ES2335395T5 - Método mejorado para la producción a gran escala de antígenos virales - Google Patents
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Description
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METODO MEJORADO PARA LA PRODUCCION A GRAN ESCALA DE
ANTfGENOS VIRALES
La presente invencion se refiere a metodos mejorados para la produccion de antfgenos virales en un cultivo de celulas adherentes unidas a un microportador, caracterizada porque los metodos preven un aumento de la produccion por volumen del antfgeno viral en el medio de cultivo. La invencion se refiere asimismo a una biomasa de cultivo celular de celulas adherentes con una densidad celular y una concentracion de microportadores incrementada en comparacion con el cultivo celular confluente respectivo.
La produccion eficaz de vacunas requiere el desarrollo de cantidades a gran escala de virus producidos en grandes cantidades a partir de un sistema huesped. Las condiciones de cultivo en las que se desarrolla una cepa viral son muy importantes en lo que se refiere a conseguir una produccion aceptablemente alta de la cepa. Asf, con el fin de maximizar la produccion del virus deseado, tanto el sistema como las condiciones de cultivo se deben adaptar espedficamente con el fin de proporcionar un entorno que sea ventajoso para la produccion del virus deseado. Por tanto, para lograr una produccion aceptablemente elevada de las diversas cepas virales, es necesario un sistema que proporcione condiciones optimas de crecimiento para una gran cantidad de virus diferentes.
El unico proceso que es economicamente viable es un proceso en reactor, ya que la ampliacion a escala se puede adecuar al tamano del mercado y a las dosis de vacunas necesarias. En cuanto a las celulas adherentes, el proceso para preparar el soporte con un microportador clasico es actualmente la mejor eleccion para cultivos a gran escala de aquellas celulas necesarias para la propagacion viral (Van Wezel y col., 1967. Nature 216:64-65; Van Wezel y col., 1978. Process Biochem. 3:6-8). Se ha descrito la produccion mediante procesos a gran escala del virus de la poliomielitis, virus de la Hepatitis A, VHS o virus de la enfermedad de Mareck en un microportador (US 4.525.349; Widell y col., 1984. J. Virological Meth. 8:63-71; Fiorentine y col., 1985. Develop. Biol. Standard 60:421-430; Griffiths y col., 1982. Develop. Biol. Standard. 50:103-110). Los procesos actuales basados en el cultivo en microportadores permiten la produccion de virus mediante fermentadores de un tamano que alcanza los 1.200 l.
Caij y col. (1989, Arch. Virol. 105: 113-118) compararon las producciones del virus titulado del Colera Porcino en cultivos en microportadores con los
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cultivos convencionales monocapa y descubrieron que, mediante la utilizacion del sistema microportador, se podfa obtener una produccion mas elevada de virus por volumen de medio de cultivo.
Griffiths y col. (1982, Develop. Biol. Standard. 50:103-110) estudiaron la influencia de la concentracion de microportadores sobre el crecimiento celular y la produccion de VSH. Se descubrio que era necesaria una concentracion optima de microportadores para alcanzar una alta densidad celular, lo que influfa tambien en la produccion viral obtenida. Sin embargo, concentraciones mas altas de microportador en un sistema de perfusion resultaron en una perdida celular debido a que la capa celular se desprendfa de las perlas.
Ademas, Kistner y col. (Alternativen Zu Tierexperimenten, Alemania 2001, vol. 18, n° 1, paginas 50 a 54) describen la produccion en cultivo de la vacuna contra la gripe en fermentadores bajo condiciones exentas de suero; Kistner y col. (Wiener Klinische Wochenschrift, New York, NY, US, vol. 111, n° 5, 1999, paginas 207 a 214) describen la produccion de la vacuna contra la gripe en cultivos de celulas VERO bajo condiciones exentas de suero; y Barett y col. (Aids Research And Human Retroviruses, New York, NY, US. vol. 5, n° 2, 1989, paginas 159 a 172) describen la produccion y purificacion a gran escala de las glicoprotemas de la envoltura del VIH-1. Ademas, la WO 91/09935 describe la produccion del virus de la FSME por medio de celulas VERO unidas a un sustrato; Percheson y col. (Developments In Biological Standardization, vol. 98, 1999, paginas 127 a 132) describen un estudio clmico en adultos sanos utilizando una vacuna contra la gripe derivada de virus desarrollados en cultivo celular; y Sharkey y col. (Journal Of Virology, vol. 75, n° 6, 2001, paginas 2653 a 2659) describen una lmea celular estable que produce el retrovirus glicoproteico-pseudotipado del alfavirus.
La productividad del proceso de produccion viral en el sistema microportador depende del virus, de las celulas, del tipo de microportador y de la densidad celular obtenida en el sistema. Concentraciones mas elevadas de microportador en el cultivo celular permiten cantidades totales mas elevadas de celulas. Sin embargo, los microportadores son caros y, en estas condiciones, puede tener lugar una perdida celular debido a que las capas celulares se desprenden de las perlas por el esfuerzo de cizalla que aparece en el sistema. Esto implica que, para producciones virales mas elevadas, es necesario un mayor volumen de cultivo celular en los microportadores, sin embargo, esto aumenta los esfuerzos que se deben realizar para procesar y purificar dichos grandes volumenes.
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En cuanto a la propagacion viral, es importante alcanzar una densidad celular optima para obtener la maxima produccion viral. Tambien es importante permitir la adsorcion eficaz del virus en las celulas. Por tanto, en los metodos convencionales, el volumen del medio de cultivo se reduce antes de la infeccion para permitir la adsorcion del virus en las celulas en un volumen mmimo de cultivo y para obtener una mejor relacion entre el virus y las celulas. Sin embargo, para obtener una propagacion optima del virus, el volumen del medio de cultivo se incrementa de nuevo despues de un tiempo de adsorcion adecuado para que las celulas puedan mantener su viabilidad y/o desarrollo. Esto, sin embargo, aumenta el volumen del medio de cultivo que incluye las celulas y/o virus, lo que tiene el inconveniente de que se deben procesar grandes volumenes para la purificacion posterior del virus procedente de las celulas o del medio de cultivo celular.
En caso de una epidemia de infeccion viral, resulta cntico producir grandes cantidades de vacunas de forma adecuada para proporcionar varios millones de dosis de vacunas en un penodo de tiempo muy corto. Por tanto, sigue existiendo la necesidad de metodos seguros y eficaces para producir virus y antfgenos. Ademas, se necesita una aproximacion a la propagacion viral mediante el empleo de materiales ya disponibles y que requieran una cantidad mmima de manipulaciones prolongadas, tal como el manejo de volumenes reducidos de medio de cultivo celular, y que faciliten la purificacion y el procesamiento posterior para la produccion de vacunas.
Un objeto de la presente invencion consiste en proporcionar un metodo para la produccion de virus o antfgenos virales en un cultivo celular de celulas adherentes unidas a un microportador.
Tambien es objeto de la presente invencion proporcionar un metodo de produccion viral en un pequeno volumen de cultivo celular.
De acuerdo con estos y otros objetos, la presente invencion proporciona un metodo segun la reivindicacion 1. El incremento de la densidad celular en el cultivo celular se lleva a cabo mediante la concentracion del cultivo celular, lo que incluye un aumento de la concentracion de los microportadores en el cultivo celular.
En general, las celulas adherentes unidas a microportadores necesitan una relacion optima entre la concentracion de microportadores y las celulas para alcanzar una densidad celular elevada. El incremento de la concentracion de microportadores en el cultivo celular permitina teoricamente alcanzar una
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densidad celular mas alta por volumen de medio de cultivo. Sin embargo, debido a los efectos de cizalla, a la reduccion de las fuentes de alimentacion en el medio y a la tension fisiologica de las celulas por el aumento de la concentracion de microportadores, la concentracion del soporte del sistema de cultivo celular se limita a una concentracion espedfica (vease tambien Griffiths y col., 1982, mas arriba).
El metodo de la invencion permite que las celulas se desarrollen en condiciones optimas de crecimiento, incluyendo la concentracion de microportadores, alimentacion y tension fisiologica mmimas, para alcanzar la maxima densidad celular para el sistema utilizado.
En la presente invencion, se descubre que la reduccion del volumen de medio de cultivo antes o despues de la infeccion por el virus, gracias a los cual se incrementan la densidad celular y la concentracion de microportadores en la biomasa del cultivo celular, no influye en la productividad de las celulas. Por contraste, se descubre sorprendentemente que la production viral obtenida por cada una de las celulas se puede incrementar en comparacion con las celulas que se mantienen a la misma densidad celular que el cultivo celular confluente original. Esto era totalmente inesperado ya que, debido al aumento de la concentracion de microportadores en el cultivo celular, se esperaba una reduccion de la viabilidad celular, un desprendimiento de las celulas de los microportadores y una tension fisiologica debida a la mayor densidad celular y durante la produccion viral
El metodo de la invencion permite reducir el volumen del medio de cultivo que ha de ser procesado durante el proceso posterior de purification viral a la vez que, simultaneamente, la productividad del virus por celula es similar o incluso aumenta en comparacion con el cultivo celular original. El sistema se puede ampliar hasta un volumen de fermentador de 6.000 l, lo que convierte el proceso para la produccion de virus para vacunas en mas eficaz y rapido.
Segun una realization del metodo, las celulas dependientes de anclaje se seleccionan de entre el grupo de celulas adherentes de VERO, BHK, CHO, RK, RK44, RK13, MRC-5, MDCK, CEF o celulas diploides monocapa, tal como se describe en Reuveny y col. (1985, Develop. Biol. Standard, 60:243-254) y otros bien conocidos en la tecnica.
Las celulas adherentes unidas a microportador se pueden desarrollar en un medio de cultivo convencional que contenga suero. Segun una realizacion
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preferente de la invencion, las celulas se cultivan en un medio exento de suero o exento de suero y protemas, tal como se describe en Kistner y col. (1998, Vaccine 16: 960-968), Merten y col. (1994, Cytotech. 14: 47-59), Cinati. y col. (1993, Cell Biology Internat. 17: 885-895), Kessler y col. (1999. Dev. Biol. Stand. 98: 13-21), WO 96/15231, US 6.100.061 o cualquier otro medio exento de suero o exento de suero y protemas conocido en la tecnica. Las celulas se cultivan preferentemente desde una ampolla a gran escala hasta una biomasa en un medio exento de suero o exento de suero y protemas.
Segun una realizacion de la invencion, el cultivo de celulas adherentes unidas a microportador se desarrolla hasta alcanzar la confluencia y se infectan con un virus despues de aumentar la densidad celular y la concentracion de microportadores de la biomasa celular del cultivo celular confluente.
De acuerdo con una realizacion de la invencion, el cultivo de celulas adherentes unidas a microportador se desarrolla hasta alcanzar la confluencia y se infecta con un virus antes de aumentar la densidad celular y la concentracion de microportadores de la biomasa confluente. En cualquier caso, si el cultivo celular con mayor densidad celular o concentracion de microportadores por volumen se infecta antes o despues de la concentracion del cultivo, la densidad celular y la concentracion de microportadores en la biomasa se mantienen constantes durante la propagacion viral y durante el proceso de produccion, no volviendose a incrementar el volumen del medio. El metodo empleado para aumentar la densidad celular y la concentracion de microportadores en la biomasa de cultivo celular no infectado o infectado por un virus puede ser cualquier metodo conocido en la tecnica para concentrar un cultivo celular. Esto se puede llevar a cabo por metodos tales como sedimentacion, centrifugacion, filtracion, concentracion con un dispositivo de perfusion, tal como un tamiz, que permitan la reduccion del volumen de trabajo, o reuniendo 2 o mas sistemas por biorreactor.
La densidad del cultivo celular y la concentracion de microportadores del cultivo celular desarrollado hasta la confluencia aumentan, siendo el aumento al menos 1,3 veces mas importante que la biomasa original cultivada hasta la confluencia. La densidad celular del cultivo celular original de partida que se ha cultivado hasta la confluencia puede ser de entre aproximadamente 0,6 x 106 y aproximadamente 7,0 x 106 celulas/ml. En este caso, la biomasa, cuya densidad celular ha aumentado en comparacion con la biomasa del cultivo de partida, puede tener una densidad celular de entre al menos 0,8 x 106 y al menos 9,0 x 106 celulas/ml.
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La concentracion de microportadores en el cultivo celular de partida se encuentra preferentemente en el rango de aproximadamente 0,5 g/l a aproximadamente 7,0 g/l. La concentracion de microportadores despues de la concentracion de la biomasa confluente se situa preferentemente en el rango de aproximadamente 0,65 g/l a aproximadamente 21 g/l.
Preferentemente, el microportador utilizado segun el metodo de la invencion se selecciona de entre el grupo de microportadores basados en dextrano, colageno, poliestireno, poliacrilamida, gelatina, vidrio, celulosa, polietileno y plastico, asf como aquellos que se describen en Miller y col. (1989, Advances in Biochem Eng./Biotech. 39: 73-95) y en Butler (1988, Spier & Griffiths, Animal Cell Biotechnology. 3: 283-303).
De acuerdo con una realizacion del metodo de la invencion, el virus se selecciona de entre el grupo de virus de la gripe, Virus de Ross-River, Virus de la Hepatitis A, Virus de la Vaccinia y Virus de la Vaccinia recombinante, Virus del Herpes Simple, Virus de la Encefalitis Japonesa, Virus del Nilo Occidental, Virus de la Fiebre Amarilla y virus quimericos de los mismos, asf como Rhinovirus y Reovirus. Forma parte del conocimiento de un especialista en la tecnica seleccionar una celula huesped adherente y el virus susceptible a este huesped y utilizar el metodo de la invencion para obtener un aumento de la produccion viral del virus deseado.
Forma parte del conocimiento de un especialista en la tecnica seleccionar el tipo de microportador respectivo, la concentracion de microportadores en el cultivo de partida, las celulas adherentes susceptibles al virus y el medio, asf como las condiciones optimas de cultivo, tal como la concentracion de oxfgeno, suplementos del medio, temperatura, pH, presion, velocidad de agitacion y control de la alimentacion, para obtener una biomasa de cultivo celular confluente que se pueda utilizar para obtener una biomasa celular que tenga una densidad celular y una concentracion de microportadores aumentadas de acuerdo con este metodo. El cultivo celular con una biomasa de densidad celular incrementada se puede utilizar entonces para la propagacion y produccion virales eficaces. Una vez alcanzada la confluencia por el cultivo celular, el metodo de la invencion permite obtener un cultivo celular con una mayor densidad celular y una mayor concentracion de microportadores incrementadas en al menos 1,3 veces a 10 veces y obtener una produccion viral superior por volumen de cultivo debido i) el menor volumen de cultivo y ii) el aumento de la productividad por celula.
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El proceso de produccion viral y la duracion de la produccion dependen del sistema empleado. La produccion maxima de virus a alcanzar en el sistema respectivo se puede determinar por metodos estandar. Cuando se alcanza la produccion viral maxima, el virus y/o las celulas que incluyen el virus se cosechan. Por tanto, el metodo de la invencion comprende ademas un paso de cosecha del virus propagado y producido.
Otro aspecto de la invencion preve un metodo para la produccion viral o de anffgenos virales purificados, que comprende los pasos de proporcionar un cultivo de celulas adherentes unidas a un microportador, desarrollar el cultivo celular hasta alcanzar la confluencia, infectar el cultivo de celulas con un virus, donde la densidad celular en el cultivo celular se incrementa (i) antes de la infeccion por el virus o (ii) despues de la infeccion por el virus, incubar dicho cultivo de celulas infectadas por dicho virus para su propagacion; (f) cosechar el virus producido y (g) purificar dicho virus cosechado.
Dependiendo de la naturaleza del virus empleado para la infeccion y propagacion, el virus producido se encuentra en el sobrenadante del cultivo celular y/o se asocia a la biomasa celular. Los virus lfficos, por ejemplo el virus de la gripe, lisan las celulas tras un tiempo apropiado despues de la infeccion, liberandose el virus en el medio de cultivo celular. El virus producido y liberado en el medio de cultivo celular se puede separar de la biomasa celular o de otros fragmentos celulares por metodos convencionales, tales como centrifugacion, incluyendo ultracentrifugacion, centrifugacion en gradiente de densidad, microfiltracion, ultrafiltracion, cromatograffa de intercambio ionico, etc., y se purifica.
Los virus no lfficos se propagan dentro de las celulas y siguen asociados a las celulas de la biomasa. Estos virus se pueden cosechar recogiendo la biomasa, lisando las celulas por metodos convencionales, tales como tratamiento de las celulas con un detergente, calor, congelacion/descongelacion, sonicacion, prensa francesa u otros metodos de lisado celular. Los virus liberados de las celulas se cosechan, se concentran y se purifican. La purificacion del virus se puede llevare a cabo mediante cualquier metodo conocido en la tecnica, tal como ultrafiltracion, cromatograffa de intercambio ionico o centrifugacion isopfcnica, etc.
El virus de la gripe se puede propagar en lmeas celulares, incluyendo las celulas mas eficaces MDCK, asf como en la lmea celular cuyo uso ha sido concedido para la fabrication de vacunas humanas, celulas Vero. Ya se ha
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descrito la production a gran escala del virus de la gripe, en un medio exento de suero o en un medio exento de suero y protemas, en un cultivo celular de mamffero, en perlas microportadoras, en un biorreactor, asf como el desarrollo de una vacuna contra el virus de la gripe (Merten y col., 1999, Dev. Biol. Stand. 98: 23-37; Kistner y col., 1998. Vaccine 16: 960-968; Kistner y col., 1999, Dev. Biol. Stand. 98: 101-110 y WO 96/15231).
De acuerdo con un aspecto, la invention proporciona un metodo para la produccion del virus de la gripe que comprende los pasos de: proporcionar un cultivo de celulas adherentes unidas a un microportador, desarrollar el cultivo celular hasta alcanzar la confluencia, infectar las celulas con el virus de la gripe; donde la densidad celular del cultivo celular aumenta (i) antes de la infection por el virus o (ii) despues de la infeccion por el virus, incubar el cultivo de celulas infectadas por dicho virus de la gripe para su propagation. Las celulas infectadas por el virus de la gripe pueden ser celulas VERO o MDCK o cualquier celula que sea susceptible al virus de la gripe. Segun una realization preferente de la invencion, se utilizan celulas VERO y se infectan con el virus de la gripe. Segun una realizacion preferente, las celulas VERO se cultivan en un medio exento de suero o en un medio exento de suero y protemas, desde la ampolla original hasta la biomasa. Las celulas VERO unidas al microportador se cultivan en el medio respectivo hasta alcanzar la confluencia, y la densidad celular asf como la concentration de microportadores aumentan al menos 1,3 veces. Las celulas se pueden infectar con el virus gripe antes o despues del aumento de la densidad celular en el volumen de cultivo. Despues de la incubation de la biomasa infectada de alta densidad celular y la produccion viral, se cosecha el virus de la gripe o el antfgeno del virus de la gripe producido. El virus cosechado se purifica a continuacion por metodos conocidos en la tecnica, tal como se describe en Kistner y col., 1998 (mas arriba) o US 6.048.537.
Al haber sido descrita en general esta invencion, a continuation se entendera la misma con referencia a los siguientes ejemplos, los cuales se proporcionan con el unico proposito de la ilustracion y no pretenden ser limitativos, salvo que se especifique de otro modo.
Ejemplo 1: Produccion de Antlgenos Virales en una Biomasa Concentrada de Celulas Vero
a) Desarrollo del cultivo celular
Se utilizo como lmea celular de production celulas VERO (Mono Verde Africano, Cercopthecus aethiops, rinon). Las celulas se obtuvieron de la Coleccion de Cultivos Celulares de Tipo Americano, Rockville, Maryland con numero de 5 acceso 124, bajo la designation ATCC CCL 81. Las celulas se adaptaron para desarrollarse en un medio exento de suero o exento de suero y protemas tal como se describe en Kistner y col., 1998 (mas arriba), la WO 96/15231 o la US 6.100.061. Para el desarrollo en un medio exento de suero, se utiliza un medio basal DMEM de HAM F12 suplementado con sales inorganicas, aminoacidos, 10 bicarbonato de sodio (2 g/l) y levadura o extracto de soja (0,1 a 10 g/l). Se preparo el banco de celulas de trabajo sin utilizar ningun componente del medio derivado animal.
Las celulas del banco de celulas de trabajo se desarrollaron en matraces-T y botellas rodantes con una relation de division de 1:6 o 1:8. Se realizo otra 15 propagation de las celulas en un biorreactor con tanque de 100 l bajo agitation utilizando un microportador Cytodex® como sustrato de sujecion. Las celulas se desarrollaron a 37°C durante 6-8 dfas. Las condiciones del cultivo fueron: una saturation de oxfgeno del 20% ± 10% y un pH de 7. Se mantuvo constante a 25 ± 0,35. Al final de la produccion de biomasa, cuando las celulas alcanzaron el 20 crecimiento de confluencia, una parte del volumen del reactor de biomasa se concentro en dos veces por sedimentation y se determino la densidad celular del cultivo celular concentrado y no concentrado.
b) Determination de la densidad celular de la biomasa
El numero de celulas en la biomasa del cultivo celular al final de la 25 produccion de biomasa se determino por tripsinizacion de las celulas y su recuento se llevo a cabo con un contador celular CASY® (metodo A), tal como se describe en Scharfe y col. (1988, Biotechnologie in LaborPraxis 10: 1096-1103) o con acido dtrico y tratamiento con cristal violeta, seguido de recuento con un hemocitometro (metodo B) tal como se describe en Sanford y col. (1951, j. Natl. 30 Cancer Inst. 11: 773-795). La densidad celular y la concentration de portadores para las celulas Vero al final de la produccion de biomasa y despues de la concentracion de la biomasa confluente (antes de la infection) se calculo por los metodos A y B. Los datos se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1
Determinacion del numero de celulas en un cultivo celular confluente al final de la produccion de biomasa y despues de la concentracion del cultivo
celular confluente
- Produccion de Biomasa Biomasa Concentrada
- Concentracion de Microportadores (g/l)
- 5,0 10,0
- Densidad Celular (celulas / ml) (Metodo A)
- 4,6 x 106 9,2 x 106
- Densidad Celular (celulas / ml) (Metodo B)
- 5,6 x 106 11,2 x 106
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Ejemplo 2: Comparacion de la Produccion de Antigeno Viral en una Biomasa Confluente con una Biomasa Confluente Concentrada
10 Celulas Vero con el numero de acceso definido se descongelaron del
nitrogeno lfquido y se pasaron a botellas de Roux y botellas rodantes con el fin de producir suficientes celulas para inocular un biorreactor de 1,5 litros. Tras alcanzar la confluencia, con una densidad celular final de 1,5 x 106 celulas/ml, se sometieron las celulas a tripsinizacion y se trasladaron a un biorreactor de 10 15 litros. Esto, a su vez, se utilizo como inoculo para un biorreactor de 100 litros que tema una concentracion de microportadores de 1,5 g/l. Partiendo de una ampolla del banco celular de trabajo que contiene 107 celulas, eran necesarias aproximadamente 30 generaciones para alcanzar la biomasa confluente final de celulas Vero. Se desarrollo el cultivo para alcanzar la confluencia con una 20 densidad celular final de 1,9 x 106/ml. Antes de la infeccion por el virus, se cargaron dos sistemas biorreactores de 10 litros con la biomasa del cultivo celular con distintos numeros de celulas totales. El fermentador A se cargo con 1,9 x 1010 celulas y el fermentador B se cargo con un numero de celulas totales de 3,8 x 1010 Con el fin de conseguir una mayor concentracion de biomasa y portadores 25 para cargar el fermentador B, el cultivo celular desarrollado hasta alcanzar la confluencia se concentro, por sedimentacion de la biomasa, hasta alcanzar una concentracion del doble. El fermentador A contema un 100% y el fermentador B
un 200% de biomasa celular del cultivo celular original desarrollado hasta alcanzar la confluencia.
a) Produccion del virus de la Gripe
El cultivo celular de los fermentadores A y B se infecto con la cepa H3N2 5 A/Sydney/5/97 del virus de la gripe con una MOI (Multiplicidad de Infeccion) de 0,01. Se aplicaron parametros de proceso identicos de 32°C, pO2 del 20% y pH de 7,1. Para activar el virus de la gripe para la propagacion viral, se anadio una proteasa, tal como tripsina, pronasa o una parte analoga a la tripsina de la misma.
Se determino la productividad de antfgeno viral de los dos cultivos celulares 10 diferentes de los fermentadores A y B que conteman distintas concentraciones de biomasa y se comparo en base a virus de la gripe titulado (HAU/ml) y el contenido en antfgeno (antfgeno purificado en gradiente de densidad). La zona pico corresponde a la concentracion total de antfgeno al final del ciclo lrtico al tercer dfa despues de la infeccion. Se muestran los datos en la Tabla 2.
15 Tabla 2
Determination del tltulo del Virus de la Gripe y del antlgeno en un cultivo confluente de celulas VERO y una biomasa confluente concentrada de
celulas VERO
- Fermentador
- A B
- Concentracion de Portadores (g/l)
- 1,5 g/l 3,0 g/l
- Densidad celular (celulas / ml) (Metodo B)
- 1,90 x 106 3,80 x 106
- HAU / ml
- 640 2560
- Zona Pico (rel. Unidades)
- 83,3 (100%) 412,3 (495%)
20 b) Produccion del Virus de Ross-River
Se propagaron las celulas VERO tal como se describe anteriormente hasta alcanzar la confluencia, con una densidad final de 1,6 x 106 celulas/ml. Antes de la infeccion viral, se cargaron dos sistemas biorreactores de 50 l con la biomasa de cultivo celular que tema distintos numeros de celulas totales. El fermentador A 25 se cargo con 1,6 x 106 celulas/ml y el fermentador B se cargo con 2,3 x 106 celulas/ml, que representa una concentracion de 1,5 veces la de la biomasa del cultivo celular confluente. Los fermentadores A y B se infectaron con el Virus de Ross-River y se determino la productividad de antfgeno viral de los fermentadores
5
10
15
20
A y B tal como se ha descrito anteriormente. La Tabla 3 muestra los resultados de la production viral obtenida mediante el uso de distintas concentraciones de biomasa para la propagation viral.
Tabla 3
Determination del tltulo del Virus de Ross-River y de la produccion de
antlgeno
- Fermentador
- A B
- Concentration de Portadores (g/l)
- 1,5 2,25
- Densidad celular (x 106 celulas / ml)
- 1,6 2,3
- Tftulo viral (log TCID50)
- 8,71 8,95
- Trtulo viral pfu / 106 celulas (x 106)
- 321 388
- Produccion (%)
- 100 121
Ejemplo 3: Produccion de Antigeno Viral en una Biomasa Concentrada de Celulas RK
a) Desarrollo del Cultivo Celular
Como lmeas celulares de produccion se emplearon celulas de rinon de conejo RK-13 o un derivado complementary de las mismas RK-D4R-44, tal como se describen en Holzer y col. (1997. J. Virol. 71: 4997-5002). Se cultivaron las celulas en un medio convencional que contema un 2% de suero.
Las celulas del banco de celulas de trabajo se desarrollaron en frascos-T y botellas rodantes con una relation de division de 1:6. Se realizo otra propagacion de las celulas en un biorreactor con tanque de 10 l bajo agitation utilizando microportadores Cytodex® (Pharmacia) como sustrato de sujecion.
b) Produccion del Virus Defectuoso de la Vaccinia
Tras haber alcanzado las celulas RK-13 o RK-D4R-44 la confluencia y una densidad celular final en los biorreactores de tanque, se infecto la biomasa con el Virus de la Vaccinia WR o el Virus de la Vaccinia defectuoso vD4-ZG#2 tal como se describe en Holzer y col. (1997, mas arriba) con una MOI de 0,01. Despues de la infection, se cargaron dos sistemas biorreactores de 10 l con la biomasa de cultivo celular infectada, con distintos numeros de celulas totales. Se cargo el
fermentador A con 1,2 x 1010 celulas/ml y el fermentador B con 2,4 x 1010 celulas/ml. Para conseguir concentraciones mayores de biomasa y portadores para el fermentador B, el cultivo celular infectado desarrollado hasta alcanzar la confluencia se concentro por sedimentacion de la biomasa para obtener una 5 mayor concentracion. El fermentador A contema un 100% y el fermentador B un 200% de biomasa celular del cultivo celular original desarrollado hasta alcanzar la confluencia. Se determino la productividad de antfgeno viral de los dos fermentadores A y B de diferentes cultivos celulares que conteman distintas concentraciones de biomasa por volumen de medio de celulas infectadas. Se 10 resumen los resultados en la Tabla 4.
Tabla 4
Determination del tltulo del Virus de la Vaccinia en celulas RK
- Fermentador
- A B
- Concentracion de Portadores (g/l)
- 1,5 2,5
- Densidad celular (x 106 celulas / ml)
- 1,2 2,4
- Trtulo viral pfu / 106 celulas (x 106)
- 0,8 1,3
- Production (%)
- 100 162
Claims (13)
- 51015
- 2.20
- 3.25 4.REIVINDICACIONES1. Metodo para la produccion de virus o antfgenos virales que comprende las siguientes fasesa) proporcionar un cultivo de celulas adherentes unidas a un microportador,b) desarrollar el cultivo celular hasta alcanzar la confluencia,c) infectar las celulas con un virus, yd) incubar dicho cultivo de celulas infectadas por dicho virus para la propagacion de esteaumentando la densidad celular de la biomasa del cultivo celular desarrollado hasta alcanzar la confluencia y la concentracion de microportadores al menos de 1,3 a 10 veces reduciendo el volumen de medio de cultivo(i) antes del paso (c), o(ii) despues del paso (c)y manteniendolas a una densidad celular elevada durante el paso (d), mientras que el volumen del medio no aumenta de nuevo.Metodo segun la reivindicacion 1, caracterizado porque la densidad del cultivo celular desarrollado hasta alcanzar la confluencia se encuentra entre aproximadamente 0,5 x 105 y aproximadamente 7,0 x 105 celulas/ml.Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque el microportador se selecciona de entre el grupo de microportadores compuesto por dextrano, colageno, poliestireno, poliacrilamida, gelatina, vidrio, celulosa, polietileno y plastico.Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la concentracion de microportadores en el cultivo celular de la fase (a) se situa entre aproximadamente 0,5 g/l y aproximadamente 14 g/l.Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque dichas celulas se seleccionan de entre el grupo de celulas510152025adherentes de VERO, BHK, CHO, RK, RK44, RK13, MRC-5, MDCK, CEF o celulas diploides monocapa.
- 6. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dichas celulas unidas a un microportador se cultivan en un medio exento de suero.
- 7. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque dichas celulas unidas a un microportador se cultivan en un medio exento de suero y de protemas.
- 8. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el virus se selecciona de entre el grupo de virus de la gripe, Virus de Ross-River, Virus de la Hepatitis A, Virus de la Vaccinia y derivados recombinantes del mismo, Virus del Herpes Simple, Virus de la Encefalitis Japonesa, Virus del Nilo Occidental, Virus de la Fiebre Amarilla y virus quimericos de los mismos, asf como Rhinovirus y Reovirus.
- 9. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende ademas la fase (e) de cosecha del virus propagado.
- 10. Metodo segun la reivindicacion 9, que comprende ademas la fase (f) de purificacion del virus cosechado para obtener un virus o antfgeno viral purificado.
- 11. Metodo segun la reivindicacion 9 o 10, caracterizado porque el virus producido se cosecha del sobrenadante del cultivo celular.
- 12. Metodo segun la reivindicacion 9 o 10, caracterizado porque el virus producido se cosecha de la biomasa celular.
- 13. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, caracterizado porque ademas comprende la fase de procesar el virus o el antfgeno viral purificado en una vacuna.
- 14. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque el virus o el antfgeno viral producido es el virus de la gripe o el antfgeno del virus de la gripe.
- 15. Metodo segun la reivindicacion 14, caracterizado porque dichas celulas son celulas VERO.Metodo segun la reivindicacion 14, caracterizado porque dichas celulas son celulas MDCK.
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