的转移前器官是肺。
在某些实施方案中，所述G-CSF拮抗剂是抗G-CSF抗体。在某些实施方案中，所述抗G-CSF抗体是单克隆抗体。在某些实施方案中，所述抗G-CSF抗体是人源化抗体。在某些实施方案中，所述抗G-CSF抗体是人抗体。
在某些实施方案中，所述Bv8拮抗剂是抗Bv8抗体。在某些实施方案中，所述Bv8拮抗剂是抗PKR1抗体。在某些实施方案中，所述抗Bv8抗体或抗PKR1抗体是单克隆抗体。在某些实施方案中，所述抗Bv8抗体或抗PKR1抗体是人源化抗体。在某些实施方案中，所述抗Bv8抗体或抗PKR1抗体是人抗体。
在另一个方面，本发明提供预测受试者中的肿瘤是否会有效响应G-CSF拮抗剂和/或Bv8拮抗剂的治疗的方法，包括确定来自所述受试者的样品是否包含以大于参照样品中的表达水平的水平表达Bv8、PKR1和/或G-CSF的细胞，其中检测到所述细胞指示所述受试者具有会有效响应所述G-CSF拮抗剂和/或Bv8拮抗剂的治疗的肿瘤。在某些实施方案中，检测到以大于参照样品中的表达水平的水平表达Bv8、PKR1和G-CSF的细胞指示所述受试者具有会有效响应所述G-CSF拮抗剂和/或Bv8拮抗剂的治疗的肿瘤细胞。在某些实施方案中，测量Bv8、PKR1和/或G-CSF的mRNA表达水平。在某些实施方案中，测量Bv8、PKR1和/或G-CSF的蛋白质表达水平。在某些实施方案中，所述肿瘤是转移性肿瘤。
在另一个方面，本发明提供预测受试者中的肿瘤是否会有效响应G-CSF拮抗剂和/或Bv8拮抗剂的治疗的方法，包括确定来自所述受试者的样品是否包含以大于参照样品中的表达水平的水平表达Bv8的CD11b+Gr1+细胞的功能性人对应物，其中检测到所述CD11b+Gr1+细胞的功能性人对应物指示所述受试者具有会有效响应所述G-CSF拮抗剂和/或Bv8拮抗剂的治疗的肿瘤。在某些实施方案中，测量Bv8的mRNA表达水平。在某些实施方案中，测量Bv8的蛋白质表达水平。在某些实施方案中，所述人对应物细胞是人未成熟髓样细胞。在某些实施方案中，所述人对应物细胞是人髓样衍生抑制细胞。在某些实施方案中，所述人对应物细胞是人嗜中性细胞、单核细胞或巨噬细胞的前体。在某些实施方案中，所述人对应物细胞是人嗜中性细胞、单核细胞或巨噬细胞。在某些实施方案中，所述肿瘤是转移性肿瘤。
在又一个方面，本发明提供预测受试者中的肿瘤是否会有效响应G-CSF拮抗剂和/或Bv8拮抗剂的治疗的方法，包括确定来自所述受试者的样品是否具有与参照样品相比增多的或升高的CD11b+Gr1+细胞的功能性人对应物的数目或频率，其中增多的或升高的CD11b+Gr1+细胞的功能性人对应物的数目或频率指示所述受试者具有会有效响应所述G-CSF拮抗剂和/或Bv8拮抗剂的治疗的肿瘤。在某些实施方案中，所述人对应物细胞是人未成熟髓样细胞。在某些实施方案中，所述人对应物细胞是人髓样衍生抑制细胞。在某些实施方案中，所述人对应物细胞是人嗜中性细胞、单核细胞或巨噬细胞的前体。在某些实施方案中，所述人对应物细胞是嗜中性细胞、单核细胞或巨噬细胞。在某些实施方案中，所述肿瘤是转移性肿瘤。
在一个方面，本发明提供用G-CSF拮抗剂和/或Bv8拮抗剂治疗受试者中的肿瘤的方法，包括(a)确定来自所述受试者的样品是否包含以大于参照样品中的表达水平的水平表达Bv8、PKR1和/或G-CSF的细胞，并(b)如果所述样品包含以大于参照样品中的表达水平的水平表达Bv8、PKR1和/或G-CSF的细胞的话，对所述受试者施用有效量的所述G-CSF拮抗剂和/或Bv8拮抗剂。在某些实施方案中，所述细胞是CD11b+Gr1+细胞的功能性人对应物。在某些实施方案中，所述人对应物细胞是人未成熟髓样细胞。在某些实施方案中，所述人对应物细胞是人髓样衍生抑制细胞。在某些实施方案中，所述人对应物细胞是人嗜中性细胞、单核细胞或巨噬细胞的前体。在某些实施方案中，所述人对应物细胞是嗜中性细胞、单核细胞或巨噬细胞。在某些实施方案中，所述细胞是转移性肿瘤细胞。在某些实施方案中，所述细胞来自所述受试者的转移前器官。在某些实施方案中，如果所述样品包含以大于参照样品中的表达水平的水平表达Bv8、PKR1和G-CSF的细胞的话，将有效量的所述G-CSF拮抗剂和/或Bv8拮抗剂施用于所述受试者。
在某些实施方案中，测量Bv8、PKR1和/或G-CSF的mRNA表达水平。在某些实施方案中，测量Bv8、PKR1和/或G-CSF的蛋白质表达水平。
在另一个方面，本发明提供用G-CSF拮抗剂和/或Bv8拮抗剂治疗受试者中的肿瘤的方法，包括(a)确定来自所述受试者的样品是否具有与参照样品相比增多的或升高的CD11b+Gr1+细胞的功能性人对应物的数目或频率，并(b)如果所述样品具有与参照样品相比增多的或升高的CD11b+Gr1+细胞的功能性人对应物的数目或频率的话，对所述受试者施用有效量的所述G-CSF拮抗剂和/或Bv8拮抗剂。在某些实施方案中，所述人对应物细胞是人未成熟髓样细胞。在某些实施方案中，所述人对应物细胞是人髓样衍生抑制细胞。在某些实施方案中，所述人对应物细胞是人嗜中性细胞、单核细胞或巨噬细胞的前体。在某些实施方案中，所述人对应物细胞是嗜中性细胞、单核细胞或巨噬细胞。在某些实施方案中，所述肿瘤是转移性肿瘤。
在另一个方面，本发明提供治疗肿瘤的方法，包括(a)对携带肿瘤的受试者施用有效量的G-CSF拮抗剂，并(b)通过相对于治疗前自所述受试者获得的样品中CD11b+Gr1+细胞的功能性人对应物的数目或频率，测定治疗后自所述受试者获得的样品中CD11b+Gr1+细胞的功能性人对应物的数目或频率来监测所述治疗的功效，其中治疗后自所述受试者获得的样品中CD11b+Gr1+细胞的功能性人对应物的数目或频率增多或升高指示所述治疗是有效的。在某些实施方案中，所述人对应物细胞是人未成熟髓样细胞。在某些实施方案中，所述人对应物细胞是人髓样衍生抑制细胞。在某些实施方案中，所述人对应物细胞是人嗜中性细胞、单核细胞或巨噬细胞的前体。在某些实施方案中，所述人对应物细胞是嗜中性细胞、单核细胞或巨噬细胞。在某些实施方案中，所述肿瘤是转移性肿瘤。
在另一个方面，本发明提供治疗肿瘤的方法，包括(a)对携带肿瘤的受试者施用有效量的G-CSF拮抗剂和/或Bv8拮抗剂，并(b)通过相对于治疗前自所述受试者获得的样品中Bv8、MMP-9、S100A8或S100A9的表达水平，测定治疗前自所述受试者获得的样品中Bv8、MMP-9、S100A8或S100A9的表达水平来监测所述治疗的功效，其中治疗后自所述受试者获得的样品中Bv8、MMP-9、S100A8或S100A9的表达水平降低指示所述治疗是有效的。
在某些实施方案中，治疗后自所述受试者获得的样品中下述四种分子(Bv8，MMP-9，S100A8和S100A9)中至少两种的表达水平与治疗前自所述受试者获得的样品相比降低。在某些实施方案中，治疗后自所述受试者获得的样品中下述四种分子(Bv8，MMP-9，S100A8和S100A9)中至少三种的表达水平与治疗前自所述受试者获得的样品相比降低。在某些实施方案中，测量Bv8、MMP-9、S100A8和/或S100A9的mRNA表达水平。在某些实施方案中，测量Bv8、MMP-9、S100A8和/或S100A9的蛋白质表达水平。在某些实施方案中，所述肿瘤是转移性肿瘤。
在某些实施方案中，转移前肺和/或转移肺中Bv8、MMP-9、S100A8和/或S100A9的mRNA表达水平升高。在某些实施方案中，转移前肺和/或转移肺中Bv8、MMP-9、S100A8和/或S100A9的蛋白质表达水平升高。在某些实施方案中，转移前组织或肿瘤组织中Bv8、MMP-9、S100A8和/或S100A9的mRNA表达水平升高。在某些实施方案中，转移前组织或肿瘤组织中Bv8、MMP-9、S100A8和/或S100A9的蛋白质表达水平升高。在某些实施方案中，如果Bv8和/或MMP-9的mRNA表达水平在用抗Bv8抗体治疗后降低的话，抗Bv8抗体的治疗是有效的。在某些实施方案中，抗Bv8抗体的治疗降低转移前肺中Bv8和/或MMP-9的mRNA表达水平。在某些实施方案中，如果Bv8和/或MMP-9的蛋白质表达水平在用抗Bv8抗体治疗后降低的话，抗Bv8抗体的治疗是有效的。在某些实施方案中，抗Bv8抗体的治疗降低转移前肺中Bv8和/或MMP-9的蛋白质表达水平。在某些实施方案中，如果Bv8和/或MMP-9的mRNA表达水平在用抗G-CSF抗体治疗后降低的话，抗G-CSF抗体的治疗是有效的。在某些实施方案中，抗G-CSF抗体的治疗降低转移前肺和/或转移肺中Bv8和/或MMP-9的mRNA表达水平。在某些实施方案中，如果Bv8和/或MMP-9的蛋白质表达水平在用抗G-CSF抗体治疗后降低的话，抗G-CSF抗体的治疗是有效的。在某些实施方案中，抗G-CSF抗体的治疗降低转移前肺和/或转移肺中Bv8和/或MMP-9的蛋白质表达水平。在某些实施方案中，如果Bv8和/或MMP-9的mRNA表达水平在用抗PKR1抗体治疗后降低的话，抗PKR1抗体的治疗是有效的。在某些实施方案中，抗PKR1抗体的治疗降低转移前肺和/或转移肺中Bv8和/或MMP-9的mRNA表达水平。在某些实施方案中，如果Bv8和/或MMP-9的蛋白质表达水平在用抗PKR1抗体治疗后降低的话，抗PKR1抗体的治疗是有效的。在某些实施方案中，抗PKR1抗体的治疗降低转移前肺和/或转移肺中Bv8和/或MMP--9的蛋白质表达水平。
在某些实施方案中，所述肿瘤是转移性肿瘤。在某些实施方案中，G-CSF拮抗剂和/或Bv8拮抗剂的治疗预防转移性肿瘤转移至身体中别处的转移前组织或转移前器官。在某些实施方案中，所述来自受试者的样品是组织、血浆、血清、或其任何组合。在某些实施方案中，这些方法中使用的样品来自转移前或转移器官。在某些实施方案中，所述转移前或转移器官是肺、肝、脑、骨、淋巴结或卵巢。在某些实施方案中，所述样品来自转移前或转移组织。在某些实施方案中，所述转移前或转移组织来自受试者的肺、肝、脑、卵巢、淋巴结、骨或骨髓。在某些实施方案中，所述样品是来自转移前器官的组织样品。在某些实施方案中，如果所述样品来自转移前器官或转移前组织的话，所述样品不含有任何肿瘤细胞。在某些实施方案中，所述样品是原发性肿瘤组织。
在某些实施方案中，使用qRT-PCR或qPCR来测量基因的mRNA表达水平。在某些实施方案中，使用微阵列来测量mRNA表达水平。在某些实施方案中，使用ISH(原位杂交)来测量mRNA表达水平。在某些实施方案中，使用IHC测定法来测量基因的蛋白质表达水平。
在另一个方面，本发明提供抑制CD11b+Gr1+细胞的功能性人对应物自骨髓动员至转移前或转移器官的方法，包括对受试者施用有效量的G-CSF拮抗剂和/或Bv8拮抗剂。在某些实施方案中，所述人对应物细胞是人未成熟髓样细胞。在某些实施方案中，所述人对应物细胞是人髓样衍生抑制细胞。在某些实施方案中，所述人对应物细胞是人嗜中性细胞、单核细胞或巨噬细胞的前体。在某些实施方案中，所述人对应物细胞是嗜中性细胞、单核细胞或巨噬细胞。
在一个方面，本发明提供在抗癌疗法复发或不应的受试者中治疗肿瘤的方法，包括对受试者施用有效量的G-CSF拮抗剂。在某些实施方案中，所述抗癌疗法包括VEGF拮抗剂。在某些实施方案中，所述VEGF拮抗剂是抗VEGF抗体或其片段。在某些实施方案中，所述抗VEGF抗体是贝伐单抗或其片段或变体。
在一个方面，本发明提供在受试者中治疗良性、癌前、或非转移性癌症的方法，包括对所述受试者施用有效量的G-CSF拮抗剂和/或Bv8拮抗剂。在某些实施方案中，施用G-CSF拮抗剂和/或Bv8拮抗剂预防良性、癌前、或非转移性癌症变成侵入性或转移性癌症。在某些实施方案中，所述良性、癌前、或非转移性癌症是0期、I期、或II期癌症。在某些实施方案中，施用G-CSF拮抗剂和/或Bv8拮抗剂预防良性、癌前或非转移性癌症进展成III期或IV期癌症。在某些实施方案中，施用G-CSF拮抗剂和/或Bv8拮抗剂缩小肿瘤大小。
在另一个方面，本发明提供治疗具有可手术癌症的受试者的方法，包括对所述受试者施用有效量的G-CSF拮抗剂和/或Bv8拮抗剂并实施手术，由此将所述癌症切除。在某些实施方案中，G-CSF拮抗剂和/或Bv8拮抗剂在手术前施用于受试者。在某些实施方案中，所述方法进一步包括在手术后对所述受试者施用有效量的G-CSF拮抗剂和/或Bv8拮抗剂的步骤以预防癌症复发。在某些实施方案中，施用G-CSF拮抗剂和/或Bv8拮抗剂预防微转移增殖。
在另一个方面，本发明提供在具有可手术癌症的受试者中新辅助疗法的方法，包括对所述受试者施用G-CSF拮抗剂和/或Bv8拮抗剂。
在另一个方面，本发明提供在受试者预防癌症复发的方法，包括对所述受试者施用G-CSF拮抗剂和/或Bv8拮抗剂，其中所述施用在所述受试者预防癌症复发。在又一个方面，本发明提供在受试者降低癌症复发风险的方法，包括对所述受试者施用G-CSF拮抗剂和/或Bv8拮抗剂，其中所述施用在所述受试者中降低癌症复发风险。在某些实施方案中，施用G-CSF拮抗剂和/或Bv8拮抗剂预防临床可检测肿瘤复发或其转移或降低临床可检测肿瘤复发或其转移的风险。在某些实施方案中，所述受试者在施用G-CSF拮抗剂和/或Bv8拮抗剂之前接受确定性手术。
在另一个方面，本发明提供在受试者中预防肿瘤再生长的方法，包括清除肿瘤和其后对受试者施用G-CSF拮抗剂和/或Bv8拮抗剂的步骤。在又一个方面，本发明提供在具有肿瘤的受试者中预防癌症复发的方法，包括清除肿瘤和其后对受试者施用G-CSF拮抗剂和/或Bv8拮抗剂的步骤。在某些实施方案中，所述方法进一步包括清除肿瘤和施用G-CSF拮抗剂和/或Bv8拮抗剂之间的一段时间，其中所述时间段对于手术切口完全愈合或降低伤口开裂的风险是足够的。
在某些实施方案中，施用的G-CSF拮抗剂是抗G-CSF抗体或其片段。在某些实施方案中，施用的Bv8拮抗剂是抗Bv8抗体或其片段。在某些实施方案中，施用的Bv8拮抗剂是抗PKR1抗体或其片段。
在某些实施方案中，本发明的拮抗剂和抗体序贯施用。在某些实施方案中，本发明的拮抗剂和抗体并行施用。
在一个方面，本发明提供抑制肺转移、肝转移、脑转移、卵巢转移、淋巴结转移和/或骨转移的方法，包括对受试者施用有效量的抗G-CSF抗体和/或抗Bv8抗体。在另一个方面，本发明提供抑制肺转移的方法，包括对受试者使用有效量的抗G-CSF抗体，其中所述抗G-CSF抗体抑制肿瘤转移至转移前肺。在另一个方面，本发明提供抑制肺转移的方法，包括对受试者使用有效量的抗Bv8抗体，其中所述抗Bv8抗体抑制肿瘤转移至转移前肺(pre-metastatic lung)。在另一个方面，本发明提供抑制肺转移的方法，包括对受试者使用有效量的抗PKR1抗体，其中所述抗PKR1抗体抑制肿瘤转移至转移前肺。在另一个方面，本发明提供抑制肺转移的方法，包括对受试者使用有效量的抗G-CSF抗体和有效量的抗Bv8抗体。在另一个方面，本发明提供抑制肺转移的方法，包括对受试者使用有效量的抗G-CSF抗体和有效量的抗PKR1抗体。在另一个方面，本发明提供抑制肺转移的方法，包括对受试者使用有效量的抗Bv8抗体和有效量的抗PKR1抗体。
在另一个方面，本发明提供抑制肝转移的方法，包括对受试者施用有效量的抗G-CSF抗体，其中所述抗G-CSF抗体抑制肿瘤转移至转移前肝(pre-metastatic liver)。在另一个方面，本发明提供抑制肝转移的方法，包括对受试者施用有效量的抗Bv8抗体，其中所述抗Bv8抗体抑制肿瘤转移至转移前肝。在另一个方面，本发明提供抑制肝转移的方法，包括对受试者施用有效量的抗PKR1抗体，其中所述抗PKR1抗体抑制肿瘤转移至转移前肝。
在某些实施方案中，所述抗体或抗体片段可以是嵌合的、人源化的或人的。
在某些实施方案中，本发明的方法进一步包括对所述受试者施用有效量的VEGF拮抗剂。在某些实施方案中，所述受试者具有先前用VEGF拮抗剂治疗过的肿瘤。在某些实施方案中，所述受试者对VEGF拮抗剂复发或不应。在某些实施方案中，所述VEGF拮抗剂是抗VEGF抗体或其片段。在某些实施方案中，所述抗VEGF抗体是贝伐单抗或其片段或变体。在某些实施方案中，本发明的方法进一步包括对所述受试者施用有效量的化疗剂。在某些实施方案中，治疗的受试者接受化疗和/或放疗，其中化疗可例如包括施用细胞毒剂。在某些实施方案中，别的治疗是已知是用于治疗所靶向的特定肿瘤的“标准处理(standard care)”的治疗。在某些实施方案中，G-CSF拮抗剂与不同抗肿瘤剂和/或治疗方案，诸如化疗和/或放疗组合施用。在某些实施方案中，Bv8拮抗剂与不同抗肿瘤剂和/或治疗方案，诸如化疗和/或放疗组合施用。在某些实施方案中，本发明的方法进一步包括施用别的血管发生抑制剂，诸如例如血管发生因子的抗体。
在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在某些实施方案中，所述受试者是人。在某些实施方案中，所述受试者诊断有癌症。在某些实施方案中，所述肿瘤是癌症。在某些实施方案中，所述转移性肿瘤是癌症。在某些实施方案中，所述癌症是结肠癌、肺癌、乳腺癌、肾细胞癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、黑素瘤或成胶质细胞瘤。
上文描述的任何实施方案或其任何组合应用于本文所述发明的任何和所有方法。
附图简述
图1。Bv8在携带转移性肿瘤的小鼠的转移前肺中强烈上调。A.比较来自Balb/c未处理小鼠、携带非转移肿瘤67NR和转移性4T1肿瘤的小鼠的肺中基因表达的微阵列研究的设计和结果。“转移性”基因表达谱与未处理和“非转移性”谱明显不同。每个谱柱代表一只小鼠个体。B.与未处理或携带67NR的小鼠相比，来自携带4T1肿瘤的小鼠的转移前肺中前24名上调和下调基因的示意图。C.携带各种肿瘤的小鼠的转移前肺中的Bv8蛋白浓度(n＝3只每组)。D.携带各种肿瘤的Balb/c小鼠的转移前肺中CD11b+Gr1+细胞的FACS分析。图呈现均值±SEM。
图2。升高的G-CSF和Bv8水平与转移表型有关。A.接种非转移性或转移性肿瘤细胞后2周，SDF1α、PlGF、VEGF-A、M-CSF、GM-CSF、G-CSF和Bv8的血浆水平。星号(*)指示与未处理组相比的显著差异。B.来自携带4T1肿瘤并用抗Bv8、抗G-CSF抗体、或组合处理的小鼠的肺中CD11b+Gr1+细胞总数的分析(n＝10只每组)。4T1细胞同位接种入雌性CB6F1小鼠的第4乳房脂肪垫。抗体处理在接种细胞后2天开始，并如实施例1中材料和方法小节所述实施。给肺灌注PBS，并在接种细胞后1周(转移前期)或5.5周(转移期)收获。星号(*)指示与相应ISO组相比的显著差异。C.携带4T1肿瘤并如小图B中处理的小鼠的肺中的肿瘤数目。分析自肿瘤接种后5.5周实施。ISO-同种型对照抗体(n＝5只每组)。星号(*)指示相对于未处理组的显著差异。D.携带66c14肿瘤并用对照(ISO)或抗Bv8抗体处理的Balb-c小鼠中通过micro-CT分析的肺肿瘤数目(ISO组n＝8，而抗Bv8组n＝10)。ISO和抗Bv8组中展现出转移结节(红色)的代表性micro-CT扫描肺的透视图(2只每组)显示在图下面。所示数据为均值±SEM。
图3。G-CSF启动转移前“生态位”且增强数种肿瘤的转移潜力。A.自用媒介或人rG-CSF处理(持续5天，10μg/小鼠)的小鼠分离的组织中CD11b+Gr1+细胞的FACS分析。在最后一剂rG-CSF之后24小时收获组织。在组织收获之间给小鼠灌注PBS(n＝5只每组)。星号(*)指示与媒介组相比的显著差异。数据呈现为活细胞中CD11b+Gr1+(或Cd11b+Gr1-)细胞的百分比。B.与小图A中的组织匹配的组织中通过ELISA测量的Bv8水平。数值相对于总蛋白质含量标准化，并在对数标尺上绘图。星号(*)指示与媒介组相比的显著差异(n＝5只每组)。C.用人rG-CSF(10μg/小鼠，灰色柱)或媒介(白色柱)预处理5天的小鼠的肺中肿瘤的数目。在G-CSF处理之后，给小鼠(5只每组)静脉内(经由尾静脉)注射肿瘤细胞(10,000个细胞每只小鼠)。将66c14和4T1细胞注射入Balb/c小鼠，而将B16F10细胞注射入C57BL/6小鼠。rG-CSF处理再继续5天。细胞接种后3周对肺分析可见肿瘤的存在。星号(*)指示媒介和G-CSF处理小鼠之间的显著差异(n＝5只每组)。D.如小图C中，来自注射B16F10细胞并用媒介或rG-CSF任一预处理的小鼠的肺的代表性图像。来自用rG-CSF处理的小鼠的肺具有较高数目的肿瘤(黑色点)。E.如小图C中，静脉内注射非转移性67NR细胞并用人rG-CSF处理的Balb/c小鼠中肺肿瘤的数目。细胞接种后3周对小鼠分析可见肺肿瘤的存在。星号(*)指示显著差异。频率表示肺中具有可检测肿瘤的小鼠的数目(n＝5只每组)。F.每天用小鼠rG-CSF(2.5μg/小鼠)处理，然后用对照(ISO)、抗Bv8、抗Gr1或抗G-CSF抗体处理，并静脉内注射66c14细胞的小鼠的肺中肿瘤的数目，如实施例1中材料和方法小节所述。细胞接种后3周对肺分析肿瘤的存在。所示数据为均值±SEM。
图4。Bv8经由增强癌细胞迁移来介导G-CSF诱导的转移。A.体外非转移性和转移性癌细胞的PKR1和PKR2表达的qRT-PCR分析。数据呈现为相对于Hprt1表达标准化的数值(n＝6只每组)。星号(*)指示与67NR细胞相比的显著差异。B.非转移性和转移性细胞响应提高人Bv8浓度的迁移。1％FBS充当阳性对照。测定启动后16小时对穿过经胶原包被的8μm孔径孔迁移的细胞计数(n＝5只每组)。星号(*)指示与未处理组相比的显著差异。C.静脉内接种(尾静脉)经CellTracker Green标记的细胞后36小时评估的4T1细胞体内溢出。Balb/c Nude小鼠用小鼠rG-CSF(2.5μg/小鼠，每天)预处理连续5天，然后用对照(ISO)、抗Bv8、抗Gr1或抗G-CSF抗体处理。“无标记物”表示接种未用CellTracker Green标记的细胞的一组小鼠。图像显示代表性肺切片中的4T1肿瘤细胞(以白色箭头指示)。比例尺＝50μm。D.来自小图C的体内溢出测定的定量。平均而言，使用三只小鼠每组，且分析中包括15幅图像(每只小鼠5张随机切片)。E.代表来自基于G-CSF表达分层的Pawitan乳腺数据集的乳腺癌患者的总体存活概率的Kaplan-Meier曲线。曲线显示高水平G-CSF和缩短的存活之间的强关联。F.G-CSF和Bv8在转移中的作用的示意模型。LU-肺，T-原发性肿瘤，BM-骨髓。数据为均值±SEM。
图5。转移前肺在组织收获时没有肿瘤。来自荷瘤小鼠的转移前肺别的分析。A.研究中使用的4T1相关细胞系的示意图，及已知转移部位。B.肺或原发性肿瘤中潮霉素基因的qRT-PCR表达分析，显示来自携带4T1-Luc-zsGreen-Hygro肿瘤的小鼠的肺中潮霉素信号的缺失。注意来自原发性肿瘤的阳性信号。肿瘤细胞接种后6天收获肺。C.携带4T1-Luc-zsG-Hygro肿瘤的小鼠的BLI成像。注意肺区域中信号的缺失和原发性肿瘤中的阳性信号。D.用于微阵列分析的肺组织的Bv8qRT-PCR分析。E.携带非转移性和转移性肿瘤的小鼠的转移前肺中Bv8表达的qRT-PCR分析。F.自来自未处理小鼠或具有4T1肿瘤的小鼠的肺组织分离的CD11b+Gr1+和Cd11b+Gr1-细胞中Bv8转录物水平的qRT-PCR分析。G.来自携带67NR或4T1肿瘤的小鼠的转移前肺中Bv8 IHC染色的例子。携带4T1肿瘤的转移前肺组织中的暗染色指示Bv8阳性细胞。将67NR或4T1细胞同位接种入第4乳房脂肪垫，在1周后收获肺，并通过IHC来检测Bv8，如实施例1中材料和方法小节所述。比例尺代表50μm。H.来自携带B16F10和LLC肿瘤的小鼠(注射Matrigel的小鼠充当对照组)以及MMTV-PyMT小鼠(PyMT阴性同窝仔充当对照组)的转移前肺中CD11b+Gr1+的FACS分析(n＝5只每组)。I.来自具有LLC(通过ELISA来测量Bv8蛋白)、B16F10和MMTV-PyMT(通过qRT-PCR来测量Bv8RNA)肿瘤的小鼠的转移前肺中的Bv8表达水平。数据显示为相对于未处理组织的表达。所示数值为均值±SEM。
图6。荷瘤小鼠中G-CSF和Bv8表达别的分析。肿瘤负担的另外的分析。A.48小时温育后细胞培养物上清液中的G-CSF浓度，如实施例1中材料和方法小节所述(n＝3只每组)。星号(*)指示与未处理组相比的显著差异。B.携带4T1肿瘤且用ISO对照或抗G-CSF抗体处理的小鼠中肺和血浆中的Bv8水平(n＝5只每组)。星号(*)指示与未处理组相比的显著差异。C.携带转移前和转移期中的4T1肿瘤的小鼠中的血浆和肿瘤G-CSF水平(n＝5只每组)。星号(*)指示与未处理组相比的显著差异。D.用对照(ISO)、抗Bv8、抗G-CSF或这两种抗体处理的小鼠中的4T1原发性肿瘤生长(n＝10只每组)。将4T1细胞同位接种入雌性CB6F1小鼠右侧第4乳房脂肪垫。紧挨着抗Bv8处理组的星号(*)指示与ISO组相比的显著差异。E.用对照(ISO)、抗Bv8、抗G-CSF和这两种抗体处理的小鼠中的66c14原发性肿瘤生长(n＝10只每组)。将66c14细胞同位接种入雌性Balb/c小鼠右侧第4乳房脂肪垫。紧挨着抗Bv8处理组的星号(*)指示与ISO组相比的显著差异。F.肿瘤接种后6周，携带66c14肿瘤的小鼠中的肺肿瘤多重性。如小图E中那样植入肿瘤并实施处理(n＝10只每组)。星号(*)指示与ISO组相比的显著差异。图显示均值±SEM。
图7。静脉内(尾静脉)注射癌细胞的小鼠中G-CSF诱导的转移的分析。A.接种肿瘤细胞并用人rG-CSF或媒介处理后肺团块的增加(与来自未处理小鼠的肺相比)。数据对应于图3C中的组。星号(*)指示显著差异(n＝5只每组)。B.来自注射67NR细胞并用媒介或G-CSF处理的小鼠的肺的H&E染色。注意G-CSF处理组中肿瘤的存在。放大图中的比例尺＝50μm.T-肿瘤区，L-正常肺区。C.每天(持续3天)用小鼠rG-CSF(1μg/小鼠)或媒介处理并用对照抗体(ISO)、抗Bv8、抗Gr1或抗G-CSF抗体处理的小鼠的肺中CD11b+Gr1+细胞的FACS分析，如实施例1中材料和方法小节所述(n＝5只每组)。D.接种4T1细胞后3周小鼠中肺肿瘤的数目。小鼠用媒介或人rG-CSF预处理(每天)并用对照(ISO)或抗Bv8或抗Gr1抗体处理。rG-CSF和抗体二者的处理在接种癌细胞后再继续5天。E.接种4T1细胞的小鼠中肺肿瘤的数目。3周后分析肺。还用对照(ISO)、抗Bv8、抗VEGF、抗Gr1、或抗G-CSF抗体处理动物。F.连续3天每天用小鼠rG-CSF或媒介处理的小鼠中肺中VEGFR1+细胞的FACS分析。G.如小图F中每天用小鼠rG-CSF或媒介处理的小鼠的肺中CD11b+Gr1+(和Gr1-)细胞的FACS分析。H.如小图F和G中服用媒介或小鼠rG-CSF的小鼠中所有CD11b+Gr1+(或Gr1-)细胞中的VEGFR1+细胞分布。对于小图F、G、和H，星号(*)指示与媒介组相比的显著差异，NS-不显著(n＝5只每组)。所示数值为均值±SEM。
图8。G-CSF启动的转移前微环境的背后机制。A.来自用媒介或小鼠rG-CSF(1μg/小鼠，每天，持续3天)预处理，然后用对照(ISO)、抗Bv8、抗Gr1或抗G-CSF抗体处理的小鼠的总肺组织中MMP-9、S100A8和S100A9的qRT-PCR基因表达分析。星号(*)指示与G-CSF+ISO组相比的显著差异(n＝5只每组)。B.自来自用媒介或rG-CSF预处理的小鼠的肺分拣的CD11b+Gr1+(或Gr1-)细胞中通过qRT-PCR测量的Bv8、S100A8、S100A9和MMP9基因表达。自组织生成单细胞悬浮液，用特异性抗Cd11b和抗Gr1抗体对细胞染色，并通过FACS分开双重阳性细胞(CD11b+Gr1+)、Cd11b+Gr1-、和双重阴性细胞(Cd11b-Gr1-)细胞群。自细胞分离总RNA，并通过qRT-PCR来测量基因表达。数据呈现为相对于Hprt1的相对表达(n＝5只每组)。星号(*)指示与媒介组相比的显著差异。C.来自携带同位接种的4T1肿瘤并用对照(ISO)、抗Bv8、抗G-CSF或抗Bv8和抗G-CSF抗体二者组合处理的小鼠的转移前或转移肺中通过ELISA测量的MMP-9浓度(n＝5只每组)。未处理-来自没有肿瘤的小鼠的肺。样品来自图2B中的对应实验。星号(*)指示与ISO组相比的显著差异。D.免疫印迹分析，显示67NR和66c14细胞中用Bv8刺激后的ERK1/2(p-ERK1/2)磷酸化。用Bv8(5ng/ml)或用1％FBS刺激细胞指定时间。显示双份样品。E.静脉内接种(尾静脉)经CellTracker Green标记的细胞后36小时评估的66c14细胞体内溢出的定量。小鼠用小鼠rG-CSF(2.5μg/小鼠，每天)预处理连续5天，然后用对照(ISO)、抗Bv8、抗Gr1或抗G-CSF抗体处理。“无标记物”表示接种未用CellTracker Green标记的细胞的一组小鼠。所示数据为均值±SEM。
图9。癌症患者中的高G-CSF表达与缩短的存活有关。A.代表来自Chin乳腺组的乳腺癌患者基于G-CSF表达分层的总体存活概率的Kaplan-Meier曲线。图显示了高G-CSF水平和缩短的存活之间的强关联。B.代表来自BlaveriBladder组的乳腺癌患者基于G-CSF分层的总体存活概率的Kaplan-Meier曲线。图显示了高G-CSF水平和较短的存活之间显著的关联。C.此研究中用于分析G-CSF临床意义的数据集的汇总。
图10。转移前肺指在组织收获时没有肿瘤。别的对来自荷瘤小鼠的转移前肺的分析。携带4T1肿瘤的小鼠中肺转移发生的时机，肺或原发性肿瘤中潮霉素基因的qRT-PCR表达分析，显示直至接种4T1-Luc-zsGreen-Hygro肿瘤后2周肺中没有潮霉素信号。记录来自原发性肿瘤的阳性信号。肿瘤接种后每7天收获肺，并分析组织中与癌细胞的存在关联的潮霉素的存在。
图11。转移前组织中CD11b+Gr1+细胞的FACS分析。Bv8和G-CSF表达的另外的分析。A.肿瘤接种后2周，来自携带4T1肿瘤的小鼠的转移前肺中不同细胞群的FACS分析。B.48小时温育后，细胞培养物上清液中的G-CSF浓度(n＝3只每组)。星号(*)指示与未处理和非转移性组相比的显著差异。C.用同种型IgG(ISO)、抗Bv8(2D3)或抗GCSF抗体处理的未处理或携带2PyMT-肿瘤的FVB小鼠的外周血中的Ly6G+Ly6C+细胞数目(上部小图)。未处理或携带PyMT-肿瘤的FVB小鼠的肺、原发性肿瘤和骨髓中Ly6G+Ly6C+细胞的FACS分析(下部小图)。星号(*)指示与未处理组相比的显著差异，双重星号(**)指示与ISO组相比的显著差异。
图12。升高的G-CSF和Bv8水平与转移表型有关。A.携带MDA-MB-231-X1.1肿瘤并用抗Bv8(2D3)或抗G-CSF处理6周的SCID/bg小鼠的肺中肿瘤灶的数目(n＝10只每组)。星号(*)指示相对于ISO组的显著差异。B.用对照(ISO)、抗Bv8(2D3)、或抗G-CSF处理的SCID/bg小鼠中的MDA-MB-231-X1.1原发性肿瘤生长(n＝10只每组)。C.携带66c14肿瘤并用指定抗体处理的Balb-c Nude小鼠中的肺肿瘤数目(n＝10只每组)。星号(*)指示相对于ISO组的显著差异。所示数据为均值±SEM。
图13。携带同位接种肿瘤的小鼠中肺肿瘤负担和原发性肿瘤生长的分析。A和B.通过胎肝移植获得Bv8 WT或KO BMMNC的小鼠中的肺转移数目。给小鼠接种66c14(小图A)或4T1(小图B)肿瘤(同位模型)，并用同种型对照IgG(ISO)或抗Bv8(2B9+3F1)抗体处理。星号(*)指示与WT-ISO组相比的显著差异。C.来自小图A和B的Bv8 WT和KO实验的统计分析的汇总。注意，比较只在线性函数值小于0时才是显著的。只有下述比较实现了统计学显著性：WT抗Bv8对WT ISO，KO ISO对WT ISO，KO抗Bv8对WT ISO和ISO对所有其它组。D.肿瘤接种后7周，携带MMTV-PyMT肿瘤的FVB小鼠每个肺中转移的数目。植入肿瘤，并实施处理(n＝6只每组)。星号(*)指示与ISO组相比的显著差异。E.用对照(ISO)、抗Bv8(2D3)、或抗G-CSF处理的FVB小鼠中的MMTV-PyMT原发性肿瘤生长(n＝10只每组)。F.携带MDA-MB-231-X1.1肿瘤的小鼠的血浆和原发性肿瘤中小鼠和人G-CSF(mG-CSF和hG-CSF)的表达水平。星号(*)指示与未处理组相比的显著差异。所示数据为均值±SEM。
图14。G-CSF启动转移前“生态位(niche)”并增强数种肿瘤的转移潜力。A.每天用媒介或小鼠rG-CSF(2.5μg/小鼠)处理并用对照(ISO)、抗Bv8(2D3)、或抗G-CSF抗体处理并静脉内注射MDA-MB-231-L1.1细胞的小鼠的肺中的肿瘤数目(n＝5只每组)。B.每天用媒介或rG-CSF(2.5μg/小鼠)并然后用对照(ISO)、抗Bv8(2D3)、抗Ly6G、抗Gr1抗体或抗G-CSF抗体处理并静脉内注射66c14细胞的小鼠的肺中的肿瘤数目。细胞接种后3周对肺分析肿瘤的存在(n＝10只每组)。在小图A和B中，星号(*)指示与媒介-ISO组相比的显著差异，而双重星号(**)指示与G-CSF-ISO组相比的显著差异。所示数据为均值±SEM。
图15。Bv8经由增强癌细胞迁移来介导G-CSF诱导的转移。A.静脉内注射67NR或67NR-PKR1细胞的Balb/c小鼠中的肺肿瘤数目。用媒介或人rG-CSF预处理小鼠。细胞接种后3周对小鼠分析可见肺肿瘤的存在。星号(*)指示用媒介和G-CSF处理的小鼠之间的显著差异。频率表示肺中有可检测肿瘤的小鼠的数目(n＝10只每组)。B.自肺转移(肺)或自原发性肿瘤(肿瘤)分离的MDA-MB-231细胞的基因表达分析。每个组分析三个独立的细胞系(对于肺：细胞系L1.1，L2.1，和L3.1；对于肿瘤：细胞系T1.1，T2.1，和T3.1)。与亲本MDA-MB-231-D3H1细胞系比较表达。星号(*)指示与亲本细胞系相比的显著差异，而双重星号(**)指示与肿瘤或亲本细胞系相比的显著差异。数据为均值±SEM。C.用于图15B中基因表达分析的MDA-MB-231克隆的示意图。将MDA-MB-231-D3H1接种入第4乳房脂肪垫或经由SCID/bg小鼠的尾静脉接种。随后，自建立的肿瘤(乳房或肺中)分离癌细胞，并在体外扩增。自每种组织，建立三个独立的细胞系(L1.1、L2.1、和L3.1来自三个分开的肺，而T1.1、T2.1、和T3.1来自三个独立的原发性肿瘤)。
图16。由G-CSF启动的转移前微环境的背后的机制。A.过表达PKR1的67NR细胞中PKR1表达的qRT-PCR分析。注意，表达水平与66c14细胞可比。B.表达靶向PKR1的shRNA(shPKR1)的66c14细胞中PKR1和G-CSF表达的qRT-PCR分析。注意，G-CSF不受shPKR1影响。sh(对照)是用作对照的混杂shRNA。星号(*)指示与sh(对照)组相比的显著差异。C.用媒介或G-CSF预处理并注射66c14或66c14-shPKR1细胞的小鼠的肺中的肿瘤数目。分析在细胞接种后3周实施。星号(*)指示与66c14-WT ISO组相比的显著差异，而双重星号(**)指示与66c14-WT G-CSF组相比的显著差异(n＝10只每组)。所示数据为均值±SEM。
发明详述
在详细描述本发明前，应当理解本发明不限于具体的组合物或生物学系统，它们当然可以有所变化。还应当理解本文所使用术语是仅仅为了描述具体实施方案的目的，并非意图是限制性的。
除非另有定义，本文中所使用的技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常的理解具有相同的含义。以下文献为本领域技术人员提供了本申请中所使用的许多术语的一般性指导：Singleton et al.，Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology 2nd ed.，J.Wiley&Sons(New York，N.Y.1994)；及March，Advanced Organic Chemistry Reactions，Mechanisms andStructure 4th ed.，John Wiley&Sons(New York，N.Y.1992)。通过述及完整收录本文中引用的所有参考文献，包括专利申请和出版物。
A.定义
为了解释本说明书的目的，应用以下定义，而且在任何适宜的时候，以单数使用的术语也会包括复数，反之亦然。在所列任何定义与通过述及收入本文的任何文件抵触的情况中，应当以下文所列定义为准。
术语“粒细胞集落刺激因子”、“G-CSF”、“集落刺激因子3”和“CSF3”在本文中可互换使用，而且指全长多肽和/或全长多肽的活性片段。
“天然序列G-CSF”包括与自自然界衍生的G-CSF具有相同氨基酸序列的多肽，不管其制备模式。如此，天然序列G-CSF可具有天然发生的人G-CSF、鼠G-CSF、或来自任何其它哺乳动物物种的G-CSF的氨基酸序列。天然序列人G-CSF氨基酸序列的例子显示于SEQ ID NO：8、10、12和14。人和鼠G-CSF序列还披露于例如Nagata et al.Nature 319，415-418(1986)；Nagata et al.EMBO J.5，575-581(1986)，及Tsuchiya et al.Proc Natl Acad Sci 83(20)，7633-7637(1986)。此类天然序列G-CSF可以自自然界分离，或者可以通过重组和/或合成手段来生成。术语“天然序列G-CSF”具体涵盖天然发生的前原(prepro)G-CSF、原(pro)G-CSF和成熟形式或截短形式的G-CSF、天然发生的变体形式和天然发生的等位变体。
“G-CSF变体”指因天然序列内一个或多个氨基酸残基的插入、删除、修饰和/或替代，具有与人和鼠G-CSF的天然序列G-CSF多肽的序列不同的氨基酸序列的生物学活性G-CSF多肽。G-CSF变体一般与天然序列G-CSF，诸如SEQ ID NO：8、10、12和14中所示人G-CSF具有不到100％序列同一性。然而，通常，生物学活性G-CSF变体会具有如下的氨基酸序列，其与天然发生G-CSF的氨基酸序列具有至少约70％氨基酸序列同一性。在某些实施方案中，生物学活性G-CSF变体会具有如下的氨基酸序列，其与天然发生G-CSF的氨基酸序列具有至少约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、或以1％增量至至少约99％氨基酸序列同一性。在某些实施方案中，G-CSF变体包括至少5个氨基酸的肽片段，其保留相应天然序列G-CSF多肽的生物学活性。G-CSF变体还包括其中在天然G-CSF序列的N或C端或内部添加一个或多个氨基酸残基的G-CSF多肽。G-CSF变体还包括其中删除一些氨基酸残基和任选用一个或多个氨基酸残基替代的G-CSF多肽。G-CSF变体也可共价修饰，例如通过用天然发生氨基酸以外的模块替代或通过修饰氨基酸残基以生成非天然发生氨基酸。
术语“G-CSF拮抗剂”在用于本文时指结合G-CSF并抑制或实质性降低G-CSF生物学活性的分子。G-CSF拮抗剂的非限制性例子包括抗体或其抗原结合片段、蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有机分子、肽模拟物、药剂及其代谢物、转录和翻译控制序列、等等。拮抗剂还包括G-CSF的小分子抑制剂、针对G-CSF的反义分子、RNA适体、和针对G-CSF的核酶。在本发明的一个实施方案中，G-CSF拮抗剂是抗体，尤其是抗结合人G-CSF的G-CSF抗体或其片段。
“G-CSF拮抗性抗体”指作为G-CSF拮抗剂(如上文定义的)，且因此部分或完全阻断、抑制、或中和调控CD11b+Gr1+细胞动员或CD11b+Gr1+细胞的功能性人对应物动员、调控Bv8表达、促进肿瘤血管发生和/或促进肿瘤转移的能力的抗体。在某些实施方案中，人对应物细胞是人未成熟髓样细胞。在某些实施方案中，人对应物细胞是人髓样衍生抑制细胞。在某些实施方案中，人对应物细胞是人嗜中性细胞、单核细胞或巨噬细胞的前体。在某些实施方案中，人对应物细胞是嗜中性细胞、单核细胞或巨噬细胞。
术语“Bv8”、“Bv8同系物”、“起动蛋白原-2”(也称作“PK2”、“KAL4”、和“MIT1”)在本文中可互换使用，指全长多肽和/或全长多肽的活性片段。
“天然序列Bv8”包括与自自然界衍生的Bv8具有相同氨基酸序列的多肽，不管其制备模式。如此，天然序列Bv8可具有天然发生的人Bv8、鼠Bv8、或来自任何其它哺乳动物物种的Bv8的氨基酸序列。例如，一种全长天然序列人Bv8氨基酸序列显示于SEQ ID NO：2。另一种全长天然序列人Bv8显示于SEQ ID NO：4。这两种序列是编码一种规范的肝素结合域的外显子可变剪接的结果。如此，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2中所示的天然序列人Bv8包含肝素结合域，而SEQ ID NO：4所示天然序列Bv8不然。一种天然序列小鼠Bv8氨基酸序列显示于SEQ ID NO：6。人和鼠Bv8序列还披露于例如Wechselberger et al.(FEBS Lett.462：177-181(1999))及Li et al.(Mol.Pharm.59：692-698(2001))。此类天然序列Bv8可以自自然界分离，或者可以通过重组和/或合成手段来生成。术语“天然序列Bv8”具体涵盖天然发生的前原(prepro)Bv8、原(pro)Bv8和成熟形式和截短形式的Bv8、天然发生的变体形式(例如可变剪接形式，诸如SEQ ID NO：4所示，和天然存在的等位变体。在某些实施方案中，天然序列Bv8是如SEQ ID NO：2中所示的全长天然序列人Bv8。在某些实施方案中，天然序列Bv8是如SEQ ID NO：4中所示的全长天然序列人Bv8。
“Bv8变体”指因天然序列内一个或多个氨基酸残基的插入、删除、修饰和/或替代，具有与人和鼠Bv8的天然序列Bv8多肽的序列(诸如SEQ ID NO：2、4和6所示)不同的氨基酸序列的生物学活性Bv8多肽。Bv8变体一般与天然序列Bv8，诸如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中所示人Bv8具有不到100％序列同一性。然而，通常，生物学活性Bv8变体会具有如下的氨基酸序列，其与天然发生Bv8的氨基酸序列具有至少约70％氨基酸序列同一性。在某些实施方案中，生物学活性Bv8变体会具有如下的氨基酸序列，其与天然发生Bv8的氨基酸序列具有至少约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、或以1％增量至至少约99％氨基酸序列同一性。Bv8变体包括至少5个氨基酸的肽片段，其保留相应天然序列Bv8多肽的生物学活性。Bv8变体还包括其中在天然Bv8序列的N或C端或内部添加一个或多个氨基酸残基的Bv8多肽。Bv8变体还包括其中删除一些氨基酸残基和任选用一个或多个氨基酸残基替代的Bv8多肽。Bv8变体也可共价修饰，例如通过用天然发生氨基酸以外的模块替代或通过修饰氨基酸残基以生成非天然发生氨基酸。Bv8变体可包含肝素结合域。
如本文中使用的，术语“Bv8拮抗剂”指部分或完全阻断、抑制、或中和天然序列Bv8调控CD11b+Gr1+细胞或CD11b+Gr1+细胞的功能性人对应物动员、促进肿瘤发生期间的血管发生和/或促进肿瘤转移的能力的任何分子。合适的拮抗剂分子具体包括拮抗性抗体或其抗原结合片段、蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有机分子、肽模拟物、药剂及其代谢物、转录和翻译控制序列、等等。拮抗剂还包括Bv8的小分子抑制剂、和特异性结合Bv8，由此隔绝其结合其靶的融合蛋白、受体分子和衍生物、Bv8的拮抗性变体、针对Bv8的反义分子、RNA适体、和针对Bv8的核酶。
特别地，Bv8拮抗剂包括但不限于特异性结合天然序列Bv8多肽或天然序列Bv8受体(PKR1/EG-VEGFR1或PKR2/EG-VEGFR2)多肽的抗体和抗体片段。在某些实施方案中，Bv8拮抗剂是PKR1拮抗剂。在某些实施方案中，PKR1拮抗剂是抗PKR1抗体。用于鉴定Bv8多肽的拮抗剂的方法可包括使Bv8多肽与候选拮抗剂分子接触并测量Bv8调控CD11b+Gr1+细胞动员或CD11b+Gr1+细胞的功能性人对应物动员、促进肿瘤血管发生和/或促进肿瘤转移的能力的可检测变化。
“Bv8拮抗性抗体”指作为Bv8拮抗剂(如上文定义的)，且因此部分或完全阻断、抑制、或中和调控CD11b+Gr1+细胞动员或CD11b+Gr1+细胞的功能性人对应物动员、促进肿瘤血管发生和/或促进肿瘤转移的能力的抗体。
“Bv8受体”指Bv8结合的和介导Bv8生物学特性的分子。因此，术语“Bv8受体”在其含义内包括PKR1/GPR73/EG-VEGF受体-1/PROKR1和PKR2/GPR73L1/EG-VEGF受体-2/PROKR2(LeCouter et al.，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，100：2685-2690；Lin et al.，2002，J.Biol.Chem.，277：19276-19280；Masuda et al.，2002，Biochem.Biophys.Res.Commun.，293：396-402)。
术语“生物学活性”和“有生物学活性的”就多肽而言指分子特异性结合并调节细胞应答(例如增殖、迁移等)的能力。细胞应答还包括那些经由受体介导的，包括但不限于迁移和/或增殖。在此语境中，术语“调控”包括促进和抑制二者。
关于Bv8或G-CSF，为了本文中的目的，“有活性的”或“活性”指保留天然的或天然发生的Bv8或G-CSF的生物学和/或免疫学活性的Bv8或G-CSF形式，其中“生物学”活性指天然的或天然发生的Bv8或G-CSF所拥有的，在诱导针对抗原性表位的抗体生成的能力以外，由天然的或天然发生的Bv8或G-CSF引起的生物学功能(或是抑制性或是刺激性的)，而“免疫学”活性指天然的或天然发生的Bv8或G-CSF所拥有的，诱导针对抗原性表位的抗体生成的能力。在某些实施方案中，G-CSF的生物学活性是调控CD11b+Gr1+细胞(或CD11b+Gr1+细胞的功能性人对应物)动员、调控Bv8表达、促进肿瘤血管发生和/或促进肿瘤转移的能力。在某些实施方案中，Bv8的生物学活性是调控CD11b+Gr1+细胞(或CD11b+Gr1+细胞的功能性人对应物)动员、促进肿瘤血管发生和/或促进肿瘤转移的能力。在某些实施方案中，人对应物细胞是人未成熟髓样细胞。在某些实施方案中，人对应物细胞是人髓样衍生抑制细胞。在某些实施方案中，人对应物细胞是人嗜中性细胞、单核细胞或巨噬细胞的前体。在某些实施方案中，人对应物细胞是人嗜中性细胞、单核细胞或巨噬细胞。
“造血干细胞/祖细胞”或“原始造血细胞”指能够分化形成更定型的或成熟的血细胞类型的细胞。“淋巴样血细胞谱系”指能够分化形成淋巴细胞(B细胞或T细胞)的造血祖细胞。类似的，“淋巴细胞生成”指淋巴细胞的形成。“红细胞样血细胞谱系”指能够分化形成红细胞(红血球)的造血祖细胞，而“红细胞生成”指红细胞的形成。
短语“髓细胞样血细胞谱系”在用于本文时涵盖上文所述淋巴样和红细胞样谱系以外的所有造血祖细胞，而“髓细胞生成”涉及血细胞(淋巴细胞和红细胞以外的)的形成。
在某些实施方案中，髓样细胞群体可以在Gr1+/CD11b+(或CD11b+Gr1+)或Gr1+/Mac-1+的髓样免疫细胞中富集。在某些实施方案中，人髓样细胞群可以在Gr1+/CD11b+之功能性人对应物(或CD11b+Gr1+之功能性人对应物)的髓样免疫细胞中富集。参见例如Almand，B.et al.J Immunol 166，678-689(2001)；Young，M.R.&Lathers，D.M.Int J Immunopharmacol 21，241-252(1999)。在某些实施方案中，人对应物细胞是人未成熟髓样细胞。在某些实施方案中，人对应物细胞是人髓样衍生抑制细胞。在某些实施方案中，人对应物细胞是人嗜中性细胞、单核细胞或巨噬细胞的前体。在某些实施方案中，人对应物细胞是嗜中性细胞、单核细胞或巨噬细胞。在某些实施方案中，髓样免疫细胞表达巨噬细胞谱系的髓样细胞的标志物，即CD11b，和粒细胞的标志物，即Gr1。Gr1+/CD11b+可以通过免疫粘附淘选(例如用针对Gr1+的抗体)来选择。
术语“Gr1拮抗剂”在用于本文时指能结合Gr1并抑制或实质性降低Gr1生物学活性的分子。Gr1拮抗剂的非限制性例子包括抗体、蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有机分子、肽模拟物、药用药剂及其代谢物、转录和翻译控制序列、诸如此类。拮抗剂还包括Gr1的小分子抑制剂、针对Gr1的反义分子、RNA适体、和针对Gr1的核酶。在本发明的一个实施方案中，所述Gr1拮抗剂是抗体，尤其是能结合人Gr1的抗Gr1抗体或其片段。在某些实施方案中，抗Gr1抗体能够抑制G-CSF的生物学活性。
如本文中使用的，术语“VEGF”或“VEGF-A”指165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子及相关的121个、189个和206个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子，如Leung et al.(1989)Science 246：1306；及Houck et al.(1991)Mol.Endocrin.5：1806所述，及其天然发生等位形式和加工形式。术语“VEGF”还指来自非人物种诸如小鼠、大鼠或灵长类动物的VEGF。有时，来自特定物种的VEGF以下述术语表示，诸如hVEGF表示人VEGF，mVEGF表示鼠VEGF，等等。术语“VEGF”还用于指包含165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子的氨基酸第8-109位或第1-109位的截短形式多肽。本申请中可能通过例如“VEGF(8-109)”、“VEGF(1-109)”或“VEGF165”来鉴别VEGF的任何此类形式VEGF的称谓。“截短的”天然VEGF的氨基酸位置如天然VEGF序列中所示编号。例如，截短的天然VEGF中的第17位氨基酸(甲硫氨酸)也是天然VEGF中的第17位(甲硫氨酸)。截短的天然VEGF具有与天然VEGF相当的对KDR和Flt-1受体的结合亲和力。
“VEGF生物学活性”包括对任何VEGF受体的结合或任何VEGF信号传导活性，诸如对正常的和异常的血管发生(angiogenesis)和脉管发生(vasculogenesis)的调节(Ferrara和Davis-Smyth(1997)Endocrine Rev.18：4-25；Ferrara(1999)J.Mol.Med.77：527-543)；促进胚胎脉管发生和血管发生(Carmeliet et al.(1996)Nature 380：435-439；Ferrara et al.(1996)Nature380：439-442)；及调控雌性生殖道中的和为了骨生长和软骨形成的周期性血管增殖(Ferrara et al.(1998)Nature Med.4：336-340；Gerber et al.(1999)NatureMed.5：623-628)。在作为血管发生和脉管发生中的血管发生因子之外，VEGF，作为多效生长因子，在其它生理过程诸如内皮细胞存活、血管通透性和血管舒张、单核细胞趋化性和钙内流中展现出多种生物学效应(Ferrara和Davis-Smyth (1997)，见上文；及Cebe-Suarez et al.Cell.Mol.Life Sci.63：601-615(2006))。此外，研究报道了VEGF对少数非内皮细胞类型诸如视网膜色素上皮细胞、胰导管细胞、和许旺(Schwann)细胞的促有丝分裂效应(Guerrin et al.(1995)J.Cell Physiol.164：385-394；Oberg-Welsh et al.(1997)Mol.Cell.Endocrinol.126：125-132；Sondell et al.(1999)J.Neurosci.19：5731-5740)。
“VEGF拮抗剂”指能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF活性(包括但不限于其与一种或多种VEGF受体的结合)的分子。VEGF拮抗剂包括但不限于抗VEGF抗体及其抗原结合片段、特异性结合VEGF由此使其隔绝与一种或多种受体结合的受体分子及衍生物、抗VEGF受体抗体和VEGF受体拮抗剂诸如VEGFR酪氨酸激酶的小分子抑制剂。如本文中使用的，术语“VEGF拮抗剂”具体包括结合VEGF且能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF活性的分子，包括抗体、抗体片段、其它结合多肽、肽、和非肽小分子。如此，术语“VEGF活性”具体包括VEGF介导的VEGF生物学活性。
“抗VEGF抗体”指以足够亲和力和特异性结合VEGF的抗体。在一个实施方案中，抗VEGF抗体可用作治疗剂，用于靶向和干扰其中牵涉VEGF活性的疾病或疾患。抗VEGF抗体通常不会结合其它VEGF同系物，诸如VEGF-B或VEGF-C，也不会结合其它生长因子，诸如PlGF、PDGF或bFGF。在一个实施方案中，抗VEGF抗体包括与杂交瘤ATCC HB 10709所生成的单克隆抗VEGF抗体A4.6.1；重组人源化抗VEGF单克隆抗体(参见Presta et al.(1997)Cancer Res.57：4593-4599)结合相同表位的单克隆抗体，包括但不限于称作贝伐单抗(Bevacizumab，BV)，也称作“rhuMAb VEGF”或“AVASTIN
Figure BDA0000145434760000241
”的抗体。贝伐单抗包括突变的人IgG1框架区和来自鼠抗hVEGF单克隆抗体A.4.6.1(其阻断人VEGF对其受体的结合)的抗原结合互补决定区。AVASTIN
Figure BDA0000145434760000242
当前可商购。贝伐单抗包含突变的人IgG1框架区和来自阻断人VEGF结合其受体的鼠抗体A.4.6.1的抗原结合互补决定区。贝伐单抗大约93％的氨基酸序列，包括大部分框架区，衍生自人IgG1，而大约7％的序列衍生自A4.6.1。贝伐单抗具有约149,000道尔顿的分子量，而且是糖基化的。贝伐单抗和其它人源化抗VEGF抗体进一步记载于2005年2月26日公告的美国专利No.6,884,879。别的抗VEGF抗体包括G6或B20系列抗体(例如G6-23、G6-31、B20-4.1)，如PCT申请公开文本No.WO2005/012359中所记载的。关于别的抗体，参见美国专利No.7,060,269；6,582,959；6,703,020；6,054,297；WO98/45332；WO 96/30046；WO94/10202；EP 0666868B1；美国专利申请公开文本No.2006009360，20050186208，20030206899，20030190317，20030203409，和20050112126；及Popkov et al.，Journal of Immunological Methods 288：149-164(2004)。
如本文中使用的，术语“B20系列多肽”指结合VEGF的多肽，包括抗体。B20系列多肽包括但不限于自B20抗体或美国公开号20060280747、美国公开号20070141065和/或美国公开号20070020267(通过述及明确将这些专利申请的内容收入本文)中记载的B20衍生抗体的序列衍生的抗体。在一个实施方案中，B20系列多肽为美国公开号20060280747、美国公开号20070141065和/或美国公开号20070020267中记载的B20-4.1。在另一个实施方案中，B20系列多肽为美国申请No.12/315,220中记载的B20-4.1.1(通过述及明确将其完整公开内容收入本文)。
如本文中使用的，术语“G6系列多肽”指结合VEGF的多肽，包括抗体。G6系统多肽包括但不限于自G6抗体或美国公开号20060280747、美国公开号20070141065和/或美国公开号20070020267中记载的G6衍生抗体的序列衍生的抗体。如美国公开号20060280747、美国公开号20070141065和/或美国公开号20070020267中记载的，G6系统多肽包括但不限于G6-8、G6-23和G6-31。
“转移”指癌自其原发部位传播至身体中的其它位置。癌细胞能脱离原发性肿瘤，渗透入淋巴和血管，经由血流而循环和在身体中其它地方的正常组织中的远端病灶(转移)中生长。转移可以是局部的或远端的。转移是一个连续过程，视肿瘤细胞自原发性肿瘤脱落、经由血流或淋巴系统而传播、并在远端部位停止而定。在肿瘤细胞到另一部位休息之后，它们再渗透穿过血管或淋巴壁，继续繁殖，并最终形成另一个肿瘤。在新的部位，该细胞建立血供且能生长至形成危及生命的团块。在某些实施方案中，此新肿瘤称作转移性(或继发性)肿瘤。在某些实施方案中，术语转移性肿瘤指能够转移，但尚未转移至身体中别处的组织或器官的肿瘤。在某些实施方案中，术语转移性肿瘤指已经转移至身体中别处的组织或器官的肿瘤。在某些实施方案中，转移性肿瘤由转移性肿瘤细胞构成。
“转移器官”或“转移组织(metastatic organ)”以最广义使用，指其中来自原发性肿瘤的癌细胞或来自身体另一部分的癌细胞已经传播的器官或组织。转移器官和转移组织的例子包括但不限于肺、肝、脑、卵巢、骨、骨髓和淋巴结。
如本文中使用的，“转移前器官(pre-metastatic organ)”或“转移前组织”指其中没有检测到来自原发性肿瘤或来自身体另一部分的癌细胞的器官或组织。在某些实施方案中，如本文中使用的，转移前器官或转移前组织指处于癌细胞从原发性肿瘤或从身体另一部分传播至此器官或组织发生之前的阶段的器官或组织。转移前器官或转移前组织的例子包括但不限于肺、肝、脑、卵巢、骨、骨髓和淋巴结。
“微转移”指自原发性肿瘤传播至身体其它部分的少数细胞。微转移在筛选或诊断测试中可以检测得到或检测不到。
“非转移的”指良性的或保留在原发部位且尚未渗透入淋巴或血管系统或渗透至原发部位以外的组织的癌症。在某些实施方案中，非转移性癌症指作为0期、I期、或II期癌症和偶尔的III期癌症的任何癌症。
将肿瘤或癌症称作“0期”、“I期”、“II期”、“III期”、或“IV期”指示使用本领域已知的整体阶段分组(Overall Stage Grouping)或罗马数字分期(RomanNumeral Staging)方法对肿瘤或癌症的分类。虽然实际的癌症阶段取决于癌症的类型，一般而言，0期癌症为原位病灶，I期癌症为小的局限性肿瘤，II期和III期癌症是局部高级的肿瘤，其展现出涉及局部淋巴结，而IV期癌症代表转移性癌症。每类肿瘤的具体阶段是熟练临床医生已知的。
“原发性肿瘤”或“原发性癌”指初始的癌症，而不是位于受试者身体中另一组织、器官、或位置中的转移病灶。在某些实施方案中，原发性肿瘤由原发性肿瘤细胞构成。
“良性肿瘤”或“良性癌”指仍然局限于起源部位且没有能力渗透、侵入、或转移至远端部位的肿瘤。
“癌症复发”在本文中指癌症在治疗后回来，而且包括癌症在原发性器官中的回来，以及远端复发，即癌症在原发性器官以外回来。
“肿瘤休眠”指一种延长的静止状态，其中肿瘤细胞存在但肿瘤进展在临床上不明显。休眠的肿瘤在筛选或诊断测试中可以检测得到或检测不到。
“肿瘤载荷”指身体中癌细胞的数目、肿瘤的尺寸、或癌的量。肿瘤载荷也称作肿瘤负荷。
“肿瘤数目”指肿瘤的数目。
“URMCNA”指在肿瘤、转移前器官和/或转移器官中上调的核酸。URMCNA包括但不限于Stfa3、CAMP、Bv8、TNFSF14、MGAM、Ngp、S100A8、S100A9、LRP1B、CEACAM4、HAO1、C10orf46、CLECSF9、Mcpt8、PRTN3、Slfn3和MMP-9。在某些实施方案中，URMCNA指Bv8、S100A8、S100A9和MMP-9。
“URMCP”指在肿瘤、转移前器官和/或转移器官中上调的蛋白质。URMCP包括但不限于Stfa3、CAMP、Bv8、TNFSF14、MGAM、Ngp、S100A8、S100A9、LRP1B、CEACAM4、HAO1、C10orf46、CLECSF9、Mcpt8、PRTN3、Slfn3和MMP-9。在某些实施方案中，URMCP指Bv8、S100A8、S100A9和/或MMP-9。
“DRMCNA”指在肿瘤、转移前器官和/或转移器官中下调的核酸。DRMCNA包括但不限于TYMS、CRIPTO CR-1、MPHOSPH1、CDH6、WWP2、DMC1、BCHE、NSLE16484、F9、GDAP1、LOC375188、DNTT、PPIL3、KCND2、ZNF597、IGSF4D和GTF3C4。
“DRMCP”指在蛋白质肿瘤、转移前器官和/或转移器官中下调的。DRMCP包括但不限于TYMS、CRIPTO CR-1、MPHOSPH1、CDH6、WWP2、DMC1、BCHE、NSLE16484、F9、GDAP1、LOC375188、DNTT、PPIL3、KCND2、ZNF597、IGSF4D和GTF3C4。
如本文中使用的，术语“样品”指自感兴趣受试者获得或衍生的，含有要例如基于物理、生物化学、化学和/或生理学特征来表征和/或鉴定的细胞和/或其它分子实体的组合物。在某些实施方案中，该定义涵盖血液和生物起源的其它液体样品和组织样品诸如活检标本或自其衍生的组织培养物或细胞。组织样品的来源可以是实体组织，像来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活检物或穿刺物；血液或任何血液组分；体液；和来自受试者的妊娠或发育任何时间的细胞或血浆。
在另一个实施方案中，该定义包括在获得它们后已经以任何方式进行过操作的生物学样品，诸如用试剂处理、增溶、或富集某些成分诸如蛋白质或多核苷酸、或为切片目的而埋藏在半固体或固体基质中。在某些实施方案中，组织样品的“切片”意指一块或一片组织样品，例如自组织样品切下的一薄片组织或细胞。
样品包括但不限于原代的或培养的细胞或细胞系、细胞上清液、细胞裂解物、血小板、血清、血浆、玻璃体液、淋巴液、滑液、卵泡液、精液、羊水、乳液、全血、尿液、脑脊液、唾液、痰、泪液、出汗、粘液、肿瘤裂解物、和组织培养液、以及组织提取物诸如匀浆化组织、肿瘤组织和细胞提取物。
在一个实施方案中，样品是临床样品。在另一个实施方案中，样品用于诊断测定法。在某些实施方案中，样品是自转移前器官或转移前组织获得的。在某些实施方案中，样品是自原发性肿瘤或转移性肿瘤获得的。常常使用组织活检来获得代表性的肿瘤组织块/片。或者，可以已知或认为包含感兴趣的肿瘤细胞的组织/流体的形式间接获取肿瘤细胞。例如，肺癌损伤的样品可通过切除术、支气管镜检、细针抽吸、支气管刷检、或从痰/唾液、胸膜液或血液中获得。
在某些实施方案中，样品是在用G-CSF拮抗剂和/或Bv8拮抗剂治疗之前自受试者或患者获得的。在某些实施方案中，样品是在用G-CSF拮抗剂和/或Bv8拮抗剂治疗之后自受试者或患者获得的。在某些实施方案中，样品是在VEGF拮抗剂疗法之前自受试者或患者获得的。在某些实施方案中，样品是在VEGF拮抗剂疗法之后自受试者或患者获得的。在某些实施方案中，样品是在抗VEGF抗体疗法之前自受试者或患者获得的。在某些实施方案中，样品是在抗VEGF抗体疗法之后自受试者或患者获得的。在某些实施方案中，样品是在癌症转移之前获得的。在某些实施方案中，样品是在癌症转移之后获得的。
如本文中使用的，“参照样品”指用于比较目的的任何样品、标准、或水平。在一个实施方案中，参照样品是自相同受试者或患者的身体的健康和/或未患病部分获得的。在另一个实施方案中，参照样品是自相同受试者或患者的身体的未处理组织和/或细胞获得的。
在某些实施方案中，参照样品是在一个或多个与获得样品的时间不同的时间点来自相同受试者或患者的单一样品或组合多份样品。例如，参照样品是在比获得样品的时间更早的时间点自相同受试者或患者获得的。如果参照样品是在癌症的初始诊断期间获得的而样品是更晚，在癌症已经转移时获得的话，此类参照样品可以是有用的。
在一个实施方案中，参照样品是自不是受试者或患者的个体的身体的健康和/或未患病部分获得的。在另一个实施方案中，参照样品是自不是受试者或患者的个体的身体的未处理组织和/或细胞部分获得的。
在某些实施方案中，参照样品包括自一个或多个不是受试者或患者的个体获得的，上文术语“样品”下定义的所有类型的生物学样品。在某些实施方案中，参照样品是自一个或多个有癌症的、不是受试者或患者的个体获得的。
在某些实施方案中，参照样品是来自一个或多个不是受试者或患者的健康个体的组合多份样品。在某些实施方案中，参照样品是来自一个或多个具有癌症的、不是受试者或患者的个体的组合多份样品。在某些实施方案中，参照样品是来自来自一个或多个不是受试者或患者的个体的转移前器官或转移前组织的合并RNA样品。在某些实施方案中，参照样品是来自来自一个或多个具有癌症的、不是受试者或患者的个体的转移前器官或转移前组织的合并RNA样品。
若基因、基因产物例如蛋白质或生物标志物在第一样品中的表达水平/量大于该基因、基因产物例如蛋白质或生物标志物在第二样品中的表达水平/量，则该基因、蛋白质或生物标志物在第一样品中的表达表达/量与第二样品中的表达水平/量相比升高。表达水平/量可以基于本领域已知的任何合适标准来测定，包括但不限于mRNA、cDNA、蛋白质、蛋白质片段和/或基因拷贝。表达水平/量可以定性和/或定量测定。
在某些实施方案中，基因、基因产物例如蛋白质或生物标志物在第一样品中的表达水平/量的升高是相应基因、基因产物例如蛋白质或生物标志物在第二样品中的表达水平/量的至少约5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％或100％，通过本领域已知标准方法诸如本文中描述的那些来检测。在某些实施方案中，基因、基因产物例如蛋白质或生物标志物在第一样品中的表达水平/量的升高是相应基因、基因产物例如蛋白质或生物标志物在第二样品中的表达水平/量的至少约1.5倍、1.75倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、25倍、50倍、75倍、或100倍。在某些实施方案中，第一样品是自受试者获得的样品，而第二样品是参照样品。
在某些实施方案中，术语“降低”在本文中指通过本领域已知标准方法(诸如本文中描述的那些)检测的，基因、基因产物例如蛋白质或生物标志物在第一样品中的表达水平/量与相应基因、基因产品例如蛋白质或生物标志物在第二样品中的表达水平/量相比约5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、或100％的总体降低。在某些实施方案中，术语降低指第一样品中基因或生物标志物的表达水平/量的降低，其中该降低是第二样品中相应基因或生物标志物的表达水平/量的至少约0.9倍、0.8倍、0.7倍、0.6倍、0.5倍、0.4倍、0.3倍、0.2倍、0.1倍、0.05倍、或0.01倍。在某些实施方案中，第一样品是自受试者获得的样品，而第二样品是参照样品。
在某些实施方案中，将样品关于所测定的RNA或蛋白质的量的差异和所使用的RNA或蛋白质样品的质量的变异性二者标准化。此类标准化可以通过测量和引入某些标准化基因(包括公知的持家基因，诸如GAPDH)的表达来实现。或者，标准化可基于所有所测定基因或其大子集的均值或中值信号(整体标准化办法)。以逐个基因为基础，将患者肿瘤mRNA或蛋白质的测量标准化量与参照集中找到的量比较。可以将每位患者的每份测试肿瘤的每种mRNA或蛋白质的标准化表达水平表述成相对于在参照集中测量得出的表达水平的百分比。在要分析的特定患者样品中测量得出的表达水平会落在此范围内的一些百分点处，这可通过本领域公知方法来测定。
术语“检测”以最广义使用来包括靶分子的定性和定量测量。检测包括任何检测手段，包括直接和间接检测。
“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互换使用，指任何长度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经过修饰的核苷酸或碱基、和/或其类似物，或者是可通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应掺入聚合物的任何底物。多核苷酸可包含经过修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及其类似物。
“寡核苷酸”在用于本文时一般指短的多核苷酸，一般是单链，一般是合成的，长度一般但不是必需小于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”与“多核苷酸”并不互相排斥。上文关于多核苷酸的描述平等且完全适用于寡核苷酸。
在某些实施方案中，多核苷酸能够与基因在各种严格条件下特异性杂交。杂交反应的“严格性”可以由本领域普通技术人员容易的确定，而且通常根据探针长度、洗涤温度和盐浓度凭经验计算。一般而言，较长的探针要求较高的温度以正确退火，而较短的探针需要较低的温度。杂交通常依赖于当互补链存在于低于其解链温度的环境中时变性DNA重新退火的能力。探针与可杂交序列之间的期望同源性程度越高，可使用的相对温度也越高。结果，可推出较高相对温度将趋向于使反应条件更为严格，而较低温度也就较不严格。关于杂交反应严格性的其它细节和解释，参见Ausubel et al.，CurrentProtocols in Molecular Biology，Wiley Interscience Publishers，1995。
“严格条件”或“高严格条件”可以如下鉴定：(1)对于洗涤使用低离子强度和高温，例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠，50℃；(2)在杂交期间使用变性剂，诸如甲酰胺，例如，50％(v/v)甲酰胺及0.1％牛血清清蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/具有750mM氯化钠，75mM柠檬酸钠的50mM磷酸钠缓冲液pH 6.5，42℃，或(3)使用50％甲酰胺，5x SSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH6.8)，0.1％焦磷酸钠，5x Denhardt氏溶液，超声处理的鲑精DNA(50μg/ml)，0.1％SDS和10％硫酸右旋糖苷，42℃，在42℃于0.2x SSC(氯化钠/柠檬酸钠)和50％甲酰胺中洗涤，55℃，然后在55℃由含有EDTA的0.1x SSC组成的高严格洗涤。
中等严格条件可规定为如Sambrook等的《Molecular Cloning：ALaboratory Manual》(New York：Cold Spring Harbor Press，1989)所描述的，而且包括使用与上文所述那些相比较不严格的洗涤溶液和杂交条件(例如温度、离子强度和％SDS)。中等严格条件的一个例子是在含：20％甲酰胺、5x SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5xDenhardt氏溶液、10％硫酸右旋糖苷和20mg/ml变性的剪切的鲑精DNA的溶液中于37℃温育过夜，然后于约37-50℃在1x SSC中洗涤滤膜。本领域熟练技术人员应当认识到如何根据适应诸如探针长度等因素的需要来调节温度、离子强度等。
“分离的”核酸分子指已经鉴定且与多肽核酸的天然来源中通常与之关联的至少一种污染性核酸分子分开的核酸分子。分离的核酸分子不同于在自然界中发现它时的形式或背景。分离的核酸分子因此与存在于天然细胞中时的核酸分子有区别。然而，分离的核酸分子包括通常表达该多肽的细胞中所包含的核酸分子，例如当所述核酸分子在所述细胞中的染色体定位不同于它在天然细胞中的染色体定位时。
“引物”一般是短的单链多核苷酸，一般具有游离的3′-OH基团，其通过与靶序列杂交而结合目的样品中潜在存在的靶，然后促进与靶互补的多核苷酸的聚合。
术语“持家基因”指所编码的蛋白质的活性对维持细胞功能来说是至关重要的一组基因。这些基因通常在所有细胞类型中相似表达。
术语“生物标志物”在用于本文时一般指其在哺乳动物组织或细胞中或上的表达可以通过标准方法(或本文所披露的方法)来检测且预测、诊断和/或预后哺乳动物组织或细胞对基于抑制血管发生的治疗方案(例如抗血管发生剂，诸如VEGF特异性抑制剂、Bv8特异性抑制剂、G-CSF特异性抑制剂)的敏感性的分子，包括基因、蛋白质、碳水化合物结构或糖脂。在某些实施方案中，此类生物标志物的表达测定出高于或低于在参照样品中所观察到的。此类生物标志物的表达可使用高通量多路免疫测定法来测定，诸如那些可购自Rules Based Medicine，Inc.或Meso Scale Discovery的。生物标志物的表达还可使用例如PCR或FACS测定法、免疫组织化学测定法或基于基因芯片的测定法来测定。
术语“阵列”或“微阵列”在用于本文时指可杂交阵列元素，优选多核苷酸探针(例如寡核苷酸)在基片上的有序排列。基片可以是固体基片(诸如玻璃载玻片)或半固体基片(诸如硝酸纤维素膜)。核苷酸序列可以是DNA、RNA、或其任意排列。
“靶基因”、“靶生物标志物”、“靶序列”、“靶核酸”或“靶蛋白质”在用于本文时指想要检测的感兴趣的多核苷酸或蛋白质。一般而言，“模板”在用于本文时指包含靶核苷酸序列的多核苷酸。在有些情况中，术语“靶序列”、“模板DNA”、“模板多核苷酸”、“靶核酸”、“靶多核苷酸”、及其变异可互换使用。
“扩增”在用于本文时一般指生成多拷贝的所需序列的过程。“多拷贝”指至少2个拷贝。“拷贝”不必指与模板序列有完美的序列互补性或同一性。例如，拷贝可包括诸如脱氧肌苷的核苷酸类似物、故意引入的序列改变(诸如通过包含能与模板杂交但不互补的序列的引物而引入的序列改变)、和/或在扩增过程中发生的序列错误。
“天然序列”多肽包括与衍生自自然界的多肽具有相同氨基酸序列的多肽。如此，天然序列多肽可以具有来自任何哺乳动物的天然存在多肽的氨基酸序列。此类天然序列多肽可以从自然界分离，或者可以通过重组或合成手段来生产。术语“天然序列”多肽明确涵盖该多肽的天然存在的截短或分泌形式(例如胞外结构域序列)、天然存在的变体形式(例如可变剪接形式)、及天然存在的等位变体。
“分离的”多肽或“分离的”抗体指已经鉴定且与/由其天然环境的一种成分分开和/或回收的多肽。多肽的天然环境的污染性成分指将会干扰其诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在某些实施方案中，将多肽纯化至(1)根据Lowry法的测定，多肽重量超过95％或重量超过99％，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据使用考马斯蓝或银染色的还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE，达到同质。既然多肽的天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的多肽包括重组细胞内的原位多肽。然而，分离的多肽通常通过至少一个纯化步骤来制备。
“多肽链”指其中其每个结构域通过肽键(不同于非共价相互作用或二硫键)与其它结构域相连的多肽。
多肽“变体”指与相应的天然序列多肽具有至少约80％氨基酸序列同一性的生物学活性多肽。此类变体包括例如其中在多肽的N和/或C末端添加或删除一个或多个氨基酸(天然存在氨基酸和/或非天然存在氨基酸)残基的多肽。通常，变体将会与天然序列多肽具有至少约80％氨基酸序列同一性，或至少约90％氨基酸序列同一性，或至少约95％或更多氨基酸序列同一性。变体还包括天然序列的多肽片段(例如亚序列、截短等)，通常是有生物学活性的多肽片段。
术语“蛋白质变体”在用于本文时指上文所述变体和/或在天然蛋白质序列中包含一处或多处氨基酸突变的蛋白质。任选的是，所述一处或多处氨基酸突变包括氨基酸替代。用于本发明的蛋白质及其变体可通过本领域众所周知的多种方法来制备。蛋白质的氨基酸序列变体可通过蛋白质DNA中的突变来制备。此类变体包括例如蛋白质氨基酸序列内的残基删除、插入或替代。可以进行删除、插入和替代的任何组合以获得具有期望活性的最终构建物。将在编码变体的DNA中进行的突变绝不能将序列置于读码框之外，而且优选不会产生能产生二级mRNA结构的互补区。EP 75,444A。
在某些实施方案中，多肽“变体”(即本文中公开的任何多肽的变体)指与相应的天然序列多肽具有至少约80％氨基酸序列同一性的生物学活性多肽。此类变体包括例如其中在多肽的N和/或C末端添加或删除一个或多个氨基酸(天然存在氨基酸和/或非天然存在氨基酸)残基的多肽。通常，变体将会与天然序列多肽具有至少约80％氨基酸序列同一性，或至少约90％氨基酸序列同一性，或至少约95％或更多氨基酸序列同一性。变体还包括天然序列的多肽片段(例如亚序列、截短等)，通常是有生物学活性的。
本文中的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与选定序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定用于测量对比的适宜参数，包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然而，为了本发明的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2如下所述获得的。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司编写，而且已经连同用户文档一起提交给美国版权局(USCopyright Office，Washington D.C.，20559)，并以美国版权注册号TXU510087注册，公众可通过Genentech公司(South San Francisco，California)获取。ALIGN2程序应当编译成在UNIX操作系统(优选数码UNIX V4.0D)上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。
为了本发明的目的，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：
分数X/Y乘100其中X是由序列对比程序ALIGN-2在该程序的A和B对比中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。可以领会，若氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等，则A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。
术语“拮抗剂”在用于本文时指能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰蛋白质的活性(包括其与一种或多种受体的结合(在配体的情况中)或与一种或多种配体的结合(在受体的情况中)的分子。拮抗剂包括抗体及其抗原结合片段、蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有机分子、肽模拟物、药用药剂及其代谢物、转录和翻译控制序列、诸如此类。拮抗剂还包括蛋白质的小分子抑制剂、和融合蛋白、能特异性结合蛋白质由此使其隔绝与其靶物结合的受体分子及衍生物、蛋白质的拮抗性变体、针对蛋白质的反义分子、RNA适体、和针对蛋白质的核酶。
术语“抗体”以最广义使用，明确涵盖单克隆抗体(包括全长的或完整的单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、及抗体片段(见下文)，只要它们展现出期望的生物学活性。
除非另有说明，表述“多价抗体”贯穿本说明书用于指包含三个或更多抗原结合位点的抗体。多价抗体通常改造成具有三个或更多抗原结合位点，而且一般不是天然序列IgM或IgA抗体。
“阻断性”抗体或“拮抗性”抗体指抑制或降低其所结合的抗原的生物学活性的抗体。某些阻断性抗体或拮抗性抗体实质或完全抑制抗原的生物学活性。
“激动性抗体”在用于本文时指部分或完全模拟目的多肽的至少一项功能性活性的抗体。
“抗体片段”只包含完整抗体的一部分，一般包括完整抗体的抗原结合位点，因此保留了与抗原结合的能力。此定义所涵盖的抗体片段的例子包括：(i)Fab片段，其具有VL、CL、VH和CH1结构域；(ii)Fab′片段，其是在CH1结构域的C-末端具有一个或多个半胱氨酸残基的Fab片段；(iii)Fd片段，其具有VH和CH1结构域；(iv)Fd′片段，其具有VH和CH1结构域及CH1结构域C-末端的一个或多个半胱氨酸残基；(v)Fv片段，其具有抗体单臂的VL和VH结构域；(vi)dAb片段(Ward et al.，Nature 341：544-546(1989))，其由VH结构域组成；(vii)分离的CDR区；(viii)F(ab′)2片段，包含通过铰链区的二硫键相连的两个Fab′片段的二价片段；(ix)单链抗体分子(例如单链Fv；scFv)(Birdet al.，Science 242：423-426(1988)和Huston et al.，PNAS(USA)85：5879-5883(1988))；(x)“双抗体”，其具有两个抗原结合位点，包含在同一条多肽链中相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)(参见例如EP 404,097；WO93/11161；和Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993))；(xi)“线性抗体”，其包含一对串联的Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata et al.，Protein Eng.8(10)：1057-1062(1995)和美国专利5,641,870)。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体是相同的，除了可以以极小量存在的可能突变(例如天然存在突变)外。如此，修饰语“单克隆”表明抗体不是不同抗体混合物的特征。单克隆抗体是针对单一抗原高度特异性的。在某些实施方案中，单克隆抗体典型的包括包含能结合靶物的多肽序列的抗体，其中靶物结合多肽序列是通过包括从众多多肽序列中选择单一靶物结合多肽序列在内的过程得到的。例如，选择过程可以是从众多克隆(诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的集合)中选择独特克隆。应当理解，所选择的靶物结合序列可进一步改变，例如为了提高对靶物的亲和力、将靶物结合序列人源化、提高其在细胞培养物中的产量、降低其在体内的免疫原性、创建多特异性抗体等，而且包含改变后的靶物结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性之外，单克隆抗体制备物的优点在于它们通常未受到其它免疫球蛋白的污染。
修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，将依照本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括例如杂交瘤法(例如Kohler and Milstein，Nature 256：495-97(1975)；Hongo et al.，Hybridoma，14(3)：253-260(1995)；Harlow et al.，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，2nd ed.1988；Hammerling et al.，于：Monoclonal Antibodies and T-CellHybridomas，563-681，Elsevier，N.Y.，1981)、重组DNA法(参见例如美国专利No.4,816,567)、噬菌体展示技术(参见例如Clackson et al.，Nature 352：624-628(1991)；Marks et al.，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)；Sidhu et al.，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee et al.，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；及Lee et al.，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004))、及用于在具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中生成人或人样抗体的技术(参见例如WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO1991/10741；Jakobovits et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551(1993)；Jakobovits et al.，Nature 362：255-258(1993)；Bruggemann et al.，Year inImmuno.7：33(1993)；美国专利No.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016；Marks et al.，Bio/Technology 10：779-783(1992)；Lonberget al.，Nature 368：856-859(1994)；Morrison，Nature 368：812-813(1994)；Fishwild et al.，Nature Biotechnol.14：845-851(1996)；Neuberger，NatureBiotechnol.14：826(1996)；及Lonberg and Huszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995))。
单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利No.4,816,567和Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠、家兔或非人灵长类动物)的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有找到的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个如下的可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones et al.，Nature321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature 332：323-329(1988)；及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。还可参见例如Vaswani and Hamilton，Ann.Allergy，Asthma&Immunol.1：105-115(1998)；Harris，Biochem.Soc.Transactions 23：1035-1038(1995)；Hurle and Gross，Curr.Op.Biotech.5：428-433(1994)；及美国专利No.6,982,321和7,087,409。还可参见van Dijkand van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol.，5：368-74(2001)。人抗体可以如下制备，即将抗原施用于转基因动物，其经修饰而应答抗原挑战生成此类抗体，但是其内源基因座已经失去能力，例如经免疫的异种移植小鼠(xenomice)(参见例如美国专利No.6,075,181和6,150,584，关于XENOMOUSETM技术)。还可参见例如Li et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103：3557-3562(2006)，关于经人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体。
“人抗体”指拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术生成的抗体。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来生成。在一个实施方案中，人抗体是从噬菌体文库选择的，该噬菌体文库表达人抗体(Vaughan et al.，Nature Biotechnology 14：309-314(1996)；Sheets et al.，PNAS(USA)95：6157-6162(1998)；Hoogenboom andWinter，J.Mol.Biol.227：381(1991)；Marks et al.，J.Mol.Biol.222：581(1991))。人抗体还可通过将人免疫球蛋白基因座导入内源免疫球蛋白基因已经部分或完全灭活的转基因动物例如小鼠来生成。在受到攻击时，观察到人抗体生成，它在所有方面与在人体中看到的极其相似，包括基因重排、装配和抗体全集。这种方法记载于例如美国专利No.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016，及以下科学出版物：Marks et al.，Bio/Technology 10：779-783(1992)；Lonberg et al.，Nature 368：856-859(1994)；Morrison，Nature 368：812-13(1994)；Fishwild et al.，Nature Biotechnology14：845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology 14：826(1996)；Lonberg andHuszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995)。或者，人抗体可通过生成针对靶抗原的抗体的人B淋巴细胞的永生化来制备(此类B淋巴细胞可从个体回收，或者可在体外免疫)。参见例如Cole et al.，Monoclonal Antibodies andCancer Therapy，Alan R.Liss，p.77(1985)；Boerner et al.，J.Immunol.147(1)：86-95(1991)；美国专利No.5,750,373。
术语“可变的”指可变域中的某些部分在抗体间序列差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变域。它集中于轻链和重链可变域中称作高变区的三个区段。可变域中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR，它们大多采取β-折叠片构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠片结构一部分的三个高变区连接。每条链中的高变区通过FR非常接近的保持在一起，并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat et al.，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service，National Institute of Health，Bethesda，MD.(1991))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如抗体在抗体依赖性细胞的细胞毒性中的参与。
术语“高变区”、“HVR”或“HV”在用于本文时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。例如，术语高变区指抗体可变域中序列上高度可变和/或形成结构上定义的环的区域。通常，抗体包含六个HVR：三个在VH中(H1、H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。在天然抗体中，H3和L3展示这六个HVR的最大多样性，而且认为特别是H3在赋予抗体以精密特异性中发挥独特作用。参见例如Xu et al.Immunity 13：37-45(2000)；Johnson and Wu于：Methods in Molecular Biology 248：1-25(Lo，ed.，Human Press，Totowa，NJ，2003)。事实上，仅由重链组成的天然存在camelid抗体在缺乏轻链时是有功能的且稳定的。参见例如Hamers-Casterman et al.Nature 363：446-448(1993)；Sheriffet al.Nature Struct.Biol.3：733-736(1996)。
本文中使用且涵盖许多HVR的叙述。Kabat互补决定区(CDR)是以序列变异性为基础的，而且是最常用的(Kabat et al.，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD.(1991))。Chothia改为指结构环的位置(Chothia and LeskJ.Mol.Biol.196：901-917(1987))。AbM HVR代表Kabat HVR与Chothia结构环之间的折衷，而且得到Oxford Molecular的AbM抗体建模软件的使用。“接触”HVR是以对可获得的复合物晶体结构的分析为基础的。下文记录了这些HVR中每一个的残基。
Figure BDA0000145434760000391
HVR可包括如下“延伸的HVR”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)及VH中的26-35(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。对于这些定义中的每一个，可变域残基是依照Kabat等，见上文编号的。
“框架区”或“FR”残基指可变域中除本文中所定义的高变区残基之外的那些残基。
术语“依照Kabat的可变域残基编号方式”或“依照Kabat的氨基酸位置编号方式”及其变化形式指Kabat et al.，见上文中的用于抗体重链可变域或轻链可变域编辑的编号系统。使用此编号系统，实际的线性氨基酸序列可包含较少或另外的氨基酸，对应于可变域FR或HVR的缩短或插入。例如，重链可变域可包含H2残基52后的单一氨基酸插入(依照Kabat为残基52a)及重链FR残基82后的插入残基(例如依照Kabat为残基82a、82b和82c等)。给定抗体的Kabat残基编号方式可通过将抗体序列与“标准”Kabat编号序列对比同源区来确定。
贯穿本说明书和权利要求书，Kabat编号系统一般在提及可变域中的残基(大约是轻链残基1-107和重链残基1-113)时使用(例如Kabat et al.，Sequences of Immunological Interest.5th Ed.Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，Md.(1991))。“EU编号系统”或“EU索引”一般在提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时使用(例如Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)中报道的EU索引，明确收入本文作为参考)。除非本文中另有说明，提及抗体可变域中的残基编号指根据Kabat编号系统的残基编号方式。除非本文中另有说明，提及抗体恒定域中的残基编号指根据EU编号系统的残基编号方式(例如参见美国临时申请No.60/640,323，EU编号方式的图)。
根据其重链恒定域的氨基酸序列，抗体(免疫球蛋白)可归入不同的类。免疫球蛋白有五大类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1(包括非A和A同种异型)、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。将与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ和μ。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的，一般性记载于例如Abbas et al.，Cellular and Mol.Immunology，4th ed.(W.B.Saunders，Co.，2000)。抗体可以是抗体与一种或多种其它蛋白质或肽共价或非共价结合而形成的更大融合分子的一部分。
根据其恒定域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可归入两种截然不同的型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C端区，其可以是通过木瓜蛋白酶消化完整抗体生成的。Fc区可以是天然序列Fc区或变异Fc区。虽然免疫球蛋白重链Fc区的边界可以变化，但是人IgG重链Fc区通常定义为Fc区自大约Cys226位置或大约Pro230位置的氨基酸残基至羧基末端的区段。Fc区的C-末端赖氨酸(残基447，依照EU编号系统)可以消除，例如在生产或纯化抗体的过程中，或者通过对编码抗体重链的核酸进行重组工程改造。因而，完整抗体的组合物可包括所有K447残基都被消除的抗体群、无一K447残基被消除的抗体群、或者混合了有和无K447残基的抗体的抗体群。免疫球蛋白的Fc区一般包含两个恒定域，即CH2结构域和CH3结构域，任选包含CH4结构域。
除非本文另有说明，免疫球蛋白重链的残基编号方式是如Kabat et al.，见上文中的EU索引的编号方式。“如Kabat中的EU索引”指人IgG1 EU抗体的残基编号方式。
“Fc区链”在本文中指Fc区两条多肽链之一。
人IgG Fc区的“CH2结构域”(也称为“Cg2”结构域)通常自约第231位氨基酸残基延伸至约第340位氨基酸残基。CH2结构域的独特之处在于它没有与另一结构域紧密配对。而是，有两个N-连接的分支的碳水化合物链介于完整天然IgG分子的两个CH2结构域之间。推测碳水化合物可能提供结构域-结构域配对的替代且有助于稳定CH2结构域。Burton，Molec.Immunol.22：161-206(1985)。CH2结构域在本文中可以是天然序列CH2结构域或变异CH2结构域。
“CH3结构域”包含Fc区中CH2结构域C端的一段残基(即自IgG的约第341位氨基酸残基至约第447位氨基酸残基)。CH3区在本文中可以是天然序列CH3结构域或变异CH3结构域(例如在其一条链中具有引入的“隆起”(protroberance)而在其另一条链中具有相应引入的“空腔”(cavity)的CH3结构域；参见美国专利No.5,821,333，明确收入本文作为参考)。此类变异CH3结构域可用于生成本文所述多特异性(例如双特异性)抗体。
“铰链区”通常定义为自人IgG1的约Glu216或约Cys226至约Pro230的区段(Burton，Molec.Immunol.22：161-206(1985))。其它IgG同种型的铰链区可以通过将第一个和最后一个形成重链间S-S键的半胱氨酸残基置于相同位置而与IgG1序列对比。铰链区在本文中可以是天然序列铰链区或变异铰链区。变异铰链区的两条多肽链通常每条多肽链保留至少一个半胱氨酸残基，使得变异铰链区的两条多肽链可在两条链之间形成二硫键。本文中优选的铰链区是天然序列人铰链区，例如天然序列人IgG1铰链区。
“功能性Fc区”拥有天然序列Fc区的“效应器功能”。例示性的“效应器功能”包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)下调等。此类效应器功能一般要求Fc区与结合结构域(例如抗体可变域)联合，而且可以使用本领域已知的用于评估此类抗体效应器功能的多种测定法来评估。
“天然序列Fc区”包含与在自然界中找到的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1 Fc区(非A和A同种异型)；天然序列人IgG2 Fc区；天然序列人IgG3 Fc区；和天然序列人IgG4 Fc区；及其天然存在变体。
“完整”抗体指包含抗原结合可变区以及轻链恒定区(CL)和重链恒定区CH1、CH2和CH3的抗体。恒定区可以是天然序列恒定区(例如人天然序列恒定区)或其氨基酸序列变体。优选的是，完整抗体具有一项或多项效应物功能。
“亲本抗体”或“野生型”抗体指包含如下氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列与本文所公开的抗体变体相比缺少一处或多处氨基酸序列改变。如此，亲本抗体一般具有至少一个如下高变区，所述高变区在氨基酸序列方面与本文所公开的抗体变体的相应高变区的氨基酸序列不同。亲本多肽可包含天然序列(即不然存在的)抗体(包括天然存在的等位变体)或具有天然存在序列的预先存在的氨基酸序列修饰(诸如插入、删除和/或其它改变)的抗体。贯穿本公开内容，“野生型”、“WT”、“wt”、和“亲本”抗体可互换使用。
在用于本文时，“抗体变体”或“变体抗体”指具有如下氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列与亲本抗体的氨基酸序列不同。优选的是，抗体变体包含具有在自然界中未找到的氨基酸序列的重链可变域或轻链可变域。此类变体必然地与亲本抗体具有少于100％的序列同一性或相似性。在一个优选的实施方案中，抗体变体会具有如下的氨基酸序列，所述氨基酸序列与亲本抗体的重链或轻链可变域具有约75％至少于100％，更优选约80％至少于100％，更优选约85％至少于100％，更优选约90％至少于100％，和最优选约95％至少于100％的氨基酸序列特异性或相似性。抗体变体一般是在其一个或多个高变区中或附近包含一处或多处氨基酸改变的抗体。
“变异Fc区”包含由于至少一处氨基酸修饰而与天然序列Fc区有所不同的氨基酸序列。在某些实施方案中，变异Fc区具有与天然序列Fc区或与亲本多肽的Fc区相比至少一处氨基酸替代，例如在天然序列Fc区中或在亲本多肽的Fc区中具有约1处至约10处氨基酸替代，优选约1处至约5处氨基酸替代，例如在天然序列Fc区中或在亲本多肽的Fc区中具有约1处至约10处氨基酸替代，优选约1处至约5处氨基酸替代。典型的是，变异Fc区在本文中将与天然序列Fc区和/或亲本多肽的Fc区拥有至少约80％序列同一性，或至少约90％序列同一性，或至少约95％或更多序列同一性。
抗体“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指其中结合到某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)上的分泌型Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞，随后用细胞毒素杀死靶细胞的细胞毒性形式。介导ADCC的主要细胞即NK细胞只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估感兴趣分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，诸如美国专利No.5,500,362或5,821,337中所记载的。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes et al.，PNAS(USA)95：652-656(1998)中所披露的。
“人效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应器功能的白细胞。在某些实施方案中，该细胞至少表达FcγRIII并行使ADCC效应器功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性细胞，一般优选PBMC和NK细胞。效应细胞可以从其天然来源(例如从血液或PBMC)分离，如本文所述。
“Fc受体”或“FcR”描述结合抗体Fc区的受体。在有些实施方案中，FcR是天然人FcR。在有些实施方案中，FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)，包括属于FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括那些受体的等位变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，区别主要在于其胞质结构域。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见例如
Figure BDA0000145434760000441
，Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))。FcR的综述参见例如Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)；Capel et al.，Immunomethods 4：25-34(1994)；及de Haas etal.，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)。术语“FcR”在本文中涵盖其它FcR，包括那些未来将会鉴定的。
术语“Fc受体”或“FcR”还包括新生儿受体，FcRn，它负责将母体IgG转移给胎儿(Guyer et al.，J.Immunol.117：587(1976)和Kim et al.，J.Immunol.24：249(1994))并调节免疫球蛋白的体内稳态。测量对FcRn的结合的方法是已知的(参见例如Ghetie 1997，Hinton 2004)。测量对FcRn的结合的方法是已知的(参见例如Ghetie and Ward.，Immunol.Today 18(12)：592-598(1997)；Ghetie etal.，Nature Biotechnology，15(7)：637-640(1997)；Hinton et al.，J.Biol.Chem.279(8)：6213-6216(2004)；WO 2004/92219(Hinton et al.))。
可测定人FcRn高亲和力结合多肽与人FcRn的体内结合和血清半衰期，例如在表达人FcRn的转基因小鼠或经转染人细胞系中，或者在施用了具有变异Fc区的多肽的灵长类动物中。WO 00/42072(Presta)记载了对FcR的结合提高或降低的抗体变体。还可参见例如Shields et al.，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001)。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指存在补体时对靶细胞的溶解。经典补体途径的激活是由补体系统第一组分(C1q)结合抗体(适宜亚类的)起始的，该抗体已结合至其关联抗原。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如如Gazzano-Santoro et al.，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所记载的。具有更改的Fc区氨基酸序列(具有变异Fc区的多肽)及提高或降低的C1q结合能力的多肽变体记载于例如美国专利No.6,194,551B1和WO1999/51642。还可参见例如Idusogie et al.，J.Immunol.164：4178-4184(2000)。
“亲和力成熟的”抗体指在抗体的一个或多个CDR中具有一处或多处改变、导致该抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有所改进的抗体。在一个实施方案，亲和力成熟的抗体具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体可通过本领域已知规程来生成。Markset al.，Bio/Technology 10：779-783(1992)记载了通过VH和VL结构域改组进行的亲和力成熟。以下文献记载了CDR和/或框架残基的随机诱变：Barbas et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91：3809-3813(1994)；Schier et al.，Gene 169：147-155(1995)；Yelton et al.，J.Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson et al.，J.Immunol.154(7)：3310-9(1995)；及Hawkins et al.，J.Mol.Biol.226：889-896(1992)。
“柔性接头”在本文中指包含两个或更多通过肽键相连的氨基酸残基且为由其连接的两段多肽(诸如两个Fd区)提供更多旋转自由的肽。所述旋转自由容许由柔性接头连接的两个或更多抗原结合位点各自更高效的接近靶抗原。合适的柔性接头肽序列的例子包括gly-ser、gly-ser-gly-ser(SEQ ID NO：18)、ala-ser、和gly-gly-gly-ser(SEQ ID NO：19)。
“二聚化结构域”是由至少两个氨基酸残基(一般是半胱氨酸残基)或者至少两个肽或多肽(其可以具有相同或不同的氨基酸序列)结合形成的。所述肽或多肽可以经由共价和/或非共价结合而彼此相互作用。本文中的二聚化结构域的例子包括Fc区；铰链区；CH3结构域；CH4结构域；CH1-CL对；具有“结节”(knob)和/或“突起”(protruberance)的“界面”，如美国专利No.5,821,333中所记载的，明确收入本文作为参考；亮氨酸拉链(例如jun/fos亮氨酸拉链，参见Kostelney et al.，J.Immunol.，148：1547-1553(1992)；或酵母GCN4亮氨酸拉链)；异亮氨酸拉链；受体二聚体对(例如白介素-8受体(IL-8R)；和整联蛋白异二聚体，诸如LFA-1和GPIIIb/IIIa)或其二聚化区；二聚体配体多肽(例如神经生长因子(NGF)、神经营养因子-3(NT-3)、白介素-8(IL-8)、血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF-C、VEGF-D、PDGF成员、和脑衍生神经营养性因子(BDNF)；参见Arakawa et al.J.Biol.Chem.269(45)：27833-27839(1994)及Radziejewski et al.Biochem.32(48)：1350(1993))或其二聚化区；一对能够形成二硫键的半胱氨酸残基；一对肽或多肽，各自包含至少一个半胱氨酸残基(例如约1个、2个或3个到约10个半胱氨酸残基)使得可以在所述肽或多肽之间形成二硫键(下文的“合成铰链”)；及抗体可变域。本文中最优选的二聚化结构域是Fc区或铰链区。
抗体的“功能性抗原结合位点”指能够结合靶抗原的位点。抗原结合位点的抗原结合亲和力不必像衍生该抗原结合位点的亲本抗体那样强，但是结合抗原的能力必须是使用已知用于评估抗体对抗原结合的多种方法之任一可测量到的。此外，本文中多价抗体的每个抗原结合位点的抗原结合亲和力不必定量相同。对于本文中的多聚体抗体，功能性抗原结合位点的数目可以使用超速离心分析来评估。依照这种分析方法，将靶抗原与多聚体抗体以不同比例混合，并计算复合物的平均分子量，其中假设不同数目的功能性结合位点。将这些理论值与得到的实际实验值进行比较以评估功能性结合位点的数目。
具有指定抗体的“生物学特征”的抗体指拥有该指定抗体区别于其它结合相同抗原的抗体的一项或多项生物学特征的抗体。
为了筛选结合抗原上感兴趣抗体所结合的表位的抗体，可以实施常规交叉阻断测定法，诸如Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Ed Harlow and David Lane(1988)中所记载的。
术语“表位”用于指蛋白质抗原上(单克隆或多克隆)抗体的结合位点。
如本文中使用的，“治疗”或“处理”指用于获得有益或期望临床结果的办法。为了本发明的目的，有益或期望临床结果包括但不限于缓解症状、削弱疾病的程度、疾病状态稳定(即不恶化)、延迟或减缓疾病进展、改善或减轻疾病状态、及消退(无论是部分的还是完全的)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”或“处理”还可以指与不接受治疗的预期存活相比延长存活。“治疗”或“处理”指旨在预防病症发展或改变病症病理而进行的干预。因此，“治疗”或“处理”指治疗性处理及预防性或防范性措施二者，其中目标是预防或减缓(减轻)所针对的病理疾患或病症。需要治疗的受试者包括早就患有病症的受试者以及要预防病症的受试者。具体而言，治疗或处理可直接预防、减缓或以其它方式减轻细胞变性或损伤的病理，诸如与肿瘤转移、肿瘤细胞迁移和/或CD11b+Gr1+细胞动员有关的疾病或状况的病理。
术语“有效量”或“治疗有效量”指在受试者中有效治疗疾病或病症的药物量。在某些实施方案中，有效量指足以实现有益或期望治疗(包括预防)结果的量。有效量可以在一次或多次施用中施用。在某些实施方案中，有效量指在必需的剂量和时间上有效实现期望的治疗或预防结果的量。本发明的物质/分子的治疗有效量可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重及该物质/分子在个体中引发期望应答的能力等因素而变化。治疗有效量涵盖该物质/分子的治疗有益效果胜过任何有毒或有害后果的量。在癌症的情况中，有效量的药物可减少癌细胞的数目；缩小肿瘤的尺寸；抑制(即一定程度的减缓，典型的是阻止)癌细胞浸润入周围器官；抑制(即一定程度的减缓，典型的是阻止)肿瘤转移；一定程度的抑制肿瘤生长；容许治疗肿瘤；和/或一定程度的减轻一种或多种与病症有关的症状。根据药物可阻止现有癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞的程度，它可以是细胞抑制性的和/或细胞毒性的。
“预防有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的预防效果的量。通常而非必然，由于预防剂量是在疾病发作之前或在疾病的早期用于受试者的，因此预防有效量低于治疗有效量。
在癌变前、良性、早期或晚期肿瘤的情况中，血管发生抑制剂的治疗有效量可减少癌细胞数；缩小原发性肿瘤尺寸；抑制(即一定程度的减缓，优选停止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即一定程度的减缓，优选停止)肿瘤转移；一定程度的抑制或延迟肿瘤生长或肿瘤进展；和/或一定程度的减轻与病症有关的一种或多种症状。就药物可预防癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞的程度而言，它可以是抑制细胞的和/或毒害细胞的。
“个体”、“受试者”、或“患者”指脊椎动物。在某些实施方案中，脊椎动物指哺乳动物。哺乳动物包括，但不限于，牲畜(诸如牛)、运动用动物、宠物(诸如猫、犬、和马)、灵长类动物、小鼠和大鼠。在某些实施方案中，哺乳动物指人。
“维持疗法”意指为了降低疾病复发或进展的可能性而给予的治疗方案。维持疗法可提供任意长度的时间，包括长至受试者终身的延长的时段。维持疗法可在初始疗法之后或与初始或别的疗法联合提供。用于维持疗法的剂量可变化，而且可包括与其它类型的疗法使用的剂量相比降低的剂量。
“新辅助疗法”或“术前疗法”在本文中指在手术之前给予的疗法。新辅助疗法的目标是提供立即的系统治疗，潜在根除若遵循标准序列手术继以系统疗法则会增殖的微转移。新辅助疗法还可帮助缩小肿瘤尺寸，由此容许完全切除起初可不切除的肿瘤或保留部分器官及其功能。另外，新辅助疗法容许体内评估药物功效，这可指导后续治疗的选择。
“辅助疗法”在本文中指在手术之后给予的疗法，其中检测不到残余疾病的迹象，从而来降低疾病复发的风险。辅助疗法的目标是预防癌症复发，及因此降低癌症相关死亡的机会。
在本文中，“标准治疗(standard of care)”化疗指常规使用来治疗特定癌症的化疗剂。
“确定性手术”(definitive surgery)指完全切除肿瘤及周围组织以及任何涉及的淋巴结。
“可手术”癌症指限于原发性器官且适合于手术的癌症。
“肿瘤”在用于本文时指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。如本文中所提及的，术语“癌症”、“癌性”、“细胞增殖性病症”、“增殖性病症”和“肿瘤”不互相排斥。
肿瘤可以是实体瘤或者是非实体瘤或软组织肿瘤。软组织肿瘤的例子包括白血病(例如慢性髓细胞性白血病(chronic myelogenous leukemia)、急性髓细胞性白血病(acute myelogenous leukemia)、成人急性成淋巴细胞性白血病(adult acute lymphoblastic leukemia)、急性髓细胞性白血病(acute myelogenousleukemia)、成熟B细胞急性成淋巴细胞性白血病(mature B-cell acutelymphoblastic leukemia)、慢性淋巴细胞性白血病(chronic lymphocyticleukemia)、多形核细胞性白血病(polymphocytic leukemia)、或毛细胞性白血病(hairy cell leukemia))、或淋巴瘤(例如非何杰金氏淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、或何杰金氏病(Hodgkin’s disease))。实体瘤包括血液、骨髓、或淋巴系统以外的身体组织的任何癌症。实体瘤可进一步分成上皮细胞起源的那些和非上皮细胞起源的那些。实体瘤的例子包括结肠、乳腺、前列腺、肺、肾、肝、胰腺、卵巢、头和颈、口腔、胃、十二指肠、小肠、大肠、胃肠道、肛门、胆囊、唇(labium)、鼻咽、皮肤、子宫、男性生殖器官、泌尿器官、膀胱、和皮肤的肿瘤。非上皮起源的实体瘤包括肉瘤、脑瘤、和骨瘤。
术语“癌症”和“癌性”指向或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调节的生理疾患。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴样恶性肿瘤。此类癌症的更具体例子包括但不限于鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌和肺的鳞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌和胃肠基质癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、肝瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、黑素瘤、浅表扩散性黑素瘤、恶性雀斑样痣黑素瘤、肢端黑素瘤、结节性黑素瘤、多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞性(SL)NHL、中级/滤泡性NHL、中级弥漫性NHL、高级成免疫细胞性NHL、高级成淋巴细胞性NHL、高级小无核裂细胞性NHL、贮积病(bulkydisease)NHL、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦(Waldenstrom)氏巨球蛋白血症)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、毛细胞性白血病、慢性成髓细胞性白血病、和移植后淋巴增殖性病症(PTLD)、以及与瘢痣病(phakomatoses)、水肿(诸如与脑瘤有关的)和梅格斯(Meigs)氏综合征有关的异常血管增殖、脑瘤和脑癌、以及头颈癌、及相关转移。在某些实施方案中，适合于通过本发明的抗G-CSF抗体、抗Bv8抗体、抗PKR1抗体或其任意组合来治疗的癌症包括乳腺癌、结肠直肠癌、直肠癌、非小细胞肺癌、成胶质细胞瘤、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、肾细胞癌、前列腺癌、黑素瘤、肝癌、胰腺癌、软组织肉瘤、卡波西(Kaposi)氏肉瘤、类癌(carcinoid carcinoma)、头颈癌、卵巢癌和多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，癌症选自下组：小细胞肺癌、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、黑素瘤、乳腺癌、胃癌、结肠直肠癌(CRC)、和肝细胞癌。还有，在一些实施方案中，癌症选自下组：非小细胞肺癌、结肠直肠癌、肾细胞癌、卵巢癌、前列腺癌、成胶质细胞瘤和乳腺癌，包括那些癌症的转移性形式。
术语癌症涵盖增殖性病症的集合，包括但不限于癌前生长、良性肿瘤、恶性肿瘤和休眠的肿瘤。良性肿瘤仍然局限于起源部位且没有能力渗透、侵入、或转移至远端部位。恶性肿瘤会侵入并损害它们周围的其它组织。它们还能获得脱离起源部位并传播至身体其它部分(转移)(通常经由血流或在淋巴结所处位置经由淋巴系统)的能力。休眠的肿瘤指静止肿瘤，其中肿瘤细胞存在但肿瘤进展在临床上不明显。原发性肿瘤以发生它们的组织类型来分类；转移性肿瘤以衍生癌细胞的组织类型来分类。随着时间消逝，恶性肿瘤的细胞变得越来越异常，而且表现出更不像正常细胞。癌细胞外观的这种变化称作肿瘤等级(tumor grade)，而且将癌细胞描述为完全分化的(well-differentiated)、中度分化的(moderately-differentiated)、不良分化的(poorly-differentiated)、或未分化的(undifferentiated)。完全分化的细胞相当正常，表现为和类似它们起源的正常细胞。未分化的细胞指已经变得如此异常以致于不再可能确定其起源的细胞。
上皮癌症一般自良性肿瘤进展至侵入前阶段(例如原位癌)，至恶性癌症，其渗透基底膜并侵入上皮下基质。
“发育异常”指组织、器官、或细胞的任何异常生长或发育。在某些实施方案中，发育异常是高级的或癌前的。
术语“抗性肿瘤”或“不依赖VEGF的肿瘤”指对包含至少一种VEGF拮抗剂的癌症疗法的疗程没有完全响应，或丧失响应或显示降低的响应的癌症、癌性细胞、或肿瘤。在某些实施方案中，抗性肿瘤是对抗VEGF抗体疗法有抗性的肿瘤。在一个实施方案中，抗VEGF抗体是贝伐单抗。在某些实施方案患者，抗性肿瘤是不大可能响应包含至少一种VEGF拮抗剂的癌症疗法的肿瘤。
“顽固性”或“不应性”指疾病或疾患对治疗有抗性或没有响应(例如，即使给予治疗，新生性浆细胞的数目仍增加)。在某些实施方案中，术语“顽固性”或“不应性”指对任何先前治疗(包括但不限于VEGF拮抗剂、抗血管发生剂和化疗治疗)有抗性或没有响应。在某些实施方案中，术语“顽固性”或“不应性”指疾病或疾患对任何先前治疗(包括VEGF拮抗剂、抗血管发生剂和/或化疗治疗)的内在不响应性。在某些实施方案中，VEGF拮抗剂是抗VEGF抗体。
“复发”指患者的病退行回到其从前的患病状态，尤其是在表观恢复(apparent recovery)或部分恢复(partial recovery)后症状的回复。在某些实施方案中，复发状态指回到先前治疗(包括但不限于VEGF拮抗剂、抗血管发生剂和化疗治疗)前的病的过程或回到先前治疗前的病。在某些实施方案中，复发状态指在对癌症疗法(包括VEGF拮抗剂、抗血管发生剂和/或化疗治疗)的初始强响应之后，回到病的过程或回到病。在某些实施方案中，VEGF拮抗剂是抗VEGF抗体。
术语“抗癌疗法”或“癌症疗法”指在治疗癌症中有用的疗法。抗癌治疗剂的例子包括但不限于例如化疗剂、生长抑制剂、细胞毒剂、放射疗法中所使用的药剂、抗血管发生剂、凋亡剂、抗微管蛋白剂、和其它治疗癌症的药剂，诸如抗HER-2抗体、抗CD20抗体、表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂(例如酪氨酸激酶抑制剂)、HER1/EGFR抑制剂(例如erlotinib(TARCEVA
Figure BDA0000145434760000511
))、血小板衍生生长因子抑制剂(例如GLEEVEC
Figure BDA0000145434760000512
(Imatinib Mesylate))、COX-2抑制剂(例如celecoxib)、ERBITUX
Figure BDA0000145434760000513
(cetuximab，Imclone)、干扰素、细胞因子、结合一种或多种以下靶物的拮抗剂(例如中和性抗体)(ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR-β、BlyS、APRIL、BCMA或VEGF受体、TRAIL/Apo2)、和其它生物活性和有机化学剂，等。本发明还包括它们的组合。
术语“抗肿瘤组合物”指可用于治疗癌症的组合物，其包含至少一种活性治疗剂，例如“抗癌剂”。治疗剂(抗癌剂)的例子包括但不限于例如化疗剂、生长抑制剂、细胞毒剂、放射疗法中所使用的药剂、抗血管发生剂、凋亡剂、抗微管蛋白剂、毒素、和其它用于治疗癌症的药剂，例如抗VEGF中和性抗体、VEGF拮抗剂、抗HER-2、抗CD20、表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂(例如酪氨酸激酶抑制剂)、HER1/EGFR抑制剂、erlotinib、COX-2抑制剂(例如塞来考昔(celecoxib))、干扰素、细胞因子、能与ErbB2、ErbB3、ErbB4、或VEGF受体中的一种或多种结合的拮抗剂(例如中和性抗体)、血小板衍生生长因子(PDGF)和/或干细胞因子(SCF)的受体酪氨酸激酶的抑制剂(例如甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate)(Gleevec
Figure BDA0000145434760000514
Novartis))、TRAIL/Apo2、及其它生物活性和有机化学剂等。本发明还包括它们的组合。
术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括放射性同位素(例如211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P和Lu的放射性同位素)、化疗剂、和毒素(诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素，包括其片段和/或变体)。
“生长抑制剂”在用于本文时指在体外和/或在体内抑制细胞生长的化合物或组合物。如此，生长抑制剂可以是显著降低处于S期的细胞百分比的药剂。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期行进(处于S期以外的位置)的药剂，诸如诱导G1停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长春药类(vincas)(长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))、TAXOL
Figure BDA0000145434760000515
和拓扑异构酶II抑制剂，诸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。那些阻滞G1的药剂也溢出进入S期停滞，例如DNA烷化剂类，诸如他莫昔芬(tamoxifen)、泼尼松(prednisone)、达卡巴嗪(dacarbazine)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、顺铂(cisplatin)、甲氨喋呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可参见The Molecular Basis of Cancer，Mendelsohn and Israel编，第1章，题为“Cell cycle regulation，oncogenes，and antineoplastic drugs”，Murakamiet al.，WB Saunders，Philadelphia(1995)，尤其是第13页。
“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂类(alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa)和CYTOXAN
Figure BDA0000145434760000521
环磷酰胺(cyclophosphamide)；磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol)，MARINOL
Figure BDA0000145434760000522
)；β-拉帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素类(colchicines)；白桦脂酸(betulinicacid)；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan)(HYCAMTIN
Figure BDA0000145434760000523
)、CPT-11(伊立替康(irinotecan)，CAMPTOSAR
Figure BDA0000145434760000524
)、乙酰喜树碱、东莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(例如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见例如Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.33：183-186(1994))；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括ADRIAMYCIN
Figure BDA0000145434760000531
吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、盐酸多柔比星脂质体注射剂(DOXIL
Figure BDA0000145434760000532
)和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；培美曲赛(pemetrexed)(ALIMTA)；吉西他滨(gemicitabine)(GEMZAR)；抗代谢物类，诸如甲氨喋呤(methotrexate)、吉西他滨(gemcitabine)(GEMZAR
Figure BDA0000145434760000535
)、替加氟(tegafur)(UFTORAL
Figure BDA0000145434760000536
)、卡培他滨(capecitabine)(XELODA
Figure BDA0000145434760000537
)、埃坡霉素(epothilone)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨喋呤(methotrexate)、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多糖复合物(JHS NaturalProducts，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)(ELDISINEFILDESIN
Figure BDA0000145434760000543
)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇类(taxoids)，例如帕利他塞(paclitaxel)(TAXOL
Figure BDA0000145434760000544
)、帕利他塞的清蛋白改造的纳米颗粒剂型(ABRAXANE
Figure BDA0000145434760000545
)和多西他塞(doxetaxel)(TAXOTERE
Figure BDA0000145434760000546
))；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨喋呤(methotrexate)；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)(VELBAN)；铂(platinum)；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)(ONCOVIN
Figure BDA0000145434760000548
)；奥沙利铂(oxaliplatin)；亚叶酸(leucovorin)；长春瑞滨(vinorelbine)(NAVELBINE
Figure BDA0000145434760000549
)；能灭瘤(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；伊本膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基乌氨酸(DMFO)；类视黄酸类(retinoids)，诸如视黄酸(retinoic acid)；任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物；以及两种或更多上述物质的组合，诸如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙联合疗法的缩写)和FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATINTM)联合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写)。
该定义还包括作用为调节、降低、阻断或抑制可促进癌生长的激素效果的抗激素剂，且常常是系统或全身治疗的形式。它们自身可以是激素。例子包括抗雌激素类和选择性雌激素受体调控物类(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX
Figure BDA0000145434760000551
他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)(EVISTA
Figure BDA0000145434760000552
)、屈洛昔芬(droloxifene)、4一羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(FARESTON
Figure BDA0000145434760000553
)；抗孕酮类；雌激素受体下调剂类(ERD)；功能为抑制或关闭卵巢的药剂，例如促黄体生成激素释放激素(LHRH)激动剂，诸如醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)(LUPRON
Figure BDA0000145434760000554
和ELIGARD)、醋酸戈舍瑞林(goserelinacetate)、醋酸布舍瑞林(buserelin acetate)和曲普瑞林(triptorelin)；其它抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)；及抑制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)(MEGASE
Figure BDA0000145434760000556
)、依西美坦(exemestane)(AROMASIN
Figure BDA0000145434760000557
)、福美坦(fomestane)、法倔唑(fadrozole)、伏氯唑(vorozole)(RIVISOR
Figure BDA0000145434760000558
)、来曲唑(letrozole)(FEMARA
Figure BDA0000145434760000559
)和阿那曲唑(anastrozole)(ARIMIDEX
Figure BDA00001454347600005510
)。另外，化疗剂的这种定义包括二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)(例如BONEFOS
Figure BDA00001454347600005511
或OSTAC
Figure BDA00001454347600005512
)、依替膦酸钠(etidronate)(DIDROCAL
Figure BDA00001454347600005513
)、NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronic acid/zoledronate)(ZOMETA)、阿伦膦酸盐(alendronate)(FOSAMAX
Figure BDA00001454347600005515
)、帕米膦酸盐(pamidronate)(AREDIA
Figure BDA00001454347600005516
)、替鲁膦酸盐(tiludronate)(SKELID
Figure BDA00001454347600005517
)或利塞膦酸盐(risedronate)(ACTONEL
Figure BDA00001454347600005518
)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是那些抑制牵涉异常(abherant)细胞增殖的信号传导途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，诸如THERATOPE
Figure BDA00001454347600005519
疫苗和基因疗法疫苗，例如ALLOVECTIN
Figure BDA0000145434760000561
疫苗、LEUVECTIN
Figure BDA0000145434760000562
疫苗和VAXID
Figure BDA0000145434760000563
疫苗；拓扑异构酶1抑制剂(例如LURTOTECAN
Figure BDA0000145434760000564
)；rmRH(例如ABARELIX
Figure BDA0000145434760000565
)；lapatinibditosylate(ErbB-2和EGFR双重酪氨酸激酶小分子抑制剂，也称为GW572016)；COX-2抑制剂，诸如塞来考昔(CELEBREX
Figure BDA0000145434760000566
4-(5-(4-甲基苯基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基)苯磺酰胺；及任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物。
术语“细胞因子”是由一种细胞群释放，作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通称。此类细胞因子的例子有淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子中包括生长激素，诸如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松驰素；松驰素原；糖蛋白激素类，诸如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；促乳素；胎盘催乳激素；肿瘤坏死因子-α和-β；穆勒氏(Mullerian)抑制性物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子(例如VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E)；胎盘衍生生长因子(PlGF)；血小板衍生生长因子(PDGF)(例如PDGFA、PDGFB、PDGFC、PDGFD)；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，诸如NGF-α；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子(osteoinductive factor)；干扰素，诸如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，诸如巨噬细胞CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞CSF(GM-CSF)和粒细胞CSF(G-CSF)；白介素(IL)，诸如IL-1、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20-IL-30；分泌珠蛋白(secretoglobin)/子宫珠蛋白；制瘤素M(OSM)；肿瘤坏死因子，诸如TNF-α或TNF-β；及其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。在用于本文时，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质及天然序列细胞因子的生物学活性等效物。
术语“前体药物”在用于本申请时指与母药(parent drug)相比对肿瘤细胞的细胞毒性较小并能够酶促活化或转变为更具活性母药形式的前体或衍生物形式药用活性物质。参见例如Wilman，“Prodrugs in Cancer Chemotherapy”，Biochemical Society Transactions，14，pp.375-382，615th Meeting Belfast(1986)和Stella et al.，“Prodrugs：A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery”，Directed Drug Delivery，Borchardt et al.，ed.，pp.247-267，Humana Press(1985)。本发明的前体药物包括但不限于含磷酸盐/酯前体药物、含硫代磷酸盐/酯前体药物、含硫酸盐/酯前体药物、含肽前体药物、D-氨基酸修饰前体药物、糖基化前体药物、含β-内酰胺前体药物、含任选取代苯氧基乙酰胺的前体药物或含任选取代苯乙酰胺的前体药物、可转变为更具活性而无细胞毒性的药物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前体药物。可衍生为本发明使用的前体药物形式的细胞毒性药物的例子包括但不限于上文描述的那些化疗剂。
“血管发生因子”或“血管发生剂”指刺激血管发育，例如促进血管发生(angiogenesis)、内皮细胞生长、血管稳定性和/或血管生成(vasculogenesis)等的生长因子。例如，血管发生因子包括但不限于例如VEGF和VEGF家族的成员、PlGF、PDGF家族、成纤维细胞生长因子家族(FGF)、TIE配体(血管生成素)、肝配蛋白、ANGPTL3、ANGPTL4等。它还包括加速伤口愈合的因子，诸如生长激素、胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、VIGF、表皮生长因子(EGF)、CTGF及其家族成员、及TGF-α和TGF-β。参见例如Klagsbrun andD’Amore，Annu.Rev.Physiol.53：217-39(1991)；Streit and Detmar，Oncogene22：3172-3179(2003)；Ferrara&Alitalo，Nature Medicine 5(12)：1359-1364(1999)；Tonini et al.，Oncogene 22：6549-6556(2003)(例如列举血管发生因子的表1)；和Sato，Int.J.Clin.Oncol.8：200-206(2003)。
“抗血管发生剂”或“血管发生抑制剂”指或是直接或是间接抑制血管发生(angiogenesis)、血管生成(vasculogenesis)或不想要的血管通透性的小分子量物质、多核苷酸、多肽、分离的蛋白质、重组蛋白、抗体或其偶联物或融合蛋白。例如，抗血管发生剂是上文定义的血管发生剂的抗体或其它拮抗剂，例如VEGF的抗体、VEGF受体的抗体、阻断VEGF受体信号传导的小分子(例如PTK787/ZK2284、SU6668、SUTENT/SU11248(sunitinib malate)、AMG706、sorafenib(NEXAVAR
Figure BDA0000145434760000571
)、axitinib、和pazopanib)。抗血管发生剂还包括天然血管发生抑制剂，例如血管他丁(angiostatin)、内皮他丁(endostatin)等。参见例如Klagsbrun and D’Amore Annu.Rev.Physiol.53：217-39(1991)；Streit andDetmar Oncogene 22：3172-3179(2003)(例如列举恶性黑素瘤中抗血管发生疗法的表3)；Ferrara&Alitalo Nature Medicine 5(12)：1359-1364(1999)；Tonini等Oncogene 22：6549-6556(2003)(例如列举抗血管发生因子的表2)；及Sato，Int.J.Clin.Oncol.8：200-206(2003)(例如列举临床试验中所使用的抗血管发生剂的表1)。
术语“免疫抑制剂”在用于本文时指作用于抑制或掩盖本文所治疗哺乳动物的免疫系统的物质。这包括抑制细胞因子生成、下调或抑制自身抗原表达或掩盖MHC抗原的物质。此类药剂的例子包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(见美国专利No.4,665,077)；非类固醇抗炎药(NSAID)；更昔洛韦(ganciclovir)、他克莫司(tacrolimus)、糖皮质激素诸如皮质醇(cortisol)或醛甾酮(aldosterone)、抗炎药诸如环加氧酶抑制剂、5-脂加氧酶抑制剂或白三烯受体拮抗剂；嘌呤拮抗剂，诸如硫唑嘌呤(azathioprine)或麦考酚酸吗乙酯(mycophenolate mofetil，MMF)；烷化剂，诸如环磷酰胺；溴隐亭(bromocryptine)；达扎唑(danazol)；氨苯砜(dapsone)；戊二醛(其掩盖MHC抗原，如美国专利No.4,120,649中所记载的)；针对MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体；环孢菌素A；类固醇，诸如皮质类固醇或糖皮质类固醇或糖皮质激素类似物，例如泼尼松(prednisone)、甲基泼尼松龙(methylprednisolone)和地塞米松(dexamethasone)；二氢叶酸还原酶抑制剂，诸如甲氨蝶呤(methotrexate)(口服或皮下)；羟氯喹(hydroxycloroquine)；柳氮磺吡啶(sulfasalazine)；来氟米特(leflunomide)；细胞因子或细胞因子受体抗体，包括抗干扰素-α、-β或-γ抗体、抗肿瘤坏死因子-α抗体(infliximab或adalimumab)、抗TNFα免疫粘附素(依那西普(etanercept))、抗肿瘤坏死因子-β抗体、抗白介素-2抗体和抗IL-2受体抗体；抗LFA-1抗体，包括抗CD11a和抗CD18抗体；抗L3T4抗体；异源抗淋巴细胞球蛋白；泛T抗体(pan-Tantibody)，优选抗CD3或抗CD4/CD4a抗体；含有LFA-3结合域的可溶性肽(1990年7月26日公布的WO 1990/08187)；链激酶；TGF-β；链道酶；来自宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；脱氧精胍菌素(deoxyspergualin)；雷帕霉素(rapamycin)；T细胞受体(Cohen et al.，美国专利No.5,114,721)；T细胞受体片段(Offner et al.，Science 251：430-432(1991)；WO 1990/11294；Ianeway，Nature 341：482(1989)；及WO 1991/01133)；及T细胞受体抗体(EP340,109)，诸如T10B9。
“非类固醇抗炎药”或“NSAID”的例子有乙酰水杨酸(acetylsalicylicacid)、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、吲哚美辛(indomethacin)、舒林酸(sulindac)、托美丁(tolmetin)，包括其盐和衍生物，等。
疾病的“病理”包括所有危及患者康乐的现象。例如，这包括但不限于异常的或不可控的细胞生长、转移、对邻近细胞正常机能的干扰、细胞因子或其它分泌产物的异常水平释放、炎性或免疫学应答的抑制或恶化、等。
与一种或多种其它治疗剂“联合”施用包括同时(共同)施用和任何次序的序贯施用。
术语“并行”在本文中用于指施用两种或更多种治疗剂，其中至少部分施用在时间上交叠。因而，并行施用包括如下的剂量给药方案，一种或多种药剂的施用中断后继续一种或多种其它药剂的施用。
“长期”施用指与短期模式相反，以连续模式施用药剂，从而将初始治疗效果(活性)维持较长一段时间。“间歇”施用指不是无间断连续进行的治疗，而是本质上周期性的。
“载体”在用于本文时包括药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂，它们在所采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。通常，生理学可接受的载体是pH缓冲水溶液。生理学可接受载体的例子包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖醇，诸如甘露醇或山梨醇；成盐反荷离子，诸如钠；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。
“脂质体”指由各种类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂构成的，可用于对哺乳动物投递药物(诸如Bv8多肽或其抗体)的小囊泡。脂质体的成分通常排列成双层形式，与生物膜的脂质排列相似。
“小分子”在本文中定义为分子量小于约500道尔顿。
“氨基酸改变”指预定的氨基酸序列的氨基酸序列中的变化。例示性的改变包括插入、替代和删除。“氨基酸替代”指预定氨基酸序列中的现有氨基酸残基用另一种不同氨基酸残基置换。
“置换”氨基酸残基指置换或替代氨基酸序列中另一个氨基酸残基的氨基酸残基。置换残基可以是天然存在的或非天然存在的氨基酸残基。
“氨基酸插入”指将一个或多个氨基酸残基导入预定氨基酸序列中。氨基酸插入可包含“肽插入”，在这种情况中将包含两个或多个通过肽键相连接的氨基酸残基的肽导入预定的氨基酸序列中。若氨基酸插入牵涉肽的插入，则所插入的肽可通过随机诱变来生成，使得它具有自然界中不存在的氨基酸序列。“高变区附近的”氨基酸改变指在高变区的N末端和/或C末端导入或替代一个或多个氨基酸残基，使得至少一个所插入或置换的氨基酸残基与所讨论高变区的N端或C端氨基酸残基形成肽键。
“天然存在的氨基酸残基”指由遗传密码编码的氨基酸残基，一般选自：丙氨酸(Ala)；精氨酸(Arg)；天冬酰胺(Asn)；天冬氨酸(Asp)；半胱氨酸(Cys)；谷氨酰胺(Gln)；谷氨酸(Glu)；甘氨酸(Gly)；组氨酸(His)；异亮氨酸(Ile)；亮氨酸(Leu)；赖氨酸(Lys)；甲硫氨酸(Met)；苯丙氨酸(Phe)；脯氨酸(Pro)；丝氨酸(Ser)；苏氨酸(Thr)；色氨酸(Trp)；酪氨酸(Tyr)；和缬氨酸(Val)。
“非天然存在的氨基酸残基”在本文中指上文所列天然存在氨基酸残基以外的，能够在多肽链中与邻近氨基酸残基共价结合的氨基酸残基。非天然存在氨基酸残基的例子包括正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸和其它氨基酸残基类似物，诸如那些Ellman等，Meth.Enzym.202：301-336(1991)中所记载的。为了生成此类非天然存在氨基酸残基，可使用Noren等，Science244：182(1989)和Ellman等(见上文)的操作程序。简而言之，这些操作程序包括用非天然存在氨基酸残基化学活化阻抑型tRNA，接着体外转录并翻译RNA。
在用于本文时，具有“高亲和力”的抗体指具有纳摩尔(nM)范围中的或更好的Kd或解离常数的抗体。“纳摩尔范围”中的或更好的Kd可以表示为XnM，其中X是小于约10的数。
“结合亲和力”通常指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，在用于本文时，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体与抗原)之间1∶1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用解离常数(Kd)，即结合常数(Ka)的倒数来表述。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的那些。低亲和力抗体通常缓慢的结合抗原且/或趋于容易解离，而高亲和力抗体通常更快速的结合抗原且/或趋于保持更长时间的结合。本领域知道测量结合亲和力的多种方法，其中任一种都可用于本发明的目的。下文描述了测量结合亲和力的具体的示例性和例示性实施方案。
在某些实施方案中，依照本发明的“KD”、“Kd”、“Kd”或“Kd值”是通过表面等离振子共振测定法使用BIACORETM-2000或BIACORETM-3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)于25℃使用固定化抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)测量的。简而言之，依照供应商的说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，BIACORE Inc.)。用10mM乙酸钠pH 4.8将抗原稀释至5μg/ml(约0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注入至获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，于25℃以约25μl/分钟的流速注入在含0.05％TWEEN-20的PBS(PBST)中连续稀释的多肽，例如全长抗体。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(BIACORE
Figure BDA0000145434760000611
Evaluation Software version 3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)以比率koff/kon计算。参见例如Chen et al.，J Mol Biol 293：865-881(1999)。如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过106M-1s-1，那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(a stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)或8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量，在存在浓度渐增的抗原的条件下，测量PBS，pH 7.2中的20nM抗抗原抗体于25℃的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的升高或降低。
术语“丝状噬菌体”指能够在其表面上展示异源多肽的病毒颗粒，而且包括但不限于f1、fd、Pf1、和M13。丝状噬菌体可包含选择标志，诸如四环素(例如“fd-tet”)。多种丝状噬菌体展示系统对于本领域技术人员是众所周知的(参见例如Zacher等，Gene 9：127-140(1980)；Smith等，Science 228：1315-1317(1985)；及Parmley和Smith Gene 73：305-318(1988))。
术语“淘选”用于指鉴定和分离携带如下化合物(诸如抗体)的噬菌体的多轮筛选过程，所述化合物对靶物具有高亲和力和特异性。
术语“短干扰RNA(siRNA)”指干扰基因表达的双链小RNA。siRNA是RNA干扰(双链RNA沉默同源基因的过程)的媒介物。siRNA典型地由两条长约15-25个核苷酸、形成双链体(其可包括单链突出端)的单链RNA构成。酶复合物(例如聚合酶)对双链RNA的加工导致切割双链RNA以生成siRNA。RNA干扰(RNAi)沉默复合物使用siRNA的反义链来引导mRNA切割，由此促进mRNA降解。为了使用siRNA来沉默特定基因，例如在哺乳动物细胞中，选择碱基配对区来避免与无关mRNA的偶然互补。本领域已经鉴定了RNAi沉默复合物诸如例如Fire等，Nature 391：806-811(1998)及McManus等，Nat.Rev.Genet.3(10)：737-47(2002)。
术语“干扰RNA(RNAi)”在本文中用于指导致特定mRNA的催化性降解，如此可用于抑制/降低特定基因表达的双链RNA。
在用于本文时，表述“细胞”、“细胞系”、和“细胞培养物”可互换使用，而且所有这类名称都包括后代。如此，词语“转化子/转化体”和“转化细胞”包括原代受试细胞及由其衍生的培养物，不管转移的次数。还应理解，由于有意的或无意的突变，所有后代可能在DNA内容上不是精确相同的。术语“后代”指初始转化细胞或细胞系之后每一代的任何和所有后裔。在最初转化细胞中筛选的具有相同功能或生物学活性的突变后代包括在内。若想做出不同的命名，上下文会有清楚的表述。
杂交反应的“严格性”可以由本领域普通技术人员容易的确定，而且通常根据探针长度、洗涤温度和盐浓度凭经验计算。一般而言，较长的探针要求较高的温度以正确退火，而较短的探针需要较低的温度。杂交通常依赖于当互补链存在于低于其解链温度的环境中时变性DNA重新退火的能力。探针和可杂交序列之间的期望同一性程度越高，可使用的相对温度也越高。结果是，推断出较高相对温度将趋向于使反应条件更为严格，而较低温度也就较不严格。关于杂交反应严格性的其它细节和解释，参见Ausubel et al.，CurrentProtocols in Molecular Biology，Wiley Interscience Publishers(1995)。
“高严格性条件”，如本文中所定义的，通过如下各项定义：(1)采用低离子强度和高温进行清洗；0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠，于50℃；(2)在杂交过程中采用变性剂；50％(v/v)甲酰胺及0.1％牛血清清蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液pH 6.5及750mM氯化钠，75mM柠檬酸钠，于42℃；或(3)采用50％甲酰胺，5x SSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH 6.8)，0.1％焦磷酸钠，5x Denhardt氏溶液，超声处理的鲑鱼精DNA(50μg/ml)，0.1％SDS，和10％硫酸右旋糖苷，于42℃，及于42℃在0.2x SSC(氯化钠/柠檬酸钠)和50％甲酰胺中清洗，接着于55℃在含EDTA的0.1x SSC中进行高严格性清洗。
“中等严格条件”可以如Sambrook et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，New York，Cold Spring Harbor Press(1989)中所述鉴定，包括于37℃在含20％甲酰胺，5x SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH 7.6)，5x Denhardt氏溶液，10％硫酸右旋糖苷，和20mg/ml变性剪切的鲑鱼精DNA的溶液中温育过夜，接着于约37-50℃在1x SSC中清洗滤膜。技术人员将认识到如何在必要时调整温度、离子强度等以适应诸如探针长度等因素。
B.详述
本发明至少部分基于G-CSF和Bv8在导致肿瘤转移的细胞和分子事件中发挥重要作用的认识。
2007年3月28日提交的、共同悬而未决的申请流水号11/692,681(通过述及将其完整公开内容收入本文)描述了募集造血骨髓衍生细胞和肿瘤形成对抗VEGF治疗的抗性之间的关系。2008年9月19日提交的、共同悬而未决的PCT公开号WO 2009/039337(通过述及明确将其完整公开内容收入本文)描述了Bv8在导致肿瘤对抗VEGF治疗的抗性的细胞和分子事件中的作用。
转移实体瘤所致死亡的一个主要原因。为了转移，肿瘤细胞需要降解和侵入细胞外基质，进入血管，由血液或淋巴管携带，在继发性部位溢出血管，并最终建立继发性肿瘤(Nguyen，D.X.&Massague，J.Nat Rev Genet 8，341-352(2007))。另外，制片证据提示肿瘤能够在转移性肿瘤细胞到达之前改变远端微环境以创建所谓的“转移前生态位”(Psaila，B.&Lyden，D.NatRev Cancer 9，285-293(2009))。肿瘤影响远端组织的这种能力使得癌细胞能够靶向特定器官，在那里它们能启动继发性肿瘤生长和支持“种子和土壤”假说(Paget，S.Cancer Metastasis Rev.8(2)，98-101(1989))。认为骨髓衍生细胞(BMDC)是居于生态位的一种主要细胞类型(Kaplan，R.N.et al.Nature 438，820-827(2005)；Hiratsuka，S.et al.Nat Cell Biol 8，1369-1375(2006))。
虽然已经牵涉数种分子(Kaplan，R.N.et al.Nature 438，820-827(2005)；Hiratsuka，S.et al.Nat Cell Biol 8，1369-1375(2006)；Yamamoto，M.et al.Cancer Res 68，9754-9762(2008)；Kim，S.et al.Nature 457，102-106(2009)；Erler，J.T.et al.Cancer Cell 15，35-44(2009))，但是对肿瘤启动生态位的机制和生态位在转移中的精确作用的了解还不完全。
器官特异性转移前位点的引发是转移期间的一个重要步骤，但是对启动转移前生态位的根本机制的了解还不完全。本文中提供的数据显示具有转移能力的肿瘤分泌粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，其自骨髓动员CD11b+Gr1+细胞并在肿瘤细胞到达之前促进CD11b+Gr1+细胞随后在远端器官处归巢。G-CSF表达与所检查的肿瘤的转移潜力有关。此外，本文中呈现的数据显示G-CSF动员的CD11b+Gr1+细胞局部生成促血管发生Bv8蛋白。抗G-CSF或抗Bv8抗体的治疗显著降低肺转移。该数据还鉴定了Bv8的一种新作用，即刺激肿瘤细胞迁移的能力，涉及两种Bv8受体(PKR-1/GPR73)之一的表达的效果。最后，本文中提供的数据显示重组G-CSF足以启动生态位(niche)和增加器官特异性转移位点中CD11b+Gr1+细胞的数目。这导致数种肿瘤增强的转移能力。因此，本文中提供的数据提示G-CSF是转移的一种关键调节物。
C.制备起肿瘤血管发生和肿瘤转移抑制剂作用的抗G-CSF抗体、抗Bv8抗体和抗PKR1抗体
通过本发明的结合和活性测定法所鉴定的抗体可通过本领域已知方法来生产，包括DNA重组技术。
i)抗原制备
可溶性抗原或其片段(任选偶联有其它分子的)可作为免疫原用于生成抗体。对于跨膜分子，诸如受体，它们的片段(例如受体的胞外结构域)可用作免疫原。或者，表达跨膜分子的细胞可用作免疫原。此类细胞可衍生自天然来源(例如癌细胞系)，或者可以是经重组技术转化而表达跨膜分子的细胞。对于制备抗体有用的其它抗原及其形式对于本领域技术人员会是显而易见的。
(ii)多克隆抗体
多克隆抗体优选在动物中生成，通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂。使用双功能或衍生化试剂，例如马来酰亚氨基苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基偶联)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N＝C＝NR(其中R和R1是不同的烃基)，将相关抗原与在待免疫物种中有免疫原性的蛋白质偶联可能是有用的，例如匙孔虫戚血蓝蛋白、血清清蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂。
通过将例如100μg或5μg蛋白质或偶联物(分别用于兔或小鼠)与3倍体积的弗氏完全佐剂混和并将该溶液皮内注射于多个部位，将动物针对抗原、免疫原性偶联物或衍生物进行免疫。1个月后，通过多个部位的皮下注射，用弗氏完全佐剂中初始量1/5-1/10的肽或偶联物对动物进行加强免疫。7-14天后，采集动物的血液并测定血清的抗体滴度。对动物进行加强免疫直到滴度达到平台(plateau)。优选的是，将动物用相同抗原但与不同蛋白质和/或通过不同交联剂偶联得到的偶联物进行加强免疫。偶联物还可在重组细胞培养中作为蛋白质融合物来制备。同样，适当使用凝聚剂诸如明矾来增强免疫应答。
(iii)单克隆抗体
单克隆抗体可以使用最初由Kohler等，Nature，256：495(1975)记载的杂交瘤方法来生成，或者可以通过DNA重组方法(美国专利No.4,816,567)来生成。在杂交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它适宜的宿主动物，诸如仓鼠或猕猴，以引发生成或能够生成如下抗体的淋巴细胞，所述抗体将特异性结合用于免疫的蛋白质。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。然后使用合适的融合剂诸如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103，Academic Press，1986)。
将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养，所述培养基优选含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质。例如，若亲本骨髓瘤细胞缺少次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基典型的将含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。
优选的骨髓瘤细胞是那些高效融合、支持所选择的抗体生产细胞稳定且高水平地生成抗体、且对培养基诸如HAT培养基敏感的骨髓瘤细胞。其中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，诸如那些自可从索尔克研究所细胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center，San Diego，Calif.USA)获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤和可从美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection，Rockville，Md.USA)获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也可用于生成人单克隆抗体(Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等，Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications，pp.51-63，Marcel Dekker，Inc.，NewYork，1987)。
可对杂交瘤细胞正在其中生长的培养基测定针对抗原的单克隆抗体的生成。优选的是，通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，诸如放射性免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。
在鉴定出生成具有期望特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，所述克隆就可通过有限稀释操作程序进行亚克隆，并通过标准方法进行培养(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103，Academic Press，1986)。适于这一目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可在动物中作为腹水瘤进行体内培养。
可通过常规免疫球蛋白纯化操作程序，诸如例如蛋白A-Sepharose、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析、或亲和层析，将由亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹水或血清适当分开。
编码单克隆抗体的DNA易于使用常规操作程序分离和测序(例如通过使用能够特异性结合编码单克隆抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞是此类DNA的优选来源。一旦分离，就可将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染到不另外生成免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞中，诸如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。抗体的重组生产在下文中有更详细描述。
在另一个实施方案中，可从使用McCafferty等，Nature，348：552-554(1990)中记载的技术构建的噬菌体抗体库中分离抗体或抗体片段。
Clackson等，Nature，352：624-628(1991)及Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)分别记载了使用噬菌体文库进行的鼠和人抗体的分离。后续出版物记载了通过链改组生成高亲和力(nM范围)的人抗体(Marks等，Bio/Technology 10：779-783(1992))，以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse等，Nuc.Acids Res.21：2265-2266(1993))。如此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方法。
也可以修饰DNA，例如通过用人重链和轻链恒定域的编码序列替代同源鼠序列(美国专利No.4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851(1984))，或通过将免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列共价连接。
典型地，用此类非免疫球蛋白多肽替代抗体的恒定域，或者用它们替代抗体的一个抗原结合位点的可变域，以产生嵌合二价抗体，它包含对一种抗原具有特异性的一个抗原结合位点和对不同抗原具有特异性的另一个抗原结合位点。
(iv)人源化抗体和人抗体
人源化抗体具有一个或多个导入其中的来自非人来源的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称作“输入”残基，它们通常取自“输入”可变域。人源化可基本上遵循Winter及其同事的方法进行(Jones等，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，239：1534-1536(1988))，即用啮齿类CDR或CDR序列替代人抗体的相应序列。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利4,816,567)，其中基本上小于整个人可变域的区域用来自非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通常是其中一些CDR残基以及可能一些FR残基用来自啮齿类抗体中类似位点的残基替代的人抗体。
用于制备人源化抗体的人可变域的选择，包括轻链和重链，对于降低抗原性非常重要。依照所谓的“最适”(best-fit)法，用啮齿类抗体的可变域序列对已知的人可变域序列的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类序列最接近的人序列作为人源化抗体的人框架(FR)(Sims等，J.Immunol.，151：2296(1993)；Chothia等，J.Mol.Biol.，96：901(1987))。另一种方法使用由特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架。同一框架可被用于数种不同的人源化抗体(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；Presta等，J.Immunol.，151：2623(1993))。
更为重要的是，抗体在人源化后保持对抗原的高亲和力及其它有利的生物学特性。为了实现这一目的，依照一种优选的方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的，且为本领域技术人员所熟悉。还可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。检查这些显示图像能够分析残基在候选免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可从受体和输入序列中选出FR残基并进行组合，从而获得期望抗体特征，诸如对靶抗原的亲和力提高。通常，CDR残基直接且最实质的涉及对抗原结合的影响。
或者，现在有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫时生成人抗体完整全集的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列将导致在抗原攻击时生成人抗体。参见例如Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551(1993)；Jakobovits等，Nature，362：255-258(1993)；Bruggermann等，Yearin Immuno.，7：33(1993)；及Duchosal等，Nature，355：258(1992)。还可从噬菌体展示库衍生人抗体(Hoogenboom等，J.Mol.Biol.，227：381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)；Vaughan等，Nature Biotech.，14：309(1996))。下文进一步描述了自抗体噬菌体展示文库生成人抗体。
(v)抗体片段
已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimoto等，Journal of Biochemical andBiophysical Methods 24：107-117(1992)；及Brennan等，Science，229：81(1985))。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。例如，可以从上文讨论的噬菌体抗体库分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab′-SH片段并化学偶联以形成F(ab′)2片段(Carter等，Bio/Technology 10：163-167(1992))。在另一个实施方案中，如下文实施例所述，使用亮氨酸拉链GCN4促进F(ab′)2分子的装配来形成F(ab′)2。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab′)2片段。用于生成抗体片段的其它技术对熟练从业人员将是显而易见的。在其它实施方案中，所选抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185。
(vi)多特异性抗体
多特异性抗体具有对至少两种不同表位的结合特异性，其中所述表位通常来自不同抗原。尽管此类分子通常只会结合两种不同表位(即双特异性抗体，BsAb)，但是此表述在用于本文时涵盖具有额外特异性的抗体，诸如三特异性抗体。BsAb的例子包括那些一个臂针对Bv8或G-CSF而另一个臂针对VEGF或EG-VEGF的抗体。
用于构建双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统生产基于两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达，其中两种链具有不同的特异性(Millstein等，Nature，305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))生成10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行正确分子的纯化，这相当麻烦且产物产量低。类似的操作程序披露于WO 93/08829及Traunecker等，EMBO J.，10：3655-3659(1991)。依照一种不同的方法，将具有期望结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变域与免疫球蛋白恒定域序列融合。优选的是，与包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定域进行融合。优选在至少一种融合物中存在包含轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物和，在需要时，免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体中，并共转染到合适的宿主生物体中。在用于构建的三种多肽链比例不等时提供所期望的最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了很大的灵活性。然而，在至少两种多肽链以相同比例表达导致高产量时或在该比例没有特别意义时，有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入到一个表达载体中。
在该方法的某些实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中存在提供了便利的分离途径，因此发现这种不对称结构便于将期望的双特异性复合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该方法披露于WO 94/04690。关于生成双特异性抗体的进一步详情参见例如Suresh等，Methods inEnzymology，121：210(1986)。
依照WO96/27011中记载的另一种方法，可改造一对抗体分子间的界面，以将从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比最大化。优选的界面包含抗体恒定域的至少部分CH3结构域。在该方法中，将第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换。通过将大氨基酸侧链用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换，在第二抗体分子的界面上产生与大侧链相同或相似大小的补偿性“空腔”。这提供了较之其它不想要的终产物诸如同二聚体提高异二聚体产量的机制。
双特异性抗体包括交联的或“异源偶联的”抗体。例如，可以将异源偶联物中的一种抗体与亲合素偶联，而将另一种抗体与生物素偶联。此类抗体已经建议用于例如将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利No.4,676,980)和用于治疗HIV感染(WO 91/00360，WO 92/200373)。异源偶联抗体可以使用任何方便的交联方法来制备。合适的交联剂连同许多交联技术是本领域众所周知的，而且披露于美国专利No.4,676,980。
文献中还记载了由抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan等，Science，229：81(1985)记载了通过蛋白水解切割完整抗体以生成F(ab′)2片段的操作程序。将这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠的情况下还原，以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫键的形成。然后将产生的Fab′片段转变为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab′-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成Fab′-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab′-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作选择性固定酶的试剂。
也可以从大肠杆菌直接回收Fab′-SH片段，而且可以将这些片段化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby等，J.Exp.Med.，175：217-225(1992)记载了完全人源化的双特异性抗体F(ab′)2分子的生成。由大肠杆菌分别分泌每种Fab′片段，并在体外进行定向化学偶联以形成双特异性抗体。
还记载了从重组细胞培养物直接生成和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已使用亮氨酸拉链生成双特异性抗体。Kostelny等，J.Immunol.，148(5)：1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab′部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原以形成单体，然后重新氧化以形成抗体异二聚体。这种方法也可用于生成抗体同二聚体。Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)记载的“双抗体”技术提供了构建双特异性抗体片段的替代机制。该片段包含通过接头相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)，所述接头太短使得同一条链上的两个结构域之间不能配对。因此，迫使一个片段上的VH和VL结构域与另一个片段上的互补VL和VH结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体构建双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber等，J.Immunol.，152：5368(1994)。
设想了具有超过两个效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt等，J.Immunol.，147：60(1991)。
(vii)效应器功能工程改造
可能希望在效应器功能方面修饰本发明的抗体，从而增强抗体的效力。例如，可向Fc区中引入半胱氨酸残基，从而使得在该区中形成链间二硫键。如此生成的同二聚体抗体可具有改善的内在化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。参见Caron等，J.Exp.Med.，176：1191-1195(1992)和Shopes，B.，J.Immunol.，148：2918-2922(1992)。具有增强的抗肿瘤活性的同二聚体抗体还可使用异双功能交联剂来制备，如Wolff等，Cancer Research，53：2560-2565(1993)中记载。或者，抗体可改造成具有双重Fc区，由此可具有增强的补体溶解和ADCC能力。参见Stevenson等，Anti-Cancer Drug Design，3：219-230(1989)。
(viii)抗体-补救受体结合表位融合物
在本发明的某些实施方案中，可能希望使用抗体片段，而非完整抗体，来例如提高肿瘤穿透。在这种情况中，可能希望修饰抗体片段以延长其血清半衰期。这可通过例如将补救受体结合表位掺入抗体片段中来实现(例如通过抗体片段中适宜区域的突变或通过将表位掺入肽标签中然后将该肽标签融合至抗体片段的任一末端或中部，例如通过DNA或肽合成来实现)。
补救受体结合表位优选构成这样一个区域，其中将来自Fc结构域的一个或两个环的任何一个或多个氨基酸残基转移至抗体片段的类似位置。甚至更优选的是，转移来自Fc结构域的一个或两个环的三个或更多残基。仍更优选的是，表位取自Fc区(例如IgG的)的CH2结构域并转移至抗体的CH1、CH3、或VH区，或超过一个此类区域。或者，表位取自Fc区的CH2结构域并转移至抗体片段的CL区或VL区或二者。
(ix)抗体的其它共价修饰
抗体的共价修饰包括在本发明的范围内。如果适用，它们可通过化学合成或者通过酶促或化学切割抗体来生成。抗体的其它类型共价修饰如下引入分子，即通过使抗体的目标氨基酸残基与能够与选定侧链或N-末端或C-末端的残基反应的有机衍生化试剂起反应。共价修饰的例子记载于美国专利No.5,534,615，明确引入本文作为参考。一类优选的抗体共价修饰包括将抗体连接至多种非蛋白质性质聚合物之一，例如聚乙二醇、聚丙二醇、或聚氧化烯，以美国专利No.4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192；或4,179,337所列方式。
本发明还涵盖包含本文所述抗体且其偶联至细胞毒剂的免疫偶联物，所述细胞毒剂诸如化疗剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射偶联物)。多种放射性核素可用于生成放射偶联抗体。例子包括但不限于例如212Bi、131I、131In、90Y和186Re。
可用于生成此类免疫偶联物的化疗剂上文已有描述。例如，BCNU、链佐星(streptozoicin)、长春新碱、5-氟尿嘧啶、统称为LL-E33288复合物的药剂家族(美国专利5,053,394，5,770,710)、埃斯波霉素类(美国专利5,877,296)等(还可见本文中化疗剂的定义)可以偶联至本发明的抗体或其片段。
为了选择性破坏肿瘤，抗体可包含高度放射性原子。多种放射性同位素可用于生成放射偶联的抗体或其片段。例子包括但不限于例如211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、212Pb、111In、Lu的放射性同位素等。在将偶联物用于诊断时，它可包含放射性原子以用于闪烁照相研究，例如99mtc或123I，或自旋标记物以用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像(MRI))，诸如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可以以已知方式将放射性标记物或其它标记物掺入偶联物。例如，肽可以生物合成，或者可以通过化学氨基酸合成法合成，其中使用牵涉例如以氟-19代替氢的合适氨基酸前体。可以经肽中的半胱氨酸残基来附着标记物，诸如99mtc或123I、186Re、188Re和111In。可以经赖氨酸残基来附着钇-90。IODOGEN法(Fraker等，Biochem.Biophys.Res.Commun.80：49-57(1978))可用于掺入碘-123。参见例如Chatal，Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy，CRC Press，1989，其详细记载了其它方法。
可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合性活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹毒蛋白(dianthinprotein)、美洲商陆(Phytolaca americana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、新霉素(neomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。参见例如1993年10月28日公布的WO 93/21232。
使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和细胞毒剂的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异硫氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可以如Vitetta等，Science 238：1098(1987)中所记载的制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO 94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒性药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头或含二硫化物接头(Chari等，Cancer Research 52：127-131(1992)；美国专利No.5,208,020)。
或者，可通过例如重组技术或肽合成来生成包含抗VEGF和/或抗本发明蛋白质抗体和细胞毒剂的融合蛋白。DNA的长度可以包含各自编码偶联物两部分的区域，或是彼此毗邻或是由编码接头肽的区域分开，所述接头肽不破坏偶联物的期望特性。
在某些实施方案中，将抗体与“受体”(诸如链霉亲合素)偶联以用于肿瘤预先靶向，其中对患者施用抗体-受体偶联物，接着使用清除剂由循环中清除未结合的偶联物，然后施用与细胞毒剂(例如放射性核苷酸)偶联的“配体”(例如亲合素)。在某些实施方案中，在抗体与具有核酸降解活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶诸如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)之间形成免疫偶联物。
本发明提供了偶联至一个或多个美登木素生物碱类分子的本发明抗体。美登木素生物碱类是通过抑制微管蛋白聚合来起作用的有丝分裂抑制剂。美登素最初从东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)分离到(美国专利No.3,896,111)。随后发现某些微生物也生成美登木素生物碱类，诸如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利No.4,151,042)。合成的美登醇及其衍生物和类似物披露于例如美国专利No.4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；及4,371,533。
本发明的抗体可以偶联至美登木素生物碱类分子且不显著削弱抗体或美登木素生物碱类分子的生物学活性。每个抗体分子偶联平均3-4个美登木素生物碱类分子在增强针对靶细胞的细胞毒性中显示出功效，且对抗体的功能或溶解度没有负面影响，尽管预计甚至一个分子的毒素/抗体也将较之裸抗体的使用增强细胞毒性。美登木素生物碱类在本领域是众所周知的，而且可通过已知技术合成或从天然来源分离。例如美国专利No.5,208,020及上文提及的其它专利和非专利出版物中披露了合适的美登木素生物碱类。在一个实施方案中，美登木素生物碱类是美登醇和美登醇分子的芳香环或其它位置经过修饰的美登醇类似物，诸如各种美登醇酯。
本领域知道许多连接基团可用于生成抗体-美登木素生物碱类偶联物，包括例如美国专利No.5,208,020或欧洲专利0425235B1及Chari等，CancerResearch 52：127-131(1992)中所披露的。连接基团包括二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团或酯酶不稳定基团，正如上述专利中所披露的，优选二硫化物和硫醚基团。
可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体与美登木素生物碱类的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对重氮苯甲酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。典型的偶联剂包括N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson等，Biochem.J.173：723-737(1978))和N-琥珀酰亚氨基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)，以提供二硫化物连接。
根据连接的类型，可将接头附着于美登木素生物碱类分子的多个位置。例如，可使用常规偶联技术通过与羟基的反应来形成酯连接。反应可发生在具有羟基的C-3位置、用羟甲基修饰的C-14位置、用羟基修饰的C-15位置和具有羟基的C-20位置。在美登醇或美登醇类似物的C-3位置形成连接。
另一种感兴趣的免疫偶联物包含与一个或多个加利车霉素分子偶联的本发明抗体。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度产生双链DNA断裂。关于加利车霉素家族偶联物的制备参见美国专利No.5,712,374；5,714,586；5,739,116；5,767,285；5,770,701；5,770,710；5,773,001；5,877,296(都属于美国Cyanamid公司)。可使用的加利车霉素结构类似物包括但不限于γ1 I、α2 I、α3 I、N-乙酰基-γ1 I、PSAG和θI 1(Hinman等，Cancer Research 53：3336-3342(1993)；Lode等，Cancer Research 58：2925-2928(1998)；及上述授予美国Cyanamid公司的美国专利)。可以与抗体偶联的另一种抗肿瘤药物是QFA，它是一种抗叶酸药物。加利车霉素和QFA都具有胞内作用位点，且不易穿过质膜。因此，这些药剂经由抗体介导的内在化的细胞摄取大大增强了它们的细胞毒性效果。
(x)从合成的抗体噬菌体文库中产生抗体
在某些实施方案中，本发明提供利用独特的噬菌体展示法来产生和挑选新的抗体的方法。该方法包括基于单个框架模板产生合成抗体噬菌体文库，设计可变域内的足够的多样性，展示具有多样化可变域的多肽，选择对靶抗原具有高亲和力的候选抗体，和分离所选的抗体。
噬菌体展示方法的详情可在例如2003年12月11日公开的WO03/102157中找到，将其完整公开内容明确引入本文作为参考。
在一个方面，本发明中所用的抗体文库可通过突变抗体可变域的至少一个CDR中溶剂可及的和/或高度多变的位置来产生。一些或全部CDR可用本文提供的方法来突变。在一些实施方案中，优选突变CDRH1、CDRH2和CDRH3中的位置以形成单个文库或突变CDRL3和CDRH3中的位置以形成单个文库或突变CDRL3和CDRH1、CDRH2和CDRH3中的位置以形成单个文库，由此产生多样的抗体文库。
例如，可产生这样的抗体可变域文库，其在CDRH1、CDRH2和CDRH3中溶剂可及的和/或高度多变的位置上有突变。产生的另一种文库在CDRL1、CDRL2和CDRL3中有突变。这些文库也可互相结合使用以产生具有期望亲和力的结合物。例如，在一轮或多轮选择对靶抗原结合的重链文库后，在其它轮次的选择中可将轻链文库替换入重链结合物群中以提高结合物的亲和力。
文库优选通过用重链序列可变区CDRH3区中的变异氨基酸替代原始氨基酸来产生。所得文库可包含多种抗体序列，其中序列多样性主要位于重链序列的CDRH3区中。
在一个方面，文库在人源化抗体4D5序列、或人源化抗体4D5序列的框架氨基酸序列的背景中产生。文库优选通过用DVK密码子集编码的氨基酸至少替代重链残基95-100a来产生，其中DVK密码子集用于编码这些位置中每个位置的变异氨基酸集。可用于产生这些替代的寡核苷酸子集的例子包括序列(DVK)7。在一些实施方案中，文库通过用DVK和NNK两个密码子集编码的氨基酸至少替代残基95-100a来产生。可用于产生这些替代的寡核苷酸子集的例子包括序列(DVK)6(NNK)。在另一个实施方案中，文库通过用DVK和NNK两个密码子集编码的氨基酸替代残基95-100a来产生。可用于产生这些替代的寡核苷酸子集的例子包括序列(DVK)5(NNK)。可用于产生这些替代的寡核苷酸子集的另一个例子包括序列(NNK)6。根据本文所述标准，本领域技术人员可确定合适寡核苷酸序列的其它例子。
在另一个实施方案中，利用不同的CDRH3设计来分离高亲和力结合物和分离针对各种表位的结合物。该文库中产生的CDRH3的长度范围是11至13个氨基酸，尽管也可产生不同于此的长度。通过用NNK、DVK和NVK密码子集也可拓展H3的多样性，以及在N和/或C-末端处的更有限的多样性。
CDRH1和CDRH2中也可产生多样性。CDR-H1和H2多样性的设计遵循目标为模拟所述带有如下修饰的天然抗体全集的策略，所述修饰使多样性较前述设计更紧密地与天然多样性相匹配。
对于CDRH3中的多样性，可分别构建具有不同长度的H3的多个文库，然后组合起来以选择针对靶抗原的结合物。可合并多个文库并用前述和本文下述的固体支持物选择和溶液分选法来选择。可采用多种选择策略。例如，一种变化涉及在结合至固相的靶物上选择，然后分选可能在融合多肽上存在的标签(例如抗gD标签)，然后再一次在结合至固相的靶物上分选。或者，文库可首先在结合至固体表面的靶物上选择，然后用靶抗原浓度逐渐降低的溶液相结合来分选所洗脱的结合物。利用不同分选方法的组合来最低限度地只选择高度表达的序列并选择许多不同的高亲和力克隆。
针对靶抗原的高亲和力结合物可由文库分离。H1/H2区中的有限多样性可降低简并性约104至105倍，而允许更大的H3多样性提供了更多高亲和力结合物。利用在CDRH3中具有不同类型多样性的文库(例如利用DVK或NVT)可分离能与靶抗原的不同表位结合的结合物。
对于从如上所述合并的文库中分离的结合物，已经发现可通过提供轻链中的有限多样性来进一步提高亲和力。在该实施方案中，轻链多样性如下产生，在CDRL1中：第28位氨基酸由RDT编码；第29位氨基酸由RKT编码；第30位氨基酸由RVW编码；第31位氨基酸由ANW编码；第32位氨基酸由THT编码；任选的，第33位氨基酸由CTG编码；在CDRL2中：第50位氨基酸由KBG编码；第53位氨基酸由AVC编码；任选的，第55位氨基酸由GMA编码；在CDRL3中：第91位氨基酸由TMT或SRT或这两者编码；第92位氨基酸由DMC编码；第93位氨基酸由RVT编码；第94位氨基酸由NHT编码；和第96位氨基酸由TWT或YKG或这两者编码。
在另一个实施方案中，产生在CDRH1、CDRH2和CDRH3的区域中具有多样性的一个或多个文库。在该实施方案中，用各种长度的H3区并主要用密码子集XYZ和NNK或NNS来产生CDRH3中的多样性。可用各寡核苷酸形成文库并合并，或者可合并寡核苷酸来形成文库子集。该实施方案的文库可针对结合至固体的靶物进行分选。分离自多次分选的克隆可利用ELISA测定法来筛选特异性和亲和力。对于特异性，克隆可以针对期望靶抗原以及其它非靶抗原进行筛选。然后，在溶液结合竞争ELISA测定法或点竞争测定法中对那些针对靶抗原的结合物筛选亲和力。可以用如上所述制备的XYZ密码子集从文库中分离高亲和力结合物。可方便地在细胞培养中以高产率将这些结合物制备成抗体或抗原结合片段。
在一些实施方案中，可能希望产生在CDRH3区长度方面具有更大多样性的文库。例如，可能希望产生CDRH3区的长度范围为约7至19个氨基酸的文库。
由这些实施方案中的文库分离的高亲和力结合物可方便地在细菌和真核细胞培养中以高产率产生。可设计载体以方便地去除如下序列诸如gD标签、病毒外壳蛋白成分序列，和/或增加恒定区序列来高产率地产生全长抗体或抗原结合片段。
可以将CDRH3中有突变的文库与包含不同型式的其它CDR(例如CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1和/或CDRH2)的文库组合。因此，例如，在一个实施方案中，将CDRH3文库与CDRL3文库组合，所述CDRL3文库用预先确定的密码子集在第28、29、30、31、和/或32位有变异氨基酸的人源化4D5抗体序列的背景中产生。在另一个实施方案中，可将CDRH3有突变的文库与包含变异CDRH1和/或CDRH2重链可变域的文库组合。在一个实施方案中，CDRH1文库用第28、30、31、32和33位有变异氨基酸的人源化抗体4D5序列产生。CDRH2文库可用预先确定的密码子集以及第50、52、53、54、56和58位有变异氨基酸的人源化抗体4D5序列来产生。
(xi)抗体变体
可进一步修饰噬菌体文库产生的新抗体以产生抗体突变体，所述抗体突变体具有比亲本抗体改善了的物理、化学和/或生物学性质。当所用的测定法是生物学活性测定法时，优选抗体突变体在所选测定法中的生物学活性比亲本抗体在该测定法中的生物学活性好至少约10倍，优选好至少约20倍，更优选好至少约50倍，有时好至少约100倍或200倍。在某些实施方案中，抗Bv8抗体突变体或抗G-CSF突变体针对Bv8或G-CSF的结合亲和力分别比亲本抗体的结合亲和力强至少约10倍，优选强至少约20倍，更优选强至少约50倍，有时强至少约100倍或200倍。
为了产生抗体突变体，在亲本抗体的一个或多个高变区中导入一处或多处氨基酸改变(例如替代)。或者/另外，可将框架区残基的一处或多处改变(例如替代)导入亲本抗体，这些改变导致抗体突变体针对来自第二哺乳动物物种的抗原的结合亲和力有所改善。要修饰的框架区残基的实例包括那些直接非共价结合抗原的残基(Amit等(1986)Science 233：747-753)；相互作用于/影响CDR构象的残基(Chothia等(1987)J.Mol.Biol.196：901-917)；和/或参与VL-VH界面的(EP 239400B1)残基。在某些实施方案中，一个或多个这类框架区残基的修饰导致抗体针对来自第二哺乳动物物种的抗原的结合亲和力有所增强。例如，在本发明的该实施方案中，可改变约1个至约5个框架残基。有时，这可足以产生适用于临床前试验中的抗体突变体，甚至其中没有高变区残基被改变。可是通常，抗体突变体将包含别的高变区改变。
被改变的高变区残基可以是随机变化的，尤其是在亲本抗体的起始结合亲和力之处，使得这类随机产生的抗体突变体可方便地被筛选出来。
可用于生成此类抗体突变体的一种方法称作“丙氨酸扫描诱变”(Cunningham和Wells(1989)Science 244：1081-1085)。这里，一个或多个高变区残基用丙氨酸或多丙氨酸残基替代，以影响氨基酸与来自第二哺乳动物物种的抗原的相互作用。然后通过在或对替代位点引入更多或其它的突变，推敲那些对替代表现出功能敏感性的高变区残基。如此，虽然引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，但是突变本身的性质不需要预先决定。如本文所述对如此生成的丙氨酸突变体筛选它们的生物学活性。
通常，从保守替代诸如下文显示在标题“优选替代”下的那些开始。如果此类替代导致生物学活性(例如结合亲和力)的改变，那么引入下表中称为“例示替代”的或如下文中关于氨基酸种类的进一步描述的更实质性改变，并筛选产物。
优选替代：
  原始残基  例示替代   优选替代
  Ala(A)  val；leu；ile   val
  Arg(R)  lys；gln；asn   lys
  Asn(N)  gln；his；lys；arg   gln
  Asp(D)  glu   glu
  Cys(C)  ser   ser
  Gln(Q)  asn   asn
  Glu(E)  asp   asp
  Gly(G)  pro；ala   ala
  His(H)  asn；gln；lys；arg   arg
  Ile(I)  leu；val；met；ala；phe；正亮氨酸   leu
  Leu(L)  正亮氨酸；ile；val；met；ala；phe   ile
  Lys(K)  arg；gln；asn   arg
  Met(M)  leu；phe；ile   leu
  Phe(F)  leu；val；ile；ala；tyr   leu
  Pro(P)  ala   ala
  Ser(S)  thr   thr
  Thr(T)  ser   ser
  Trp(W)  tyr；phe   tyr
  Tyr(Y)  trp；phe；thr；ser   phe
  Val(V)  ile；leu；met；phe；ala；正亮氨酸   leu
对抗体生物学特性的甚至更实质性修饰通过选择在保持以下方面的效果上显著不同的替代来完成：(a)替代区域的多肽主链的结构，例如作为折叠片或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。基于共同的侧链特性，将天然存在残基如下分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；
(2)中性、亲水性的：cys、ser、thr、asn、gln；
(3)酸性的：asp、glu；
(4)碱性的：his、lys、arg；
(5)影响链取向的残基：gly、pro；及
(6)芳香族的：trp、tyr、phe。
非保守替代将需要用这些类别之一的一个成员替换另一个类别的。
在另一个实施方案中，利用噬菌体展示(见上文)，对为修饰而选择的位点进行亲和力成熟。
编码氨基酸序列突变体的核酸分子由本领域已知的多种方法制备。这些方法包括但不限于，寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变、和盒式诱变早先制备的突变或非突变型式的亲本抗体。制备突变体的优选方法是定点诱变(参见例如Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488)。
在某些实施方案中，抗体突变体仅有单个高变区残基被替代。在其它实施方案中，亲本抗体的两个或更多个高变区残基被替代，例如约2个至约10个高变区替代。
通常，生物学特性得到改善的抗体突变体所具有的氨基酸序列与亲本抗体重链或轻链可变域的氨基酸序列有至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，和最优选至少95％的氨基酸序列同一性或相似性。关于此序列的同一性或相似性在本文中定义为在比对序列并在必要时引入缺口以获得最大百分比序列同一性后，候选序列中与亲本抗体残基相同(即相同残基)或相似(即来自同一组具有共同侧链特性的氨基酸残基，见上文)的氨基酸残基的百分比。N-末端、C-末端、或内部的延伸、删除、或插入可变域以外的抗体序列都不应视为影响序列同一性或相似性。
产生抗体突变体后，测定该分子相对于亲本抗体的生物学活性。如上所示，这可包括测定抗体的结合亲和力和/或其它生物学活性。在本发明的一个优选实施方案中，制备一组抗体突变体并筛选针对抗原或其片段的结合亲和力。任选将该初始筛选中选出的一个或多个抗体突变体进行一种或多种其它生物学活性测定法以确证结合亲和力增强的抗体突变体是真正有用的，例如可用于临床前研究。
这样选出的抗体突变体可进一步修饰，修饰时常取决于抗体的预期用途。此类修饰可包括进一步改变氨基酸序列，融合异源多肽和/或共价修饰，诸如下文所详述的那些。对于氨基酸序列改变，示例性的修饰在上文有详述。例如，任何不参与保持抗体突变体正确构象的半胱氨酸残基也可被替代，一般替代为丝氨酸，用以改善分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反地，可向抗体中加入半胱氨酸键以改善其稳定性(特别是在抗体是抗体片段时，诸如Fv片段)。另一类氨基酸突变体具有改变的糖基化模式。这可通过删除抗体中发现的一个或多个碳水化合物模块和/或增加不存在于抗体中的一个或多个糖基化位点来实现。抗体糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接的指碳水化合物模块连接于天冬酰胺残基侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X是除了脯氨酸之外的任何氨基酸，是碳水化合物模块酶促连接于天冬酰胺侧链的识别序列。因此，多肽中存在这些三肽序列之任一产生潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、或木糖之一连接于羟基氨基酸(最常见的是丝氨酸或苏氨酸，尽管也可用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸)。在抗体上增加糖基化位点可通过改变氨基酸序列使之包含一个或多个上述的三肽序列来方便地实现(用于N-连接的糖基化位点)。也可在原始抗体序列中(用于O-连接的糖基化位点)通过添加、或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来产生改变。
若抗体包含Fc区，则可改变附着其上的碳水化合物。例如，美国专利申请No.US 2003/0157108(Presta，L.)中记载了有缺乏岩藻糖的成熟碳水化合物结构附着于抗体Fc区的抗体。还可参见US 2004/0093621(Kyowa HakkoKogyo Co.，Ltd.)。WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)和美国专利No.6,602,684(Umana等人)中提到了在附着于抗体Fc区的碳水化合物中有等分N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的抗体。WO 1997/30087(Patel等人)中报告了在附着于抗体Fc区的寡糖中有至少一个半乳糖残基的抗体。关于有更改碳水化合物附着于其Fc区的抗体还可参见WO 1998/58964(Raju，S.)和WO 1999/22764(Raju，S.)。关于具有改良糖基化的抗原结合分子还可参见US 2005/0123546(Umana等)。
本文中优选的糖基化变体包含Fc区，其中附着于Fc区的碳水化合物结构缺乏岩藻糖。此类变体具有改进的ADCC功能。任选的是，Fc区还包含进一步改进ADCC的一处或多处氨基酸替代，例如Fc区位置298、333和/或334处的替代(Eu残基编号方式)。涉及“脱岩藻糖型”或“岩藻糖缺乏型”抗体的出版物的例子包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO 2005/053742；Okazaki等J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87：614(2004)。生成脱岩藻糖化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖化缺陷的Lec13 CHO细胞(Ripka等Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美国专利申请No.US 2003/0157108A1，Presta，L；及WO 2004/056312A1，Adams等，尤其是实施例11)和敲除细胞系，诸如α-1，6-岩藻糖转移酶基因FUT8敲除的CHO细胞(Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87：614(2004))。
(xii)抗体的重组生产
为了重组生产抗体，分离编码抗体的核酸，并插入可复制载体中，用于进一步克隆(DNA扩增)或表达。编码单克隆抗体的DNA易于使用常操作程序分离和测序(例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。可以获得许多载体。载体构件通常包括但不限于下列一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标志基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列(例如如美国专利No.5,534,615中所记载的，明确引入本文作为参考)。
适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞是上文描述的原核生物、酵母或高等真核细胞。适于此目的的原核生物包括真细菌，诸如革兰氏阴性生物体或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科，诸如埃希氏菌属(Escherichia)例如大肠埃希氏菌或大肠杆菌(E.coli)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、和志贺氏菌属(Shigella)、以及芽孢杆菌属(Bacilli)诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日公布的DD 266,710中披露的地衣芽孢杆菌41P)、假单胞菌属(Pseudomonas)诸如铜绿假单胞菌(Paeruginosa)、和链霉菌属(Streptomyces)。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC31,446)，尽管其它菌株诸如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)也是合适的。这些例子是例示性的，而不是限制性的。
在原核生物以外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主。酿酒糖酵母或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常用的面包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。然而，通常可获得许多其它属、种和菌株且可用于本发明，诸如粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，诸如例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克思克鲁维酵母(K.marxianus)；亚罗酵母属(Yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070)；假丝酵母属(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，诸如西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；和丝状真菌，诸如例如脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)、和曲霉属(Aspergillus)宿主诸如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。
适于表达糖基化抗体的宿主细胞衍生自多细胞生物体。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株和变体及相应的允许昆虫宿主细胞，它们来自诸如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)等宿主。公众可获得多种病毒株用于转染，例如苜蓿尺蠖(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕(Bombyx mori)NPV的Bm-5株，而且此类病毒可依照本发明用作本文中的病毒，特别是用于转染草地夜蛾细胞。还可利用棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄和烟草的植物细胞培养物作为宿主。
然而，脊椎动物细胞得到最多关注，而且培养(组织培养)繁殖脊椎动物细胞已经成为常规流程。有用哺乳动物宿主细胞系的例子是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾系(293或为了在悬浮培养中生长而亚克隆的293细胞，Graham等，J.Gen Virol.，36：59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4216(1980))；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.，23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1，ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A，ATCCCRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)；TRI细胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.，383：44-68(1982)；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝瘤系(Hep G2)。
用上文所述用于生产抗体的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当更改的常规营养培养基中进行培养。
可以在多种培养基中培养用于生产本发明抗体的宿主细胞。商品化培养基诸如Ham氏F10(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、极限必需培养基(MEM，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、RPMI-1640(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、和Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)适于培养宿主细胞。另外，可以使用下列文献中记载的任何培养基作为宿主细胞的培养基：Ham等，Meth.Enz.58：44(1979)；Barnes等，Anal.Biochem.102：255(1980)；美国专利No.4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利复审30,985。任何这些培养基可以根据需要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMICINTM)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、和葡萄糖或等效能源。还可以以本领域技术人员知道的适宜浓度包含任何其它必需补充物。培养条件，诸如温度、pH等，就是先前为表达而选择用于宿主细胞的，这对于普通技术人员而言是显而易见的。
在使用重组技术时，可以在细胞内、在周质空间中生成抗体，或者直接分泌到培养基中。如果在细胞内生成抗体，那么作为第一步，通过例如离心或超滤除去宿主细胞或裂解细胞的微粒碎片。如果将抗体分泌到培养基中，那么通常首先使用商品化蛋白质浓缩滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元，浓缩来自此类表达系统的上清液。在任何上述步骤中，可以包括蛋白酶抑制剂诸如PMSF来抑制蛋白水解，而且可以包括抗生素来防止外来污染物的生长。
可以使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析来纯化由细胞制备的抗体组合物，优选的纯化技术是亲和层析。蛋白A作为亲和配体的适宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss等，EMBO J.5：1567-1575(1986))。亲和配体所附着的基质最常用的是琼脂糖，但是可以使用其它基质。物理稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯容许获得比琼脂糖所能获得的更快的流速和更短的加工时间。若抗体包含CH3结构域，则可使用Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)进行纯化。根据待回收的抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术，诸如离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的层析、肝素SEPHAROSETM上的层析、阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE、和硫酸铵沉淀。
D.G-CSF拮抗剂和Bv8拮抗剂的用途
本发明的G-CSF拮抗剂和Bv8拮抗剂可以单独使用或与用于抑制血管发生、肿瘤转移、肿瘤细胞迁移和/或调控CD11b+Gr1+细胞或CD11b+Gr1+细胞的功能性人对应物的动员的其它治疗剂组合使用。
本发明的治疗方法的主要靶是转移性肿瘤和能够转移至转移前器官或转移前组织的肿瘤。本发明的治疗方法还靶向分泌G-CSF(其自骨髓动员CD11b+Gr1+细胞或CD11b+Gr1+细胞的功能性人对应物，如此启动转移前生态位)的肿瘤。人对应物细胞的例子包括人未成熟髓样细胞，人髓样抑制细胞，人嗜中性细胞、单核细胞和巨噬细胞的前体，及人嗜中性细胞、单核细胞和巨噬细胞。本发明的治疗方法还靶向具有升高的G-CSF、Bv8、PKR1、MMP-9、S100A8和/或S100A9表达的肿瘤。
要通过本发明的方法来治疗的疾病和病症的例子包括赘生性病症，诸如本文中在术语“癌症”和“癌性”下描述的那些。在某些实施方案中，要通过本发明的方法来治疗的疾病是转移性肿瘤或转移性癌症。
本发明的治疗方法还提供良性、癌前或非转移性癌症的治疗，其中该治疗预防良性、癌前、或非转移性癌症变成转移性癌症。
本发明进一步提供用于预测患者中的转移性肿瘤是否会有效响应G-CSF拮抗剂和/或Bv8拮抗剂的治疗的方法。此类方法的例子包括确定自受试者获得的样品是否包含表达Bv8、PKR1和/或G-CSF的细胞。在某些实施方案中，所述表达是mRNA表达。在某些实施方案中，所述表达是蛋白质表达。在某些实施方案中，使用qRT-PCR或qPCR来测量基因的mRNA表达水平。在另一个实施方案中，使用微阵列来测量mRNA表达水平。在另一个实施方案中，使用ISH(原位杂交)来测量mRNA表达水平。在某些实施方案中，使用IHC测定法来测量基因的蛋白质表达水平。在某些实施方案中，所述治疗预防良性、癌前、或非转移性癌症变成转移性癌症。在某些实施方案中，G-CSF拮抗剂和/或Bv8拮抗剂的治疗预防转移性癌症转移至身体中别处的转移前组织或器官。
在某些实施方案中，G-CSF拮抗剂和/或Bv8拮抗剂的治疗的功效可通过测定转移前器官或转移前组织G-CSF、Bv8、PKR1、MMP-9、S100A8或S100A9的表达水平来监测。在某些实施方案中，转移前肺和/或转移肺中Bv8、MMP-9、S100A8和/或S100A9的mRNA表达水平和/或蛋白质表达水平上调。在某些实施方案中，如果Bv8和/或MMP-9的mRNA表达水平和/或蛋白质表达水平在用抗Bv8抗体治疗后降低的话，抗Bv8抗体的治疗是有效的。在某些实施方案中，抗Bv8抗体的治疗降低转移前肺中Bv8和/或MMP-9的mRNA表达水平和/或蛋白质(表达水平)。在某些实施方案中，如果Bv8和/或MMP-9的mRNA表达水平和/或蛋白质表达水平在用抗G-CSF抗体治疗后降低的话，抗G-CSF抗体的治疗是有效的。在某些实施方案中，抗G-CSF抗体的治疗降低转移前肺和/或转移肺中Bv8和/或MMP-9的mRNA表达水平和/或蛋白质表达水平。
本发明提供组合疗法，其中本发明的G-CSF拮抗剂或Bv8拮抗剂与另一种疗法组合施用。组合治疗尤其包括与VEGF拮抗剂，诸如抗VEGF抗体组合施用本文中的G-CSF拮抗剂和/或Bv8拮抗剂。另外/或者，本文中的G-CSF拮抗剂和/或Bv8拮抗剂可以与一种或多种别的药剂，例如抗癌剂或治疗剂、抗血管发生剂、或抗新血管形成治疗组合施用来治疗各种赘生性状况。
本发明的G-CSF拮抗剂或Bv8拮抗剂可以与对那些目的有效的另一药剂顺次或组合施用，或是以同一组合物形式或是作为分开的组合物形式顺次或组合施用。
拮抗剂和/或药剂的施用可以同时进行，例如作为单一组合物或者作为两种或更多不同的组合物，使用相同或不同的施用路径。或者/另外，施药可以以任一次序序贯进行。在某些实施方案中，两次或更多次组合物施用之间可以有范围为数分钟、至数天、至数周、至数月的时间间隔。例如，可以先施用VEGF拮抗剂，接着是不同拮抗剂或药剂。然而，也涵盖同时施用或先施用本发明的不同拮抗剂或药剂。
施用的治疗剂的有效量会取决于医师或兽医的判断。完成剂量施用和调整以实现对要治疗的状况的最大管理。此外剂量会取决于诸如待使用的治疗剂的类型和所治疗的特定患者等因素。VEGF拮抗剂的合适剂量就是当前所用的那些，而且可以由于本发明VEGF拮抗剂和不同拮抗剂的联合作用(协同)而降低。在某些实施方案中，抑制剂的组合增强单一抑制剂的功效。术语“增强”指治疗剂在其常用或批准的剂量功效得到提高。还可参见本文中标题为“药物组合物”的部分。
与癌症有关的抗血管发生疗法是致力于抑制为支持肿瘤生长而提供养分所需要的肿瘤血管发育的癌症治疗策略。因为血管发生牵涉原发性肿瘤生长和转移二者，所以本发明提供的抗血管发生治疗不但能够在原发性位点抑制肿瘤的赘生性生长，而且能够预防肿瘤在继发性位点的转移，从而容许由其它治疗剂攻击肿瘤。在本发明的一个实施方案中，抗癌剂或治疗剂是抗血管发生剂。在另一个实施方案中，抗癌剂是化疗剂。
本领域已经鉴定和知道许多抗血管发生剂，包括本文所列的那些，例如定义下所列的，还可参见例如Carmeliet and Jain，Nature 407：249-257(2000)；Ferrara et al.，Nature Reviews：Drug Discovery，3：391-400(2004)；and Sato Int.J.Clin.Oncol.，8：200-206(2003)。还可参见美国专利申请US20030055006。在一个实施方案中，G-CSF拮抗剂和/或Bv8拮抗剂与抗VEGF中和性抗体(或片段)和/或另一种VEGF拮抗剂或VEGF受体拮抗剂，包括但不限于例如可溶性VEGF受体(例如VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、神经毡蛋白(例如NRP1、NRP2))片段、能够阻断VEGF或VEGFR的适体、中和性抗VEGFR抗体、VEGFR酪氨酸激酶(RTK)的低分子量抑制剂、VEGF的反义策略、针对VEGF或VEGF受体的核酶、VEGF的拮抗性变体、及其任何组合联合使用。或者/另外，任选的是，可以在VEGF拮抗剂和G-CSF拮抗剂和/或Bv8拮抗剂之外对患者共施用两种或更多种血管发生抑制剂。在某些实施方案中，可以与G-CSF拮抗剂、Bv8拮抗剂、VEGF拮抗剂、和/或抗血管发生剂组合施用一种或多种别的治疗剂，例如抗癌剂。
在本发明的某些方面，可用于G-CSF拮抗剂或Bv8拮抗剂的组合肿瘤疗法的其它治疗剂包括其它癌症疗法(例如手术、放射学治疗(例如牵涉照射或施用放射性物质)、化疗、本文所列和本领域知道的抗癌剂的治疗、或其组合)。或者/另外，结合本文披露的相同抗原或两种或更多种本文披露的不同抗原的两种或更多抗体可以共施用于患者。有时，还对患者施用一种或多种细胞因子可能是有益的。
在某些方面，本发明提供抑制转移的方法，其通过给对癌症易感的或诊断有癌症的患者施用有效量的VEGF拮抗剂和G-CSF拮抗剂和/或Bv8拮抗剂和一种或多种化疗剂来进行。多种化疗剂可用于本发明的组合治疗方法。本文在“定义”下提供了所涵盖的化疗剂的例示性和非限制性列表。
正如本领域普通技术人员会理解的，化疗剂的适宜剂量一般会在单独或联合其它化疗剂施用该化疗剂的临床疗法中早就采用的那些剂量附近。根据所治疗的状况，剂量有可能发生变化。施行治疗的医师能够为受试者个体确定适宜的剂量。
本发明提供用于治疗先前抗癌疗法复发或不应的患者的方法和组合物。本发明还提供用于治疗复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长的方法和组合物。复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长用于描述正在接受一种或多种当前可用疗法(例如癌症疗法，诸如化疗、放疗、手术、激素疗法和/或生物学疗法/免疫疗法、抗VEGF抗体疗法，特别是特定癌症的标准治疗方案)或用一种或多种当前可用疗法治疗过的患者在临床上不足以治疗患者或患者不再由该疗法取得任何有益效果使得这些患者需要别的有效疗法的状况。在某些实施方案中，该表述也可指“无响应/顽固性”患者的状况，例如描述患者对疗法有响应但遭受副作用、形成抗性、对疗法不响应、对疗法的响应不令人满意、等。在各种实施方案中，癌症是复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长，其中癌细胞数目没有显著的减少，或者增多了，或者肿瘤大小没有显著的缩小，或者增大了，或者癌细胞的大小或数目未能有任何进一步的缩小或减少。确定癌细胞是否是复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长可以在体内或在体外进行，通过本领域知道的用于测定治疗对癌细胞有效性的任何方法，在这样的语境中使用本领域公认的“复发性”或“顽固性”或“无响应”的含义以及使用本文中在定义下提供的定义。
另外，G-CSF拮抗剂或Bv8拮抗剂可以与激素、放射和化疗剂组合施用，由此使癌细胞对一种或多种这些药剂再次敏感，然后可以施用(或继续施用)所述药剂以治疗或控制癌症，包括转移性癌症，及预防转移。
本发明还部分基于对于鉴定会有效响应G-CSF拮抗剂和/或Bv8拮抗剂的治疗的患者有用的生物标志物的鉴定。这些生物标志物也可用于预测和监测此类治疗的功效。例如，癌症患者可以接受活检以获得组织或细胞样品，而且可以提供各种体外测定法来检查样品以确定G-CSF、PKR1、或一种或多种作为URMCNAs或DRMCNA所列的基因的表达与参照样品相比是否升高或降低。包含靶生物标志物的样品可以通过本领域公知的且适合于感兴趣癌症的特定类型和位置的方法来获得。常常使用组织活检来获得一块代表性的癌性组织。可以对同时或在不同时间测量的样品和参照样品实施比较。如此，所公开的方法和测定法提供方便的、有效的、且潜在划算的手段来获得数据和信息，其可用于评估用于治疗癌症患者的适宜或有效疗法。
在本发明的方法中，获得哺乳动物组织或细胞样品并检查一种或多种生物标志物的表达。样品中各种生物标志物的表达可通过多种方法来分析，其中许多是本领域已知的和熟练技术人员了解的，包括但不限于免疫组织化学和/或Western印迹分析、免疫沉淀、分子结合测定法、ELISA、ELIFA、荧光活化的细胞分拣(FACS)等等、基于定量血液的测定法(例如血清ELISA)(用于检查例如蛋白质表达水平)、生化酶活性测定法、原位杂交、Northern分析和/或PCR分析mRNA、以及可通过基因和/或组织阵列分析来实施的极其多种测定法之任一。用于评估基因和基因产物的状态的典型方案可见于例如Ausubel et al.eds.，1995，Current Protocols In Molecular Biology，单元2(Northern印迹)、单元4(Southern印迹)、单元15(免疫印迹)和单元18(PCR分析)。也可使用多路免疫测定法，诸如那些自Rules Based Medicine或MesoScale Discovery(MSD)可得的。
本发明的方法进一步包括检查组织或细胞样品中作为URMCNA或DRMNA所列的一种或多种靶基因的mRNA的存在和/或表达的方案。靶基因还包括G-CSF和PKR1。用于评估细胞中mRNA的方法是众所周知的，包括例如使用互补DNA探针的杂交测定法(诸如使用经标记的对作为URMCNA、DRMCNA所列的一种或多种基因、G-CSF或PKR1特异性的RNA探针的原位杂交、Northern印迹和相关技术)和各种核酸扩增测定法(诸如使用对作为URMCNA、DRMCNA所列的一种或多种基因、G-CSF或PKR1特异性的互补引物的RT-PCR，及其它扩增型检测方法，诸如例如分支DNA、SISBA、TMA等等)。
可以使用Northern、点印迹或PCR分析方便地对来自哺乳动物的组织或细胞样品测定mRNA。例如，RT-PCR测定法(诸如定量PCR测定法)是本领域众所周知的。在本发明的一个例示性实施方案中，用于检测生物学样品中的靶mRNA的方法包括使用至少一种引物通过逆转录自样品生成cDNA；使用靶多核苷酸作为有义和反义引物扩增如此生成的cDNA以扩增其中的靶cDNA；并检测所扩增靶cDNA的存在。另外，此类方法可以包括一个或多个如下步骤，其容许测定生物学样品中靶mRNA的水平(例如通过同时检查“持家”基因诸如肌动蛋白家族成员的比较性对照mRNA序列的水平)。任选的是，可以测定所扩增靶cDNA的序列。在某些实施方案中，本发明的方法包括通过微阵列技术来检查或检测组织或细胞样品中mRNA，诸如靶mRNA的方案。
在一些实施方案中，使用免疫组织化学和染色方案来检查样品中的靶蛋白质表达。组织切片的免疫组织化学染色已经证明是一种评估或检测样品中蛋白质存在的可靠方法。免疫组织化学(“IHC”)技术利用抗体来探查和显现原位细胞抗原，通常通过显色或者荧光方法。
针对靶蛋白质的诊断性标志物集可以包括URMCP或DRMCP下所列分子中的一种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种、十种或更多种、十一种或更多种、十二种或更多种、十三种或更多种、十四种或更多种、十五种或更多种、或全集。所述分子是编码蛋白质的核酸或具有改变的表达和/或活性的蛋白质，而且选自下述：C-CSF，Bv8，PKR1，Stfa3，CAMP，TNFSF14，MGAM，Ngp，S100A8，S100A9，LRP1B，CEACAM4，HAO1，C10orf46，CLECSF9，Mcpt8，PRTN3，Slfn3，MMP-9，TYMS，CRIPTO CR-1，MPHOSPH1，CDH6，WWP2，DMC1，BCHE，NSLE16484，F9，GDAP1，LOC375188，DNTT，PPIL3，KCND2，ZNF597，IGSF4D和GTF3C4。在某些实施方案中，提供检测一种或多种靶蛋白质的一种或多种抗体。
E.药物组合物和施用
依照已知方法将本发明的G-CSF拮抗剂和Bv8拮抗剂，诸如抗G-CSF抗体、抗Bv8抗体和抗PKR1抗体(单独的或与其它治疗剂组合的)施用于人患者，诸如静脉内施用(像推注或持续一段时间的连续输注)、肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、表面或吸入路径，和/或皮下施用。
在某些实施方案中，本发明的治疗牵涉组合施用G-CSF拮抗剂或Bv8拮抗剂和VEGF拮抗剂和/或化疗剂。在一个实施方案中，存在别的抗癌剂，例如一种或多种不同抗血管发生剂、一种或多种化疗剂、等。本发明还涵盖施用多种抑制剂，例如针对同一抗原的多种抗体或针对本发明不同蛋白质的多种抗体。在一个实施方案中，与本文中的Bv8拮抗剂一起施用不同化疗剂的混合物。组合施用包括使用分开的配制剂或单一药物配制剂的共施用，和/或任一次序的顺次施用。例如，VEGF拮抗剂可以在施用G-CSF拮抗剂或Bv8拮抗剂之前、之后、交替，或者可以同时给予。在一个实施方案中，有一段时间两种(或全部)活性剂同时发挥其生物学活性。
对于疾病的预防或治疗，本发明药剂的适宜剂量取决于上文定义的待治疗疾病的类型、疾病的严重程度和病程、施用抑制剂是用于预防还是治疗目的、先前的疗法、患者的临床史和对抑制剂的响应、及主治医师的判断。将抑制剂一次性或者在一系列治疗中适当的施用于患者。在组合治疗方案中，本发明的组合物以治疗有效量或治疗协同量施用。在用于本文时，治疗有效量指导致所针对疾病或疾患得到减轻或抑制的本发明组合物的施用量和/或VEGF拮抗剂和一种或多种其它治疗剂的共施用量。药剂组合的施用效果可以是叠加的。在一个实施方案中，施用的效果是协同效应。治疗协同量指协同地或显著地减轻或消除与特定疾病有关的状况或症状所必需的VEGF拮抗剂和一种或多种其它治疗剂(例如G-CSF拮抗剂和/或Bv8拮抗剂和任选的化疗剂和/或抗癌剂)的量。
根据疾病的类型和严重程度，大约1μg/kg到50mg/kg(例如0.1-20mg/kg)G-CSF拮抗剂、Bv8拮抗剂、VEGF拮抗剂、化疗剂、和/或抗癌剂是施用于患者的初始候选剂量，无论是例如通过一次或多次分开施用，或者是通过连续输注。典型每日剂量的范围可以为大约1μg/kg到大约100mg/kg或者更多，取决于上述因素。对于持续数天或更长时间的重复给药，根据疾患，治疗维持到直至发生期望的疾病症状抑制。然而，其它剂量方案可能也是有用的。典型的是，临床医师将会施用本发明的分子，直至剂量达到提供所需生物学效应。可以通过常规技术和测定法来容易的监测本发明疗法的进展。
例如，血管发生抑制剂(例如抗VEGF抗体，诸如AVASTIN(Genentech，South San Francisco，CA))的制备和剂量给药方案可以依照制造商的说明书使用，或者由熟练从业人员凭经验确定。在另一个例子中，此类化疗剂的制备和剂量给药方案可以依照制造商的说明书使用，或者由熟练从业人员凭经验确定。化疗的准备和剂量给药方案还记载于Chemotherapy Service Ed.，M.C.Perry，Williams&Wilkins，Baltimore，MD(1992)。
本发明治疗的功效可以通过评估赘生性病症中常用的各种终点来测量。例如，癌症治疗可以通过例如但不限于肿瘤消退、肿瘤重量或大小收缩、距进展的时间、存活持续时间、无进展存活、整体响应率、响应持续时间、生活质量、蛋白质表达和/或活性来评估。因为本文所述抗血管发生剂靶向肿瘤血管结构而不必是赘生性细胞本身，所以它们代表了一类独特的抗癌药，并因此可以要求独特的对药物的临床应答的测量和定义。例如，二维分析中大于50％的肿瘤收缩是宣告响应的标准截留。然而，本发明的抑制剂可以引起对转移性扩散的抑制而没有原发瘤的收缩，或者可以仅仅发挥抑制肿瘤效果。因而，可采用测定治疗功效的方法，包括例如测量血管发生的血浆或尿液标志物和通过放射学成像测量响应。
在本发明的另一个实施方案中，提供了包含可用于治疗或诊断上文所述病症的物质的制品。所述制品包括容器、标签和包装插页。合适的容器包括例如药瓶、药管、注射器等。所述容器可以用多种材料制成，诸如玻璃或塑料。在一个实施方案中，所述容器装有有效治疗所述疾患的组合物，可以具有无菌存取口(例如所述容器可以是带有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或药瓶)。所述组合物中的至少一种活性药剂是G-CSF拮抗剂或Bv8拮抗剂。在某些实施方案中，所述活性药剂是抗G-CSF抗体。在某些实施方案中，所述活性药剂是抗Bv8抗体。容器上或与容器相连的标签指明该组合物用于治疗所选择的疾患。在某些实施方案中，所述容器装有作为检测会有效响应G-CSF拮抗剂和/或Bv8拮抗剂的治疗的转移性肿瘤的诊断剂的标志物集合。在某些实施方案中，所述组合物中的至少一种药剂是用于检测G-CSF、PKR1、URMCNA、URMCP、DRMCNA和/或DRMCP的标志物。所述制品可进一步包括第二容器，其中装有药学可接受的缓冲液，诸如磷酸盐缓冲盐水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。
以下非限制性实施例例示了本发明的更多详情。
实施例1
材料和方法
细胞系。小鼠乳房肿瘤细胞系67NR、168FARN、4TO7、和66c14(Dexter，DL et al Cancer Res 38，3174(1978)；Aslakson，CJ and Miller，FR Cancer Res 52，1399(1992))来自F.Miller(Karmanos Cancer Institute，Detroit，MI)。4T1乳腺癌、Lewis肺癌(LLC)、和B16F10小鼠黑素瘤购自ATCC。MDA-MB-231-D3H1(稳定表达萤光素酶的MDA-MB-231细胞)来自Xenogen(Alameda，CA)。MDA-MB-231-X1.1是表达GFP的细胞，先前经由小鼠传代以生成高致瘤性细胞系。它们是如下生成的，用表达GFP和嘌呤霉素的载体转染亲本MDA-MB-231细胞。随后，将GFP阳性细胞皮下(在Matrigel)注射入SCID/bg小鼠中。收获可见的肿瘤，并分离和扩增致瘤细胞。所有乳腺癌细胞系在IMDM中培养，MDA-MB-231、LLC和B16F10细胞除外，它们在DMEM(Invitrogen，Carlsbad，CA)中培养。IMDM和DMEM都补充有10％FBS(Sigma，St.Louis，MO)。所有细胞维持于37℃、在5％CO2、80％湿度温箱中。
小鼠。小鼠乳腺癌MMTV-PyMT小鼠得自McMaster大学(Ontario)。雌性Balb/c、Balb/c Nude、CB6F1(雌性BALB/c和雄性C57BL/6之间的杂交)来自Charles River Laboratory(Hollister，CA)。雌性C57BL/6小鼠得自The JacksonLaboratory(Sacramento，CA)。动物维持和实验方案遵循联邦法规进行并得到科研动物护理和使用委员会批准。
肿瘤模型。将67NR、168FARN、4TO7、66c14、和4T1细胞同位注射入雌性Balb/c或CB6F1的右侧第4乳房脂肪垫，浓度为200,000个细胞每10μlPBS。抗Bv8处理如先前所述实施(Shojaei，F.et al.Nature 450，825-831(2007))。简言之，抗Bv8处理在肿瘤细胞接种后2天通过腹膜内施用路径开始(2B9和3F1单克隆抗体各5mg/kg)。抗豚草单克隆抗体(10mg/kg)充当对照。每周两次将抗体施用于携瘤小鼠。中和性抗小鼠G-CSF mAb(MAB414)和匹配同等型IgG对照(R&D Systems，Minneapolis，MN)以25μg每只小鼠的剂量隔天施用。隔天使用椭球体体积公式计算肿瘤体积(0.5xLxW2，其中L是长度而W是宽度)。
B16F10和LLC细胞以1x108个细胞每ml Matrigel(生长因子减少的；BDPharmingen，San Jose，CA)的浓度重悬浮并皮下注射(100μl)入C57BL/6小鼠的背侧。肿瘤接种后15天(此时在肺组织中没有检测到癌细胞)对来自携带B16F10或LLC的小鼠的组织分析CD11b+Gr1+细胞含量和Bv8表达。
在8周(没有检测到可见的肺转移)和12周(转移结节清楚可见)龄时对来自雌性MMTV-PyMT小鼠的组织分析血浆和肺组织中的G-CSF和Bv8表达。MMTV-PyMT阴性同胞(根据基因型测定的评估，转基因缺失的同窝仔)用作对照动物，并称作未处理的。为了抗Bv8和抗G-CSF研究，自12周龄雌性的原发性肿瘤分离MMTV-PyMT细胞。所有分离的细胞(肿瘤和基质)计数并以2x107个细胞每ml PBS∶Matrigel(1∶1混合物)(生长因子减少的；BDPharmingen，San Jose，CA)的浓度重悬浮并注射(50μl)入FVB小鼠的第4乳房脂肪垫。分离的细胞还在补充有FBS的DMEM中培养。抗Bv8(10mg/kg 2D3单克隆抗体)或抗小鼠G-CSF(抗G-CSF，2.5mg/kg，MAB414，来自R&DSystems，Minneapolis，MN)的处理在肿瘤接种后2天通过腹膜内施用路径启动。在研究结束时，肺用PBS灌注并在福尔马林中固定。随后，7-μm厚切片H&E染色，并对肺中存在的肿瘤计数。平均而言，每个肺分析三个切片(相距250μm)。
MDA-MB-231-X1.1细胞以4x107个细胞每ml PBS∶Matrigel(1∶1混合物)(BD Pharmingen，San Jose，CA)的浓度重悬浮，并注射(50μl)入SCID/bg小鼠的第4乳房脂肪垫。抗Bv8(10mg/kg 2D3单克隆抗体)或抗人G-CSF(抗hG-CSF，2.5mg/kg，MAB214，来自R&D Systems，Minneapolis，MN)的处理在肿瘤细胞接种后2天通过腹膜内施用路径启动。匹配同种型IgG对照充当对照。抗体每周三次施用于携瘤小鼠。在研究结束时，肺用PBS灌注并在低聚甲醛中固定16小时。随后，肺转移至30％蔗糖/PBS溶液。转移灶数目如下产生，将整个肺放置在荧光显微镜下并对组织内的GFP阳性灶计数(由超过2个细胞组成，以避免对肺脉管系统中捕获的单个癌细胞计数)。
或者，为了涉及将重组G-CSF注射入雌性Balb/c Nude小鼠的研究，仓鼠抗小鼠Bv8 mAb 2D3(Shojaei，F.et al.Proc Natl Acad Sci USA(2009))，一种适合于免疫中和和免疫组织化学的抗体(Genentech，South San Francisco，CA)，以10mg/kg的剂量每周施用两次。
Bv8缺无小鼠的生成。为了评估内源Bv8缺失在肿瘤模型中的影响，我们经由移植Bv8缺无胎肝细胞生成了骨髓衍生单个核细胞(BMMNC)中缺失Bv8的小鼠。为了生成Bv8缺无小鼠，使用含有小鼠基因Bv8的BAC克隆mVRPA BAC 133N12(Research Genetics)和具有三个loxP位点的打靶载体TNLOX1-3来构建打靶构建物，其设计用于生成具有Bv8敲除和调节性敲除删除等位基因的小鼠。正确靶向外显子2的具有PGK-Neo盒的ES克隆通过Southern印迹来筛选，并进行Cre重组酶电泳以切除PGK-Neo选择盒和外显子2二者，从而实现Bv8敲除。将六个Bv8KO克隆注射入来自C57BL/6小鼠的胚泡。经由种系遗传断裂突变的嵌合体与C57BL/6小鼠杂交。小鼠在近交129SvEv背景上维持，并回交至C57BL/6背景。
胎肝移植和肿瘤接种入经致死照射的宿主。胎肝(FL)细胞分离自第E13.5-14.5天的的Bv8WT或KO小鼠胚胎。怀孕小鼠在妊娠第13.5-14.5天处以安乐死，并在显微解剖显微镜中分离FL细胞，并立即放置在装有冷的普通DMEM的Petri皿中。通过剧烈移液FL及使细胞通过40微米细胞滤器(BDFalcon，CA)生成单细胞悬浮液。然后对FL细胞使用ACK裂解缓冲液(Cambrex，MA)进行红血球裂解，保持在普通DMEM中，并随后用于移植入经致死照射的小鼠。
在移植之前，CB6F1小鼠在Cs辐照器中以1080拉德致死照射，以消除宿主中的内源BMMNC，接着iv注射100μl PBS中4x105个完整胎肝细胞。
FL移植后4周，如所述的，将4T1或66c14细胞接种入CB6F1小鼠的第4乳房脂肪垫。同种型对照或抗Bv8抗体(2B9和3F1)的处理如(Shojaei，F.et al.Nature 450，825-831(2007))所述实施。对肺分析转移的存在，或是通过micro-CT或是通过对肺表面上可见的肿瘤计数。
Luc-zsGreen-Hygro细胞系的生成。通过将萤光素酶cDNA以符合zsGreen cDNA读码框的方式插入pMSCV-zsGreen载体生成编码融合蛋白萤光素酶-zsGreen(萤火虫萤光素酶和zsGreen之间的一种功能性融合物)的pMSCV载体。潮霉素抗性基因由pMSCV载体编码。
为了生成稳定表达萤光素酶-zsGreen融合物的67NR和4T1细胞，使用FuGENE转染试剂依照制造商的方案(Roche，Indianapolis，IN)用pMSCV-Luc-zsGreen-Hygro载体转染细胞。通过在200μg/ml潮霉素存在下培养经转染细胞10天来选择潮霉素抗性细胞。萤光素酶-zsGreen阳性细胞通过流式细胞术基于它们的zsGreen表达来分拣并通过用双重萤光素酶报告物测定系统(Promega，San Luis Obispo，CA)测量萤光素酶活性来进一步验证表达萤光素酶。表达zsGreen和萤光素酶二者的细胞在潮霉素(100μg/ml)存在下进一步扩增并用于随后的实验。
MDA-MB-231细胞的体内选择。为了生成在肺中显示增强的转移潜力的MDA-MB-231细胞系，经由SCID/bg小鼠的尾静脉注射PBS中的5x105个MDA-MB-231-D3H1细胞。6周后(此时生物发光成像显示肺中存在正在生长的肿瘤)，自三只小鼠收获肺，剥离肿瘤细胞，并在培养中扩增。生成三个独立的细胞系(得自三只不同小鼠)并命名为MDA-MB-231-L1.1、-L2.1和-L3.1。为了获得在原发性肿瘤部位致瘤的细胞，将Matrigel中的1x106个MDA-MB-231-D3H1细胞接种入SCID/bg小鼠的第4乳房脂肪垫。收获原发性肿瘤，剥离细胞，并在培养中扩增。生成三个独立的细胞系(得自三只不同小鼠)，并命名为MDA-MB-231-T1.1、-T2.1和-T3.1。为了基因表达分析，以500,000个细胞/孔(在6孔板中)的密度接种新建立的细胞系，48小时后收集RNA，并用于随后的qRT-PCR表达分析。
66c14-shPKR1和67NR-PKR1细胞的生成。为了生成具有降低的PKR1表达的66c14细胞，用靶向小鼠PKR1的shRNA载体(shPKR1，Open Biosystems，Huntsville，AL)转染66c14细胞，并经由在嘌呤霉素(5μg/ml)存在下培养细胞来分离稳定表达shPKR1的克隆。作为对照，用表达非靶向shRNA的载体(sh(对照))转染66c14细胞。为了生成过表达PKR1的67NR细胞，用含有CMV-PKR1表达盒的载体与携带Zeocin抗性基因的载体一起共转染67NR细胞。在Zeocin(200ng/ml)存在下选择稳定表达PKR1的细胞。随后，将细胞经由尾静脉静脉内注射入经媒介或G-CSF预处理的Balb/c小鼠。3周后，分离肺，并检查可见肿瘤的存在。肺中肿瘤的真实性通过H&E染色确认。
RNA样品制备和定量逆转录-PCR(qRT-PCR)分析。用RNeasy试剂盒(Qiagen，Germany)依照制造商的方案自经PBS灌注的肺制备无DNA的总RNA。用SuperScript III铂金级一步qRT-PCR试剂盒(SuperScript III PlatinumOne-step qRT-PCR kit)(Invitrogen，Carlsbad，CA)或用TaqMan一步RT-PCR大师级混合物(TaqMan One-step RT-PCR Master Mix)(Applied Biosystems，FosterCity，CA)和100ng总RNA在50μL总体积中进行一步定量逆转录-PCR。使用下述TaqMan基因表达测定引物和探针混合物：Bv8(测定ID：Mm00450080_m1)，MMP9(测定ID：Mm00442991_m1)，S100A8(测定ID：Mm00496696_g1)，S100A9(测定ID：Mm00656925_m1)，G-CSF(测定ID：Hs99999083_m1)，M-CSF(测定ID：Hs99999084_m1)，GM-CSF(测定ID：Hs00929873_m1)VEGF-A(测定ID：Hs00900054_m1)，PlGF(测定ID：Hs01119262_m1)，SDF1α(测定ID：Hs00171022_m1)，Cxcl1(测定ID：Hs00236937_m1)，MMP1(测定ID：Hs00899658_m1)，PKR1(测定ID：Mm00517546_m1和Hs03044877_m1)，PKR2(测定ID：Mm00769571_m1和Hs03046077_m1)，Hprt1(测定ID：Mm00446968_m1和Hs99999909_m1)，GAPDH(测定ID：Mm99999915_g1和Hs99999905_m1)。使用定制引物和TaqMan探针(Applied Biosystems，Foster City，CA)来检测潮霉素表达：正向引物：CCGCAAGGAATCGGTCAAT(SEQ ID NO：15)；反向引物：GATCAGCAATCGCGCATATG(SEQ ID NO：16)；TaqMan探针：6FAM-CACTACATGGCGTGATT-MGBNFQ(SEQ ID NO：17)(分子沟结合非荧光淬灭物，Applied Biosystems，Foster City，CA)。
使用Applied Biosystems 7500实时PCR系统在下述条件下进行反应：逆转录步骤(15min，48℃)，接着是95℃的变性步骤和40个循环的15秒95℃和1分钟60℃。用相对定量方法使用GAPDH或Hprt1 mRNA作为内源对照测定每份样品中基因表达的水平。
微阵列样品制备和分析。给Balb/c小鼠注射PBS(未处理)、非转移性67NR细胞(PBS中200,000个细胞每只小鼠)、或转移性4T1细胞(PBS中的200,000细胞每只小鼠)。每个条件使用5只小鼠。肿瘤细胞接种后6天(或在肿瘤达到约50mm3时)，对小鼠处以安乐死，并给肺灌注PBS以完全自肺脉管系统清除血液。将经清洁的肺叶浸泡在RNAlater(Qiagen，Germany)中以稳定RNA。如RNA制备小节所述分离总RNA，并用于随后的微阵列分析。使用Affymetrix微阵列(小鼠430-v2)来分析组织样品的表达谱。1份来自4T1组的样品被排除在最终的分析之外，因为数据的质量很差。使用执行Choe，et al.Genome Biol 6，R16(2005)的推荐的程序加工原始数据。
mG-CSF克隆和表达。为了生成鼠G-CSF瞬时表达构建物，自IMAGE小鼠cDNA克隆#40129682(OPEN BIOSYSTEMS)扩增含有共有Kozak序列和mG-CSF编码区及其C端6xHis标签的PCR片段，并插入pRK载体的ClaI和EcoRI位点。然后将所得构建物用于瞬时转染CHO细胞。收获上清液，并使用Ni-NTA柱继以大小排阻柱来纯化重组mG-CSF蛋白。
体内G-CSF和抗G-CSF研究。为了分析G-CSF对远端器官处髓样细胞动员和归巢的影响，连续5天每天给8周龄雌性Balb/c或Balb/c Nude小鼠皮下注射10μg重组人G-CSF(Neupogen，Amgen，Thousand Oaks，CA)或重组小鼠G-CSF。将G-CSF储液用无菌PBS(Invitrogen，Carlsbad，CA)稀释至期望浓度。对照动物给予作为媒介的PBS。在研究结束时(最后一次G-CSF注射后24小时)，给小鼠灌注PBS，并取出组织(肺、骨髓、全血、脾、肝、和肾)供分析用。如流式细胞术小节所述分析CD11b+Gr1+或Ly6G+Ly6C+细胞。通过ELISA如描述的那样测量组织中Bv8的水平。
为了确定Bv8在G-CSF诱导的CD11b+Gr1+细胞动员中的作用，Balb/cNude小鼠接受每日剂量(持续5天)的抗Bv82D3抗体(2.5mg/kg)，接着是处理后6小时的小鼠G-CSF(Genentech，South San Francisco，CA)。抗gp120抗体(Genentech，South San Francisco，CA)用作同种型对照。在一些实验中，用大鼠抗Gr1抗体(50μg每只小鼠，克隆RB6-8C5，eBioscience，San Diego，CA)或抗Ly6G抗体(50μg每只小鼠，克隆1A8，BD Biosciences，San Jose，CA)处理小鼠。作为阳性对照，我们使用大鼠抗小鼠G-CSF单克隆抗体(50μg每只小鼠，MAB414，R&D Systems，Minneapolis，MN)，以与抗Bv8抗体相同的间隔给予，并继以小鼠G-CSF。
为了确定G-CSF在转移中的作用，将Balb/c、Balb/c Nude、C57BL/6或SCID/bg小鼠如上所述用人或小鼠G-CSF(10μg每只小鼠)预处理。这之后是尾静脉注射100μl PBS中的10,000个细胞(66c14，4T1，67NR，B16F10或MDA-MB-231-L1.1)。G-CSF施用在注射癌细胞后再继续5天。在注射癌细胞后3周(67NR是4周而MDA-MB-231-L1.1肿瘤是5周)对小鼠分析肺肿瘤的存在。给肺灌注PBS，在福尔马林中固定，并对可见肿瘤计数。肺中肿瘤的真实性通过H&E染色来确认。
为了确定Bv8、Gr1+或Ly6G+细胞在G-CSF诱导的转移中的作用，将小鼠用媒介或小鼠G-CSF(2.5μg每只小鼠)预处理，并用抗Bv8、抗Gr1、抗Ly6G或抗G-CSF抗体进一步处理5天，如上所述进行。抗VEGF抗体(G6.31，Genentech，South San Francisco，CA)隔天以5mg/kg给予。抗体处理在接种肿瘤细胞后中断。
迁移测定法。细胞用胰蛋白酶处理，用无FBS的IMDM清洗，并以100,000个细胞/ml的浓度重悬浮。将300μl细胞悬浮液加载至经I型胶原(BDBiosciences，San Jose，CA)包被的FluoroBlok 24-多孔插入系统板(8.0μm，BDBiosciences)的上部孔1小时，之后建立测定。给下部孔填充1ml具有指定浓度人Bv8(Peprotech，Rocky Hill，NJ)的IMDM。具有1％FCS的IMDM充当阳性对照。将板温育16小时。用钙黄绿素AM(BD Biosciences，San Jose，CA)荧光标记迁移穿过膜的细胞。获取经标记细胞的图像(Zeiss显微镜系统)，并使用ImageJ软件(NIH)对细胞计数。
自肿瘤细胞收集条件培养基。67NR、168FARN、4TO7、和66C14、和4T1分离的MMTV-PyMT和MDA-MB-231-X1.1细胞如细胞系小节所述培养。达到90％汇合后，将培养基更换成无血清IMDM。两天温育后收集条件培养基，并使用Vi-Cell XR(Beckman Coulter，Fullerton，CA)测量细胞存活力和总细胞数。如ELISA小节所述对收集的培养基分析细胞因子的存在。所有数据相对于总细胞数标准化。
体内溢出测定法。培养66c14或4T1细胞，直至它们达到90％汇合，并用10μM CellTracker Green CMFDA(Invitrogen，Carlsbad，CA)依照制造商的方案标记30分钟。标记后，将细胞用胰蛋白酶处理，用PBS清洗，计数，并经由尾静脉给在抗Bv8(2B9+3F1)、抗Gr1、抗G-CSF、或同种型对照(ISO)抗体存在下经小鼠G-CSF预处理(2.5μg每只小鼠，每天，持续5天)的Balb/c Nude小鼠静脉内注射100μl PBS中的100,000个经标记细胞，如G-CSF小节所述。对于阴性对照，将未标记66c14或4T1细胞注射入经G-CSF和同种型对照抗体(ISO)预处理的小鼠。G-CSF和抗体的处理在细胞接种之后再继续1天。在细胞接种后36小时对小鼠处以安乐死，给肺灌注PBS，收获并在低聚甲醛中固定。将经固定的肺包埋入O.C.T.化合物(Tissue-Tek，Torrance，CA)，冷冻并生成5μm切片。将切片用DAPI复染色，并用ProLong Gold封固介质(Invitrogen，Carlsbad，CA)安装盖玻片。获取图像，并对荧光标记细胞手动计数。平均而言，每个组使用3只小鼠，而且分析包括15幅图像(5张随机切片每只小鼠)。最终的值呈现为每个视野的平均细胞数。
组织学分析(H&E)。经福尔马林固定的组织脱水，并在石蜡中包埋。将5-μm厚切片脱蜡，再水化，并用苏木精和曙红染色，遵循标准方案进行。
Bv8免疫组织化学(IHC)。如先前所述实施Bv8 IHC(Shojaei，F.et al.ProcNatl Acad Sci USA(2009))。简言之，自经PBS灌注的携带67NR或4T1肿瘤的小鼠收获转移前肺，并在中性缓冲的福尔马林中固定。将5-μm厚的石蜡包埋切片脱蜡，并再水化。在高压锅(Biocare Medical，Concord，CA)中使用通用Decloaker缓冲液(Biocare Medical，Concord，CA)修复抗原后，将切片用过氧化物酶封闭试剂(DAKO，Glostrup，Denmark)封闭5分钟，接着用蛋白质封闭溶液(DAKO，Glostrup，Denmark)封闭30分钟。然后将切片与仓鼠抗mBv8 mAb2D3(Genentech，South San Francisco，CA)一起或与仓鼠IgG1(BDPharmingen，San Jose，CA)一起(10μg/mL)于室温温育1小时。接着，将样品用生物素化山羊抗仓鼠抗体(Jackson Immuno Research，West Grove，PA)于室温染色30分钟，接着与Vectastain ABC Elite reagents(Vector Laboratories，Burlingame，CA)一起温育。然后将样品与过氧化物酶底物溶液(金属增强的DAB；Pierce Chemical，Rockford，IL)一起温育，直至显色达到期望的强度。最后，将切片用苏木精可见光复染色，再水化，并安装盖玻片。
ELISA。使用经EDTA处理的管收集血浆。给小鼠灌注PBS，并收集小份肺、脾、肿瘤、肾、和骨髓组织，并立即在液氮中冷冻。随后将组织在RIPA缓冲液中裂解，并通过Bradford法依照制造商的方案(Pierce)测量总蛋白质含量。通过ELISA测量血浆和组织裂解物中Bv8蛋白的水平，如描述的那样(Shojaei，F.et al.Nature 450，825-831(2007)；Shojaei，F.et al.Proc Natl AcadSci USA(2009))。通过物种特异性ELISA试剂盒(R&D System，Minneapolis，MN)测量G-CSF、GM-CSF、M-CSF、SDF1α、PlGF、VEGF和MMP9的水平。所有值相对于总蛋白质含量标准化。
流式细胞术(FACS)。给小鼠灌注PBS。收集肺、脾、肿瘤、肾和骨髓组织，切碎成小份，并过滤以生成单细胞悬浮液。为了数项实验，将肿瘤和肺组织碎片用胶原酶和分散酶的混合物(Roche)酶促消化，接着使用16号针头tituration机械解离。红血球使用ACK裂解缓冲液(Lonza，Basel，Switzerland)裂解。将细胞与大鼠抗小鼠CD16/CD32mAb(BD Biosciences，San Jose，CA)一起温育以防止非特异性抗体结合，之后用下述偶联有荧光团的抗体染色：抗cd45(30-F11)，抗cd11b(M1/70)，抗F4/80(BM8)，抗cd11c(N418)，抗cd117(2B8)(都来自eBiosciences，San Diego，CA)，抗Ly6G(1A8)，抗Ly6C(AL-21)，抗Gr1(RB6-8C5)，抗SiglecF(E50-2440)(都来自BD Biosciences，San Jose，CA)，和抗Flt-1(141522)(R&D Systems，Minneapolis，MN)。使用碘化丙啶(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)来区分活的和死的细胞。使用FACSCalibur或BD LSR II仪器(BD Biosciences，San Jose，CA)获取数据，并使用FlowJo软件(Tree Star，shland，OR)或BD FACSDiva程序分析。
CD11b+Gr1+细胞的分拣。将肺准备好，并用Cd11b-APC和Gr1-FITC抗体染色，如流式细胞术小节所述。在FACS仪器上分拣期望细胞，确认它们的纯度，并立即分离RNA，如RNA分离小节所述。平均而言，分拣群的纯度为99％。
p-ERK免疫印迹。以10,000个每100μl 10％FCS/IMDM的密度接种细胞。24小时后，将培养基更换成无血清的IMDM，并将细胞饥饿24小时。将细胞用5ng/ml 人Bv8(Peprotech，Rocky Hill，NJ)刺激5、10、15、和20分钟，立即裂解，并在Tris-甘氨酸SDS样品缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA)中煮沸。将等体积的裂解物进行SDS-PAGE电泳，并用特异性抗体(Cell SignalingTechnology，Danvers，MA)对磷酸化的或总的p44/p42 MAP激酶(ERK1和ERK2)免疫印迹。
Micro-CT分析。肺制备、成像和分析先前有详细描述(Caunt，M.et al.Cancer Cell 13，331-342(2008))。简言之，用5％异氟烷麻醉来麻醉小鼠。暴露心和肺，并取出左和右心房。将一钝的24号针头插入右心室，并灌注10mlPBS以自肺脉管系统清除血液。剥离肺，并用10％中性缓冲的福尔马林(NBF)膨胀。将肺在10％NBF中浸泡24小时，然后在基于碘的x射线计算机断层摄影术对比剂Isovue370(Bracco Diagnostics Inc，Princeton，NJ)用PBS稀释的20％溶液中浸泡24小时。然后经气管给肺灌注20ml大豆油(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)以清除过量的对比剂。在大豆油(用于为成像提供背景介质)中对肺成像。
将小鼠肺用μCT 40(SCANCO Medical，Basserdorf，Switzerland)x射线微型计算机断层摄影术(micro-CT)系统离体成像。通过以能级45kV、电流177μA和积分时间450毫秒操作x射线管来生成micro-CT图像。以各向同性分辨率20μm获得轴图像。通过半自动图像分析算法(其包括由经过训练的读者进行的检查步骤)来获得肺肿瘤估值(数目和体积)。通过一系列图像加工步骤来提取潜在肿瘤块(Caunt，M.et al.Cancer Cell 13，331-342(2008))。图像分析软件以C++编码，并采用Analyze(AnalyzeDirect Inc.，Lenexa，KS，USA)图像分析软件库。然后由经过训练的读者用Analyze 3D显现软件评估提取对象。基于对象的外观和它在肺内的定位，接受或否决各对象为可能的肿瘤。为每个肺测定肿瘤计数、各肿瘤体积和总肿瘤体积。
生物发光成像(BLI)。给小鼠腹膜内注射200μL 200mg/ml D-萤光素(Invitrogen，Carlsbad，CA)，在成像期间经鼻锥用异氟烷(Henry Schein，Sparks，NV)麻醉，并使用加热垫维持体温。使用固定至不透光成像室的冷却强化电荷耦合器件相机(Stanford Photonics，Palo Alto，CA)获取生物发光图像。图像获取时间通常不到5分钟。通过与生物发光数据图像一起共寄存参照图像来加工图像。
公开微阵列数据集的分析。自http://waldman.ucsf.edu/bladder/blaveri.cgh/下载Blaveri膀胱癌数据集(Blaveri，E.et al.Clin Cancer Res 11，7012-7022(2005))。自caArray(http://caarrav.nci.nih.gov/)下载Chin乳腺癌数据集(Chin，K.et al.Cancer Cell 10，529-541(2006))，并自Gene Expression Omnibus(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/GSE1456)下载Pawitan乳腺癌数据(Pawitan，Y.et al.Breast Cancer Res 7，R953-964(2005))。在存活分析采用两种方法：1)Cox比例风险模型用于评估G-CSF基因表达(作为连续变量)与存活结果的关联的显著性，2)在每个数据集内，通过使用时序检验测试G-CSF基因表达值的一系列分位数截留来选择G-CSF基因表达的最佳阈值。然后基于鉴定的最佳截留为两个亚组绘制Kaplan-Meier存活曲线，并然后使用Cox模型来估算两个组之间的风险比。
统计分析。除非另有说明，Student氏t检验用于所有统计分析，而且p值≤0.05认定为显著。图呈现均值±SEM。所有实验重复至少两次，并呈现代表性数据。对于胎肝移植物实验中肿瘤研究的分析，将一具有Poisson误差和分布的一般化线性模型拟合至数据。
结果和讨论
转移是实体瘤所致死亡的一个主要原因。为了转移，肿瘤细胞需要降解和侵入细胞外基质，进入血管，由血液或淋巴管携带，在继发性部位溢出血管，并最终建立继发性肿瘤(Nguyen，D.X.&Massague，J.Nat Rev Genet 8，341-352(2007))。另外，制片证据提示肿瘤能够在转移性肿瘤细胞到达之前改变远端微环境以创建所谓的“转移前生态位(premetastatic niche)”(Psaila，B.&Lyden，D.Nat Rev Cancer 9，285-293(2009))。肿瘤影响远端组织的这种能力使得癌细胞能够靶向特定器官，在那里它们能启动继发性肿瘤生长和支持“种子和土壤”假说(Paget，S.Cancer Metastasis Rev.8(2)，98-101(1989))。认为骨髓衍生细胞(BMDC)是居于生态位的一种主要细胞类型(Kaplan，R.N.etal.Nature 438，820-827(2005)；Hiratsuka，S.et al.Nat Cell Biol 8，1369-1375(2006))。
虽然已经研究数种分子(Kaplan，R.N.et al.Nature 438，820-827(2005)；Hiratsuka，S.et al.Nat Cell Biol 8，1369-1375(2006)；Yamamoto，M.et al.Cancer Res 68，9754-9762(2008)；Kim，S.et al.Nature 457，102-106(2009)；Erler，J.T.et al.Cancer Cell 15，35-44(2009))，但是对肿瘤启动生态位的机制和生态位在转移中的精确作用的了解还不完全。为了表征由远端部位的原发性肿瘤触发的变化，我们对来自没有任何肿瘤的小鼠(未处理)和携带非转移性(67NR)或转移前期的转移性(4T1)乳腺癌的小鼠的总肺组织实施了cDNA微阵列分析(图1A)。作为模型，我们使用小鼠乳腺癌的4T1相关细胞系(Dexter，D.L.et al.Cancer Res 38，3174-3181(1978)；Aslakson，C.J.&Miller，F.R.Cancer Res 52，1399-1405(1992))，它提供范围为从非转移性细胞(67NR，168FARN)至能够完成所有转移步骤的细胞(4TO7，66c14和4T1)的表型谱(图5A)。最近，对这些细胞系的分析能够鉴定调节转移的新基因(Yang，J.et al.Cell 117，927-939(2004))。为了确保我们检查的组织真正是转移前的，将表达萤光素酶-zsGreen和潮霉素的4T1细胞(4T1-Luc-zsG-Hyg细胞)同位接种入第4乳房脂肪垫，并在6天后收获肺。此时我们未能在肺中检测到任何4T1-Luc-zsG-Hyg癌细胞，如通过检测潮霉素的qRT-PCR评估的(图5B和图10)。另外，生物发光成像未能在处于此阶段的肺中检测到任何萤光素酶阳性4T1细胞(图5C)。如此，我们在我们的基因表达分析中检测到的任何信号不是癌细胞引起的。
在这些研究中，肿瘤发生但肺中没有任何可检测到的癌细胞的时段会称作转移前期，而我们能检测到肺中的甚至单一癌细胞或肿瘤的阶段会称作转移期。
我们的分析鉴定出相对于来自未处理或携带非转移性67NR肿瘤的小鼠的肺，在来自携带4T1肿瘤的小鼠的肺中特异性上调超过2倍的260种基因和下调超过2倍的274种基因(图1A)。我们聚焦于Bv8，因为它是居前的上调基因之一(图1B)。Bv8是先前表征为促血管发生因子(LeCouter，J.et al.ProcNatl Acad Sci USA 100，2685-2690(2003))、造血祖细胞的生长因子(LeCouter，J.et al.Proc Natl Acad Sci USA 101，16813-16818(2004))、及神经调质(Cheng，M.Y.et al.Nature 417，405-410(2002)；Matsumoto，S.et al.Proc Natl Acad SciUSA 103，4140-4145(2006))的分泌蛋白。还有，Bv8最近显示出由CD11b+Gr1+髓样细胞表达且介导抗VEGF抗性肿瘤的生长(Shojaei，F.et al.Nature 450，825-831(2007))。对肺组织中Bv8表达的qRT-PCR分析确认了微阵列结果(图5D)。此外，我们第一个发现了转移前肺中的高Bv8表达和所检查的肿瘤的转移潜力之间的关联(图1C和图5E)。Bv8显示出由CD11b+Gr1+髓样细胞高度表达(Shojaei，F.et al.Nature 450，825-831(2007))，因此我们假设转移性肿瘤能够经由自骨髓动员CD11b+Gr1+细胞和随后在肺中归巢来改变肺微环境。为了检验这种假说，我们测量了转移前期期间浸润肺组织的CD11b+Gr1+细胞的频率(图1D)。我们观察到携带转移性肿瘤4TO7、66c14和4T1的小鼠中这些细胞的数目增多，而来自携带非转移性肿瘤67NR和168FARN的小鼠的肺没有显示任何CD11b+Gr1+细胞增多(图1D)。另外，自携带4T1肿瘤的小鼠的肺分离的CD11b+Gr1+细胞强烈表达Bv8(图5F)。然而，我们在Cd11b+Gr1-细胞中只能检测到微量水平的Bv8转录物，而在自没有肿瘤的小鼠分离的CD11b+Gr1+细胞中基本上检测不到转录物，提示原发性肿瘤分泌上调CD11b+Gr1+细胞中Bv8的因子(图5F)。另外，我们用抗Bv8抗体染色肺组织，而且我们只能在自携带能转移的肿瘤的小鼠分离的肺中检测到Bv8阳性细胞(图5G)。我们还在携带别的转移性肿瘤，诸如B16F10、LLC和乳腺癌的一种遗传模型，即MMTV-PyMT的小鼠的转移前肺中检测到升高的CD11b+Gr1+细胞频率(图5H)。类似地，我们在来自这些小鼠的肺中检测到升高的Bv8表达(图5I)。如此，表达Bv8的CD11b+Gr1+细胞表现为转移前微环境的一种主要成分。为了进一步定义此类微环境的组成，我们实施了FACS分析来表征CD11b+Gr1+细胞和鉴定转移前肺中别的细胞类型(图11A)。此类分析揭示了携带4T1肿瘤的小鼠的转移前肺中Ly6C+Ly6G+粒细胞的特异性积累和Ly6C+Ly6G-单核细胞的适度积累(图11A)。我们未能观察到巨噬细胞(F4/80+细胞)、嗜曙红细胞(SiglecF+细胞)或树突细胞频率响应原发性肿瘤的任何显著变化(见例如图11A)。还有，我们未能在未处理或荷瘤小鼠的肺中检测到任何肥大细胞。此外，我们检测到先前描述的VEGFR1+CD117+造血组细胞的存在(Kaplan，RN et al.，Nature 438，820(2005))，尽管它们的频率比Ly6G+Ly6C+细胞低得多(HPC的2.7％对Ly6G+Ly6C+细胞的27％)(图11A)。我们得出结论，转移性肿瘤诱导粒细胞(定义为Ly6C+Ly6G+细胞，在Cd45+Cd11b+群中)的特异性积累和单核细胞(Ly6C+Ly6G-细胞)的适度积累(图11A)。
为了确定由肿瘤细胞分泌的哪种/哪些细胞因子可能负责启动生态位，我们测量了未处理或荷瘤小鼠中数种候选物的血浆水平，即血管内皮生长因子(VEGF)-A、胎盘生长因子(PlGF)、基质衍生因子(SDF)1α、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞(GM)-CSF、粒细胞(G)-CSF和Bv8(图2A)。令人惊讶的是，只有G-CSF和Bv8血浆水平与肿瘤转移的能力有关。在转移期间找到了相似的关联。我们发现G-CSF在携带MMTV-PyMT肿瘤的小鼠的血浆中也高度表达。有趣的是，在携带MDA-MB-231肿瘤的小鼠中，对于人和小鼠G-CSF二者，我们检测到升高的肿瘤和血浆水平，提示浸润肿瘤的宿主细胞也是G-CSF的重要来源(图13F)。G-CSF是粒细胞生成的一种主要调节物，由多种细胞类型生成(Metcalf，D.Nature 339，27-30(1989))，在自骨髓动员嗜中性细胞中发挥关键作用(Christopher，M.J.&Link，D.C.Curr OpinHematol 14，3-8(2007))，而且最近显示出介导肿瘤对抗VEGF疗法的不应性(Shojaei，F.et al.106(16)，6742-6747 Proc Natl Acad Sci USA(2009))。G-CSF作为远离肿瘤起源的过程，诸如转移前生态位发生的潜在调节物的另一个诱人特征是它内分泌作用模式(Metcalf，D.Nature 339，27-30(1989))。我们发现G-CSF在体外(图6A和图11B)及在体内由转移性而不是由非转移性肿瘤细胞释放。还有，用抗G-CSF抗体处理携带4T1的小鼠阻止CD11b+Gr1+细胞动员和归巢入肺(图2B)，而且还降低肺和血浆中的Bv8水平(图6B)。这些数据提示G-CSF是由转移性肿瘤分泌的一种主要细胞因子，用于启动富含CD11b+Gr1+细胞的转移前微环境。抗Bv8抗体处理在携带4T1肿瘤的小鼠中降低CD11b+Gr1+细胞动员入转移前肺(图2B)，尽管这在转移期(接种肿瘤细胞后5.5周)期间没有任何显著影响。另外，用抗G-CSF抗体处理携带MMTV-PyMT肿瘤的小鼠阻止Ly6G+Ly6C+细胞动员入外周血和这些细胞归巢入肺(图11C)。肿瘤发生晚期对抗Bv8处理的响应的缺失可能是由于很高量的由原发性肿瘤释放的G-CSF(图6C)。
为了研究G-CSF和Bv8在转移肿瘤进展中的意义，我们将66c14或4T1肿瘤细胞同位接种入Balb/c或CB6F1小鼠的第4乳房脂肪垫，并用抗Bv8、抗G-CSF或这两种(组合)抗体处理它们。处理在接种肿瘤细胞后2天启动，并在肿瘤细胞接种后6(对于66c14模型)或5.5(对于4T1模型)周评估转移肺结节数目。虽然我们未能在这些肿瘤模型中检测到原发性肿瘤生长的任何显著变化(图6D和6E)，但是我们在用抗Bv8或抗G-CSF抗体处理的小鼠中观察到肺肿瘤数目的显著减少。在携带4T1肿瘤的小鼠中，与相应同种型对照抗体组相比，抗Bv8抗体将可见肿瘤的数目减少50％，抗G-CSF减少65％，而所述组合减少75％(图2C)。在携带66c14肿瘤的小鼠中，抗Bv8抗体处理将肺肿瘤数目减少30％，而抗G-CSF减少43％(图6F)。在使用micro-CT分析来定量来自用抗Bv8抗体处理的携带66c14或4T1肿瘤的小鼠的肺中微观和宏观肿瘤的详细数目时获得了相似的结果(图2D)。重要的是，在BMMNC中缺失Bv8的小鼠中接种肿瘤时，4T1或66c14同位肿瘤的转移降低至与抗Bv8处理可比的水平(图13A，13B和13C)。随后，我们分析了抗Bv8抗体和抗G-CSF抗体在其它乳腺癌模型，即人MDA-MB-231(图12A)和小鼠MMTV-PyMT(图13D)中的功效。在这两种模型中，抗Bv8抗体或抗G-CSF抗体处理导致肺转移降低(图12B和13E)。
为了直接评估CD11b+Gr1+细胞在转移发生中的作用，用抗Gr1抗体(克隆RB6-8C5，其消减单核细胞和嗜中性细胞二者)或抗Ly6G抗体(克隆1A8，其特异性消减嗜中性细胞(Daley，JM et al.，J Leukoc Biol 83，64(2008))处理携带同位66c14肿瘤的小鼠(图12C)。每种抗体的处理显著减少肺转移数目至与抗Bv8抗体或抗G-CSF抗体可比的程度。然而，抗Gr1抗体导致与抗Ly6G处理相比略微更加显著的对转移的抑制，指示虽然主要是Ly6G+Ly6C+嗜中性细胞负责测试模型中的转移，但是单核细胞也有可能对此过程有贡献。
我们试图直接测试G-CSF正调节转移的假说。首先，我们提出G-CSF施用是否足以启动转移前生态位。我们分析了连续5天每天用重组G-CSF(rG-CSF)处理的小鼠中CD11b+Gr1+细胞的频率(图3A)。rG-CSF投递诱导CD11b+Gr1+细胞动员，因为我们检测到BM、外周血和脾中这些细胞显著增多。值得注意的是，我们检测到肺中CD11b+Gr1+细胞的频率显著升高(图3A)，而且接着是升高的Bv8表达(图3B)。另外，我们观察到肝中升高的CD11b+Gr1+细胞频率和增强的Bv8表达，肝是作为测试肿瘤的转移靶的另一种器官。我们在通常不是转移靶向的组织(诸如肾)中没有检测到升高的Bv8表达(图3B)。为了确定这些效果是否导致增强的转移潜力，经由尾静脉在注射肿瘤细胞之前和之后连续5天用rG-CSF处理小鼠。这使得我们能够聚焦于G-CSF和G-CSF启动的转移前生态位在转移的最后阶段，诸如远端器官处的溢出、存活和肿瘤生长时的潜在作用。我们给小鼠注射非转移性肿瘤细胞系67NR或多种攻击性细胞系，即66c14、4T1、和B16F10。用rG-CSF处理的小鼠展现出肺肿瘤数目的显著增多(图3C和3D)。接着是与可见肿瘤数目对应的肺块的显著增多(图7A)。值得注意的是，一旦小鼠经过G-CSF预处理，非转移性细胞系67NR在肺中展现出转移行为(图3E)。经G-CSF预处理的小鼠中肿瘤的真实性通过H&E染色切片的组织学分析得到了进一步确认(图7B)。
为了定义Bv8在由G-CSF诱导的转移前生态位中的作用，用rG-CSF和抗Bv8抗体处理小鼠。抗Bv8抗体处理显著降低肺中CD11b+Gr1+细胞数目的增多(图7C)。此外，抗Gr1抗体完全消除G-CSF对CD11b+Gr1+细胞的影响。类似地，抗G-CSF抗体处理完全阻止G-CSF效果(图7C)。随后，为了进一步调查Bv8在由G-CSF驱动的转移中的作用，我们在抗Bv8抗体存在或缺失下将66c14或4T1细胞经由尾静脉注射入经预G-CSF处理的小鼠。抗Bv8抗体处理显著降低由G-CSF诱导的66c14(图3F)、4T1(图7D)和MDA-MB-231(图14A)肺转移。抗Gr1抗体或抗Ly6G抗体处理也显著抑制G-CSF效果(图14B，图3F和图7D)，指示主要是嗜中性细胞负责由G-CSF诱导的转移前引发和转移。我们还测试了抗VEGF抗体是否能阻止由G-CSF诱导的转移。与抗Bv8处理相反，抗VEGF疗法未能阻止G-CSF效果(图7E)，提示由G-CSF促进的肺转移是不依赖VEGF的。值得注意地，我们未能在抗VEGF抗体存在下检测到转移性肿瘤负担的任何升高，正如最近在使用其它抗血管发生疗法时报告的(Paez-Ribes，M.et al.Cancer Cell 15，220-231(2009)；Ebos，J.M.et al.Cancer Cell 15，232-239(2009))。
我们在VEGF受体(VEGFR)-1表达方面进一步表征响应G-CSF在肺中归巢的髓样细胞群，因为先前报告此受体由转移前生态位内的造血细胞表达(Kaplan，R.N.et al.Nature 438，820-827(2005))。在rG-CSF注射之后，我们检测到肺中CD11b+Gr1+VEGFR1+细胞频率的显著升高(图7F)，与CD11b+Gr1+细胞频率的升高(图7G)匹配。更详细的分析揭示了约44％百分比的CD11b+Gr1+细胞是VEGFR1+(图7H)。然而，此数值不受rG-CSF施用显著影响(图7H)。如此，我们的结果显示了由G-CSF诱导的转移前生态位中的CD11b+Gr1+细胞部分共享先前报告启动生态位的细胞的特征(Kaplan，R.N.et al.Nature 438，820-827(2005))。
微阵列分析显示了在Bv8之外，转移前肺富含多种先前显示出促进转移的因子，诸如MMP-9(Hiratsuka，S.et al.Cancer Cell 2，289-300(2002)；Acuff，H.B.et al.Cancer Res 66，259-266(2006))、S100A8和S100A9(Hiratsuka，S.etal.Nat Cell Biol 8，1369-1375(2006))(图1B)。虽然MMP-9显示出促进肺环境中肿瘤细胞的侵入(Hiratsuka，S.et al.Cancer Cell 2，289-300(2002))和存活(Acuff，H.B.et al.Cancer Res 66，259-266(2006))，S100A8和S100A9显示出介导肺中髓样和肿瘤细胞的募集(Hiratsuka，S.et al.Nat Cell Biol 8，1369-1375(2006))。为了调查G-CSF/Bv8轴是否可能至少部分经由调节那些分子来执行它的促转移效应，我们测量了经rG-CSF处理的小鼠的肺中它们的表达水平。我们发现了所有三种分子显著上调(图8A)。抗Bv8抗体处理显著降低由G-CSF诱导的MMP-9、S100A8和S100A9表达(图8A)。这与经抗Bv8处理的小鼠的肺中降低的CD11b+Gr1+细胞频率有关(图7C)。再次，与同位接种肿瘤的实验相似，仅在用低剂量的rG-CSF处理小鼠时检测到抗Bv8抗体效果(图7C)，但是在注射最大剂量的rG-CSF时没有检测到。自暴露于G-CSF的肺分拣的CD11b+Gr1+细胞表达显著水平的MMP-9、S100A8和S100A9，以及Bv8(图8B)。在同位接种4T1细胞并用抗Bv8或抗G-CSF抗体处理的小鼠中获得了相似的结果(图2C)。转移前肺中的MMP--9表达通过抗Bv8抗体处理而显著降低(图8C)，而抗G-CSF抗体处理也降低转移肺中的MMP-9表达(图8C)。降低的MMP-9表达与肺中降低的CD11b+Gr1+细胞频率有关(图2B)。如此，转移前微环境的发生中，我们的数据将G-CSF定位于Bv8、MMP-9、S100A8和S100A9上游。
抗Bv8抗体处理有效阻止G-CSF对肺转移发生的影响(图3F和图7D)。然而，相同处理仅部分抑制由G-CSF诱导的CD11b+Gr1+细胞动员和归巢入转移前肺(图C)。此发现提示调控CD11b+Gr1+细胞动员至肺组织只能部分解释Bv8促进转移的机制。为了确定Bv8是否通过另外的机制来调节转移，我们提出Bv8是否可能对肿瘤细胞具有直接影响。我们测量了非转移性和转移性肿瘤细胞二者中Bv8受体(PKR-1/GPR73和PKR-2/GPR73L1)的表达水平。我们能检测到转移性肿瘤细胞系(4TO7、66c14、4T1以及B16F10和LLC)中显著的PKR-1表达，而非转移性细胞系(67NR和168FARN)展现水平低得多或检测不到的PKR-1(图4A)。我们在所测试的任何细胞系中没能检测到PKR-2，LLC除外(图4A)。为了确定PKR-1是否是功能性的，我们用Bv8刺激肿瘤细胞，然后我们测量磷酸化ERK1/2的水平(图8D)。我们仅能在转移性细胞系中检测到响应Bv8显著的ERK1/2活化，提示这些细胞中的Bv8信号传导确实是功能性的(图8D)。Bv8显示出促进髓样细胞迁移(Chin，K.et al.Cancer Cell10，529-541(2006))。因此，我们检查了Bv8可能也促进转移性肿瘤细胞迁移的可能性。确实，我们检测到响应提高Bv8浓度而升高的转移(图4B)。相反，非转移性细胞系没有显示响应Bv8任何增强的迁移。因此，在调节CD11b+Gr1+细胞动员和归巢入转移前生态位之外，Bv8可经由其对肿瘤细胞的直接影响来调节转移。最后，为了确认由G-CSF诱导的转移前生态位在体内推动肿瘤细胞迁移，我们在抗Bv8、抗Gr1或抗G-CSF抗体存在或缺失下将用CellTracker Green荧光标记(为了能够容易地在体内跟踪注射的细胞)的4T1或66c14细胞注射入经G-CSF预处理的Balb/c Nude小鼠。36小时后，我们评估能够溢出并接种肺组织的肿瘤细胞的数目。我们检测到与对照相比经G-CSF预处理的小鼠的肺中肿瘤细胞数目的显著增多(图4C和4D，和图8E)。此效果通过施用抗Bv8抗体而显著降低。在用抗Gr1抗体或抗G-CSF抗体处理小鼠时获得相似的结果(图4C和4D，和图8E)。
67NR细胞在经由经G-CSF预处理的小鼠的尾静脉注射时展现转移特性(图3E)，可能是由于经G-CSF引发的肺中实质性升高的MMP9和其它促转移分子表达。我们推测67NR细胞的转移可能因PKR-1过表达得到增强。确实，67NR细胞中PKR-1过表达至与66c14细胞可比的水平(图16A)，导致经G-CSF预处理的小鼠中67NR转移显著增强(图15A)。相反，PKR-1缺陷66c14细胞(图16B)具有与表达对照shRNA的细胞相比显著减少的由G-CSF诱导的转移数目(图16C)。如此，Bv8可以在体内作为肿瘤细胞的化学引诱物起作用，并促进它们溢出入转移前肺。
为了确定在肺中建群的肿瘤细胞中G-CSF或PKR-1的表达是否维持在较高水平，实施了驻留在原发性肿瘤或能够在肺中生成转移的MDA-MB-231细胞的体内克隆选择(图15C)。一种相似的方法先前用于鉴定介导乳腺癌转移至肺(Minn，AJ et al，Nature 436，518(2005))和其它器官(Bos，PD et al，Nature 459，1005(2009)；Lu，X et al，Genes Dev 23，1882(2009))的基因集。基因表达谱测定揭示了自肺分离的MDA-MB-231细胞表达与自原发性肿瘤分离的细胞或亲本细胞相比水平高得多的G-CSF和PKR-1二者以及GM-CSF、MMP-9和先前鉴定的Cxcl1和MMP-1(Minn，AJ et al，Nature 436，518(2005))(图15B)。重要的是，没有检测到PKR-2、M-CSF、SDF1α、VEGF-A或PlGF表达的升高，提示为了转移，癌细胞选择性提高一小组基因的表达，包括G-CSF和PKR-1。
我们检查了公众可得的数据集以鉴定原发性肿瘤中的G-CSF表达和疾病结果之间的潜在关联。我们分析了三个微阵列数据集：两个来自乳腺癌(Pawitan乳腺癌和Chin乳腺癌数据集(Pawitan，Y.et al.Breast Cancer Res 7，R953-964(2005)；Chin，K.et al.Cancer Cell 10，529-541(2006)))和一个来自膀胱癌患者(Blaveri膀胱癌数据集(Blaveri，E.et al.Clin Cancer Res 11，7012-7022(2005)))。我们鉴定出乳腺癌患者的存活和高G-CSF表达之间的强负关联(图4E和图9A)。我们在膀胱癌患者中鉴定出相似关联(图9B)。详细的统计分析显示于图9C。
CD11b+Gr1+和其它髓样细胞类型在多项研究中显示出在小鼠模型中推动肿瘤生长(Yang，L.et al.Cancer Cell 6，409-421(2004)；Shojaei，F.et al.NatBiotechnol 25，911-920(2007)；De Palma，M.et al.Trends Immunol 28，519-524(2007)；Murdoch，C.et al.Nat Rev Cancer 8，618-631(2008))。重要的是，已经发现它们的人对应物在癌症患者中也过生成(Almand，B.et al.J Immunol 166，678-689(2001)；Young，M.R.&Lathers，D.M.Int J Immunopharmacol 21，241-252(1999))。最近，CD11b+Gr1+细胞显示出经由升高的MMP和TGF-β1生成促进原发性肿瘤部位的侵入和转移(Yang，L.et al.Cancer Cell 13，23-35(2008))。
本文中的数据提示CD11b+Gr1+细胞在转移中的作用不限于原发性肿瘤，而且我们第一个显示了这些细胞在转移前肺中富集以创建支持转移的最终步骤，诸如继发性肿瘤的溢出、存活和生长的微环境(图4F)。肿瘤分泌的G-CSF自BM动员CD11b+Gr1+细胞，而且还诱导Bv8表达。Bv8继而作为BM衍生CD11b+Gr1+细胞的化学引诱物起作用，并在肿瘤细胞到达之前推动它们归巢入肺。一旦在肺中，CD11b+Gr1+细胞充当Bv8、MMP-9和S100A8和S100A9的来源。通过促进侵入或进一步动员BMDC至肺，这些分子能进一步推动转移(Hiratsuka，S.et al.Cancer Cell 2，289-300(2002)；Acuff，H.B.et al.Cancer Res 66，259-266(2006)；Yang，L.et al.Cancer Cell 6，409-421(2004))。我们还在经G-CSF预处理的小鼠的肝中检测到升高的Bv8表达，提示G-CSF和Bv8的促转移效果可能不限于肺，而且还存在于其它器官中。
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尽管已经参照所谓的具体实施方案描述了本发明，但是应当理解，本发明不限于此类实施方案。与之相反，本发明意图覆盖所附权利要求的精神和范围内所包括的各种修改形式和等同形式。
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Claims (19)

1.一种抑制或降低肿瘤转移的方法，包括对受试者施用有效量的G-CSF拮抗剂。
2.权利要求1的方法，其中所述G-CSF拮抗剂抑制或降低原发性肿瘤扩散至所述受试者的转移前器官。
3.权利要求1的方法，其中降低肿瘤转移包括缩小肺转移的大小或减少肺转移的数目。
4.权利要求1的方法，其中抑制或降低肿瘤转移包括降低所述受试者的转移前器官中Bv8、PKR1、MMP-9、S100A8或S100A9中一种或多种的表达水平。
5.权利要求4的方法，其中抑制或降低肿瘤转移包括降低所述受试者的转移前器官中MMP-9、S100A8和S100A9的表达水平。
6.权利要求1的方法，其中抑制或降低肿瘤转移包括降低所述受试者的转移前器官中G-CSF和PKR1的表达水平。
7.权利要求1的方法，进一步包括对所述受试者施用有效量的Bv8拮抗剂。
8.权利要求1的方法，进一步包括对所述受试者施用有效量的VEGF拮抗剂。
9.权利要求1的方法，其中所述受试者先前已经用VEGF拮抗剂治疗过。
10.权利要求8或9的方法，其中所述VEGF拮抗剂是抗VEGF抗体或其片段。
11.权利要求10的方法，其中所述抗VEGF抗体是贝伐单抗(bevacizumab)或其片段。
12.一种降低转移前器官中G-CSF、Bv8、PKR1、MMP-9、S100A8或S100A9中一种或多种的表达水平的方法，包括对受试者施用有效量的G-CSF拮抗剂或Bv8拮抗剂。
13.权利要求12的方法，其中所述转移前器官中MMP-9、S100A8和S100A9的表达水平降低。
14.一种抑制转移性肿瘤细胞或嗜中性细胞迁移至转移前器官的方法，包括对受试者施用有效量的G-CSF拮抗剂或Bv8拮抗剂。
15.权利要求2、4、6、12或14的方法，其中所述转移前器官是肺或肝。
16.权利要求1、12或14的方法，其中所述G-CSF拮抗剂是抗G-CSF抗体或其片段。
17.权利要求7、12或14的方法，其中所述Bv8拮抗剂是抗Bv8抗体或抗PKR1抗体或其片段。
18.权利要求1、12或14的方法，进一步包括对所述受试者施用有效量的化疗剂。
19.权利要求1、12或14的方法，其中所述受试者是人。
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