JP2005512564A - ウイルス抗原の大規模生成方法 - Google Patents
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Abstract
(b)この細胞培養物をコンフルエンスまで増殖させる工程、(c)この細胞にウイルスを感染させる工程、ならびに(d)このウイルスに感染した細胞培養物をインキュベートして該ウイルスを増殖させる工程を包含する。
Description
本発明は、マイクロキャリアに結合された接着細胞培養物において、ウイルス抗原を生成する改良方法に関する。この方法は、培養培地の容積当たりのウイルス抗原収量の増加を提供する。本発明はまた、個々のコンフルエントな細胞培養物と比較して増加した細胞密度およびマイクロキャリア濃度を有する、接着細胞の細胞培養物バイオマスに関する。
効率的なワクチン生成には、宿主系から高収量で生成される大規模量のウイルスの増殖が必要とされる。ウイルス株が増殖される培養条件は、その株の許容できる高収量を達成することに関して、非常に重要である。従って、望ましいウイルスの収量を最大にするために、その系および培養条件の両方が、その望ましいウイルスの生成のために有利である環境を提供するために特に適合されなければならない。従って、種々のウイルス株の許容できる高収量を達成するために、多数の種々のウイルスについて最適の増殖条件を提供する系が、必要とされる。
マイクロキャリアに結合された接着細胞の細胞培養物において、ウイルスまたはウイルス抗原を生成するための方法を提供することが、本発明の目的である。
これらの目的および他の目的に従って、本発明は、ウイルスまたはウイルス抗原の生成のための方法を提供し、この方法は、マイクロキャリアに結合された接着細胞培養物を提供する工程、その細胞培養物をコンフルエンスまで増殖させる工程、その細胞にウイルスを感染させる工程、ならびにそのウイルスに感染した該細胞培養物をインキュベートしてそのウイルスを増殖させる工程、を包含し、この細胞培養物の細胞密度は、(i)ウイルス感染の前または(ii)ウイルス感染の後に増加される。この細胞培養物中の細胞密度の増加は、その細胞培養物の濃度によりなされ、この増加は、その細胞培養物中のマイクロキャリア濃度の増加を含む。
(濃縮Vero細胞バイオマスにおけるウイルス抗原生成)
(a)細胞培養物の増殖)
VERO細胞(アフリカミドリザル、Cercopthecus aethiops、腎臓)を産生細胞株として使用した。この細胞を、ATCC CCL 81の名称の下、継代数124で、Amenrican Type Cell Culture Collection、Rockville、Marylandから得た。この細胞を、Kistnerら、1998(上記)、WO96/15231または米国特許第6,100,061号に記載されるような無血清培地または無血清無タンパク質培地中で増殖するように適合させた。無血清培地中での増殖のために、無機塩、アミノ酸、重炭酸ナトリウム(2g/l)および酵母抽出物または大豆抽出物(0.1〜10g/l)を補充した、基本DMEM HAM’s F12培地を、使用する。作業細胞バンクを、いかなる動物由来の培地成分も使用することなく調製した。
バイオマス生成の終わりの細胞培養物のバイオマスの細胞数を、Scharfeら(1988.Biotechnologie in LaborPraxis 10:1096〜1103)により記載されるように、その細胞をトリプシン処理し、CASY(登録商標)細胞計数器を用いて計数すること(方法A)、またはSanfordら(1951.J.Natl.Cancer Inst.11:773〜795)により記載されるように、クエン酸およびクリスタルバイオレット処理した後、血球計を用いて係数すること(方法B)のいずれかによって、決定した。バイオマス生成の終わりのVero細胞についての細胞密度およびキャリア濃度、ならびにコンフルエントバイオマスの濃縮後(感染前)のVero細胞についての細胞密度およびキャリア濃度を、方法Aおよび方法Bによって計算した。データを表1に示す。
(バイオマス生成の終わりのコンフルエント細胞培養物中の細胞数、およびコンフルエント細胞培養物の濃縮後の細胞数の決定)
(コンフルエントバイオマスと濃縮したコンフルエントバイオマスとの、ウイルス抗原生成の比較)
規定した継代数のVero細胞を、液体窒素から融解し、そしてルー(roux)およびローラーボトルに通して、1.5リットルバイオリアクターに接種するために十分な細胞を生成した。最終細胞密度1.5×106細胞/mlのコンフルエンシーに達した後、その細胞をトリプシン処理し、10リットルバイオリアクターに移した。その後、これを、マイクロキャリア濃度1.5g/lを有する100リットルバイオリアクターへの接種物として使用する。107細胞を含む作業細胞バンクアンプルから出発して、約30世代が、最終コンフルエントVero細胞バイオマスに達するために必要とされる。この培養物を、最終細胞密度1.9×106/mlのコンフルエンシーに達するように増殖させた。ウイルス感染の前に、2つの10リットルバイオリアクターシステムに、異なる総細胞数を有する細胞培養物バイオマスを充填した。発酵槽Aに、1.9×1010細胞を充填し、発酵槽Bに、合計細胞数3.8×1010を充填する。発酵槽Bに充填するためのより高いバイオマス濃度およびキャリア濃度を達成するために、コンフルエンシーまで増殖させた細胞培養物を、このバイオマスを2倍濃縮に達するように沈降することによって濃縮した。発酵槽Aは、コンフルエンシーまで増殖させた元の細胞培養物の100%の細胞バイオマスを含み、発酵槽Bは、コンフルエンシーまで増殖させた元の細胞培養物の200%のバイオマスを含む。
発酵槽Aおよび発酵槽Bにおける細胞培養物に、インフルエンザウイルス株H3N2A/Sydney/5/97を、感染多重度0.01にて感染させた。同一のプロセスパラメーターである32℃、pO2 20%およびpH7.1を適用した。ウイルス増殖のためにインフルエンザウイルスを活性化するために、プロテアーゼ(例えば、トリプシン、プロナーゼ、またはそのトリプシン様部分)を添加した。
(コンフルエントVERO細胞培養物および濃縮したコンフルエントVERO細胞バイオマスにおける、インフルエンザウイルス力価および抗原の決定)
VERO細胞を、最終密度1.6×106/mlのコンフルエンシーに達するように、上記のように増殖させた。ウイルス感染の前に、2つの50リットルバイオリアクターシステムに、異なる総細胞数を有する細胞培養物バイオマスを充填した。発酵槽Aに、1.6×106細胞/mlを充填し、発酵槽Bに、2.3×106細胞/ml(これは、コンフルエント細胞培養物バイオマスの1.5倍の濃度である)を充填する。発酵槽Aおよび発酵槽Bに、ロス川ウイルスを感染させた。発酵槽Aおよび発酵槽Bのウイルス抗原生産性を、上記のように決定した。表3は、ウイルス増殖のために異なるバイオマス濃度を使用することにより得られたウイルス収率の結果を示す。
(ロス川ウイルス力価および抗原生成の決定)
(RK細胞の濃縮バイオマスにおけるウイルス抗原生成)
(a)細胞培養物の増殖)
ウサギ腎細胞RK−13またはHolzerら(1997.J.Virol.71:4997〜5002)により記載されるその補完誘導株RK−D4R−44を、生成細胞株として使用した。細胞を、2%血清を含む従来の培地において増殖させた。
RK−13細胞またはRK−D4R−44細胞が、タンクバイオリアクターにおいてコンフルエンスおよび最終密度に達した後、このバイオマスに、Holzerら、1997(上記)により記載されるように、ワクシニアウイルスWRまたは欠損ワクシニアウイルスvD4−ZG#2を、感染多重度0.01にて感染させた。感染後、2つの10リットルバイオリアクターシステムに、異なる総細胞数を有する感染細胞培養物バイオマスを充填した。発酵槽Aに、1.2×1010細胞を充填し、発酵槽Bに、2.4×1010細胞を充填する。発酵槽Bのためにより高いバイオマス濃度およびキャリア濃度を達成するために、コンフルエンシーまで増殖させた感染細胞培養物を、より高濃度に達するようにバイオマスを沈降することによって濃縮した。発酵槽Aは、コンフルエンシーまで増殖させた元の細胞培養物の100%の細胞バイオマスを含み、発酵槽Bは、コンフルエンシーまで増殖させた元の細胞培養物の200%の細胞バイオマスを含む。感染細胞の培地容積当たり異なるバイオマス濃度を含む2つの異なる細胞培養物発酵槽Aおよび発酵槽Bのウイルス抗原生産性を、決定した。その結果を、表4にまとめる。
(RK細胞におけるワクシニアウイルス力価の決定)
Claims (26)
- ウイルスまたはウイルス抗原の生成のための方法であって、
(a)マイクロキャリアに結合された接着細胞培養物を提供する工程、
(b)該細胞培養物をコンフルエンスまで増殖させる工程、
(c)該細胞にウイルスを感染させる工程、ならびに
(d)該ウイルスに感染した該細胞培養物をインキュベートして該ウイルスを増殖させる工程、
を包含し、該コンフルエンスまで増殖した細胞培養物のバイオマスの細胞密度は、(i)工程(c)の前または(ii)工程(c)の後に増加され、そして工程(d)の間、高い細胞密度にて維持される、方法。 - 請求項1に記載の方法であって、前記コンフルエンスまで増殖した細胞培養物の密度は、少なくとも約1.3倍濃縮される、方法。
- 請求項1または2に記載の方法であって、前記コンフルエンスまで増殖した細胞培養物の細胞密度が、約0.6×106細胞/mlと約7.0×106細胞/mlとの間にある、方法。
- 請求項1〜3のうちのいずれか1項に記載の方法であって、前記マイクロキャリアが、デキストラン製マイクロキャリア、コラーゲン製マイクロキャリア、ポリスチレン製マイクロキャリア、ポリアクリルアミド製マイクロキャリア、ゼラチン製マイクロキャリア、ガラス製マイクロキャリア、セルロース製マイクロキャリア、ポリエチレン製マイクロキャリア、およびプラスチック製マイクロキャリアからなる群より選択される、方法。
- 請求項1〜4のうちのいずれか1項に記載の方法であって、前記工程(a)の細胞培養物中のマイクロキャリア濃度が、約0.5g/lと約14g/lとの間にある、方法。
- 請求項1〜5のうちのいずれか1項に記載の方法であって、前記細胞が、VERO接着細胞、BHK接着細胞、CHO接着細胞、RK接着細胞、RK44接着細胞、RK13接着細胞、MRC−5接着細胞、MDCK接着細胞、CEF接着細胞、または二倍体単層細胞接着細胞からなる群より選択される、方法。
- 請求項1〜6のうちのいずれか1項に記載の方法であって、前記マイクロキャリアに結合された細胞が、無血清培地中で増殖される、方法。
- 請求項1〜7のうちのいずれか1項に記載の方法であって、前記マイクロキャリアに結合された細胞が、無血清無タンパク質培地中で増殖される、方法。
- 請求項1〜8のうちのいずれか1項に記載の方法であって、前記ウイルスが、インフルエンザウイルス、ロス川ウイルス、A型肝炎ウイルス、ワクシニアウイルスおよびその組換え誘導体、単純疱疹ウイルス、日本脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルスおよびそのキメラ、ライノウイルス、ならびにレオウイルスからなる群より選択される、方法。
- 請求項1〜9のうちのいずれか1項に記載の方法であって、
工程(e)前記増殖したウイルスを採集する工程
をさらに包含する、方法。 - 請求項10に記載の方法であって、
工程(f)前記採集したウイルスを精製して、精製ウイルスまたは精製ウイルス抗原を得る工程
をさらに包含する、方法。 - 請求項10または11に記載の方法であって、前記生成されたウイルスが、前記細胞培養物上清から採集される、方法。
- 請求項10または11に記載の方法であって、前記生成されたウイルスが、前記細胞バイオマスから採集される、方法。
- 請求項1〜13のうちのいずれか1項に記載の方法であって、前記生成されたウイルスまたはウイルス抗原が、インフルエンザウイルスまたはインフルエンザウイルス抗原である、方法。
- 請求項14に記載の方法であって、前記細胞がVERO細胞である、方法。
- 請求項14に記載の方法であって、前記細胞がMDCK細胞である、方法。
- マイクロキャリアに結合された接着細胞の細胞培養物バイオマスであって、該細胞培養物中の細胞のバイオマスは、コンフルエンスまで増殖した細胞培養物と比較して、少なくとも約1.3倍である、細胞培養物バイオマス。
- 請求項17に記載の培養物であって、前記細胞がVERO細胞である、培養物。
- 請求項17または18に記載の培養物であって、該培養物は無血清培養物である、培養物。
- 請求項19に記載の培養物であって、該培養物は無血清無タンパク質培養物である、培養物。
- 請求項17〜20のうちのいずれか1項に記載の培養物であって、前記細胞がウイルスに感染している、培養物。
- 請求項21に記載の培養物であって、該細胞培養物中の感染した細胞のバイオマスは、感染前のコンフルエンスまで増殖した細胞培養物と比較して、少なくとも約1.3倍である、培養物。
- 請求項21または22に記載の培養物であって、インフルエンザウイルス、ロス川ウイルス、A型肝炎ウイルス、ワクシニアウイルスおよびその組換え誘導体、単純疱疹ウイルス、日本脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルスおよびそのキメラ、ライノウイルス、ならびにレオウイルスからなる群より選択されるウイルスに感染している、培養物。
- 請求項21〜23のうちのいずれか1項に記載の培養物であって、前記ウイルスがインフルエンザウイルスである、培養物。
- 請求項21〜23のうちのいずれか1項に記載の培養物であって、前記ウイルスがロス川ウイルスである、培養物。
- 請求項21〜23のうちのいずれか1項に記載の培養物であって、前記ウイルスがワクシニアウイルスである、培養物。
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