PL208232B1 - Sposób wytwarzania wirusa lub antygenu wirusowego oraz biomasa hodowli komórkowej - Google Patents
Sposób wytwarzania wirusa lub antygenu wirusowego oraz biomasa hodowli komórkowejInfo
- Publication number
- PL208232B1 PL208232B1 PL373487A PL37348702A PL208232B1 PL 208232 B1 PL208232 B1 PL 208232B1 PL 373487 A PL373487 A PL 373487A PL 37348702 A PL37348702 A PL 37348702A PL 208232 B1 PL208232 B1 PL 208232B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- virus
- cells
- cell
- culture
- cell culture
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims description 124
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 82
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims description 29
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims description 29
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims description 29
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 title description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 116
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims abstract description 91
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 218
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 claims description 34
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims description 30
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 22
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 18
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 18
- 206010066919 Epidemic polyarthritis Diseases 0.000 claims description 12
- 241000710942 Ross River virus Species 0.000 claims description 12
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 claims description 12
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 11
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 claims description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 8
- 241000710842 Japanese encephalitis virus Species 0.000 claims description 6
- 241000702263 Reovirus sp. Species 0.000 claims description 6
- 241000710886 West Nile virus Species 0.000 claims description 6
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 claims description 6
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 claims description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 6
- 206010039083 rhinitis Diseases 0.000 claims description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims description 5
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 claims description 5
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 claims description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 4
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000002356 single layer Substances 0.000 claims description 4
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 3
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 3
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 claims description 3
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 claims description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims description 3
- 208000003152 Yellow Fever Diseases 0.000 claims description 3
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 3
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 3
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 claims description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 claims description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 claims description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 claims description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims description 3
- -1 polyethylene Polymers 0.000 claims description 3
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 claims description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 31
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 5
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 4
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 4
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 4
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 4
- 241000710772 Yellow fever virus Species 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 3
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 3
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 3
- 229940051021 yellow-fever virus Drugs 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 2
- 230000006727 cell loss Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 2
- 230000009894 physiological stress Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 1
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 208000006758 Marek Disease Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- ZXJXZNDDNMQXFV-UHFFFAOYSA-M crystal violet Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC=C1[C+](C=1C=CC(=CC=1)N(C)C)C1=CC=C(N(C)C)C=C1 ZXJXZNDDNMQXFV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 235000020712 soy bean extract Nutrition 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000001810 trypsinlike Effects 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16151—Methods of production or purification of viral material
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania wirusa lub antygenu wirusowego na dużą skalę oraz biomasa hodowli komórkowej. Niniejszy wynalazek dotyczy ulepszonych sposobów wytwarzania wirusowego antygenu w hodowli komórek adhezyjnych związanych z mikronośnikiem, które dostarczają wirusowy antygen ze zwiększoną wydajnością na objętość pożywki hodowli. Wynalazek dotyczy także biomasy hodowli komórkowej komórek adhezyjnych o zwiększonej gęstości komórkowej i stężeniu mikronośników w porównaniu z odpowiadającą hodowlą zlewających się komórek (hodowlą konfluentną).
Wydajne wytwarzanie szczepionki wymaga wzrostu na dużą skalę ilości wirusa wytwarzanego z dużą wydajnością z układu gospodarza. Warunki prowadzenia hodowli, w których wzrasta szczep wirusa mają ogromne znaczenie odnośnie osiągania dopuszczalnie wysokich wydajności szczepu. Tak więc, aby zmaksymalizować wydajność pożądanego wirusa, warunki zarówno układu jak i prowadzenia hodowli muszą być dostosowane specjalnie, aby otrzymać środowisko, które sprzyja wytwarzaniu pożądanego wirusa. Dlatego też, aby uzyskać dopuszczalnie wysoką wydajność dla różnych szczepów wirusa jest potrzebny układ, który dostarcza optymalnych warunków wzrostu dla licznych zróżnicowanych wirusów.
Jedynym sposobem, który jest ekonomicznie opłacalny jest sposób prowadzony w reaktorze, ponieważ dzięki niemu możliwe jest zwiększenie produkcji w zależności od wielkości rynku zbytu i pożądanych dawek szczepionki. Dla komórek adhezyjnych sposób prowadzony na nośniku z klasycznymi mikronośnikami jest obecnie najlepszym wyborem dla hodowli komórek niezbędnych do propagacji wirusa na dużą skalę (Van Wezel i wsp. 1967. Nature 216:64-65; Van Wezel i wsp. 1978. Process Biochem. 3:6-8). Opisano sposób wytwarzania na mikronośniku na dużą skalę wirusa poliomielitis, wirusa zapalenia wątroby typu A, wirusa HSV oraz choroby Mareka (opis patentowy USA Nr 4525349; Widell i wsp., 1984. J. Virological Meth. 8:63-71; Fiorentine i wsp., 1985. Develop. Biol. Standard 60:421-430; Griffiths i wsp., 1982. Develop. Biol. Standard. 50:103-110). Obecne sposoby oparte na hodowli na mikronośniku pozwalają na wytwarzanie wirusa z wykorzystaniem fermentora o rozmiarach do 1200 l.
Caij i wsp. (1989. Arch. Virol. 105: 113-118) porównali wydajności wirusowego miana wirusa cholery HOG wytwarzanego w hodowlach na mikronośniku i w tradycyjnych hodowlach monowarstwowych i stwierdzili, że przez zastosowanie układu mikronośników można uzyskać wyższe wydajności wirusa na objętość pożywki.
Griffiths i wsp. (1982. Develop. Biol. Standard. 50:103-110) badali wpływ stężenia mikronośnika na wzrost komórek i wytwarzanie HSV. Stwierdzili, że aby osiągnąć wysoką gęstość komórek, potrzebne jest optymalne stężenie mikronośników, co także wpływa na uzyskiwaną wydajność wirusa. Jednak, wyższe stężenie mikronośników w układach perfuzyjnych prowadzi do utraty komórek na skutek zsuwania się warstwy komórek z cząsteczek nośnika.
Wydajność sposobu wytwarzania wirusa w układzie mikronośników zależy od wirusa, komórek, rodzaju mikronośnika i uzyskanej w układzie gęstości komórek. Wyższe stężenie mikronośników w hodowli komórkowej pozwala na uzyskanie większej całkowitej liczby komórek. Jednak, mikronośniki są kosztowne i, w tych warunkach, może nastąpić utrata komórek na skutek zsuwania się warstwy komórek z cząsteczek nośnika ze względu na działanie sił ścinających w tych układach. To sugeruje, że w celu uzyskania wyższych wydajności wirusa pożądana jest duża objętość hodowli komórkowej z mikronośnikami, jednak to zwiększa wysiłki, jakie należy podjąć, aby zrealizować sposób oraz oczyścić tak duże objętości.
W przypadku namnażania wirusa istotne jest osiągnięcie optymalnej gęstości komórek, aby uzyskać maksymalną wydajność wirusa. Istotne jest także, umożliwienie skutecznej adsorpcji wirusa do komórek. Dlatego też, w tradycyjnych sposobach objętość pożywki wzrostowej jest zmniejszana przed zainfekowaniem, aby umożliwić adsorpcję wirusa do komórek w jak najmniejszej objętości hodowli i w celu osiągnięcia lepszej proporcji wirusa do komórek. Jednak, aby uzyskać optymalną propagację wirusa, objętość hodowli komórek ponownie wzrasta po odpowiednim czasie adsorpcji, w celu zachowania żywotności komórek i/lub umożliwienia dalszego ich wzrostu. To, jednak, zwiększa objętość hodowli komórkowej obejmującej komórki i/lub wirus, czego wadą jest konieczność poddawania dalszej obróbce dużych objętości podczas późniejszego oczyszczania wirusa z komórek lub pożywki hodowli komórkowej.
W przypadku występowania infekcji wirusowej, istotne jest wytwarzanie dużych ilości szczepionki w określonym czasie, aby dostarczyć kilka milionów dawek szczepionki w ciągu bardzo krótkiego okresu czasu. Dlatego też, istnieje ciągłe zapotrzebowanie na bezpieczne i wydajne sposoby wytwarzania wirusów i antygenów. Ponadto, istnieje zapotrzebowanie na podejścia do namnażania wirusów, wykorzystującego materiały, które są obecnie dostępne na rynku i wymagającego minimalnej
PL 208 232 B1 liczby czasochłonnych zabiegów, takich jak manipulowanie zmniejszonymi objętościami pożywki hodowli komórkowej, oraz ułatwiającego oczyszczanie i dalszą obróbkę w celu wytwarzania szczepionki.
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania wirusa lub wirusowego antygenu, korzystnie wirusa wybranego z grupy obejmującej wirusa grypy, wirusa Ross River, wirusa zapalenia wątroby typu A, wirusa krowianki i jego rekombinowanych pochodnych, wirusa opryszczki, wirusa japońskiego zapalenia mózgu, wirusa gorączki zachodniego Nilu, wirusa żółtej gorączki i ich chimer, jak również wirusa nieżytu nosa oraz reowirusa, w hodowli komórkowej adhezyjnych komórek, korzystnie komórek wybranych z grupy komórek adhezyjnych VERO, BHK, CHO, RK, RK44, RK13, MRC-5, MDCK, CEF lub komórek monowarstwy diploidalnej, związanych z mikronośnikiem. Sposób według wynalazku obejmuje etapy (a) dostarczania hodowli komórek adhezyjnych związanych z mikronośnikiem, (b) wzrostu hodowli komórkowej do momentu konfluencji, (c) zainfekowania tych komórek wirusem, i (d) inkubowania hodowli komórek zainfekowanych wirusem do namnażania wirusa, przy czym gęstość komórek w biomasie hodowli komórkowej wzrastającej do momentu konfluencji jest zatężona (i) przed etapem (c) lub (ii) po etapie (c) i jest utrzymywana zatężona gęstość komórek podczas etapu (d). Korzystnie gęstość komórek biomasy hodowli komórkowej wrastającej do momentu konfluencji zawiera się między około 0,6x106 a około 7,0x106 komórek/ml. Także korzystnie mikronośnik jest wybrany z grupy składającej się z mikronośników otrzymanych w oparciu o dekstran, kolagen, polistyren, poliakrylamid, żelatynę, szkło, celulozę, polietylen i tworzywo sztuczne. W sposobie według wynalazku korzystnie stężenie mikronośnika w hodowli komórek w etapie (a) zawiera się między około 0,5 g/l i około 14 g/l.
W korzystnej postaci wykonania komórki zwią zane z mikronoś nikiem wrastają w poż ywce wolnej od surowicy, a korzystniej w pożywce wolnej od surowicy i białka.
Korzystnie sposób według wynalazku dodatkowo obejmuje etap (e) zbierania namnożonego wirusa. Korzystniej sposób według wynalazku dodatkowo obejmuje etap (f) oczyszczania zbieranego wirusa w celu uzyskania oczyszczonego wirusa lub antygenu wirusa. Jeszcze korzystniej wytworzony wirus jest zbierany z supernatantu hodowli komórkowej lub z biomasy komórkowej. Najkorzystniej sposób według wynalazku obejmuje ponadto etap przetwarzania oczyszczonego wirusa lub antygenu wirusowego do postaci szczepionki.
W korzystnej postaci wykonania sposobu wedł ug wynalazku wytworzony wirus lub antygen wirusa jest wirusem grypy lub antygenem wirusa grypy, a komórki są komórkami VERO lub MDCK.
Wynalazek dostarcza hodowlę komórkową adhezyjnych komórek o większej gęstości komórkowej w porównaniu do pierwotnej hodowli komórkowej wzrastającej do momentu zlania (konfluencji) komórek. Przedmiotem wynalazku jest w szczególności biomasa hodowli komórkowej adhezyjnych komórek związanych z mikronośnikiem, w której gęstość komórkowa biomasy komórek w hodowli komórkowej jest przynajmniej około 1,3-krotna w porównaniu do gęstości komórkowej tej hodowli wzrastającej do momentu konfluencji. Korzystnie komórkami w hodowli komórkowej są komórki VERO.
Ponadto korzystnie hodowla komórkowa jest wolna od surowicy, a korzystniej jest wolna od surowicy i białka.
W korzystnym aspekcie komórki w hodowli według wynalazku są zainfekowane wirusem. Korzystniej, gęstość komórkowa biomasy zainfekowanych komórek w hodowli komórkowej jest przynajmniej około 1,3 krotna w porównaniu do gęstości komórek tej hodowli komórkowej, która wzrastała do momentu konfluencji przed zainfekowaniem. Najkorzystniej hodowla według wynalazku jest zainfekowana wirusem wybranym z grupy wirusów: wirusa grypy, wirusa Ross River, wirusa zapalenia wątroby typu A, wirusa krowianki i jego rekombinowanych pochodnych, wirusa opryszczki, wirusa japońskiego zapalenia mózgu, wirusa gorączki zachodniego Nilu, wirusa żółtej gorączki i ich chimer, jak również wirusa nieżytu nosa oraz reowirusa. W szczególnie korzystnych postaciach wykonania wirusem jest wirus grypy, wirus Ross River lub wirus krowianki.
Szczegółowy opis wynalazku
Wynalazek dostarcza sposobów wytwarzania wirusa lub wirusowego antygenu, obejmujących etapy dostarczania hodowli komórek adhezyjnych związanych z mikronośnikiem, wzrostu hodowli komórkowej do momentu zlania, zainfekowania tych komórek wirusem, przy czym gęstość komórek w hodowli komórkowej wzrasta (i) przed zainfekowaniem wirusem lub (ii) po zainfekowaniu wirusem, i inkubowania hodowli komórek zainfekowanych wirusem w celu namnożenia wirusa. Wzrost gęstości komórkowej w hodowli komórkowej jest uzyskiwany przez zatężenie hodowli komórkowej, co obejmuje wzrost stężenia mikronośników w hodowli komórkowej.
W ogólności, aby osi ą gnąć wysoką gę stość komórek adhezyjne komórki związane z mikronośnikami wymagają optymalnej proporcji stężenia mikronośnika do liczby komórek. Wzrost stężenia
PL 208 232 B1 mikronośników w hodowli komórkowej mógłby teoretycznie pozwolić na osiągnięcie większej gęstości komórkowej na objętość pożywki hodowli. Jednakże, ze względu na efekty ścinające, zmniejszenie źródeł odżywiania w pożywce i fizjologiczny stres komórek wywołany wzrostem stężenia mikronośnika, stężenie nośnika w układzie hodowli komórkowej jest ograniczone stężeniem charakterystycznym (patrz także Griffiths i wsp. 1982, supra).
Aby osiągnąć maksymalną gęstość komórek w stosowanym układzie sposób według wynalazku pozwala na wzrost komórek w optymalnych warunkach wzrostu, obejmujących stężenie mikronośnika, odżywianie i minimalny stres fizjologiczny.
Twórcy obecnego wynalazku stwierdzili, że zmniejszenie objętości pożywki hodowli przed lub po zainfekowaniu wirusem, dzięki czemu gęstość komórek i stężenie mikronośnika w biomasie hodowli komórkowej wzrasta, nie ma wpływu na produktywność komórek. Dla odróżnienia, niespodziewanie stwierdzono także, że otrzymana wydajność wirusa na komórkę może być zwiększona w porównaniu do komórek, które są utrzymywane przy tej samej gęstości komórek, jak w pierwotnie zlewających się hodowlach komórkowych. Było to wysoce nieoczekiwane, ponieważ można by oczekiwać, iż na skutek wzrostu stężenia mikronośnika w hodowli komórkowej nastąpi zmniejszenie żywotności komórek, oddzielanie się komórek od mikronośników oraz pojawi się stres fizjologiczny wynikający z większej gęstości komórek i wytwarzania wirusa.
Sposób według wynalazku pozwala na zmniejszenie objętości pożywki hodowli, która ma być poddawana obróbce w trakcie dalszego procesu oczyszczania wirusa, podczas gdy jednocześnie produktywność wirusa na komórkę jest podobna lub nawet wzrasta w porównaniu do pierwotnej hodowli komórkowej. Układ może być skalowany do 6000 l objętości fermentora, co czyni sposób wytwarzania wirusa do szczepionek bardziej efektywnym i mniej czasochłonnym.
Zgodnie z jednym wariantem wykonania sposobu uzależnione od zakotwiczenia komórki są wybrane z grupy komórek adhezyjnych VERO, BHK, CHO, RK, RK44, RK13, MRC-5, MDCK, CEF lub komórek monowarstwy diploidalnej jak opisano przez Reuveny i wsp. (1985. Develop. Biol. Standard. 60:243-253) i innych dobrze znanych w dziedzinie.
Adhezyjne komórki związane z mikronośnikiem mogą wzrastać w tradycyjnej pożywce hodowli zawierającej surowicę. Zgodnie z korzystnym wariantem wykonania niniejszego wynalazku komórki wzrastają na wolnej od surowicy lub wolnej od surowicy i białka pożywce jak opisano przez Kistner i wsp. (1998. Vaccine 16: 960-968), Merten i wsp. (1994. Cytotech. 14:47-59), Cinatl. i wsp. (1993. Cell Biology Internat. 17:885-895), Kessler i wsp. (1999. Dev. Biol. Stand. 98:13-21), w opisie patentowym WO 96/15231, w opisie patentowym USA 6100061 lub w dowolnej innej wolnej od surowicy lub wolnej od surowicy i białka pożywce znanej w dziedzinie. Komórki korzystnie wzrastają od ampułki do biomasy o dużej skali w wolnej od surowicy lub wolnej od surowicy i białka pożywce.
Zgodnie z jednym wariantem wykonania według wynalazku hodowla adhezyjnych komórek związanych z mikronośnikiem wzrasta do momentu zlania się i jest infekowana wirusem po zwiększeniu gęstości komórek i stężenia mikronośnika biomasy komórkowej zlewającej się hodowli komórkowej.
Zgodnie z jednym wariantem wykonania według wynalazku hodowla adhezyjnych komórek związanych z mikronośnikiem wzrasta do momentu zlania się i jest infekowana wirusem po zwiększeniu gęstości komórek i stężenia mikronośnika zlewającej się biomasy. W każdym przypadku, jeżeli hodowla komórkowa o większej gęstości komórek i stężeniu mikronośnika na objętość jest zainfekowywana przed lub po zatężeniu hodowli, to podczas propagacji wirusa i procesu wytwarzania gęstość komórkowa, stężenie mikronośnika w biomasie jest utrzymywane na stałym poziomie, a objętość pożywki nie jest zwiększana ponownie. Sposób stosowany do zwiększenia gęstości komórek i stężenia mikronośnika w biomasie hodowli komórkowej, zarówno niezainfekowanej jak i zainfekowanej wirusem, może być dowolnym sposobem znanym w dziedzinie stosowanym do zagęszczania hodowli komórkowej. Może to być dokonane metodami takimi jak np. sedymentacja, odwirowywanie, przesączanie, zatężanie z wykorzystaniem przyrządu perfuzyjnego takiego, jak sito, pozwalającymi na zmniejszenie obrabianej objętości, lub przez zlewanie płynów z dwóch lub więcej układów bioreatorów.
Gęstość hodowli komórkowej i stężenie mikronośników hodowli komórkowej rozrastającej się do momentu zlania są zwiększane, przy czym wzrost powinien być co najmniej 1,3-krotny w porównaniu do pierwotnej biomasy hodowanej do momentu zlania. Gęstość komórek pierwotnej wyjściowej hodowli komórkowej, która rozrasta się do zlania może zawierać się pomiędzy około 0,6x106 i około 7,0x106 komórek/ml. W tym przypadku, biomasa o zwiększonej gęstości komórkowej w porównaniu do wyjściowej biomasy hodowli może mieć gęstość komórek pomiędzy co najmniej 0,8x106 a co najmniej 9,0x106 komórek/ml.
PL 208 232 B1
Stężenie mikronośnika w wyjściowej hodowli komórkowej korzystnie zawiera się w przedziale od około 0,5 g/l do około 7,0 g/l. Stężenie mikronośnika po zatężeniu zlewającej się biomasy korzystnie zawiera się w przedziale od około 0,65 g/l do około 21 g/l.
Mikronośnik stosowany zgodnie ze sposobem według wynalazku korzystnie jest wybrany z grupy mikronośników otrzymanych w oparciu o dekstran, kolagen, polistyren, poliakrylamid, żelatynę, szkło, celulozę, polietylen i tworzywo sztuczne oraz tych opisanych przez Miller'a i wsp. (1989. Advances in Biochem Eng./Biotech. 39:73-95) i opisanych przez Butler'a (1988. W: Spier & Griffiths, Animal Cell Biotechnology 3:283-303).
Zgodnie z jednym wariantem wykonania sposobu według wynalazku wirus jest wybrany z grupy wirusa grypy, wirusa Ross River, wirusa zapalenia wątroby typu A, wirusa krowianki i rekombinowanego wirusa krowianki, wirusa opryszczki, wirusa japońskiego zapalenia mózgu, wirusa gorączki zachodniego Nilu, wirusa żółtej gorączki i ich chimer, jak również wirusa nieżytu nosa oraz reowirusa. Wybranie adhezyjnej komórki gospodarza i wirusa podatnego na takiego gospodarza oraz zastosowanie sposobu według wynalazku do uzyskania zwiększonej wydajności wirusa pożądanego wirusa mieści się w zakresie wiedzy specjalistów w dziedzinie.
Wybranie odpowiedniego typu mikronośnika, stężenia mikronośnika w wyjściowej hodowli, adhezyjnych komórek podatnych na wirusa, oraz pożywki i optymalnych warunków wzrostu, takich jak stężenie tlenu, dodatki pożywki, temperatura, pH, ciśnienie, szybkość sterowania i kontrola odżywiania, tak aby uzyskać biomasę zlewających się hodowli komórkowych, która może być użyta do wytworzenia biomasy komórek o zwiększonej gęstości komórkowej i stężeniu mikronośników zgodnie z tym sposobem jest w zakresie wiedzy specjalistów w dziedzinie. Hodowla komórkowa o biomasie wykazującej większą gęstość komórek może być wtedy stosowana do skutecznego namnażania i wytwarzania wirusa. Po tym, gdy hodowla komórkowa ulegnie zlaniu, sposób według wynalazku umożliwia uzyskanie hodowli komórkowej o zwiększonej gęstości komórek w stosunku do stężenia mikronośnika od co najmniej 1,3-krotnego do 10 krotnego i uzyskanie większej wydajności wirusa na objętość hodowli dzięki i) zmniejszeniu objętości hodowli i ii) zwiększeniu wydajności na komórkę.
Sposób wytwarzania wirusa i rozpiętość czasowa wytwarzania zależą od zastosowanego układu. Maksymalna wydajność wirusa możliwa do uzyskania dla poszczególnych układów może być określona z wykorzystaniem standardowych metod. Wirus i/lub komórki zawierające wirus jest/są zbierane kiedy osiągnięta jest maksymalna wydajność wirusa. Sposób według wynalazku dodatkowo obejmuje więc etap zbierania namnożonego i wytworzonego wirusa.
Innym aspektem wynalazku jest sposób wytwarzania oczyszczonego wirusa lub antygenu wirusa obejmujący etapy dostarczania hodowli adhezyjnych komórek związanych z mikronośnikiem, wzrostu hodowli komórkowej do momentu zlania, zainfekowania hodowli komórkowej wirusem, przy czym gęstość komórek w hodowli komórkowej wzrasta (i) przed zainfekowaniem wirusem lub (ii) po zainfekowaniu wirusem, inkubowania hodowli komórek zainfekowanych wirusem, w celu namnożenia tego wirusa (f) zebrania wytworzonego wirusa i (g) oczyszczania zebranego wirusa.
Zależnie od właściwości wirusa zastosowanego do zainfekowania i namnażania, wytwarzany wirus jest obecny w supernatancie hodowli komórkowej i/lub zasocjowany z biomasą komórkową. Wirusy lityczne, takie jak wirus grypy, przyczyniają się do lizy komórek po upływie odpowiedniego okresu czasu od zainfekowania i wirus jest uwalniany do pożywki hodowli komórkowej. Wytworzony i uwolniony do pożywki hodowli komórkowej wirus może być oddzielany od biomasy komórkowej lub innych fragmentów komórek konwencjonalnymi sposobami, takimi jak odwirowywanie, łącznie z ultrawirowaniem, wirowanie frakcjonujące, mikrosączenie, ultrasączenie, chromatografia jonowymienna itp., oraz oczyszczany.
Nielityczne wirusy są namnażane w komórkach i są zawsze związane z komórkami w biomasie. Wirusy te mogą być zebrane przez zebranie biomasy, lizę komórek konwencjonalnymi sposobami, takimi jak poddanie komórek działaniu detergenta, temperatury, procesu zamrażania/rozmrażania, sonikacji, prasy francuskiej lub innymi sposobami użytecznymi do rozkładu litycznego komórek. Uwolnione z komórek wirusy są zbierane, zatężane i oczyszczane. Oczyszczanie wirusa może być wykonane dowolnym sposobem znanym w dziedzinie, takim jak na przykład ultrasączenie, chromatografia jonowymienna lub wirowywanie w gradiencie gęstości itp.
Wirus grypy może być namnażany w liniach komórkowych, obejmujących najbardziej wydajne komórki MDCK, jak również w linii komórkowej, która została dopuszczona do użytku w procesie wytwarzania szczepionek dla ludzi, komórek Vero. Uprzednio opisano wytwarzanie na dużą skalę wirusa grypy na wolnej od surowicy lub wolnej od surowicy i białka pożywce w hodowli komórek ssaka na sferycznym mikronośniku - koralikach w bioreaktorze i uzyskiwanie szczepionki na grypę (Merten
PL 208 232 B1 i wsp., 1999, Dev. Biol. Stand. 98: 23-37; Kistner i wsp., 1998. Vaccine 16:960-968; Kistner i wsp. 1999, Dev. Biol. Stand. 98:101-110 i WO 96/15231).
Zgodnie z jednym aspektem, przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania wirusa grypy, obejmujący etapy dostarczania hodowli adhezyjnych komórek związanych z mikronośnikiem, wzrostu hodowli komórkowej do momentu zlania, zainfekowania komórek wirusem grypy, przy czym gęstość komórek w hodowli komórkowej wzrasta (i) przed zainfekowaniem wirusem lub (ii) po zainfekowaniu wirusem, inkubacji hodowli komórek zainfekowanych wirusem grypy do namnożenia wirusa. Komórkami zainfekowanymi wirusem grypy mogą być komórki VERO lub MDCK, lub dowolne inne komórki, które są podatne na wirusa grypy. Zgodnie z korzystnym wariantem wykonania według wynalazku, stosuje się komórki VERO, które są infekowane wirusem grypy. Zgodnie z korzystnym wariantem wykonania według wynalazku, komórki VERO wzrastają w wolnej od surowicy lub wolnej od surowicy i białka pożywce od początkowej ampułki do biomasy. Komórki VERO związane z mikronośnikiem wzrastają w odpowiedniej pożywce do momentu zlania i gęstość komórek i stężenie mikronośników są zwiększone co najmniej 1,3-krotnie. Komórki mogą być zainfekowane wirusem grypy albo przed albo po zwiększeniu gęstości komórek na objętość hodowli. Po inkubacji biomasy o wysokiej gęstości zainfekowanych komórek i wytworzeniu wirusa, wytworzony wirus grypy lub antygen wirusa grypy jest zbierany. Zebrany wirus jest dodatkowo oczyszczany sposobem znanym w dziedzinie, takim jak opisany w publikacji Kistner i wsp. 1998 (supra) lub w opisie patentowym USA 6048537.
Według innego aspektu wynalazku dostarczona jest biomasa hodowli komórek adhezyjnych związanych z mikronośnikiem o wysokiej gęstości komórek, przy czym gęstość komórek biomasy komórek w hodowli komórkowej jest, co najmniej 1,3-krotna w porównaniu do hodowli komórkowej, która wzrastała do momentu zlania. Hodowle adhezyjnych komórek związanych z mikronośnikiem stanowią komórki wybrane z grupy komórek zależnych od przylegania, takich jak VERO, BHK, CHO, RK, RK44, RK13, MRC-5, MDCK, CEF lub diploidalnych komórek monowarstwowych. Biomasę hodowli komórkowej o dużej gęstości komórek korzystnie stanowi hodowla komórek VERO.
Zgodnie z korzystnym wariantem wykonania niniejszego wynalazku biomasa hodowli komórkowej wzrasta w wolnej od surowicy pożywce i nie zawiera jakichkolwiek substancji lub środków pochodzących z surowicy. Zgodnie z innym korzystnym wariantem wykonania biomasa jest wolna od surowicy i białka i nie zawiera jakichkolwiek dodanych do pożywki substancji lub białek pochodzących z surowicy. Korzystnie, komórki wzrastają w wolnej od surowicy lub wolnej od surowicy i białka pożywce od początkowej ampułki do biomasy. Biomasa o wysokiej gęstości komórek podczas namnażania wirusa i procesu wytwarzania jest utrzymywana w wolnej od surowicy lub wolnej od surowicy i białka pożywce.
Według wynalazku biomasa komórek o większej gęstości komórek w porównaniu do hodowli komórkowej, która wzrasta do momentu zlania jest korzystnie zainfekowana wirusem. Gęstość komórek i objętość pożywki hodowli biomasy o wysokiej gęstości komórek zainfekowanych wirusem jest utrzymywana podczas procesu namnażania wirusa.
Według innego aspektu wynalazku przedmiotem wynalazku jest biomasa hodowli komórkowej komórek VERO związanych z mikronośnikiem, przy czym biomasa i gęstość komórek VERO w hodowli komórkowej jest co najmniej 1,3-krotna w porównaniu do hodowli komórek VERO, która wzrastała do zlania. Hodowla komórkowa ma także większe stężenie mikronośnika w porównaniu do komórek wzrastających do momentu zlania.
Według korzystnego wariantu wykonania niniejszego wynalazku biomasa hodowli komórkowej mająca większą gęstość komórek jest biomasą komórek VERO. Korzystnie, komórki wzrastają w wolnej od surowicy pożywce i biomasa jest wolna od surowicy. Według innego korzystnego wariantu wykonania niniejszego wynalazku biomasa hodowli jest wolna od surowicy i białka.
Według innego aspektu wynalazku przedmiotem wynalazku jest biomasa hodowli komórkowej zainfekowanych wirusem komórek adhezyjnych związanych z mikronośnikiem, przy czym biomasa zainfekowanych wirusem komórek w hodowli komórkowej jest co najmniej 1,3-krotna w porównaniu do hodowli komórkowej, która wzrastała do momentu zlania przed zainfekowaniem, i ma większą gęstość komórkową. Zgodnie z jednym wariantem wykonania biomasa komórek hodowli komórkowej jest wolna od surowicy. Zgodnie z innym korzystnym wariantem wykonania niniejszego wynalazku biomasa hodowli komórkowej komórek jest wolna od surowicy i białka. Komórkami korzystnie są komórki VERO. Ta wysoka gęstość komórek biomasy o wysokiej gęstości komórkowej zainfekowanej wirusem nie zmniejsza się podczas procesu propagacji wirusa.
Inny aspekt wynalazku dostarcza biomasę hodowli komórkowej komórek VERO związanych z mikronoś nikiem i wykazują c ą wysoką gę stość komórek zwią zanych z mikronoś nikiem, przy czym
PL 208 232 B1 biomasa komórek VERO we wspomnianej hodowli komórkowej jest co najmniej 1,3-krotna w porównaniu do hodowli komórek VERO, która wzrastała do momentu zlania, przy czym komórki VERO są zainfekowane wirusem. Komórki VERO są zainfekowane wirusem wybranym z grupy wirusa grypy, wirusa Ross River, wirusa zapalenia wątroby typu A, wirusa krowianki i ich rekombinowanych pochodnych, wirusa opryszczki pospolitej, wirusa japońskiego zapalenia mózgu, wirusa gorączki zachodniego Nilu, wirusa żółtej gorączki i ich chimer, wirusa nieżytu nosa i reowirusa.
Według jednego innego aspektu wynalazku przedmiotem wynalazku jest biomasa hodowli komórkowej komórek VERO związanych z mikronośnikiem i wykazująca wysoką gęstość komórek, przy czym komórki są zainfekowane wirusem grypy, a biomasa komórek VERO w hodowli komórkowej jest co najmniej 1,3-krotna w porównaniu do hodowli komórek VERO, która wzrastała do momentu zlania.
Według jednego innego aspektu wynalazku przedmiotem wynalazku jest biomasa hodowli komórkowej komórek VERO związanych z mikronośnikiem i wykazująca wysoką gęstość komórek, przy czym komórki są zainfekowane wirusem Ross River, a biomasa komórek VERO w hodowli komórkowej jest co najmniej 1,3-krotna w porównaniu do hodowli komórek VERO, która wzrastała do momentu zlania.
Według jednego innego aspektu wynalazku, wynalazek dostarcza biomasy hodowli komórkowej komórek VERO związanych z mikronośnikiem, wykazującej wysoką gęstość komórek, przy czym komórki są zainfekowane wirusem zapalenia wątroby typu A, a biomasa komórek VERO w hodowli komórkowej jest co najmniej 1,3-krotna w porównaniu do hodowli komórek VERO, która wzrastała do momentu zlania.
Po ogólnym opisie wynalazku, to samo będzie bardziej zrozumiałe przez odniesienie do następujących przykładów zamieszczonych jedynie w celu zilustrowania, a niezamierzonych do ograniczenia zakresu wynalazku chyba, że sprecyzowano inaczej.
P r z y k ł a d 1
Wytwarzanie antygenu wirusa w zatężonej biomasie komórek VERO a) Wzrost hodowli komórkowej
Komórki VERO (Zielona małpa Afrykańska, Cercopthecus aetiops, nerka) użyto do wytwarzania linii komórkowej. Komórki otrzymano z American Type Cell Culture Collection, Rockville, Stan Meryland z pasaża numer 124 oznaczonego przez ATCC jako CCL 81. Komórki przystosowano do wzrostu w pożywce wolnej od surowicy lub wolnej od surowicy i białka jak opisano w publikacji Kistner i wsp., 1998 (supra), opisie patentowym WO 96/15231 lub opisie patentowym USA 6100061. Do wzrostu na wolnej od surowicy pożywce zastosowano podstawową pożywkę DMEM HAM F12 uzupełniony solami nieorganicznymi, aminokwasami, wodorowęglanem sodu (2 g/l) i drożdżami lub wyciągiem z nasion soi (0,1 do 10 g/l). Roboczy bank komórek wytworzono bez zastosowania jakiegokolwiek składnika pożywki pochodzenia zwierzęcego.
Komórki roboczego banku komórek rozwijano w kolbach T i butelkach typu walcowego w stosunku 1:6 lub 1:8. Dalsze namnażanie komórek prowadzono w 100 l zbiorniku bioreaktora z mieszaniem z zastosowaniem mikronośnika Cytodex® jako podłoża do adsorpcji. Komórki wzrastały w temperaturze 37°C przez 6-8 dni. Utrzymywano stałe warunki hodowli - nasycenie tlenem 20% ± 10% i pH 7,25 ± 0,35. Pod koniec wytwarzania biomasy, wówczas gdy komórki osiągnęły wzrost do momentu zlania, jedną część objętości reaktora biomasy dwukrotnie zatężono na drodze sedymentacji i określono gęstość komórek niezatężonej i zatężonej hodowli komórkowej.
b) Określenie gęstości komórek w biomasie
Liczbę komórek w biomasie hodowli komórkowej pod koniec wytwarzania biomasy określono albo przez trypsynizację komórek i zliczenie licznikiem komórek CASY® (sposób A) jak opisano w publikacji Scharfe i wsp. (1988. Biotechnologie in LaborPraxis 10:1096-1103) lub przez potraktowanie kwasem cytrynowym i fioletem metylowym, a następnie zliczenie hemocytometrem (sposób B) jak opisano w publikacji Sanford i wsp. (1951. J. Natl. Cancer Inst. 11:773-795). Gęstość komórek i stężenie nośnika dla komórek Vero na koniec wytwarzania biomasy i po zatężeniu zlewającej się biomasy (przed zainfekowaniem) obliczono sposobami A i B. Dane przedstawiono w Tabeli 1.
T a b e l a 1
Oznaczanie liczby komórek w zlewającej się hodowli komórkowej pod koniec wytwarzania biomasy i po zatężeniu zlewają cej się hodowli komórkowej
| Wytworzona biomasa | Zatężona biomasa | |
| Stężenie nośnika g/l | 5,0 | 10,0 |
| Gęstość komórek Komórki/ml (sposób A) | 4,6 x 106 | 9,2 x 106 |
| Gęstość komórek Komórki/ml (sposób B) | 5,6 x 106 | 11,2 x 106 |
PL 208 232 B1
P r z y k ł a d 2
Porównanie wytwarzania antygenu wirusa w zlewającej się biomasie i zatężonej zlewającej się biomasie
Komórki Vero o określonych numerach pasaży wyjęto z ciekłego azotu i pozostawiono do odtajenia, oraz pasażowano w kolbie Roux i butelkach typu walcowego do wytworzenia wystarczającej liczby komórek do zaszczepienia w 1,5 litrowym bioreaktorze. Po osiągnięciu zlania się komórek o końcowej gęstości komórek 1,5x106 komórek/ml komórki poddano działaniu trypsyny i przeniesiono do 10 litrowego bioreaktora. Te z kolei użyto jako materiał inokulacyjny do 100 litrowego bioreaktora przy stężeniu mikronośnika 1,5 g/l. Wychodząc z ampułki z roboczego banku komórek zawierającej 10 komórek około 30 pokoleń jest pożądanym osiągnięcie końcowego zlania się komórek Vero w biomasę. Hodowla wzrastała do osiągnięcia zlania się komórek i osiągnięcia końcowej gęstości komórek 1,9x106 /ml. Przed zainfekowaniem wirusem, do dwóch 10 litrowych układów bioreaktorów wprowadzono biomasę hodowli komórkowej, o różnej całkowitej liczbie komórek. Do fermentora A wprowadzono 1,9x1010 komórek, a do fermentora B całkowitą liczbę komórek 3,8x1010. Aby osiągnąć większą biomasę i stężenie nośnika wprowadzanego do fermentora B hodowlę komórkową wzrastającą do zlania się komórek zatężono by przez sedymantację biomasy uzyskując dwukrotne zatężenie. Fermentor A zawiera 100% i fermentor B 200% biomasy komórek wyjściowej hodowli komórkowe wzrastającej do zlania,
a) Wytwarzanie wirusa grypy
Hodowle komórkowe w fermentorze A i B zainfekowano szczepem wirusa grypy H3N2 A/Sydney/5/97 o m.o.i (nadmiarze wirusa w stosunku do komórek docelowych; ang. multiplicity of infeciton) 0,01. Zastosowano identyczne parametry procesu 32°C, pO2 -20% i pH 7,1. Aby zaktywować wirusa grypy w celu namnożenia wirusa dodano proteazy, takiej jak trypsyna, pronaza lub jej trypsyno - podobnej części.
Oznaczono wydajność wytwarzania antygenu wirusa w dwu różnych hodowlach komórkowych z fermentorów A i B zawierają cych róż ne stężenia biomasy i porównano w oparciu o miano wirusa grypy (HAU/ml) i zawartość antygenu (gradient gęstości oczyszczonego antygenu). Pole pod krzywą odpowiada całkowitemu stężeniu antygenu pod koniec cyklu litycznego po 3 dniach od zainfekowania. Dane przedstawiono w Tabeli 2.
T a b e l a 2
Oznaczanie miana wirusa grypy i antygenu w zlewającej się hodowli komórek VERO i zatężonej zlewają cej się biomasie komórek VERO
| Fermentor | A | B |
| Stężenie nośnika | 1,5 g/l | 3,0 g/l |
| Gęstość komórek Komórki/ml (sposób B) | 1,90 x 106 | 3,80 x 106 |
| HAU/ml | 640 | 2560 |
| Pole powierzchni (jednostki wzg.) | 83,3 (100%) | 412,3 (495%) |
b) Wytwarzanie wirusa Ross River
Komórki VERO namnażano jak opisano wyżej do momentu zlania się komórek i osiągnięcia końcowej 1,6x106 komórek/ml. Przed zainfekowaniem wirusem, do dwóch 10 litrowych układów bioreaktorów wprowadzono biomasę hodowli komórkowej, o różnej całkowitej liczbie komórek. Do fermentora A wprowadzono 1,6x106 komórek, a do fermentora B 2,3x106 komórek, co stanowi 1,5 krotne stężenie biomasy zlewającej się hodowli komórkowej. Fermentory A i B zainfekowano wirusem Ross River i określono wydajność wytwarzania antygenu wirusa w fermentorach A i B tak jak opisano wyżej. Tabela 3 przedstawia wyniki wydajności wirusa otrzymane przy zastosowaniu różnych stężeń biomasy do namnażania wirusa.
T a b e l a 3
Oznaczanie miana wirusa Ross River i wytwarzania antygenu wirusa
| Fermentor | A | B |
| Stężenie nośnika g/l | 1,5 | 2,25 |
| Gęstość komórek (x106 komórek/ml) | 1,6 | 2,3 |
| Miano wirusa (log TCID50) | 8,71 | 8,95 |
| Miano wirusa pfu/106 komórek (x 106) | 321 | 388 |
| Wydajność (%) | 100 | 121 |
PL 208 232 B1
P r z y k ł a d 3
Wytwarzanie antygenu wirusa w zatężonej biomasie komórek RK
a) Wzrost hodowli komórkowej
Komórki z nerki królika RK-13 lub ich komplementarną pochodną RK-D4R-44 jak opisano w publikacji Holzer'a i wsp. (1997. J. Virol. 71:4997-5002) zastosowano do wytwarzania linii komórkowych. Komórki wzrastały w tradycyjnej pożywce zawierającej 2% surowicy.
Komórki z roboczego banku komórek rozwijano w kolbach T i butelkach typu walcowego w stosunku 1:6. Dalsze namnażanie komórek prowadzono w 10 l zbiorniku bioreaktora z mieszaniem wykorzystując mikronośniki Cytodex® (Pharmacia) jako podłoże do związania komórek.
b) Wytwarzanie uszkodzonego wirusa krowianki
Po osiągnięciu zlania komórek RK-13 lub RK-D4R-44 i osiągnięciu gęstości końcowej w zbiorniku bioreaktora, biomasę zainfekowano wirusem krowianki WR lub uszkodzonym wirusem krowianki vD4-ZG#2 jak opisano w publikacji Holzer i wsp. 1997 (supra) z m.o.i. 0,01. Po zainfekowaniu, do dwóch 10 litrowych układów bioreaktorów wprowadzono biomasy hodowli komórkowej, mające różne całkowite liczby komórek. Do fermentora A wprowadzono 1,2 x 1010 komórek, a do fermentora B 2,4x1010 komórek. Aby uzyskać większą biomasę i stężenie nośnika w fermentorze B, zainfekowaną hodowlę komórkową wzrastającą do zlania zatężono przez sedymantację biomasy ażeby osiągnąć większe stężenie. Fermentor A zawiera 100% a fermentor B 200% biomasy komórek pierwotnej hodowli komórkowej wzrastającej do zlania. Określono wydajność antygenu wirusa dla dwóch różnych hodowli komórkowych fermentorów A i B zawierających różne stężenia biomasy na objętość pożywki zainfekowanych komórek. Wyniki zebrano w Tabeli 4.
T a b e l a 4
Oznaczanie miana wirusa krowianki komórek-RK
| Fermentor | A | B |
| Stężenie nośnika g/l | 1,5 | 2,5 |
| Gęstość komórek (x 106 komórek/ml) | 1,2 | 2,4 |
| Miano wirusa pfu/106 komórek (x 106) | 0,8 | 1,3 |
| Wydajność (%) | 100 | 162 |
Powyższe przykłady zamieszczono jedynie w celu zilustrowania wynalazku, a nie w celu ograniczenia jego zakresu. Inne warianty wykonania niniejszego wynalazku są łatwe do opracowania przez specjalistę w dziedzinie i są objęte dołączonymi zastrzeżeniami. Wszystkie cytowane publikacje, opisy patentowe i zgłoszenia patentowe są włączone niniejszym jako odnośniki literaturowe.
Claims (27)
1. Sposób wytwarzania wirusa lub wirusowego antygenu, znamienny tym, że obejmuje etapy (a) dostarczania hodowli komórek adhezyjnych związanych z mikronośnikiem, (b) wzrostu hodowli komórkowej do momentu konfluencji, (c) zainfekowania tych komórek wirusem, i (d) inkubowania hodowli komórek zainfekowanych wirusem do namnażania wirusa, przy czym gęstość komórek w biomasie hodowli komórkowej wzrastającej do momentu konfluencji jest zatężona (i) przed etapem (c) lub (ii) po etapie (c) i jest utrzymywana zatężona gęstość komórek podczas etapu (d).
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że gęstość komórek biomasy hodowli komórkowej wrastającej do momentu konfluencji zatężono co najmniej około 1,3-krotnie.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że gęstość komórek biomasy hodowli komórkowej wrastającej do momentu konfluencji zawiera się między około 0,6 x 106 a około 7,0 x 106 komórek/ml.
4. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 3, znamienny tym, że mikronośnik jest wybrany z grupy składającej się z mikronośników otrzymanych w oparciu o dekstran, kolagen, polistyren, poliakrylamid, żelatynę, szkło, celulozę, polietylen i tworzywo sztuczne.
5. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 4, znamienny tym, że stężenie mikronośnika w hodowli komórek w etapie (a) zawiera się między około 0,5 g/l i około 14 g/l.
PL 208 232 B1
6. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 5, znamienny tym, że komórki są wybrane z grupy komórek adhezyjnych VERO, BHK, CHO, RK, RK44, RK13, MRC-5, MDCK, CEF lub komórek monowarstwy diploidalnej.
7. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 6, znamienny tym, że komórki związane z mikronośnikiem wrastają w pożywce wolnej od surowicy.
8. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 7, znamienny tym, że komórki związane z mikronośnikiem wrastają w pożywce wolnej od surowicy i białka.
9. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 7, znamienny tym, ż e wirus jest wybrany z grupy wirusów: wirusa grypy, wirusa Ross River, wirusa zapalenia wątroby typu A, wirusa krowianki i jego rekombinowanych pochodnych, wirusa opryszczki, wirusa japońskiego zapalenia mózgu, wirusa gorączki zachodniego Nilu, wirusa żółtej gorączki i ich chimer, jak również wirusa nieżytu nosa oraz reowirusa.
10. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 9, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje etap (e) zbierania namnożonego wirusa.
11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje etap (f) oczyszczania zbieranego wirusa w celu uzyskania oczyszczonego wirusa lub antygenu wirusa.
12. Sposób według zastrz. 10 albo 11, znamienny tym, że wytworzony wirus jest zbierany z supernatantu hodowli komórkowej.
13. Sposób według zastrz. 10 albo 11, znamienny tym, że wytworzony wirus jest zbierany z biomasy komórkowej.
14. Sposób według jednego z zastrz. 10 albo 11 albo 13, znamienny tym, że obejmuje ponadto etap przetwarzania oczyszczonego wirusa lub antygenu wirusowego do postaci szczepionki.
15. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 14, znamienny tym, że wytworzony wirus lub antygen wirusa jest wirusem grypy lub antygenem wirusa grypy.
16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że komórki są komórkami VERO.
17. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że komórki są komórkami MDCK.
18. Biomasa hodowli komórkowej adhezyjnych komórek związanych z mikronośnikiem, znamienna tym, że gęstość komórkowa biomasy komórek w hodowli komórkowej jest przynajmniej około 1,3-krotna w porównaniu do gęstości komórkowej tej hodowli wzrastającej do momentu konfluencji.
19. Hodowla według zastrz. 18, znamienna tym, że komórkami są komórki VERO.
20. Hodowla według zastrz. 18 albo 19, znamienna tym, że jest wolna od surowicy.
21. Hodowla według zastrz. 20, znamienna tym, że jest wolna od surowicy i białka.
22. Hodowla według jednego z zastrz. 18 do 21, znamienna tym, że komórki są zainfekowane wirusem.
23. Hodowla według zastrz. 22, znamienna tym, że gęstość komórkowa biomasy zainfekowanych komórek w hodowli komórkowej jest przynajmniej około 1,3 krotna w porównaniu do gęstości komórek tej hodowli komórkowej, która wzrastała do momentu konfluencji przed zainfekowaniem.
24. Hodowla według zastrz. 22 albo 23, znamienna tym, że jest zainfekowana wirusem wybranym z grupy wirusów: wirusa grypy, wirusa Ross River, wirusa zapalenia wątroby typu A, wirusa krowianki i jego rekombinowanych pochodnych, wirusa opryszczki, wirusa japońskiego zapalenia mózgu, wirusa gorączki zachodniego Nilu, wirusa żółtej gorączki i ich chimer, jak również wirusa nieżytu nosa oraz reowirusa.
25. Hodowla według jednego z zastrz. 22 do 24, znamienna tym, że wirusem jest wirus grypy.
26. Hodowla według jednego z zastrz. 22 do 24, znamienna tym, że wirusem jest wirus Ross River.
27. Hodowla według jednego z zastrz. 22 do 24, znamienna tym, że wirusem jest wirus krowianki.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US10/006,881 US6951752B2 (en) | 2001-12-10 | 2001-12-10 | Method for large scale production of virus antigen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL373487A1 PL373487A1 (pl) | 2005-09-05 |
| PL208232B1 true PL208232B1 (pl) | 2011-04-29 |
Family
ID=21723079
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL373487A PL208232B1 (pl) | 2001-12-10 | 2002-12-10 | Sposób wytwarzania wirusa lub antygenu wirusowego oraz biomasa hodowli komórkowej |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6951752B2 (pl) |
| EP (3) | EP1894998A1 (pl) |
| JP (2) | JP4370511B2 (pl) |
| CN (2) | CN101100657B (pl) |
| AT (1) | ATE447010T2 (pl) |
| AU (1) | AU2002358662B2 (pl) |
| CA (1) | CA2469644C (pl) |
| DE (2) | DE122010000025I1 (pl) |
| DK (2) | DK2330189T3 (pl) |
| ES (2) | ES2488818T3 (pl) |
| FR (1) | FR10C0026I1 (pl) |
| HU (1) | HU225791B1 (pl) |
| MX (1) | MXPA04005644A (pl) |
| NO (1) | NO20042910L (pl) |
| PL (1) | PL208232B1 (pl) |
| RU (1) | RU2314344C2 (pl) |
| WO (1) | WO2003054174A1 (pl) |
Families Citing this family (70)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7445924B2 (en) | 2000-11-23 | 2008-11-04 | Bavarian Nordic A/S | Modified Vaccinia Ankara virus variant and cultivation method |
| US6951752B2 (en) * | 2001-12-10 | 2005-10-04 | Bexter Healthcare S.A. | Method for large scale production of virus antigen |
| ATE302268T1 (de) * | 2001-12-20 | 2005-09-15 | Bavarian Nordic As | Methode zur gewinnung und reinigung von poxviren aus infizierten zellen |
| ES2305514T5 (es) | 2002-09-05 | 2019-06-14 | Bavarian Nordic As | Método para la amplificación de un poxvirus en condiciones exentas de suero |
| TWI312368B (en) * | 2002-12-23 | 2009-07-21 | Bristol Myers Squibb Compan | Mammalian cell culture processes for protein production |
| CA2551026A1 (en) * | 2003-12-23 | 2005-07-14 | Schering Corporation | Methods for producing a549 cell lines stable in serum-free medium suspension culture |
| JP2007522814A (ja) | 2004-02-23 | 2007-08-16 | クルセル ホランド ベー ヴェー | ウイルスの精製方法 |
| WO2005103235A1 (ja) * | 2004-04-19 | 2005-11-03 | Denka Seiken Co., Ltd. | ウイルスの生産方法 |
| NZ551640A (en) * | 2004-05-20 | 2010-05-28 | Id Biomedical Corp | Process for the production of an influenza vaccine |
| EP1831353B1 (en) * | 2004-12-23 | 2012-02-29 | MedImmune, LLC | Non-tumorigenic mdck cell line for propagating viruses |
| US7344839B2 (en) * | 2004-12-23 | 2008-03-18 | Aurx, Inc. | Virus preparations and methods |
| AU2007245192B2 (en) | 2006-03-31 | 2012-04-12 | Wisconsin Alumni Research Foundation | High titer recombinant influenza viruses for vaccines |
| KR101464783B1 (ko) | 2006-09-15 | 2014-11-26 | 메디뮨 엘엘씨 | 높은 역가로 바이러스 증식을 지원하는 ｍｄｃｋ 세포주 및 이를 이용한 생물반응기 공정 |
| JP5084214B2 (ja) * | 2006-09-29 | 2012-11-28 | 一般財団法人日本ポリオ研究所 | Ｉｐｖワクチン |
| RU2476594C2 (ru) * | 2007-05-04 | 2013-02-27 | Бакстер Интернэшнл Инк. | Двухстадийный температурный профиль для культивирования вирусов |
| US9474798B2 (en) | 2007-06-18 | 2016-10-25 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Influenza M2 protein mutant viruses as live influenza attenuated vaccines |
| JP2011512877A (ja) * | 2008-03-12 | 2011-04-28 | ワイス・エルエルシー | 組換えタンパク質の大スケール産生に適した細胞を同定する方法 |
| CA2733356C (en) * | 2008-08-01 | 2016-06-07 | Gamma Vaccines Pty Limited | Influenza vaccines |
| CA2738024A1 (en) | 2008-09-24 | 2010-04-01 | Medimmune, Llc | Methods for purification of viruses |
| CN103952376A (zh) * | 2008-09-24 | 2014-07-30 | 米迪缪尼有限公司 | 培养细胞、增殖和纯化病毒的方法 |
| ES2524975T3 (es) | 2009-07-31 | 2014-12-16 | Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. | Cepa del virus de la fiebre amarilla de alto rendimiento con mayor propagación en células |
| JP2013507990A (ja) | 2009-10-26 | 2013-03-07 | ダブリュエーアールエフ−ウィスコンシン アラムナイ リサーチ ファウンデーション | ベロ細胞において増強された複製を有する高力価の組換えインフルエンザウイルス |
| WO2011077035A1 (fr) * | 2009-12-23 | 2011-06-30 | Sanofi Pasteur | Procede de culture de cellules adherentes |
| US10130697B2 (en) | 2010-03-23 | 2018-11-20 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Vaccines comprising mutant attenuated influenza viruses |
| WO2011130119A2 (en) | 2010-04-14 | 2011-10-20 | Millipore Corporation | Methods of producing high titer, high purity virus stocks and methods of use thereof |
| EP2625264B1 (en) | 2010-10-08 | 2022-12-07 | Terumo BCT, Inc. | Methods and systems of growing and harvesting cells in a hollow fiber bioreactor system with control conditions |
| CN101979517B (zh) * | 2010-10-15 | 2011-12-28 | 普莱柯生物工程股份有限公司 | 一种利用生物反应器大规模生产流感病毒的方法 |
| EP2667891B1 (en) | 2011-01-27 | 2021-10-06 | Gamma Vaccines Pty Limited | Combination vaccines |
| JP2014527799A (ja) | 2011-08-26 | 2014-10-23 | ダブリュエーアールエフ−ウィスコンシン アラムナイ リサーチ ファウンデーション | 変異型ｐｂ２遺伝子セグメントを有する弱毒化生ワクチンとしてのインフルエンザウイルス |
| CN102492659A (zh) * | 2011-11-14 | 2012-06-13 | 成都康华生物制品有限公司 | 一种疫苗生产用甲肝病毒的生产方法 |
| EP3022296B1 (en) | 2013-07-15 | 2022-12-28 | Wisconsin Alumni Research Foundation | High titer recombinant influenza viruses with enhanced replication in mdck or vero cells or eggs |
| CN103387958B (zh) * | 2013-08-16 | 2016-04-06 | 北京科兴中维生物技术有限公司 | 人胚肺成纤维细胞sv-7在病毒培养中的应用 |
| EP3068866B1 (en) | 2013-11-16 | 2018-04-25 | Terumo BCT, Inc. | Expanding cells in a bioreactor |
| WO2015148704A1 (en) | 2014-03-25 | 2015-10-01 | Terumo Bct, Inc. | Passive replacement of media |
| WO2015196150A2 (en) | 2014-06-20 | 2015-12-23 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Mutations that confer genetic stability to additional genes in influenza viruses |
| US20160090569A1 (en) | 2014-09-26 | 2016-03-31 | Terumo Bct, Inc. | Scheduled Feed |
| KR101983486B1 (ko) | 2015-01-26 | 2019-05-28 | 우베 고산 가부시키가이샤 | 폴리이미드 다공질막을 이용하는 세포의 대량 배양 방법, 장치 및 키트 |
| US10519478B2 (en) | 2015-01-26 | 2019-12-31 | Ube Industries, Ltd. | Method of producing substance |
| US10633422B2 (en) | 2015-06-01 | 2020-04-28 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Influenza virus replication by inhibiting microRNA lec7C binding to influenza viral cRNA and mRNA |
| WO2017004592A1 (en) | 2015-07-02 | 2017-01-05 | Terumo Bct, Inc. | Cell growth with mechanical stimuli |
| US9890363B2 (en) | 2015-07-06 | 2018-02-13 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Influenza virus replication for vaccine development |
| JP2019510481A (ja) | 2016-02-19 | 2019-04-18 | ウィスコンシン アルムニ リサーチ ファンデイション | ワクチン開発のための改善されたｂ型インフルエンザウイルス複製 |
| WO2017205667A1 (en) | 2016-05-25 | 2017-11-30 | Terumo Bct, Inc. | Cell expansion |
| US11685883B2 (en) | 2016-06-07 | 2023-06-27 | Terumo Bct, Inc. | Methods and systems for coating a cell growth surface |
| US11104874B2 (en) | 2016-06-07 | 2021-08-31 | Terumo Bct, Inc. | Coating a bioreactor |
| US11932841B2 (en) | 2016-07-25 | 2024-03-19 | Ube Corporation | Cell cultivation module |
| JP6897680B2 (ja) | 2016-07-25 | 2021-07-07 | 宇部興産株式会社 | サイフォン式培養法 |
| CN110612344B (zh) | 2017-03-31 | 2023-09-12 | 泰尔茂比司特公司 | 细胞扩增 |
| US12234441B2 (en) | 2017-03-31 | 2025-02-25 | Terumo Bct, Inc. | Cell expansion |
| US11624046B2 (en) | 2017-03-31 | 2023-04-11 | Terumo Bct, Inc. | Cell expansion |
| EP3700562A1 (en) | 2017-10-25 | 2020-09-02 | Wisconsin Alumni Research Foundation (WARF) | Recombinant influenza viruses with stabilized ha for replication in eggs |
| CN111615399A (zh) * | 2018-01-18 | 2020-09-01 | 依生生物制药(新加坡)私人有限公司 | 一种使流感病毒适应Vero细胞的方法 |
| SG11202007503WA (en) * | 2018-02-07 | 2020-09-29 | Bharat Biotech Int Ltd | A process for enterovirus purification and inactivation and vaccine compositions obtained thereof |
| JP7783047B2 (ja) | 2018-08-07 | 2025-12-09 | ウィスコンシン アルムニ リサーチ ファンデイション | 組換えの生物学的に封じ込められたフィロウイルスワクチン |
| EP3840780A1 (en) | 2018-08-20 | 2021-06-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Vectors for eliciting immune responses to non-dominant epitopes in the hemagglutinin (ha) protein |
| EP3914295A2 (en) | 2019-01-23 | 2021-12-01 | Yoshihiro Kawaoka | Mutations that confer genetic stability to additional genes in influenza viruses |
| KR102228267B1 (ko) * | 2019-01-25 | 2021-03-17 | 바이로큐어 주식회사 | Bhk-21 세포를 이용한 바이러스 생산방법 |
| WO2020153619A1 (ko) * | 2019-01-25 | 2020-07-30 | 바이로큐어 주식회사 | Bhk-21 세포를 이용한 바이러스 생산방법 |
| US11851648B2 (en) | 2019-02-08 | 2023-12-26 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Humanized cell line |
| AU2020221305A1 (en) * | 2019-02-15 | 2021-08-26 | Ology Bioservices, Inc. | Method for virus production |
| WO2020223699A1 (en) | 2019-05-01 | 2020-11-05 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Improved influenza virus replication for vaccine development |
| TW202122569A (zh) | 2019-08-09 | 2021-06-16 | 日商宇部興產股份有限公司 | 應用小片多孔膜的細胞培養法 |
| TW202122572A (zh) | 2019-08-09 | 2021-06-16 | 日商宇部興產股份有限公司 | 胞外體的產生方法 |
| WO2021041624A2 (en) | 2019-08-27 | 2021-03-04 | Yoshihiro Kawaoka | Recombinant influenza viruses with stabilized ha for replication in eggs |
| JP2023511444A (ja) | 2020-01-24 | 2023-03-17 | ウィスコンシン アルムニ リサーチ ファンデイション | 安定化されたｎａを有する組換えインフルエンザウイルス |
| US12290562B2 (en) | 2020-03-25 | 2025-05-06 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Recombinant multivalent influenza viruses |
| CN111850169B (zh) * | 2020-07-16 | 2022-09-27 | 华农（肇庆）生物产业技术研究院有限公司 | 一种计算AIV在MDCK-sus细胞中细胞单位均产毒量的方法 |
| WO2022204315A1 (en) | 2021-03-23 | 2022-09-29 | Terumo Bct, Inc. | Cell capture and expansion |
| US12209689B2 (en) | 2022-02-28 | 2025-01-28 | Terumo Kabushiki Kaisha | Multiple-tube pinch valve assembly |
| USD1099116S1 (en) | 2022-09-01 | 2025-10-21 | Terumo Bct, Inc. | Display screen or portion thereof with a graphical user interface for displaying cell culture process steps and measurements of an associated bioreactor device |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4525349A (en) | 1981-12-29 | 1985-06-25 | Societe Anonyme Dite: Institut Merueux | Process for the large-scale production of a vaccine against poliomyelitis and the resulting vaccine |
| AT393356B (de) | 1989-12-22 | 1991-10-10 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung von fsme-virus-antigen |
| US5719051A (en) * | 1989-12-22 | 1998-02-17 | Immuno Aktiengesellschaft | Perfusion system and a method for the large scale production of virus or virus antigen |
| FR2723740B1 (fr) | 1994-08-16 | 1996-11-08 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Procede de preparation d'antigenes du virus grippal, antigenes obtenus et leurs applications |
| US5824536A (en) * | 1994-08-23 | 1998-10-20 | St. Jude Children's Research Hospital | Influenza virus replicated in mammalian cell culture and vaccine production |
| DK0791055T3 (da) | 1994-11-10 | 2012-04-16 | Baxter Healthcare Sa | Fremgangsmåde til fremstilling af biologiske produkter i proteinfri kultur |
| DE19612966B4 (de) * | 1996-04-01 | 2009-12-10 | Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh & Co. Kg | MDCK-Zellen und Verfahren zur Vermehrung von Influenzaviren |
| GB2319413B (en) * | 1996-11-12 | 2001-06-06 | Lsi Logic Corp | Driver circuits |
| US6168944B1 (en) * | 1997-01-31 | 2001-01-02 | Schering Corporation | Methods for cultivating cells and propagating viruses |
| DE69835813T2 (de) * | 1997-01-31 | 2007-09-13 | Schering Corp. | Verfahren zur kultivierung von zellen und zur vermehrung von viren |
| AT407255B (de) | 1997-06-20 | 2001-02-26 | Immuno Ag | Rekombinanter zellklon mit erhöhter stabilität in serum- und proteinfreiem medium und verfahren zur gewinnung des stabilen zellklons |
| US5994134A (en) * | 1998-05-04 | 1999-11-30 | Canji, Inc. | Viral production process |
| US6855535B2 (en) * | 2001-12-10 | 2005-02-15 | Baxter Healthcare S.A. | Method of large scale production of Hepatitis A virus |
| US6951752B2 (en) * | 2001-12-10 | 2005-10-04 | Bexter Healthcare S.A. | Method for large scale production of virus antigen |
-
2001
- 2001-12-10 US US10/006,881 patent/US6951752B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-12-10 EP EP07021348A patent/EP1894998A1/en not_active Withdrawn
- 2002-12-10 DK DK10011842.1T patent/DK2330189T3/da active
- 2002-12-10 EP EP10011842.1A patent/EP2330189B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-12-10 MX MXPA04005644A patent/MXPA04005644A/es active IP Right Grant
- 2002-12-10 WO PCT/EP2002/014011 patent/WO2003054174A1/en not_active Ceased
- 2002-12-10 EP EP02792957.9A patent/EP1453956B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-12-10 CN CN2007101271424A patent/CN101100657B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2002-12-10 RU RU2004121178/13A patent/RU2314344C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2002-12-10 DE DE122010000025C patent/DE122010000025I1/de active Pending
- 2002-12-10 DE DE60234211T patent/DE60234211D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-12-10 AT AT02792957T patent/ATE447010T2/de active
- 2002-12-10 CA CA2469644A patent/CA2469644C/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-12-10 PL PL373487A patent/PL208232B1/pl unknown
- 2002-12-10 CN CNB028279778A patent/CN100335619C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2002-12-10 ES ES10011842.1T patent/ES2488818T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-12-10 ES ES02792957.9T patent/ES2335395T5/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-12-10 JP JP2003554878A patent/JP4370511B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2002-12-10 DK DK02792957T patent/DK1453956T3/da active
- 2002-12-10 HU HU0402415A patent/HU225791B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2002-12-10 AU AU2002358662A patent/AU2002358662B2/en not_active Expired
-
2004
- 2004-07-09 NO NO20042910A patent/NO20042910L/no not_active Application Discontinuation
-
2005
- 2005-03-17 US US11/084,485 patent/US7524676B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2009
- 2009-07-02 JP JP2009157882A patent/JP5021000B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2010
- 2010-04-16 FR FR10C0026C patent/FR10C0026I1/fr active Active
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL208232B1 (pl) | Sposób wytwarzania wirusa lub antygenu wirusowego oraz biomasa hodowli komórkowej | |
| CA2455189C (en) | Methods for producing an active constituent of a pharmaceutical or a diagnostic agent in an mdck cell suspension culture | |
| AU2002338666B2 (en) | Multiplication of viruses in a cell culture | |
| JP6244294B2 (ja) | 細胞を培養するための動物性タンパク質非含有培地 | |
| HK1115609B (en) | Method for large scale production of virus antigen | |
| HK1158691B (en) | Method for large scale production of virus | |
| HK1116825A (en) | Method for large scale production of virus | |
| HK1062029B (en) | Multiplication of viruses in a cell culture | |
| HK1083635B (en) | Animal protein free media for cultivation of cells |