ES2335395T3 - Metodo mejorado para la produccion a escala de antigenos virales. - Google Patents
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Abstract
Método para la producción de virus o antígenos virales que comprende los pasos de (a) proporcionar un cultivo de células adherentes unidas a un microportador, (b) desarrollar el cultivo celular hasta alcanzar la confluencia, (c) infectar las células con un virus y (d) incubar dicho cultivo de células infectadas por dicho virus para la propagación de éste, caracterizado porque la densidad celular de la biomasa del cultivo celular desarrollado hasta alcanzar la confluencia aumenta (i) antes del paso (c), o (ii) después del paso (c) y se mantiene a una densidad celular elevada durante el paso (d).
Description
Método mejorado para la producción a gran escala
de antígenos virales.
La presente invención se refiere a métodos
mejorados para la producción de antígenos virales en un cultivo de
células adherentes unidas a un microportador, caracterizada porque
los métodos prevén un aumento de la producción por volumen del
antígeno viral en el medio de cultivo. La invención se refiere
asimismo a una biomasa de cultivo celular de células adherentes con
una densidad celular y una concentración de microportadores
incrementada en comparación con el cultivo celular confluente
respectivo.
La producción eficaz de vacunas requiere el
desarrollo de cantidades a gran escala de virus producidos en
grandes cantidades a partir de un sistema huésped. Las condiciones
de cultivo en las que se desarrolla una cepa viral son muy
importantes en lo que se refiere a conseguir una producción
aceptablemente alta de la cepa. Así, con el fin de maximizar la
producción del virus deseado, tanto el sistema como las condiciones
de cultivo se deben adaptar específicamente con el fin de
proporcionar un entorno que sea ventajoso para la producción del
virus deseado. Por tanto, para lograr una producción aceptablemente
elevada de las diversas cepas virales, es necesario un sistema que
proporcione condiciones óptimas de crecimiento para una gran
cantidad de virus diferentes.
El único proceso que es económicamente viable es
un proceso en reactor, ya que la ampliación a escala se puede
adecuar al tamaño del mercado y a las dosis de vacunas necesarias.
En cuanto a las células adherentes, el proceso para preparar el
soporte con un microportador clásico es actualmente la mejor
elección para cultivos a gran escala de aquellas células necesarias
para la propagación viral (Van Wezel y col., 1967. Nature
216:64-65; Van Wezel y col., 1978. Process Biochem.
3:6-8). Se ha descrito la producción mediante
procesos a gran escala del virus de la poliomielitis, virus de la
Hepatitis A, VHS o virus de la enfermedad de Mareck en un
microportador (US 4.525.349; Widell y col., 1984. J. Virological
Meth. 8:63-71; Fiorentine y col., 1985. Develop.
Biol. Standard 60:421-430; Griffiths y col., 1982.
Develop. Biol. Standard. 50:103-110). Los procesos
actuales basados en el cultivo en microportadores permiten la
producción de virus mediante fermentadores de un tamaño que alcanza
los 1.200 l.
Caij y col. (1989, Arch. Virol. 105:
113-118) compararon las producciones del virus
titulado del Cólera Porcino en cultivos en microportadores con los
cultivos convencionales monocapa y descubrieron que, mediante la
utilización del sistema microportador, se podía obtener una
producción más elevada de virus por volumen de medio de cultivo.
Griffiths y col. (1982, Develop. Biol. Standard.
50:103-110) estudiaron la influencia de la
concentración de microportadores sobre el crecimiento celular y la
producción de VSH. Se descubrió que era necesaria una concentración
óptima de microportadores para alcanzar una alta densidad celular,
lo que influía también en la producción viral obtenida. Sin
embargo, concentraciones más altas de microportador en un sistema de
perfusión resultaron en una pérdida celular debido a que la capa
celular se desprendía de las perlas.
Además, Kistner y col. (Alternativen Zu
Tierexperimenten, Alemania 2001, vol. 18, nº 1, páginas 50 a 54)
describen la producción en cultivo de la vacuna contra la gripe en
fermentadores bajo condiciones exentas de suero; Kistner y col.
(Wiener Klinische Wochenschrift, New York, NY, US, vol. 111, nº 5,
1999, páginas 207 a 214) describen la producción de la vacuna
contra la gripe en cultivos de células VERO bajo condiciones exentas
de suero; y Barett y col. (Aids Research And Human Retroviruses,
New York, NY, US. vol. 5, nº 2, 1989, páginas 159 a 172) describen
la producción y purificación a gran escala de las glicoproteínas de
la envoltura del VIH-1. Además, la WO 91/09935
describe la producción del virus de la FSME por medio de células
VERO unidas a un sustrato; Percheson y col. (Developments In
Biological Standardization, vol. 98, 1999, páginas 127 a 132)
describen un estudio clínico en adultos sanos utilizando una vacuna
contra la gripe derivada de virus desarrollados en cultivo celular;
y Sharkey y col. (Journal Of Virology, vol. 75, nº 6, 2001, páginas
2653 a 2659) describen una línea celular estable que produce el
retrovirus glicoproteico-pseudotipado del
alfavirus.
La productividad del proceso de producción viral
en el sistema microportador depende del virus, de las células, del
tipo de microportador y de la densidad celular obtenida en el
sistema. Concentraciones más elevadas de microportador en el
cultivo celular permiten cantidades totales más elevadas de células.
Sin embargo, los microportadores son caros y, en estas condiciones,
puede tener lugar una pérdida celular debido a que las capas
celulares se desprenden de las perlas por el esfuerzo de cizalla que
aparece en el sistema. Esto implica que, para producciones virales
más elevadas, es necesario un mayor volumen de cultivo celular en
los microportadores, sin embargo, esto aumenta los esfuerzos que se
deben realizar para procesar y purificar dichos grandes
volúmenes.
En cuanto a la propagación viral, es importante
alcanzar una densidad celular óptima para obtener la máxima
producción viral. También es importante permitir la adsorción eficaz
del virus en las células. Por tanto, en los métodos convencionales,
el volumen del medio de cultivo se reduce antes de la infección para
permitir la adsorción del virus en las células en un volumen mínimo
de cultivo y para obtener una mejor relación entre el virus y las
células. Sin embargo, para obtener una propagación óptima del virus,
el volumen del medio de cultivo se incrementa de nuevo después de
un tiempo de adsorción adecuado para que las células puedan mantener
su viabilidad y/o desarrollo. Esto, sin embargo, aumenta el volumen
del medio de cultivo que incluye las células y/o virus, lo que
tiene el inconveniente de que se deben procesar grandes volúmenes
para la purificación posterior del virus procedente de las células
o del medio de cultivo celular.
En caso de una epidemia de infección viral,
resulta crítico producir grandes cantidades de vacunas de forma
adecuada para proporcionar varios millones de dosis de vacunas en un
período de tiempo muy corto. Por tanto, sigue existiendo la
necesidad de métodos seguros y eficaces para producir virus y
antígenos. Además, se necesita una aproximación a la propagación
viral mediante el empleo de materiales ya disponibles y que
requieran una cantidad mínima de manipulaciones prolongadas, tal
como el manejo de volúmenes reducidos de medio de cultivo celular,
y que faciliten la purificación y el procesamiento posterior para la
producción de vacunas.
Un objeto de la presente invención consiste en
proporcionar un método para la producción de virus o antígenos
virales en un cultivo celular de células adherentes unidas a un
microportador.
También es objeto de la presente invención
proporcionar un método de producción viral en un pequeño volumen de
cultivo celular.
De acuerdo con estos y otros objetos, la
presente invención proporciona métodos para la producción de virus
o antígenos virales, que comprenden los pasos de proporcionar un
cultivo de células adherentes unidas a un microportador,
desarrollar el cultivo celular hasta alcanzar la confluencia,
infectar estas células con un virus, donde la densidad celular en
el cultivo celular aumenta (i) antes de la infección con el virus o
(ii) después de la infección con el virus; e incubar el cultivo de
células infectadas con el virus para propagarlo. El incremento de
la densidad celular en el cultivo celular se lleva a cabo mediante
la concentración del cultivo celular, lo que incluye un aumento de
la concentración de los microportadores en el cultivo celular.
En general, las células adherentes unidas a
microportadores necesitan una relación óptima entre la concentración
de microportadores y las células para alcanzar una densidad celular
elevada. El incremento de la concentración de microportadores en el
cultivo celular permitiría teóricamente alcanzar una densidad
celular más alta por volumen de medio de cultivo. Sin embargo,
debido a los efectos de cizalla, a la reducción de las fuentes de
alimentación en el medio y a la tensión fisiológica de las células
por el aumento de la concentración de microportadores, la
concentración del soporte del sistema de cultivo celular se limita a
una concentración específica (véase también Griffiths y col., 1982,
más arriba).
El método de la invención permite que las
células se desarrollen en condiciones óptimas de crecimiento,
incluyendo la concentración de microportadores, alimentación y
tensión fisiológica mínimas, para alcanzar la máxima densidad
celular para el sistema utilizado.
En la presente invención, se descubre que la
reducción del volumen de medio de cultivo antes o después de la
infección por el virus, gracias a los cual se incrementan la
densidad celular y la concentración de microportadores en la
biomasa del cultivo celular, no influye en la productividad de las
células. Por contraste, se descubre sorprendentemente que la
producción viral obtenida por cada una de las células se puede
incrementar en comparación con las células que se mantienen a la
misma densidad celular que el cultivo celular confluente original.
Esto era totalmente inesperado ya que, debido al aumento de la
concentración de microportadores en el cultivo celular, se esperaba
una reducción de la viabilidad celular, un desprendimiento de las
células de los microportadores y una tensión fisiológica debida a
la mayor densidad celular y durante la producción viral.
El método de la invención permite reducir el
volumen del medio de cultivo que ha de ser procesado durante el
proceso posterior de purificación viral a la vez que,
simultáneamente, la productividad del virus por célula es similar o
incluso aumenta en comparación con el cultivo celular original. El
sistema se puede ampliar hasta un volumen de fermentador de 6.000
l, lo que convierte el proceso para la producción de virus para
vacunas en más eficaz y rápido.
Según una realización del método, las células
dependientes de anclaje se seleccionan de entre el grupo de células
adherentes de VERO, BHK, CHO, RK, RK44, RK13, MRC-5,
MDCK, CEF o células diploides monocapa, tal como se describe en
Reuveny y col. (1985, Develop. Biol. Standard,
60:243-254) y otros bien conocidos en la
técnica.
Las células adherentes unidas a microportador se
pueden desarrollar en un medio de cultivo convencional que contenga
suero. Según una realización preferente de la invención, las células
se cultivan en un medio exento de suero o exento de suero y
proteínas, tal como se describe en Kistner y col. (1998, Vaccine 16:
960-968), Merten y col. (1994, Cytotech. 14:
47-59), Cinati. y col. (1993, Cell Biology Internat.
17: 885-895), Kessler y col. (1999. Dev. Biol.
Stand. 98: 13-21), WO 96/15231, US 6.100.061 o
cualquier otro medio exento de suero o exento de suero y proteínas
conocido en la técnica. Las células se cultivan preferentemente
desde una ampolla a gran escala hasta una biomasa en un medio
exento de suero o exento de suero y proteínas.
Según una realización de la invención, el
cultivo de células adherentes unidas a microportador se desarrolla
hasta alcanzar la confluencia y se infectan con un virus después de
aumentar la densidad celular y la concentración de microportadores
de la biomasa celular del cultivo celular confluente.
De acuerdo con una realización de la invención,
el cultivo de células adherentes unidas a microportador se
desarrolla hasta alcanzar la confluencia y se infecta con un virus
antes de aumentar la densidad celular y la concentración de
microportadores de la biomasa confluente. En cualquier caso, si el
cultivo celular con mayor densidad celular o concentración de
microportadores por volumen se infecta antes o después de la
concentración del cultivo, la densidad celular y la concentración
de microportadores en la biomasa se mantienen constantes durante la
propagación viral y durante el proceso de producción, no volviéndose
a incrementar el volumen del medio. El método empleado para
aumentar la densidad celular y la concentración de microportadores
en la biomasa de cultivo celular no infectado o infectado por un
virus puede ser cualquier método conocido en la técnica para
concentrar un cultivo celular. Esto se puede llevar a cabo por
métodos tales como sedimentación, centrifugación, filtración,
concentración con un dispositivo de perfusión, tal como un tamiz,
que permitan la reducción del volumen de trabajo, o reuniendo 2 o
más sistemas por biorreactor.
La densidad del cultivo celular y la
concentración de microportadores del cultivo celular desarrollado
hasta la confluencia aumentan, debiendo ser el aumento al menos 1,3
veces más importante que la biomasa original cultivada hasta la
confluencia. La densidad celular del cultivo celular original de
partida que se ha cultivado hasta la confluencia puede ser de entre
aproximadamente 0,6 x 10^{6} y aproximadamente 7,0 x 10^{6}
células/ml. En este caso, la biomasa, cuya densidad celular ha
aumentado en comparación con la biomasa del cultivo de partida,
puede tener una densidad celular de entre al menos 0,8 x 10^{6} y
al menos 9,0 x 10^{6} células/ml.
La concentración de microportadores en el
cultivo celular de partida se encuentra preferentemente en el rango
de aproximadamente 0,5 g/l a aproximadamente 7,0 g/l. La
concentración de microportadores después de la concentración de la
biomasa confluente se sitúa preferentemente en el rango de
aproximadamente 0,65 g/l a aproximadamente 21 g/l.
Preferentemente, el microportador utilizado
según el método de la invención se selecciona de entre el grupo de
microportadores basados en dextrano, colágeno, poliestireno,
poliacrilamida, gelatina, vidrio, celulosa, polietileno y plástico,
así como aquellos que se describen en Miller y col. (1989, Advances
in Biochem Eng./Biotech. 39: 73-95) y en Butler
(1988, Spier & Griffiths, Animal Cell Biotechnology. 3:
283-303).
De acuerdo con una realización del método de la
invención, el virus se selecciona de entre el grupo de virus de la
gripe, Virus de Ross-River, Virus de la Hepatitis A,
Virus de la Vaccinia y Virus de la Vaccinia recombinante, Virus del
Herpes Simple, Virus de la Encefalitis Japonesa, Virus del Nilo
Occidental, Virus de la Fiebre Amarilla y virus quiméricos de los
mismos, así como Rhinovirus y Reovirus. Forma parte del conocimiento
de un especialista en la técnica seleccionar una célula huésped
adherente y el virus susceptible a este huésped y utilizar el
método de la invención para obtener un aumento de la producción
viral del virus deseado.
Forma parte del conocimiento de un especialista
en la técnica seleccionar el tipo de microportador respectivo, la
concentración de microportadores en el cultivo de partida, las
células adherentes susceptibles al virus y el medio, así como las
condiciones óptimas de cultivo, tal como la concentración de
oxígeno, suplementos del medio, temperatura, pH, presión, velocidad
de agitación y control de la alimentación, para obtener una biomasa
de cultivo celular confluente que se pueda utilizar para obtener una
biomasa celular que tenga una densidad celular y una concentración
de microportadores aumentadas de acuerdo con este método. El cultivo
celular con una biomasa de densidad celular incrementada se puede
utilizar entonces para la propagación y producción virales
eficaces. Una vez alcanzada la confluencia por el cultivo celular,
el método de la invención permite obtener un cultivo celular con
una mayor densidad celular y una mayor concentración de
microportadores incrementadas en al menos 1,3 veces a 10 veces y
obtener una producción viral superior por volumen de cultivo debido
i) el menor volumen de cultivo y ii) el aumento de la productividad
por célula.
El proceso de producción viral y la duración de
la producción dependen del sistema empleado. La producción máxima
de virus a alcanzar en el sistema respectivo se puede determinar por
métodos estándar. Cuando se alcanza la producción viral máxima, el
virus y/o las células que incluyen el virus se cosechan. Por tanto,
el método de la invención comprende además un paso de cosecha del
virus propagado y producido.
Otro aspecto de la invención prevé un método
para la producción viral o de antígenos virales purificados, que
comprende los pasos de proporcionar un cultivo de células adherentes
unidas a un microportador, desarrollar el cultivo celular hasta
alcanzar la confluencia, infectar el cultivo de células con un
virus, donde la densidad celular en el cultivo celular se
incrementa (i) antes de la infección por el virus o (ii) después de
la infección por el virus, incubar dicho cultivo de células
infectadas por dicho virus para su propagación; (f) cosechar el
virus producido y (g) purificar dicho virus cosechado.
Dependiendo de la naturaleza del virus empleado
para la infección y propagación, el virus producido se encuentra en
el sobrenadante del cultivo celular y/o se asocia a la biomasa
celular. Los virus líticos, por ejemplo el virus de la gripe, lisan
las células tras un tiempo apropiado después de la infección,
liberándose el virus en el medio de cultivo celular. El virus
producido y liberado en el medio de cultivo celular se puede separar
de la biomasa celular o de otros fragmentos celulares por métodos
convencionales, tales como centrifugación, incluyendo
ultracentrifugación, centrifugación en gradiente de densidad,
microfiltración, ultrafiltración, cromatografía de intercambio
iónico, etc., y se purifica.
Los virus no líticos se propagan dentro de las
células y siguen asociados a las células de la biomasa. Estos virus
se pueden cosechar recogiendo la biomasa, lisando las células por
métodos convencionales, tales como tratamiento de las células con
un detergente, calor, congelación/descongelación, sonicación, prensa
francesa u otros métodos de lisado celular. Los virus liberados de
las células se cosechan, se concentran y se purifican. La
purificación del virus se puede llevare a cabo mediante cualquier
método conocido en la técnica, tal como ultrafiltración,
cromatografía de intercambio iónico o centrifugación isopícnica,
etc.
El virus de la gripe se puede propagar en líneas
celulares, incluyendo las células más eficaces MDCK, así como en la
línea celular cuyo uso ha sido concedido para la fabricación de
vacunas humanas, células Vero. Ya se ha descrito la producción a
gran escala del virus de la gripe, en un medio exento de suero o en
un medio exento de suero y proteínas, en un cultivo celular de
mamífero, en perlas microportadoras, en un biorreactor, así como el
desarrollo de una vacuna contra el virus de la gripe (Merten y col.,
1999, Dev. Biol. Stand. 98: 23-37; Kistner y col.,
1998. Vaccine 16: 960-968; Kistner y col., 1999,
Dev. Biol. Stand. 98: 101-110 y WO 96/15231).
De acuerdo con un aspecto, la invención
proporciona un método para la producción del virus de la gripe que
comprende los pasos de: proporcionar un cultivo de células
adherentes unidas a un microportador, desarrollar el cultivo
celular hasta alcanzar la confluencia, infectar las células con el
virus de la gripe; donde la densidad celular del cultivo celular
aumenta (i) antes de la infección por el virus o (ii) después de la
infección por el virus, incubar el cultivo de células infectadas
por dicho virus de la gripe para su propagación. Las células
infectadas por el virus de la gripe pueden ser células VERO o MDCK o
cualquier célula que sea susceptible al virus de la gripe. Según
una realización preferente de la invención, se utilizan células VERO
y se infectan con el virus de la gripe. Según una realización
preferente, las células VERO se cultivan en un medio exento de
suero o en un medio exento de suero y proteínas, desde la ampolla
original hasta la biomasa. Las células VERO unidas al microportador
se cultivan en el medio respectivo hasta alcanzar la confluencia, y
la densidad celular así como la concentración de microportadores
aumentan al menos 1,3 veces. Las células se pueden infectar con el
virus gripe antes o después del aumento de la densidad celular en el
volumen de cultivo. Después de la incubación de la biomasa
infectada de alta densidad celular y la producción viral, se cosecha
el virus de la gripe o el antígeno del virus de la gripe producido.
El virus cosechado se purifica a continuación por métodos conocidos
en la técnica, tal como se describe en Kistner y col., 1998 (más
arriba) o US 6.048.537.
Al haber sido descrita en general esta
invención, a continuación se entenderá la misma con referencia a los
siguientes ejemplos, los cuales se proporcionan con el único
propósito de la ilustración y no pretenden ser limitativos, salvo
que se especifique de otro modo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizó como línea celular de producción
células VERO (Mono Verde Africano, Cercopthecus aethiops,
riñón). Las células se obtuvieron de la Colección de Cultivos
Celulares de Tipo Americano, Rockville, Maryland con número de
acceso 124, bajo la designación ATCC CCL 81. Las células se
adaptaron para desarrollarse en un medio exento de suero o exento
de suero y proteínas tal como se describe en Kistner y col., 1998
(más arriba), la WO 96/15231 o la US 6.100.061. Para el desarrollo
en un medio exento de suero, se utiliza un medio basal DMEM de HAM
F12 suplementado con sales inorgánicas, aminoácidos, bicarbonato de
sodio (2 g/l) y levadura o extracto de soja (0,1 a
10 g/l). Se preparó el banco de células de trabajo sin utilizar ningún componente del medio derivado animal.
10 g/l). Se preparó el banco de células de trabajo sin utilizar ningún componente del medio derivado animal.
Las células del banco de células de trabajo se
desarrollaron en matraces-T y botellas rodantes con
una relación de división de 1:6 ó 1:8. Se realizó otra propagación
de las células en un biorreactor con tanque de 100 l bajo agitación
utilizando un microportador Cytodex® como sustrato de sujeción. Las
células se desarrollaron a 37ºC durante 6-8 días.
Las condiciones del cultivo fueron: una saturación de oxígeno del
20% \pm 10% y un pH de 7. Se mantuvo constante a 25 \pm 0,35.
Al final de la producción de biomasa, cuando las células alcanzaron
el crecimiento de confluencia, una parte del volumen del reactor de
biomasa se concentró en dos veces por sedimentación y se determinó
la densidad celular del cultivo celular concentrado y no
concentrado.
\vskip1.000000\baselineskip
El número de células en la biomasa del cultivo
celular al final de la producción de biomasa se determinó por
tripsinización de las células y su recuento se llevó a cabo con un
contador celular CASY® (método A), tal como se describe en Schärfe
y col. (1988, Biotechnologie in LaborPraxis 10:
1096-1103) o con ácido cítrico y tratamiento con
cristal violeta, seguido de recuento con un hemocitómetro (método B)
tal como se describe en Sanford y col. (1951, j. Natl. Cancer Inst.
11: 773-795). La densidad celular y la concentración
de portadores para las células Vero al final de la producción de
biomasa y después de la concentración de la biomasa confluente
(antes de la infección) se calculó por los métodos A y B. Los datos
se muestran en la Tabla 1.
Células Vero con el número de acceso definido se
descongelaron del nitrógeno líquido y se pasaron a botellas de Roux
y botellas rodantes con el fin de producir suficientes células para
inocular un biorreactor de 1,5 litros. Tras alcanzar la
confluencia, con una densidad celular final de 1,5 x 10^{6}
células/ml, se sometieron las células a tripsinización y se
trasladaron a un biorreactor de 10 litros. Esto, a su vez, se
utilizó como inóculo para un biorreactor de 100 litros que tenía
una concentración de microportadores de 1,5 g/l. Partiendo de una
ampolla del banco celular de trabajo que contiene 10^{7} células,
eran necesarias aproximadamente 30 generaciones para alcanzar la
biomasa confluente final de células Vero. Se desarrolló el cultivo
para alcanzar la confluencia con una densidad celular final de 1,9
x 10^{6}/ml. Antes de la infección por el virus, se cargaron dos
sistemas biorreactores de 10 litros con la biomasa del cultivo
celular con distintos números de células totales. El fermentador A
se cargó con 1,9 x 10^{10} células y el fermentador B se cargó con
un numero de células totales de 3,8 x 10^{10}. Con el fin de
conseguir una mayor concentración de biomasa y portadores para
cargar el fermentador B, el cultivo celular desarrollado hasta
alcanzar la confluencia se concentró, por sedimentación de la
biomasa, hasta alcanzar una concentración del doble. El fermentador
A contenía un 100% y el fermentador B un 200% de biomasa celular
del cultivo celular original desarrollado hasta alcanzar la
confluencia.
El cultivo celular de los fermentadores A y B se
infectó con la cepa H3N2 A/Sydney/5/97 del virus de la gripe con
una MOI (Multiplicidad de Infección) de 0,01. Se aplicaron
parámetros de proceso idénticos de 32ºC, pO_{2} del 20% y pH de
7,1. Para activar el virus de la gripe para la propagación viral, se
añadió una proteasa, tal como tripsina, pronasa o una parte análoga
a la tripsina de la misma.
Se determinó la productividad de antígeno viral
de los dos cultivos celulares diferentes de los fermentadores A y B
que contenían distintas concentraciones de biomasa y se comparó en
base a virus de la gripe titulado (HAU/ml) y el contenido en
antígeno (antígeno purificado en gradiente de densidad). La zona
pico corresponde a la concentración total de antígeno al final del
ciclo lítico al tercer día después de la infección. Se muestran los
datos en la Tabla 2.
Se propagaron las células VERO tal como se
describe anteriormente hasta alcanzar la confluencia, con una
densidad final de 1,6 x 10^{6} células/ml. Antes de la infección
viral, se cargaron dos sistemas biorreactores de 50 l con la
biomasa de cultivo celular que tenía distintos números de células
totales. El fermentador A se cargó con 1,6 x 10^{6} células/ml y
el fermentador B se cargó con 2,3 x 10^{6} células/ml, que
representa una concentración de 1,5 veces la de la biomasa del
cultivo celular confluente. Los fermentadores A y B se infectaron
con el Virus de Ross-River y se determinó la
productividad de antígeno viral de los fermentadores A y B tal como
se ha descrito anteriormente. La Tabla 3 muestra los resultados de
la producción viral obtenida mediante el uso de distintas
concentraciones de biomasa para la propagación viral.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Como líneas celulares de producción se emplearon
células de riñón de conejo RK-13 o un derivado
complementario de las mismas
RK-D4R-44, tal como se describen en
Holzer y col. (1997. J. Virol. 71: 4997-5002). Se
cultivaron las células en un medio convencional que contenía un 2%
de suero.
Las células del banco de células de trabajo se
desarrollaron en frascos-T y botellas rodantes con
una relación de división de 1:6. Se realizó otra propagación de las
células en un biorreactor con tanque de 10 l bajo agitación
utilizando microportadores Cytodex® (Pharmacia) como sustrato de
sujeción.
\vskip1.000000\baselineskip
Tras haber alcanzado las células
RK-13 o RK-D4R-44 la
confluencia y una densidad celular final en los biorreactores de
tanque, se infectó la biomasa con el Virus de la Vaccinia WR o el
Virus de la Vaccinia defectuoso vD4-ZG#2 tal como
se describe en Holzer y col. (1997, más arriba) con una MOI de 0,01.
Después de la infección, se cargaron dos sistemas biorreactores de
10 l con la biomasa de cultivo celular infectada, con distintos
números de células totales. Se cargó el fermentador A con 1,2 x
10^{10} células/ml y el fermentador B con 2,4 x 10^{10}
células/ml. Para conseguir concentraciones mayores de biomasa y
portadores para el fermentador B, el cultivo celular infectado
desarrollado hasta alcanzar la confluencia se concentró por
sedimentación de la biomasa para obtener una mayor concentración.
El fermentador A contenía un 100% y el fermentador B un 200% de
biomasa celular del cultivo celular original desarrollado hasta
alcanzar la confluencia. Se determinó la productividad de antígeno
viral de los dos fermentadores A y B de diferentes cultivos
celulares que contenían distintas concentraciones de biomasa por
volumen de medio de células infectadas. Se resumen los resultados en
la Tabla 4.
Claims (17)
1. Método para la producción de virus o
antígenos virales que comprende los pasos de (a) proporcionar un
cultivo de células adherentes unidas a un microportador, (b)
desarrollar el cultivo celular hasta alcanzar la confluencia, (c)
infectar las células con un virus y (d) incubar dicho cultivo de
células infectadas por dicho virus para la propagación de éste,
caracterizado porque la densidad celular de la biomasa del
cultivo celular desarrollado hasta alcanzar la confluencia aumenta
(i) antes del paso (c), o (ii) después del paso (c) y se mantiene a
una densidad celular elevada durante el paso (d).
2. Método según la reivindicación 1,
caracterizado porque la densidad del cultivo celular
desarrollado hasta alcanzar la confluencia se concentra al menos
1,3 veces aproximadamente.
3. Método según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque la densidad celular del cultivo celular
desarrollado hasta alcanzar la confluencia se encuentra entre
aproximadamente 0,6 x 10^{6} y aproximadamente 7,0 x 10^{6}
células/ml.
4. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el microportador
se selecciona de entre el grupo de microportadores compuesto por
dextrano, colágeno, poliestireno, poliacrilamida, gelatina, vidrio,
celulosa, polietileno y plástico.
5. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la concentración
de microportadores en el cultivo celular del paso (a) se sitúa
entre aproximadamente 0,5 g/l y aproximadamente 14 g/l.
6. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dichas células
se seleccionan de entre el grupo de células adherentes de VERO,
BHK, CHO, RK, RK44, RK13, MRC-5, MDCK, CEF o células
diploides monocapa.
7. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque dichas células
unidas a un microportador se cultivan en un medio exento de
suero.
8. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque dichas células
unidas a un microportador se cultivan en un medio exento de suero y
de proteínas.
9. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el virus se
selecciona de entre el grupo de virus de la gripe, Virus de
Ross-River, Virus de la Hepatitis A, Virus de la
Vaccinia y derivados recombinantes del mismo, Virus del Herpes
Simple, Virus de la Encefalitis Japonesa, Virus del Nilo Occidental,
Virus de la Fiebre Amarilla y virus quiméricos de los mismos, así
como Rhinovirus y Reovirus.
10. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, que comprende además el paso (e) de cosecha
del virus propagado.
11. Método según la reivindicación 10, que
comprende además el paso (f) de purificación del virus cosechado
para obtener un virus o antígeno viral purificado.
12. Método según la reivindicación 10 u 11,
caracterizado porque el virus producido se cosecha del
sobrenadante del cultivo celular.
13. Método según la reivindicación 10 u 11,
caracterizado porque el virus producido se cosecha de la
biomasa celular.
14. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 13, caracterizado porque además
comprende el paso de procesar el virus o el antígeno viral
purificado en una vacuna.
15. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque el virus o el
antígeno viral producido es el virus de la gripe o el antígeno del
virus de la gripe.
16. Método según la reivindicación 14,
caracterizado porque dichas células son células VERO.
17. Método según la reivindicación 14,
caracterizado porque dichas células son células MDCK.
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