CN104940922B - 一种猪瘟活疫苗的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种猪瘟活疫苗的制备方法，所述方法按以下步骤进行：a.生产用细胞的制备；b.制苗用毒液的制备；c.疫苗制备。本发明改进了猪瘟活疫苗的生产方法，提高了病毒感染率，简化了生产操作，提升了产品质量和产量，更适合于规模化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备猪瘟活疫苗的方法，属于生物医药技术领域。
背景技术
猪瘟（Classical Swine Fever，CSF）俗称“烂肠瘟”，是由猪瘟病毒引起的一种急性热性全身性败血性传染病，各种年龄猪只均可发病，病程从急性到慢性等多种多样。一年四季流行，传染性极强，具有高度发病率和死亡率，一旦发生具有毁灭性。目前使用的猪瘟病毒兔化弱毒（C株）是国际公认的最佳猪瘟病毒疫苗株，已被欧洲很多国家采用，它有效的控制了猪瘟的流行。近年来，猪瘟常有免疫失败的报道，其原因虽然很多，但疫苗的质量有很重要的影响。
猪瘟活疫苗现在采用的仍是传统的转瓶生产工艺技术，随着生物反应器在兽用疫苗行业逐步应用，许多企业也致力于开发生物反应器生产工艺技术，但是由于猪瘟病毒及制苗细胞的生物学特性，还经常出现半成品效价低、批间差异大、疫苗质量不够稳定等问题，这就限制了猪瘟活疫苗的质量与产量。因此从行业需求出发，也急需开发一种高效、快捷、稳定的猪瘟活疫苗生产方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪瘟活疫苗的制备方法，它具有产品质量批间稳定性高，产品副反应发生率低、工艺简单、成本低，适于规模化生产的特点。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种猪瘟活疫苗的制备方法，制备按以下步骤进行：
a. 生产用细胞的制备
用EDTA-胰酶细胞分散液消化已长满良好单层的猪睾丸细胞（ST），加入细胞生长液终止消化，制备细胞悬液。将猪瘟病毒毒种与细胞悬液同步接入转瓶中，补入细胞生长液进行培养，每4d收获一次毒液，收获1～3次，收获后补加细胞维持液继续培养，最后一次收获毒液后将带毒细胞消化、冻存，作为生产用细胞，备用；
所述猪瘟病毒毒种为猪瘟兔化弱毒株脾毒或猪瘟兔化弱毒株细胞毒；
b. 制苗用毒液的制备
复苏生产用细胞，接种至转瓶或生物反应器中培养。细胞长满后更换细胞维持液继续培养，每2d或4d收获换液一次，共10～15次，收获的毒液为制苗用毒液；
c. 疫苗制备
向制苗用毒液中加入冻干保护剂，分装、冻干，即得猪瘟活疫苗。
上述制备方法，所述步骤a中，在接入猪瘟病毒的同时加入聚乙二醇（PEG），所述聚乙二醇选用PEG4000和PEG6000，PEG的使用浓度为2%（m:V）。
上述制备方法，所述步骤a中，细胞冻存时二甲基亚砜（DMSO）的使用浓度为10～15%（V:V）。
上述制备方法，所述步骤b中，在收获制苗用毒液过程中，当第8～10次收获换液时，补入生产用细胞，补入量为接种量的1/5。
上述制备方法，在步骤a和步骤b中，细胞生长液为含4%（V:V）新生牛血清的低血清培养基，细胞维持液为含1%（V:V）新生牛血清的低血清培养基。
上述制备方法，在步骤a和步骤b中，所述低血清培养基为低血清DMEM培养基（DMEM/F12）或低血清MEM培养基（MD611、OPTI-MEM）。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明采用同步接毒的方法接种猪瘟病毒，且利用PEG促进胞膜融合，加快了猪瘟病毒感染制苗用细胞的速度，提高了病毒感染率，进一步提升病毒产量。
2、本发明将带毒细胞直接用于生产，省略了接种病毒步骤，简化了操作，有利于提高产品质量批间稳定性，降低生产成本，更适合规模化生产。
3、本发明在毒液收获过程中补加生产用细胞，增加了高效价毒液收获次数，提高了单批次制苗用毒液产量。
4、本发明使用低血清培养基，降低生产成本，减少产品副反应发生率。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，其中各实施例仅用于说明本发明而并非限定本发明的专利保护范围。
猪睾丸细胞（ST）购自中国兽医药品监察所；猪瘟病毒疫苗株为猪瘟病毒兔化弱毒株（C株），购自中国兽医药品监察所；猪瘟兔化弱毒株脾毒由本公司自行繁殖并保存。
实施例1
本实施例采用转瓶制备猪瘟活疫苗
细胞生长液的配方为：体积百分含量96%的MD611液，4%新生牛血清，调整pH值为7.2；
细胞维持液的配方为：体积百分含量99%的MD611液，1%新生牛血清，调整pH值为7.4；
1、生产用细胞的制备
A. 从液氮罐中取出冻存的猪睾丸细胞（ST细胞）复苏后，转至10L转瓶中培养，长满良好单层后用EDTA-胰酶分散液消化，加入细胞生长液终止消化后，按1：2～3分散制备成细胞悬液（含细胞及细胞生长液）。
B. 按照3.0g/转瓶的接毒量，称取猪瘟兔化弱毒株脾毒，去除脂肪组织后研磨，MD611液冲洗，过滤、离心取上清，制备成脾毒悬液。
C. 分别量取细胞悬液、猪瘟兔化弱毒株脾毒悬液、100ml PEG6000（质量浓度20%）接入转瓶中，补加细胞生长液至1000ml，置于37℃温室培养。 每4d收获一次，收获毒液后补加1000ml细胞维持液。
D. 第3次收获完成后，将收获的病毒液冻存，作为猪瘟兔化弱毒株细胞毒；消化带毒细胞并冻存，作为生产用细胞（标记为SC3），使用的冻存液二甲基亚砜（DMSO）使用浓度为15%（V:V）。
2、制苗用毒液的制备
A、从液氮罐中取出冻存的生产用细胞（SC3）复苏并转至10L转瓶中培养，细胞长满良好单层后将培养液更换为细胞维持液继续培养。收获制苗用毒液，每4d收获换液一次，在第10次收获换液时，补入生产用细胞（SC3），补入量为接种量的1/5，继续培养，收获至第15次。收获的病毒液作为制苗用毒液，-20℃保存备用。
B. 制苗用毒液效力检验
用标准的兔体定型热反应法测定制苗用毒液效价，15批次收获病毒液效价均≥0.4×106RID/ml。（如表1）
表1 15批次收获病毒液的效价（RID/ml）
3、疫苗制备
将检验合格的病毒培养液，加入同等体积的5%蔗糖脱脂乳稳定剂，充分摇匀，定量分装，每头份含细胞毒液不少于0.015mL，冻干制备疫苗。
4、安全检验
参照《中华人民共和国兽用生物制品规程》 二○○○年版操作，用猪做安检，免疫后，断奶猪体温、精神、食欲与注苗前无明显变化，安检合格。
5、疫苗效力检验
用家兔效检，用无菌生理盐水将每头份疫苗稀释7500倍，耳静脉注射家兔2只，每只1ml，家兔接种后测温观察，根据家兔定型热反应标准进行判定，效检合格。
实施例2
本实施例应用生物反应器制备猪瘟活疫苗。
所用生物反应器为AP20C型激流灌注式生物反应器，购自杭州安普生物工程有限公司，其理论有效培养体积为10L。
细胞生长液采用体积百分含量为96%的DMEM/F12液，4%新生牛血清，调整pH值为7.2；
细胞维持液采用体积百分含量为99%的DMEM/F12液，1%新生牛血清，调整pH值为7.4。
1、生产用细胞的制备
生产用细胞的制备步骤同实施例1，但接种的是猪瘟兔化弱毒株细胞毒，第2次收获完成后，将收获的病毒液冻存，作为猪瘟兔化弱毒株细胞毒种冻存待用；消化带毒细胞并冻存，作为生产用细胞（标记为CC2）。
2、制苗用毒液的制备
A、从液氮罐中取出冻存的生产用细胞（CC2）复苏并转至10L转瓶中培养，细胞长成良好单层后，消化5个转瓶细胞，接种至AP20C型激流灌注式生物反应器中培养。
设置设备参数如下：T1：36℃、T2：39℃、T3：35℃，pH：7.3，DO：50-70%，震荡速度30rpm，液体循环速度500ml /min，空气流量400ml/min，启动培养程序开始培养。（T1为激流罐内液体温度，T2为激流罐加热膜的温度，T3为灌注袋外环境温度，pH为激流罐内液体pH值，DO为激流罐内液体溶氧率，振荡速度为激流罐的振荡速度，空气流量为激流罐内空气流通量）。
每12h取样检测残糖量，细胞接种后第3日（72h）单日耗糖量趋于平稳，确定细胞已基本长满。排空灌注袋内细胞生长液，更换为细胞维持液继续培养。每48h收获换液一次，进行第8次收获换液时，同时补入1个转瓶量的生产用细胞（CC2），继续培养，收获至第13次。收获的病毒液作为制苗用毒液，-20℃保存备用。
B. 制苗用毒液效力检验
用标准的兔体定型热反应法测定制苗用毒液效价，13批次收获病毒液效价均≥1.5×106RID/ml。（如表2）
表2 13批次收获病毒液的效价（RID/ml）
。
3、 疫苗制备
将检验合格的病毒培养液，加入同等体积的5%蔗糖脱脂乳稳定剂，充分摇匀，定量分装，，每头份含细胞毒液不少于0.015mL，冻干制备疫苗。
4、安全检验
参照《中华人民共和国兽用生物制品规程》 二○○○年版操作，用猪做安检，免疫后，断奶猪体温、精神、食欲与注苗前无明显变化，安检合格。
5、疫苗效力检验
用家兔效检，用无菌生理盐水将每头份疫苗稀释7500倍，耳静脉注射家兔2只，每只1ml，家兔接种后测温观察，根据家兔定型热反应标准进行判定，效检合格。
Claims (2)
1.一种猪瘟活疫苗的制备方法，其特征在于，制备按以下步骤进行：
a. 生产用细胞的制备
用EDTA-胰酶细胞分散液消化已长满良好单层的猪睾丸细胞，加入细胞生长液终止消化，制备细胞悬液；将猪瘟病毒毒种与细胞悬液同步接入转瓶中，补入细胞生长液进行培养，每4d收获一次毒液，收获1～3次，收获后补加细胞维持液继续培养，最后一次收获毒液后将带毒细胞消化、冻存，作为生产用细胞，备用；
所述猪瘟病毒毒种为猪瘟兔化弱毒株脾毒或猪瘟兔化弱毒株细胞毒；
b. 制苗用毒液的制备
复苏生产用细胞，接种至转瓶或生物反应器中培养；细胞长满后更换细胞维持液继续培养，每2d或4d收获换液一次，共10～15次，收获的毒液为制苗用毒液；
c. 疫苗制备
向制苗用毒液中加入冻干保护剂，分装、冻干，即得猪瘟活疫苗；
所述步骤a中，细胞冻存时二甲基亚砜DMSO的使用浓度为10～15%（V:V）；
所述步骤b中，在收获制苗用毒液过程中，当第8～10次收获换液时，补入生产用细胞，补入量为接种量的1/5；
所述步骤a中，在接入猪瘟病毒的同时加入聚乙二醇（PEG），所述聚乙二醇选用PEG4000和PEG6000，PEG的使用浓度为2%（m:m）；
在步骤a和步骤b中，细胞生长液为含4%（V:V）新生牛血清的低血清培养基，细胞维持液为含1%（V:V）新生牛血清的低血清培养基。
2.根据权利要求1所述猪瘟活疫苗的制备方法，其特征在于，在步骤a和步骤b中，所述低血清培养基为低血清DMEM培养基或低血清MEM培养基。
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