HU225791B1 - Method for large scale production of virus antigen - Google Patents
Method for large scale production of virus antigen Download PDFInfo
- Publication number
- HU225791B1 HU225791B1 HU0402415A HUP0402415A HU225791B1 HU 225791 B1 HU225791 B1 HU 225791B1 HU 0402415 A HU0402415 A HU 0402415A HU P0402415 A HUP0402415 A HU P0402415A HU 225791 B1 HU225791 B1 HU 225791B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- virus
- cells
- culture
- cell
- cell culture
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims description 88
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 49
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims description 23
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims description 23
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims description 23
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 title description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 86
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims abstract description 75
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 claims abstract description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 44
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 25
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims description 21
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 15
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 claims description 12
- 206010066919 Epidemic polyarthritis Diseases 0.000 claims description 9
- 241000710942 Ross River virus Species 0.000 claims description 9
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 claims description 9
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 9
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 8
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 claims description 7
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 5
- 241000710842 Japanese encephalitis virus Species 0.000 claims description 4
- 241000702263 Reovirus sp. Species 0.000 claims description 4
- 241000710886 West Nile virus Species 0.000 claims description 4
- 241000710772 Yellow fever virus Species 0.000 claims description 4
- 229940051021 yellow-fever virus Drugs 0.000 claims description 4
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 claims description 3
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 claims description 3
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 claims description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 claims description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 claims description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 claims description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 claims description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 claims description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims description 2
- -1 polyethylene Polymers 0.000 claims description 2
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 claims description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 189
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 11
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 9
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 9
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000006727 cell loss Effects 0.000 description 2
- 230000001427 coherent effect Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 230000009894 physiological stress Effects 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000710777 Classical swine fever virus Species 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241000701047 Gallid alphaherpesvirus 2 Species 0.000 description 1
- 229940124873 Influenza virus vaccine Drugs 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000700646 Vaccinia virus WR Species 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000012656 cationic ring opening polymerization Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001524 infective effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012092 media component Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 235000020712 soy bean extract Nutrition 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 230000001810 trypsinlike Effects 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16151—Methods of production or purification of viral material
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
A jelen találmány mikrohordozóra kötött adherens sejtek tenyészetén végzett vírusantigén-termelés javított eljárásaival foglalkozik, mely eljárások a vírusantigénnek a tenyészközeg mennyiségére vonatkoztatottan megemelkedett hozamát biztosítják. A találmány tárgyát képezi továbbá az adherens sejteknek az illető összenőtt (konfluens) sejttenyészethez viszonyítottan megnövelt sejtsűrűséggel és mikrohordozókoncentrációval rendelkező tenyészetének biomasszája is.
A hatékony vakcinatermelés megkívánja a gazdarendszerből magas hozamban előállított vírus nagy méretekben történő növesztését. A vírusszaporodásnál alkalmazott tenyésztési körülmények nagy jelentőségűek a törzs megfelelően magas hozamának elérése szempontjából. A kívánt vírus hozamának maximalizálásához tehát úgy a rendszert, mint a tenyésztési körülményeket specifikusan kell kialakítanunk, hogy a kívánt vírus termeléséhez előnyös környezetet jelentsenek. Ezért, hogy a különféle vírustörzsek megfelelően magas hozamát elérjük, olyan rendszer alkalmazása szükséges, amely optimális növekedési körülményeket biztosít számos különböző vírus számára.
Az egyetlen gazdaságilag megfelelő eljárás a reaktoros eljárás, mivel így a méretnövelés a piac terjedelmének és a vakcinaadagoknak megfelelően elvégezhető. Az adherens sejteket illetően a vírus szaporításához szükséges sejtek nagy méretekben történő tenyésztéséhez jelenleg a klasszikus mikrohordozóval végzett eljárás a legmegfelelőbb [Van Wezel és munkatársai, Natúré, 216:64-65. (1967); Van Wezel és munkatársai, Process Biochem. 3:6-8. (1978)]. A poliomyelitisvírus, a hepatitis A vírus, a HSV (herpes simplex vírus) és a Marek-betegség vírusának mikrohordozón végzett, nagy méretekben történő termelési eljárását többen leírták [4 525 349 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom; Widell és munkatársai, J. Virological Meth., 8:63-71 (1984); Fiorentine és munkatársai, Develop. Bioi. Standard, 60:421-430 (1985); Griffiths és munkatársai, Develop. Bioi. Standard, 50:103-110. (1982)]. A jelenlegi eljárások mikrohordozós tenyészeteken alapulnak, melyek lehetővé teszik az akár 1200 literes fermentorok használatát is a vírustermeléshez.
Caij és munkatársai [Arch. Virol., 105:113-118. (1989)] mikrohordozós tenyészeteken és hagyományos egyrétegű tenyészeteken összehasonlították a Hog koleravírus vírustiterének termelési hozamát, és úgy találták, hogy mikrohordozós rendszert használva a közeg mennyiségére vonatkoztatott magasabb vírushozamot érnek el.
Griffiths és munkatársai [Develop. Bioi. Standard, 50:103-110. (1982)] a mikrohordozó koncentrációjának a sejtnövekedésre és HSV-termelésre kifejtett hatását vizsgálták. Azt találták, hogy a magas sejtsűrűség elérése a mikrohordozók megfelelő koncentrációját igényli, ami a kapott vírushozamra is befolyással van. Az áramoltatásos rendszerben azonban a mikrohordozó magasabb koncentrációja sejtvesztéshez vezet, mivel a sejtréteg lehámlik a gyöngyökről.
A mikrohordozós rendszeren végzett vírustermelési eljárás hatékonysága függ a vírustól, a sejtektől, a mikrohordozó típusától és a rendszerben kapott sejtsürűségtől. A sejttenyészetben a mikrohordozó magasabb koncentrációja magasabb teljes sejtszámot tesz lehetővé. A mikrohordozók azonban költségesek, és ilyen körülmények között sejtvesztés következhet be a sejtréteggel fedett gyöngyökre ható, a rendszerben működő nyíróerő következtében. Ez azt jelenti, hogy a magasabb vírushozam elérése nagyobb mennyiségű mikrohordozós sejttenyészetet igényel, ez viszont növeli az ilyen nagy mennyiségek feldolgozásánál és a tisztításánál megteendő erőfeszítéseket.
A vírusszaporításnál a maximális vírushozam eléréséhez fontos, hogy az optimális sejtsűrűséget elérjük. Szintén lényeges, hogy a vírust hagyjuk hatékonyan kötődni a sejtekhez. A szokásos eljárásokban ezért a fertőzést megelőzően csökkentik a tenyésztőközeg térfogatát, hogy a minimális térfogatú tenyésztőközegben elősegítsék a vírus sejthez kötődését, és javítsák a vírus/sejt arányt. A lehető legjobb vírusszaporodás eléréséhez azonban a tenyészközeg térfogatát a megfelelő adszorpciós idő elteltével újra növelik, hogy a sejtek számára lehetővé tegyék az életképesség fenntartását és/vagy a növekedést. Ezáltal azonban nő a sejteket és/vagy vírust tartalmazó tenyészközeg mennyisége, ami azzal a hátránnyal jár, hogy a továbbiakban nagyobb mennyiséget kell feldolgozni a sejtekből vagy a sejttenyésztő közegből történő vírustisztítás során.
Egy vírusfertőzés kitörése esetén döntő fontosságú a megfelelő időben és nagy mennyiségben termelt vakcina, hogy abból rövid időn belül több millió adag oltóanyagot lehessen előállítani. Ezért folyamatos igény áll fenn a biztonságos és hatékony vírus- és antigéntermelési eljárásokra. Továbbá olyan virustenyésztési eljárásra van szükség, amely már rendelkezésre álló anyagokat használ fel, és amely a lehető legkevesebb időigényes folyamatot igényli, például csökkentett mennyiségű tenyészközeggel dolgozva, és megkönnyítve a tisztítást, valamint a vakcinává való feldolgozási folyamatot.
A jelen találmány tárgya eljárás vírus vagy vírusantigén mikrohordozóra kötött adherens sejtek tenyészetén végzett termelésére.
A jelen találmány további tárgya kis sejttenyészeti térfogatban történő vírustermelési eljárás.
A jelen találmány további tárgya adherens sejtek olyan tenyészetének nyújtása, melynek az eredeti, összenőtt sejttenyészethez viszonyított sejtsűrűsége nagyobb.
A jelen találmány további tárgya mikrohordozóra kötött adherens sejtek olyan tenyészetének nyújtása, melynek az eredeti, összenőtt sejttenyészethez viszonyított sejtsűrűsége nagyobb, és amely sejttenyészet vírussal fertőzött.
Ezeknek és egyéb céloknak megfelelően a jelen találmány olyan vírus- vagy vírusantigén-termelési eljárásokat nyújt, melyek a következő lépésekből állnak: a mikrohordozóra kötött adherens sejtek tenyészetének elkészítése; a sejttenyészet összefüggővé (konfluenssé) növesztése; ezen sejtek vírussal történő fertőzése, mely során a sejtsűrűséget (i) a vírusfertőzés előtt vagy
HU 225 791 (ii) a vírusfertőzés után a sejttenyészetben megnöveljük; és a vírussal fertőzött sejttenyészet inkubálása a nevezett vírus elszaporitásához. A sejttenyészet sejtsűrűségének növelését a sejttenyészet betöményítésévei végezzük, amely magában foglalja mikrohordozó koncentrációjának növelését a sejttenyészetben.
Általánosságban mondva, a mikrohordozókra kötött adherens sejteknél optimális mikrohordozó/sejt koncentrációarány szükséges a magas sejtsűrűség eléréséhez. A mikrohordozó koncentrációjának emelése a sejttenyészetben elméletileg a tenyészközeg mennyiségére vonatkoztatott nagyobb sejtsűrűség elérését tenné lehetővé. Azonban a mikrohordozó megnövelt koncentrációja okozta nyíróhatások, a közeg tápanyagforrásának csökkenése és a sejteket érő élettani stressz miatt egy sejttenyészeti rendszerben a hordozó koncentrációja meghatározott értékre korlátozott [lásd fent is: Griffiths és munkatársai (1982)].
A találmány szerinti eljárás a sejtek növekedéséhez szükséges optimális körülményeket - beleértve a sejtek táplálását és a sejteket érő lehető legkevesebb stresszt - nyújtja, annak érdekében, hogy a használt rendszerben a lehető legnagyobb sejtsűrűséget érjük el.
A jelen találmány kapcsán úgy találtuk, hogy a tenyészközeg térfogatának a vírusfertőzés előtti vagy utáni csökkentése - mely csökkenés során a sejttenyészet biomasszájában a sejtsűrűség és a mikrohordozó koncentrációja emelkedik - nem befolyásolja a sejtek termelőképességét. Ellenkezőleg, meglepő módon azt is tapasztaltuk, hogy a sejtenként! vírushozam növekedhet az eredeti összenőtt sejttenyészet sejtsűrűségén tartott sejtekhez viszonyítva. Ez rendkívül váratlan volt, mivel a sejttenyészet mikrohordozókoncentrációjának növekedése következtében a sejtek életképességének csökkenése, a sejtek mikrohordozókról való leválása és a magasabb sejtsűrűségből és a vírustermelésből adódó élettani stressz lett volna várható.
A találmány szerinti eljárás lehetőséget ad a tenyészközeg térfogatának csökkentésére, melyet a további vírustisztítási eljárás során amúgy is végre kell hajtani, miközben a sejtek vírustermelése ezzel egyidejűleg azonos marad, vagy éppen emelkedik az eredeti sejttenyészethez képest. A rendszer méretnövelése 6000 literes fermentortérfogatig megtörténhet, amely a vakcina előállításához szükséges vírustermelését jóval hatékonyabbá és időtakarékossá teszi.
Az eljárás egyik megvalósítási módjánál a megkötődést igénylő sejteket a következő adherens sejtek közül választjuk: VERŐ, BHK, CHO, RK, RK44, RK13, MRC-5, MDCK, CEF vagy diploid, egy réteget képző sejtek, mint amilyeneket Reuveny és munkatársai [Develop. Bioi. Standard, 60:243-253. (1985)] írnak le, valamint egyéb, a szakterületen ismert sejtek.
A mikrohordozóra kötött adherens sejteket a szokásos, szérumot tartalmazó tenyésztőközegben növeszthetjük. A találmány egy előnyös megvalósítási módjánál a sejteket szérummentes vagy szérum- és proteinmentes közegben tenyésztjük, mint amilyeneket Kistner és munkatársai [Vaccine, 16:960-968. (1998)], Mértén és munkatársai [Cytotech., 14:47-59. (1994)], Cinatl. és munkatársai [Cell Biology Internat., 17:885-895. (1993)], Kessler és munkatársai [Dev. Bioi. Stand., 98:13-21., (1999)], a WO 96/15231 számú nemzetközi szabadalmi irat és az US 6 100 061 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom írnak le, valamint a tenyésztés történhet bármely más, a szakterületen ismert szérummentes vagy szérum- és proteinmentes közegben. Az ampullából a sejteket a nagy mennyiségű biomassza eléréséhez előnyösen szérummentes vagy szérum- és proteinmentes közegben növesztjük.
A találmány egyik megvalósítási módja szerint a mikrohordozóra kötött adherens sejttenyészetet összenövesztjük, és az összenőtt (konfluens) sejttenyészetet
- miután megnöveltük a biomasszájának sejtsűrűségét és mikrohordozókoncentrációját - vírussal fertőzzük.
A találmány egyik megvalósítási módja szerint a mikrohordozóra kötött adherens sejttenyészetet összenövesztjük, és az összenőtt (konfluens) sejttenyészetet
- biomasszájának sejtsűrűsége és mikrohordozókoncentrációja növelése előtt - vírussal fertőzzük. Akár a tenyészet betöményítése előtt, akár azután fertőzzük vírussal a megemelt sejtsűrűségű és mikrohordozókoncentrációjú sejttenyészetet, a biomassza sejtsűrűségét és mikrohordozójának koncentrációját a vírus szaporítása és termelése alatt állandó értéken tartjuk, miközben a közeg térfogatát újra nem növeljük. A vírussal még nem vagy már fertőzött sejttenyészet biomasszájának sejtsűrűségét és mikrohordozókoncentrációját bármely, a szakterületen ismert, a sejttenyészet betöményítésére szolgáló módszerrel növelhetjük. Ilyen eljárás lehet például az ülepítés, centrifugálás, szűrés, perfúziós eszközzel, például szűrővel végzett koncentrálás, amely lehetővé teszi a munkamennyiség csökkentését, vagy a betöményítés történhet kettő vagy több bioreaktor tartalmának összegyűjtésével.
Az összenőtt sejttenyészet sejtsűrűségét és mikrohordozókoncentrációját növeljük, amikor is a növekedés mértéke az eredeti összenőtt biomasszához viszonyítva legalább 1,3-szeres kell legyen. Az összenövesztett eredeti, kiinduló sejttenyészet sejtsűrűsége 0,6* 10®-7,0*10® sejt/ml lehet. Ebben az esetben a kiindulótenyészethez képest megnövelt sejtsűrűségű biomassza sejtsűrűsége legalább 0,8* 10®-9,0*10® sejt/ml.
A mikrohordozó koncentrációja a kiinduló sejttenyészetben előnyösen a 0,5-7,0 g/l tartományba esik. A mikrohordozó koncentrációja az összenőtt biomassza betöményítése után előnyösen 0,65-21 g/l.
A találmány eljárása szerint előnyösen dextrán-, kollagén-, polisztirol-, poliakrilamid-, zselatin-, üveg-, cellulóz-, polietilén- és műanyagalapú mikrohordozókat használunk, illetve melyeket Miller és munkatársai [Advances in Biochem Eng./Biotech., 39:73-95. (1989)] és Butler [Spier és Griffiths szerk., „Animál cell Biotechnology”, 3. kötet, 283-303. (1988)] írnak le.
A találmány egyik megvalósítási módja szerint a vírusokat a következők közül választjuk: influenzavírus, Ross River vírus, hepatitis A vírus, vacciniavírus és rekombináns vacciniavírus, herpes simplex vírus, japán encephalitis vírus, West Nile vírus, a sárgaláz vírusa és ezek kimérái, valamint a rhino- és reovírus. A szakem3
HU 225 791 bér ki tudja választani az adherens gazdasejtet és a termeléshez alkalmas vírust, valamint alkalmazni a találmány szerinti eljárást a kívánt vírus megemelkedett vírushozamának elérésére.
A szakember képes megválasztani a mikrohordozó megfelelő típusát, a kiindulási tenyészet mikrohordozókoncentrációját, a vírusra érzékeny adherens sejteket, a közeget és az optimális növekedési körülményeket nevezetesen az oxigénkoncentrációt, a közeg kiegészítő anyagait, a hőmérsékletet, a kémhatást (pH), a nyomást, a keverési sebességet, a tápanyagellátás szabályozását -, hogy megkapja azt az összenőtt sejttenyészetű biomasszát, melyet a találmány szerinti eljárás során felhasználhat a megnövelt sejtsűrűségű és mikrohordozókoncentrációjú biomassza előállításához. Ez a megnövelt sejtsűrűségű sejttenyészet alkalmas azután a tényleges virusszaporitásra és -termelésre. Miután a sejttenyészet elérte a konfluens állapotot, a találmány szerinti eljárás lehetővé teszi a legalább 1,3-10-szeres sejtsűrűségű és mikrohordozókoncentrációjú sejttenyészet előállítását és a tenyészközeg mennyiségére vonatkoztatott magasabb vírushozam elérését, (i) a közeg csökkent mennyiségének és (ii) a sejtenként! megnövekedett termelőképességnek köszönhetően.
A vírustermelés folyamata és a termelés időtartama az alkalmazott rendszertől függ. Az adott rendszerben elérhető lehető legnagyobb vírushozam a szokásos módszerekkel határozható meg. Amennyiben elértük a maximális vírustermelési hozamot, a vírust és/vagy a vírust tartalmazó sejteket összegyűjtjük. Ezért a találmány szerinti eljárás magában foglalja az elszaporított és termelődött vírus összegyűjtésének lépését is.
A találmány egy másik tárgyát képezi a tisztított vírus vagy vírusantigén előállításának eljárása, mely eljárás az alábbi lépésekből áll: a mikrohordozóra kötött adherens sejtek tenyészetének elkészítése; a sejttenyészet összefüggővé növesztése; ezen sejtek vírussal történő fertőzése, mely során a sejtsűrűséget (i) a vírusfertőzés előtt vagy (ii) a vírusfertőzés után a sejttenyészetben megnöveljük; a vírussal fertőzött sejttenyészet inkubálása a nevezett vírus elszaporitásához; a termelt vírus összegyűjtése és az említett összegyűjtött vírus tisztítása.
A fertőzéshez és szaporításhoz használt vírus természetétől függően a termelődött vírus vagy a sejttenyészet felülúszójában, és/vagy a sejt biomasszájában található. A litikus vírusok, mint amilyen az influenzavírus, a fertőzés után meghatározott idővel feloldják a sejteket, és kijutnak a sejttenyészet közegébe. A termelt és a sejttenyészetközegbe kijutott vírust a sejtes biomasszától vagy egyéb sejtalkotórészektől a szokásos módszerekkel - mint amilyen a centrifugálás, beleértve az ultracentrifugálást és a sűrűséggradiens centrifugálást, mikroszűrés, ultraszűrés, ioncserélő kromatográfia stb. - elkülönítjük, majd tisztítjuk.
A nem litikus vírusok a sejtekben szaporodnak, és a biomassza sejtjeiben maradnak. Ezeket a vírusokat a biomassza gyűjtésével és a sejtek szokásos módszerekkel történő feltárásával nyerhetjük ki, mint amilyen a sejtek detergenssel való kezelése, melegítése, lefagyasztása/felengedése, ultrahangos kezelése, French présben történő feltárása vagy egyéb eljárások. A sejtekből kiszabadult vírusokat összegyűjtjük, betöményítjük és tisztítjuk. A tisztítást bármely, a szakterületen ismert eljárás szerint végezhetjük, mint amilyen az ultraszűrés, az ioncserélő kromatográfia vagy az izopignikus centrifugálás stb.
Az influenzavírust szaporíthatjuk sejtvonalakon, beleértve a leghatékonyabb MDCK sejteket, valamint a humán vakcinák gyártásánál engedélyezett Verő sejteket. Az influenzavírus bioreaktorban, mikrohordozógyöngyökre kötött emlőssejttenyészeten, szérummentes vagy szérum- és proteinmentes közegben történő, nagyléptékű termelését és az influenzavírus elleni vakcina kifejlesztését már leírták [Mértén és munkatársai, Dev. Bioi. Stand., 98:23-37. (1999); Kistner és munkatársai, Vaccine 16:960-968. (1998); Kistner és munkatársai, Dev. Bioi. Stand., 98:101-110. (1999); és WO 96/15231 számú nemzetközi szabadalmi irat].
A találmány egyik tárgyát képezi az influenzavírus termelésére szolgáló eljárás, amely a következő lépésekből áll: a mikrohordozóra kötött adherens sejtek tenyészetének elkészítése; a sejttenyészet összefüggővé növesztése; ezen sejtek influenzavírussal történő fertőzése, mely során a sejtsűrűséget (i) a vírusfertőzés előtt vagy (ii) a vírusfertőzés után a sejttenyészetben megnöveljük; az influenzavírussal fertőzött sejttenyészet inkubálása a vírus elszaporitásához. Az influenzavírussal fertőzött sejtek lehetnek VERŐ vagy MDCK sejtek vagy bármely, az influenzavírusra érzékeny sejt. A találmány egyik előnyös megvalósítási módjánál VERŐ sejteket használunk az influenzavírus szaporítására. A találmány előnyös megvalósításánál a VERŐ sejteket az eredeti ampullából a biomassza termeléséhez szérummentes vagy szérum- és proteinmentes közegben tenyésztjük. A mikrohordozóra kötött VERŐ sejteket a megfelelő közegben összenövesztjük, és a sejtsűrűséget és a mikrohordozó koncentrációját legalább 1,3-szeresére növeljük. A sejteket vagy a sejtsűrűség növelése előtt, vagy azt követően fertőzzük az influenzavírussal. A fertőzött, megnövelt sejtsűrűségű biomassza inkubálása és vírustermelése után a termelt influenzavírust vagy az influenzavírus antigénjét összegyűjtjük. Az összegyűjtött vírust a szakterületen ismert módon tovább tisztítjuk, például Kistner és munkatársai (1998, lásd fent) által vagy az US 6 048 537 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalomban leírtaknak megfelelően.
A találmány egy másik tárgyát képezi a mikrohordozóra kötött adherens sejtek megnövelt sejtsűrűségű tenyészetének biomasszája, ahol a sejttenyészetben a biomassza sejtsűrüsége legalább 1,3-szer nagyobb, mint a konfluens sejttenyészetben. A mikrohordozóra kötött sejteket a következő, megkötődést igénylő sejtek közül választjuk: VERŐ, BHK, CHO, RK, RK44, RK13, MRC-5, MDCK, CEF vagy diploid, egy réteget képző sejtek. A megnövelt sejtsűrüségű sejttenyészet biomasszája előnyösen a VERŐ sejtek tenyészete.
A találmány egyik előnyös megvalósítási módja szerint a sejttenyészet biomasszáját szérummentes
HU 225 791 közegben tenyésztjük, mely közeg semmilyen szérumból származó összetevőt vagy anyagot nem tartalmaz. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint a biomassza szérum- és proteinmentes, és semmilyen közeghez adott szérumszármazékot vagy proteint nem tartalmaz. Az ampullából a biomassza előállításához az eredeti sejteket előnyösen szérummentes vagy szérum- és proteinmentes közegben tenyésztjük. A megnövelt sejtsűrűségű biomasszát a vírusszaporítás és vírustermelés alatt szérummentes vagy szérum- és proteinmentes közegben tartjuk.
A találmány egy másik megvalósítási módjánál az összenövesztett eredeti sejttenyészethez képest megnövelt sejtsűrűségű biomassza sejtjeit vírussal fertőzzük. A megnövelt sejtsűrűségű, vírussal fertőzött biomassza sejtsűrűségét és tenyészközegének térfogatát a vírustermelési eljárás során állandó értéken tartjuk.
A találmány egy másik tárgyát képezi a mikrohordozóra kötött VERŐ sejtek tenyészetének biomasszája, ahol az említett sejttenyészetben a VERŐ sejtek biomasszája és sejtsűrűsége legalább 1,3-szer több, mint a VERŐ sejtek eredeti konfluens sejttenyészetében. Ez a sejttenyészet az összenövesztett tenyészethez képest magasabb mikrohordozókoncentrációval is rendelkezik.
A találmány egyik előnyös megvalósítási módja szerint a megnövelt sejtsűrűséggel rendelkező sejttenyészet biomasszája VERŐ sejtekből áll. A sejteket előnyösen szérummentes közegben növesztjük, és a biomassza előnyösen szérummentes. A találmány egy másik előnyös megvalósítása szerint a biomasszatenyészet szérum- és proteinmentes.
A találmány egy további tárgyát képezi a mikrohordozóra kötött, vírussal fertőzött adherens sejtek megnövelt sejtsűrűségű tenyészetének biomasszája, ahol a nevezett sejttenyészetben a fertőzött sejtek biomasszája legalább 1,3-szerese a fertőzés előtti konfluens tenyészet biomasszájának. A találmány egyik megvalósítási módja szerint a sejttenyészet biomasszája szérummentes. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint a sejttenyészet biomasszája szérum- és proteinmentes. A sejtek előnyösen VERŐ sejtek. A vírussal fertőzött, magasabb sejtsűrűségű biomasszának ez a sejtsűrűsége a vírusszaporító eljárás során nem csökken.
A találmány egy másik tárgyát képezi a mikrohordozóra kötött, vírussal fertőzött VERŐ sejtek megnövelt sejtsűrűségű tenyészetének biomasszája, ahol az említett sejttenyészetben a VERŐ sejtek biomasszája legalább 1,3-szerese a VERŐ sejtek összenövesztett sejttenyészete biomasszájának. A VERŐ sejteket a következő vírusokkal fertőzzük: influenzavírus, Ross River vírus, hepatitis A vírus, vacciniavírus és rekombináns származékai, herpes simplex vírus, japán encephalitis vírus, West Nile vírus, a sárgaláz vírusa és ezek kimérái, valamint rhino- és reovírus.
A találmány egy másik tárgyát képezi a Verő sejtek mikrohordozóra kötött, megnövelt sejtsűrűségű, influenzavírussal fertőzött tenyészetének biomasszája, ahol a VERŐ sejtek nevezett tenyészetének biomasszája legalább 1,3-szerese a VERŐ sejtek összenövesztett sejttenyészete biomasszájának.
A találmány egy másik tárgyát képezi a Verő sejtek mikrohordozóra kötött, megnövelt sejtsűrűségű, Ross River vírussal fertőzött tenyészetének biomasszája, ahol a VERŐ sejtek nevezett tenyészetének biomasszája legalább 1,3-szerese a VERŐ sejtek összenövesztett sejttenyészete biomasszájának.
A találmány egy másik tárgyát képezi a Vera sejtek mikrohordozóra kötött, megnövelt sejtsűrűségű, hepatitis A vírussal fertőzött tenyészetének biomasszája, ahol a VERŐ sejtek nevezett tenyészetének biomasszája legalább 1,3-szerese a VERŐ sejtek összenövesztett sejttenyészete biomasszájának.
A találmány általános leírását követően, az elmondottak szemléltetésére az alábbiakban példákat adunk meg. A példák kizárólag szemléltető célzatúak, a találmány oltalmi körét semmi módon nem korlátozzák.
1. példa
Vírusantigén-termelés betöményített VERŐ sejt biomasszán
a) A sejttenyészet kinövesztése
Termelő sejtvonalként VERŐ sejteket (afrikai Cercopthecus aethiops majom, vese) használunk. A 124 passzázsú ATCC CCL81 jelű sejtek az amerikai törzsgyűjteményből (American Type Cell Culture Collection, Rockville, Maryland, USA) származnak. A sejtek alkalmasak a szérummentes és szérum- és proteinmentes közegben való tenyésztésre, amint azt Kistner és munkatársai (1998, lásd fent), valamint a WO 96/15231 számú nemzetközi szabadalmi Irat, illetve az US 6 100 061 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom leírják. A sejttenyésztéshez DMEM HAM F12 szérummentes alapközeget használunk, szervetlen sókkal, aminosavakkal, nátrium-hidrogénkarbonáttal (2 g/l) és élesztő- vagy szójababkivonattal (0,1-10 g/l) kiegészítve. A munkasejtbank („working cell bank”) előállításához semmilyen állati eredetű közegösszetevőt nem használunk.
A munkasejtbank sejtjeit T-edényekben és forgóedényekben visszük tovább 1:6 vagy 1:8 megosztási arányban. A sejtek további szaporítását 100 literes kevertetett tankreaktorban végezzük, kötőszubsztrátként Cytodex® mikrohordozót használva. A sejteket 37 °C hőmérsékleten 6-8 napon át növesztjük. A tenyésztési körülmények közül az oxigéntelítettséget 20%±10% és a kémhatást pH=7 értéken tartjuk. A biomasszatermelés végeztével, mikor a sejtek már összenőttek (konfluens tenyészetet alkotnak), a reaktor térfogatának egy részét kitevő biomasszát ülepítéssel a kétszeresére betöményítjük, és meghatározzuk a nem betöményített és a betöményített sejttenyészet sejtsűrűségét.
b) A biomassza sejtsűrűségének meghatározása
A biomasszatermelés végeztével a sejttenyészet sejtszámát a sejtek tripszines kezelése után CASY® sejtszámláló segítségével (A eljárás) határozzuk meg, amint azt Schárfe és munkatársai [Blotechnologie in Laborpraxis, 10:1096-1103. (1988)] leírják; vagy a sejtek citromsavas és kristályibolyás kezelését követően,
HU 225 791 azokat hemocitométerrel számláljuk meg (B eljárás), Sanford és munkatársai [J. Natl. Cancer Inst., 11:773-795. (1951)] módszere szerint. A kapott eredményeket az 1. táblázatban foglaljuk össze.
1. táblázat
A biomasszatermelés végeztével kapott összenőtt sejttenyészet és a betöményített összenőtt sejttenyészet sejtszámának meghatározása
| Biomassza- termelés | Betöményített biomassza | |
| A hordozó koncentrációja (g/i) | 5,0 | 10,0 |
| A eljárás szerinti sejtsűrűség (sejt/ml) | 4,6*10® | 9,2*10® |
| S eljárás szerinti sejtsűrűség (sejt/ml) | 5,6*10® | 11,2*10® |
2. példa
Egy konfluens biomassza és egy betöményített konfluens biomassza vírusantigén-termelésének összehasonlítása
A folyékony nitrogén alatt tartott, meghatározott passzázsszámú VERŐ sejteket felengedjük, majd Roux edényben és forgóedényben passzáljuk, hogy egy 1,5 literes bioreaktor beoltásához elegendő sejtet nyerjünk. A végső, 1,5*10® sejtszámú, összenőtt (konfluens) sejttenyészet elérése után a sejteket tripszinnel kezeljük, és 10 literes bioreaktorba visszük át, ezt a tenyészetet pedig egy 100 literes, 1,5 g/l mikrohordozókoncentrációjú bioreaktor beoltásához használjuk. A 107 sejtszámú munkasejtbank-ampullából kiindulva, körülbelül 30 generáció kell a végső, összefüggő Verő sejtekből álló biomassza eléréséhez. A tenyészet végső, összenőtt biomasszájának sejtszáma 1,9*10® sejt/ml. A vírusfertőzést megelőzően két, egyenként 10 literes bioreaktort különböző teljes sejtszámú sejttenyészettel töltünk fel. Az A fermentort 1,9*101° számú sejttel, a B fermentort 3,8* 101° számú sejttel töltjük fel. Hogy a B fermentor feltöltéséhez szükséges magasabb biomassza- és hordozókoncentrációt elérjük, az összenőtt sejttenyészet biomasszáját ülepítéssel kétszeres töménységűre koncentráljuk. Az A fermentor az eredeti összenőtt sejttenyészet biomasszájának 100%-át, míg a B fermentor 200%-át tartalmazza.
a) Az influenzavírus termelése
Az A és B fermentorok sejttenyészetét 0,01 m.o.i. (multiplicity of infection) arányban H3N2 A/Sydney/5/97 vírustörzzsel fertőzzük. Az eljárás körülményei: 32 °C hőmérséklet, 20%-os parciális oxigénnyomás és pH 7,1-es kémhatás. Hogy az influenzavírust a vírusszaporításhoz aktiváljuk, a rendszerhez proteázt adunk, ami lehet például tripszin, pronáz vagy annak tripszinszerű része.
Meghatározzuk a két különböző koncentrációjú biomasszával feltöltött A és B fermentor sejtenyészetének vírusantigén-termelését, és az értékeket az influenzavírus vírustiterének (HAU/ml, hemagglutinációs egység/ml) és az antigéntartalom (sűrűséggradienssel tisztított antigén) alapján összehasonlítjuk egymással. A csúcs alatti terület megfelel a fertőzés utáni 3. napon, a litikus ciklus végeztével kapott antigén-összkoncentrációnak. A kapott eredményeket a 2. táblázat mutatja.
2. táblázat összenőtt VERŐ sejttenyészeten és betöményített összenőtt VERŐ sejttenyészeten termelt influenzavírus titerének és antigéntermelésének meghatározása
| A fermentor | B fermentor | |
| A hordozó koncentrációja | 1,5 g/l | 3,0 g/l |
| Sejtsűrűség (B eljárás, sejt/ml) | 1,9*10® | 3,8*10® |
| HAU/ml | 640 | 2560 |
| Csúcs alatti terület (relatív egységek) | 83,3 (100%) | 412,3 (495%) |
b) A Ross River vírustermelése A fent leírt módon VERŐ sejtekből összenőtt sejttenyészetet állítunk elő 0,6*10® sejt/ml végső sejtsűrűséggel. A vírusfertőzést megelőzően két, egyenként 50 literes bioreaktort különböző teljes sejtszámú biomasszával töltünk fel. Az A fermentort 1,6*10® sejt/ml, a B fermentort 2,3*10® sejt/ml sejtsűrűségű biomasszával töltjük fel, amely 1,5-szerese az összenőtt sejttenyészetű biomasszának. Az A és B fermentorokat Ross River vírussal fertőzzük, és az A és B fermentorok vírusantigén-termelését a fent leírt módon meghatározzuk. A vírustermeléshez a biomassza különböző koncentrációját használva, a kapott vírushozam eredményeit a 3. táblázat a mutatja.
3. táblázat
A Ross River vírus titerének és antigéntermelésének meghatározása
| A fermentor | B fermentor | |
| A hordozó koncentrációja (g/l) | 1,5 | 2,25 |
| Sejtsűrűség (*10® sejt/ml) | 1,6 | 2,3 |
| Vírustiter (lóg TCID50) | 8,71 | 8,95 |
| Vírustiter PFU/10® sejt (*10®) | 321 | 388 |
| Hozam (%) | 100 | 121 |
(PFU - plakkformáló egység)
3. példa
Vírusantigén-termelés RK sejtek betöményített biomasszáján
a) A sejtek tenyésztése
Sejtvonal előállítására az RK-13 jelű nyúlvesesejteket vagy ezek RK-D4R-44 komplementáló származékát használjuk, amint azt Holzer és munkatársai [J. Virol., 71:4997-5002. (1997)] leírják. A sejteket a szo6
HU 225 791 kásos, 2% szérumot tartalmazó közegben tenyésztjük.
A munkasejtbankból a sejteket T-edényekbe és forgóedényekbe 1:6 megosztási arányban visszük tovább. A sejtek további szaporítását 10 literes, kevertetett tankreaktorokban végezzük, kötőszubsztrátként Cytodex® (Pharmacia) mikrohordozót használva.
b) Legyöngített (defektív) vacciniavírus termelése
Miután az RK-13 vagy az RK-D4R-44 sejtek összenőttek, és elérték a végső sejtsűrűséget a tankreaktorban, a biomasszát vacciniavírus WR vagy defektív vacciniavírus vD4-ZG#2 törzzsel m.o.i. 0,01 arányban fertőzzük, amint azt Holzer és munkatársai (1997, lásd fent) leírják. A vírusfertőzést követően két, egyenként 10 literes bioreaktort különböző teljes sejtszámú, fertőzött sejttenyészet biomasszával töltünk fel. Az A fermentort 1,2X 1010 számú sejttel, a B fermentort 3,8* 101° számú sejttel töltjük fel. Hogy a B fermentor feltöltéséhez szükséges magasabb biomassza- és hordozókoncentrációt elérjük, az összenőtt, fertőzött sejttenyészetet ülepítéssel betöményítjük. Az A fermentor az eredeti, összenőtt sejttenyészet biomasszájának 100%-át, míg a B fermentor 200%-át tartalmazza.
Meghatározzuk a különböző koncentrációjú biomasszát tartalmazó A és B fermentorok fertőzött sejtjeinek vírusantigén-termelését. A kapott eredményeket a 4. táblázat tartalmazza.
4. táblázat
Az RK sejteken termelt vacciniavírus titerének meghatározása
| A fermentor | B fermentor | |
| A hordozó koncentrációja (g/l) | 1,5 | 2,5 |
| Sejtsűrűség (χ106 sejt/ml) | 1,2 | 2,4 |
| Vírustiter PFU/106 sejt (χ10θ) | 0,8 | 1,3 |
| Hozam (%) | 100 | 162 |
A fentiekben megadott példák kizárólag szemléltető célzatúak, a találmány oltalmi körét semmi módon nem korlátozzák. A találmány egyéb változatai a szakember előtt nyilvánvalóak, és ezeket a szabadalmi igénypontok magukban foglalják. Minden idézett publikáció, szabadalom és szabadalmi beadvány referenciaként itt beépített.
Claims (25)
1. Eljárás tisztított vírus vagy vírusantigén előállítására, mely eljárás az alábbi lépésekből áll: (a) mikrohordozóra kötött adherens sejtek tenyészetének elkészítése; (b) a sejttenyészet összefüggővé növesztése; (c) ezen sejtek vírussal történő fertőzése, és (d) a vírussal fertőzött sejttenyészet inkubálása a nevezett vírus elszaporításához, mely során a sejtsűrűséget (i) a (c) lépés előtt vagy (ii) a (c) lépés után a sejttenyészetben megnöveljük; és a sejtsűrűséget a (d) lépés során állandó szinten tartjuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol az összenőtt sejttenyészet sejtsűrűségét legalább 1,3-szeresére töményítjük.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, ahol az összenőtt sejttenyészet sejtsűrűsége legalább 0,6x106-7,0x106 sejt/ml.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol dextrán-, kollagén-, polisztirol-, poliakrilamid-, zselatin-, üveg-, cellulóz-, polietilén- és műanyagalapú mikrohordozókat használunk.
5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a mikrohordozó koncentrációja az (a) lépésben 0,5—14 g/l.
6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a mikrohordozóra kötött sejteket a következő, megkötődést igénylő sejtek közül választjuk: VERŐ, BHK, CHO, RK, RK44, RK13, MRC-5, MDCK, CEF vagy diploid, egy réteget képző sejtek.
7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol az említett, mikrohordozóra kötött sejteket szérummentes közegben tenyésztjük.
8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol az említett, mikrohordozóra kötött sejteket szérum- és proteinmentes közegben tenyésztjük.
9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a vírust az alábbiak közül választjuk ki: influenzavírus, Ross River vírus, hepatitis A vírus, vacciniavírus és rekombináns származékai, herpes simplex vírus, japán encephalitis vírus, West Nile vírus, a sárgaláz vírusa és ezek kimérái, valamint rhino- és reovírus.
10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, mely (e) lépésként magában foglalja a termelt vírus összegyűjtését Is.
11. A 10. igénypont szerinti eljárás, mely (f) lépésként magában foglalja az összegyűjtött vírus tisztított vírust vagy vírusantigént eredményező tisztítását is.
12. A 10. vagy 11. igénypont szerinti eljárás, ahol a termelt vírust a sejttenyészet felülúszójából gyűjtjük össze.
13. A 10. vagy 11. igénypont szerinti eljárás, ahol a termelt vírust a biomasszából gyűjtjük össze.
14. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a termelt vírus vagy vírusantigén az influenzavírus, illetve antigénje.
15. A 14. igénypont szerinti eljárás, ahol az említett sejtek VERŐ sejtek.
16. A 14. igénypont szerinti eljárás, ahol az említett sejtek MDCK sejtek.
17. Mikrohordozóra kötött adherens sejtek tenyészetének biomasszája, ahol az említett sejttenyészetben a sejtek biomasszája legalább 1,3-szerese, mint az eredeti konfluens sejttenyészetben, ahol az említett sejttenyészet szérummentes.
18. A 17. igénypont szerinti sejttenyészet, ahol az említett sejtek VERŐ sejtek.
19. A 17. vagy 18. igénypont szerinti sejttenyészet, ahol az említett tenyészet szérum- és proteinmentes.
HU 225 791
20. A 17-19. igénypontok bármelyike szerinti tenyészet, ahol az említett sejtek vírussal fertőzöttek.
21. A 20. igénypont szerinti tenyészet, ahol az említett tenyészetben a fertőzött sejtek biomasszája legalább 1,3-szer több, mint a fertőzés előtti konfluens sejttenyészetben.
22. A 20. vagy 21. igénypont szerinti tenyészet, ahol a vírust a következők közül választjuk ki: influenzavírus, Ross River vírus, hepatitis A vírus, vacciniavírus és rekombináns származékai, herpes simplex ví rus, japán encephalitis vírus, West Nile vírus, a sárga láz vírusa és ezek kimérái, valamint rhino- és reovirus
23. A 20-22. igénypontok bármelyike szerinti te 5 nyészet, ahol a vírus az influenzavírus.
24. A 20-22. igénypontok bármelyike szerinti te nyészet, ahol a vírus a Ross River vírus.
25. A 20-22. igénypontok bármelyike szerinti te nyészet, ahol a vírus a vacciniavírus.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US10/006,881 US6951752B2 (en) | 2001-12-10 | 2001-12-10 | Method for large scale production of virus antigen |
| PCT/EP2002/014011 WO2003054174A1 (en) | 2001-12-10 | 2002-12-10 | Method for large scale production of virus antigen |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP0402415A2 HUP0402415A2 (hu) | 2005-02-28 |
| HUP0402415A3 HUP0402415A3 (en) | 2005-07-28 |
| HU225791B1 true HU225791B1 (en) | 2007-09-28 |
Family
ID=21723079
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0402415A HU225791B1 (en) | 2001-12-10 | 2002-12-10 | Method for large scale production of virus antigen |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6951752B2 (hu) |
| EP (3) | EP1894998A1 (hu) |
| JP (2) | JP4370511B2 (hu) |
| CN (2) | CN100335619C (hu) |
| AT (1) | ATE447010T2 (hu) |
| AU (1) | AU2002358662B2 (hu) |
| CA (1) | CA2469644C (hu) |
| DE (2) | DE60234211D1 (hu) |
| DK (2) | DK2330189T3 (hu) |
| ES (2) | ES2488818T3 (hu) |
| FR (1) | FR10C0026I1 (hu) |
| HK (2) | HK1115609A1 (hu) |
| HU (1) | HU225791B1 (hu) |
| MX (1) | MXPA04005644A (hu) |
| NO (1) | NO20042910L (hu) |
| PL (1) | PL208232B1 (hu) |
| RU (1) | RU2314344C2 (hu) |
| WO (1) | WO2003054174A1 (hu) |
Families Citing this family (60)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004022729A1 (en) | 2002-09-05 | 2004-03-18 | Bavarian Nordic A/S | Method for the cultivation of primary cells and for the amplification of viruses under serum free conditions |
| US7445924B2 (en) | 2000-11-23 | 2008-11-04 | Bavarian Nordic A/S | Modified Vaccinia Ankara virus variant and cultivation method |
| US6951752B2 (en) * | 2001-12-10 | 2005-10-04 | Bexter Healthcare S.A. | Method for large scale production of virus antigen |
| SI1407006T1 (sl) * | 2001-12-20 | 2006-04-30 | Bavarian Nordic As | Postopek za ponovno pridobivanje in ciscenje poksvirusov iz inficiranih celic |
| TWI312368B (en) * | 2002-12-23 | 2009-07-21 | Bristol Myers Squibb Compan | Mammalian cell culture processes for protein production |
| EP1697505A1 (en) * | 2003-12-23 | 2006-09-06 | Schering Corporation | Methods for producing a549 cell lines stable in serum-free medium suspension culture |
| AU2005214090B2 (en) | 2004-02-23 | 2008-09-11 | Crucell Holland B.V. | Virus purification methods |
| US8221969B2 (en) * | 2004-04-19 | 2012-07-17 | Sanyo Chemical Industries, Ltd. | Method of producing virus |
| CN101094915A (zh) * | 2004-05-20 | 2007-12-26 | 益得生物医学公司 | 生产流感疫苗的方法 |
| US7344839B2 (en) * | 2004-12-23 | 2008-03-18 | Aurx, Inc. | Virus preparations and methods |
| EP1831353B1 (en) | 2004-12-23 | 2012-02-29 | MedImmune, LLC | Non-tumorigenic mdck cell line for propagating viruses |
| US9254318B2 (en) | 2006-03-31 | 2016-02-09 | Wisconsin Alumni Research Foundation | High titer recombinant influenza viruses for vaccines |
| WO2008105931A2 (en) * | 2006-09-15 | 2008-09-04 | Medimmune Vaccines, Inc. | Mdck cell lines supporting viral growth to high titers and bioreactor process using the same |
| JP5084214B2 (ja) * | 2006-09-29 | 2012-11-28 | 一般財団法人日本ポリオ研究所 | Ｉｐｖワクチン |
| WO2008135230A1 (en) * | 2007-05-04 | 2008-11-13 | Baxter International Inc. | Two-step temperature profile for the propagation of viruses |
| US9474798B2 (en) | 2007-06-18 | 2016-10-25 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Influenza M2 protein mutant viruses as live influenza attenuated vaccines |
| EP2257634A1 (en) * | 2008-03-12 | 2010-12-08 | Wyeth LLC | Method for identifying cells suitable for large-scale production of recombinant proteins |
| EP2318044B1 (en) * | 2008-08-01 | 2015-12-02 | Gamma Vaccines Pty Limited | Influenza vaccines |
| CN102215865B (zh) | 2008-09-24 | 2013-10-30 | 米迪缪尼有限公司 | 病毒纯化方法 |
| CN102216450B (zh) * | 2008-09-24 | 2014-05-14 | 米迪缪尼有限公司 | 培养细胞、增殖和纯化病毒的方法 |
| CA2973863C (en) | 2009-07-31 | 2022-05-17 | Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. | High yield yellow fever virus strain with increased propagation in cells |
| JP2013507990A (ja) | 2009-10-26 | 2013-03-07 | ダブリュエーアールエフ−ウィスコンシン アラムナイ リサーチ ファウンデーション | ベロ細胞において増強された複製を有する高力価の組換えインフルエンザウイルス |
| CN102782121A (zh) * | 2009-12-23 | 2012-11-14 | 赛诺菲巴斯德有限公司 | 用于培养贴壁细胞的方法 |
| US10130697B2 (en) | 2010-03-23 | 2018-11-20 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Vaccines comprising mutant attenuated influenza viruses |
| JP2013523175A (ja) | 2010-04-14 | 2013-06-17 | イーエムディー・ミリポア・コーポレーション | 高力価、高純度のウイルスストックの作製方法及びその使用方法 |
| US9677042B2 (en) | 2010-10-08 | 2017-06-13 | Terumo Bct, Inc. | Customizable methods and systems of growing and harvesting cells in a hollow fiber bioreactor system |
| CN101979517B (zh) * | 2010-10-15 | 2011-12-28 | 普莱柯生物工程股份有限公司 | 一种利用生物反应器大规模生产流感病毒的方法 |
| WO2012100302A1 (en) | 2011-01-27 | 2012-08-02 | Gamma Vaccines Pty Limited | Combination vaccines |
| CN102492659A (zh) * | 2011-11-14 | 2012-06-13 | 成都康华生物制品有限公司 | 一种疫苗生产用甲肝病毒的生产方法 |
| US9950057B2 (en) | 2013-07-15 | 2018-04-24 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | High titer recombinant influenza viruses with enhanced replication in MDCK or vero cells or eggs |
| CN103387958B (zh) * | 2013-08-16 | 2016-04-06 | 北京科兴中维生物技术有限公司 | 人胚肺成纤维细胞sv-7在病毒培养中的应用 |
| US9617506B2 (en) | 2013-11-16 | 2017-04-11 | Terumo Bct, Inc. | Expanding cells in a bioreactor |
| EP3613841B1 (en) | 2014-03-25 | 2022-04-20 | Terumo BCT, Inc. | Passive replacement of media |
| WO2015196150A2 (en) | 2014-06-20 | 2015-12-23 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Mutations that confer genetic stability to additional genes in influenza viruses |
| EP3198006B1 (en) | 2014-09-26 | 2021-03-24 | Terumo BCT, Inc. | Scheduled feed |
| BR112017015728A2 (pt) | 2015-01-26 | 2018-03-13 | Ube Industries, Ltd. | método de produção de substância |
| WO2016121773A1 (ja) | 2015-01-26 | 2016-08-04 | 宇部興産株式会社 | ポリイミド多孔質膜を用いる細胞の大量培養方法、装置及びキット |
| US10633422B2 (en) | 2015-06-01 | 2020-04-28 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Influenza virus replication by inhibiting microRNA lec7C binding to influenza viral cRNA and mRNA |
| WO2017004592A1 (en) | 2015-07-02 | 2017-01-05 | Terumo Bct, Inc. | Cell growth with mechanical stimuli |
| WO2017007839A1 (en) | 2015-07-06 | 2017-01-12 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Improved influenza virus replication for vaccine development |
| CN109477074B (zh) | 2016-02-19 | 2023-01-24 | 威斯康星旧生研究基金会 | 用于疫苗开发的改进的乙型流感病毒复制 |
| US11965175B2 (en) | 2016-05-25 | 2024-04-23 | Terumo Bct, Inc. | Cell expansion |
| US11685883B2 (en) | 2016-06-07 | 2023-06-27 | Terumo Bct, Inc. | Methods and systems for coating a cell growth surface |
| US11104874B2 (en) | 2016-06-07 | 2021-08-31 | Terumo Bct, Inc. | Coating a bioreactor |
| CN109477056A (zh) | 2016-07-25 | 2019-03-15 | 宇部兴产株式会社 | 虹吸式培养法 |
| JP6841282B2 (ja) | 2016-07-25 | 2021-03-10 | 宇部興産株式会社 | 細胞培養モジュール |
| EP3656842A1 (en) | 2017-03-31 | 2020-05-27 | Terumo BCT, Inc. | Cell expansion |
| US11624046B2 (en) | 2017-03-31 | 2023-04-11 | Terumo Bct, Inc. | Cell expansion |
| SG11202005528PA (en) * | 2018-01-18 | 2020-07-29 | Yisheng Biopharma Singapore Pte Ltd | Method for adapting influenza viruses to vero cells |
| WO2019155492A1 (en) * | 2018-02-07 | 2019-08-15 | Bharat Biotech International Limited | A process for enterovirus purification and inactivation and vaccine compositions obtained thereof |
| JP2022527235A (ja) | 2019-01-23 | 2022-06-01 | 義裕 河岡 | インフルエンザウイルスにおける付加的遺伝子に遺伝的安定性を付与する突然変異 |
| KR102228267B1 (ko) * | 2019-01-25 | 2021-03-17 | 바이로큐어 주식회사 | Bhk-21 세포를 이용한 바이러스 생산방법 |
| WO2020153619A1 (ko) * | 2019-01-25 | 2020-07-30 | 바이로큐어 주식회사 | Bhk-21 세포를 이용한 바이러스 생산방법 |
| JP2022522112A (ja) | 2019-02-08 | 2022-04-14 | ウィスコンシン アルムニ リサーチ ファンデイション | ヒト化細胞系 |
| SG11202108435WA (en) * | 2019-02-15 | 2021-08-30 | Ology Bioservices Inc | Method for virus production |
| US11390649B2 (en) | 2019-05-01 | 2022-07-19 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Influenza virus replication for vaccine development |
| TW202122572A (zh) | 2019-08-09 | 2021-06-16 | 日商宇部興產股份有限公司 | 胞外體的產生方法 |
| TW202122569A (zh) | 2019-08-09 | 2021-06-16 | 日商宇部興產股份有限公司 | 應用小片多孔膜的細胞培養法 |
| JP2022551805A (ja) | 2019-08-27 | 2022-12-14 | ウィスコンシン アルムニ リサーチ ファンデイション | 卵内複製のための安定化されたｈａを持つ組換えインフルエンザウイルス |
| CN111850169B (zh) * | 2020-07-16 | 2022-09-27 | 华农（肇庆）生物产业技术研究院有限公司 | 一种计算AIV在MDCK-sus细胞中细胞单位均产毒量的方法 |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4525349A (en) | 1981-12-29 | 1985-06-25 | Societe Anonyme Dite: Institut Merueux | Process for the large-scale production of a vaccine against poliomyelitis and the resulting vaccine |
| AT393356B (de) | 1989-12-22 | 1991-10-10 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung von fsme-virus-antigen |
| US5719051A (en) * | 1989-12-22 | 1998-02-17 | Immuno Aktiengesellschaft | Perfusion system and a method for the large scale production of virus or virus antigen |
| FR2723740B1 (fr) | 1994-08-16 | 1996-11-08 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Procede de preparation d'antigenes du virus grippal, antigenes obtenus et leurs applications |
| US5824536A (en) * | 1994-08-23 | 1998-10-20 | St. Jude Children's Research Hospital | Influenza virus replicated in mammalian cell culture and vaccine production |
| WO1996015231A2 (en) | 1994-11-10 | 1996-05-23 | Immuno Aktiengesellschaft | Method for producing biologicals in protein-free culture |
| DE19612966B4 (de) * | 1996-04-01 | 2009-12-10 | Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh & Co. Kg | MDCK-Zellen und Verfahren zur Vermehrung von Influenzaviren |
| GB2319413B (en) * | 1996-11-12 | 2001-06-06 | Lsi Logic Corp | Driver circuits |
| US6168944B1 (en) * | 1997-01-31 | 2001-01-02 | Schering Corporation | Methods for cultivating cells and propagating viruses |
| WO1998033886A1 (en) * | 1997-01-31 | 1998-08-06 | Schering Corporation | Methods for cultivating cells and propagating viruses |
| AT407255B (de) | 1997-06-20 | 2001-02-26 | Immuno Ag | Rekombinanter zellklon mit erhöhter stabilität in serum- und proteinfreiem medium und verfahren zur gewinnung des stabilen zellklons |
| US5994134A (en) * | 1998-05-04 | 1999-11-30 | Canji, Inc. | Viral production process |
| US6951752B2 (en) * | 2001-12-10 | 2005-10-04 | Bexter Healthcare S.A. | Method for large scale production of virus antigen |
| US6855535B2 (en) * | 2001-12-10 | 2005-02-15 | Baxter Healthcare S.A. | Method of large scale production of Hepatitis A virus |
-
2001
- 2001-12-10 US US10/006,881 patent/US6951752B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-12-10 PL PL373487A patent/PL208232B1/pl unknown
- 2002-12-10 HU HU0402415A patent/HU225791B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2002-12-10 CA CA2469644A patent/CA2469644C/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-12-10 ES ES10011842.1T patent/ES2488818T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-12-10 DE DE60234211T patent/DE60234211D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-12-10 DK DK10011842.1T patent/DK2330189T3/da active
- 2002-12-10 MX MXPA04005644A patent/MXPA04005644A/es active IP Right Grant
- 2002-12-10 WO PCT/EP2002/014011 patent/WO2003054174A1/en active Application Filing
- 2002-12-10 CN CNB028279778A patent/CN100335619C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2002-12-10 EP EP07021348A patent/EP1894998A1/en not_active Withdrawn
- 2002-12-10 EP EP02792957.9A patent/EP1453956B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-12-10 DE DE122010000025C patent/DE122010000025I1/de active Pending
- 2002-12-10 DK DK02792957T patent/DK1453956T3/da active
- 2002-12-10 EP EP10011842.1A patent/EP2330189B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-12-10 ES ES02792957.9T patent/ES2335395T5/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-12-10 JP JP2003554878A patent/JP4370511B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2002-12-10 CN CN2007101271424A patent/CN101100657B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2002-12-10 RU RU2004121178/13A patent/RU2314344C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2002-12-10 AU AU2002358662A patent/AU2002358662B2/en not_active Expired
- 2002-12-10 AT AT02792957T patent/ATE447010T2/de active
-
2004
- 2004-07-09 NO NO20042910A patent/NO20042910L/no not_active Application Discontinuation
-
2005
- 2005-03-17 US US11/084,485 patent/US7524676B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2008
- 2008-06-02 HK HK08106127.5A patent/HK1115609A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2009
- 2009-07-02 JP JP2009157882A patent/JP5021000B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2010
- 2010-04-16 FR FR10C0026C patent/FR10C0026I1/fr active Active
-
2011
- 2011-12-07 HK HK11113237.3A patent/HK1158691A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU225791B1 (en) | Method for large scale production of virus antigen | |
| CA2455189C (en) | Methods for producing an active constituent of a pharmaceutical or a diagnostic agent in an mdck cell suspension culture | |
| AU2002338666B2 (en) | Multiplication of viruses in a cell culture | |
| JP6244294B2 (ja) | 細胞を培養するための動物性タンパク質非含有培地 | |
| AU2001236042B9 (en) | Cell usable in serum-free culture and suspension culture and process for producing virus for vaccine by using the cell | |
| KR20100017593A (ko) | 바이러스의 증식을 위한 ２-단계 온도 프로파일 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| TH4A | Erratum | ||
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |