PT1511768E

PT1511768E - Composições imunogénicas

Info

Publication number: PT1511768E
Application number: PT03757056T
Authority: PT
Inventors: Cabezon Silva; Jonathan H Ellis; C M G Gerard; Paul A Hamblin; R M Palmantier; C Vinals Y De Bassols
Original assignee: Glaxo Group Ltd; Glaxosmithkline Biolog Sa
Priority date: 2002-06-11
Filing date: 2003-06-06
Publication date: 2007-07-16
Also published as: US20060147477A1; JP2006512047A; MXPA04012443A; CO5631450A2; ES2285174T3; CN1675237A; EP1511768A1; HK1074846A1; IL165372A0; ATE359295T1; MY139557A; CA2487831A1; DK1511768T3; UY27840A1; NZ537125A; WO2003104272A1; TW200400970A; AR040178A1; PL374534A1; IS7547A

Description

DESCRIÇÃO "COMPOSIÇÕES IMUNOGÉNICAS" A presente invenção refere-se a parceiros de fusão que actuam como parceiros de fusão imunológicos, como intensificadores de expressão e, de um modo preferido, a parceiros de fusão que têm ambas as funções. A invenção também se refere a proteínas de fusão que os contêm, à sua produção, à sua utilização em vacinas e à sua utilização em medicamentos. Em particular, são proporcionados parceiros de fusão que contêm um denominado domínio de ligação à colina, por exemplo fusões compreendendo LytA de Streptococcus pneumoniae ou a lisozima CPI de fago pneumocócico (CPL1), em que o domínio de ligação à colina é modificado para incluir um epitopo heterólogo de auxiliar T. É mostrado que esses parceiros de fusão melhoram o nível de expressão da proteína heteróloga aí ligada e também têm utilidade particular quando fundidos a proteínas ou péptidos pouco imunogénicos que são, de outro modo, úteis como antigénios de vacina. Mais particularmente, esses parceiros de fusão são úteis em construções compreendendo auto-antigénios, e. g., antigénios específicos de tumor ou específicos de tecido.

Antecedentes da invenção 0 streptococcus pneumoniae sintetiza uma N-acetil-L-alanina amidase, LytA, uma autolisina que degrada especificamente a estrutura básica de peptidoglicano da parede celular conduzindo, eventualmente, à lise celular. A sua cadeia polipeptídica tem dois domínios. 0 domínio do N-terminal é responsável pela 1 actividade catalítica, enquanto que o domínio do C-terminal da LytA é responsável pela afinidade à colina e ancoragem à parede celular. Este domínio do C-terminal é conhecido por se ligar a colina e a análogos de colina e também se irá ligar a aminas terciárias, tais como DEAE (dietilaminoetilo), habitualmente utilizadas em cromatografia. A LytA é uma proteína de 318 aminoácidos e a parte do C-terminal compreende um tandem de seis repetições imperfeitas de 20 ou 21 aminoácidos e uma extremidade do COOH-terminal curta. As repetições estão localizadas nas seguintes posições:

Rl: 177-191 R2: 192-212 R3: 213-234 R4: 235-254 R5: 255-275 R6: 276-298

Estas repetições são previstas serem numa conformação de beta-volta. O C-terminal é responsável pela ligação à colina. Do mesmo modo, o C-terminal de CPL1 é responsável pela afinidade de ligação e os resíduos aromáticos na repetição contribuem para essa ligação. Estas proteínas foram utilizadas como marcadores de afinidade para permitir purificação rápida (Sanchez Puelles, Eur J Biochem. 1992, 203, 153-9).

Foram também estudadas outras proteínas com um domínio de ligação à colina em Streptococcus pneumoniae.

Uma delas, PspA (ou Proteína A de Superfície Pneumocócica), é um factor de virulência (Yother J e Briles (1992) J Bacteriol 174(2) p 601). Esta proteína é antigénica e imunogénica. Tem um 2 domínio do C-terminal consistindo de 10 repetições de 20 aminoácidos, homólogas às repetições da LytA. A CbpA (ou Proteína A de Ligação à Colina) está envolvida na aderência dos pneumococos às células humanas (Rosenow et al. (1997) Mol Microbiol 25 (5) p 819) . Apresenta 10 repetições de 20 aminoácidos no domínio do C-terminal que são quase idênticas àquelas da PspA. A LytB e a LytC têm uma organização modular diferente das proteínas acima mencionadas uma vez que os seus domínios de ligação à colina, compostos de 15 repetições e 11 repetições respectivamente, estão situados na extremidade do N-terminal, não na extremidade do C-terminal (Garcia P Mol Microbiol (1999) 31 (4) pl275 e Garcia P et al. (1999) Mol Microbiol do 33(1) pl28) . A comparação de sequência mostra que LytB tem actividade de glucosamidase. A LytC mostra in vitro uma actividade de tipo lisozima. Adicionalmente, em 1995 foram clonados três genes denominados PepA, PepB e PepC. Embora a sua função seja desconhecida, estes genes também têm um número variável de repetições homólogas àquelas da LytA.

No seu ciclo de infecção, os fagos sintetizam mureína hidrolases que facilitam a sua passagem para a bactéria. Estas hidrolases têm um domínio de ligação à colina. A muramidase CPL1 do fago Cp-1 tem sido bem estudada. Esta apresenta 6 repetições de 20 aminoácidos no C-terminal envolvidas no reconhecimento específico da colina (Garica J. L. J. Virol 61 (8) p2573-80; (1987) e Garcia E Prol Natl Acad Sei (1988) p914) . Uma comparação das repetições de LytA e CPLl permite que seja feito um consenso inicial daquelas repetições. 3

As mureína hidrolases de fagos Dp-1 (Garcia P et al. (1983) J Gen Microbiol 129 (2) p489, Cpl-9 (Garcia P et al. (1989) Biochem Biophys Res Commun 158(1) p 251, Hb-3 Romero et al. 1990 J Bacteriol 172 (9) p 5064-5070) e EJ-1 Diaz (1992) J Bacteriol 174 (17) p 5516), também apresentam as caracteristicas de dominios de ligação à colina.

Esta propriedade é também partilhada pela lisozima codificada pelo fago pneumocócico Cp-1. O documento WO 99/10375 descreve inter alia, as proteínas do vírus do papiloma humano E6 ou E7 ligadas a um marcador His e à porção do C-terminal da LytA (aqui C-LytA) e a purificação das proteínas através de cromatografia de afinidade diferencial. O documento WO 99/40188 descreve inter alia, proteínas de fusão compreendendo antigénios MAGE com extremidades His e uma porção de C-LytA no N-terminal da molécula.

Foi agora surpreendentemente verificado que parceiros de fusão de acordo com a presente invenção, quando fundidos a uma proteína heteróloga, foram capazes de intensificar a imunogenicidade das proteínas heterólogas aí ligadas. Foi também verificado que pode ser intensificado o nível de expressão das proteínas heterólogas aí ligadas. De acordo com o exposto, a presente invenção proporciona, numa forma de realização preferida, um parceiro de fusão imunológico melhorado que também pode actuar como um intensificador de expressão.

Sumário da invenção

Consequentemente, a presente invenção compreende uma molécula de parceiro de fusão compreendendo um domínio de ligação à colina ou um seu fragmento ou um seu análogo, e um 4 epitopo de auxiliar T heterólogo promíscuo, de um modo preferido, um epitopo de T de MHC Classe II promíscuo. 0 referido parceiro de fusão mostra uma capacidade de actuação como um parceiro de fusão imunológico ou como um intensificador de expressão e, de um modo preferido, como um parceiro imunológico e como intensificador de expressão. Um epitopo de auxiliar T promíscuo é um epitopo que se liga a mais de um alelo de MHC Classe II, de um modo preferido, a mais de 3 alelos de MHC Classe II. Em particular, esses epitopos são capazes de induzir uma resposta por célula auxiliar T num grande número de indivíduos que expressam diversos haplotipos de MHC. Opcionalmente, a proteína de fusão pode reter a sua capacidade de ligação à colina.

Numa forma de realização preferida, a porção de ligação à colina é derivada do C-terminal da LytA. De um modo preferido, a C-LytA ou derivados compreendem, pelo menos, quatro repetições de qualquer uma das repetições RI a R6 apresentadas na figura 1 (SEQ ID N°:l a 6). Numa forma de realização muito preferida, a C-LytA estende-se dos aminoácidos 177-298 que contêm uma porção da primeira repetição e os cinco outros completos.

Num aspecto adicional da invenção é proporcionado um parceiro de fusão como aqui definido, compreendendo ainda uma proteína heteróloga. A proteína heteróloga pode ser quimicamente conjugada ou fundida ao parceiro de fusão. De um modo preferido, a proteína heteróloga é um antigénio associado a tumor ou um seu fragmento imunogénico.

Num aspecto adicional da invenção é proporcionada uma sequência de ácidos nucleicos codificando as proteínas como aqui definidas. É também proporcionado um vector de expressão compreendendo o referido ácido nucleico e um hospedeiro transformado com o referido ácido nucleico ou vector. 5

Num aspecto adicional da invenção é proporcionada uma composição imunogénica compreendendo uma proteína ou uma sequência de ácidos nucleicos, como aqui descrita, e um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável. De um modo preferido, a composição imunogénica compreende ainda um adjuvante indutor de Th-1.

Ainda noutra forma de realização, a invenção proporciona a composição imunogénica ou proteína e ácidos nucleicos para utilização em medicina. Em particular, é proporcionada uma proteína ou um ácido nucleico da invenção, na produção de um medicamento para induzir uma resposta imunológica num doente ou para utilização no tratamento ou profilaxia de doenças infecciosas ou doenças cancerígenas. A invenção proporciona, ainda, métodos de tratamento de um doente que sofre de uma doença infecciosa ou uma doença cancerígena, particularmente carcinoma da mama, pulmonar (particularmente, carcinoma pulmonar das células não pequenas), colorrectal, ovárico, da próstata, gástrico e outros GI (gastrointestinais) através da administração de uma quantidade segura e eficaz de uma composição ou ácido nucleico como aqui descrito.

Ainda noutra forma de realização, a invenção proporciona um método de produção de uma composição imunogénica como aqui descrita, por mistura de um ácido nucleico ou proteína da invenção com um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável.

Descrição detalhada da invenção 6

Como aí descrito, numa forma de realização da presente invenção o domínio modificado de ligação à colina (parceiro de fusão) tem uma capacidade de actuação como um intensificador de expressão, com a resultante proteína de fusão a ser expressa com um rendimento mais elevado numa célula hospedeira comparativamente com a proteína não fundida, de um modo preferido, com um rendimento superior em cerca de 100% (2 vezes superior) ou 150% ou mais, como medido através de SDS-PAGE seguida por coloração com azul de Coomassie ou coloração com prata, opcionalmente seguida por digitalização de gel. O domínio modificado de ligação à colina, de acordo com a invenção tem também a capacidade de actuação como um parceiro imunológico com a resultante proteína de fusão com uma proteína heteróloga que irá ser mais imunogénica num hospedeiro comparativamente à proteína heteróloga não fundida.

Noutra forma de realização da presente invenção, o domínio modificado de ligação à colina tem a capacidade de actuar como um parceiro de fusão imunológico, permitindo que seja obtida uma resposta imunológica intensificada com a proteína de fusão comparativamente à proteína heteróloga isolada.

Numa forma de realização preferida, o domínio modificado de ligação à colina tem uma função dupla, tendo a capacidade para actuar como um parceiro de fusão imunológico e como um intensificador de expressão.

Numa forma de realização preferida, a unidade de ligação à colina é derivada do C-terminal da LytA. De um modo preferido, a C-LytA ou derivados compreendem, pelo menos, duas repetições, de um modo preferido, pelo menos, quatro repetições. Neste contexto, os derivados de C-LytA referem-se a uma variante de C-LytA de acordo com a presente invenção, isto é, variantes que 7 retiveram a capacidade de actuação como um parceiro imunológico e como um intensificador de expressão. As variantes preferidas incluem, por exemplo, péptidos compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo, pelo menos, 85% de identidade, de um modo preferido, pelo menos, 90% de identidade, de um modo mais preferido, pelo menos, 95% de identidade, de um modo muito preferido, pelo menos, 97-99 % de identidade, com quaisquer das repetições RI a R6 apresentadas na figura 1 (SEQ ID N°:l a 6) ou um péptido compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo, pelo menos, 15, 20, 30, 40, 50 ou 100 aminoácidos contíguos da sequência de aminoácidos apresentada na figura 1 (SEQ ID N°:l a 8) .

De acordo com o exposto, num aspecto da invenção, é proporcionada uma proteína parceira de fusão compreendendo um domínio modificado de ligação à colina e um epitopo heterólogo de auxiliar T promíscuo, em que o domínio de ligação à colina é seleccionado do grupo compreendendo: a) o domínio do C-terminal da LytA como apresentado em SEQ ID N°:7; b) a sequência de SEQ ID N°:8; c) uma sequência peptídica compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo, pelo menos, 85% de identidade, de um modo preferido, pelo menos, 90% de identidade, de um modo mais preferido, pelo menos, 95% de identidade, de um modo muito preferido, pelo menos, 97-99% de identidade, com qualquer de SEQ ID N°:l a 6; d) uma sequência peptídica compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem, pelo menos, 15, 20, 30, 40, 50 ou 100 8 aminoácidos contíguos da sequência de aminoácidos de SEQ ID a N°:7 ou SEQ ID N°:8.

Numa forma de realização muito preferida, a C-LytA estende-se dos aminoácidos 177-298 que contém uma porção da primeira repetição e os cinco outros completos, como apresentado na figura 1. 0 segundo componente do parceiro de fusão, o epitopo de célula T heterólogo é seleccionado, de um modo preferido, do grupo de epitopos que se irão ligar a um número de indivíduos que expressam mais do que uma molécula MHC II em humanos. Por exemplo, os epitopos que são especificamente contemplados são os epitopos P2 e P30 do toxóide de tétano, Panina - Bordignon Eur. J. Immunol 19 (12), 2237 (1989). Numa forma de realização preferida, o epitopo heterólogo de célula T é P2 ou P30 da toxina do Tétano. 0 epitopo P2 tem a sequência QYIKANSKFIGITE e corresponde aos aminoácidos 830-843 da toxina do Tétano. O epitopo P30 (resíduos 947-967 da Toxina do Tétano) tem a sequência FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE. A sequência FNNFTV pode ser, opcionalmente, removida. Os outros epitopos de T universais podem ser derivados da proteína circunsporozoite de Plasmodium falciparum - em particular a região 378-398 que tem a sequência DIEKKIAKMEKASSVFNWNS (Alexander J, (1994) Immunity 1 (9), p 751-761). Um outro epitopo é derivado da proteína de fusão do vírus do sarampo nos resíduos 288-302 que têm a sequência LSEIKGVIVHRLEGV (Partidos CD, 1990, J. Gen Virol 71(9) 2099-2105) . Ainda outro epitopo é derivado do antigénio de superfície do vírus da hepatite B, em particular os aminoácidos que têm a sequência FFLLTRILTIPQSLD. Outro conjunto de epitopos é derivado da toxina da difteria. Quatro destes péptidos (aminoácidos 271-290, 321-340, 331-350, 351-370) estão mapeados 9 dentro do domínio T do fragmento B da toxina e os restantes 2 estão mapeados no domínio R (411-430, 431-450) :

PVFAGANYAAWAVNVAQVI VHHNTEEIVAQSIALSSLMV QSIALS SLMVAQAIPLVGEL VDIGFAAYNFVESII NLFQV QGESGHDIKITAENTPLPIA GVLLPTIPGKLDVNKSKTHI (Raju R., Navaneetham D., Okita D., Diethelm-Okita B., McCormick D., Conti-Fine B. M. (1995) Eur. J. Immunol. 25: 3207-14 .) O epitopo T heterólogo é, de um modo preferido fundido a C-LytA contendo, pelo menos, 4 repetições, de um modo preferido repetições 2-5 inclusive. Uma ou mais repetições subsequentes podem ser, opcionalmente, fundidas ao C-terminal do epitopo T. Alternativamente, o epitopo T heterólogo é, de um modo preferido, introduzido entre duas repetições consecutivas de C-LytA contendo um total de, pelo menos, 4 repetições ou introduzido numa das repetições de C-LytA contendo um total de, pelo menos, 4 repetições. De um modo mais preferido, a C-LytA contém 6 repetições e o epitopo heterólogo é introduzido dentro e no início da sexta repetição de C-LytA. A presente invenção proporciona ainda, noutros aspectos, proteínas de fusão que compreendem, pelo menos, um polipéptido como acima descrito, assim como polinucleótidos codificando essas proteínas de fusão, tipicamente na forma de composições farmacêuticas, e. g., composições de vacina, compreendendo um veiculo fisiologicamente aceitável e/ou um imunoestimulante. Assim, uma auto-proteina ou outra proteína pouco imunogénica pode ser fundida à extremidade N- ou C-terminal do parceiro de fusão resultante. Alternativamente, a auto-proteína ou a 10 proteína pouco imunogénica pode ser introduzida no parceiro de fusão. Numa forma de realização opcional, um marcador de histidina ou, pelo menos, quatro, de um modo preferido mais de 6 resíduos de histidina podem ser fundidos à extremidade alternativa da proteína pouco imunogénica. Isto permitiria à proteína ser purificada através de passos de cromatografia de afinidade, como uma extremidade de histidina compreendendo tipicamente, pelo menos, quatro, de um modo preferido seis ou mais resíduos de ligação a iões metálicos e é, deste modo, adequada para cromatografia de afinidade de ião metálico (IMAC) com metal imobilizado.

As construções típicas compreenderiam assim:

Proteína pouco imunogénica - repetiçõesi-4 de C-LytA -

epitopo P2 (introduzido ou substituindo a repetição5 de C-LytA)- repetições C-LytA

Repetiçõesi-4 de C-LytA - epitopo P2 (introduzido na ou substituindo a repetição5 de C-LytA) - repetição6 de C-LytA - Proteína pouco imunogénica

Proteína pouco imunogénica - repetições2-5 de C-LytA epitopo P2 (introduzido na repetição6 de C-LytA) C-LytA2_5 - epitopo P2 (introduzido na repetição6 de C-LytA) - Proteína pouco imunogénica.

Proteína pouco imunogénica - repetiçõesi-5 de C-LytA - epitopo P2 introduzido na repetição6 de C-LytA Repetiçõesi-5 de C-LytA - epitopo P2 introduzido na repetição6 de C-LytA - Proteína pouco imunogénica

Proteína pouco imunogénica - epitopo P2 introduzido na repetiçãoi de C-LytA - repetições2-5 de C-LytA Epitopo P2 introduzido na repetiçãoi de C-LytA - repetições2_5 de C-LytA - Proteína pouco imunogénica

Proteína pouco imunogénica - epitopo P2 introduzido na

repetiçãoi de C-LytA - repetiçÕes2-6 de C-LytA 11

Epitopo P2 introduzido na repetiçãoi de C-LytA - repetições2-6 de C-LytA- Proteína pouco imunogénica

Proteína pouco imunogénica - repetiçãoi de C-LytA - epitopo P2 introduzido na repetição2 de C-LytA - repetições3_6 de C-LytA

RepetiçãOi de C-LytA - epitopo P2 introduzido na repetição2 de C-LytA - repetições3-6 de C-LytA - Proteína pouco imunogénica; em que "introduzido" significa em qualquer local na repetição, por exemplo, entre o resíduo 1 e 2 ou entre 2 e 3, etc. 0 epitopo de auxiliar T promíscuo pode ser introduzido dentro de uma região de repetição, por exemplo, repetições2.5 de C-LytA - repetição 6a de C-LytA - epitopo P2 - repetição 6b de C-LytA, em que o epitopo P2 é introduzido dentro da sexta repetição (ver figura 2) .

Noutras formas de realização preferidas, a extremidade C-terminal de CPLl (C-CPLl) pode ser utilizada como uma alternativa a C-LytA.

Alternativamente, o epitopo P2 nas construções acima pode ser substituído por outros epitopos T promíscuos, por exemplo, P30. Numa forma de realização da invenção, dois ou mais epitopos promíscuos são parte da construção de fusão. É contudo preferido manter o parceiro de fusão tão pequeno quanto possível, limitando assim o número de epitopos CD8+ e B, potencialmente interferentes. Assim, o parceiro de fusão é, de um modo preferido, não maior que 100-140 aminoácidos, de um modo preferido, não maior que 120 aminoácidos, tipicamente cerca de 100 aminoácidos. 12 0 antigénio ao qual o parceiro de fusão é fundido pode ser de fontes bacterianas, virais, de protozoários, fúngicas ou de mamífero, incluindo humano. 0 parceiro de fusão da presente invenção é fundido, de um modo preferido, a um auto-antigénio, tal como antigénios específicos de tecido ou associados a tumor, tais como aqueles para cancros da próstata, mama, colorrectal, pulmonar, pancreático, ovárico, renal ou melanoma. Os fragmentos dos referidos antigénios auto ou tumorais são expressamente contemplados para serem fundidos ao parceiro de fusão da invenção. Tipicamente, o fragmento conterá, pelo menos, 20, de um modo preferido 50, de um modo mais preferido 100 aminoácidos contíguos da sequência de tamanho total. Tipicamente, esses fragmentos serão desprovidos de um ou mais domínios transmembranares ou podem ter delecções no N-terminal ou C-terminal de cerca de 3, 5, 8, 10, 15, 20, 28, 33, 50, 54 aminoácidos. Esses fragmentos serão capazes, quando apropriadamente apresentados, de gerar respostas imunológicas que reconhecem a proteína de tamanho total. Os polipéptidos particularmente ilustrativos da presente invenção compreendem uma sequência de, pelo menos, 10 aminoácidos contíguos, de um modo preferido 20, de um modo mais preferido 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180 aminoácidos de uma proteína específica de tecido ou associada a tumor fundida ao parceiro de fusão.

Os polipéptidos da invenção são imunogénicos, i. e., reagem detectavelmente num ensaio imunológico (tal como um ensaio de estimulação de células T ou ELISA) com anti-soros e/ou células T de um doente com cancro expressando cripto. O rastreio para a actividade imunogénica pode ser realizado utilizando técnicas bem conhecidas do especialista. Por exemplo, esses rastreios podem ser realizados utilizando métodos tais como aqueles 13 descritos em Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Num exemplo ilustrativo, um polipéptido pode ser imobilizado num suporte sólido e colocado em contacto com soros de doentes para permitir a ligação de anticorpos dos soros ao polipéptido imobilizado. Os soros não ligados podem ser depois removidos e os anticorpos ligados detectados utilizando, por exemplo, Proteína A marcada com 125I. Como seria reconhecido por um especialista, as porções imunogénicas de antigénio associado a tumor ou específico de tumor estão também abrangidas pela presente invenção. Uma "porção imunogénica" como aqui utilizado, é um fragmento que ele próprio é imunologicamente reactivo (i. e., liga-se especificamente) com os receptores antigénicos de superfície de células B e/ou células T que reconhecem o polipéptido. As porções imunogénicas podem ser geralmente identificadas utilizando técnicas bem conhecidas, tais como aquelas resumidas em Paul, Fundamental Immunology, 3a ed., 243-247 (Raven Press, 1993) e referências aí citadas. Esses técnicas incluem rastreio de polipéptidos para a capacidade de reagirem com anticorpos específicos de antigénio, anti-soros e/ou linhas de células T ou clones. Como aqui utilizado, os anti-soros e anticorpos são "específicos de antigénio" se se ligarem especificamente a um antigénio (í. e., reagem com a proteína num ELISA ou outro ensaio imunológico, e não reagem detectavelmente com proteínas não relacionadas). Esses anti-soros e anticorpos podem ser preparados como aqui descrito, e utilizando técnicas bem conhecidas. Numa forma de realização preferida, uma porção imunogénica de um polipéptido é uma porção que reage com anti-soros e/ou células T a um nível que não é substancialmente menor do que a reactividade do polipéptido de tamanho total (e. g., num ensaio de reactividade de célula T e/ou ELISA) . De um modo preferido, o nível de actividade imunogénica da porção imunogénica é, pelo menos, cerca de 50%, de um modo preferido, pelo menos, cerca de 70% e de um modo muito preferido maior do 14 que cerca de 90% da imunogenicidade para o polipéptido de tamanho total. Nalguns casos, serão identificadas as porções imunogénicas preferidas que têm um nível de actividade imunogénica maior do que aquela do polipéptido de tamanho total correspondente, e. g., tendo mais do que cerca de 100% ou 150% ou mais de actividade imunogénica.

Nalgumas outras formas de realização, as porções imunogénicas ilustrativas podem incluir péptidos em que foi removida uma sequência líder do N-terminal e/ou domínio transmembranar. Outras porções imunogénicas ilustrativas irão conter uma pequena delecção do N- e/ou C-terminal (e. g., cerca de 1-50 aminoácidos, de um modo preferido cerca de 1-30 aminoácidos, de um modo mais preferido cerca de 5-15 aminoácidos), relativamente à proteína madura.

Os antigénios exemplificativos ou fragmentos daí derivados incluem antigénios MAGE 1, Mage 3 e MAGE 4 ou outros MAGE, tal como divulgados no documento WO 99/40188, PRAME (documento WO 96/10577), BAGE, RAGE, LAGE 1 (documento WO 98/32855), LAGE 2 (também conhecido como NY-ESO-1, documento WO 98/14464), XAGE (Liu et al., Câncer Res, 2000, 60:4752-4755; documento WO 02/18584) SAGE, e HAGE (documento WO 99/53061) ou GAGE (Robbins e Kawakami, 1996, Current Opinions in Immunology 8, pps 628-636; Van den Eynde et al., International Journal of Clinicai e Laboratory Research (submetido em 1997); Correale et al. (1997), Journal of the National Câncer Institute 89, p293. De facto estes antigénios são expressos numa vasta gama de tipos de tumor, tais como melanoma, carcinoma pulmonar, sarcoma e carcinoma da bexiga.

Numa forma de realização preferida são utilizados antigénios da próstata, tais como antigénio específico de Próstata (PSA), 15 PAP, PSCA (PNAS 95(4) 1735-1740 1998), PSMA ou o antigénio conhecido como prostase.

Numa forma de realização particularmente preferida, o antigénio de próstata é P501S ou um seu fragmento. O P501S, também denominado prosteina (Xu et al., Câncer Res. 61, 2001, 1563-1568), é conhecida como SEQ ID N° 113 do documento W098/37814 e é uma proteína de 553 aminoácidos. Os fragmentos imunogénicos e suas porções compreendendo, pelo menos, 20, de um modo preferido 50, de um modo mais preferido 100 aminoácidos contíguos como divulgados no pedido de patente acima referenciado e são especificamente contemplados através da presente invenção. Os fragmentos preferidos são divulgados no documento WO 98/50567 (antigénio PS108) e como proteína associada ao cancro da próstata (SEQ ID N°: 9 do documento WO 99/67384). Outros fragmentos preferidos são os aminoácidos 51-553, 34-553 ou 55-553 da proteína P501S de tamanho total. Em particular, as construções 1, 2 e 3 (ver figura 2, SEQ ID N° 27-32) são contempladas e podem ser expressas em sistemas de levedura, por exemplo, sequências de ADN codificando esses polipéptidos podem ser expressos em sistema de levedura. A prostase é uma protease de serina específica da próstata (de tipo tripsina) , de 254 aminoácidos de comprimento, com uma tríade H-D-S catalítica conservada de protease de serina e uma sequência pré-propéptido do amino-terminal, indicando uma potencial função excretora (P. Nelson, Lu Gan, C. Ferguson, P. Moss, R. linas, L. Hood e K. Wand, "Molecular cloning and characterisation of prostase, an androgen-regulated serine protease with prostate restricted expression, em Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1999) 96, 3114-3119). Foi descrito um local putativo de glicosilação. A estrutura prevista é muito semelhante a outras proteases de serina conhecidas, mostrando que o polipéptido maduro se enrola num único domínio. A proteína 16 madura tem 224 aminoácidos, com um epitopo A2 mostrado ser processado naturalmente. A sequência de nucleótidos da prostase e a sequência polipeptidica deduzida e homólogos são divulgados em Ferguson, et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1999, 96, 3114-3119) e nos Pedidos de Patente Internacional N° WO 98/12302 (e também a correspondente patente concedida U.S. 5955306), WO 98/20117 (e também as correspondentes patentes concedidas U.S. 5840871 e U.S. 5786148) (calicreina especifica da próstata) e WO 00/04149 (P703P).

Outros antigénios específicos da próstata são conhecidos dos documentos W098/37418 e WO/004149. Outro é STEAP (PNAS 96 14523 14528 7-12 1999) .

Outros antigénios associados a tumor, úteis no contexto da presente invenção incluem: Plu-1 J. Biol. Chem 274 (22) 15633 -15645, 1999, HASH-1, HASH-2 (Alders, M. et al., Hum. Mol. Genet. 1997, 6, 859-867) . Cripto (Salomon et al. Bioessays 199, 21 61 -70, patente U.S. 5654140), CASB616 (documento WO 00/53216), Criptina (documento U.S. 5981215). Adicionalmente, os antigénios particularmente relevantes para vacinas na terapia do cancro também compreendem tirosinase, telomerase, P53, NY-Brl.l (documento WO 01/47959) e os seus fragmentos, como divulgado no documento WO 00/43420, B726 (documento WO 00/60076, SEQ ID N° 469 e 463; documento WO 01/79286, SEQ ID N° 474 e 475), P510 (documento WO 01/34802 SEQ ID N° 537 e 538) e survivina. A presente invenção é também útil em combinação com antigénios do cancro da mama, tais como Her-2/neu, mamaglobina (patente U.S. 5668267), B305D (documento WO 00/61753 SEQ ID N° 299, 304, 305 e 315) ou aqueles divulgados nos documentos WO 00/52165, WO 99/33869, WO 99/19479, WO 98/45328. Os antigénios Her-2/neu são divulgados inter alia, na patente U.S. 5801005. De um modo preferido, o Her-2/neu compreende o 17 domínio extracelular completo (compreendendo, aproximadamente, 1-645 aminoácidos) ou os seus fragmentos e, pelo menos, uma porção imunogénica de ou o domínio intracelular inteiro, aproximadamente, de 580 aminoácidos do C-terminal. Em particular, a porção intracelular deve compreender o domínio de fosforilação ou os seus fragmentos. Essas construções são divulgadas no documento WO 00/44899. Uma construção particularmente preferida é conhecida como ECD-PhD, uma segunda é conhecida como ECD deltaPhD (ver documento WO 00/44899) . O Her-2/neu como aqui utilizado, pode ser derivado de rato, murganho ou humano.

Determinados antigénios tumorais são pequenos antigénios peptídicos (i. e., menos do que cerca de 50 aminoácidos). Estes antigénios podem ser quimicamente conjugados com a proteína de ligação à colina modificada da presente invenção.

Os péptidos exemplificativos incluem péptidos derivados de Mucina, tais como MUC-1 (ver, por exemplo, documentos U.S. 5744144; U.S. 5827666; WO 88/05054, U.S. 4963484). São especificamente contemplados péptidos derivados de MUC-1 que compreendem, pelo menos, uma unidade de repetição do péptido MUC-1, de um modo preferido, pelo menos, duas dessas repetições e que é reconhecida pelo anticorpo SM3 (documento U.S. 6054438). Outros péptidos derivados de mucina incluem péptidos de MUC-5.

Alternativamente, o referido antigénio é uma interleucina, tal como IL13 e IL14, as quais são preferidas. Ou o referido antigénio talvez uma hormona auto-peptídica, tal como a hormona libertadora da hormona Gonadotrofina de tamanho total (GnRH, documento WO 95/20600), um péptido curto de 10 aminoácidos, úteis no tratamento de muitos cancros ou em imunocastração. 18

Outros antigénios específicos de tumor são adequados para serem acoplados com a proteína de ligação à Colina modificada da presente invenção incluem, mas não são restritos a, gangliósidos específicos de tumor, tais como GM2 e GM3. 0 acoplamento covalente do péptido à proteína de ligação à colina modificada pode ser realizada de um modo bem conhecido na técnica. Assim, por exemplo, para acoplamento covalente directo é possível utilizar uma carbodiimida, glutaraldeído ou um éster de (N-[γ-maleimidobutiriloxi]succinimida, utilizando ligantes heterobifuncionais comuns comercialmente disponíveis, tais como CDAP e SPDP (utilizando as instruções dos fabricantes) . Após a reacção de acoplamento, o imunogénio pode ser facilmente isolado e purificado através de um método de diálise, um método de filtração em gel, um método de fraccionamento, etc. 0 antigénio pode também ser derivado de fontes que são patogénicas aos humanos, tais como o vírus da Imunodeficiência Humana HIV-1 (tal como tat, nef, transcriptase reversa, gag, gpl20 e gpl60) , vírus do herpes simplex humano, tais como gD ou os seus derivados ou proteína Imediatamente Precoce, tal como ICP27 de HSV1 ou HSV2, citomegalovírus ( (esp Humano) (tais como gB ou os seus derivados), Rotavírus (incluindo vírus vivos atenuados), vírus de Epstein-Barr (tal como gp350 ou os seus derivados), Vírus Varicella Zoster (tal como gpl, II e IE63) ou de um vírus da hepatite, tal como o vírus da hepatite B (por exemplo, o antigénio de Superfície da Hepatite B ou um seu derivado), vírus da hepatite A, vírus da hepatite C e vírus da hepatite E ou de outros patogéneos virais, tais como paramixovírus: Vírus Sincicial Respiratório (tais como as proteínas F e G ou os seus derivados) , vírus da parainfluenza, vírus do sarampo, vírus da parotidite, vírus do papiloma humano (por exemplo, HPV6, 11, 16, 18,.), flavivírus (e. g., Vírus da Febre Amarela, Vírus do Dengue, vírus da encefalite da Febre da 19

Carraça, Vírus da Encefalite Japonesa) ou vírus Influenza (vírus inteiro vivo ou inactivado, vírus influenza divido, cultivado em ovos ou células MDCK ou virossomas inteiros da gripe (como descrito por R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920) ou as suas proteínas purificadas ou recombinantes, tais como proteínas HA, NP, NA ou M ou as suas combinações) ou derivados de patogéneos bacterianos, tais como Neisseria spp, incluindo N. gonorrhea e N. meningitidis (por exemplo, polissacáridos capsulares e os seus conjugados, proteínas de ligação a transferrina, proteínas de ligação a lactoferrina, PIIC, adesinas); S. Pyogenes (por exemplo, proteínas M ou os seus fragmentos, protease C5A, ácidos lipoteicóicos), S. agalactiae, S. mutans; H. Ducreyi; Moraxella spp, incluindo M. catarrhalis, também conhecida como Branhamella catarrhalis (por exemplo, adesinas e invasinas de peso molecular elevado e baixo); Bordetella spp, incluindo B. pertussis (por exemplo, pertactina, toxina pertussis ou os seus derivados, hemaglutinina filamentosa, adenilato ciclase, fimbriae), B. parapertussis e B. bronchiseptica; Mycobacterium spp., incluindo M. tuberculosis (por exemplo, ESAT6, Antigénio 85A, -B ou -C), M. bovis, M. leprae, M. avium, M. paratuberculosis, M. smegmatis; Legionella spp, incluindo L. pneumophila; Escherichia spp, incluindo E. coli enterotóxica (por exemplo, factores de colonização, toxinas ou os seus derivados, toxinas estáveis ao calor ou os seus derivados), E. coli entero-hemorrágica, E. coli enteropatogénica (por exemplo, toxina do tipo toxina shiga ou os seus derivados) ; Vibrio spp, incluindo V. cholera (por exemplo, toxina da cólera ou os seus derivados); Shigella spp, incluindo S. sonnei, S. dysenteriae, S. flexnerii; Yersinia spp, incluindo Y. enterocolitica (por exemplo, uma proteína Yop), Y. pestis, Y. pseudotuberculosis; Campylobacter spp, incluindo C. jejuni (por exemplo, toxinas, adesinas e invasinas) e C. coli, Salmonella spp, incluindo S. typhi, S. paratyphi, S. choleraesuis, S. enteritidis; Listeria spp., incluindo 20 L. monocytogenes; Helicobacter spp, incluindo H. pylori (por exemplo, urease, catalase, toxina vacuolante); Pseudomonas spp, incluindo P. aeruginosa; Staphylococcus spp., incluindo S. aureus, S. epidermidis; Enterococcus spp., E. faecalis, incluindo E. faecium; Clostridium spp., incluindo C. tetani (por exemplo, toxina do tétano e os seus derivados), C. botulinum (por exemplo, toxina botulina e os seus derivados), C. difficile (por exemplo, toxinas A ou B de clostridium e os seus derivados); Bacilus spp., incluindo B. anthracis (por exemplo, toxina botulina e os seus derivados); Corynebacterium spp., incluindo C. diphtheriae (por exemplo, toxina da difteria e os seus derivados); Borrelia spp., incluindo B. burgdorferi (por exemplo, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. garinii (por exemplo, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. afzelii (por exemplo, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. andersonii (por exemplo, OspA, OspC, -DbpA, DbpB), B. hermsii, Ehrlichia spp., incluindo E. equi e o agente da Erliquiose Granulocitica Humana; Rickettisia spp, incluindo R. rickettsii; Chlamydia spp., incluindo C. trachomatis (por exemplo, proteínas MOMP, de ligação a heparina), C. pneumoniae (por exemplo, proteínas MOMP, de ligação a heparina), C. psittaci; Leptospira spp., incluindo L. interrogans; Treponema spp., incluindo T. pallidum (por exemplo, as proteínas raras da membrana externa), T. denticola, T. hyodysenteriae/ ou derivados de parasitas, tais como Plasmodium spp., incluindo P. falciparum, Toxoplasma spp., incluindo T. gondii (por exemplo, SAG2, SAG3, Tg34); Entamoeba spp., incluindo E. histolytica; Babesia spp., incluindo B. microti; Trypanosoma spp, incluindo T. cruzi; Giardia spp., incluindo G. lamblia; Leshmania spp., incluindo L. major; Pneumocystis spp., incluindo P. carinii; Trichomonas spp., incluindo T. vaginalis;

Schisostoma spp., incluindo S. mansoni ou derivados de levedura, 21 tal como Candida spp., incluindo C. lbicans; Cryptococcus spp., incluindo C. neoformans.

Outros antigénios específicos preferidos para M. tuberculosis são, por exemplo, Tb Ral2, Tb H9, Tb Ra35, Tb38-1, Erd 14, DPV, MTI, MSL, mTTC2 e hTCCl (documento WO 99/51748). As proteínas para M. tuberculosis também incluem proteínas de fusão e suas variantes, em que, pelo menos, dois, de um modo preferido três polipéptidos de M. tuberculosis estão fundidos numa proteína maior. As fusões preferidas incluem Ral2-TbH9-Ra35, Erdl4-DPV-MTI, DPV-MTI-MSL, Erdl4-DPV-MTI-MSL-mTCC2, Erdl4-DPV-MTI-MSL, DPV-MTI-MSL-mTCC2, TbH9-DPV-MTI (documento WO 99/51748) .

Os antigénios muito preferidos para Chlamydia incluem, por exemplo, a Proteína de Elevado Peso Molecular (HWMP) (documento WO 99/17741), 0RF3 (documento EP 366412) e proteínas putativas de membrana (Pmps). Outros antigénios de Chlamydia da formulação de vacina podem ser seleccionados do grupo descrito no documento WO 99/28475.

Os antigénios bacterianos preferidos são derivados de Streptococcus spp, incluindo S. pneumoniae (por exemplo, polissacáridos capsulares e os seus conjugados, PsaA, PspA, estreptolisina, proteínas de ligação à colina) e o antigénio proteico Pneumolisina (Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007; Rubins et al., Microbial Pathogenesis, 25, 337-342), e os seus derivados mutantes desintoxicados (documentos WO 90/06951; WO 99/03884). Outros antigénios bacterianos preferidos são derivados de Haemophilus spp., incluindo H. influenzae tipo B (por exemplo, PRP e os seus conjugados), H. influenzae não tipável, por exemplo, OMP26, adesinas de peso molecular elevado, P5, P6, proteína D e lipoproteína D, e fimbrina e péptidos 22 derivados de fimbrina (documento U.S. 5843464) ou variantes de múltiplas cópias ou suas proteínas de fusão.

Os derivados do antigénio de Superfície da Hepatite B são bem conhecidos na técnica e incluem, inter alia, aqueles antigénios S PreSl, PreS2 apresentados, descritos nos pedidos de Patente Europeia Ep-A-414374; EP-A-0304578 e EP198-474. Num preferido, o antigénio HBV é a HBV polimerase (Ji Hoon Jeong et al, 1996, BBRC 223, 264-271; Lee H.J. et al, Biotechnol. Lett. 15. 821-826). Noutro aspecto preferido, o antigénio dentro da fusão é um antigénio HIV-1, gpl20, especialmente quando expresso em células CHO. Numa forma de realização adicional, o antigénio compreende gD2t como aqui definido acima.

Numa forma de realização preferida da presente invenção, as fusões compreendem um antigénio derivado do Vírus do Papiloma Humano (HPV 6a, 6b, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 e 68), em particular aqueles serotipos de HPV considerados serem responsáveis por verrugas genitais (HPV 6 ou HPV 11 e outros) , e os vírus HPV responsáveis pelo cancro cervical (HPV16, HPV18 e outros).

Os antigénios adequados de HPV são El, E2, E4, E5, E6, E7, LI e L2. Particularmente formas preferidas de fusões profiláticas ou terapêuticas de verruga genital, compreendem partículas Ll ou capsómeros, e proteínas de fusão compreendendo um ou mais antigénios seleccionados das proteínas E6, E7, Ll, e L2 de HPV 6 e HPV 11.

As formas mais preferidas de proteína de fusão são: L2E7 como divulgada no documento WO 96/26277, e proteínaD(1/3)-E7 divulgada no documento GB 9717953.5 (documento PCT/EP98/05285) . 23

Uma composição preferida de vacina terapêutica ou profilática de cancro ou infecção cervical de HPV pode compreender antigénios 16 ou 18 de HPV. Por exemplo, monómeros de antigénio LI ou L2 ou antigénios LI ou L2 apresentados conjuntamente como uma partícula de tipo virai (VLP) ou só a proteína LI apresentada isolada numa VLP ou estrutura de capsómero. Esses antigénios, partículas de tipo virai e capsómero são conhecidos por si. Ver, por exemplo, documentos WO94/00152, WO94/20137, WO94/05792 e WO93/02184 .

Podem ser incluídas proteínas precoces adicionais isoladas ou como proteínas de fusão, tais como E7, E2 ou, de um modo preferido, E5, por exemplo; formas de realização particularmente preferidas destas incluem uma VLP compreendendo proteínas de fusão LI E7 (documento WO 96/11272). Antigénios particularmente preferidos de HPV 16 compreendem as proteínas precoces E6 ou E7 em fusão com uma proteína D de veículo para formar as fusões Proteína D - E6 ou E7 a partir de HPV 16 ou suas combinações; ou combinações de E6 ou E7 com L2 (documento WO 96/26277) . Alternativamente, as proteínas precoces E6 e E7 de HPV 16 ou 18, podem ser apresentadas numa única molécula, de um modo preferido, uma fusão Proteína D - E6/E7. Outras fusões contêm opcionalmente cada uma ou ambas as proteínas E6 e E7 de HPV 18, de um modo preferido, na forma de uma proteína de fusão Proteína D - E6 ou Proteína D - E7 ou proteína de fusão Proteína D - E6/E7. As fusões podem compreender antigénios de outras estirpes de HPV, de um modo preferido de estirpes 31 ou 33 de HPV.

As fusões, de acordo com a presente invenção, compreendem antigénios derivados de parasitas que causam a Malária. Por exemplo, os antigénios preferidos de Plasmodia falciparum incluem RTS,S e TRAP. A RTS é uma proteína híbrida compreendendo substancialmente toda a porção do C-terminal da proteína 24 circunsporozoítica (CS) de P. falciparum ligada através de quatro aminoácidos da porção preS2 do antigénio de superfície da Hepatite B ao antigénio de superfície (S) do vírus da hepatite B. A sua estrutura completa é divulgada no Pedido de Patente Internacional N° PCT/EP92/02591, publicado com o Número WO 93/10152 reivindicando prioridade do pedido de patente UK N° 9124390.7. Quando expressa em levedura, a RTS é produzida como uma partícula de lipoproteína, e quando é co-expressa com o antigénio S de HBV produz uma partícula mista conhecida como RTS,S. Os antigénios TRAP são descritos no Pedido de Patente Internacional N° PCT/GB89/00895, publicado no documento WO 90/01496. Uma forma de realização preferida da presente invenção é uma fusão em que a preparação antigénica compreende uma combinação de antigénios RTS,S e TRAP. Outros antigénios de plasmodia que são candidatos prováveis a serem componentes da fusão são MSP1, AMAI, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, Sequestrina, PfEMPl, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXPl, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfsl6, Pfs48/45, Pfs230 de P. faciparum e os seus análogos em Plasmodium spp. A presente invenção também proporciona um polinucleótido codificando o parceiro de fusão de acordo com a presente invenção. A invenção refere-se ainda a um polinucleótido que híbrida com a sequência de polinucleótidos aqui proporcionada na figura 1 (SEQ ID N°:9 a 16). A este respeito, a invenção refere-se especialmente aos polinucleótidos que hibridam sob condições restringentes para o polinucleótido aqui descrito. Como aqui utilizado, os termos "condições restringentes" e "condições de hibridação restringentes" significam ocorrer hibridação apenas se existir identidade de, pelo menos, 95% e de um modo preferido de, pelo menos, 97% entre as sequências. Um exemplo específico de condições de hibridação restringentes é incubação de um dia para o outro a 42 °C numa solução compreendendo: 50% de formamida, 5x SSC (150 mM de NaCl, 15 mM de citrato trissódico) , 25 50 mM de fosfato de sódio (pH 7,6), 5x solução de Denhardt, 10% de sulfato de dextrano e 20 microgramas/mL de ADN de esperma de salmão cortado e desnaturado, seguido por lavagem do suporte de hibridação em 0,lx SSC a cerca de 65 °C. As condições de hibridação e lavagem são bem conhecidas e exemplificadas em Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), particularmente no seu Capitulo 11. A solução de hibridação pode também ser utilizada com as sequências de polinucleótidos proporcionadas através da invenção. A presente invenção também proporciona um polinucleótido codificando o polipéptido, compreendendo o parceiro de fusão de acordo com a presente invenção fundido a um antigénio associado a tumor ou seu fragmento. Em particular, a presente invenção proporciona sequências de polinucleótidos codificando uma proteina parceira de fusão compreendendo um dominio de ligação à colina e um epitopo T auxiliar promíscuo heterólogo, de um modo preferido em que o domínio de ligação à colina é derivado a partir do C-terminal da LytA. Numa forma de realização mais preferida, a unidade de C-LytA dos polinucleótidos de acordo com a invenção compreende, pelo menos, quatro repetições de qualquer de SEQ ID N° 9-14, de um modo mais preferido compreende a sequência de SEQ ID N° 15, de um modo ainda mais preferido a sequência de SEQ ID N° 16. Noutras formas de realização relacionadas, a presente invenção proporciona variantes de polinucleótidos que têm identidade substancial com as sequências aqui divulgadas em SEQ ID N°:9-16, por exemplo, aquelas compreendendo, pelo menos, 70% de identidade de sequência, de um modo preferido, pelo menos, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou superior, identidade de sequência comparativamente a uma sequência de polinucleótidos desta invenção utilizando métodos convencionais, e. g., análise BLAST utilizando parâmetros padrão. Ainda noutra forma de realização, o 26 polinucleótido como reivindicado compreende ainda uma proteína heteróloga.

Essas sequências de polinucleótidos podem ser introduzidas num vector de expressão adequado e expressas numa hospedeiro adequado. Podem ser proporcionados vectores que codificam a proteína modificada de ligação à colina da invenção e que contêm um sítio de restrição adequado no qual pode ser introduzido um ADN codificando uma proteína pouco imunogénica para produzir uma proteína de fusão.

Noutras formas de realização da invenção, as sequências de polinucleótidos ou os seus fragmentos que codificam fusões polipeptídicas da invenção, podem ser utilizadas em moléculas de ADN recombinante para direccionar a expressão de um polipéptido em células hospedeiras apropriadas. Devido à degenerescência inerente do código genético, podem ser produzidas outras sequências de ADN codificando substancialmente a mesma ou uma sequência de aminoácidos funcionalmente equivalente e estas sequências podem ser utilizadas para clonar e expressar um determinado polipéptido.

Como será compreendido pelos especialistas na técnica, pode ser vantajoso nalguns casos produzir sequências de nucleótidos codificando polipéptidos que possuem codões de ocorrência não natural. 0 código de ADN tem 4 letras (A, T, C e G) e utiliza-as para soletrar "codões" de três letras que representam os aminoácidos que as proteínas codificam em genes de um organismo. A sequência linear de codões ao longo da molécula de ADN é traduzida na sequência linear de aminoácidos na(s) proteína(s) codificada(s) por aqueles genes. 0 código é altamente degenerado, com 61 codões codificando para 20 aminoácidos naturais e 3 codões representando sinais de "terminação". Assim, a maioria dos aminoácidos são codificados por mais de um codão - 27 de facto diversos são codificados por quatro ou mais codões diferentes.

Nos casos em que está disponível mais de um codão para codificar um determinado aminoácido, foi observado que os perfis de utilização do codão de organismos são altamente não aleatórios. Espécies diferentes apresentam uma propensão diferente na sua selecção de codão e, além disso, a utilização de codões pode ser acentuadamente diferente numa única espécie entre genes que são expressos em níveis elevados e baixos. Esta propensão é diferente em vírus, plantas, bactérias e células de mamíferos, e algumas espécies apresentam uma propensão mais forte do que outras de uma selecção aleatória de codão. Por exemplo, os humanos e outros mamíferos são menos fortemente propensos do que determinadas bactérias ou vírus. Por estas razões, existe uma probabilidade significativa de que um gene de mamífero expresso em E. coli ou um gene virai expresso em células de mamífero tenham uma distribuição inadequada de codões para expressão eficiente. Acredita-se que a presença numa sequência de ADN heterólogo de aglomerados de codões que são raramente observados no hospedeiro em que a expressão é para ocorrer, é predicativo de baixos níveis de expressão heteróloga nesse hospedeiro.

Em consequência, os codões preferidos por um hospedeiro procariótico particular (por exemplo, E. coli ou levedura) ou eucariótico podem ser optimizados, isto é, seleccionados para aumentar a taxa de expressão de proteína, para produzir um transcripto de ARN recombinante possuindo propriedades desejáveis, tal como, por exemplo, uma semi-vida que é mais longa do que a de um transcripto gerado a partir de uma sequência de ocorrência natural ou para optimizar a resposta imunológica em humanos. 0 processo de optimização de codão pode incluir qualquer sequência, gerada manualmente ou através de 28 software de computador, em que são modificados alguns ou todos os codões da sequência nativa. Foram publicados diversos métodos (Nakamura et ai., Nucleic Acids Research 1996, 24:214-215; documento WO98/34640). Um método preferido de acordo com esta invenção é o método Syngene, uma modificação do método Calcgene (R. S. Hale e G Thompson (Protein Expression and Purification Vol. 12 pp.185-188 (1998)).

Deste modo, numa forma de realização preferida a sequência de ADN da proteína tem um RSCU (Utilização relativa de Codão Sinónimo (também conhecido como índice de Codão Cl)) de, pelo menos, 0,65 e tem menos de 85% de identidade com a região de tipo selvagem correspondente.

Este processo de optimização de codão e as construções resultantes são vantajosos uma vez que pode ter alguns ou todos os seguintes benefícios: 1) melhorar a expressão do produto génico por substituição de codões raros ou infrequentemente utilizados com codões mais frequentemente utilizados, 2) remover ou incluir sítios de enzimas de restrição para facilitar a clonagem a jusante e 3) reduzir o potencial para a recombinação homóloga entre a sequência da inserção no vector de ADN e sequências genómicas e 4) melhorar a resposta imunológica em humanos através do aumento de uma resposta celular e/ou de anticorpo (de um modo preferido, ambas as respostas) contra o antigénio alvo. As sequências da presente invenção reduziram vantajosamente o potencial de recombinação, mas expressam, pelo menos, ao mesmo nível que as sequências de tipo selvagem. Devido à natureza dos algoritmos utilizados através do programa SynGene para gerar uma sequência de codão optimizado, é possível gerar um número extremamente grande de sequências optimizadas de codão diferentes que irão realizar uma função semelhante. Resumidamente, os codões são atribuídos utilizando um método estatístico para produzir um gene sintético possuindo uma 29 frequência de codão mais próxima daquela encontrada naturalmente em genes de E. coli e humanos de elevada expressão.

Resumidamente, os codões são atribuídos utilizando um método estatístico para produzir um gene sintético possuindo uma frequência de codão mais próxima daquela encontrada naturalmente em genes humanos altamente expressos, tal como β-Actina. Os exemplos ilustrativos, não limitativos, de sequências de codão optimizado adequadas são apresentados em SEQ ID N°:19-22 e SEQ ID N°:24-26.

Nos polinucleótidos da presente invenção, o perfil de utilização de codão é alterado do típico do antigénio alvo para representar, de forma mais próxima, a propensão de codão de um gene altamente expresso num organismo alvo, por exemplo, a 6-actina humana. 0 "coeficiente de utilização de codão" é uma medida de quão próximo o perfil de codão de uma determinada sequência de polinucleótidos se assemelha àquela de uma espécie alvo. As frequências de codão podem ser derivadas de fontes de literatura para os genes altamente expressos de muitas espécies (ver, e. g., Nakamura et al. Nucleic Acids Research 1996, 24:214-215). As frequências de codão para cada um dos 61 codões (expressos como o número de ocorrências que ocorrem por 1000 codões da classe seleccionada de genes) são normalizadas para cada um dos vinte aminoácidos naturais, de modo que o valor para o codão mais frequentemente utilizado para cada aminoácido seja definido como 1 e as frequências para os codões menos comuns são escalonadas de forma a situarem-se entre zero e 1. Assim, a cada um dos 61 codões é atribuído um valor de 1 ou inferior para os genes altamente expressos da espécie alvo. De modo a calcular um coeficiente de utilização de codão para um polinucleótido específico, relativamente a genes altamente expressos daquela espécie, o valor escalonado para cada codão do polinucleótido específico é assinalado e é calculada a média geométrica de todos estes valores (por divisão da soma dos 30 logaritmos naturais destes valores pelo número total de codões e calculo do antilogaritmo). 0 coeficiente terá um valor entre zero ele quanto mais alto for o coeficiente, mais codões no polinucleótido são codões frequentemente utilizados. Se uma sequência de polinucleótidos tiver um coeficiente de utilização de codão de 1, todos os codões são os codões "mais" frequentes para genes altamente expressos da espécie alvo.

De acordo com a presente invenção, o perfil de utilização de codão do polinucleótido irá excluir, de um modo preferido, os codões que representam < 10% dos codões utilizados para um aminoácido particular. Um valor de utilização relativa de codão sinónimo (RSCU) é o número observado de codões dividido pelo número esperado, se todos os codões para aquele aminoácido forem utilizados igualmente de um modo frequente. Um polinucleótido da presente invenção irá excluir, de um modo preferido, codões com um valor de RSCU menor que 0,2 em genes altamente expressos do organismo alvo. Um polinucleótido da presente invenção terá geralmente um coeficiente de utilização de codão para genes humanos altamente expressos superior a 0,6, de um modo preferido superior a 0,65, de um modo muito preferido superior a 0,7. As tabelas de utilização de codão para humanos também podem ser encontradas no Genbank.

Em comparação, um gene da beta actina altamente expresso tem um RSCU de 0,747. A tabela de utilização de codão (Tabela 1) para um homo sapiens é apresentada abaixo: 31

Tabela 1. Utilização de codão para genes humanos (altamente expressos) 1/24/91 (human high.cod) Aminoácido Codão Número /1000 Fracção Gly GGG 905,00 18,76 0,24 Gly GGA 525,00 10,88 0,14 Gly GGT 441,00 9,14 0,12 Gly GGC 1867,00 38,70 0,50 Glu GAG 2420,00 50,16 0,75 Glu GAA 792,00 16,42 0,25 Asp GAT 592,00 12,27 0,25 Asp GAC 1821,00 37,75 0,75 Vai GTG 1866,00 38,68 0, 64 Vai Gt a 134,00 2,78 0,05 Vai GTT 198,00 4,10 0, 07 Vai GTC 728,00 15,09 0,25 Ala GCG 652,00 13,51 0,17 Ala GCA 488,00 10,12 0,13 Ala GCT 654,00 13,56 0,17 Ala GCC 2057,00 42,64 0,53 Arg AGG 512,00 10,61 0,18 Arg AGA 298,00 6,18 0,10 Ser AGT 354,00 7,34 0,10 Ser AGC 1171,00 24,27 0,34 Lys AAG 2117,00 43,88 0, 82 Lys Aaa 471,00 9,76 0,18 Asn AAT 314,00 6,51 0,22 Asn AAC 1120,00 23,22 0,78 (continuação) 32

Aminoácido Codão Número /1000 Fracção Met ATG 1077,00 22,32 1, 00 Ile ATA 88,00 1,82 0,05 Ile ATT 315,00 6,53 0,18 Ile ATC 1369,00 28,38 0,77 Thr ACG 405,00 8,40 0,15 Thr ACA 373,00 7,73 0,14 Thr ACT 358,00 7,42 0,14 Thr ACC 1502,00 31,13 0,57 Trp TGG 652,00 13,51 1, 00 End TGA 109,00 2,26 0,55 Cys TGT 325,00 6,74 0,32 Cys TGC 706,00 14,63 0, 68 End TAG 42,00 0,87 0,21 End TAA 46, 00 0,95 0,23 Tyr Tat 360,00 7,46 0,26 Tyr Tac 1042,00 21,60 0,74 Leu TTG 313,00 6,49 0,06 Leu TTA 76,00 1,58 0, 02 Phe TTT 336,00 6,96 0,20 Phe TTC 1377,00 28,54 0, 80 Ser TCG 325,00 6,74 0,09 Ser TCA 165,00 3,42 0,05 Ser TCT 450,00 9,33 0,13 Ser TCC 958,00 19,86 0,28 (continuação) 33

Aminoácido Codão Número /1000 Fracção Arg CGG 611,00 12,67 0,21 Arg CGA 183,00 3,79 0,06 Arg CGT 210,00 4,35 0, 07 Arg CGC 1086,00 22,51 0,37 Gin CAG 2020,00 41,87 0, 88 Gin CAA 283,00 5,87 0,12 His Cat 234,00 4,85 0,21 His CAC 870,00 18,03 0,79 Leu CTG 2884,00 59,78 0,58 Leu CTA 166,00 3,44 0,03 Leu CTT 238,00 4,93 0,05 Leu Ctc 1276,00 26,45 0,26 Pro CCG 482,00 9,99 0,17 Pro CCA 456,00 9,45 0,16 Pro Cct 568,00 11,77 0,19 Pro Ccc 1410,00 29,23 0,48 Uma sequência de ADN codificando as proteínas de fusão ou a proteína de ligação à colina modificada da presente invenção pode ser sintetizada utilizando técnicas convencionais de síntese de ADN, tal como por ligação enzimática como descrito por D.M. Roberts et al. em Biochemistry 1985, 24, 5090 -5098, por síntese química, por polimerização enzimática in vitro ou por tecnologia de PCR utilizando, por exemplo, uma polimerase termoestável . ou por uma combinação destas técnicas. A polimerização enzimática de ADN pode ser realizada

in vitro utilizando uma ADN polimerase, tal como a ADN 34 polimerase I (fragmento Klenow) ou Taq polimerase num tampão apropriado contendo os trifosfatos de nucleósido dATP, dCTP, dGTP e dTTP como requerido a uma temperatura de 10-37 °C, geralmente num volume de 50 pi ou menos. A ligação enzimática de fragmentos de ADN pode ser realizada utilizando uma ADN ligase, tal como a T4 ADN ligase num tampão apropriado, tal como 0,05 M de Tris (pH 7,4), 0,01 M de MgCl2, 0,01 M de ditiotreitol, 1 mM de espermidina, 1 mM de ATP e 0,1 m/mL de albumina de soro bovino, a uma temperatura de 4 °C até à ambiente, geralmente num volume de 50 pL ou menos. A sintese quimica do polimero ou fragmento de ADN pode ser realizada por quimica convencional de fosfotriéster, fosfato ou fosforamidite, utilizando técnicas de fase sólida, tais como aquelas descritas em "Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments - A Laboratory Manual" (ed. H.G. Gassen e A. Lang), Verlag Chemie, Weinheim (1982) ou outras publicações cientificas, por exemplo, M.J. Gait, H.W.D. Matthes, M. Singh, B.S. Sproat, e R.C. Titmas, Nucleic Acids Research, 1982, 10, 6243; B.S. Sproat, e W. Bannwarth,

Tetrahedron Letters, 1983, 24, 5771; M.D. Matteucci e M.H.

Caruthers, Tetrahedron Letters, 1980, 21, 719; M.D. Matteucci e M.H. Caruthers, Journal of the American Chemical Society, 1981, 103, 3185; S.P. Adams et al., Journal of the American Chemical Society, 1983, 105, 661; N.D. Sinha, J. Biemat, J. McMannus, e H. Koester, Nucleic Acids Research, 1984, 12, 4539; e H.W.D.

Matthes et al., EMBO Journal, 1984, 3, 801. O processo da invenção pode ser realizado através de técnicas recombinantes convencionais, tais como descritas em Maniatis et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, 1982-1989.

Em particular, o processo pode compreender os passos de: 35 i) preparação de um vector de expressão replicável ou integrante capaz de expressar, numa célula hospedeira, um polímero de ADN compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifique a proteína ou um seu derivado imunogénico ii) transformação de uma célula hospedeira com o referido vector iii) cultivar a referida célula hospedeira transformada sob condições que permitem a expressão do referido polímero de ADN para produzir a referida proteína; e iv) recuperação da referida proteína 0 termo "transformação" é aqui utilizado para demonstrar a introdução de ADN estranho numa célula hospedeira. Isto pode ser realizado, por exemplo, por transformação, transfecção ou infecção com um vector plasmídico ou virai apropriado utilizando, e. g., técnicas convencionais como descritas em Genetic Engineering; Eds. S.M. Kingsman e A.J. Kingsman;

Blackwell Scientific Publications; Oxford, Inglaterra, 1988. 0 termo "transformado" ou "transformante" aplicar-se-á daqui por diante à célula hospedeira resultante contendo e expressando o gene estranho de interesse.

Os vectores de expressão são novos e também fazem parte da da invenção.

Os vectores de expressão replicáveis podem ser preparados de acordo com a invenção, por clivagem de um vector compatível com a célula hospedeira para proporcionar um segmento de ADN linear que tem um replicão intacto, e combinação do referido segmento linear com uma ou mais moléculas de ADN que, conjuntamente com o referido segmento linear codificam o produto desejado, tal como 36 o polímero de ADN que codifica a proteína da invenção ou os seus derivados, sob condições de ligação.

Assim, o polímero de ADN pode ser realizado ou formado durante a construção do vector, como desejado. A escolha do vector será determinada em parte pela célula hospedeira, que pode ser procariótica ou eucariótica mas é, de um modo preferido, E. coli, levedura ou células CHO. Os vectores adequados incluem plasmídeos, bacteriófagos, cosmídeos e vírus recombinantes. Os vectores de expressão e clonagem contêm, de um modo preferido, um marcador de selecção de modo que apenas irão sobreviver as células hospedeiras que expressam o marcador sob as condições selectivas. Os genes de selecção incluem, mas não estão limitados, àqueles que codificam a proteína que confere uma resistência à ampicilina, tetraciclina ou canamicina. Os vectores de expressão também contêm sequências de controlo que são compatíveis com o hospedeiro designado. Por exemplo, as sequências de controlo de expressão para E. coli, e de um modo mais geral para procariótas, incluem promotores e sítios de ligação ao ribossoma. As sequências promotoras podem ser naturais, tais como a β-lactamase (penicilinase) (Weissman 1981, em Interferon 3 (ed. L. Gresser), lactose (lac) (Chang et al. Nature, 1977, 198: 1056) e triptofano (trp) (Goeddel et al. Nucl. Acids Res. 1980, 8, 4057) e sistema promotor PL derivado de lambda. Além disso, os promotores sintéticos que não ocorrem na natureza funcionam também como promotores bacterianos. Este é o caso, por exemplo, do promotor híbrido sintético tac que é derivado de sequências dos promotores trp e lac (De Boer et al., Proc. Acad Natl Sei. USA 1983, 80, 21-26). Estes sistemas são particularmente adequados com E. coli.

Os vectores compatíveis com levedura também contêm marcadores que permitem a selecção de transformantes bem 37 sucedidos, por proporcionarem prototrofia a mutantes auxotróficos ou resistência a metais pesados em estirpes de tipo selvagem. As sequências de controlo de expressão para vectores de levedura incluem promotores para enzimas glicoliticas (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 1968, 7, 149), gene PH05 codificando a fosfatase ácida, gene CUP1, gene ARG3, promotores de genes GAL e sequências promotoras sintéticas. Outros elementos de controlo úteis na expressão de levedura são terminadores e sequências líder de ARNm. A sequência codificadora 5' é particularmente útil uma vez que codifica tipicamente um péptido sinal compreendido de aminoácidos hidrofóbicos que direccionam a secreção da proteína da célula. As sequências sinal adequadas podem ser codificadas por genes para proteínas de levedura excretadas, tal como o gene da invertase de levedura e o gene do factor a, fosfatase ácida, toxina assassina, o gene do factor alfa-acasalamento e recentemente a sequência sinal da inulinase heteróloga derivada do INU1A de Kluyveromyces marxianus. Foram desenvolvidos vectores adequados para expressão em Pichia pastoris e Saccharomyces cerevisiae.

Estão disponíveis vários vectores de expressão de P. pastoris baseados em vários promotores indutíveis ou constitutivos (Cereghino e Cregg, FEMS Microbiol. Rev. 2000, 24:45-66). Para a produção de proteínas citosólicas e excretadas, os vectores de P. pastoris mais habitualmente utilizados contêm o promotor muito forte e firmemente regulado da álcool oxidase (A0X1). Os vectores também contêm o gene da histidinol desidrogenase de P. pastoris (HIS4) para a selecção em hospedeiros his4. A secreção da proteína estranha requer a presença de uma sequência sinal e a sequência sinal do factor alfa-acasalamento prepro de S. cerevisiae tem sido amplamente utilizado com sucesso no sistema de expressão de Pichia. Os vectores de expressão são integrados no genoma de P. pastoris 38 para maximizar a estabilidade de estirpes de expressão. Como em S. cerevisiae, a clivagem de um vector de expressão de P. pastoris dentro de uma sequência partilhada pelo genoma hospedeiro (A0X1 ou HIS4) estimula os eventos de recombinação homóloga que direccionam eficientemente a integração do vector nesse locus genómico. Em geral, uma estirpe recombinante que contém múltiplas cópias integradas de uma cassete de expressão pode produzir mais proteína heteróloga do que uma estirpe de cópia única. 0 modo mais eficaz para obter transformantes de elevado número de cópias requer a transformação de uma estirpe receptora de Pichia através da técnica do esferoplasto (Cregg et al. 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 3376-3385). A preparação do vector de expressão replicável pode ser realizada convencionalmente com enzimas apropriadas para restrição, polimerização e ligação de ADN, através de processos descritos em, por exemplo, Maniatis et al. acima referido. A célula hospedeira recombinante é preparada, de acordo com a invenção, por transformação de uma célula hospedeira com um vector de expressão replicável da invenção sob condições de transformação. As condições de transformação adequadas são convencionais e estão descritas em, por exemplo, Maniatis et al. acima referido ou "DNA Cloning" Vol. II, D.M. Glover ed., IRL Press Ltd, 1985. A escolha das condições de transformação depende da escolha da célula hospedeira a ser transformada. Por exemplo, a transformação in vivo utilizando um vector virai vivo como o agente de transformação para os polinucleótidos da invenção é descrita acima. A transformação bacteriana de um hospedeiro, tal como E. coli, pode ser realizada através de incorporação directa dos polinucleótidos (que podem ser vectores de expressão 39 contendo a sequência desejada) depois do hospedeiro ser tratado com uma solução de CaCl2 (Cohen et al., Proc. Nat. Acad. Sei., 1973, 69, 2110) ou com uma solução compreendendo uma mistura de cloreto de rubidio (RbCl), MnCl2, acetato de potássio e glicerol, e depois com ácido 3-[N-morfolino]-propano-sulfónico, RbCl e glicerol ou através de electroporação. A transformação de organismos eucarióticos inferiores, tal como células de levedura em cultura através de incorporação directa pode ser realizada, por exemplo, através da utilização do método Hinnen et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. 1978, 75: 1929-1933) . As células de mamíferos em cultura podem ser transformadas utilizando a coprecipitação com fosfato de cálcio do ADN do vector sobre as células (Graham e Van der Eb, Virology 1978, 52, 546) . Outros métodos para introdução de polinucleótidos em células de mamífero incluem transfecção mediada por dextrano, transfecçâo mediada por polibreno, fusão de protoplastos, electroporação, encapsulação do(s) polinucleótido(s) em lipossomas e microinjecção directa de polinucleótidos em núcleos. A invenção também se estende a uma célula hospedeira transformada com um ácido nucleico codificando a proteína da invenção ou um vector de expressão replicável da invenção. O cultivo da célula hospedeira transformada sob condições que permitem a expressão do polímero de ADN é realizada convencionalmente, como descrito em, por exemplo, Maniatis et al. e "DNA Cloning", referidos acima. Assim, de um modo preferido a célula é fornecida com nutriente e cultivada a uma temperatura abaixo de 50 °C, de um modo preferido entre 25 °C e 42 °C, de um modo mais preferido entre 25 °C e 35 °C, de um modo muito preferido a 30 °C. O tempo de incubação pode variar desde alguns minutos até algumas horas, de acordo com a proporção do polipéptido na célula bacteriana, como avaliado por SDS-PAGE ou transferência de Western. 40 0 produto pode ser recuperado através de métodos convencionais, de acordo com a célula hospedeira e de acordo com a localização do produto de expressão (intracelular ou excretado no meio de cultura ou no periplasma da célula) . Assim, no caso em que a célula hospedeira é bacteriana, tal como E. coli, pode, por exemplo, ser lisada fisicamente, quimicamente ou enzimaticamente e o produto proteico isolado do lisado resultante. No caso em que a célula hospedeira é de mamífero, o produto pode ser geralmente isolado do meio nutriente ou de extractos sem células. No caso em que a célula hospedeira é uma levedura, tal como Saccharomyces cerevisiae ou Pichía pastoris, o produto pode ser geralmente isolado a partir de células lisadas ou do meio de cultura, e depois ainda purificado utilizando técnicas convencionais. A especificidade do sistema de expressão pode ser avaliada através de transferência de Western ou por ELISA utilizando um anticorpo dirigido contra o polipéptido de interesse.

As técnicas convencionais de isolamento de proteína incluem precipitação selectiva, cromatografia de adsorção, e cromatografia de afinidade, incluindo uma coluna de afinidade de anticorpo monoclonal. Quando as proteínas da presente invenção são expressas com uma extremidade de histidina (marcador His), estas podem ser facilmente purificadas através de cromatografia de afinidade utilizando uma coluna de cromatografia de afinidade de ião metálico (IMAC) . 0 ião metálico pode ser qualquer ião adequado, por exemplo, zinco, níquel, ferro, magnésio ou cobre, mas, de um modo preferido, é zinco ou níquel. De um modo preferido, o tampão de IMAC contém detergente, de um modo preferido um detergente aniónico, tal como SDS, de um modo mais preferido um detergente não iónico, tal como Tween 80 ou um detergente anfotérico, tal como Empigen BB, uma vez que isto 41 pode resultar em níveis inferiores de endotoxina no produto final.

Os passos cromatográficos adicionais incluem, por exemplo, um passo de Q-Sepharose que pode ser realizado antes ou depois da coluna de IMAC. De um modo preferido, o pH está na escala de 7,5 até 10, de um modo mais preferido desde 7,5 até 9,5, optimamente entre 8 e 9.

As proteínas da invenção podem ser assim purificadas de acordo com o seguinte protocolo. Após ruptura das células, os extractos celulares contendo a proteína podem ser solubilizados num tampão Tris a pH 8,5 contendo ureia (por exemplo, 8,0 M) e SDS (por exemplo, desde 0,5% a 1%). Após centrifugação, o sobrenadante resultante pode ser depois carregado sobre uma coluna Sepharose FF (Níquel) de IMAC, equilibrada com um tampão Tris a pH 8,5. A coluna pode ser depois lavada com um tampão contendo sal elevado (e. g., 0,75 - 1,5 M de NaCl, 15 mM de tampão Tris a pH 8,5). A coluna pode ser depois opcionalmente lavada, novamente com tampão de fosfato sem sal. As proteínas da invenção podem ser eluídas da coluna com uma solução tamponada contendo imidazole. As proteínas podem ser depois submetidas a um passo cromatográfico adicional, tal como uma cromatografia de permuta aniónica (por exemplo, Q Sepharose).

As proteínas da presente invenção são proporcionadas solúveis numa forma líquida ou numa forma liofilizada, a qual é a forma preferida. É geralmente esperado que cada dose humana irá compreender 1 a 1000 yg de proteína, e de um modo preferido 30-300 yg. O processo de purificação pode também incluir um passo de carboxiamidação em que a proteína é primeiro reduzida na presença de Glutationo e depois carboximetilada na presença de iodoacetamida. Este passo oferece a vantagem de controlo da agregação oxidativa da molécula com ela própria ou com 42 contaminantes proteicos da célula hospedeira através de ligação covalente com ligações dissulfureto. A presente invenção também proporciona composições farmacêuticas e imunogénicas compreendendo uma proteína da presente invenção num excipiente farmaceuticamente aceitável. Uma composição de vacina preferida compreende, pelo menos, uma proteína de acordo com a invenção. A referida proteína tem, de um modo preferido, grupos tiol bloqueados e está altamente purificada, e. g., tem menos do 5% de contaminação da célula hospedeira. Essa vacina pode conter opcionalmente um ou mais outros antigénios associados a tumores e derivados. Por exemplo outro antigénio associado adequado inclui a prostase, PAP-1, PSA (antigénio específico da próstata), PSMA (antigénio de membrana específico da próstata), PSCA (Antigénio da Célula Estaminal da Próstata), STEAP.

Noutra forma de realização, as composições imunogénicas ilustrativas, tais como, por exemplo, composições de vacina, da presente invenção compreendem ADN codificando um ou mais dos polipéptidos de fusão como acima descritos, de modo que o polipéptido de fusão seja gerado in situ. Como assinalado acima, o polinucleótido pode ser administrado dentro de qualquer um de uma variedade de sistemas de distribuição conhecidos dos especialistas na técnica. De facto, são bem conhecidas na técnica numerosas técnicas de transferência génica, tal como aquelas descritas por Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug carrier Systems 15:143-198, 1998, e referências aí citadas. Os sistemas de expressão de polinucleótido apropriados irão, naturalmente, conter as sequências reguladoras de ADN reguladoras necessárias para expressão num doente (tal como um promotor e sinal de terminação adequado). Alternativamente, os sistemas de distribuição bacterianos podem envolver a administração de uma bactéria (tal como o Bacillus-Calmette-Guerrin) que expressa uma 43 porção imunogénica do polipéptido na sua superfície celular ou segrega esse epitopo.

Deste modo, em determinadas formas de realização, os polinucleótidos codificando polipéptidos imunogénicos aqui descritos são introduzidos em células hospedeiras adequadas de mamífero para expressão utilizando qualquer de um número de sistemas baseados em vírus conhecidos. Numa forma de realização ilustrativa, o retrovírus proporciona uma plataforma conveniente e eficaz para sistemas de transferência génica. Uma sequência de nucleótidos seleccionada codificando um polipéptido da presente invenção pode ser introduzida num vector e empacotada em partículas retrovirais utilizando as técnicas conhecidas na matéria. 0 vírus recombinante pode ser depois isolado e transferido a um indivíduo. Têm sido descritos uma variedade de sistemas retrovirais ilustrativos (e. g., Pat. U.S. N° 5219740; Miller e Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852; Bums et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:8033-8037; e Boris-Lawrie e Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109.

Além disso, foi também descrita uma variedade de sistemas baseados em adenovírus ilustrativos. Ao contrário dos retrovírus que se integram no genoma do hospedeiro, os adenovírus persistem extracromossomicamente, minimizando assim os riscos associados com a mutagénese por inserção (Haj-Ahmad e Graham (1986) J. Virol. 57:267-274; Bett et al. (1993) J. Virol. 67:5911-5921; Mittereder et al. (1994) Human Gene Therapy 5:717-729; Seth et al. (1994) J. Virol. 68:933-940; Barr et al. (1994) Gene Therapy 1:51-58; Berkner, K. L. (1988) BioTechniques 6:616-629; e Rich et al. (1993) Human Gene Therapy 4:461-476). Uma vez que os humanos são por vezes infectados com serotipos de adenovírus 44 humanos comuns, tal como AdHu5, uma proporção significativa da população tem uma resposta de anticorpo neutralizante do adenovírus, que é provável que afecte a resposta imunológica a um antigénio heterólogo num sistema baseado em vacina recombinante. Os vectores adenovirais de primatas não humanos, tal como o adenovírus 68 de chimpanzé (AdC68, Fitzgerald et al. (2003) J. Immunol 170(3):1416-22)) podem oferecer um sistema adenoviral alternativo sem a desvantagem de uma resposta de anticorpo neutralizante pré-existente.

Foram também desenvolvidos vários sistemas de vector de vírus adeno-associados (AAV) para a distribuição de polinucleótido. Os vectores de AAV podem ser prontamente construídos utilizando técnicas bem conhecidas na matéria. Ver, e. g., Pat. U.S. N° 5173414 e 5139941; Publicação Internacional N° WO 92/01070 e WO 93/03769; Lebkowski et al. (1988) Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996; Vincent et al. (1990) Vaccine 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Cárter, B. J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:533-539; Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129; Kotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Shelling e Smith (1994) Gene Therapy 1:165-169; e Zhou et al. (1994) J. Exp. Med. 179:1867-1875.

Os vectores virais adicionais úteis para a transferência de moléculas de ácidos nucleicos codificando polipéptidos da presente invenção, através de transferência génica, incluem aqueles derivados da família pox de vírus, tais como vírus vaccinia e poxvírus de aves. A título de exemplo, podem ser construídos vírus vaccinia recombinantes que expressam as novas moléculas como se segue. O ADN codificando um polipéptido é primeiro introduzido num vector apropriado de modo que esteja adjacente a um promotor de vaccinia e a sequências de ADN de vaccinia flanqueadoras, tal como a sequência codificando a 45 timidina cinase (TK). Este vector é depois utilizado para transfectar células que são simultaneamente infectadas com vaccinia. A recombinação homóloga serve para introduzir o promotor de vaccinia mais o gene codificando o polipéptido de interesse no genoma virai. 0 TK.sup.(-) recombinante resultante pode ser seleccionado através de cultivo das células na presença de 5-bromodesoxiuridina e escolhendo as placas virais ai resistentes.

Um sistema de infecção/transfecção baseado em vaccinia pode ser utilizado convenientemente para proporcionar expressão ou coexpressão transitória, indutível, de um ou mais polipéptidos aqui descritos em células hospedeiras de um organismo. Neste sistema particular, as células são primeiro infectadas in vitro com um virus vaccinia recombinante que codifica a T7 ARN polimerase de bacteriófago. Esta polimerase apresenta especificidade subtil uma vez que apenas transcreve moldes contendo promotores T7. Depois da infecção, as células são transfectadas com o polinucleótido ou polinucleótidos de interesse, movidas por um promotor T7. A polimerase expressa no citoplasma a partir do virus vaccinia recombinante transcreve o ADN transfectado em ARN que é depois traduzido no polipéptido pela maquinaria de tradução do hospedeiro. 0 método proporciona uma produção citoplasmática transitória de nivel elevado, de quantidades grandes de ARN e os seus produtos de tradução. Ver, e. g., Elroy-Stein e Moss, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1990) 87:6743-6747; Fuerst et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1986) 83:8122-8126.

Alternativamente, os avipoxvirus, tais como os virus de fowlpox e canarypox, podem também ser utilizados para transferir as sequências codificantes de interesse. Os virus avipox recombinantes, expressando imunogénios de mamíferos patogéneos, são conhecidos por conferirem imunidade protectora quando 46 administrados à espécies não aviárias. A utilização de um vector de avipox é particularmente desejável em humanos e outras espécies de mamíferos uma vez que os membros do género Avipox podem apenas replicar produtivamente em espécies aviárias susceptíveis e, deste modo, não infectam células de mamíferos. Os métodos para produzir vírus Avipox recombinantes são conhecidos na técnica e utilizam recombinação genética, como acima descrito relativamente à produção de vírus vaccinia. Ver, e. g., documentos WO 91/12882; WO 89/03429; e WO 92/03545.

Qualquer um de uma variedade de vectores alfavírus também pode ser utilizado para a distribuição de composições de polinucleótido da presente invenção, como aqueles vectores descritos nas Patentes U.S. N° 5843723; 6015686; 6008035 e 6015694. São também utilizados determinados vectores baseados na Encefalite Equina Venezuelana (VEE), cujos exemplos ilustrativos podem ser encontrados nas Patentes U.S. N° 5505947 e 5643576.

As composições da presente invenção também podem ser distribuídas através de uma variedade de vias, tais como intramuscularmente, subcutaneamente, intraperitonalmente ou intravenosamente.

Noutra forma de realização da invenção, um polinucleótido é administrado/transferido como ADN "nú" como, por exemplo, descrito em Ulmer et al., Science 259:1745-1749, 1993 e revisto por Cohen, Science 259:1691-1692, 1993. A incorporação de ADN nú pode ser aumentada através do revestimento de esferas biodegradáveis com o ADN, que são eficientemente transportadas para as células. Numa forma de realização preferida, a composição é distribuída intradermicamente. Em particular, a composição é distribuída através de técnicas de administração com pistola de genes (particularmente bombardeamento de partículas) que envolve o revestimento do vector sobre uma 47 esfera (e. g. ouro) que são depois administradas sob alta pressão na epiderme; tal como, por exemplo, descrito em Haynes et al.f J Biotechnology 44: 37-42 (1996).

Num exemplo ilustrativo, a aceleração das partículas impelidas por gás é realizada com dispositivos, tais como aqueles produzidos pela Powderject Pharmaceuticals PLC (Oxford, Reino Unido) e Powderject Vaccines Inc. (Madison, WI), alguns exemplos dos quais são descritos nas Patentes U.S. N° 5846796; 6010478; 5865796; 5584807; e Patente EP N° 0500799. Esta abordagem oferece uma abordagem de distribuição sem agulha em que uma formulação de pó seco de partículas microscópicas, tal como o polinucleótido, é acelerada a alta velocidade dentro de um jacto de gás hélio produzido por um dispositivo agarrado manualmente, propulsionando as partículas num tecido alvo de interesse, tipicamente a pele. As partículas são, de um modo preferido, esferas de ouro de diâmetro de 0,4 - 4,0 ym, de um modo mais preferido 0,6 - 2,0 ym e o ADN conjugado revestido sobre estas e depois encerradas num cartucho ou cassete para colocação na "pistola de genes".

Numa forma de realização relacionada outros dispositivos e métodos que podem ser úteis para a injecção impelida por gás e sem agulha de composições da presente invenção incluem aqueles proporcionado pela Bioject, Inc. (Portland, OR), alguns exemplos dos quais são descritos nas Patentes U.S. N° 4790824; 5064413; 5312335; 5383851; 5399163; 5520639 e 5993412. É possível para o componente imunogénico compreendendo a sequência de nucleótidos codificando o péptido antigénico, a ser administrado numa base de uma só vez ou a ser administrado repetidamente, por exemplo, entre 1 e 7 vezes, de um modo preferido entre 1 e 4 vezes, em intervalos entre cerca de 1 dia e cerca de 18 meses. Contudo, este regime do tratamento irá 48 varias significativamente dependendo do tamanho do doente, da doença que está a ser tratada/protegida contra, da quantidade de sequência de nucleótidos administrada, da via de administração, e de outros factores que seriam evidentes a um médico assistente especialista. É deste modo outro aspecto da presente invenção proporcionar a utilização de uma proteína ou um ADN codificando a referida proteína, como aqui descrita, na produção de uma composição imunogénica para induzir uma resposta imunológica num doente. De um modo preferido, a resposta imunológica é para ser induzida através de administração sequencial i) da referida proteína seguida pela referida sequência de ADN; ou ii) a referida sequência de ADN seguida pela referida proteína. De um modo mais preferido, a sequência de ADN é revestida em esferas biodegradáveis ou distribuída através de uma abordagem de bombardeamento de partículas. De um modo ainda mais preferido, a proteína é adjuvantada, de um modo preferido com um adjuvante de indução de TH-1, de um modo preferido com uma formulação adjuvante baseada em CpG/QS21.

Os vectores que compreendem as sequências de nucleótidos codificando péptidos antigénicos são administrados numa quantidade que será profilaticamente ou terapeuticamente eficaz. A quantidade a ser administrada é geralmente na escala de um picograma até 16 miligrama, de um modo preferido 1 picograma até 10 microgramas para distribuição mediada por partícula, e 10 microgramas até 16 miligrama para outras vias de nucleótido por dose. A quantidade exacta pode variar consideravelmente dependendo do peso do doente a ser imunizado e da via de administração.

As técnicas adequadas para introduzir o vector ou polinucleótido nu num doente também incluem a aplicação tópica 49 com um veículo apropriado. 0 ácido nucleico pode ser administrado topicamente à pele ou a superfícies mucósicas, por exemplo, através de administração intranasal, oral, intravaginal ou intra-rectal. 0 vector ou polinucleótido nu podem estar presentes conjuntamente com um excipiente farmaceuticamente aceitável, tal como soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS). A incorporação de ADN pode ser ainda facilitada através da utilização de agentes facilitadores, tal como bupivacaína, separadamente ou incluída na formulação de ADN. Outros métodos de administração do ácido nucleico directamente a um receptor incluem ultra-sons, estimulação eléctrica, electroporação e micro-inoculação que é descrita no documento U.S. 5697901. A incorporação de construções de ácidos nucleicos pode ser intensificada através de diversas técnicas de transfecção conhecidas, por exemplo, aquelas que incluem a utilização de agentes de transfecção. Os exemplos destes agentes incluem agentes catiónicos, por exemplo, fosfato de cálcio e DEAE-Dextrano e lipofectantes, por exemplo, lipofectam e transfectam. A dosagem do ácido nucleico a ser administrado pode ser alterada.

As proteínas de fusão e polipéptidos codificantes de acordo com a invenção podem também ser formulados como uma composição farmacêutica/imunogénica, e. g., como uma vacina. Deste modo, de acordo com o exposto, a presente invenção também proporciona uma composição farmacêutica/imunogénica compreendendo uma proteína de fusão da presente invenção num excipiente farmaceuticamente aceitável. De acordo com o exposto, é também proporcionado um processo para a preparação de uma composição imunogénica de acordo com a presente invenção, compreendendo a mistura da proteína de fusão da invenção ou o polinucleótido codificante com um adjuvante, diluente ou outro veículo farmaceuticamente aceitável adequado. 50

As proteínas de fusão da presente invenção são proporcionadas, de um modo preferido, pelo menos, 80% puras, de um modo mais preferido, 90% puras como visualizado através de SDS-PAGE. De um modo preferido, as proteínas aparecem como uma única banda através de SDS-PAGE. A preparação de vacina é geralmente descrita em Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (eds. Powell M.F. e Newman M.J). (1995) Plenum Press Nova Iorque). A encapsulação em lipossomas é descrita por Fullerton, Patente U.S. 4235877.

As proteínas de fusão da presente invenção e os polinucleótidos codificantes são, de um modo preferido, adjuvantados na formulação de vacina da invenção. Determinados adjuvantes estão comercialmente disponíveis como, por exemplo, Adjuvante Incompleto de Freund e Adjuvante Completo (Difco Laboratories, Detroit, MI); Adjuvante 65 Merck (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ); AS-2 (SmithKline Beecham, Filadélfia, PA); sais de alumínio, tais como gel de hidróxido de alumínio (alúmen) ou fosfato de alumínio; sais de cálcio, ferro ou zinco; uma suspensão insolúvel de tirosina acilada; açúcares acilados; polissacáridos derivados cationicamente ou anionicamente; polifosfazenos; microesferas biodegradáveis; monofosforil-lípido A e quil A. Citocinas, tais como GM-CSF, interleucina-2, -7, -12 e outros factores de crescimento semelhantes, também podem ser utilizados como adjuvantes.

Dentro de determinadas formas de realização da invenção, a composição adjuvante é, de um modo preferido, uma que induz uma resposta imunológica predominantemente de tipo Thl. Níveis elevados de citocinas de tipo Thl (e. g., IFN-γ, TNFa, IL-2 e IL-12) tendem a favorecer a indução de respostas imunológicas mediadas por célula a um antigénio administrado. Em contraste, 51 níveis elevados de citocinas de tipo Th2 (e. g., IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10) tendem a favorecer a indução de respostas imunológicas humorais. Após aplicação de uma vacina como aqui proporcionada, um doente suportará uma resposta imunológica que inclua respostas de tipo Thl e Th2. Dentro de uma forma de realização preferida, em que uma resposta é predominantemente do tipo Thl, o nível de citocinas de tipo Thl aumentará em maior grau do que o nível de citocinas de tipo Th2. Os níveis destas citocinas podem ser prontamente avaliados utilizando ensaios convencionais. Para uma revisão das famílias de citocinas, ver Mosmann e Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7:145-173, 1989.

Os adjuvantes indutores de Th-1 preferidos são seleccionados do grupo de adjuvantes compreendendo: 3D-MPL, QS21, uma mistura de QS21 e colesterol, e um oligonucleótido CpG ou uma mistura de dois ou mais dos referidos adjuvantes. Determinados adjuvantes preferidos para induzir uma resposta predominantemente de tipo Thl incluem, por exemplo, uma combinação de monofosforil-lípido A, de um modo preferido monofosforil-lípido A 3-de-0-acilado, conjuntamente com um sal de alumínio. Os adjuvantes MPL® estão disponíveis da Corixa Corporation (Seattle, WA; ver, por exemplo, Patentes U.S. N° 4436727; 4877611; 4866034 e 4912094). Os oligonucleótidos contendo CpG (em que o dinucleótido CpG está não metilado) induzem também predominantemente uma resposta Thl. Esses oligonucleótidos são bem conhecidos e são descritos, por exemplo, nos documentos WO 96/02555, WO 99/33488 e Patentes U.S. N° 6008200 e 5856462. São também descritas sequências de ADN imunoestimuladoras, por exemplo, por Sato et al., Science 273:352, 1996. Outro adjuvante preferido compreende uma saponina, tal como Quil A ou os seus derivados, incluindo QS21 e QS7 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA); Escina; Digitonina; ou saponinas de Gypsophila ou Chenopodium quinoa. Outras formulações preferidas incluem mais do que uma saponina nas combinações adjuvantes da presente invenção, por exemplo, 52 combinações de, pelo menos, dois do seguinte grupo compreendendo QS21, QS7, Quil A, β-escina ou digitonina.

Alternativamente, as formulações de saponina podem ser combinadas com veiculos de vacina compostos de quitosano ou outros polímeros policatiónicos, partículas de polilactida e polilactida-co-glicolida, matriz polimérica baseada em poli-N-acetil-glucosamina, partículas compostas de polissacáridos ou polissacáridos quimicamente modificados, lipossomas e partículas baseadas em lípido, partículas compostas de monoésteres de glicerol, etc. As saponinas podem também ser formuladas na presença de colesterol para formar estruturas particuladas, tais como lipossomas ou ISCOM. Além disso, as saponinas podem ser formuladas conjuntamente com um éter ou éster de polioxietileno, numa solução não particulada ou suspensão ou numa estrutura particulada, tal como um lipossoma paucilamelar ou ISCOM. As saponinas também podem ser formuladas com excipientes, tal como CarbopolR para aumentar a viscosidade ou podem ser formuladas numa forma de pó seco com um excipiente em pó, tal como a lactose.

Numa forma de realização preferida, o sistema adjuvante inclui a combinação de um monofosforil-lípido A e um derivado de saponina, tal como a combinação de QS21 e adjuvante 3D-MPL®, como descrito no documento WO 94/00153 ou uma composição menos reactogénica em que QS21 é neutralizada com colesterol, como descrito no documento WO 96/33739. Outras formulações preferidas compreendem uma emulsão óleo-em-água e tocoferol. Uma outra formulação adjuvante particularmente preferida utilizando QS21, adjuvante 3D-MPL® e tocoferol numa emulsão óleo-em-água é descrita no documento WO 95/17210.

Outros sistemas adjuvantes intensificados envolvem a combinação de um oligonucleótido contendo CpG e um derivado de 53 saponina, particularmente a combinação de CpG e QS21 como divulgada nos documentos WO 00/09159 e WO 00/62800. De um modo preferido, a formulação compreende adicionalmente uma emulsão óleo em água e tocoferol.

Ainda noutra forma de realização, a presente invenção proporciona uma composição imunogénica compreendendo uma proteína de fusão de acordo com a invenção, e compreendendo ainda D3-MPL, uma saponina de um modo preferido QS21 e um oligonucleótido CpG, opcionalmente formulado numa emulsão óleo em água.

Os adjuvantes ilustrativos adicionais para utilização nas composições farmacêuticas da invenção incluem Montanide ISA 720 (Seppic, França), SAF (Chiron, Califórnia, Estados Unidos), ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron), a série de adjuvantes SBAS (e. g., SBAS-2 ou SBAS-4, disponíveis da SmithKline Beecham, Rixensart, Bélgica), Detox (Enhanzyn® (Corixa, Hamilton, TA) , RC-529 (Corixa, Hamilton, MT) e outros 4-fosfatos de aminoalquilglucosaminida (AGP), como aqueles descritos nos Pedidos pendentes de Patente U.S. N° de Série 08/853826 e 09/074720, cujas divulgações são aqui incorporadas põe referência na sua totalidade, e adjuvantes de éter de polioxietileno, tais como aqueles descritos no documento WO 99/52549A1.

Outros adjuvantes preferidos incluem moléculas adjuvantes da fórmula geral (I) : HO (CH2CH20) n-A-R, em que n é 1-50, A é uma ligação ou -C(O)-, R é alquiloCi-5o ou FenilalquiloCi-5o. Uma forma de realização da presente invenção consiste de uma formulação de vacina compreendendo um éter de polioxietileno de fórmula geral (I) , em que n está entre 1 e 50, de um modo preferido 4-24, de um modo 54 muito preferido 9; o componente R é C1-50, de um modo preferido alquiloC4-C2o e de um modo muito preferido alquiloCi2, e A é uma ligação. A concentração dos éteres de polioxietileno devem estar na gama de 0,1-20%, de um modo preferido a partir de 0,1-10%, e de um modo muito preferido na gama de 0,1-1%. Os éteres de polioxietileno preferidos são seleccionados a partir do seguinte grupo: éter de polioxietileno-9-laurilo, éter de polioxietileno-9-esteorilo, éter de polioxietileno-8-esteorilo, éter de polioxietileno-4-laurilo, éter de polioxietileno-35-laurilo, e éter de polioxietileno-23-laurilo. Os éteres de polioxietileno, tais como éter polioxietileno-laurilo são descritos no índice da Merck (12a edição: entrada 7717). Estas moléculas adjuvantes são descritas no documento WO 99/52549. O éter de polioxietileno de acordo com a fórmula geral (I) acima pode, se desejado, ser combinado com outro adjuvante. Por exemplo, uma combinação adjuvante preferida é, de um modo preferido, com CpG como descrito no pedido pendente de Patente UK GB 9820956.2. É uma forma de realização da invenção que os antigénios, incluindo vector de ácido nucleico, da invenção sejam utilizados com agente imunoestimulador. De um modo preferido, o agente imunoestimulador é administrado ao mesmo tempo que os antigénios da invenção e em formas de realização preferidas são formulados conjuntamente. É outra forma de realização da invenção que o antigénio e o agente imunoestimulador (ou vice-versa) sejam administrados sequencialmente aos mesmos sítios ou adjacentes, separados no tempo por períodos entre 0-100 horas. Esses agentes imunoestimuladores incluem, mas não estão limitados a: imidazoquinolinas sintéticas, tais como imiquimod [S-26308, R-837], (Harrison, et al., Vaccine 19: 1820-1826, 2001; e resiquimod [S—28463, R-848] (Vasilakos, et al., Cellular immunology 204: 64-74, 2000; Bases de Schiff de carbonilos e aminas que são constitutivamente expressas na célula apresentadora de antigénio e superfícies de célula T, tais como 55 tucaresol (Rhodes, J. et al., Nature 377: 71-75, 1995), citocina, quimiocina e moléculas co-estimuladoras como proteína ou péptido, incluindo, por exemplo, citocinas pró-inflamatórias, tais como Interferão, GM-CSF, IL-1 alfa, IL-1 beta, TGF-alfa e TGF-beta, indutores Thl, tais como interferão gama, IL-2, IL-12, IL-15, IL-18 e IL-21, indutores Th2, tais como IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13 e outros genes de quimiocina e co-estimuladores, tais como MCP-1, MIP-1 alfa, MIP-1 beta, RANTES, TCA-3, CD80, CD86 e CD40L outros ligandos direccionantes imunoestimuladores, tais como CTLA-4 e L-selectina, proteínas e péptidos estimuladores de apoptose, tais como Fas, (49), adjuvantes sintéticos baseados em lípido, tais como vaxfectin, (Reyes et al., Vaccine 19: 3778-3786, 2001) esqualeno, alfa tocoferol, polissorbato 80, DOPC e colesterol, endotoxina, [LPS], (Beutler, B., Current Opinion in Microbiology 3: 23-30, 2000); Oligo- e di-nucleótidos de CpG (Sato, Y. et al., Science 273 (5273): 352-354, 1996; Hemmi, H. et al., Nature 408: 740-745, 2000) e outros ligandos potenciais que activam receptores Toll para produzir citocinas indutoras de Thl, tais como lipoproteínas Micobacterianas sintéticas, proteína Micobacteriana pl9, peptidoglicano, ácido teicóico e lípido A.

Outro adjuvante adequado inclui CT (toxina da cólera, subunidades A e B) e LT (enterotoxina lábil ao calor de E. coli, subunidades A e B), família das proteínas de choque térmico (HSP), e LLO (listeriolisina 0; documento WO 01/72329).

Nos casos em que o agente imunoestimulador é uma proteína, o agente pode ser administrado como uma proteína ou como um polinucleótido codificando a proteína.

Outros sistemas de distribuição adequados incluem microesferas, em que o material antigénico é incorporado ou 56 conjugado a polímeros/microesferas biodegradáveis de modo que o material antigénico possa ser misturado com um veiculo farmacêutico adequado e utilizado como uma vacina. 0 termo "microesferas" é geralmente utilizado para descrever partículas coloidais que são substancialmente esféricas e têm um diâmetro na gama de 10 nm a 2 mm. As microesferas feitas a partir de uma vastíssima gama de polímeros naturais e sintéticos encontraram utilização numa variedade de aplicações biomédicas. Este sistema de distribuição é especialmente vantajoso para proteínas que têm semi-vidas curtas in vivo, requerendo tratamentos múltiplos para proporcionar eficácia ou sendo instáveis em fluidos biológicos ou não totalmente absorvidos a partir do tracto gastrointestinal por causa dos seus pesos moleculares relativamente elevados. Foram descritos diversos polímeros como uma matriz para a libertação de proteína. Os polímeros adequados incluem gelatina, colagénio, alginatos, dextrano. Os sistemas de distribuição preferidos incluem poli(ácido DL-láctico) (PLA), poli(lactida-co-glicolida) (PLG), poli(ácido glicólico) (PGA), poli(s-caprolactona) (PCL), copolímeros de poli(ácido DL-láctico-co-glicólico) (PLGA) biodegradáveis. Outros sistemas preferidos incluem hidrogéis heterogéneos, tais como copolímeros multibloco poli(éter éster), contendo blocos repetitivos baseados em poli-(etilenoglicol) (PEG) hidrofílico e poli(tereftalato de butileno) (PBT) hidrofóbico ou poli(etilenoglicol)-tereftalato/poli(tereftalato de butileno) (PEGT/PBT) (Sohier et al. Eur. J. Pharm and Biopharm, 2003, 55, 221-228). São preferidos os sistemas que proporcionam uma libertação sustentada durante 1 a 3 meses, tais como PLGA, PLA e PEGT/PBT. É possível à composição imunogénica ou de vacina ser administrada uma única vez ou, de um modo preferido, ser administrada repetidamente, tantas vezes quanto necessário, por exemplo, entre 1 e 7 vezes, de um modo preferido entre 1 e 4 vezes, em intervalos entre cerca de 1 dia e cerca de 18 meses, 57 de um modo preferido um mês. Isto pode ser opcionalmente seguido por dosagem em intervalos regulares entre 1 e 12 meses durante um período até ao resto da vida do doente. Numa forma de realização preferida, o doente recebe o antigénio em formas diferentes num regime de "primeiro reforço". Assim, por exemplo, o antigénio, a proteína de fusão, é primeiro administrado como uma formulação de base adjuvante de proteína e depois subsequentemente administrado como uma vacina baseada em ADN. Este modo de administração é preferido. 0 adjuvante preferido é uma combinação de um oligonucleótido contendo CpG e um derivado de saponina, particularmente a combinação de CpG e QS21 como divulgada nos documentos WO 00/09159 e WO 00/62800. A incorporação de ADN nu pode ser aumentada por revestimento do ADN sobre esferas biodegradáveis, que são transportadas eficientemente para dentro das células. Alternativamente, o ADN pode ser transferido através de uma abordagem de bombardeamento de partículas, por exemplo, aceleração de partículas impelidas por gás com dispositivos, tais como aqueles fabricados pela Powderject Pharmaceuticals PLC (Oxford, Reino Unido) e Powderject Vaccines Inc. (Madison, Wl) como aqui ensinado. Esta abordagem oferece uma abordagem de distribuição sem agulha em que uma formulação de pó seco de partículas microscópicas, tais como partículas de polinucleótido ou polipéptido, são aceleradas a alta velocidade dentro de um jacto de hélio gasoso produzido por um dispositivo agarrado manualmente, propulsionando as partículas num tecido alvo de interesse.

Noutra forma de realização preferida, a vacina baseada em ADN será administrada primeiro, seguida pela formulação de base adjuvante de proteína. Ainda outra forma de realização irá referir-se à transferência da construção de ADN através de vectores de transferência especializados, de um modo preferido através de um sistema virai, de um modo muito preferido através de sistemas baseados em adenovírus. Outros sistemas baseados em 58 vírus adequados de transferência de ADN incluem sistemas baseados em retrivírus, lentivírus, vírus adeno-associados, vírus herpes e vírus vaccinia.

Noutra forma de realização preferida, a formulação de base adjuvante de proteína e a vacina baseada em ADN podem ser co-administradas em sítios adjacentes ou sobrepostos. Dependendo da natureza da formulação de vacina de ADN, isto pode ser realizado por mistura da formulação adjuvante de proteína e ADN antes da administração ou por administração simultânea do ADN e formulação adjuvante da proteína. 0 regime de tratamento será significativamente variado dependendo do tamanho e espécie do doente em causa, da quantidade de ácido nucleico de vacina e/ou composição de proteína administrada, da via de administração, da potência e dose de quaisquer compostos adjuvantes utilizados e outros factores que serão evidentes a um médico assistente especialista.

Dentro de aspectos adicionais, a presente invenção proporciona métodos para a estimulação de uma resposta imunológica num doente, de um modo preferido uma resposta de célula T num doente humano, compreendendo a administração de uma composição farmacêutica aqui descrita. 0 doente pode sofrer de cancro do pulmão ou do cólon ou cancro colorrectal ou cancro da mama, o que nesses casos os métodos proporcionam tratamento para a doença ou um doente considerado em risco para uma tal doença pode ser tratado profilaticamente.

Dentro de aspectos adicionais, a presente invenção proporciona métodos para inibição do desenvolvimento de um cancro num doente, compreendendo a administração a um doente uma composição farmacêutica como referida acima. 0 doente pode 59 sofrer de, por exemplo, sarcoma, cancro da próstata, ovário, bexiga, pulmão, cólon, colorrectal ou da mama, o que nesses casos os métodos proporcionam tratamento para a doença ou um doente considerado em risco para uma tal doença pode ser tratado profilaticamente. A presente invenção proporciona ainda, dentro de outros aspectos, métodos para remoção de células tumorais de uma amostra biológica, compreendendo a colocação em contacto de uma amostra biológica com células T que reagem especificamente com um polipéptido da presente invenção, em que o passo de colocação em contacto é realizado sob condições e durante um tempo suficiente para permitir a remoção de células expressando a proteína da amostra.

Dentro de aspectos relacionados, são proporcionados métodos para a inibição do desenvolvimento de um cancro num doente, compreendendo a administração a um doente uma amostra biológica tratada como acima descrito. São ainda proporcionados métodos, dentro doutros aspectos, para a estimulação e/ou expansão de células T específicas para um polipéptido da presente invenção, compreendendo a colocação em contacto da célula T com um ou mais de: (i) um polipéptido como acima descrito; (ii) um polinucleótido codificando esse polipéptido; e/ou (iii) uma célula apresentadora de antigénio que expressa esse polipéptido; sob condições e durante um tempo suficiente para permitir a estimulação e/ou expansão de células T. São também proporcionadas populações de células T isoladas compreendendo células T preparadas como acima descrito.

Dentro de aspectos adicionais, a presente invenção proporciona métodos para inibição do desenvolvimento de um cancro num doente, compreendendo a administração a um doente de 60 uma quantidade eficaz de uma população de células T, como acima descrito. A presente invenção proporciona ainda métodos para inibição do desenvolvimento de um cancro num doente, compreendendo os passos de: (a) incubação de células T CD4 + e/ou CD8+ isoladas de um doente com um ou mais de: (i) um polipéptido aqui divulgado; (ii) um polinucleótido codificando esse polipéptido; e (iii) uma célula apresentadora de antigénio que expressa esse polipéptido; e (b) administração ao doente de uma quantidade eficaz das células T proliferadas e, desse modo, inibindo o desenvolvimento de um cancro no doente. As células proliferadas podem, mas não necessitam, ser clonadas antes da administração ao doente.

De acordo com uma outra forma de realização desta invenção, uma composição imunogénica aqui descrita é distribuída a um hospedeiro através de células apresentadoras de antigénio (APC), tais como células dendríticas, macrófagos, células B, monócitos e outras células que podem ser manipuladas para serem APC eficientes. Esses células podem, mas não necessitam, ser modificadas geneticamente para aumentar a capacidade de apresentação do antigénio, para melhorar a activação e/ou manutenção da resposta da célula T, para terem efeitos antitumorais per se e/ou para serem imunologicamente compatíveis com o receptor (i. e., haplotipo HLA condizente). As APC podem ser geralmente isoladas a partir de qualquer uma variedade de fluidos e órgãos biológicos, incluindo tecidos tumorais e peritumorais, e podem ser células autólogas, alogénicas, singénicas ou xenogénicas.

Determinadas formas de realização preferidas da presente invenção utilizam células dendríticas ou suas progenitoras como células apresentadoras de antigénio. As células dendríticas são APC altamente potentes (Banchereau e Steinman, Nâture 392:245- 61 251, 1998) e foi demonstrado que são eficazes como um adjuvante fisiológico para induzir imunidade antitumoral profilática ou terapêutica (ver Timmerman e Levy, Ann. Rev. Med. 50:507-529, 1999). Em geral, as células dendriticas podem ser identificadas com base na sua forma típica (estreladas in situ, com processos citoplasmáticos acentuados (dendrites) visíveis in vitro), na sua capacidade para incorporar, processar e apresentar antigénios com eficiência elevada e pela sua capacidade para activar respostas de células T naive. As células dendriticas podem, naturalmente, ser concebidas para expressar ligandos ou receptores específicos de superfície celular que não são habitualmente encontrados em células dendriticas in vivo ou ex vivo, e essas células dendriticas modificadas estão contempladas na presente invenção. Como uma alternativa às células dendriticas, podem ser utilizadas células dendriticas carregadas de antigénio excretadas em vesículas (denominadas exossomas) dentro de uma vacina (ver Zitvogel et al., Nature Med. 4:594-600, 1998).

As células dendriticas e progenitoras podem ser obtidas de sangue periférico, medula óssea, células infiltrantes de tumor, células infiltrantes de tecido peritumoral, nódulos linfáticos, baço, pele, sangue de cordão umbilical ou qualquer outro tecido ou fluido adequado. Por exemplo, as células dendriticas podem ser diferenciadas ex vivo por adição de uma combinação de citocinas, tais como GM-CSF, IL-4, IL-13 e/ou TNFa a culturas de monócitos recolhidos de sangue periférico. Alternativamente, células positivas a CD34 recolhidas de sangue periférico, sangue de cordão umbilical ou medula óssea podem ser diferenciadas em célula dendriticas através da adição ao meio de cultura de combinações de GM-CSF, IL-3, TNFa, ligando CD40, LPS, ligando flt3 e/ou outro(s) composto(s) que induz(em) diferenciação, maturação e proliferação de células dendriticas. 62

As células dendríticas são convenientemente categorizadas como células "imaturas" e "maduras", o que permite uma forma simples para discriminar entre dois fenótipos bem caracterizados. Contudo, esta nomenclatura não deve ser interpretada para excluir todas as fases intermediárias possíveis de diferenciação. As células dendríticas imaturas são caracterizadas como APC com uma capacidade elevada para incorporação e processamento de antigénio, que se correlaciona com a expressão elevada do receptor Fey e o receptor de manose. 0 fenótipo maduro é caracterizado tipicamente por uma expressão mais baixa destes marcadores, mas uma expressão elevada das moléculas de superfície celular responsáveis pela activação das células T, tais como MHC de classe I e classe II, moléculas de adesão (e. g., CD54 e CD11) e moléculas coestimuladoras (e. g., CD40, CD80, CD86 e 4-1 BB) .

As APC podem geralmente ser transfectadas com um polinucleótido da invenção (ou porção ou outra variante do mesmo) de modo que o polipéptido codificado ou uma sua porção imunogénica, seja expresso na superfície celular. Essa transfecção pode ocorrer ex vivo, e uma composição farmacêutica compreendendo essas células transfectadas pode ser depois utilizada para objectivos terapêuticos, como aqui descritos. Alternativamente, um veículo de transferência génica que se direccione para uma célula dendrítica ou outra apresentadora de antigénio pode ser administrada a um doente, resultando em transfecção que ocorre in vivo. A transfecção in vivo e ex vivo de célula dendríticas, por exemplo, pode geralmente ser realizada utilizando quaisquer métodos conhecidos na técnica, tais como aqueles descritos no documento WO 97/24447 ou a abordagem da pistola de genes descrita por Mahvi et al., Immunology and cell Biology 75:456-460, 1997. O carregamento de antigénio de células dendríticas pode ser realizado por 63 incubação de células dendriticas ou células progenitoras com o polipéptido tumoral, ADN (nu ou dentro de um vector plasmidico) ou ARN; ou com bactéria recombinante expressando antigénio ou vírus (e. g., vectores de vaccinia, fowlpox, adenovírus ou lentivírus) . Antes do carregamento, o polipéptido pode ser covalentemente conjugado a um parceiro imunológico que proporciona ajuda de célula T (e. g., uma molécula de veículo). Alternativamente, uma célula dendrítica pode ser pulsada com um parceiro imunológico não conjugado, separadamente ou na presença do polipéptido.

Definições São também proporcionados pela invenção métodos para a análise de séries ou sequências de caracteres, particularmente sequências genéticas ou sequências codificadas por proteína. Os métodos preferidos de análise de sequências incluem, por exemplo, métodos de análise de homologia de sequências, tais como análise de identidade e semelhança, análise da estrutura de ADN, ARN e proteína, montagem de sequência, análise cladística, análise de motivos de sequência, determinação de grelha de leitura aberta, base calling de ácidos nucleicos, análise de utilização de codão, base trimming de ácidos nucleicos e análise de picos do cromatograma de sequenciação. É proporcionado um método computacional para realização de identificação de homologia. Este método compreende os passos de: proporcionar uma primeira sequência de polinucleótidos compreendendo a sequência de um polinucleótido da invenção num meio de leitura por computador; e comparar a referida primeira sequência de polinucleótido com, pelo menos, uma segunda sequência de polinucleótidos ou polipeptídica para identificar a 64 homologia. É também proporcionado um método computacional para a realização de identificação de homologia, compreendendo o referido método os passos de: proporcionar uma primeira sequência polipeptidica compreendendo a sequência de um polipéptido da invenção num meio de leitura por computador; e comparar a referida primeira sequência polipeptidica com, pelo menos, uma segunda sequência de polinucleótidos ou polipeptidica para identificar a homologia. A "identidade," como conhecida na técnica, é uma relação entre duas ou mais sequências polipeptídicas ou duas ou mais sequências de polinucleótidos, conforme o caso, como determinado por comparação das sequências. Na técnica, a "identidade" também significa o grau de parentesco de sequência entre sequências polipeptídicas ou de polinucleótidos, conforme o caso, como determinado pela igualdade entre séries dessas sequências. A "identidade" pode ser prontamente calculada através de métodos conhecidos, incluindo mas não limitados àqueles descritos em (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nova Iorque, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nova Iorque, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A.M., e Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; e Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. e Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nova Iorque, 1991; e Carillo, H., e Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Os métodos para determinar a identidade são concebidos para produzir a maior igualdade entre as sequências testadas. Além disso, os métodos para determinar a identidade são codificados em programas de computador publicamente disponíveis. Os métodos de programas computacionais para determinar a identidade entre duas sequências incluem, mas não estão 65 limitados, ao programa GAP no pacote de programa GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN (Altschul, S.F. et al., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990), e FASTA (Pearson e Lipman Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85; 2444-2448 (1988) . A família BLAST de programas está disponível publicamente a partir de NCBI e outras fontes (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). O bem conhecido algoritmo de Smith Waterman também pode ser utilizado para determinar a identidade.

Os parâmetros para a comparação de sequências polipeptídicas incluem os seguintes:

Algoritmo: Needleman e Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)

Matriz de comparação: BLOSSUM62 de Henikoff e Henikoff,

Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 89:10915-10919 (1992)

Penalidade de Abertura: 8

Penalidade de Comprimento de Abertura: 2

Um programa útil com estes parâmetros está publicamente disponível como o programa "gap" do Genetics Computer Group, Madison WI. Os parâmetros acima mencionados são os parâmetros por defeito para comparações peptídicas (conjuntamente sem penalizações para aberturas de extremidade).

Os parâmetros para a comparação de polinucleótidos incluem os seguintes:

Algoritmo: Needleman e Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)

Matriz de comparação: igualdades = +10, falsa igualdade = 0 Penalidade de Abertura: 50 66

Penalidade de Comprimento de Abertura: 3

Disponível como: O programa "gap" do Genetics Computer Group, Madison WI. Estes são os parâmetros por defeito para comparações de ácidos nucleicos.

Um significado preferido para a "identidade" para polinucleótidos e polipéptidos, conforme o caso, é proporcionado em (1) e (2) abaixo. (1) As formas de realização de polinucleótidos incluem ainda um polinucleótido isolado compreendendo uma sequência de polinucleótidos que tem, pelo menos, uma identidade de 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 ou 100% com qualquer das sequências de referência de SEQ ID N°: 9 a SEQ ID N°:16, em que a referida sequência de polinucleótidos pode ser idêntica a qualquer das sequências de referência de SEQ ID N°:9 a SEQ ID N°:16 ou pode incluir até um determinado número inteiro de alterações de nucleótidos comparativamente à sequência de referência, em que as referidas alterações são seleccionadas do grupo consistindo de, pelo menos, uma delecção, substituição, incluindo transição e transversão ou inserção de nucleótido, e em que as referidas alterações podem ocorrer nas posições terminais 5' ou 3' da sequência de nucleótidos de referência ou em qualquer local entre essas posições terminais, espalhadas individualmente entre os nucleótidos na sequência de referência ou em um ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência, e em que o referido número de alterações de nucleótidos é determinado por multiplicação do número total de nucleótidos em qualquer de SEQ ID N°:9 a SEQ ID N°:16 pelo número inteiro que define a percentagem de identidade divido por 100 e depois subtraindo esse produto do referido número total de nucleótidos em qualquer de SEQ ID N°:9 a SEQ ID N°:16 ou: 67 ηη ^ χη" (χη · y)< em que ηη é ο número de alterações de nucleótidos, xn é o número total de nucleótidos em qualquer de SEQ ID N°:9 a SEQ ID N°:16, y é 0,50 para 50%, 0,60 para 60%, 0,70 para 70%, 0,80 para 80%, 0,85 para 85%, 0,90 para 90%, 0,95 para 95%, 0,97 para 97% ou 1,00 para 100%, e · é o símbolo para o operador da multiplicação, e em que qualquer produto não inteiro de xn e y é arredondado para baixo, para o número inteiro mais próximo antes de subtrai-lo de xn. As alterações de sequências de polinucleótidos codificando os polipéptidos de qualquer uma de SEQ ID N°:l a SEQ ID N°:8 podem criar mutações sem sentido, de falso sentido ou desvios de grelha nesta sequência codificante e alterando, desse modo, o polipéptido codificado pelo polinucleótido que segue essas alterações. A título de exemplo, uma sequência de polinucleótidos da presente invenção pode ser idêntica a qualquer das sequências de referência de SEQ ID N°:9 a SEQ ID N°:16, isto é, pode ser 100% idêntica ou pode incluir até um determinado número inteiro de alterações de ácidos nucleicos comparativamente à sequência de referência de modo que a percentagem de identidade seja menos de 100% de identidade. Essas alterações são seleccionadas do grupo consistindo de, pelo menos, uma delecção, substituição, incluindo transição e transversão ou inserção de ácido nucleico, e em que as referidas alterações podem ocorrer nas posições terminais 5' ou 3' da sequência de polinucleótidos de referência ou em qualquer local entre essas posições terminais, espalhadas individualmente entre os ácidos nucleicos na sequência de referência ou em um ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência. O número de alterações de ácidos 68 nucleicos para uma determinada percentagem de identidade é determinado por multiplicação do número total de ácidos nucleicos em qualquer de SEQ ID N°:9 a SEQ ID N°:16 pelo número inteiro que define a percentagem de identidade divido por 100 e depois subtraindo esse produto do referido número total de ácidos nucleicos em qualquer de SEQ ID N°:9 a SEQ ID N°:16 ou: nn ^ xn “ (χη · Ϋ)< em que nn é o número de alterações de ácidos nucleicos, xn é o número total de ácidos nucleicos em qualquer de SEQ ID N°:9 a SEQ ID N°:16, y é, por exemplo, 0,70 para 70%, 0,80 para 80%, 0,85 para 85% etc., · é o símbolo para o operador da multiplicação, e em que qualquer produto não inteiro de xn e y é arredondado para baixo, para o número inteiro mais próximo antes de subtrai-lo de xn. (2) As formas de realização do polipéptido incluem ainda um polipéptido isolado compreendendo um polipéptido que tem, pelo menos, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 ou 100% de identidade com a sequência de referência de polipéptido de qualquer uma de SEQ ID N°:l a SEQ ID N°:8, em que a referida sequência polipeptídica pode ser idêntica a qualquer sequência de referência de SEQ ID N°: a SEQ ID N°:8 ou pode incluir até um determinado número inteiro de alterações de aminoácidos comparativamente à sequência de referência, em que as referidas alterações são seleccionadas do grupo consistindo de, pelo menos, uma delecção, substituição, incluindo substituição conservadora e não conservadora ou inserção de aminoácido, e em que as referidas alterações podem ocorrer nas posições terminais amino ou carboxilo da sequência polipeptídica de referência ou em qualquer local entre aquelas posições terminais, espalhadas individualmente 69 entre os aminoácidos na sequência de referência ou em um ou mais grupos contíguo dentro da sequência de referência, e em que o referido número de alterações de aminoácidos é determinado por multiplicação do número total de aminoácidos em qualquer de SEQ ID N°:l a SEQ ID N°:8 pelo número inteiro que define a percentagem de identidade divido por 100 e depois subtraindo esse produto do referido número total de aminoácidos em qualquer de SEQ ID N°:l a SEQ ID N°:8 ou: na 5 xa ‘ (xa · y)* em que na é o número de alterações de aminoácidos, xa é o número total de aminoácidos em SEQ ID N°:2, y é 0,50 para 50%, 0,60 para 60%, 0,70 para 70%, 0,80 para 80%, 0,85 para 85%, 0,90 para 90%, 0,95 para 95%, 0,97 para 97% ou 1,00 para 100%, e · é o símbolo para o operador da multiplicação, e em que qualquer produto não inteiro de xa e y é arredondado para baixo, para o número inteiro mais próximo antes de subtrai-lo de xa. A título de exemplo, uma sequência polipeptídica da presente invenção pode ser idêntica à sequência de referência de qualquer uma de SEQ ID N°:l a SEQ ID N°:8, isto é, pode ser 100% idêntica ou pode incluir até um determinado número inteiro de alterações de aminoácidos comparativamente à sequência de referência de modo que a percentagem de identidade seja menos de 100% de identidade. Essas alterações são seleccionadas do grupo consistindo de, pelo menos, uma delecção, substituição, incluindo substituição conservadora e não conservadora ou inserção de aminoácido, e em que as referidas alterações podem ocorrer nas posições terminais amino ou carboxilo da sequência polipeptídica de referência ou em qualquer local entre aquelas posições terminais, espalhadas individualmente entre 70 os aminoácidos na sequência de referência ou em um ou mais grupos contíguo dentro da sequência de referência. 0 número de alterações de aminoácidos para uma determinada % de identidade é determinado por multiplicação do número total de aminoácidos em qualquer de SEQ ID N°:l a SEQ ID N°:8 pelo número inteiro que define a percentagem de identidade divido por 100 e, depois, subtraindo esse produto do referido número total de aminoácidos em qualquer de SEQ ID N°:l a SEQ ID N°:8 ou: na ^ xa * (xa · V)· em que na é o número de alterações de aminoácidos, xa é o número total de aminoácidos em qualquer de SEQ ID N°:l a SEQ ID N°:8, y é, por exemplo, 0,70 para 70%, 0,80 para 80%, 0,85 para 85% etc., e · é o símbolo para o operador da multiplicação, e em que qualquer produto não inteiro de xa e y é arredondado para baixo, para o número inteiro mais próximo antes de subtrai-lo de xa.

Legendas das figuras

Figura 1: Informação de sequência para C-LytA. Cada repetição foi definida na base de alinhamento múltiplo de sequência e previsão da estrutura secundária utilizando os seguintes programas de alinhamento: 1) matchBox (Depiereux E et al. (1992) Comput Applic Biosci 8:501-9); 2) ClustalW (Thompson JD et al. (1994) Nucl Acid Res 22:4673-80); 3)

Block-Maker (Henikoff S et al. (1995) Gene 163:gcl7-26)

Figura 2: CPC e Construções nativas (SEQ ID N° 27-36) 71

Figura 3: Estrutura esquemática da proteína de fusão CPC-p501 His expressa em S. cerevisiae

Figura 4: Estrutura primária da proteína de fusão CPC-p501 His (SEQ ID N° 41)

Figura 5: Sequência de nucleótidos de CPC-P501

His(pRITl5201) (SEQ ID N° 42)

Figura 6: Estratégia de clonagem para a produção do plasmídeo pRIT 15201

Figura 7: Mapa do plasmídeo pRITl5201

Figura 8: Expressão comparativa de CPC P501 e P501 na estirpe DC5 de S. cerevisiae

Figura 9: Produção de CPC-p501s HIS (Y1796) em pequena escala. A Fig. 9A representa a produtividade de antigénio como estimada por SDS-PAGE com coloração de prata; A Fig. 9B representa a produtividade de antigénio como estimada por transferência de Western.

Figura 10: Esquema de purificação de CPC-P501-His produzido por Y1796.

Figura 11: Perfil da proteína purificada de CPC P501 His (géis pré-fabricados de 4-12% de poliacrilamida Novex Nu-Page).

Figura 12: Sequência de P501 S de tamanho total nativa (SEQ ID N°:17) 72

Figura 13: Sequência da cassete de expressão de CPC-p501 S de JNW735 (SEQ ID N°:18)

Figura 14: Duas Sequências P501S de codão optimizado (SEQ ID N° :19-20)

Figura 15: Sequência 19 de codão optimizado re-manipulada (SEQ ID N°:21)

Figura 16: Sequência 20 de codão optimizado re-manipulada (SEQ ID N°:22)

Figura 17: A sequência inicial para a optimização de CPC (SEQ ID N°:23)

Figura 18: Sequências de CPC de codão optimizado representativas (SEQ ID N°:24-25)

Figura 19: Sequência de CPC de codão optimizado manipulada (SEQ ID N°:26)

Figura 20: Sequências e construções de candidato de fusão de P501S CPC (SEQ ID N° 37-40 e 45-48)

Figura 21: Análise de transferência de Western de células CHO após transfecção transitória com P501 S (JNW680), CPC-p501s (JNW735) e controlo com vector vazio.

Figura 22: Respostas de anticorpo anti-P501S após imunização no dia 0, 21 e 42 com pVAC-P501S (JNW680, murganhos Bl-9) ou vector vazio (pVAC, murganhos Al-6). For recolhida uma pré-amostra de sangue no dia -1. Subsequentemente as amostras de sangue foram recolhidas no dia 28 e dia 49 (murganhos Al-3, Bl-3) e dia 56 (murganhos A4-6, B4-9). Todos os soros foram 73 testados a uma diluição de 1/100. Os resultados para os murganhos imunizados com pVAC foram utilizados para calcular a média. São mostrados os resultados para os murganhos individuais imunizados com pVAC-P501 S. Como controlo positivo são incluídos soros de murganhos imunizados com Adeno-P501 S (Corixa Corp, diluídos a 1/100).

Figura 23: Rastreio da biblioteca peptídica utilizando murganhos C57BL/6 imunizados no dia 0, 21, 42 e 70 com pVAC-P501 S (JNW680). Todos os péptidos foram utilizados a uma concentração final de 50 yg/mL. Os péptidos 1-50 estão sobrepostos em 15-20 monómeros, obtidos da Corixa. Os péptidos 51-70 são previstos com 8-9 monómeros de epitopos Kb e DB e foram encomendados à Mimotopes (Reino Unido) . As amostras 71-72 e 73-78 são controlos de DMSO e controlos sem péptido, respectivamente. O Gráfico A mostra as respostas IFN-γ enquanto que o Gráfico B mostra as respostas IL-2. Os péptidos seleccionados para utilização em ensaios imunológicos subsequentes são mostrados a preto.

Figura 24: Respostas celulares por ELISPOT no dia 77 após imunização PMID no dia 0, 21, 42, e 70 com pVAC-P501S (JNW680, B6-9) e pVAC vazio (A4-6) . Os péptidos 18, 22 e 48 foram utilizados a 50 yg/mL. A proteína CPC-p501 S foi utilizada a 20 yg/mL. O Gráfico A mostra as respostas IFN-γ enquanto que o Gráfico B mostra as respostas IL-2.

Figura 25: Comparação de P501 S e CPC-p501 S. As respostas celulares foram medidas por IL-2 ELISPOT utilizando o péptido 22 (10 yg/mL) no dia 28. Os murganhos foram imunizados por PMID no dia 0 e 21 com pVAC vazio (controlo), pVAC-P501 S (JNW680) e CPC-p501 S (JNW735). 74

Figura 26: Resposta imunológica (linfoproliferação em células de baço) após imunização de proteína com CPC-p501 S.

Figura 27: Avaliação da resposta imunológica a construções CPC-p501 S diferentes. As respostas celulares foram medidas por IL-2 ELISPOT no dia 28. Os murganhos foram imunizados por PMID no dia 0 e 21 com p7313-ie vazio (controlo), construções JNW735 e CPC-p501s (JNW770, 771 e 773)

Figura 28: Sequências de MUC-1 CPC (SEQ ID N° 49 e 50)

Figura 29: Sequências de ss-CPC-MUC-1 (SEQ ID N° 51 e 52) A invenção vai ser adicionalmente descrita com referência aos seguintes exemplos: 75 EXEMPLO I: Preparação da estirpe de Levedura reconibinante Y1796 expressando a Proteína de Fusão P501 contendo um C-LytA-P2-C-LytA (CPC) como parceiro de fusão 1. - Preparação da proteína A estrutura da proteína de fusão C-P2-C-p501 (denominada alternativamente CPC-p501) para ser expressa em S. cerevisiae é representada na figura 3. Esta fusão contém a região do C-terminal do gene LytA (resíduos 187 a 306), na qual foi introduzido o fragmento P2 da toxina do tétano (resíduos 830-843) . 0 fragmento P2 é colocado entre os resíduos 277 e 278 de C-Lyt-A. 0 fragmento de C-lytA contendo a inserção P2 é seguida por P501 (resíduos de aminoácidos 51 a 553) e pela extremidade His. A estrutura primária da proteína de fusão resultante tem a sequência descrita na figura 4 e a sequência codificante correspondente à concepção de proteína acima está na figura 5. 2. - Estratégia de clonagem para a produção de um plasmídeo de levedura expressando a proteína de fusão CPC-p501 (51-553)-His 0 material inicial é o vector de levedura pRIT15068 (pedido de Patente UK 0015619.0).

Este vector contém o promotor de levedura Cupl, a sequência codificante do sinal alfa prépro de levedura e a sequência codificante correspondente aos resíduos 55 a 553 de P501S seguida pela extremidade His. A estratégia de clonagem delineada na figura 6 inclui os seguintes passos: 76 a) 0 primeiro passo é a inserção da sequência P2 (de codão optimizado para a expressão em levedura) em grelha, dentro da sequência codificante de C-lytA. A sequência codificante de C-lytA é contida pelo plasmideo pRIT 14662 (documento PCT/EP99/00660) . A inserção é realizada utilizando um adaptador formado por dois oligonucleótidos complementares denominados P21 e P22 para dentro do plasmideo pRIT 14662 previamente aberto por Ncol. A sequência de P21 e P22 é: P21 5' catgcaatacatcaaggctaactctaagttcattggtatcactga aggcgt 3' P22 3' gttatgtagttccgattgagattcaagtaaccatagtgacttccg cagtac 5'

Após ligação e transformação de E. coli e caracterização de transformante, é obtido o plasmideo denominado pRIT15199. b) 0 segundo passo é a preparação do fragmento de ADN C-lytA-P2-C-lytA por amplificação de PCR. A amplificação é realizada utilizando pRIT15199 como molde e os oligonucleótidos denominados C-LytANOTATG e C-LytA-aa55. Sendo a sequência de ambos os oligonucleótidos:

C-LytANOTATG = 5' aaaaccatggcggccgcttacgtacattccgacggctcttatccaaaa gacaag 3' 77 C-LytA-aa55 = 5' aaacatgtacatgaacttttctggcctgtctgccagtgttc 3' 0 fragmento amplificado é tratado com as enzimas de restrição Ncol e AflIII para produzir as extremidades coesivas respectivas. c) 0 passo seguinte é a ligação do fragmento acima com o vector pRIT15068 (o maior fragmento obtido após tratamento com Ncol) para produzir a sequência codificante completa da proteína de fusão. Após ligação e transformação de E. coli, é obtido o plasmídeo denominado pRITl5200. Neste plasmídeo, o sítio único Ncol restante contém o codificador ATG para o codão de iniciação. d) No passo seguinte, o fragmento Ncol contendo o promotor CUPl e uma porção de sequências plasmídicas 2 μ é preparado a partir do plasmídeo PRIT 15202. 0 plasmídeo pRIT 15202 é um derivado 2 μ de levedura contendo o promotor CUPl com um sítio Ncol em ATG (sequência de ATG: AAACC ATG) e) O fragmento Ncol isolado a partir de pRIT 15202 é ligado a pRIT15200, previamente aberto com Ncol, na orientação certa, de tal modo que o promotor pCUPl está no lado 5' da sequência codificante. Isto resulta na produção de um plasmídeo de expressão final denominado pRIT15201 (ver figura 7). 78 3. - Preparação da estirpe Y1796 de levedura recombinante (RIX4440) 0 plasmídeo pRIT 15201 é utilizado para transformar a estirpe DC5 de S. cerevisiae (ATCC 20820) . Após selecção e caracterização dos transformantes de levedura contendo o plasmideo pRIT 15201, é obtida uma estirpe de levedura recombinante denominada Y1796 expressando a proteína de fusão CPC-P501-His. A proteína, após redução e carboxiamidação, é isolada e purificada através de cromatografia de afinidade (IMAC) seguida por cromatografia de permuta aniónica (Q Sepharose FF).

Exemplo II

De um modo análogo, as construções de proteína como descritas na figura 2 podem ser expressas utilizando as sequências de ADN correspondentes aí mostradas. Em particular, a estirpe SC333 de levedura (construção 2) corresponde à estirpe Y17 96 mas expressando P5OI55-553 desprovido do parceiro de fusão CPC. A estirpe Y1800 de levedura (construção 3) corresponde à estirpe Y1796 mas compreende adicionalmente o sinal de sequência nativo para P501S (aal-aa34), enquanto a estirpe Y1802 de levedura (construção 4) compreende a sequência de pré-sinal alfa a montante da sequência CPC-p501S. A estirpe Y1790 de levedura (construção 5) está a expressar uma construção de P501S desprovida de CPC e tendo a sequência do sinal pré-pro alfa. 79

Exemplo III. Preparação de CPC-P501 purificado 1. - Produção de CPC-P501S HIS (Y1796) em pequena escala

Para Y1796, em meio mínimo suplementado com histidina, a expressão é induzida na fase logarítmica por adição de CuS04 que varia de 100 a 500 μΜ, e a cultura é mantida a 30°. As células são recolhidas após 8 ou 24 h de indução. O cobre é adicionado imediatamente antes da utilização e previamente não misturado com o meio.

Para a análise de SDS-PAGE, a extracção das células de levedura é realizada em tampão fosfato de citrato pH 4,0 + 130 mM de NaCl. A extracção é realizada com esferas de vidro para uma pequena quantidade de células e com a prensa Francesa para uma quantidade mais elevada de células, e depois misturada com tampão de amostra e analisada por SDS-PAGE. Os resultados de análise comparativa em SDS-PAGE das diferentes construções são representados na figura 8 e resumidos na Tabela 2 abaixo. Como mostrado na Tabela 1 abaixo, o nível de expressão da cultura é muito maior para a estirpe Y1796 comparativamente ao nível de expressão da estirpe SC333 progenitora, uma estirpe que expressa o P501S-His correspondente desprovido do parceiro CPC. Do mesmo modo, a presença de uma sequência de sinal (alfa pré) não afecta os resultados discutidos acima: o nível de expressão da cultura é muito maior para a estirpe Y1802 comparativamente ao nível de expressão da correspondente estirpe Y1790, uma estirpe que expressa o P501S-His correspondente desprovido do parceiro CPC. 80

Tabela 2

Estirpe Recombi- nante Plasmídeo Promotor Sequência de sinal Parceiro de Fusão Sequências P501 aa Nível de expressão SC333 Ma333 CUP1 - - 55-553-His - ND Y1796 pRIT 15201 CUP 1 - CPC 51-553-His +++ Y1802 pRIT 15219 CUP 1 a pré CPC 51-553-His ++++ Y1790 pRIT 15068 CUP 1 o; prépro - 55-553-His + CPC = clyta P2 clyta Nd = não detectável, mesmo em transferência de Western + = detectável em transferência de Western +++/++++ = detectável em transferência de Western e visível em géis corados com prata 2. - Fermentação de Y1796 (RIX4440) em grande escala São espalhados 100 yL do inoculo de trabalho em meio sólido e cultivados durante aproximadamente 24 ha 30 °C. Esta pré-cultura sólida é, depois, utilizada para inocular uma pré-cultura liquida em balões de agitação.

Esta pré-cultura liquida é cultivada durante 20 h, a 30 °C e transferida para um fermentador de 20 L. A fermentação em batch inclui uma fase de crescimento de cerca de 44 h e uma fase de indução de cerca de 22 h. A fonte de carbono (glucose) foi suplementada à cultura por alimentação continua. A concentração residual de glucose foi mantida muito baixo (^50 mg/L) de modo a minimizar a produção de etanol por fermentação. Isto foi realizado limitando o desenvolvimento do microrganismo através de taxa de alimentação de glucose limitada. No final da fase de crescimento, o promotor 81 CUP1 é induzido por adição de CuS04 de modo a produzir o antigénio. A ausência de contaminações foi verificada por inoculação de 106 células em frasquinhos convencionais de TSB e THI suplementados com nistatina e incubados durante 14 dias a 20-25 °C e 30-35 °C, respectivamente. Não foi observado crescimento como esperado. 3. - Caracterização de antigénio e produtividade

Os homogenatos celulares foram preparados utilizando a prensa Francesa em amostras de fermentação recolhidas em tempos diferentes durante a fase de indução e analisadas por SDS-PAGE e Transferência de Western. Foi mostrado que a maior parte da proteína de interesse estava localizada na fracção insolúvel obtida do homogenato celular após centrifugação. As análises de SDS-PAGE e de Transferência de Western mostradas nas Figuras abaixo foram realizadas nos sedimentos obtidos após centrifugação destes homogenatos celulares.

As figuras 8A e B mostram uma cinética de produção de antigénio durante a fase de indução para a cultura PR0127. Parece que não ocorreu expressão do antigénio durante a fase de crescimento. A produtividade específica do antigénio parece aumentar a partir do início da fase de indução até 6 h e depois permaneceu completamente estável até ao final. Mas a produtividade volumétrica aumentou por um factor de 1,5 a 2 devido à acumulação de biomassa observada durante o mesmo período de tempo. A produtividade de antigénio foi estimada em cerca de 500 mg por litro de meio de fermentação por comparação da referência purificada de antigénio e extractos brutos em SDS-PAGE com coloração de prata (figura 9A) e análises de WB 82 utilizando um anticorpo anti-P501 S (um ascitico de murino dirigido contra P501S aa439-aa459 utilizado numa diluição de 1/1000) (figura 9B).

Exemplo IV. Purificação da proteína de fusão CPC-P501 (51-553)-His produzida por Y1796

Após ruptura das células, a proteína é associada com a fracção do sedimento. Foi introduzida uma carbamido-metilação da molécula no processo, de modo a lidar com a agregação oxidativa da molécula com ele própria ou com contaminantes proteicos da célula hospedeira através de ligação covalente com pontes dissulfureto. A utilização de detergentes foi também requerida para controlar o carácter hidrofóbico desta proteína (previstos 12 domínios transmembranares). 0 protocolo de purificação, desenvolvido para a escala de 1 L de cultura com OD (densidade óptica) de 120, é descrito na figura 10. Todas as operações são realizadas à temperatura ambiente (t.a.) .

De acordo com o ensaio de proteína DOC TCA BCA, o rendimento global da purificação é 30 - 70 mg de antigénio purificado/L de cultura a OD 120. O rendimento é ligado ao nível de expressão da cultura e é maior comparativamente ao rendimento de purificação da estirpe progenitora expressando P501 S-His não fundida. O ensaio de proteína é realizado como se segue: as proteínas são primeiro precipitadas utilizando TCA (ácido tricloroacético) na presença de DOC (desoxicolato) depois dissolvidas num meio alcalino na presença de SDS. As proteínas reagem depois com BCA (ácido bicinconínico) (Pierce) para formar um complexo roxo solúvel que apresenta uma absorvência elevada a 562 nm, que é proporcional à quantidade de proteínas presente na amostra. A 83 análise de SDS-PAGE de 3 quantidades purificadas (figura 11) não mostra diferença entre condições redutoras e não redutoras (ver pistas 2, 3 e 4 versus pistas 5, 6 e 7) . 0 perfil consiste de uma principal banda de 70 kDa, um arrastamento de elevado peso molecular e ligeiras bandas de degradação. Todas as bandas são detectadas por um anticorpo monoclonal anti P501 S especifico.

Exemplo V. Preparação de vacina utilizando a proteína CPC-P501S His A proteína do Exemplo 3 ou 4 pode ser formulada numa vacina contendo QS21 e 3D-MPL numa emulsão de óleo em água. 1. - Preparação da Vacina: O antigénio é produzido como mostrado no Exemplo 1 a 3, um C-LytA-P2-P501 S His. Como um adjuvante, a formulação compreende uma mistura de monofosforil-lípido A 3-O-acilado (3D-MPL) e QS21 numa emulsão de óleo/água. O sistema adjuvante SBAS2 foi previamente descrito no documento WO 95/17210. 3D-MPL: é um imunoestimulante derivado do lipopolissacárido (LPS) da bactéria Gram-negativa Salmonella minnesota. O MPL foi desacilado e carece de um grupo fosfato na unidade de lípido A. Este tratamento químico reduz dramaticamente a toxicidade enquanto preserva as propriedades imunoestimulantes (Ribi, 1986). A Ribi Immunochemistry produz e fornece MPL à SB-Biologicals. Experiências realizadas na Smith Kline Beecham Biologicals mostraram que 3D-MPL combinado com vários veículos intensifica fortemente a imunidade celular humoral e de tipo TH1. 84 QS21: é uma molécula natural de saponina extraída da casca da árvore Sul Americana, Quillaja saponaria Molina. Uma técnica de purificação desenvolvida para separar as saponinas individuais dos extractos brutos da casca, permitiram o isolamento da saponina particular, QS21, que é um glicósido de triterpeno demonstrando uma forte actividade adjuvante e uma toxicidade mais baixa comparativamente ao componente progenitor. Foi demonstrado que QS21 activa os CTL restritos da classe I de MHC até diversas subunidades de Ags, assim como estimula a proliferação linfocítica específica de AG (Kensil, 1992). A Aquila (anteriormente Cambridge Biotech Corporation) produz e fornece QS21 à SB-Biologicals. As experiências realizadas na SmithKline Beecham Biologicals demonstraram um claro efeito sinergístico de combinações de MPL e QS21 na indução de respostas imunológicas celulares humorais e de tipo TH1. A emulsão de óleo/água é composta de uma fase orgânica feita de 2 óleos (um tocoferol e esqualeno), e uma fase aquosa de PBS contendo Tween 80 como emulsionante. A emulsão é compreendida de 5% de esqualeno, 5% de tocoferol e 0,4% de Tween 80 e tem um tamanho médio de partícula de 180 nm e é conhecida como SB62 (ver documento WO 95/17210) . As experiências realizadas na SmithKline Beecham Biologicals provaram que a adição desta emulsão de óleo/água a 3D-MPL/QS21 (SBAS2) aumenta adicionalmente as propriedades imunoestimulantes dos últimos contra vários antigénios de subunidade. 85 2. - Preparação da emulsão SB62 (concentrada 2 vezes): 0 tween 80 é dissolvido em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) para produzir uma solução de 2% em PBS. Para proporcionar 100 mL de emulsão concentrada duas vezes, são misturados exaustivamente por vórtice 5 g de alfa DL tocoferol e 5 mL de esqualeno. São adicionados 90 mL de solução de PBS/Tween e misturados exaustivamente. A emulsão resultante é depois passada através de uma seringa e finalmente microfluidisada utilizando um aparelho M110S microfluidics. As gotas de óleo resultantes têm um tamanho de aproximadamente 180 nm. 3. - Formulações:

Uma formulação típica contendo 3D-MPL e QS21 numa emulsão de óleo/água é realizada como se segue: 20 pg - 25 pg de C-LytA P2-p501S são diluídos em PBS pH 6,8 10 vezes concentrado e H20 antes da adição consecutiva de SB62 (50 pL), MPL (20 pg), QS21 (20 pg), opcionalmente compreendendo oligonucleótido CpG (100 pg) e 1 pg/mL de tiomersal como conservante. A quantidade de cada componente pode variar como necessário. Todas as incubações são realizadas à temperatura ambiente com agitação.

Exemplo VI. Sequências P501S de codão optimizado 1. - Preparação dos plasmídeos recombinantes de controlo: A sequência de tamanho total de P501S foi clonada em pVAC (Thomsen, Immunology, 1998; 95:510P105), produzindo o plasmídeo de expressão JNW680. A SEQ ID N°:17 representa a cassete de expressão humana de P501S no plasmídeo JNW680 e é ilustrada na 86

Figura 12. A sequência de proteína de SEQ ID N°:17 é mostrado em formato de letra única, sendo os codões de iniciação e terminação mostrados a cheio. A sequência de Kozak é denotada pelos símbolos cardinal. 0 índice de utilização de codão da sequência humana de P501 S (SEQ ID N°:17) é 0,618, como calculado pelo programa SynGene.

Programa SynGene

Basicamente, os codões são atribuídos utilizando um método estatístico para produzir um gene sintético possuindo uma frequência de codão mais próxima daquela encontrada naturalmente em genes altamente expressos de E.coli e humanos. 0 SynGene é uma versão actualizada do programa de Visual Basic denominado Calcgene, escrito por R. S. Hale e G Thompson (Protein Expression and Purification Vol. 12 pp.185-188 (1998). Para cada resíduo de aminoácido na sequência original, foi atribuído um codão baseado na probabilidade dele aparecer em genes altamente expressos de E. coli. Os detalhes do programa Calcgene, que opera sob Microsoft Windows 3.1, podem ser obtidos a partir dos autores. Porque o programa aplica um método estatístico para atribuir codões ao gene sintético, nem todos os codões resultantes são os mais frequentemente utilizados no organismo alvo. Mais exactamente, a proporção de codões frequentemente e infrequentemente utilizados do organismo alvo é reflectida na sequência sintética através da atribuição de codões nas proporções correctas. Contudo, como não existe uma regra firme para atribuir um codão particular a uma posição particular na sequência, cada vez que é o programa é executado irá produzir um gene sintético diferente - embora cada um tenha o mesmo perfil de utilização de codão e cada um codifique a mesma sequência de aminoácidos. Se o programa for executado 87 diversas vezes para uma dada sequência de aminoácidos e um dado organismo alvo, serão produzidas diversas sequências de nucleótidos diferentes que podem diferir no número, tipo e posição dos sítios de restrição, sinais de splice de intrão, etc., algumas das quais pode ser indesejáveis. 0 especialista será capaz de seleccionar uma sequência apropriada para utilização na expressão do polipéptido na base destas características.

Além disso, uma vez que os codões são aleatoriamente atribuídos numa base estatística, é possível (embora talvez improvável) que dois ou mais codões que são relativamente raras vezes utilizados no organismo alvo podem ser aglomerados em intima proximidade. Acredita-se que esses aglomerados possam perturbar a maquinaria de tradução e resultar em taxas de expressão particularmente baixas, assim o algoritmo para a escolha dos codões no gene optimizado exclui quaisquer codões com um valor de RSCU menor que 0,2 para genes altamente expressos, de modo a prevenir quaisquer aglomerados de codões raros que sejam fortuitamente seleccionados. A distribuição dos codões restantes é depois alocada de acordo com as frequências para E. coli altamente expressos, para produzir uma distribuição global dentro do gene sintético que é típica desses genes (coeficiente = 0,85) e também para genes humanos altamente expressos (coeficiente = 0,50). Syngene (Peter Ertl, não publicado), uma versão actualizada do programa Calcgene, permite que a exclusão de codões raros seja opcional, e é também utilizado para alocar codões de acordo com o perfil de frequência de codão de genes humanos altamente expressos. A sequência da cassete CPC-p501 S clonada a partir do vector pRIT15201 (ver Figura 7) em pVAC, produzindo assim o plasmídeo JNW735, é apresentada em SEQ ID N°:18 e é ilustrada na

Figura 13. Esta sequência é idêntica à sequência pRITl5201 à excepção da remoção do marcador His e a adição de uma sequência de Kozak (GCCACC) e sítios de enzimas de restrição apropriados. A sequência de aminoácidos de SEQ ID N°:18 é mostrada no formato de letra única, sendo os codões de iniciação e terminação mostrados a cheio. Os resíduos em caixas de texto são o epitopo auxiliar P2 do toxóide do tétano. Os resíduos sublinhados são o marcador de purificação Clyta. A sequência de Kozak é denotada através dos símbolos de cardinal. 2. - Produção dos plasmídeos recombinantes com sequências P501S de codão optimizado:

Embora o índice do coeficiente de codão (Cl) da sequência nativa de P501S seja já alta (0,618), é possível aumentar o valor de Cl ainda mais. Isto terá dois benefícios potenciais -melhorar a expressão e/ou imunogenicidade do antigénio e reduzir a possibilidade de recombinação entre o vector de P501 S e sequências genómicas.

Utilizando o programa Syngene, foi obtida uma selecção (SEQ ID N°:19 a SEQ ID N°:20) de sequências de codão optimizado (Figura 14) . A Tabela 3 abaixo mostra uma comparação do índice do coeficiente de codão para a sequência inicial de P501 S e duas sequências de codão optimizado representativas, seleccionadas na base de um perfil adequado de sítio de enzima de restrição e de um bom índice de Cl.

Tabela 3 - Comparação dos índices do coeficiente de codão de dois genes P501 S de codão optimizado

Sequência índice do coeficiente de codão (Cl) 89 P501 S 0, 618 SEQ ID N°:19 0,725 SEQ ID N°:20 0,755 3. Avaliação adicional das sequências de codão optimizado

Sequência SEQ ID N°:19

Embora a SEQ ID N°: 19 tenha um bom índice de Cl (0,725), esta contém um dupleto de codões raros na posição 202 e 203 de aminoácidos. Estes codões foram substituídos manualmente com codões mais frequentes através de alteração da sequência de ADN de TTGTTG para CTGCTG. Para facilitar a clonagem e expressão, foram adicionados sítios de enzima de restrição e uma sequência de Kozak. A sequência manipulada final (SEQ ID N°:21) é mostrada na Figura 15. 0 programa Syngene foi utilizado para fragmentar esta sequência em oligonucleótidos com uma sobreposição mínima de 19-20 bases. Deste modo, a Figura 15 mostra a SEQ ID N° 19 de P501S de codão optimizado remanipulada. Os sítios de enzima de restrição estão sublinhados, a sequência de Kozak está a cheio, a sequência de ADN remanipulada para remover um dupleto de codões raros está numa caixa de texto.

Utilizando um protocolo de PCR de dois passos, os iniciadores com sobreposição, produzidos pelo programa Syngene foram primeiro montados utilizando um protocolo de Montagem por PCR (detalhado abaixo). A reacção de montagem produz uma população variada de fragmentos. O fragmento de tamanho total correcto foi recuperado/amplificado utilizando o protocolo de recuperação por PCR e os iniciadores terminais. O fragmento de PCR resultante foi excisado de um gel de agarose, purificado, digerido com Nhel e Xhol e clonado em pVAC. Os clones positivos 90 foram identificados através de análise de enzima de restrição e confirmados através de sequenciação de cadeia dupla. Isto produz o plasmideo JNW766 que, devido à natureza propensa a erros do processo de PCR, continha uma única mutação silenciosa (C para T na posição 360 da SEQ ID N°: 21). 1. Reacção de montagem - condições de PCR, protocolo genérico

Mistura de reacção (volume total = 50 pL):

Tampão de reacção lx (Pfx ou Proofstart) 1 pL de agrupamento de Oligos (mistura igual de todos os oligos de sobreposição) 0,5 mM de dNTPs ADN polimerase (Pfx ou Proofstart, 2,5-5 U) +/- 1 mM de MgS04 +/- Solução intensificadora lx (intensificador de Pfx ou tampão Q de Proofstart)

1. 94 °C durante 120 s (apenas Proofstart) 2. 94 °C durante 30 s 3. 40 °C durante 120 s 4. 72 °C durante 10 s 5. 94 °C durante 15 s 6. 40 °C durante 30 s 7. 72 °C durante 20 s + 3 s/ciclo 8. Ciclo até passo 5, 25 vezes 9. Manter a 4 °C 2. Reacção de recuperação - condições de PCR (protocolo genérico) 91

Mistura de reacção (volume total = 50 pL):

Tampão de reacção lx (Pfx ou Proofstart) 5-10 pL de mistura de reacção de montagem 0,3-0,75 mM de dNTPs 50 pmol de iniciador (iniciador do terminal 5' , orientação de sentido) 50 pmol de iniciador (iniciador do terminal 3', orientação anti-sentido) ADN polimerase (Pfx ou Proofstart, 2,5-5 U) +/- 1 mM de MgS04 +/- Solução intensificadora lx (intensificador de Pfx ou tampão Q de Proofstart) 1. 94 °C 120 s (apenas Proofstart) 2. 94 °C 45 s 3. 60 °C 30 s 4. 72 °C 120 s 5. Ciclo até passo 2, 25 vezes 6. 72 °C 240 s

7. Manter a 4 °C

Sequência SEQ ID N°:20

Embora a SEQ ID N°: 20 tenha um muito bom índice de Cl (0,755), verificou-se que continha um dupleto de codões raros na posição 131 e 132 de aminoácidos. Estes codões foram substituídos manualmente com codões mais frequentes por alteração da sequência de ADN de TTGTTG para CTGCTG. Para facilitar a clonagem, foi removido um sítio BamHI interno através de mutação de G para C (ver o nucleótido duplamente sublinhado na Figura 16). Para facilitar a clonagem e expressão, 92 foram adicionados sítios de enzima de restrição e uma sequência de Kozak. A sequência manipulada final (SEQ ID N°:22) é mostrada na Figura 16. 0 programa Syngene foi utilizado para fragmentar esta sequência em oligonucleótidos com uma sobreposição mínima de 19-20 bases. A Figura 16 mostra assim a sequência 20 de P501S de codão optimizado remanipulada (SEQ ID N°:22). Os sítios de enzima de restrição estão sublinhados, a sequência de Kozak está a cheio, a sequência de ADN remanipulada para remover um dupleto de codões raros está numa caixa de texto e uma mutação pontual silenciosa para remover um sítio BamHI está duplamente sublinhada.

Utilizando um protocolo de PCR de dois passos semelhante ao descrito acima, foi amplificado um fragmento de tamanho total de P501S e clonado em pVAC. Os clones positivos foram identificados através de análise de enzima de restrição e confirmados através de sequenciação de cadeia dupla. Isto produziu o plasmídeo JNW764. A sequência da cassete codificante de P501S é mostrada na Figura 16 (SEQ ID N°: 22).

Semelhança da sequência de ADN

As distâncias do par após alinhamento pelo método ClustalV (ponderado) são mostradas na Tabela 3 abaixo. A Tabela 4 abaixo mostra percentagem de semelhança entre a sequência humana de P501S inicial e as duas sequências de codão optimizado SEQ ID N°:21 e 22 seleccionadas para investigação adicional. Os dados confirmam que as sequências de ADN de codão optimizado são aproximadamente 80% semelhantes à sequência original de P501 S.

Tabela 4 93 SEQ ID N°: % de semelhança com a sequência inicial de P501S 21 79,6 22 79,4

Exemplo VII. Sequências de CPC de codão optimizado 1. - Abordagem

Uma vez que a sequência original de CPC foi concebida originalmente para expressão óptima em levedura, esta secção descreve o processo de optimização de codão para expressão humana. 2. - Preparação de sequência A sequência inicial para a optimização de CPC é mostrada na Figura 17 (SEQ ID N°: 23). Isto é inteiramente derivado do pRITl5201 e contém a sequência codificante inteira de CPC mais quatro aminoácidos de P501S para facilitar a clonagem a jusante. Utilizando o programa Syngene, foi obtida uma selecção de sequências de codão optimizado, das quais são mostradas sequências representativas na Figura 18 (SEQ ID N°: 24-25). A Tabela 5 abaixo mostra uma comparação do índice do coeficiente de codão para a sequência de CPC inicial e as duas sequências de codão optimizado representativas.

Tabela 5. índices do coeficiente de codão para duas sequências optimizados de CPC 94

Sequência índice do coeficiente de codão (Cl) CPC Original = SEQ ID N°:23 0,506 SEQ ID N°:24 0,809 SEQ ID N°:25 0, 800

Além da optimização de codão, todas as sequências foram também rastreadas para sítios de clonagem de enzima de restrição. Com base no valor mais elevado de Cl e num perfil favorável de sítio da enzima de restrição, a SEQ ID N°: 24 foi seleccionada para construção. Para facilitar a clonagem e expressão, foram adicionados sítios de clonagem 5' e 3' e foi introduzida uma sequência de Kozak (GCCACC) a 5' do codão de iniciação ATG. Esta sequência manipulada é mostrada na Figura 19 (SEQ ID N°:26). Esta sequência inclui quatro aminoácidos de P501 S (numa caixa de texto), sítios de clonagem de enzima de restrição (Nhel e Xhol, sublinhados), uma sequência de Kozak (a cheio) , um codão de terminação (em itálico) e 4 pb de ADN irrelevante flanqueador para facilitar a clonagem. 0 programa Syngene foi utilizado para fragmentar esta sequência em oligonucleótidos de 50-60 monómeros com uma sobreposição mínima de 18-20 bases. Utilizando um protocolo de PCR de dois passos semelhante ao acima descrito, o fragmento correcto foi recuperado/amplificado e clonado em pVAC. Os clones positivos foram identificados através de análise de enzima de restrição e a sequência verificada produzindo o vector JNW759.

4. - Semelhança de ADN 95

As distâncias do par após alinhamento pelo método ClustalV (ponderado) são mostradas na Tabela 6 abaixo. A Tabela mostra percentagem de semelhança ao nivel de ADN entre a sequência inicial de CPC e a sequência de codão optimizado e confirma que as sequências de codão optimizado são aproximadamente 80% semelhantes à sequência original de CPC.

Tabela 6

Exemplo VIII. Construção do candidato de fusão de P501S

Todos os candidatos mostrados no diagrama esquemático abaixo são de codão optimizado e construídos utilizando metodologias de PCR de sobreposição a partir dos plasmídeos JNW764 e JNW759 como moldes (SEQ ID N°: 22 e SEQ ID N°: 26, respectivamente) , e clonados no vector de expressão p7313 ie.

Os quatro candidatos mostrados esquematicamente abaixo são baseados em CPC-p501S. 0 CPC-p501S de codão optimizado é a construção A. Os candidatos B, C, D também incluem a sequência codificando os 50 aminoácidos do N-terminal de P501S, posicionada no N-terminal de CPC-P501S (construção D), C-terminal de CPC-P501S (construção C) ou entre CPC e P501S (construção B) . Uma representação esquemática das construções é apresentada na Figura 20. A sequência de nucleótidos e de 96 proteína para cada uma das quatro construções é mostrada em SEQ ID N°: 37-40 para as sequências de nucleótidos, e SEQ ID N° 45-48 para as sequências polipeptídicas correspondentes. Nas construções A, C e D, o codão sublinhado codifica, de um modo preferido, tirosina (quer TAC ou TAT) mas a sequência de nucleótidos pode ser alterada para codificar treonina (quer ACA, ACC, ACG ou ACT) . Na construção B, o codão sublinhado codifica, de um modo preferido, treonina (quer ACA, ACC, ACG ou ACT) , mas a sequência de nucleótidos pode ser alterada para codificar tirosina (quer TAC ou TAT). Em todas as construções, a sequência codificante é flanqueada por sítios de clonagem de enzima de restrição apropriados (nestes caso, Notl e BamHI), e uma sequência de Kozak imediatamente a montante do ATG de iniciação. A Tabela 7 abaixo mostra a identificação do plasmídeo para as construções detalhadas acima:

Tabela 7

Construção Aminoácido no codão sublinhado Sequência de codão ID do Plasmídeo A Tirosina TAC JNW771 B Treonina ACA JNW773 B Tirosina TAC JNW770 C Tirosina TAC JNW777 D Tirosina TAC JNW769

As respostas celulares depois da imunização com p7313-ie (vector vazio), pVAC-P501 S (JNW735), JNW770, JNW771 e JNW773 foram avaliadas através de ELISPOT após uma imunização primária por PMID no dia 0 e três reforços no dia 21, 42 e 70. Os ensaios foram realizados 7 dias após o reforço. A Figura 27 mostra que 97 foram detectadas boas respostas de IL-2 ELISPOT em murganhos imunizados com JNW770, JNW771 e JNW773.

Exemplo IX. Experiências de imunogenicidade utilizando estudos de distribuição intradérmica mediada por partícula (PMID) 0 P501 S de tamanho total, quando distribuído através de distribuição intradérmica mediada por partícula (PMID), produz boas respostas de anticorpo e celulares. Estes dados demonstram que a PMID é uma via muito eficaz de distribuição. Além disso, a comparação de P501 S e CPC-p501 S confirma que CPC-P501S induz uma resposta imunológica mais forte, como determinado por ELISPOT de péptido. 1. - Materiais e Métodos 1.1. Imunização cutânea por pistola de genes 0 ADN plasmídico foi precipitado sobre esferas de ouro de 2 ym de diâmetro utilizando cloreto de cálcio e espermidina. As esferas carregadas foram revestidas em tubagem Tefzel como descrito (Eisenbraum et al, 1993; Pertmer et al, 1996). 0 bombardeamento de partículas foi realizado utilizando o sistema da transferência génica da Accell (documento PCT WO 95/19799) . Para cada plasmídeo, foram imunizados murganhos C57BU6 fêmea nos dias 0, 21, 42 e 70. Cada administração consistiu em dois bombardeamentos com ADN/ouro, proporcionando uma dose total de aproximadamente 4-5 yg de plasmídeo.

1.2. Ensaios ELISPOT para respostas de célula T ao produto do gene de P501S 98 a) Preparação de esplenócitos

Os baços foram obtidos a partir de animais imunizados aos dias 7-14 após o reforço. Os baços foram processados através de moagem entre lâminas de vidro para produzir uma suspensão celular. Os glóbulos vermelhos foram lisados através de tratamento com cloreto de amónio e os restos foram removidos para deixar uma suspensão fina de esplenócitos. As células foram ressuspensas a uma concentração de 8xl08/mL em meio RPMI completo para utilização em ensaios ELISPOT. b) Rastreio da biblioteca de péptidos

Uma biblioteca de péptidos cobrindo a maior parte da sequência de P501 S foi obtida da Corixa Corp. A biblioteca continha cinquenta péptidos de 15-20 monómeros sobrepondo em 4-11 péptidos de aminoácidos. Os péptidos são numerados 1-50. Além disso, foi utilizado um programa de previsão (H-G. Rammensee, et al.: Immunogenetics, 1999, 50: 213-219) (http://syfpeithi.bmi-heidelberg.com/) para prever epitopos putativos de Kb e Db a partir da sequência de P501 S. Os dez melhores epitopos para Kb e Db foram encomendados à Mimotopes (Reino Unido) e incluídos na biblioteca (péptidos 51-70) . Para rastreio da biblioteca de péptidos, os péptidos foram utilizados numa concentração final de 50 pg/mL (aprox. 25-50 pM) em IFNy e IL-2 ELISPOTS utilizando o protocolo descrito abaixo. Para IFNy ELISPOTS, foi adicionado IL-2 aos ensaios a 10 ng/mL. Os esplenócitos utilizados para o rastreio foram recolhidos ao dia 84 de murganhos C57BU6 imunizados no dia 0, 21, 42 e 70. Foram identificados três péptidos a partir do rastreio da biblioteca -Péptidos 18 (HCRQAYSVYAFMISLGGCLG), 22 (GLSAPSLSPHCCPCRARLAF) e 99

48 (VCLAAGITYVPPLLLEVGV). Estes péptidos foram subsequentemente utilizados nos ensaios ELISPOT

c) Ensaio ELISPOT

As placas foram revestidas com 15 yg/mL (em PBS) de IFNy de rato anti-murganho ou IL-2 de rato anti-murganho (Pharmingen). As placas foram revestidas de um dia para o outro a +4 °C. Antes da utilização, as placas foram lavadas três vezes com PBS. Os esplenócitos foram adicionados às placas a 4xl05 células/poço. Os péptidos identificados no rastreio da biblioteca foram novamente encomendados à Genemed Synthesis e utilizados a uma concentração final de 50 yg/mL. A proteína CPC-P501S (GSKBio) foi utilizada no ensaio a 20 yg/mL. Os ensaios ELISPOT foram realizados na presença de IL-2 (10 ng/mL), IL-7 (10 ng/mL) ou nenhuma citocina. 0 volume total em cada poço foi 200 yL. As placas contendo células estimuladas por péptido foram incubadas durante 16 horas numa incubadora a 37 °C humidificada. e) Revelação de placas de ensaio ELISPOT.

As células foram removidas das placas por lavagem uma vez com água (com saturação de 10 minutos para assegurar lise das células) e três vezes com PBS. Foram adicionados IFNg ou IL-2 de rato anti-murganho conjugados com biotina (Phamingen) a 1 yg/mL em PBS. As placas foram incubadas com agitação durante 2 horas à temperatura ambiente. As placas foram depois lavadas três vezes com PBS antes da adição de fosfatase alcalina com estreptavidina (Caltag) numa diluição de 1/1000. Após três lavagens em PBS as manchas foram reveladas por incubação com substrato BCICP (Biorad) durante 15-45 minutos. O substrato foi removido por lavagem utilizando água e as placas foram deixadas a secar. As 100 manchas foram enumeradas utilizando um sistema de análise de imagem idealizado por Brian Hayes, Asthma Cell Biology Unit, GSK.

1.3. Ensaio de ELISA para anticorpos contra o produto do gene de P501 S

As amostras de soro foram obtidas dos animais através de venopunção nos dias -1, 28, 49 e 56, e ensaiadas para a presença de anticorpos anti-P501S. 0 ELISA foi realizado utilizando placas Nunc Maxisorp revestidas de um dia para o outro a 4 °C com 0,5 yg/mL de proteína CPC-P501S (GSKBio) em tampão de bicarbonato de sódio. Após lavagem com TBS-Tween (soro fisiológico tamponado com Tris, pH 7,4, contendo 0,05% de Tween 20) as placas foram bloqueadas com tampão de Bloqueamento (3% de BSA em tampão TBS-Tween) durante 2 h, à temperatura ambiente. Todos os soros foram incubados na diluição de 1:100 durante 1 hora, à t.a., em tampão de Bloqueamento. A ligação do anticorpo foi detectada utilizando imunoglobulinas de coelho anti-murganho conjugadas com HRP (P0260, Dako) na diluição de 1:2000 em tampão do Bloqueamento. As placas foram lavadas novamente e o conjugado ligado foi detectado utilizando reagentes corados Fast OPD (Sigma, Reino Unido). A reacção foi parada através da adição de ácido sulfúrico a 3 M e o produto OPD quantificado através da medição da absorvência a 490 nm. 1.4. Ensaios de transfecção transitória 101 A expressão de P501 S humano a partir de várias construções de ADN foi analisada através de transfecção transitória dos plasmideos em células CHO (ovário de hamster Chinês) seguida por transferência de Western na proteína celular total. As transfecções transitórias foram realizadas com o reagente Transfectam (Promega) de acordo com as directrizes do fabricante. Resumidamente, foram inoculadas placas de cultura de tecidos de 24 poços com 5xl04 de células CHO por poço em 1 mL de meio DMEM completo (DMEM, 10% de FCS, 2 mM de L-glutamina, 100 IU/mL de penicilina, 100 pg/mL de estreptomicina) e incubadas durante 16 horas a 37 °C. Foi adicionado 0,5 pg de ADN a 25 pL de NaCl a 0,3 M (suficiente para um poço) e foram adicionados 2 pL de Transfectam a 25 pL de Milli-Q. As soluções de ADN e Transfectam foram misturadas cuidadosamente e incubadas a temperatura ambiente durante 15 minutos. Durante este passo de incubação, as células foram lavadas uma vez em PBS e cobertas com 150 pL de meio sem soro (DMEM, 2 mM de L-glutamina). A solução de ADN-transfectam foi adicionada, gota a gota, às células, a placa agitada cuidadosamente e incubada a 37 °C durante 4-6 horas. Foram adicionados 500 pL de meio DMEM completo e as células incubadas durante mais 48-72 horas a 37 °C.

2. Análise de transferência de Western de células CHO transitoriamente transfectadas com plasmideos de P501S

As células CHO transitoriamente transfectadas foram lavadas com PBS e tratadas com uma solução de Versene (1:5000)/0,025% de tripsina para transferir as células para suspensão. Após tripsinização, as células CHO foram sedimentadas e ressuspensas em 50 pL de PBS. Foi adicionado um volume igual de tampão de lise 2x NP40 e as células incubadas em gelo durante 30 minutos. Foram adicionados 100 pL de tampão de amostra 2x TRIS-Glicina 102 SDS (Invitrogen) contendo 50 mM de DTT e a solução foi aquecida a 95 °C durante 5 minutos. Foram aplicados 1-20 yL de amostra num gel de TRIS-Glicina a 4-20% de 1,5 mm (Invitrogen) e submetido a electroforese sob tensão constante (125 V) durante 90 minutos em tampão lx TRIS-Glicina (Invitrogen). Foi utilizado um marcador de gama larga pré-corado (New England Biolabs, #P7708S) para determinar o tamanho das amostras. Após a electroforese, as amostras foram transferidas para membrana de PVDF Immobilon-P (Millipore), pré-molhada em metanol, utilizando um Xcell III Blot Module (Invitrogen), tampão de transferência lx contendo 20% de metanol (Invitrogen) e uma tensão constante de 25 V durante 90 minutos. A membrana foi bloqueada de um dia para o outro a 4 °C em leite em pó magro contendo 3% de TBS-Tween (soro fisiológico tamponado com Tris, pH 7,4, contendo 0,05% de Tween 20) (Marvel). O anticorpo primário (10E3) foi diluido a 1:1000 e incubado com a membrana durante 1 hora à temperatura ambiente. Depois de lavagem exaustiva em TBS-Tween, o anticorpo secundário (imunoglobulinas de coelho anti-murganho conjugadas com HRP (#P0260, Dako)) foi diluido a 1:2000 em leite em pó magro contendo 3% de TBS-Tween e incubado com a membrana durante uma hora à temperatura ambiente. Depois de lavagem exaustiva, a membrana foi incubada com substrato Supersignal West Pico Chemiluminescent (Pierce) durante 5 minutos. O excesso de líquido foi removido e a membrana selada entre duas folhas de película aderente, e exposta a filme Hyperfilm ECL (Amersham-PharmaciaBiotech) durante 1-30 minutos. 3. Preparação da cassete de expressão de P501S humano de tamanho total 0 ponto de partida para a construção de uma cassete de expressão de P501S foi o plasmídeo pcDNA3.1-P501 S (Corixa 103

Corp), que tem uma estrutura básica de pcDNA3.1 (Invitrogen) contendo uma cassete de ADNc de P501 S humano de tamanho total clonada entre os sítios EcoRl e Notl. Este vector é também denominado JNW673. A presença de P501S foi confirmada através de sequenciação fluorescente. A sequência da cassete de ADNc é dada pela sequência de NCBI/Genbank (número de acesso AY033593). 0 P501 S humano foi amplificado por PCR a partir de ADN molde JNW673, digerido com Xbal e Sall e clonado nos sítios Nhel/Xhol de pVAC, produzindo o vector JNW680. A orientação correcta do fragmento relativamente ao promotor CMV foi confirmada através de PCR e por sequenciação de ADN. A sequência da cassete de expressão é mostrada na Figura 12 (SEQ ID N°: 17). Para construir uma cassete de expressão de CPC-p501 S, o CPC-p501 S foi amplificado por PCR a partir do vector pRIT15201 (ver Figura 7), digerido com Xbal e Sall e clonado nos sítios Nhel e Xhol de pVAC, produzindo o plasmídeo JNW735. A orientação correcta foi confirmada através de PCR e sequenciação. A sequência da cassete de expressão de CPC-p501 S é mostrada na Figura 13 (SEQ ID N°:18) . 4. Expressão de P501S humano a partir de plasmídeos JNW680 e JNW735

Os plasmídeos de expressão de P501S foram transitoriamente transfectados em células CHO e um lisado celular total preparado como descrito nos métodos. Uma transferência de Western de uma lisado celular total identificou bandas únicas de aproximadamente 55 kDa e 62 kDa para amostras transfectadas com JNW680 e JNW735, respectivamente (Figura 21). Isto é consistente com os pesos moleculares previstos de 59,3 kDa e 63,3 kDa para P501 S e CPC-p501 S, respectivamente. A adição do marcador CPC não afecta adversamente a expressão de P501 S. 104 5. Resultados

5.1. Respostas de anticorpo a P501S humano após imunização de PMID

As respostas de anticorpo após imunização com pVAC (vector vazio) e pVAC-P501S (JNW680) foram avaliadas através de ELISA após um imunização primária por PMID no dia 0 e três reforços no dia 21, dia 42 e dia 70. A Figura 22 mostra as respostas de anticorpo de soros recolhidos no dia -1, dia 28, dia 49 (murganhos Al-3, Bl-3) e dia 56 (murganhos A4-6, B4-9). Embora existam algumas respostas não especificas ao vector vazio pVAC, foram observadas respostas especificas à construção P501 S em 5 de 9 murganhos.

5.2. Identificação dos novos epitopos de célula T a partir de P501S humano em murganhos C57BU6 por rastreio de uma biblioteca de péptidos de P501S

Após imunização com JNW680 (pVAC-P501S) por PMID no dia 0 e três reforços no dia 21, dia 42 e dia 70, os ensaios ELISPOT foram realizados no dia 84. Os péptidos da biblioteca de P501 S foram testados na concentração final de 50 yg/mL. A partir deste rastreio inicial, foram encontrados três péptidos que estimulam a secreção de IFN-γ e/ou IL-2. Péptidos 18, 22 e 48 (Figura 23). Estes péptidos foram utilizados em ensaios celulares subsequentes.

5.3. Respostas celulares a pVAC-P501S (JNW680) após imunização de PMID 105

As respostas celulares após imunização com pVAC (vector vazio) e pVAC-P501 S foram avaliadas por ELISPOT após imunização primária por PMID no dia 0 e três reforços no dia 21, 42 e 70. Os ensaios foram realizados 7 dias após o reforço. Foram utilizadas duas condições de ensaio diferentes: 1) os péptidos 18, 22 e 48 identificados no rastreio da biblioteca de péptidos utilizados à concentração final de 50 yg/mL e 2) a proteína CPC-P501S utilizada na concentração final de 20 yg/mL. A figura 24A mostra que embora não se tenham verificado respostas específicas de P501 S ao vector vazio (A4-6), a construção pVAC-P501 S induziu respostas específicas de IFN-γ aos Péptidos 18 e 22 em todos os murganhos (B6-9) enquanto que um murganho (B7) também mostrou uma resposta de IFN-γ ao Péptido 48. A figura 24B mostra que todos os murganhos apresentaram respostas específicas de IL-2 aos Péptidos 18, 22 e 48. Além disso, os murganhos imunizados com pVAC-P501 S (B6-9) também mostraram respostas de IL-2 moderadas a CPC-P501S, enquanto que os murganhos imunizados com vector vazio (A4-6) não apresentaram nenhuma resposta. 5.4. Comparação de respostas celulares a P501S e CPC-P501S após imunização PMID.

As respostas celulares após imunização com pVAC (vector vazio), PVAC-P501S (JNW680) e CPC-P501S (JNW735) foram avaliadas através de ELISPOT após uma imunização primária por PMID no dia 0 e reforços no dia 21 e 42. Os ensaios foram realizados 7 dias após o reforço. Foram utilizadas duas condições de ensaio diferentes: 1) os péptidos 18, 22 e 48 identificados no rastreio da biblioteca de péptidos utilizados à concentração final de 50 yg/mL e 2) a proteína CPC-P501S utilizada na concentração final de 20 yg/mL. A Figura 25 mostra que no dia 28, o CPC-p501 S induziu boas respostas de IL-2 a 10 yg/mL de péptido 106 22, enquanto não se verificaram respostas especificas de P501 S ao vector vazio ou a pVAC-P501 S. Estes resultados foram também observados utilizando a proteína CPC-p501 S para re-estimular os esplenócitos. No dia 49 (após 2o reforço), as respostas induzidas por P501 S e CPC-p501 S foram equivalentes. Estes dados sugerem que a adição do marcador CPC melhora a cinética e/ou magnitude da resposta a P501 S.

Exemplo IX. Experiências de imunogenicidade em estudos com murganhos utilizando Proteína P501S + adjuvantes 1. Concepção e formulação de adjuvante A resposta imunológica induzida através de vacinação utilizando a proteína CPC-p501 S purificada recombinante formulada em adjuvantes é caracterizada em experiências realizadas em murganhos. Grupos de 5 a 10 murganhos C57BL6 fêmeas de oito semanas de idade são vacinados 2-6 vezes intramuscularmente, em intervalos de 2 semanas com 10 pg da proteína CPC-P501S formulada em sistemas adjuvantes diferentes. O volume administrado corresponde a 1/10 da dose humana (50 pL) . A serologia (resposta total de Ig) e a resposta celular (linfoproliferação das células T e produção de citocinas) são analisadas em células do baço, 6-14 dias após a última vacinação utilizando protocolos convencionais como descritos em Gérard, C. et al., 2001, Vaccine 19, 2583-2589. São mostrados os dados de uma experiência representativa. Incluiu 5 grupos de oito murganhos C57BI/6 fêmeas que receberam 4 injecções intramusculares de CPC P501 (10 pg) + adjuvante (A, B, C) nos dias 0, 14, 28, 42. O Exemplo V proporciona um protocolo experimental de como realizar as formulações. 107

Resumidamente, as formulações adjuvantes são como se seguem (as quantidades são dadas para uma dose de 100 pL) ) : - Adjuvante A: QS21 (10 pg) , : MPL (10 μς) e CpG7909 (100 pg) preparado de acordo com 0 método divulgado no documento WO 00/62800; - Adjuvante B: formulação de QS21 (20 pg), MPL (20 pg), CpG7909 (100 pg) e 50 pL de emulsão óleo-em-água SB62 (documento WO 95/17210); - Adjuvante C: formulação de QS21 (10 pg), MPL (10 pg) r CpG7909 (100 pg) e 10 pL de emulsão óleo-em-água SB62 (documento WO 99/12565) . 2. Serologia A resposta Ig total induzida através de vacinação foi medida por ELISA utilizando CPC-p501 ou RA12-P501 (C-term, que é uma forma truncada da proteína P501 correspondente ao C-terminal da proteína fundida no seu N-terminal, a uma proteína RA12 derivada de TB - Ral2 é derivada a partir do antigénio MTB32A descrito em Skeiky et al., Infection and Immun. (1999) 67:3998-4007). As proteínas CPC-p501 S adjuvantadas dão uma boa resposta de anticorpo após vacinação. 3. Resposta celular 3.1. Linfoproliferação 7 Dias após a última vacina, a linfoproliferação foi realizada em células do baço individualmente. Foram plaqueadas 2,10e5 células do baço em quadruplicados, em microplaca de 96 poços, em meio RPMI contendo 1% de soro normal de murganho. Após 108 72 horas de re-estimulação com o imunogénio (CPC-p501) ou a proteína truncada (RA12 P501) a concentração diferente, foi adicionado 1 yCi de 3H timidina (Amersham, 5 Ci/mL). Após 16 horas, as células foram recolhidas em placas de filtro. A radioactividade incorporada foi medida num contador β. Os resultados são expressos em CPM ou como índices de estimulação* (CPM geomean em culturas com antigénio / CPM geomean em culturas sem antigénio). A re-estimulação com ConA (2 yg/mL) como controlo positivo foi incluída como controlo positivo.

Como mostrado na Figura 26, é observada uma linfoproliferação específica de P501 no baço de todos os grupos de murganhos que receberam a proteína adjuvantada após re-estimulação in vitro com o imunogénio ou outra proteína P501 produzida noutro sistema de expressão (E. coli), indicando que as células T foram iniciadas in vivo através da vacinação. 3.2. Produção de IFNg medida através de coloração intracelular de células do baço Células Dendríticas de Medula Óssea (BMDC) obtidas após cultura de PBL de murganho durante 7 dias na presença de GMCSF. 7 Dias após a última vacina, o baço ou PBL são recolhidos e é preparada uma suspensão celular. Foram incubadas 10e6 células (1 agrupamento por grupo) +/- 18 h com 10e5 BMDC pulsadas de um dia para o outro com 10 pg/mL de proteína CPCpóOl ou RA12. Após um tratamento com o anticorpo 2.4.G.2, as células do baço foram coradas com anticorpos anti CD4 e CD8 fluorescentes (anti CD4-APC e anti CDBPerCP). Após um passo de permeabilização e fixação, as células foram coradas com anticorpo anti IFNg-FITC fluorescente. 109

Em murganhos vacinados com CPC P501 em adjuvante diferente, é mostrado que ambas as células T CD4 e CD8 produzem IFNg em resposta a DC pulsado com o imunogénio e o p501 C-termo produzido em E. coli (como mostrado através de coloração intracelular do baço e PBL) . Existe um aumento de 4-10X na % de células que produzem esta citocina nos grupos que receberam o CPC-p501 S adjuvantado comparativamente à proteína isolada, e é mostrado que entre 0,1 a 10% de células T CD4 ou CD8 produzem IFNg.

Em conclusão, estes dados permitem concluir que a proteína CPC-p501 adjuvantada é imunogénica em murganhos. Tanto uma resposta humoral específica de P501 como celular incluindo produção de IFNg por células T CD4 e CD8 podem ser detectadas após diversas vacinações intramusculares com CPC P501 em adjuvantes.

Exemplo X. Construções e sequências de CPC-MUC-1 A sequência de CPC é retirada da sequência de nucleótidos SEQ ID N° 28. A sequência MUC1 está disponível a partir da base de dados Genbank (número de acesso NM 002456).

1. Construção de MUC1-CPC

Devido à presença de uma sequência sinal em MUC1 que é clivada pós-tradução, o motivo CPC foi colocado no C-terminal. A sequência de ADN resultante de MUC1-CPC é representada na SEQ ID N° xx (figura 28A) e a sequência de proteína correspondente de MUC1-CPC em SEQ ID N° yy (figura 28B) . 110 2. Construção de ss-CPC-MUCl

Devido à presença de uma sequência sinal em MUC1 que é clivada pós-tradução, a sequência sinal MUC1 foi substituída por uma sequência líder heteróloga (da cadeia pesada da imunoglobulina humana) e o motivo CPC foi introduzido entre a sequência líder heteróloga e a sequência MUC1, produzindo uma sequência denominada ss-CPC-MUCl como representada na figura 29. 111

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> GlaxosmithKline Biologicals sa Glaxo Group Ltd <120> Composições imunogénicas <130> B45311 <160> 52 <170> FastSEQ para Windows versão 4.0

<210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 1

Gly Trp Gin Lys Asn Asp Thr Gly Tyr Trp Tyr Vai His Ser Asp 15 10 15

<210> 2 <211> 21 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae < 4 0 0 > 2

Gly Ser Tyr Pro Lys Asp Lys Phe Glu Lys Ile Asn Gly Thr Trp Tyr 15 10 15

Tyr Phe Asp Ser Ser 20 <210> 3 112

<211> 22 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 3

Gly Tyr Met Leu Ala Asp Arg Trp Arg Lye His Thr Asp Gly Asn Trp 15 10 15

Tyr Trp Phe Asp Asn Ser 20

<210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 4

Gly Glu Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys Ile Ala Asp Lys Trp Tyr Tyr 15 10 15

Phe Asn Glu Glu 20

<210> 5 <211> 21 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 5

Gly Ala Met Lys Thr Gly Trp Vai Lys Tyr Lys Asp Thr Trp Tyr Tyr 15 10 15

Leu Asp Ala Lys Glu 20 <210> 6 <211> 23 113

<212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 6

Gly Ala Met Vai Ser Asn Ala Phe Ile Gin Ser Ala Asp Gly Thr Gly 15 10 15

Trp Tyr Tyr Leu Lys Pro Asp 20

<210> 7 <211> 142 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 7

Gly Trp Gin Lys Asn Asp Thr Gly Tyr Trp Tyr Vai Hls Ser Asp Gly 1 5 10 15 Ser Tyr Pro Lys Asp Lys Phe Glu Lys Ile Asn Gly Thr Trp Tyr Tyr 20 25 30 Phe Asp Ser Ser Gly Tyr Met Leu Ala Asp Arg Trp Arg Lys His Thr 35 40 45 Asp Gly Asn Trp Tyr Trp Phe Asp Asn Ser Gly Glu Met Ala Thr Gly 50 55 60 Trp Lys Lys Ile Ala Asp Lys Trp Tyr Tyr Phe Asn Glu Glu Gly Ala 65 70 75 80 Met Lys Thr Gly Trp Vai Lys Tyr Lys Asp Thr Trp Tyr Tyr Leu Asp 85 90 95 Ala Lys Glu Gly Ala Met Vai Ser Asn Ala Phe Ile Gin Ser Ala Asp 100 105 110 Gly Thr Gly Trp Tyr Tyr Leu Lys Pro Asp Gly Thr Leu Ala Asp Arg 115 120 125 Pro Glu Phe Thr Vai Glu Pro Asp Gly Leu Ile Thr Vai Lys 130 135 140

<210> 8 <211> 112 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae 114 <4Ο0> 8

Tyr Vai His Ser Asp Gly Ser Tyr Pro Lys Asp Lys Phe Glu Lys Ile 1 5 10 15 Asn Gly Thr Trp Tyr Tyr Phe Asp Ser Ser Gly Tyr Met Leu Ala Asp 20 25 30 Arg Trp Arg Lys His Thr Asp Gly Asn Trp Tyr Trp Phe Asp Asn Ser 35 40 45 Gly Glu Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys Ile Ala Asp Lys Trp Tyr Tyr 50 55 60 Phe Asn Glu Glu Gly Ala Met Lys Thr Gly Trp Vai Lys Tyr Lys Asp 65 70 75 80 Thr Trp Tyr Tyr Leu Asp Ala Lys Glu Gly Ala Met Vai Ser Asn Ala 85 90 95 Phe Ile Gin Ser Ala Asp Gly Thr Gly Trp Tyr Tyr Leu Lys Pro Asp 100 105 110

<210> 9 <211> 45 <212> ADN <213> Streptococcus pneumoniae <400> 9 ggctggcaga agaatgacac tggctactgg tacgtacatt cagac 45

<210> 10 <211> 63 <212> ADN <213> Streptococcus pneumoniae < 4 0 0 > 10 ggctcttatc caaaagacaa gtttgagaaa atcaatggca cttggtacta ctttgacagt 60 tca 63

<210> 11 <211> 66 <212> ADN 115 <213> Streptococcus pneumoniae < 4 0 0 > 11 ggctatatgc ttgcagaccg ctggaggaag cacacagacg gcaactggta ctggttcgac 60 aactca 66

<210> 12 <211> 60 <212> ADN <213> Streptococcus pneumoniae <4 0 0> 12 ggcgaaatgg ctacaggctg gaagaaaatc gctgataagt ggtactattt caacgaagaa 60

<210 > 13 <211> 63 <212> ADN <213> Streptococcus pneumoniae <4 0 0> 13 ggtgccatga agacaggctg ggtcaagtac aaggacactt ggtactactt agacgctaaa 60 gaa 63

<210> 14 <211> 69 <212> ADN <213> Streptococcus pneumoniae < 4 0 0 > 14 116 ggcgccatgg tatcaaatgc ctttatccag tcagcggacg gaacaggctg gtactacctc 60 aaaccagac 69

<210> 15 <211> 429 <212> ADN <213> Streptococcus pneumoniae < 4 0 0 > 15 cagacggctc ttatccaaaa 60 acagttcagg ctatatgctt 120 ggttcgacaa ctcaggcgaa 180 atttcaacga agaaggtgcc 240 acttagacgc taaagaaggc 300 caggctggta ctacctcaaa 360 agccagatgg cttgattaca 420 429 ggctggcaga agaatgacac gacaagtttg agaaaatcaa gcagaccgct ggaggaagca atggctacag gctggaagaa atgaagacag gctgggtcaa gccatggtat caaatgcctt ccagacggaa cactggcaga gtaaaataa tggctactgg tacgtacatt tggcacttgg tactactttg cacagacggc aactggtact aatcgctgat aagtggtact gtacaaggac acttggtact tatccagtca gcggacggaa caggccagaa ttcacagtag <210> 16 <211> 336 <212> ADN <213> Streptococcus < 4 0 0 > 16 pneumoniae

<210> 17 <211> 1674 <212> ADN <213> Homo sapiens agaaaatcaa tggcacttgg 60 ggaggaagca cacagacggc 120 gctggaagaa aatcgctgat 180 gctgggtcaa gtacaaggac 240 caaatgcctt tatccagtca 300 336 tacgtacatt ccgacggctc tactactttg acagttcagg aactggtact ggttcgacaa aagtggtact atttcaacga acttggtact acttagacgc gcggacggaa caggctggta ttatccaaaa gacaagtttg ctatatgctt gcagaccgct ctcaggcgaa atggctacag agaaggtgcc atgaagacag taaagaaggc gccatggtat ctacctcaaa ccagac 117 <400> 17 gccaccatgg tccagaggct gtgggtgagc cgcctgctgc ggcaccggaa agcccagctc 60 ttgctggtca acctgctaac ctttggcctg gaggtgtgtt tggccgcagg catcacctat 120 gtgccgcctc tgctgctgga agtgggggta gaggagaagt tcatgaccat ggtgctgggc 180 attggtccag tgctgggcct ggtctgtgtc ccgctcctag gctcagccag tgaccactgg 240 cgtggacgct atggccgccg ccggcccttc atctgggcac tgtccttggg catcctgctg 300 agcctctttc tcatcccaag ggccggctgg ctagcagggc tgctgtgccc ggatcccagg 360 cccctggagc tggcactgct catcctgggc gtggggctgc tggacttctg tggccaggtg 420 tgcttcactc cactggaggc cctgctctct gacctcttcc gggacccgga ccactgtcgc 480 caggcctact ctgtctatgc cttcatgatc agtcttgggg gctgcctggg ctacctcctg 540 cctgccattg actgggacac cagtgccctg gccccctacc tgggcaccca ggaggagtgc 600 ctctttggcc tgctcaccct catcttcctc acctgcgtag cagccacact gctggtggct 660 gaggaggcag cgctgggccc caccgagcca gcagaagggc tgtcggcccc ctccttgtcg 720 ccccactgct gtccatgccg ggcocgcttg gctttccgga acctgggcgc cctgcttccc 780 cggctgcacc agctgtgctg ccgcatgccc cgcaccctgc gccggctctt cgtggctgag 840 ctgtgcagct ggatggcact catgaccttc acgctgtttt acacggattt cgtgggcgag 900 gggctgtacc agggcgtgcc cagagctgag ccgggcaccg aggcccggag acactatgat 960 gaaggcgttc ggatgggcag cctggggctg ttcctgcagt gcgccatctc cctggtcttc 1020 tctctggtca tggaccggct ggtgcagcga ttcggcactc gagcagtcta tttggccagt 1080 gtggcagctt tccctgtggc tgccggtgcc acatgcctgt cccacagtgt ggccgtggtg 1140 acagcttcag ccgccctcac cgggttcacc ttctcagccc tgcagatcct gccctacaca 1200 ctggcctccc tctaccaccg ggagaagcag gtgttcctgc ccaaataccg aggggacact 1260 ggaggtgcta gcagtgagga cagcctgatg accagcttcc tgccaggccc taagcctgga 1320 gctcccttcc ctaatggaca cgtgggtgct ggaggcagtg gcctgctccc acctccaccc 1380 gcgctctgcg gggcctctgc ctgtgatgtc tccgtacgtg tggtggtggg tgagcccacc 1440 gaggccaggg tggttccggg ccggggcatc tgcctggacc tcgccatcct ggatagtgcc 1500 ttcctgctgt cccaggtggc cccatccctg tttatgggct ccattgtcca gctcagccag 1560 tctgtcactg cctatatggt gtctgccgca ggcctgggtc tggtcgccat ttactttgct 1620 acacaggtag tatttgacaa gagcgacttg gccaaatact cagcgtaggt cgag 1674

<210> 18 <211> 1947 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Gene híbrido entre C-LytA de St. pneum., epitopo P2 de auxiliar T e P501S humano. < 4 0 0 > 18 118 gccaccatgg cggccgctta cgtacattcc aaaatcaatg gcacttggta ctactttgac aggaagcaca cagacggcaa ctggtactgg tggaagaaaa tcgctgataa gtggtactat tgggtcaagt acaaggacac ttggtactac atcaaggcta actctaagtt cattggtatc atccagtcag cggacggaac aggctggtac aggccagaaa agttcatgta catggtgctg gtcccgctcc taggctcagc cagtgaccac ttcatctggg cactgtcctt gggcatcctg tggctagcag ggctgctgtg cccggatccc ggcgtggggc tgctggactt ctgtggccag tctgacctct tccgggaccc ggaccactgt atcagtcttg ggggctgcct gggctacctc ctggccccct acctgggcac ccaggaggag ctcacctgcg tagcagccac actgctggtg ccagcagaag ggctgtcggc cccctccttg ttggctttcc ggaacctggg cgccctgctt ccccgcaccc tgcgccggct cttcgtggct ttcacgctgt tttacacgga tttcgtgggc gagccgggca ccgaggcccg gagacactat ctgttcctgc agtgcgccat ctccctggtc cgattcggca ctcgagcagt ctatttggcc gccacatgcc tgtcccacag tgtggccgtg accttctcag ccctgcagat cctgccctac caggtgttcc tgcccaaata ccgaggggac atgaccagct tcctgccagg ccctaagcct gctggaggca gtggcctgct cccacctcca gtctccgtac gtgtggtggt gggtgagccc atctgcctgg acctcgccat cctggatagt ctgtttatgg gctccattgt ccagctcagc gcaggcctgg gtctggtcgc catttacttt ttggccaaat actcagcgta ggtcgag gacggctctt atccaaaaga caagtttgag 60 agttcaggct atatgcttgc agaccgctgg 120 ttcgacaact caggcgaaat ggctacaggc 180 ttcaacgaag aaggtgccat gaagacaggc 240 ttagacgcta aagaaggcgc catgcaatac 300 actgaaggcg tcatggtatc aaatgccttt 360 tacctcaaac cagacggaac actggcagac 420 ggcattggtc cagtgctggg cctggtctgt 480 tggcgtggac gctatggccg ccgccggccc 540 ctgagcctct ttctcatccc aagggccggc 600 aggcccctgg agctggcact gctcatcctg 660 gtgtgcttca ctccactgga ggccctgctc 720 cgccaggcct actctgtcta tgccttcatg 780 ctgcctgcca ttgactggga caccagtgcc 840 tgcctctttg gcctgctcac cctcatcttc 900 gctgaggagg cagcgctggg ccccaccgag 960 tcgccccact gctgtccatg ccgggcccgc 1020 ccccggctgc accagctgtg ctgccgcatg 1080 gagctgtgca gctggatggc actcatgacc 1140 gaggggctgt accagggcgt gcccagagct 1200 gatgaaggcg ttcggatggg cagcctgggg 1260 ttctctctgg tcatggaccg gctggtgcag 1320 agtgtggcag ctttccctgt ggctgccggt 1380 gtgacagctt cagccgccct caccgggttc 1440 acactggcct ccctctacca ccgggagaag 1500 actggaggtg ctagcagtga ggacagcctg 1560 ggagctccct tccctaatgg acacgtgggt 1620 cccgcgctct gcggggcctc tgcctgtgat 1680 accgaggcca gggtggttcc gggccggggc 1740 gccttcctgc tgtcccaggt ggccccatcc 1800 cagtctgtca ctgcctatat ggtgtctgcc 1860 gctacacagg tagtatttga caagagcgac 1920 1947

<210> 19 <211> 1662 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> P501S humano de codão optimizado <400> 19 119 atggtgcagc ggctctgggt gagccgcctc ctgcggcatc gcaaggccca gctcctgctg 60 gtgaatctgc tcacattcgg cctggaggtg tgcctggccg ccggcatcac ctacgtgccc 120 cccctcctgc tggaggtggg agtcgaggag aagttcatga ccatggtgct gggcattggg 180 cccgtcctgg gcctcgtgtg cgtgcctctc ctcggcagcg cttccgacca ttggcgcggc 240 cggtatggcc gcaggagacc cttcatctgg gctctgagtc tcggcatcct gctgagcctg 300 ttcctgatcc ctcgggccgg ctggctggcc gggctgctgt gccccgatcc tcggcccctg 360 gagctggccc tgctgatcct cggcgtgggc ctgctggact tctgcggcca ggtgtgcttc 420 acgcccctgg aggcactgct gagcgacctg ttccgggacc ccgaccattg cogccaggcg 480 tacagcgtgt acgccttcat gatctccctg ggaggctgcc tgggctacct gctccccgcc 540 atcgattggg acaccagcgc actcgccccc tatctcggaa cacaggagga atgcctgttc 600 ggattgttga cgctcatctt cctcacgtgc gtcgcggcca ccctgttggt ggccgaggag 660 gccgccctgg ggcccaccga gccggccgag ggactgagcg ccccgagcct gagtccacac 720 tgctgccctt gccgggcccg cctggccttc cgtaatctgg gcgccctcct gcctcggctc 780 catcagctgt gttgcagaat gcctaggacg ctgcggcgcc tgttcgtcgc tgagttgtgc 840 tcctggatgg ctctcatgac cttcaccctg ttttatacgg acttcgtcgg ggagggcctg 900 taccaggggg tgccgcgcgc cgagcccggg acagaggcgc gccgccacta cgacgaggga 960 gtgcgtatgg gctccctggg cctcttcttg cagtgcgcca tcagtctggt tttctctctg 1020 gtcatggaca ggctggtgca gcgcttcgga acccgggcgg tgtacctggc gagcgtggcc 1080 gccttccccg tggctgccgg cgccacctgc ctctctcact cggtggccgt ggtcaccgcc 1140 agcgccgccc tgaccgggtt caccttctct gccctgcaga ttctgcctta caccctggcc 1200 agcctgtacc atcgcgagaa acaggtgttt ctccccaagt acagaggcga caccgggggc 1260 gcctccagcg aggacagcct catgacctcc ttcctgcctg gccccaagcc cggcgcccct 1320 ttccccaacg ggcacgtggg cgccggcggg agtgggctcc tgcccccccc tcctgcgctg 1380 tgcggggcea gcgcctgcga cgtgagcgtg cgcgtggtgg tgggcgagcc caccgaggcc 1440 cgcgtggtgc cgggcagagg catttgtctg gacctggcca tcctcgactc cgccttcctc 1500 ctcagccagg tggccccgtc cctcttcatg ggctctatcg tccagctgtc tcagagcgtc 1560 accgcttaca tggtgtccgc tgctggactg ggcttggtgg ctatttattt cgccacccag 1620 gtggtgttcg acaagagcga cctggccaaa tactccgcct ga 1662 <210> 20 <211> 1662

<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> P501S humano de codão optimizado <400> 20 atggtgcagc ggctgtgggt gtcccggctg ctgcgccata gaaaggccca gttgctgctg 60 gtgaacctgc tgactttcgg actggaggtg tgcctggctg ccgggatcac gtacgtgccc 120 cccctgctgc tggaggtggg cgtggaggag aagttcatga caatggtgct gggcatcggc 180 cccgtcctgg gcctcgtgtg tgtgcccctc ctcgggagtg cgtccgatca ttggcggggc 240 cgctacggcc gccgcagacc gttcatctgg gccctgagcc tggggatcct gctctctctc 300 ttcctgatcc cccgggccgg ctggctggcc ggcctgctgt gtcccgaccc ccgccctctg 360 120 gagctggccc tcctgatcct gggcgtgggc ttgttggact tctgcggcca ggtgtgtttc 420 actcccctgg aggctctgct ctccgacctc ttccgcgacc ccgaccactg taggcaggct 480 tacagcgtgt acgccttcat gatcagtctg gggggatgcc tgggctatct gctgcccgct 540 atcgactggg acaccagcgc cctggccccc tacctgggga ctcaggagga gtgcctgttc 600 ggcctgctca ccttgatctt cctgacgtgc gtcgccgcca ccctgctggt ggccgaggag 660 gcggccctgg ggcccaccga gcccgccgag ggcctgagcg ctcccagcct gagcccccat 720 tgctgcccgt gcagggctag gctcgccttc aggaatctgg gcgctttgct gccccgcctg 780 catcagctgt gctgtcgcat gcctcgcacc ctgcgccgcc tgttcgtcgc tgagctctgt 840 tcctggatgg ccctgatgac gttcaccctc ttctacaccg acttcgtggg ggagggcctg 900 taccagggcg tgcccagggc cgagcccggc accgaggcta ggcgccatta cgacgagggc 960 gtcaggatgg gctctctggg cctcttcctg cagtgcgcca tcagtctggt gttctctctg 1020 gtgatggacc ggctggtgca gcgcttcggc acccgggccg tgtacctcgc ctctgtggcg 1080 gctttccccg tcgccgccgg cgcgacctgc ctgtctcatt ctgtcgccgt ggtgaccgcc 1140 agcgccgccc tgaccggctt caccttcagt gcgctccaga ttctgcccta caccctggcg 1200 tctctgtacc atcgcgagaa gcaggtgttc ctgcccaagt accgcgggga cacaggggga 1260 gcttcctctg aggacagcct gatgaccagc ttcttgcccg gccccaagcc gggggcccct 1320 ttccccaacg gccatgtcgg ggcgggcggc agcggcctgc tccctccccc ccccgccctg 1380 tgcggcgcta gtgcctgcga cgtgagcgtg cgggtggtgg tgggggagcc caccgaggct 1440 agggtcgtgc ctggccgggg gatctgcctg gacctggcca tcctcgactc cgccttcctg 1500 ctctcccagg tggcgcccag cctgttcatg ggcagtatcg tgcagctgag ccagagcgtg 1560 accgcctaca tggtgagcgc cgccggcctg gggttggtgg ccatctactt tgccacccag 1620 gtcgtgttcg acaagagcga tctcgccaag tatagcgcct ga 1662

<210> 21 <211> 1688 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> P501S humano de codão optimizado <400> 21 gacggctagc gccaccatgg tgcagcggct ctgggtgagc cgcctcctgc ggcatcgcaa 60 ggcccagctc ctgctggtga atctgctçac attcggcctg gaggtgtgcc tggccgccgg 120 oatcacctac gtgccccccc tcctgctgga ggtgggagtc gaggagaagt tcatgaccat 180 ggtgctgggc attgggcccg tcctgggcct cgtgtgcgtg cctctcctcg gcagcgcttc 240 cgaccattgg cgcggccggt atggccgcag gagacccttc atctgggctc tgagtctcgg 300 catcctgctg agcctgttcc tgatccctcg ggccggctgg ctggccgggc tgctgtgccc 360 cgatcctcgg cccctggagc tggccctgct gatcctcggc gtgggcctgc tggacttctg 420 cggccaggtg tgcttcacgc ccctggaggc actgctgagc gacctgttcc gggaccccga 480 ccattgccgc caggcgtaca gcgtgtacgc cttcatgatc tccctgggag gctgcctggg 540 ctacctgctc cccgccatcg attgggacac cagcgcactc gccccctatc tcggaacaca 600 ggaggaatgc ctgttcggac tgctgacgct catcttcctc acgtgcgtcg cggccaccct 660 121 gttggtggcc gaggaggccg ccctggggcc gagcctgagt ccacactgct gcccttgccg cctcctgcct cggctccatc agctgtgttg cgtcgctgag ttgtgctcct ggatggctct cgtcggggag ggcctgtacc agggggtgcc ccactacgac gagggagtgc gtatgggctc tctggttttc tctctggtca tggacaggct cctggcgagc gtggccgcct tccccgtggc ggccgtggtc accgccagcg ccgccctgac gccttacacc ctggccagcc tgtaccatcg aggegacacc gggggcgcct ccagcgagga caagcccggc gcccctttcc ccaacgggca cccccctcct gcgctgtgcg gggccagcgc cgagcccacc gaggcccgcg tggtgccggg cgactccgcc ttcctcctca gccaggtggc gctgtctcag agcgtcaccg cttacatggt ttatttcgcc acccaggtgg tgttcgacaa cgaggcag caccgagccg gccgagggac tgagcgcccc 720 ggcccgcctg gccttccgta atctgggcgc 780 cagaatgcct aggacgctgc ggcgcctgtt 840 catgaccttc accctgtttt atacggactt 900 gcgcgccgag cccgggacag aggcgcgccg 960 cctgggcctc ttcttgcagt gcgccatcag 1020 ggtgcagcgc ttcggaaccc gggcggtgta 1080 tgccggcgcc acctgcctct ctcactcggt 1140 cgggttcacc ttctctgccc tgcagattct 1200 cgagaaacag gtgtttctcc ccaagtacag 1260 cagcctcatg acctccttcc tgcctggccc 1320 cgtgggcgcc ggcgggagtg ggctcctgcc 1380 ctgcgacgtg agcgtgcgcg tggtggtggg 1440 cagaggcatt tgtctggacc tggccatcct 1500 cccgtccctc ttcatgggct ctatcgtcca 1560 gtccgctgct ggactgggct tggtggctat 1620 gagcgacctg gccaaatact ccgcctgact 1680 1688

<210> 22 <211> 1688 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> P501S humano de codão optimizado <400> 22 gacggctagc gccaccatgg tgcagcggct ggcccagttg ctgctggtga acctgctgac gatcacgtac gtgccccccc tgctgctgga ggtgctgggc atcggccccg tcctgggcct cgatcattgg cggggccgct acggccgccg catcctgctc tctctcttcc tgatcccccg cgacccccgc cctctggagc tggccctcct cggccaggtg tgtttcactc ccctggaggc ccactgtagg caggcttaca gcgtgtacgc ctatctgctg cccgctatcg actgggacac ggaggagtgc ctgttcggcc tgctcacctt gctggtggcc gaggaggcgg ccctggggcc cagcctgagc ccccattgct gcccgtgcag tttgctgccc cgcctgcatc agctgtgctg cgtcgctgag ctctgttcct ggatggccct cgtgggggag ggcctgtacc agggcgtgcc gtgggtgtcc cggctgctgc gccatagaaa 60 tttcggactg gaggtgtgcc tggctgccgg 120 ggtgggcgtg gaggagaagt tcatgacaat 180 cgtgtgtgtg cccctcctcg ggagtgcgtc 240 cagaccgttc atctgggccc tgagcctggg 300 ggccggctgg ctggccggcc tgctgtgtcc 360 gatcctgggc gtgggcctgc tggacttctg 420 tctgctctcc gacctcttcc gcgaccccga 480 cttcatgatc agtctggggg gatgcctggg 540 cagcgccctg gccccctacc tggggactca 600 gatcttcctg acgtgcgtcg ccgccaccct 660 caccgagccc gccgagggcc tgagcgctcc 720 ggctaggctc gccttcagga atctgggcgc 780 tcgcatgcct cgcaccctgc gccgcctgtt 840 gatgacgttc accctcttct acaccgactt 900 cagggccgag cccggcaccg aggctaggcg 960 122 ccattacgac gagggcgtca ggatgggctc tctggtgttc tctctggtga tggaccggct cctcgcctct gtggcggctt tccccgtcgc cgccgtggtg accgccagcg ccgccctgac gccctacacc ctggcgtctc tgtaccatcg cggggacaca gggggagctt cctctgagga caagccgggg gcccctttcc ccaacggcca tccccccccc gccctgtgcg gcgctagtgc ggagcccacc gaggctaggg tcgtgcctgg cgactccgcc ttcctgctct cccaggtggc gctgagccag agcgtgaccg cctacatggt ctactttgcc acccaggtcg tgttcgacaa cgaggcag

<210> 23 <211> 435 <212> ADN <213> Sequência Artificial tctgggcctc ttcctgcagt gcgccatcag 1020 ggtgcagcgc ttcggcaccc gggccgtgta 1080 cgccggcgcg acctgcctgt ctcattctgt 1140 cggcttcacc ttcagtgcgc tccagattct 1200 cgagaagcag gtgttcctgc ccaagtaccg 1260 cagcctgatg accagcttct tgcccggccc 1320 tgtcggggcg ggcggcagcg gcctgctccc 1380 ctgcgacgtg agcgtgcggg tggtggtggg 1440 ccgggggatc tgcctggacc tggccatcct 1500 gcccagcctg ttcatgggca gtatcgtgca 1560 gagcgccgcc ggcctggggt tggtggccat 1620 gagcgatctc gccaagtata gcgcctgact 1680 1688 <220> <223> Gene híbrido entre C-LytA de St. pneum., epitopo P2 de auxiliar T e uma pequena porção da extremidade 5' de P501S humano <400> 23 atggcggccg cttacgtaca aatggcactt ggtactactt cacacagacg gcaactggta aaaatcgctg ataagtggta aagtacaagg acacttggta gctaactcta agttcattgg tcagcggacg gaacaggctg gaaaagttca tgtac ttccgacggc tcttatccaa aagacaagtt tgagaaaatc 60 tgacagttca ggctatatgc ttgcagaccg ctggaggaag 120 ctggttcgac aactcaggcg aaâtggctac aggctggaag 180 ctatttcaac gaagaaggtg ccatgaagac aggctgggtc 240 ctacttagac gctaaagaag gcgccatgca atacatcaag 300 tatcactgaa ggcgtcatgg tatcaaatgc ctttatccag 360 gtactacctc aaaccagacg gaacactggc agacaggcca 420 435

<210> 24 <211> 435 <212> ADN <213> Sequência Artificial 123 <22 0> <223> Gene híbrido entre C-LytA de St. pneum., epitopo P2 de auxiliar T e uma pequena porção da extremidade 5' de P501S humano - codão optimizado <400> 24 cctacgtgca tagcgacggg agctacccca aggacaagtt cgagaagatc 60 ggtactactt cgactcctcc ggctacatgc tcgccgaccg ctggcggaag 120 gcaactggta ctggttcgat aactcgggag agatggccac cggctggaag 180 acaagtggta ctatttcaac gaggagggcg ccatgaagac cggctgggtg 240 acacctggta ctacctcgac gccaaggagg gcgccatgca gtatatcaag 300 agttcatcgg catcaccgag ggagtgatgg tcagcaacgc ctttatccag 360 gcaccggatg gtactacttg aagccggacg gcaccctcgc ggatcggccc 420 tgtac 435 atggccgccg aacgggacat cacaccgacg aa#tcgcgg aagtataagg gccaacagca agcgccgacg gagaagttca <210> 25 <211> 435 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Gene híbrido entre C-LytA de St. pneum., epitopo P2 de auxiliar T e uma pequena porção da extremidade 5' de P501S humano - codão optimizado <400> 25 atggccgccg cctacgtgca cagcgacggg tcctacccaa aggacaagtt cgagaagatc 60 aacggcacgt ggtactattt cgacagcagc ggctacatgc tcgccgatcg ctggcgcaag 120 cacaccgacg ggaactggta ctggttcgac aactctggcg agatggctac ggggtggaag 180 aagatcgccg acaagtggta ctacttcaac gaggagggcg ccatgaagac cgggtgggtg 240 aagtacaagg acacctggta ctacctggac gctaaggagg gcgccatgca gtacatcaag 300 gccaactcga agttcatcgg gatcaccgag ggcgtgatgg tcagtaacgc tttcatccag 360 agcgcggacg gcacaggctg gtattacctg aagcccgatg gcaccctggc ggacagacct 420 gagaaattca tgtac 435 124

<210> 26 <211> 464 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Gene híbrido entre C-LytA de St. pneum., epitopo P2 de auxiliar T e uma pequena porção da extremidade 5' de P501S humano - codão optimizado <400> 26 gacggctagc gccaccatgg ccgccgccta cgtgcatagc gacgggagct accccaagga 60 caagttcgag aagatcaacg ggacatggta ctacttcgac tcctccggct acatgctcgc 120 cgaccgctgg cggaagcaca ccgacggcaa ctggtactgg ttcgataact cgggagagat 180 ggccaccggc tggaagaaga tcgcggacaa gtggtactat ttcaacgagg agggcgccat 240 gaagaccggc tgggtgaagt ataaggacac ctggtactac ctcgacgcca aggagggcgc 300 catgcagtat atcaaggcca acagcaagtt catcggcatc accgagggag tgatggtcag 360 caacgccttt atccagagcg ccgacggcac cggatggtac tacttgaagc cggacggcac 420 cctcgcggat cggcccgaga agttcatgta ctgactcgag gcag 464

<210> 27 <211> 652 <212> PRT <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Proteína híbrida entre C-LytA de St. pneum., epitopo P2 de auxiliar T e aminoácidos 51-553 de P501S humano <400> 27

Met Ala Ala Ala Tyr Vai His Ser Asp Gly Ser Tyr Pro Lys Asp Lys 1 5 10 15 Phe Glu Lys Ile Asn Gly Thr Trp Tyr Tyr Phe Asp Ser Ser Gly Tyr 20 25 30 Met Leu Ala Asp Arg Trp Arg Lys His Thr Asp Gly Asn Trp Tyr Trp 35 40 45 Phe Asp Asn Ser Gly Glu Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys Ile Ala Asp 50 55 60 125

Lys Trp Tyr Tyr Phe Asn Glu Glu Gly Ala Met Lys Thr Gly Trp Val 65 70 75 80 Lys Tyr Lys Asp Thr Trp Tyr Tyr Leu Asp Ala Lys Glu Gly Ala Met 85 90 95 Gin Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Gly Val 100 105 110 Met Vai Ser Asn Ala Phe Ile Gin Ser Ala Asp Gly Thr Gly Trp Tyr 115 120 125 Tyr Leu Lys Pro Asp Gly Thr Leu Ala Asp Arg Pro Glu Lys Phe Met 130 135 140 Tyr Met Vai Leu Gly Ile Gly Pro Val Leu Gly Leu Val Cys Val Pro 145 150 155 160 Leu Leu Gly Ser Ala Ser Asp His Trp Arg Gly Arg Tyr Gly Arg Arg 165 170 175 Arg Pro Phe Ile Trp Ala Leu Ser Leu Gly Ile Leu Leu Ser Leu Phe 180 185 190 Leu Ile Pro Arg Ala Gly Trp Leu Ala Gly Leu Leu Cys Pro Asp Pro 195 200 205 Arg Pro Leu Glu Leu Ala Leu Leu Ile Leu Gly Val Gly Leu Leu Asp 210 215 220 Phe Cys Gly Gin Vai Cys Phe Thr Pro Leu Glu Ala Leu Leu Ser Asp 225 230 235 240 Leu Phe Arg Asp Pro Asp His Cys Arg Gin Ala Tyr Ser Val Tyr Ala 245 250 255 Phe Met Ile Ser Leu Gly Gly Cys Leu Gly Tyr Leu Leu Pro Ala Ile 260 265 270 Asp Trp Asp Thr Ser Ala Leu Ala Pro Tyr Leu Gly Thr Gin Glu Glu 275 280 285 Cys Leu Phe Gly Leu Leu Thr Leu Ile Phe Leu Thr Cys Val Ala Ala 290 295 300 Thr Leu Leu Vai Ala Glu Glu Ala Ala Leu Gly Pro Thr Glu Pro Ala 305 310 315 320 Glu Gly Leu Ser Ala Pro Ser Leu Ser Pro His Cys Cys Pro Cys Arg 325 330 335 Ala Arg Leu Ala Phe Arg Asn Leu Gly Ala Leu Leu Pro Arg Leu His 340 345 350 Gin Leu Cys Cys Arg Met Pro Arg Thr Leu Arg Arg Leu Phe Val Ala 355 360 365 Glu Leu Cys Ser Trp Met Ala Leu Met Thr Phe Thr Leu Phe Tyr Thr 370 375 380 Asp Phe Vai Gly Glu Gly Leu Tyr Gin Gly Val Pro Arg Ala Glu Pro 385 390 395 400 Gly Thr Glu Ala Arg Arg His Tyr Asp Glu Gly Val Arg Met Gly Ser 405 410 415 Leu Gly Leu Phe Leu Gin Cys Ala Ile Ser Leu Val Phe Ser Leu Val 420 425 430 Met Asp Arg Leu Vai Gin Arg Phe Gly Thr Arg Ala Val Tyr Leu Ala 435 440 445 Ser Vai Ala Ala Phe Pro Val Ala Ala Gly Ala Thr Cys Leu Ser His 450 455 460 Ser Vai Ala Vai val Thr Ala Ser Ala Ala Leu Thr Gly Phe Thr Phe 465 470 475 480 Ser Ala Leu Gin Ile Leu Pro Tyr Thr Leu Ala Ser Leu Tyr His Arg 485 490 495 126

GlU Lys Gin Val Phe Leu Pro Lys Tyr Arg Gly Asp Thr Gly Gly Ala 500 505 510 Ser Ser Glu Asp Ser Leu Met Thr Ser Phe Leu Pro Gly Pro Lys Pro 515 520 525 Gly Ala Pro Phe Pro Aan Gly His Val Gly Ala Gly Gly Ser Gly Leu 530 535 540 Leu Pro Pro Pro Pro Ala Leu Cys Gly Ala Ser Ala Cys Asp Val Ser 545 550 555 560 Vai Arg val val Val Gly Glu Pro Thr Glu Ala Arg Val Val Pro Gly 565 570 575 Arg Gly lie Cys Leu Asp Leu Ala Ile Leu Asp Ser Ala Phe Leu Leu 580 585 590 Ser Gin Val Ala Pro Ser Leu Phe Met Gly Ser Ile Val Gin Leu Ser 595 600 605 Gin Ser Val Thr Ala Tyr Met Val Ser Ala Ala Gly Leu Gly Leu Val 610 615 620 Ala Ile Tyr Phe Ala Thr Gin Val Val Phe Asp Lys Ser Asp Leu Ala 625 630 635 640 Lys Tyr Ser Ala Gly Gly His His His His His His 645 650

<210> 28 <211> 1959 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> ADN codificando a proteína híbrida entre C-LytA de St. pneum., epitopo P2 de auxiliar T e aminoácidos 51-553 de P501S humano <400> 28 atggcggccg cttacgtaca ttccgacggc tcttatccaa aagacaagtt tgagaaaatc 60 aatggcactt ggtactactt tgacagttca ggctatatgc ttgcagaccg ctggaggaag 120 cacacagacg gcaactggta ctggttcgac aactcaggcg aaatggctac aggctggaag 180 aaaatcgctg ataagtggta ctatttcaac gaagaaggtg ccatgaagac aggctgggtc 240 aagtacaagg acacttggta ctacttagac gctaaagaag gcgccatgca atacatcaag 300 gctaactcta agttcattgg tatcactgaa ggcgtcatgg tatcaaatgc ctttatccag 360 tcagcggacg gaacaggctg gtactacctc aaaccagacg gaacactggc agacaggcca 420 gaaaagttca tgtacatggt gctgggcatt ggtccagtgc tgggcctggt ctgtgtcccg 480 ctcctaggct cagccagtga ccactggcgt ggacgctatg gccgccgccg gcccttcatc 540 tgggcactgt ccttgggcat cctgctgagc ctctttctca tcccaagggc cggctggcta 600 127 gcagggctgc tgtgcccgga tcccaggccc ctggagctgg cactgctcat cctgggcgtg 660 gggctgctgg acttctgtgg ccaggtgtgc ttcactccac tggaggccct gctctctgac 720 ctcttccggg acccggacca ctgtcgccag gcctactctg tctatgcctt catgatcagt 780 cttgggggct gcctgggcta cctcctgcct gccattgact gggacaccag tgccctggcc 840 ccctacctgg gcacccagga ggagtgcctc tttggcctgc tcaccctcat cttcctcacc 900 tgcgtagcag ccacactgct ggtggctgag gaggcagcgc tgggccccac cgagccagca 960 gaagggctgt cggccccctc cttgtcgccc cactgctgtc catgccgggc ccgcttggct 1020 ttccggaacc tgggcgccct gcttccccgg ctgcaccagc tgtgctgccg catgccccgc 1080 accctgcgcc ggctcttcgt ggctgagctg tgcagctgga tggcactcat gaccttcacg 1140 ctgttttaca cggatttcgt gggcgagggg ctgtaccagg gcgtgcccag agctgagccg 1200 ggcaccgagg cccggagaca ctatgatgaa ggcgttcgga tgggcagcct ggggctgttc 1260 ctgcagtgcg ccatctccct ggtcttctct ctggtcatgg accggctggt gcagcgattc 1320 ggcactcgag cagtctattt ggccagtgtg gcagctttcc ctgtggctgc cggtgccaca 1380 tgcctgtccc acagtgtggc cgtggtgaca gcttcagccg ccctcaccgg gttcaccttc 1440 tcagccctgc agatcctgcc ctacacactg gcctccctct accaccggga gaagcaggtg 1500 ttcctgccca aataccgagg ggacactgga ggtgctagca gtgaggacag cctgatgacc 1560 agcttcctgc caggccctaa gcctggagct cccttcccta atggacacgt gggtgctgga 1620 ggcagtggcc tgctcccacc tccacccgcg ctctgcgggg cctctgcctg tgatgtctcc 1680 gtacgtgtgg tggtgggtga gcccaccgag gccagggtgg ttccgggccg gggcatctgc 1740 ctggacctcg ccatcctgga tagtgccttc ctgctgtccc aggtggcccc atccctgttt 1800 atgggctcca ttgtccagct cagccagtct gtcactgcct atatggtgtc tgccgcaggc 1860 ctgggtctgg tcgccattta ctttgctaca caggtagtat ttgacaagag cgacttggcc 1920 aaatactcag cgggtggaca ccatcaccat caccattaa 1959 <210> 29 <211> 507

<212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> P501S humano (aminoácidos 55-553) fundido a 6 resíduos de histidina <400> 29

Met Vai Leu Gly Ile Gly Pro Vai Leu Gly Leu Vai Cys Vai Pro Leu 15 10 15

Leu Gly Ser Ala Ser Asp His Trp Arg Gly Arg Tyr Gly Arg Arg Arg 20 25 30

Pro Phe lie Trp Ala Leu Ser Leu Gly He Leu Leu Ser Leu Phe Leu 35 40 45

Ile Pro Arg Ala Gly Trp Leu Ala Gly Leu Leu Cys Pro Asp Pro Arg 50 55 60

Pro Leu Glu Leu Ala Leu Leu Ile Leu Gly vai Gly Leu Leu Asp Phe 65 70 75 80 128

Cys Gly Gin Val Cys Phe Thr Pro Leu Glu Ala Leu Leu Ser Asp Leu 85 90 95 Phe Arg Asp Pro Asp His Cys Arg Gin Ala Tyr Ser Val Tyr Ala Phe 100 105 110 Met Ile Ser Leu Gly Gly Cys Leu Gly Tyr Leu Leu Pro Ala Ile Asp 115 120 125 Trp Asp Thr Ser Ala Leu Ala Pro Tyr Leu Gly Thr Gin Glu Glu Cys 130 135 140 Leu Phe Gly Leu Leu Thr Leu Ile Phe Leu Thr cys val Ala Ala Thr 145 150 155 160 Leu Leu Val Ala Glu Glu Ala Ala Leu Gly Pro Thr Glu Pro Ala Glu 165 170 175 Gly Leu Ser Ala Pro Ser Leu Ser Pro His Cys Cys Pro Cys Arg Ala 180 185 190 Arg Leu Ala Phe Arg Asn Leu Gly Ala Leu Leu Pro Arg Leu His Gin 195 200 205 Leu Cys Cys Arg Met Pro Arg Thr Leu Arg Arg Leu Phe Val Ala Glu 210 215 220 Leu Cys Ser Trp Met Ala Leu Met Thr Phe Thr Leu Phe Tyr Thr Asp 225 230 235 240 Phe Vai Gly Glu Gly Leu Tyr Gin Gly Val Pro Arg Ala Glu Pro Gly 245 250 255 Thr Glu Ala Arg Arg His Tyr Asp Glu Gly Val Arg Met Gly Ser Leu 260 265 270 Gly Leu Phe Leu Gin Cys Ala Ile Ser Leu Val Phe Ser Leu Val Met 275 280 285 Asp Arg Leu Val Gin Arg Phe Gly Thr Arg Ala Val Tyr Leu Ala Ser 290 295 300 Val Ala Ala Phe Pro Val Ala Ala Gly Ala Thr Cys Leu Ser His Ser 305 310 315 320 Val Ala Val val Thr Ala Ser Ala Ala Leu Thr Gly Phe Thr Phe Ser 325 330 335 Ala Leu Gin Ile Leu Pro Tyr Thr Leu Ala Ser Leu Tyr His Arg Glu 340 345 350 Lys Gin Val Phe Leu Pro Lye Tyr Arg Gly Asp Thr Gly Gly Ala Ser 355 360 365 Ser Glu Asp Ser Leu Met Thr Ser Phe Leu Pro Gly Pro Lys Pro Gly 370 375 380 Ala Pro Phe Pro Asn Gly His Val Gly Ala Gly Gly Ser Gly Leu Leu 385 390 395 400 Pro Pro Pro Pro Ala Leu Cys Gly Ala Ser Ala Cys Asp Val Ser Val 405 410 415 Arg Val Val Val Gly Glu Pro Thr Glu Ala Arg Val Val Pro Gly Arg 420 425 430 Gly Ile Cys Leu Asp Leu Ala Ile Leu Asp Ser Ala Phe Leu Leu Ser 435 440 445

Gin Val Ala Pro Ser Leu Phe Met Gly Ser Ile Val Gin Leu Ser Gin 450 455 460 Ser Val Thr Ala Tyr Met Val Ser Ala Ala Gly Leu Gly Leu Val Ala 465 470 475 480 Ile Tyr Phe Ala Thr Gin Val Val Phe Asp Lys Ser Asp Leu Ala Lys 485 490 495 Tyr Ser Ala Gly Gly His His His His His His 500 505 129

<210> 30 <211> 1524 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0> <223> ADN codificando P501S humano (aminoácidos 55-553) fundido a 6 resíduos de histidina <400> 30 atggtgctgg gcattggtcc agtgctgggc ctggtctgtg tcccgctcct aggctcagcc 60 agtgaccact ggcgtggacg ctatggccgc cgccggccct tcatctgggc actgtccttg 120 ggcatcctgc tgagcctctt tctcatccca agggccggct ggctagcagg gctgctgtgc 180 ccggatccca ggcccctgga gctggcactg ctcatcctgg gcgtggggct gctggacttc 240 tgtggccagg tgtgcttcac tccactggag gccctgctct ctgacctctt ccgggacccg 300 gaccactgtc gccaggccta ctctgtctat gccttcatga tcagtcttgg gggctgcctg 360 ggctacctcc tgcctgccat tgactgggac accagtgccc tggcccccta cctgggcacc 420 caggaggagt gcctctttgg cctgctcacc ctcatcttcc tcacctgcgt agcagccaca 480 ctgctggtgg ctgaggaggc agcgctgggc cccaccgagc cagcagaagg gctgtcggcc 540 ccctccttgt cgccccactg ctgtccatgc cgggcccgct tggctttccg gaacctgggc 600 gccctgcttc cccggctgca ccagctgtgc tgccgcatgc cccgcaccct gcgccggctc 660 ttcgtggctg agctgtgcag ctggatggca ctcatgacct tcacgctgtt ttacacggat 720 ttcgtgggcg aggggctgta ccagggcgtg cccagagctg agccgggcac cgaggcccgg 780 agacactatg atgaaggcgt tcggatgggc agcctggggc tgttcctgca gtgcgccatc 840 tccctggtct tctctctggt catggaccgg ctggtgcagc gattcggcac tcgagcagtc 900 tatttggcca gtgtggcagc tttccctgtg gctgccggtg ccacatgcct gtcccacagt 960 gtggccgtgg tgacagcttc agccgccctc accgggttca ccttctcagc cctgcagatc 1020 ctgccctaca cactggcctc cctctaccac cgggagaagc aggtgttcct gcccaaatac 1080 cgaggggaca ctggaggtgc tagcagtgag gacagcctga tgaccagctt cctgccaggc 1140 cctaagcctg gagctccctt ccctaatgga cacgtgggtg ctggaggcag tggcctgctc 1200 ccacctccac ccgcgctctg cggggcctct gcctgtgatg tctccgtacg tgtggtggtg 1260 ggtgagccca ccgaggccag ggtggttccg ggccggggca tctgcctgga cctcgccatc 1320 ctggatagtg ccttcctgct gtcccaggtg gccccatccc tgtttatggg ctccattgtc 1380 cagctcagcc agtctgtcac tgcctatatg gtgtctgccg caggcctggg tctggtcgcc 1440 atttactttg ctacacaggt agtatttgac aagagcgact tggccaaata ctcagcgggt 1500 ggacaccatc accatcacca ttaa 1524

<210> 31 <211> 685 <212> PRT <213> Sequência Artificial 130 <22 0> <223> P501S humano (aminoácidos 1-34 fundidos a 55-553) fundido a 6 resíduos de histidina < 4 0 0 > 31

Met Ala Ala vai Gin Arg Leu Trp Vai Ser Arg Leu Leu Arg His Arg 1 5 10 15 Lys Ala Gin Leu Leu Leu Vai Asn Leu Leu Thr Phe Gly Leu Glu Vai 20 25 30 Cys Leu Ala Ala Ala Tyr Vai His Ser Asp Gly Ser Tyr Pro Lys Asp 35 40 45 Lys Phe Glu Lys Ile Asn Gly Thr Trp Tyr Tyr Phe Asp Ser Ser Gly 50 55 60 Tyr Met Leu Ala Asp Arg Trp Arg Lys His Thr Asp Gly Asn Trp Tyr 65 70 75 80 Trp Phe Asp Asn Ser Gly Glu Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys Ile Ala 85 90 95 Asp Lys Trp Tyr Tyr Phe Asn Glu Glu Gly Ala Met Lys Thr Gly Trp 100 105 110 Vai Lys Tyr Lys Asp Thr Trp Tyr Tyr Leu Asp Ala Lys Glu Gly Ala 115 120 125 Met Gin Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Gly 130 135 140 Vai Met Vai Ser Asn Ala Phe Ile Gin Ser Ala Asp Gly Thr Gly Trp 145 ISO 155 160 Tyr Tyr Leu Lys Pro Asp Gly Thr Leu Ala Asp Arg Pro Glu Lys Phe 165 170 175 Met Tyr Met Vai Leu Gly Ile Gly Pro Vai Leu Gly Leu Vai Cys Vai 180 185 190 Pro Leu Leu Gly Ser Ala Ser Asp His Trp Arg Gly Arg Tyr Gly Arg 195 200 205 Arg Arg Pro Phe Ile Trp Ala Leu Ser Leu Gly Ile Leu Leu Ser Leu 210 215 220 Phe Leu Ile Pro Arg Ala Gly Trp Leu Ala Gly Leu Leu Cys Pro Asp 225 230 235 240 Pro Arg Pro Leu Glu Leu Ala Leu Leu Ile Leu Gly Vai Gly Leu Leu 245 250 255 Asp Phe Cys Gly Gin Vai Cys Phe Thr Pro Leu Glu Ala Leu Leu Ser 260 265 270 Asp Leu Phe Arg Asp Pro Asp His Cys Arg Gin Ala Tyr Ser Vai Tyr 275 280 285 Ala Phe Met Ile Ser Leu Gly Gly Cys Leu Gly Tyr Leu Leu Pro Ala 290 295 300 Ile Asp Trp Asp Thr Ser Ala Leu Ala Pro Tyr Leu Gly Thr Gin Glu 305 310 315 320 Glu Cys Leu Phe Gly Leu Leu Thr Leu Ile Phe Leu Thr Cys Vai Ala 325 330 335 Ala Thr Leu Leu Vai Ala Glu Glu Ala Ala Leu Gly Pro Thr Glu Pro 340 345 350 131

Alã GlU Gly Leu Ser Ala Pro Ser Leu Ser Pro His Cys Cys Pro Cys 355 360 365 Arg Ala Arg Leu Ala Phe Arg Asn Leu Gly Ala Leu Leu Pro Arg Leu 370 375 380 His Gin Leu Cys Cys Arg ttet Pro Arg Thr Leu Arg Arg Leu Phe Val 385 390 395 400 Ala Glu Leu Cys Ser Trp Met Ala Leu Met Thr Phe Thr Leu Phe Tyr 405 410 415 Thr Asp Phe Val Gly Glu Gly Leu Tyr Gin Gly Val Pro Arg Ala Glu 420 42S 430 Pro Gly "thr Glu Alá Arg Arg Mi® Tyr Asp Glu Gly Vai Arg Mét Gly 435 440 445 Ser Leu Gly Leu Phe Leu Gin Cys Ala lie Ser Leu Val Phe Ser Leu 450 45S 460 Vai «et Asp Arg Leu Val Gin Arg Phe Gly Thr Arg Alá Val Tyr Leu 465 470 47S 480 Ala Ser Vai Ala Ala Phe Pro Val Ala Ala Gly Ala Thr Cys Leu Ser 485 490 495 Mie Ser Vai Ala Val Val Thr Ala Ser Ala Ala Leu Thr Gly Phe Thr 500 505 510 Phe $«r Ãlâ Leu Gin Ile Leu Pro Tyr Thr Leu Ala Ser Leu. Tyr Ris 515 520 525 Arg Glu Lys Gin Val Phe Leu Pro Lys Tyr Arg Gly Asp Thr Gly Gly 530 535 540 Ala Ser Ser Glu Asp Ser Leu Met Thr Ser Phe Leu Pro Gly Pro Lys 545 550 555 560 Pro Gly Ala Pro Phe Pro Asn Gly His Val Gly Ala Gly Gly Ser Gly 565 570 575 Leu Leu Pro Pro Pro Pro Ala Leu Cys Gly Ala Ser Ala Cys Asp Val 580 585 590 Ser Vai Arg Val Val Val Gly Glu Pro Thr Glu Ala Arg Val val Pro 595 600 605 Gly Arg Gly Ile Cys Leu Asp Leu Ala Ile Leu Asp Ser Ala Phe Leu 610 615 620 Leu Ser Gin Val Ala Pro Ser Leu Phe Met Gly Ser Ile Val Gin Leu 625 630 635 640 Ser Gin Ser Val Thr Ala Tyr Met Val Ser Ala Ala Gly Leu Gly Leu 645 650 655 Vai Ala Ile Tyr Phe Ala Thr Gin Val Val Phe Asp Lys Ser Asp Leu 660 665 670 Ala Lys Tyr Ser Ala Gly Gly His His His His His His 675 680 685

<210> 32 <211> 2058 <212> ADN <213> Sequência Artificial 132 <2 2 Ο > <223> ADN codificando P501S humano (aminoácidos 1-34 fundidos a 55-553) fundido a 6 resíduos de histidina <400> 32 atggcggccg tgcagaggct atgggtatcg ttgttggtta acttgttgac cttcgggctg tccgacggct cttatccaaa agacaagttt gacagttcag gctatatgct tgcagaccgc tggttcgaca actcaggcga aatggctaca tatttcaacg aagaaggtgc catgaagaca tacttagacg ctaaagaagg cgccatgcaa atcactgaag gcgtcatggt atcaaatgcc tactacctca aaccagacgg aacactggca ctgggcattg gtccagtgct gggcctggtc cactggcgtg gacgctatgg ccgccgccgg ctgctgagcc tctttctcat cccaagggcc cccaggcccc tggagctggc actgctcatc caggtgtgct tcactccact ggaggccctg tgtcgccagg cctactctgt ctatgccttc ctcctgcctg ccattgactg ggacaccagt gagtgcctct ttggcctgct caccctcatc gtggctgagg aggcagcgct gggccccacc ttgtcgcccc actgctgtcc atgccgggcc cttccccggc tgcaccagct gtgctgccgc gctgagctgt gcagctggat ggcactcatg ggcgaggggc tgtaccaggg cgtgcccaga tatgatgaag gcgttcggat gggcagcctg gtcttctctc tggtcatgga ccggctggtg gccagtgtgg cagctttccc tgtggctgcc gtggtgacag cttcagccgc cctcaccggg tacacactgg cctccctcta ccaccgggag gacactggag gtgctagcag tgaggacagc cctggagctc ccttccctaa tggacacgtg ccacccgcgc tctgcggggc ctctgcctgt cccaccgagg ccagggtggt tccgggccgg agtgccttcc tgctgtccca ggtggcccca agccagtctg tcactgccta tatggtgtct tttgctacac aggtagtatt tgacaagagc catcaccatc accattaa <210> 33 <211> 671

<212> PRT <213> Sequência Artificial agactgctaa gacaccgcaa agctcagttg 60 gaagtctgtt tggcggccgc ttacgtacat 120 gagaaaatca atggcacttg gtactacttt 180 tggaggaagc acacagacgg caactggtac 240 ggctggaaga aaatcgctga taagtggtac 300 ggctgggtca agtacaagga cacttggtac 360 tacatcaagg ctaactctaa gttcattggt 420 tttatccagt cagcggacgg aacaggctgg 480 gacaggccag aaaagttcat gtacatggtg 540 tgtgtcccgc tcctaggctc agccagtgac 600 cccttcatct gggcactgtc cttgggcatc 660 ggctggctag cagggctgct gtgcccggat 720 ctgggcgtgg ggctgctgga cttctgtggc 780 ctctctgacc tcttccggga cccggaccac 840 atgatcagtc ttgggggctg cctgggctac 900 gccctggccc cctacctggg cacccaggag 960 ttcctcacct gcgtagcagc cacactgctg 1020 gagccagcag aagggctgtc ggccccctcc 1080 cgcttggctt tccggaacct gggcgccctg 1140 atgccccgca ccctgcgccg gctcttcgtg 1200 accttcacgc tgttttacac ggatttcgtg 1260 gctgagccgg gcaccgaggc ccggagacac 1320 gggctgttcc tgcagtgcgc catctccctg 1380 cagcgattcg gcactcgagc agtctatttg 1440 ggtgccacat gcctgtccca cagtgtggcc 1500 ttcaccttct cagccctgca gatcctgccc 1560 aagcaggtgt tcctgcccaa ataccgaggg 1620 ctgatgacca gcttcctgcc aggccctaag 1680 ggtgctggag gcagtggcct gctcccacct 1740 gatgtctccg tacgtgtggt ggtgggtgag 1800 ggcatctgcc tggacctcgc catcctggat 1860 tccctgttta tgggctccat tgtccagctc 1920 gccgcaggcc tgggtctggt cgccatttac 1980 gacttggcca aatactcagc gggtggacac 2040 2058 133 <220> <223> Porção C-LytA de St. pneum. fundida ao epitopo P2 de auxiliar T fundido a P501S humano (aminoácidos 55-553) fundido a 6 resíduos de histidina a jusante de sequência sinal alfa pré-pró de levedura <400> 33

Met Ala Ala Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Vai Leu Phe Ala Ala 1 5 10 15 Ser Ser Ala Leu Ala Ala Ala Tyr Vai His Ser Asp Gly Ser Tyr Pro 20 25 30 Lys Asp Lys Phe Glu Lys Ile Asn Gly Thr Trp Tyr Tyr Phe Asp Ser 35 40 45 Ser Gly Tyr Met Leu Ala Asp Arg Trp Arg Lys His Thr Asp Gly Asn 50 55 60 Trp Tyr Trp Phe Asp Asn Ser Gly Glu Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys 65 70 75 80 Ile Ala Asp Lys Trp Tyr Tyr Phe Asn Glu Glu Gly Ala Met Lys Thr 85 90 95 Gly Trp Vai Lys Tyr Lys Asp Thr Trp Tyr Tyr Leu Asp Ala Lys Glu 100 105 110 Gly Ala Met Gin Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr 115 120 125 Glu Gly Vai Met Vai Ser Asn Ala Phe Ile Gin Ser Ala Asp Gly Thr 130 135 140 Gly Trp Tyr Tyr Leu Lys Pro Asp Gly Thr Leu Ala Asp Arg Pro Glu 145 150 155 160 Lys Phe Met Tyr Met Vai Leu Gly Ile Gly Pro Vai Leu Gly Leu Vai 165 170 175 Cys Vai Pro Leu Leu Gly Ser Ala Ser Asp His Trp Arg Gly Arg Tyr 180 185 190 Gly Arg Arg Arg Pro Phe Ile Trp Ala Leu Ser Leu Gly Ile Leu Leu 195 200 205 Ser Leu Phe Leu ile Pro Arg Ala Gly Trp Leu Ala Gly Leu Leu Cys 210 215 220 Pro Asp Pro Arg Pro Leu Glu Leu Ala Leu Leu Ile Leu Gly Vai Gly 225 230 235 240 Leu Leu Asp Phe Cys Gly Gin Vai Cys Phe Thr Pro Leu Glu Ala Leu 245 250 255 Leu Ser Asp Leu Phe Arg Asp Pro Asp His Cys Arg Gin Ala Tyr Ser 260 265 270 Vai Tyr Ala Phe Met Ile Ser Leu Gly Gly Cys Leu Gly Tyr Leu Leu 275 280 285 Pro Ala Ile Asp Trp Asp Thr Ser Ala Leu Ala Pro Tyr Leu Gly Thr 290 295 300 Gin Glu Glu Cys Leu Phe Gly Leu Leu Thr Leu Ile Phe Leu Thr Cys 305 310 315 320 Vai Ala Ala Thr Leu Leu Vai Ala Glu Glu Ala Ala Leu Gly Pro Thr 134 325 330 335 Glu Pro Ala Glu Gly Leu Ser Ala Pro Ser Leu Ser Pro His Cys Cys 340 345 350 Pro Cys Arg Ala Arg Leu Ala Phe Arg Asn Leu Gly Ala Leu Leu Pro 355 360 365 Arg Leu His Gin Leu cys Cys Arg Met Pro Arg Thr Leu Arg Arg Leu 370 375 380 Phe Vai Ala Glu Leu Cys Ser Trp Met Ala Leu Met Thr Phe Thr Leu 385 390 395 400 Phe Tyr Thr Aep Phe Vai Gly Glu Gly Leu Tyr Gin Gly Vai Pro Arg 405 410 415 Ala Glu Pro Gly Thr Glu Ala Arg Arg His Tyr Asp Glu Gly Vai Arg 420 425 430 Met Gly Ser Leu Gly Leu Phe Leu Gin Cys Ala Ile Ser Leu Vai Phe 435 440 445 Ser Leu Vai Met Asp Arg Leu Vai Gin Arg Phe Gly Thr Arg Ala Vai 450 455 460 Tyr Leu Ala Ser Vai Ala Ala Phe Pro Vai Ala Ala Gly Ala Thr Cys 465 470 475 480 Leu Ser His Ser Vai Ala Vai Vai Thr Ala Ser Ala Ala Leu Thr Gly 485 490 495 Phe Thr Phe Ser Ala Leu Gin Ile Leu Pro Tyr Thr Leu Ala Ser Leu 500 505 510 Tyr His Arg Glu Lys Gin Vai Phe Leu Pro Lys Tyr Arg Gly Asp Thr 515 520 525 Gly Gly Ala Ser Ser Glu Asp Ser Leu Met Thr Ser Phe Leu Pro Gly 530 535 540 Pro Lys Pro Gly Ala Pro Phe Pro Asn Gly His Vai Gly Ala Gly Gly 545 550 555 560 Ser Gly Leu Leu Pro Pro Pro Pro Ala Leu Cys Gly Ala Ser Ala Cys 565 570 575 Asp Vai Ser Vai Arg Vai Vai Vai Gly Glu Pro Thr Glu Ala Arg Vai 580 585 590 Vai Pro Gly Arg Gly Ile Cys Leu Asp Leu Ala Ile Leu Asp Ser Ala 595 600 605 Phe Leu Leu Ser Gin Vai Ala Pro Ser Leu Phe Met Gly Ser Ile Vai 610 615 620 Gin Leu Ser Gin Ser Vai Thr Ala Tyr Met Vai Ser Ala Ala Gly Leu 625 630 635 640 Gly Leu Vai Ala lie Tyr Phe Ala Thr Gin Vai Vai Phe Asp Lys Ser 645 650 655 Asp Leu Ala Lys Tyr Ser Ala Gly Gly His His His His His His 660 665 670

<210> 34 <211> 2477 <212> ADN <213> Sequência Artificial 135 <2 2 Ο > <223> ADN codificando a porção C-LytA de St. pneum. fundido a epitopo P2 de auxiliar T fundido a P501S humano (aminoácidos 55-553) fundido a 6 resíduos de histidina a jusante de sequência sinal alfa pré-pró de levedura <400> 34 tacgtacatt ccgacggctc ttatccaaaa gacaagtttg agaaaatcaa tggcacttgg 60 tactactttg acagttcagg ctatatgctt gcagaccgct ggaggaagca cacagacggc 120 aactggtact ggttcgacaa ctcaggcgaa atggctacag gctggaagaa aatcgctgat 180 aagtggtact atttcaacga agaaggtgcc atgaagacag gctgggtcaa gtacaaggac 240 acttggtact acttagacgc taaagaaggc gccatgcaat acatcaaggc taactctaag 300 ttcattggta tcactgaagg cgtcatggta tcaaatgcct ttatccagtc agcggacgga 360 acaggctggt actacctcaa accagacgga acactggcag acaggccaga aatggcggcc 420 agatttcctt caatttttac tgcagtttta ttcgcagcat cctccgcatt agcggccgct 480 tacgtacatt ccgacggctc ttatccaaaa gacaagtttg agaaaatcaa tggcacttgg 540 tactactttg acagttcagg ctatatgctt gcagaccgct ggaggaagca cacagacggc 600 aactggtact ggttcgacaa ctcaggcgaa atggctacag gctggaagaa aatcgctgat 660 aagtggtact atttcaacga agaaggtgcc atgaagacag gctgggtcaa gtacaaggac 720 acttggtact acttagacgc taaagaaggc gccatgcaat acatcaaggc taactctaag 780 ttcattggta tcactgaagg cgtcatggta tcaaatgcct ttatccagtc agcggacgga 840 acaggctggt actacctcaa accagacgga acactggcag acaggccaga agctggtatt 900 acttacgttc caccattgtt gttggaagtt ggtgttgaag aaaagttcat gtacatggtg 960 ctgggcattg gtccagtgct gggcctggtc tgtgtcccgc tcctaggctc agccagtgac 1020 cactggcgtg gacgctatgg ccgccgccgg cccttcatct gggcactgtc cttgggcatc 1080 ctgctgagcc tctttctcat cccaagggcc ggctggctag cagggctgct gtgcccggat 1140 cccaggcccc tggagctggc actgctcatc ctgggcgtgg ggctgctgga cttctgtggc 1200 caggtgtgct tcactccact ggaggccctg ctctctgacc tcttccggga cccggaccac 1260 tgtcgccagg cctactctgt ctatgcttca tgatcagtct tgggggctgc ctgggctacc 1320 tcctgcctgc cattgactgg gacaccagtg ccctggcccc ctacctgggc acccaggagg 1380 agtgcctctt tggcctgctc accctcatct tcctcacctg cgtagcagcc acactgctgg 1440 tggctgagga ggcagcgctg ggccccaccg agccagcaga agggctgtcg gccccctcct 1500 tgtcgcccca ctgctgtcca tgccgggccc gcttggcttt ccggaacctg ggcgccctgc 1560 ttccccggct gcaccagctg tgctgccgca tgccccgcac cctgcgccgg ctcttcgtgg 1620 ctgagctgtg cagctggatg gcactcatga ccttcacgct gttttacacg gatttcgtgg 1680 gcgaggggct gtaccagggc gtgcccagag ctgagccggg caccgaggcc cggagacact 1740 atgatgaagg cgttcggatg ggcagcctgg ggctgttcct gcagtgcgcc atctccctgg 1800 tcttctctct ggtcatggac cggctggtgc agcgattcgg cactcgagca gtctatttgg 1860 ccagtgtggc agctttccct gtggctgccg gtgccacatg cctgtcccac agtgtggccg 1920 tggtgacagc ttcagccgcc ctcaccgggt tcaccttctc agccctgcag atcctgccct 1980 acacactggc ctccctctac caccgggaga agcaggtgtt cctgcccaaa taccgagggg 2040 acactggagg tgctagcagt gaggacagcc tgatgaccag cttcctgcca ggccctaagc 2100 ctggagctcc cttccctaat ggacacgtgg gtgctggagg cagtggcctg ctcccacctc 2160 cacccgcgct ctgcggggcc tctgcctgtg atgtctccgt acgtgtggtg gtgggtgagc 2220 ccaccgaggc cagggtggtt ccgggccggg gcatctgcct ggacctcgcc atcctggata 2260 gtgccttcct gctgtcccag gtggccccat ccctgtttat gggctccatt gtccagctca 2340 gccagtctgt cactgcctat atggtgtctg ccgcaggcct gggtctggtc gccatttact 2400 ttgctacaca ggtagtattt gacaagagcg acttggccaa atactcagcg ggtggacacc 2460 atcaccatca ccattaa 2477 136

<210> 35 <211> 595 <212> PRT <213> Sequência Artificial <2 2 0> <223> P501S humano (aminoácidos 55-553) fundido a 6 residuos de histidina a jusante de sequência sinal alfa pré-pró de levedura <400> 35

Met Ser Phe Leu Asn Phe Thr Ala val Leu Phe Ala Ala ser Ser Ala 1 5 10 15 Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gin Ile 20 25 30 Pro . Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe Asp 35 40 45 Vai , Ala Vai Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu Phe 50 55 60 Ile . Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val Ser 65 70 75 80 Leu < Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Met Val Leu Gly Ile Gly Pro Val 85 90 95 Leu Gly Leu val Cys Val Pro Leu Leu Gly Ser Ala Ser Asp His Trp 100 105 110 Arg Gly Arg Tyr Gly Arg Arg Arg Pro Phe Ile Trp Ala Leu Ser Leu 115 120 125 Gly Ile Leu Leu Ser Leu Phe Leu Ile Pro Arg Ala Gly Trp Leu Ala 130 135 140 Gly Leu Leu Cys Pro Asp Pro Arg Pro Leu Glu Leu Ala Leu Leu Ile 145 150 155 160 Leu Gly Val Gly Leu Leu Asp Phe Cys Gly Gin Val Cys Phe Thr Pro 165 170 175 Leu Glu Ala Leu Leu Ser Asp Leu Phe Arg Asp Pro Asp His Cys Arg 180 185 190 Gin Ala Tyr Ser Val Tyr Ala Phe Met Ile Ser Leu Gly Gly Cys Leu 195 200 205 Gly Tyr Leu Leu Pro Ala Ile Asp Trp Asp Thr Ser Ala Leu Ala Pro 210 215 220 Tyr Leu Gly Thr Gin Glu Glu Cys Leu Phe Gly Leu Leu Thr Leu Ile 225 230 235 240 Phe Leu Thr Cys Val Ala Ala Thr Leu Leu Val Ala Glu Glu Ala Ala 245 250 255 Leu Gly Pro Thr Glu Pro Ala Glu Gly Leu Ser Ala Pro Ser Leu Ser 260 265 270 Pro His Cys Cys Pro Cys Arg Ala Arg Leu Ala Phe Arg Asn Leu Gly 275 280 285 137

Ala Leu Leu Pro Arg Leu His Gin Leu Cys Cys Arg Met Pro Arg Thr 290 295 300 Leu Arg Arg Leu Phe Vai Ala Glu Leu Cys Ser Trp Met Ala Leu Met 305 310 315 320 Thr Phe Thr Leu Phe Tyr Thr Asp Phe Vai Gly Glu Gly Leu Tyr Gin 325 330 335 Gly Vai Pro Arg Ala Glu Pro Gly Thr Glu Ala Arg Arg His Tyr Asp 340 345 350 Glu Gly Vai Arg Met Gly Ser Leu Gly Leu Phe Leu Gin Cys Ala Ile 355 360 365 Ser Leu Vai Phe Ser Leu Vai Met Asp Arg Leu Vai Gin Arg Phe Gly 370 375 360 Thr Arg Ala Vai Tyr Leu Ala Ser Vai Ala Ala Phe Pro Vai Ala Ala 385 390 395 400 Gly Ala Thr Cys Leu Ser His Ser Vai Ala Vai Vai Thr Ala Ser Ala 405 410 415 Ala Leu Thr Gly Phe Thr Phe Ser Ala Leu Gin Ile Leu Pro Tyr Thr 420 425 430 Leu Ala Ser Leu Tyr His Arg Glu Lys Gin Vai Phe Leu Pro Lys Tyr 435 440 445 Arg Gly Asp Thr Gly Gly Ala Ser Ser Glu Asp Ser Leu Met Thr Ser 450 455 460 Phe Leu Pro Gly Pro Lys Pro Gly Ala Pro Phe Pro Asn Gly His Vai 465 470 475 480 Gly Ala Gly Gly Ser Gly Leu Leu Pro Pro Pro Pro Ala Leu Cys Gly 455 A ΟΛ ^ w 495 Ala Ser Ala Cys Asp Vai Ser Vai Arg Vai Vai Vai Gly Glu Pro Thr 500 505 510 Glu Ala Arg Vai Vai Pro Gly Arg Gly Ile Cys Leu Asp Leu Ala Ile 515 520 525 Leu Asp Ser Ala Phe Leu Leu Ser Gin Vai Ala Pro Ser Leu Phe Met 530 535 540 Gly Ser Ile Vai Gin Leu Ser Gin Ser Vai Thr Ala Tyr Met Vai Ser 545 550 555 560 Ala Ala Gly Leu Gly Leu Vai Ala Ile Tyr Phe Ala Thr Gin Vai Vai 565 570 575 Phe Asp Lys Ser Asp Leu Ala Lys Tyr Ser Ala Gly Gly His His His 580 585 590 His Hie His 595

<210> 36 <211> 1788 <212> ADN <213> Sequência Artificial 138 <22 0> <223> ADN codificando P501S humano (aminoácidos 55-553) fundido a 6 resíduos de histidina a jusante de sequência sinal alfa pré-pró de levedura <400> 36 atgagtttcc tcaattttac tgcagtttta ttcgcagcat cctccgcatt agctgctcca 60 gtcaacacta caacagaaga tgaaacggca caaattccgg ctgaagctgt catcggttac 120 tcagatttag aaggggattt cgatgttgct gttttgccat tttccaacag cacaaataac 180 gggttattgt ttataaatac tactattgcc agcattgctg ctaaagaaga aggggtatct 240 ctcgagaaaa gagaggctga agccatggtg ctgggcattg gtccagtgct gggcctggtc 300 tgtgtcccgc tcctaggctc agccagtgac cactggcgtg gacgctatgg ccgccgccgg 360 cccttcatct gggcactgtc cttgggcatc ctgctgagcc tctttctcat cccaagggcc 420 ggctggctag cagggctgct gtgcccggat cccaggcccc tggagctggc actgctcatc 480 ctgggcgtgg ggctgctgga cttctgtggc caggtgtgct tcactccact ggaggccctg 540 ctctctgacc tcttccggga cccggaccac tgtcgccagg cctactctgt ctatgccttc 600 atgatcagtc ttgggggctg cctgggctac ctcctgcctg ccattgactg ggacaccagt 660 gccctggccc cctacctggg cacccaggag gagtgcctct ttggcctgct caccctcatc 720 ttcctcacct gcgtagcagc cacactgctg gtggctgagg aggcagcgct gggccccacc 780 gagccagcag aagggctgtc ggccccctcc ttgtcgcccc actgctgtcc atgccgggcc 840 cgcttggctt tccggaacct gggcgccctg cttccccggc tgcaccagct gtgctgccgc 900 atgccccgca ccctgcgccg gctcttcgtg gctgagctgt gcagctggat ggcactcatg 960 accttcacgc tgttttacac ggatttcgtg ggcgaggggc tgtaccaggg cgtgcccaga 1020 gctgagccgg gcaccgaggc ccggagacac tatgatgaag gcgttcggat gggcagcctg 1080 gggctgttcc tgcagtgcgc catctccctg gtcttctctc tggtcatgga ccggctggtg 1140 cagcgattcg gcactcgagc agtctatttg gccagtgtgg cagctttccc tgtggctgcc 1200 ggtgccacat gcctgtccca cagtgtggcc gtggtgacag cttcagccgc cctcaccggg 1260 ttcaccttct cagccctgca gatcctgccc tacacactgg cctccctcta ccaccgggag 1320 aagcaggtgt tcctgcccaa ataccgaggg gacactggag gtgctagcag tgaggacagc 1380 ctgatgacca gcttcctgcc aggccctaag cctggagctc ccttccctaa tggacacgtg 1440 ggtgctggag gcagtggcct gctcccacct ccacccgcgc tctgcggggc ctctgcctgt 1500 gatgtctccg tacgtgtggt ggtgggtgag cccaccgagg ccagggtggt tccgggccgg 1560 ggcatctgcc tggacctcgc catcctggat agtgccttcc tgctgtccca ggtggcccca 1620 tccctgttta tgggctccat tgtccagctc agccagtctg tcactgccta tatggtgtct 1680 gccgcaggcc tgggtctggt cgccatttac tttgctacac aggtagtatt tgacaagagc 1740 gacttggcca aatactcagc gggtggacac catcaccatc accattaa 1788

<210> 37 <211> 1955 <212> ADN <213> Sequência Artificial 139 <2 2 0> <223> ADN codificando P501S humano de codão optimizado (aminoácidos 51-553) fundido a C-LytA de St.pneum. epitopo P2 auxiliar C-Lyta <400> 37 gcggccgcgc caccatggcc gccgcctacg agttcgagaa gatcaacggg acatggtact accgctggcg gaagcacacc gacggcaact ccaccggctg gaagaagatc gcggacaagt agaccggctg ggtgaagtat aaggacacct tgcagtatat caaggccaac agcaagttca acgcctttat ccagagcgcc gacggcaccg tcgcggatcg gcccgagaag ttcatgtaca tcgtgtgtgt gcccctcctc gggagtgcgt gcagaccgtt catctgggcc ctgagcctgg gggccggctg gctggccggc ctgctgtgtc tgatcctggg cgtgggcctg ctggacttct ctctgctctc cgacctcttc cgcgaccccg ccttcatgat cagtctgggg ggatgcctgg ccagcgccct ggccccctac ctggggactc tgatcttcct gacgtgcgtc gccgccaccc ccaccgagcc cgccgagggc ctgagcgctc gggctaggct cgccttcagg aatctgggcg gtcgcatgcc tcgcaccctg cgccgcctgt tgatgacgtt caccctcttc tacaccgact ccagggccga gcccggcacc gaggctaggc ctctgggcct cttcctgcag tgcgccatca tggtgcagcg cttcggcacc cgggccgtgt ccgccggcgc gacctgcctg tctcattctg ccggcttcac cttcagtgcg ctccagattc gcgagaagca ggtgttcctg cccaagtacc acagcctgat gaccagcttc ttgcccggcc atgtcggggc gggcggcagc ggcctgctcc cctgcgacgt gagcgtgcgg gtggtggtgg gccgggggat ctgcctggac ctggccatcc cgcccagcct gttcatgggc agtatcgtgc tgagcgccgc cggcctgggg ttggtggeca agagcgatct cgccaagtat agcgcctgag tgcatagcga cgggagctac cccaaggaca 60 acttcgactc ctccggctac atgctcgccg 120 ggtactggtt cgataactcg ggagagatgg 180 ggtactattt caacgaggag ggcgccatga 240 ggtactacct cgacgccaag gagggcgcca 300 tcggcatcac cgagggagtg atggtcagca 360 gatggtacta cttgaagccg gacggcaccc 420 tggtgctggg catcggcccc gtcctgggcc 480 ccgatcattg gcggggccgc tacggccgcc 540 gcatcctgct ctctctcttc ctgatccccc 600 ccgacccccg ccctctggag ctggccctcc 660 gcggccaggt gtgtttcact cccctggagg 720 accactgtag gcaggcttac agcgtgtacg 780 gctatctgct gcccgctatc gactgggaca 840 aggaggagtg cctgttcggc ctgctcacct 900 tgctggtggc cgaggaggcg gccctggggc 960 ccagcctgag cccccattgc tgcccgtgca 1020 ctttgctgcc ccgcctgcat cagctgtgct 1080 tcgtcgctga gctctgttcc tggatggccc 1140 tcgtggggga gggcctgtac cagggcgtgc 1200 gccattacga cgagggcgtc aggatgggct 1260 gtctggtgtt ctctctggtg atggaccggc 1320 acctcgcctc tgtggcggct ttccccgtcg 1380 tcgccgtggt gaccgccagc gccgccctga 1440 tgccctacac cctggcgtct ctgtaccatc 1500 gcggggacac agggggagct tcctctgagg 1560 ccaagccggg ggcccctttc cccaacggcc 1620 ctcccccccc cgccctgtgc ggcgctagtg 1680 gggagcccac cgaggctagg gtcgtgcctg 1740 tcgactccgc cttcctgctc tcccaggtgg 1800 agctgagcca gagcgtgacc gcctacatgg 1860 tctactttgc cacccaggtc gtgttcgaca 1920 gatcc 1955

<210> 38 <211> 2045 <212> ADN <213> Sequência Artificial 140 <22 0> <223> ADN codificando P501S humano de codào optimizado (aminoácidos 1-553) fundido a C-LytA de St. pneum. epitopo P2 auxiliar C-Lyta <400> 38 gcggccgcgc caccatggcc gccgcctacg tgcatagcga cgggagctac cccaaggaca 60 agttcgagaa gatcaacggg acatggtact acttcgactc ctccggctac atgctcgccg 120 accgctggcg gaagcacacc gacggcaact ggtactggtt cgataactcg ggagagatgg 180 ccaccggctg gaagaagatc gcggacaagt ggtactattt caacgaggag ggcgccatga 240 agaccggctg ggtgaagtat aaggacacct ggtactacct cgacgccaag gagggcgcca 300 tgcagtatat caaggccaac agcaagttca tcggcatcac cgagggagtg atggtcagca 360 acgcctttat ccagagcgcc gacggcaccg gatggtacta cttgaagccg gacggcaccc 420 tcgcggatcg gcccgagatg gtgcagcggc tgtgggtgtc ccggctgctg cgccatagaa 480 aggcccagtt gctgctggtg aacctgctga ctttcggact ggaggtgtgc ctggctgccg 540 tggtgctggg catcggcccc gtcctgggcc tcgtgtgtgt gcccctcctc gggagtgcgt 600 ccgatcattg gcggggccgc tacggccgcc gcagaccgtt catctgggcc ctgagcctgg 660 gcatcctgct ctctctcttc ctgatccccc gggccggctg gctggccggc ctgctgtgtc 720 ccgacccccg ccctctggag ctggccctcc tgatcctggg cgtgggcctg ctggacttct 780 gcggccaggt gtgtttcact cccctggagg ctctgctctc cgacctcttc cgcgaccccg 840 accactgtag gcaggcttac agcgtgtacg ccttcatgat cagtctgggg ggatgcctgg 900 gctatctgct gcccgctatc gactgggaca ccagcgccct ggccccctac ctggggactc 960 aggaggagtg cctgttcggc ctgctcacct tgatcttcct gacgtgcgtc gccgccaccc 1020 tgctggtggc cgaggaggcg gccctggggc ccaccgagcc cgccgagggc ctgagcgctc 1080 ccagcctgag cccccattgc tgcccgtgca gggctaggct cgccttcagg aatctgggcg 1140 ctttgctgcc ccgcctgcat cagctgtgct gtcgcatgcc tcgcaccctg cgccgcctgt 1200 tcgtcgctga gctctgttcc tggatggccc tgatgacgtt caccctcttc tacaccgact 1260 tcgtggggga gggcctgtac cagggcgtgc ccagggccga gcccggcacc gaggctaggc 1320 gccattacga cgagggcgtc aggatgggct ctctgggcct cttcctgcag tgcgccatca 1380 gtctggtgtt ctctctggtg atggaccggc tggtgcagcg cttcggcacc cgggccgtgt 1440 acctcgcctc tgtggcggct ttccccgtcg ccgccggcgc gacctgcctg tctcattctg 1500 tcgccgtggt gaccgccagc gccgccctga ccggcttcac cttcagtgcg ctccagattc 1560 tgccctacac cctggcgtct ctgtaccatc gcgagaagca ggtgttcctg cccaagtacc 1620 gcggggacac agggggagct tcctctgagg acagcctgat gaccagcttc ttgcccggcc 1680 ccaagccggg ggcccctttc cccaacggcc atgtcggggc gggcggcagc ggcctgctcc 1740 ctcccccccc cgccctgtgc ggcgctagtg cctgcgacgt gagcgtgcgg gtggtggtgg 1800 gggagcccac cgaggctagg gtcgtgcctg gccgggggat ctgcctggac ctggccatcc 1860 tcgactccgc cttcctgctc tcccaggtgg cgcccagcct gttcatgggc agtatcgtgc 1920 agctgagcca gagcgtgacc gcctacatgg tgagcgccgc cggcctgggg ttggtggcca 1980 tctactttgc cacccaggtc gtgttcgaca agagcgatct cgccaagtat agcgcctgag 2040 gatcc 2045

<210> 39 <211> 2105 <212> ADN <213> Sequência Artificial 141 <2 2 Ο > <223> ADN codificando C-LytA de St. pneum. epitopo P2 auxiliar C-Lyta fundido a P501S humano (aminoácidos 51-553) fundido a P501S humano (aminoácidos 1-50) - codão optimizado <400> 39 gcggccgcgc caccatggcc gccgcctacg tgcatagcga cgggagctac cccaaggaca 60 agttcgagaa gatcaacggg acatggtact acttcgactc ctccggctac atgctcgccg 120 accgctggcg gaagcacacc gacggcaact ggtactggtt cgataactcg ggagagatgg 180 ccaccggctg gaagaagatc gcggacaagt ggtactattt caacgaggag ggcgccatga 240 agaccggctg ggtgaagtat aaggacacct ggtactacct cgacgccaag gagggcgcca 300 tgcagtatat caaggccaac agcaagttca tcggcatcac cgagggagtg atggtcagca 360 acgcctttat ccagagcgcc gacggcaccg gatggtacta cttgaagccg gacggcaccc 420 tcgcggatcg gcccgagaag ttcatgtaca tggtgctggg catcggcccc gtcctgggcc 480 tcgtgtgtgt gcccctcctc gggagtgcgt ccgatcattg gcggggccgc tacggccgcc 540 gcagaccgtt catctgggcc ctgagcctgg gcatcctgct ctctctcttc ctgatccccc 600 gggccggctg gctggccggc ctgctgtgtc ccgacccccg ccctctggag ctggccctcc 660 tgatcctggg cgtgggcctg ctggacttct gcggccaggt gtgtttcact cccctggagg 720 ctctgctctc cgacctcttc cgcgaccccg accactgtag gcaggcttac agcgtgtacg 780 ccttcatgat cagtctgggg ggatgcctgg gctatctgct gcccgctatc gactgggaca 840 ccagcgccct ggccccctac ctggggactc aggaggagtg cctgttcggc ctgctcacct 900 tgatcttcct gacgtgcgtc gccgccaccc tgctggtggc cgaggaggcg gccctggggc 960 ccaccgagcc cgccgagggc ctgagcgctc ccagcctgag cccccattgc tgcccgtgca 1020 gggctaggct cgccttcagg aatctgggcg ctttgctgcc ccgcctgcat cagctgtgct 1080 gtcgcatgcc tcgcaccctg cgccgcctgt tcgtcgctga gctctgttcc tggatggccc 1140 tgatgacgtt caccctcttc tacaccgact tcgtggggga gggcctgtac cagggcgtgc 1200 ceagggccga gcccggcacc gaggctaggc gccattacga cgagggcgtc aggatgggct 1260 ctctgggcct cttcctgcag tgcgccatca gtctggtgtt ctctctggtg atggaccggc 1320 tggtgcagcg cttcggcacc cgggccgtgt acctcgcctc tgtggcggct ttccccgtcg 1380 ccgccggcgc gacctgcctg tctcattctg tcgccgtggt gaccgccagc gccgccctga 1440 ccggcttcac cttcagtgcg ctccagattc tgccctacac cctggcgtct ctgtaccatc 1500 gcgagaagca ggtgttcctg cccaagtacc gcggggacac agggggagct tcctctgagg 1560 acagcctgat gaccagcttc ttgcccggcc ccaagccggg ggcccctttc cccaacggcc 1620 atgtcggggc gggcggcagc ggcctgctcc ctcccccccc cgccctgtgc ggcgctagtg 1680 cctgcgacgt gagcgtgcgg gtggtggtgg gggagcccac cgaggctagg gtcgtgcctg 1740 gccgggggat ctgcctggac ctggccatcc tcgactccgc cttcctgctc tcccaggtgg 1800 cgcccagcct gttcatgggc agtatcgtgc agctgagcca gagcgtgacc gcctacatgg 1860 tgagcgccgc cggcctgggg ttggtggcca tctactttgc cacccaggtc gtgttcgaca 1920 agagcgatct cgccaagtat agcgccatgg tgcagcggct gtgggtgtcc cggctgctgc 1980 gccatagaaa ggcccagttg ctgctggtga acctgctgac tttcggactg gaggtgtgcc 2040 tggctgccgg gatcacgtac gtgccccccc tgctgctgga ggtgggcgtg gaggagtgag 2100 gatcc 2105 <210> 40 142

<211> 2105 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> ADN codificando P501S humano (aminoácidos 1-50) fundido a C-LytA de St. pneum. epitopo P2 auxiliar C-Lyta fundido a P501S humano (aminoácidos 51-553) - codão optimizado <400> 40 gcggccgcgc caccatggtg cagcggctgt gggtgtcccg gctgctgcgc catagaaagg 60 cccagttgct gctggtgaac ctgctgactt tcggactgga ggtgtgcctg gctgccggga 120 tcacgtacgt gccccccctg ctgctggagg tgggcgtgga ggagatggcc gccgcctacg 180 tgcatagcga cgggagctac cccaaggaca agttcgagaa gatcaacggg acatggtact 240 acttcgactc ctccggctac atgctcgccg accgctggcg gaagcacacc gacggcaact 300 ggtactggtt cgataactcg ggagagatgg ccaccggctg gaagaagatc gcggacaagt 360 ggtactattt caacgaggag ggcgccatga agaccggctg ggtgaagtat aaggacacct 420 ggtactacct cgacgccaag gagggcgcca tgcagtatat caaggccaac agoaagttca 480 tcggcatcac cgagggagtg atggtcagca acgcctttat ccagagcgcc gacggcaccg 540 gatggtacta cttgaagccg gacggcaccc tcgcggatcg gcccgagaag ttcatgtaca 600 tggtgctggg catcggcccc gtcctgggcc tcgtgtgtgt gcccctcctc gggagtgcgt 660 ccgatcattg gcggggccgc tacggccgcc gcagaccgtt catctgggcc ctgagcctgg 720 gcatcctgct ctctctcttc ctgatccccc gggccggctg gctggccggc ctgctgtgtc 780 ccgacccccg ccctctggag ctggccctcc tgatcctggg cgtgggcctg ctggacttct 840 gcggccaggt gtgtttcact cccctggagg ctctgctctc cgacctcttc cgcgaccccg 900 accactgtag gcaggcttac agcgtgtacg ccttcatgat cagtctgggg ggatgcctgg 960 gctatctgct gcccgctatc gactgggaca ccagcgccct ggccccctac ctggggactc 1020 aggaggagtg cctgttcggc ctgctcacct tgatcttcct gacgtgcgtc gccgccaccc 1080 tgctggtggc cgaggaggcg gccctggggc ccaccgagcc cgccgagggc ctgagcgctc 1140 ccagcctgag cccccattgc tgcccgtgca gggctaggct cgccttcagg aatctgggcg 1200 ctttgctgcc ccgcctgcat cagctgtgct gtcgcatgcc tcgcaccctg cgccgcctgt 1260 tcgtcgctga gctctgttcc tggatggccc tgatgacgtt caccctcttc tacaccgact 1320 tcgtggggga gggcctgtac cagggcgtgc ccagggccga gcccggcacc gaggctaggc 1380 gccattacga cgagggcgtc aggatgggct ctctgggcct cttcctgcag tgcgccatca 1440 gtctggtgtt ctctctggtg atggaccggc tggtgcagcg cttcggcacc cgggccgtgt 1500 acctcgcctc tgtggcggct ttccccgtcg ccgccggcgc gacctgcctg tctcattctg 1560 tcgccgtggt gaccgccagc gccgccctga ccggcttcac cttcagtgcg ctccagattc 1620 tgccctacac cctggcgtct ctgtaccatc gcgagaagca ggtgttcctg cccaagtacc 1680 gcggggacac agggggagct tcctctgagg acagcctgat gaccagcttc ttgcccggcc 1740 ccaagccggg ggcccctttc cccaacggcc atgtcggggc gggcggcagc ggcctgctcc 1800 ctcccccccc cgccctgtgc ggcgctagtg cctgcgacgt gagcgtgcgg gtggtggtgg 1860 gggagcccac cgaggctagg gtcgtgcctg gccgggggat ctgcctggac ctggccatcc 1920 tcgactccgc cttcctgctc tcccaggtgg cgcccagcct gttcatgggc agtatcgtgc 1980 agctgagcca gagcgtgacc gcctacatgg tgagcgccgc cggcctgggg ttggtggcca 2040 tctactttgc cacccaggtc gtgttcgaca agagcgatct cgccaagtat agcgcctgag 2100 gatcc 2105 <210> 41 143

<211> 652 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> C-LytA de St. pneum. epitopo P2 auxiliar C-Lyta fundido a P501S humano <400> 41

Met Ala Ala Ala Tyr val His Ser Asp Gly Ser Tyr Pro Lys Asp Lys 1 5 10 15 Phe Glu Lys Ile Asn Gly Thr Trp Tyr Tyr Phe Asp Ser Ser Gly Tyr 20 25 30 Met Leu Ala Asp Arg Trp Arg Lys His Thr Asp Gly Asn Trp Tyr Trp 35 40 45 Phe Asp Asn Ser Gly Glu Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys Ile Ala Asp 50 55 60 Lys Trp Tyr Tyr Phe Asn Glu Glu Gly Ala Met Lys Thr Gly Trp Val 65 70 75 80 Lys Tyr Lys Asp Thr Trp Tyr Tyr Leu Asp Ala Lys Glu Gly Ala Met 85 90 95 Gin Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Gly Val 100 105 110 Met Vai Ser Asn Ala Phe Ile Gin Ser Ala Asp Gly Thr Gly Trp Tyr 115 120 125 Tyr Leu Lys Pro Asp Gly Thr Leu Ala Asp Arg Pro Glu Lys Phe Met 130 135 140 Tyr Met Vai Leu Gly Ile Gly Pro Val Leu Gly Leu Val Cys Val Pro 145 150 155 160 Leu Leu Gly Ser Ala Ser Asp His Trp Arg Gly Arg Tyr Gly Arg Arg 165 170 175 Arg Pro Phe Ile Trp Ala Leu Ser Leu Gly Ile Leu Leu Ser Leu Phe 180 185 190 Leu Ile Pro Arg Ala Gly Trp Leu Ala Gly Leu Leu Cys Pro Asp Pro 195 200 205 Arg Pro Leu Glu Leu Ala Leu Leu Ile Leu Gly Val Gly Leu Leu Asp 210 215 220 Phe Cys Gly Gin val Cys Phe Thr Pro Leu Glu Ala Leu Leu Ser Asp 225 230 235 240 Leu Phe Arg Asp Pro Asp His Cys Arg Gin Ala Tyr Ser Val Tyr Ala 245 250 255 Phe Met Ile Ser Leu Gly Gly Cys Leu Gly Tyr Leu Leu Pro Ala Ile 260 265 270 Asp Trp Asp Thr Ser Ala Leu Ala Pro Tyr Leu Gly Thr Gin Glu Glu 275 280 285 144

Cys Leu Phe Gly Leu Leu Thr Leu Ile Phe Leu Thr Cys Val Ala Ala 290 295 300 Thr Leu Leu Val Ala Glu Glu Ala Ala Leu Gly Pro Thr Glu Pro Ala 305 310 315 320 Glu Gly Leu Ser Ala Pro Ser Leu Ser Pro His Cys Cys Pro Cys Arg 325 330 335 Ala Arg Leu Ala Phe Arg Asn Leu Gly Ala Leu Leu Pro Arg Leu His 340 345 350 Gin Leu Cys Cys Arg Met Pro Arg Thr Leu Arg Arg Leu Phe Val Ala 355 360 365 Glu Leu Cys Ser Trp Met Ala Leu Met Thr Phe Thr Leu Phe Tyr Thr 370 375 380 Asp Phe Vai Gly Glu Gly Leu Tyr Gin Gly Val Pro Arg Ala Glu Pro 385 390 395 400 Gly Thr Glu Ala Arg Arg His Tyr Asp Glu Gly Val Arg Met Gly Ser 405 410 415 Leu Gly Leu Phe Leu Gin Cys Ala Ile Ser Leu Val Phe Ser Leu val 420 425 430 Met Asp Arg Leu val Gin Arg Phe Gly Thr Arg Ala Val Tyr Leu Ala 435 440 445 Ser Vai Ala Ala Phe Pro Val Ala Ala Gly Ala Thr Cys Leu Ser His 450 455 460 Ser Vai Ala Val Val Thr Ala Ser Ala Ala Leu Thr Gly Phe Thr Phe 465 470 475 480 Ser Ala Leu Gin Ile Leu Pro Tyr Thr Leu Ala Ser Leu Tyr His Arg 485 490 495 Glu Lys Gin Val Phe Leu Pro Lys Tyr Arg Gly Asp Thr Gly Gly Ala 500 505 510 Ser Ser Glu Asp Ser Leu Met Thr Ser Phe Leu Pro Gly Pro Lys Pro 515 520 525 Gly Ala Pro Phe Pro Asn Gly His Val Gly Ala Gly Gly Ser Gly Leu 530 535 540 Leu Pro Pro Pro Pro Ala Leu Cys Gly Ala Ser Ala Cys Asp Val Ser 545 550 555 560 Vai Arg Vai Val Val Gly Glu Pro Thr Glu Ala Arg Val Val Pro Gly 565 570 575 Arg Gly Ile Cys Leu Asp Leu Ala Ile Leu Aep Ser Ala Phe Leu Leu 580 585 590 Ser Gin Vai Ala Pro Ser Leu Phe Met Gly Ser Ile Val Gin Leu Ser 595 600 605 Gin Ser val Thr Ala Tyr Met Val Ser Ala Ala Gly Leu Gly Leu Val 610 615 620 Ala Ile Tyr Phe Ala Thr Gin Val Val Phe Asp Lys Ser Asp Leu Ala 625 630 635 640 Lys Tyr Ser Ala Gly Gly His His His His His His 645 650

<210> 42 <211> 1959 <212> ADN <213> Sequência Artificial 145 <220> <223> ADN codificando C-LytA de St. pneum. epitopo P2 auxiliar C-Lyta fundido a P501S humano (mais marcador his) <400> 42 atggcggccg cttacgtaca aatggcactt ggtactactt cacacagacg gcaactggta aaaatcgctg ataagtggta aagtacaagg acacttggta gctaactcta agttcattgg tcagcggacg gaacaggctg gaaaagttca tgtacatggt ctcctaggct cagccagtga tgggcactgt ccttgggcat gcagggctgc tgtgcccgga gggctgctgg acttctgtgg ctcttccggg acccggacca cttgggggct gcctgggcta ccctacctgg gcacccagga tgcgtagcag ccacactgct gaagggctgt cggccccctc ttccggaacc tgggcgccct accctgcgcc ggctcttcgt ctgttttaca cggatttcgt ggcaccgagg cccggagaca ctgcagtgcg ccatctccct ggcactcgag cagtctattt tgcctgtccc acagtgtggc tcagccctgc agatcctgcc ttcctgccca aataccgagg agcttcctgc caggccctaa ggcagtggcc tgctcccacc gtacgtgtgg tggtgggtga ctggacctcg ccatcctgga atgggctcca ttgtccagct ctgggtctgg tcgccattta aaatactcag cgggtggaca ttccgacggc tcttatccaa tgacagttca ggctatatgc ctggttcgac aactcaggcg ctatttcaac gaagaaggtg ctacttagac gctaaagaag tatcactgaa ggcgtcatgg gtactacctc aaaccagacg gctgggcatt ggtccagtgc ccactggcgt ggacgctatg cctgctgagc ctctttctca tcccaggccc ctggagctgg ccaggtgtgc ttcactccac ctgtcgccag gcctactctg cctcctgcct gccattgact ggagtgcctc tttggcctgc ggtggctgag gaggcagcgc cttgtcgccc cactgctgtc gcttccccgg ctgcaccagc ggctgagctg tgcagctgga gggcgagggg ctgtaccagg ctatgatgaa ggcgttcgga ggtcttctct ctggtcatgg ggccagtgtg gcagctttcc cgtggtgaca gcttcagccg ctacacactg gcctccctct ggacactgga ggtgctagca gcctggagct cccttcccta tccacccgcg ctctgcgggg gcccaccgag gccagggtgg tagtgccttc ctgctgtccc cagccagtct gtcactgcct ctttgctaca caggtagtat ccatcaccat caccattaa aagacaagtt tgagaaaatc 60 ttgcagaccg ctggaggaag 120 aaatggctac aggctggaag 180 ccatgaagac aggctgggtc 240 gcgccatgca atacatcaag 300 tatcaaatgc ctttatccag 360 gaacactggc agacaggcca 420 tgggcctggt ctgtgtcccg 480 gccgccgccg gcccttcatc 540 tcccaagggc cggctggcta 600 cactgctcat cctgggcgtg 660 tggaggccct gctctctgac 720 tctatgcctt catgatcagt 780 gggacaccag tgccctggcc 840 tcaccctcat cttcctcacc 900 tgggccccac cgagccagca 960 catgccgggc ccgcttggct 1020 tgtgctgccg catgccccgc 1080 tggcactcat gaccttcacg 1140 gcgtgcccag agctgagccg 1200 tgggcagcct ggggctgttc 1260 accggctggt gcagcgattc 1320 ctgtggctgc cggtgccaca 1380 ccctcaccgg gttcaccttc 1440 accaccggga gaagcaggtg 1500 gtgaggacag cctgatgacc 1560 atggacacgt gggtgctgga 1620 cctctgcctg tgatgtctcc 1680 ttccgggccg gggcatctgc 1740 aggtggcccc atccctgttt 1800 atatggtgtc tgccgcaggc 1860 ttgacaagag cgacttggcc 1920 1959

<210> 43 <211> 553 <212> PRT <213> Homo sapiens 146 <4Ο0> 43

Met Vai Gin Arg Leu Trp Vai Ser Arg Leu Leu Arg His Arg Lys Ala 1 5 10 15 Gin Leu Leu Leu Vai Asn Leu Leu Thr Phe Gly Leu Glu Vai Cys Leu 20 25 30 Ala Ala Gly Ile Thr Tyr Vai Pro Pro Leu Leu Leu Glu Vai Gly Val 35 40 45 Glu Glu Lye Phe Met Thr Met Vai Leu Gly Ile Gly Pro Val Leu Gly 50 55 60 Leu Vai Cys Vai Pro Leu Leu Gly Ser Ala Ser Asp His Trp Arg Gly 65 70 75 80 Arg Tyr Gly Arg Arg Arg Pro Phe Ile Trp Ala Leu Ser Leu Gly Ile 85 90 95 Leu Leu Ser Leu Phe Leu Ile Pro Arg Ala Gly Trp Leu Ala Gly Leu 100 105 110 Leu Cys Pro Asp Pro Arg Pro Leu Glu Leu Ala Leu Leu Ile Leu Gly 115 120 125 Vai Gly Leu Leu Asp Phe Cys Gly Gin Vai Cys Phe Thr Pro Leu Glu 130 135 140 Ala Leu Leu Ser Asp Leu Phe Arg Asp Pro Asp His Cys Arg Gin Ala 145 150 155 160 Tyr Ser Vai Tyr Ala Phe Met Ile Ser Leu Gly Gly Cys Leu Gly Tyr 165 170 175 Leu Leu Pro Ala Ile Asp Trp Asp Thr Ser Ala Leu Ala Pro Tyr Leu 180 185 190 Gly Thr Gin Glu Glu Cys Leu Phe Gly Leu Leu Thr Leu Ile Phe Leu 195 200 205 Thr Cys Vai Ala Ala Thr Leu Leu Vai Ala Glu Glu Ala Ala Leu Gly 210 215 220 Pro Thr Glu Pro Ala Glu Gly Leu Ser Ala Pro Ser Leu Ser Pro His 225 230 235 240 Cys Cys Pro Cys Arg Ala Arg Leu Ala Phe Arg Asn Leu Gly Ala Leu 245 250 255 Leu Pro Arg Leu His Gin Leu Cys Cys Arg Met Pro Arg Thr Leu Arg 260 265 270 Arg Leu Phe Vai Ala Glu Leu Cys Ser Trp Met Ala Leu Met Thr Phe 275 280 285 Thr Leu Phe Tyr Thr Asp Phe Vai Gly Glu Gly Leu Tyr Gin Gly Val 290 295 300 Pro Arg Ala Glu Pro Gly Thr Glu Ala Arg Arg His Tyr Asp Glu Gly 305 310 315 320 Vai Arg Met Gly Ser Leu Gly Leu Phe Leu Gin Cys Ala Ile Ser Leu 325 330 335 Vai Phe Ser Leu Vai Met Asp Arg Leu Vai Gin Arg Phe Gly Thr Arg 340 345 350 Ala vai Tyr Leu Ala Ser Vai Ala Ala Phe Pro Vai Ala Ala Gly Ala 355 360 365 147

Thr Cys Leu Ser His Ser Vai Ala Vai Vai Thr Ala Ser Ala Ala Leu 370 375 380 Thr Gly Phe Thr Phe Ser Ala Leu Gin Ile Leu Pro Tyr Thr Leu Ala 3Θ5 390 395 400 Ser Leu Tyr His Arg Glu Lys Gin Vai Phe Leu Pro Lys Tyr Arg Gly 405 410 415 Asp Thr Gly Gly Ala Ser Ser Glu Asp Ser Leu Met Thr Ser Phe Leu 420 425 430 Pro Gly Pro Lys Pro Gly Ala Pro Phe Pro Asn Gly His Vai Gly Ala 435 440 445 Gly Gly Ser Gly Leu Leu Pro Pro Pro Pro Ala Leu Cys Gly Ala Ser 450 455 460 Ala Cys Asp Vai Ser Vai Arg Vai Vai Vai Gly Glu Pro Thr Glu Ala 465 470 475 480 Arg Vai Vai Pro Gly Arg Gly Ile Cys Leu Asp Leu Ala Ile Leu Asp 485 490 495 Ser Ala Phe Leu Leu Ser Gin Vai Ala Pro Ser Leu Phe Met Gly Ser 500 505 510 Ile Vai Gin Leu Ser Gin Ser Vai Thr Ala Tyr Met Vai Ser Ala Ala 515 520 525 Gly Leu Gly Leu Vai Ala Ile Tyr Phe Ala Thr Gin Vai Vai Phe Asp 530 535 540 Lys Ser Asp Leu Ala Lys Tyr Ser Ala 545 550

<210> 44 <211> 644 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> C-LytA de St. pneum. epitopo P2 auxiliar C-Lyta fundido a P501S humano <400> 44

Met Ala Ala Ala Tyr Vai His Ser Asp Gly Ser Tyr Pro Lys Asp Lys 1 5 10 15 Phe Glu Lys Ile Asn Gly Thr Trp Tyr Tyr Phe Asp Ser Ser Gly Tyr 20 25 30 Met Leu Ala Asp Arg Trp Arg Lys His Thr Asp Gly Asn Trp Tyr Trp 35 40 45 Phe Asp Asn Ser Gly Glu Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys Ile Ala Asp 50 55 60 148

Lys Trp Tyr Tyr Phe Asn Glu Glu Gly Ala Met Lys Thr Gly Trp Vai 65 70 75 80 Lys Tyr Lys Asp Thr Trp Tyr Tyr Leu Asp Ala Lys Glu Gly Ala Met 85 90 95 Gin Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Gly Vai 100 105 110 Met Vai ser Asn Ala Phe Ile Gin Ser Ala Asp Gly Thr Gly Trp Tyr 115 120 125 Tyr Leu Lys Pro Asp Gly Thr Leu Ala Asp Arg Pro Glu Lys Phe Met 130 135 140 Tyr Met Vai Leu Gly Ile Gly Pro Vai Leu Gly Leu Vai Cys Vai Pro 145 150 155 160 Leu Leu Gly Ser Ala Ser Asp His Trp Arg Gly Arg Tyr Gly Arg Arg 165 170 175 Arg Pro Phe Ile Trp Ala Leu Ser Leu Gly Ile Leu Leu Ser Leu Phe 180 185 190 Leu Ile Pro Arg Ala Gly Trp Leu Ala Gly Leu Leu Cys Pro Asp Pro 195 200 205 Arg Pro Leu Glu Leu Ala Leu Leu Ile Leu Gly Vai Gly Leu Leu Asp 210 215 220 Phe Cys Gly Gin vai Cys Phe Thr Pro Leu Glu Ala Leu Leu Ser Asp 225 230 235 240 Leu Phe Arg Asp Pro Asp His Cys Arg Gin Ala Tyr Ser Vai Tyr Ala 245 250 255 Phe Met ile Ser Leu Gly Gly Cys Leu Gly Tyr Leu Leu Pro Ala Ue 260 265 270 Asp Trp Asp Thr Ser Ala Leu Ala Pro Tyr Leu Gly Thr Gin Glu Glu 275 280 285 Cys Leu Phe Gly Leu Leu Thr Leu Ile Phe Leu Thr Cys Vai Ala Ala 290 295 300 Thr Leu Leu Vai Ala Glu Glu Ala Ala Leu Gly Pro Thr Glu Pro Ala 305 310 315 320 Glu Gly Leu Ser Ala Pro Ser Leu Ser Pro His Cys Cys Pro Cys Arg 325 330 335 Alâ Arg Leu Ala Phe Arg Asn Leu Gly Ala Leu Leu Pro Arg Leu His 340 345 350 Gin Leu Cys Cys Arg Met Pro Arg Thr Leu Arg Arg Leu Phe Vai Ala 355 360 365 Glu Leu Cys Ser Trp Met Ala Leu Met Thr Phe Thr Leu Phe Tyr Thr 370 375 380 Asp Phe Vai Gly Glu Gly Leu Tyr Gin Gly Vai Pro Arg Ala Glu Pro 385 390 395 400 Gly Thr Glu Ala Arg Arg His Tyr Asp Glu Gly Vai Arg Met Gly Ser 405 410 415 Leu Gly Leu Phe Leu Gin Cys Ala Ile Ser Leu Vai Phe Ser Leu Vai 420 425 430 Met Asp Arg Leu Vai Gin Arg Phe Gly Thr Arg Ala Vai Tyr Leu Ala 435 440 445 Ser Vai Ala Ala Phe Pro Vai Ala Ala Gly Ala Thr Cys Leu Ser His 450 455 460 Ser vai Ala Vai Vai Thr Ala Ser Ala Ala Leu Thr Gly Phe Thr Phe 465 470 475 480 Ser Ala Leu Gin Ile Leu Pro Tyr Thr Leu Ala Ser Leu Tyr His Arg 485 490 495 149

Glu Lys Gin Vai Phe Leu Pro Lys Tyr Arg Gly Asp Thr Gly Gly Ala 500 505 510 Ser Ser Glu Asp Ser Leu Met Thr Ser Phe Leu Pro Gly Pro Lys Pro 515 520 525 Gly Ala Pro Phe Pro Asn Gly His Vai Gly Ala Gly Gly Ser Gly Leu 530 535 540 Leu Pro Pro Pro Pro Ala Leu Cys Gly Ala Ser Ala Cys Asp Vai Ser 545 550 555 560 Vai Arg Vai Vai Vai Gly Glu Pro Thr Glu Ala Arg Vai Vai Pro Gly 565 570 575 Arg Gly Ile Cys Leu Asp Leu Ala Ile Leu Asp Ser Ala Phe Leu Leu 580 585 590 Ser Gin Vai Ala Pro Ser Leu Phe Met Gly Ser ile Vai Gin Leu Ser 595 600 605 Gin Ser Vai Thr Ala Tyr Met Vai Ser Ala Ala Gly Leu Gly Leu Val 610 615 620 Ala Ile Tyr Phe Ala Thr Gin Vai Vai Phe Asp Lys ser Asp Leu Ala €25 630 635 640 Lys Tyr Ser Ala

<210> 45 <211> 644 <212> PRT <213> Sequência Artificial <2 2 0> <223> proteina hibrida de codão optimizado entre C-LytA de St. pneum. epitopo P2 auxiliar C-Lyta fundido a P501S humano aminoácidos 51-553) <400> 45

Met Ala Ala Ala Tyr Val His Ser ABp Gly Ser Tyr Pro co Asp Lys 1 5 10 15 Phe Glu Lys Ile Asn Gly Thr Trp Tyr Tyr Phe Asp Ser Ser Gly Tyr 20 25 30 Met Leu Ala Asp Arg Trp Arg Lys His Thr Asp Gly Asn Trp Tyr Trp 35 40 45 Phe Asp Asn Ser Gly Glu Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys Ile Ala Asp 50 55 60 Lys Trp Tyr Tyr Phe Asn Glu Glu Gly Ala Met Lys Thr Gly Trp Val 65 70 75 80 Lys Tyr Lys Asp Thr Trp Tyr Tyr Leu Asp Ala Lys Glu Gly Ala Met 85 90 95 150

Gin Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Gly Val 100 105 110 Met Vai Ser Asn Ala Phe Ile Gin Ser Ala Asp Gly Thr Gly Trp Tyr 115 120 125 Tyr Leu Lys Pro Asp Gly Thr Leu Ala Asp Arg Pro Glu Lys Phe Met 130 135 140 Tyr Met Vai Leu Gly Ile Gly Pro val Leu Gly Leu Val Cys Val Pro 145 150 155 160 Leu Leu Gly Ser Ala Ser Asp His Trp Arg Gly Arg Tyr Gly Arg Arg 165 170 175 Arg Pro Phe Ile Trp Ala Leu Ser Leu Gly Ile Leu Leu Ser Leu Phe 180 185 190 Leu Ile Pro Arg Ala Gly Trp Leu Ala Gly Leu Leu Cys Pro Asp Pro 195 200 205 Arg Pro Leu Glu Leu Ala Leu Leu Ile Leu Gly Val Gly Leu Leu Asp 210 •215 220 Phe Cys Gly Gin Val Cys Phe Thr Pro Leu Glu Ala Leu Leu Ser Asp 225 230 235 240 Leu Phe Arg Asp Pro Asp His Cys Arg Gin Ala Tyr Ser Val Tyr Ala 245 250 255 Phe Met Ile Ser Leu Gly Gly Cys Leu Gly Tyr Leu Leu Pro Ala Ile 260 265 270 Asp Trp Asp Thr Ser Ala Leu Ala Pro Tyr Leu Gly Thr Gin Glu Glu 275 280 285 Cys Leu Phe Gly Leu Leu Thr Leu Ile Phe Leu Thr Cys Val Ala Ala 290 295 300 Thr Leu Leu Val Ala Glu Glu Ala Ala Leu Gly Pro Thr Glu Pro Ala 305 310 315 320 Glu Gly Leu Ser Ala Pro Ser Leu Ser Pro His Cys Cys Pro Cys Arg 325 330 335 Ala Arg Leu Ala Phe Arg Asn Leu Gly Ala Leu Leu Pro Arg Leu His 340 345 350 Gin Leu Cys Cys Arg Met Pro Arg Thr Leu Arg Arg Leu Phe Val Ala 355 360 365 Glu Leu Cys Ser Trp Met Ala Leu Met Thr Phe Thr Leu Phe Tyr Thr 370 375 380 Asp Phe Vai Gly Glu Gly Leu Tyr Gin Gly Val Pro Arg Ala Glu Pro 385 390 395 400 Gly Thr Glu Ala Arg Arg His Tyr Asp Glu Gly Val Arg Met Gly Ser 405 410 415 Leu Gly Leu Phe Leu Gin Cys Ala Ile Ser Leu Val Phe Ser Leu Val 420 425 430 Met Asp Arg Leu Val Gin Arg Phe Gly Thr Arg Ala Val Tyr Leu Ala 435 440 445 Ser Vai Ala Ala Phe Pro Val Ala Ala Gly Ala Thr Cys Leu Ser His 450 455 460 Ser Vai Ala Val Val Thr Ala Ser Ala Ala Leu Thr Gly Phe Thr Phe 465 470 475 480 Ser Ala Leu Gin Ile Leu Pro Tyr Thr Leu Ala Ser Leu Tyr His Arg 485 490 495 Glu Lys Gin Val Phe Leu Pro Lys Tyr Arg Gly Asp Thr Gly Gly Ala 500 505 510 Ser Ser Glu Asp Ser Leu Met Thr Ser Phe Leu Pro Gly Pro Lys Pro 515 520 525 151

Gly Ala Pro Phe Pro Asn Gly His Vai Gly Ala Gly Gly Ser Gly Leu 530 535 540 Leu Pro Pro Pro Pro Ala Leu Cys Gly Ala Ser Ala Cys Aep Vai Ser 54S 550 555 560 vai Arg Vai Vai Vai Gly Glu Pro Thr Glu Ala Arg Vai Vai Pro Gly 565 570 575 Arg Gly Ile Cys Leu Asp Leu Ala Ile Leu Asp Ser Ala Phe Leu Leu 580 585 590 Ser Gin Vai Ala Pro Ser Leu Phe Met Gly Ser Ile Vai Gin Leu Ser 595 600 605 Gin Ser Vai Thr Ala Tyr Met Vai Ser Ala Ala Gly Leu Gly Leu Vai 610 615 620 Ala Ile Tyr Phe Ala Thr Gin Vai Vai Phe Asp Lys Ser Asp Leu Ala 625 630 635 640 Lys Tyr Ser Ala

<210> 46 <211> 694 <212> PRT <213> Sequência Artificial <2 2 0> <223> C-LytA de St. pneum. epitopo P2 auxiliar C-Lyta fundido a P501S humano (aminoácidos 1-553)- codão optimizado <400> 46

Met Ala Ala Ala Tyr Val His Ser Asp Gly Ser Tyr Pro Lys Asp Lys 1 5 10 15 Phe Glu Lys Ile Asn Gly Thr Trp Tyr Tyr Phe Asp Ser Ser Gly Tyr 20 25 30 Met Leu Ala Asp Arg Trp Arg Lys His Thr Asp Gly Asn Trp Tyr Trp 35 40 45 Phe Asp Asn Ser Gly Glu Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys Ile Ala Asp 50 55 60 Lys Trp Tyr Tyr Phe Asn Glu Glu Gly Ala Met Lys Thr Gly Trp Val 65 70 75 80 Lys Tyr Lys Asp Thr Trp Tyr Tyr Leu Asp Ala Lys Glu Gly Ala Met 85 90 95 Gin Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Gly Val 100 105 110 Met Vai Ser Asn Ala Phe Ile Gin Ser Ala Asp Gly Thr Gly Trp Tyr 115 120 125 Tyr Leu Lys Pro Asp Gly Thr Leu Ala Asp Arg Pro Glu Met Val Gin 130 135 140 Arg Leu Trp Vai Ser Arg Leu Leu Arg His Arg Lys Ala Gin Leu Leu 152 145 150 155 160 Leu Vai Asn Leu Leu Thr Phe Gly Leu Glu Val Cys Leu Ala Ala Gly 165 170 175 Ile Thr Tyr Vai pro Pro Leu Leu Leu Glu Val Gly Val Glu Glu Lys ISO 185 190 Phe Met Thr Met Val Leu Gly Ile Gly Pro Val Leu Gly Leu Val Cys 195 200 205 vai Pro Leu Leu Gly Ser Ala Ser Asp His Trp Arg Gly Arg Tyr Gly 210 215 220 Arg Arg Arg Pro Phe Ile Trp Ala Leu Ser Leu Gly Ile Leu Leu Ser 225 230 235 240 Leu Phe Leu Ile Pro Arg Ala Gly Trp Leu Ala Gly Leu Leu Cys Pro 245 250 255 Asp Pro Arg Pro Leu Glu Leu Ala Leu Leu Ile Leu Gly Val Gly Leu 260 265 270 Leu Asp Phe Cys Gly Gin Val Cys Phe Thr Pro Leu Glu Ala Leu Leu 275 280 285 Ser Asp Leu Phe Arg Asp Pro Asp His Cys Arg Gin Ala Tyr Ser Val 290 295 300 Tyr Ala Phe Met Ile Ser Leu Gly Gly Cys Leu Gly Tyr Leu Leu Pro 305 310 315 320 Ala Ile Asp Trp Asp Thr Ser Ala Leu Ala Pro Tyr Leu Gly Thr Gin 325 330 335 Glu Glu Cys Leu Phe Gly Leu Leu Thr Leu Ile Phe Leu Thr Cys Val 340 345 350 Ala Ala Thr Leu Leu Val Ala Glu Glu Ala Ala Leu Gly Pro Thr Glu 355 360 365 Pro Ala Glu Gly Leu Ser Ala Pro Ser Leu Ser Pro His Cys Cys Pro 370 375 380 Cys Arg Ala Arg Leu Ala Phe Arg Asn Leu Gly Ala Leu Leu Pro Arg 385 390 395 400 Leu His Gin Leu Cys Cys Arg Met Pro Arg Thr Leu Arg Arg Leu Phe 405 410 415 Vai Ala Glu Leu Cys Ser Trp Met Ala Leu Met Thr Phe Thr Leu Phe 420 425 430 Tyr Thr Asp Phe Val Gly Glu Gly Leu Tyr Gin Gly Val Pro Arg Ala 435 440 445 Glu Pro Gly Thr Glu Ala Arg Arg His Tyr Asp Glu Gly Val Arg Met 450 455 460 Gly Ser Leu Gly Leu Phe Leu Gin Cys Ala Ile Ser Leu Val Phe Ser 465 470 475 480 Leu Vai Met Asp Arg Leu val Gin Arg Phe Gly Thr Arg Ala Val Tyr 485 490 495 Leu Ala Ser Vai Ala Ala Phe Pro Val Ala Ala Gly Ala Thr Cys Leu 500 505 510 Ser His Ser Vai Ala Val Val Thr Ala Ser Ala Ala Leu Thr Gly Phe 515 520 525 Thr Phe Ser Ala Leu Gin Ile Leu Pro Tyr Thr Leu Ala Ser Leu Tyr 530 535 540 His Arg Glu Lys Gin Val Phe Leu Pro Lys Tyr Arg Gly Asp Thr Gly 545 550 555 560 Gly Ala Ser Ser Glu Asp Ser Leu Met Thr Ser Phe Leu Pro Gly Pro 565 570 575 Lys Pro Gly Ala Pro Phe Pro Asn Gly His Val Gly Ala Gly Gly Ser 580 5B5 590 Gly Leu Leu Pro Pro Pro Pro Ala Leu Cys Gly Ala Ser Ala Cys Asp 595 600 605 Vai Ser Vai Arg Val Val Val Gly Glu Pro Thr Glu Ala Arg Val Val 610 615 620 Pro Gly Arg Gly Ile Cys Leu Asp Leu Ala Ile Leu Asp Ser Ala Phe 625 630 635 64 0 153

Leu Leu Ser Gin Vai Ala Pro Ser Leu Phe Met Gly Ser Ile Vai Gin 645 650 655 Leu Ser Gin Ser Vai Thr Ala Tyr Met Vai Ser Ala Ala Gly Leu Gly 660 665 670 Leu Vai Ala Ile Tyr Phe Ala Thr Gin Vai Vai Phe Asp Lys Ser Asp 675 680 6B5 Leu Ala Lys Tyr Ser Ala 690 <210> <211> <212> <213> 47 694 PRT Sequência Artificial <220> <223> C-LytA de St. pneum. epitopo P2 auxiliar C-Lyta fundido a P501S humano (aminoácidos 51-553) fundido a P501S humano (aminoácidos 1-50) - codão optimizado <400> 47

Met Ala Ala Ala Tyr Vai His Ser Asp Gly Ser Tyr Pro Lys Asp Lys 1 5 10 15 Phe Glu Lys Ile Asn Gly Thr Trp Tyr Tyr Phe Asp Ser Ser Gly Tyr 20 25 30 Met Leu Ala Asp Arg Trp Arg Lys His Thr Asp Gly Asn Trp Tyr Trp 35 40 45 Phe Asp Asn Ser Gly Glu Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys Ile Ala Asp 50 55 60 Lys Trp Tyr Tyr Phe Asn Glu Glu Gly Ala Met Lys Thr Gly Trp Vai 65 70 75 80 Lys Tyr Lys Asp Thr Trp Tyr Tyr Leu Asp Ala Lys Glu Gly Ala Met 85 90 95 Gin Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Gly Vai 100 105 110 Met Vai Ser Asn Ala Phe Ile Gin Ser Ala Asp Gly Thr Gly Trp Tyr 115 120 125 Tyr Leu Lys Pro Asp Gly Thr Leu Ala Asp Arg Pro Glu Lys Phe Met 130 135 140 Tyr Met Vai Leu Gly Ile Gly Pro Vai Leu Gly Leu Vai Cys Vai Pro 145 150 155 160 Leu Leu Gly Ser Ala Ser Asp His Trp Arg Gly Arg Tyr Gly Arg Arg 165 170 175 154

Arg Pro Phe Ile Trp Ala Leu Ser Leu Gly Ile Leu Leu Ser Leu Phe 180 185 190 Leu Ile Pro Arg Ala Gly Trp Leu Ala Gly Leu Leu Cys Pro Asp Pro 195 200 205 Arg Pro Leu Glu Leu Ala Leu Leu Ile Leu Gly Val Gly Leu Leu Asp 210 215 220 Phe Cys Gly Gin Val Cys Phe Thr Pro Leu Glu Ala Leu Leu Ser Asp 225 230 235 240 Leu Phe Arg Asp Pro Asp His Cys Arg Gin Ala Tyr Ser Val Tyr Ala 245 250 255 Phe Met Ile Ser Leu Gly Gly Cys Leu Gly Tyr Leu Leu Pro Ala Ile 260 265 270 Asp Trp Asp Thr Ser Ala Leu Ala Pro Tyr Leu Gly Thr Gin Glu Glu 275 280 285 Cys Leu Phe Gly Leu Leu Thr Leu Ile Phe Leu Thr Cys Val Ala Ala 290 295 300 Thr Leu Leu Val Ala Glu Glu Ala Ala Leu Gly Pro Thr Glu Pro Ala 305 310 315 320 Glu Gly Leu Ser Ala Pro Ser Leu Ser Pro His Cys Cys Pro Cys Arg 325 330 335 Ala Arg Leu Ala Phe Arg Asn Leu Gly Ala Leu Leu Pro Arg Leu His 340 345 350 Gin Leu Cys Cys Arg Met Pro Arg Thr Leu Arg Arg Leu Phe Val Ala 35S 360 365 Glu Leu Cys Ser Trp Met Ala Leu Met Thr Phe Thr Leu Phe Tyr Thr 370 375 380 Asp Phe Val Gly Glu Gly Leu Tyr Gin Gly Val Pro Arg Ala Glu Pro 385 390 395 400 Gly Thr Glu Ala Arg Arg His Tyr Asp Glu Gly Val Arg Met Gly Ser 405 410 415 Leu Gly Leu Phe Leu Gin Cys Ala Ile Ser Leu Val Phe Ser Leu Val 420 425 430 Met Asp Arg Leu Val Gin Arg Phe Gly Thr Arg Ala Val Tyr Leu Ala 435 440 445 Ser Vai Ala Ala Phe Pro Val Ala Ala Gly Ala Thr Cys Leu Ser His 450 455 460 Ser Val Ala Val Val Thr Ala Ser Ala Ala Leu Thr Gly Phe Thr Phe 465 470 475 480 Ser Ala Leu Gin Ile Leu Pro Tyr Thr Leu Ala Ser Leu Tyr His Arg 485 490 495 Glu Lys Gin Val Phe Leu Pro Lys Tyr Arg Gly Asp Thr Gly Gly Ala 500 505 510 Ser Ser Glu Asp Ser Leu Met Thr Ser Phe Leu Pro Gly Pro Lys Pro 515 520 525 Gly Ala Pro Phe Pro Asn Gly His Val Gly Ala Gly Gly Ser Gly Leu 530 535 540 Leu Pro Pro Pro Pro Ala Leu Cys Gly Ala Ser Ala Cys Asp Val Ser 545 550 555 560 Val Arg Val Val Val Gly Glu Pro Thr Glu Ala Arg Val val Pro Gly 565 570 575 Arg Gly Ile Cys Leu Asp Leu Ala Ile Leu Asp Ser Ala Phe Leu Leu 580 585 590 Ser Gin Val Ala Pro Ser Leu Phe Met Gly Ser Ile Val Gin Leu Ser 595 600 605 155

Gin Ser Vai Thr Ala Tyr Met vai ser Ala Ala Gly Leu Gly Leu Val 610 615 620 Ala Ile Tyr Phe Ala Thr Gin Val Val Phe Asp Lys Ser Asp Leu Ala 625 630 635 640 Lys Tyr Ser Ala Met Vai Gin Arg Leu Trp Val Ser Arg Leu Leu Arg 645 650 655 His Arg Lys Ala Gin Leu Leu Leu Val Asn Leu Leu Thr Phe Gly Leu 66 0 665 670 Glu Vai Cys Leu Ala Ala Gly Ile Thr Tyr Val Pro Pro Leu Leu Leu 675 680 685 Glu Vai Gly Vai Glu Glu 690

<210> 48 <211> 694 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> P501S humano (aminoácidos 1-50) fundido a C-LytA de St. pneum. epitopo P2 auxiliar C-Lyta fundido a P501S humano (aminoácidos 51-553) - codão optimizado <400> 48

Met Val Gin Arg Leu Trp Val Ser Arg Leu Leu Arg His Arg Lys Ala 1 5 10 15 Gin Leu Leu Leu val Asn Leu Leu Thr Phe Gly Leu Glu Val Cys Leu 20 25 30 Ala Ala Gly Ile Thr Tyr Val Pro Pro Leu Leu Leu Glu Val Gly Val 35 40 45 Glu Glu Met Ala Ala Ala Tyr Val His Ser Asp Gly Ser Tyr Pro Lys 50 55 60 Asp Lys Phe Glu Lys Ile Asn Gly Thr Trp Tyr Tyr Phe Asp Ser Ser 65 70 75 80 Gly Tyr Met Leu Ala Asp Arg Trp Arg Lys His Thr Asp Gly Asn Trp 85 90 95 Tyr Trp Phe Asp Asn Ser Gly Glu Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys Ile 100 105 110 Ala Asp Lys Trp Tyr Tyr Phe Asn Glu Glu Gly Ala Met Lys Thr Gly 115 120 125 Trp Val Lys Tyr Lys Asp Thr Trp Tyr Tyr Leu Asp Ala Lys Glu Gly 130 135 140 Ala Met Gin Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu 145 150 155 160 156

Gly Vai Met Vai Ser Asn Ala Phe Ile Gin Ser Ala Asp Gly Thr Gly 165 170 175 Trp Tyr Tyr Leu Lys Pro Asp Gly Thr Leu Ala Asp Arg Pro Glu Lys 180 185 190 Phe Met Tyr Met Vai Leu Gly Ile Gly Pro Vai Leu Gly Leu Vai Cys 195 200 205 Vai Pro Leu Leu Gly Ser Ala Ser Asp His Trp Arg Gly Arg Tyr Gly 210 215 220 Arg Arg Arg Pro Phe Ile Trp Ala Leu Ser Leu Gly Ile Leu Leu Ser 225 230 235 240 Leu Phe Leu Ile Pro Arg Ala Gly Trp Leu Ala Gly Leu Leu Cys Pro 245 250 255 Asp Pro Arg Pro Leu Glu Leu Ala Leu Leu Ile Leu Gly Vai Gly Leu 260 265 270 Leu Asp Phe Cys Gly Gin Vai Cys Phe Thr Pro Leu Glu Ala Leu Leu 275 280 285 Ser Asp Leu Phe Arg Asp Pro Asp His Cys Arg Gin Ala Tyr Ser Vai 290 295 300 Tyr Ala Phe Met Ile Ser Leu Gly Gly Cys Leu Gly Tyr Leu Leu Pro 305 310 315 320 Ala Ile Asp Trp Asp Thr Ser Ala Leu Ala Pro Tyr Leu Gly Thr Gin 325 330 335 Glu Glu Cys Leu Phe Gly Leu Leu Thr Leu He Phe Leu Thr Cys Vai 340 345 350 Ala Ala Thr Leu Leu Vai Ala Glu Glu Ala Ala Leu Gly Pro Thr Glu 355 360 365 Pro Ala Glu Gly Leu Ser Ala Pro Ser Leu Ser Pro His Cys Cys Pro 370 375 380 Cys Arg Ala Arg Leu Ala Phe Arg Asn Leu Gly Ala Leu Leu Pro Arg 385 390 395 400 Leu His Gin Leu Cys Cys Arg Met Pro Arg Thr Leu Arg Arg Leu Phe 405 410 415 Vai Ala Glu Leu Cys Ser Trp Met Ala Leu Met Thr Phe Thr Leu Phe 420 425 430 Tyr Thr Asp Phe Vai Gly Glu Gly Leu Tyr Gin Gly Vai Pro Arg Ala 435 440 445 Glu Pro Gly Thr Glu Ala Arg Arg His Tyr Asp Glu Gly Vai Arg Met 450 455 460 Gly Ser Leu Gly Leu Phe Leu Gin Cys Ala Ile Ser Leu Vai Phe Ser 465 470 475 480 Leu Vai Met Asp Arg Leu Vai Gin Arg Phe Gly Thr Arg Ala Vai Tyr 485 490 495 Leu Ala Ser Vai Ala Ala Phe Pro Vai Ala Ala Gly Ala Thr Cys Leu 500 505 510 Ser His Ser Vai Ala Vai Vai Thr Ala Ser Ala Ala Leu Thr Gly Phe 515 520 525 Thr Phe Ser Ala Leu Gin Ile Leu Pro Tyr Thr Leu Ala Ser Leu Tyr 530 535 540 His Arg Glu Lys Gin Vai Phe Leu Pro Lys Tyr Arg Gly Asp Thr Gly 545 550 555 560 Gly Ala Ser Ser Glu Asp Ser Leu Met Thr Ser Phe Leu Pro Gly Pro 565 570 575 157

Lys Pro Gly Ala Pro Phe Pro Asn 580 Gly Leu Leu Pro Pro Pro Pro Ala 595 600 Vai Ser Vai Arg Vai Vai Vai Gly 610 615 Pro Gly Arg Gly Ile Cys Leu Asp 625 630 Leu Leu Ser Gin Vai Ala Pro Ser 645 Leu Ser Gin Ser Vai Thr Ala Tyr 660 Leu Vai Ala lie Tyr Phe Ala Thr 675 680 Leu Ala Lys Tyr Ser Ala 690

Gly His Vai Gly Ala Gly Gly Ser 585 590

Leu Cys Gly Ala Ser Ala Cys Asp 605

Glu Pro Thr Glu Ala Arg Vai Vai 620

Leu Ala Ile Leu Asp Ser Ala Phe 635 640

Leu Phe Met Gly Ser Ile Vai Gin 650 655

Met Vai Ser Ala Ala Gly Leu Gly 665 670

Gin Vai Vai Phe Asp Lys Ser Asp 685

<210> 49 <211> 1971 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <2 2 3> ADN codificando MUC-1 Humano fundido a C-LytA de St. pneum. epitopo P2 auxiliar C-Lyta <400> 49 atgacaccgg gcacccagtc tcctttcttc gttacaggtt ctggtcatgc aagctctacc cagagaagtt cagtgcccag ctctactgag ctctccagcc acagccccgg ttcaggctcc gccccggcca cggaaccagc ttcaggttca gtcccagtca ccaggccagc cctgggctcc gccccggaca acaagccagc cccgggctcc gccccggaca ccaggccgcc cccgggctcc gccccggaca ccaggccgcc cccgggctcc gccccggaca ccaggccggc cccgggctcc gccccggaca acaggcccgc cttggcgtcc gcctcaggct ctgcatcagg ctcagcttct gctaccacaa ccccagccag caagagcact actcctacca cccttgccag ccatagcacc acggtacctc ctctcacctc ctccaatcac tctttctttt tcctgtcttt tcacatttca cccagcaccg actactacca agagctgcag tataaacaag ggggttttct gggcctctcc gtacaattga ctctggcctt ccgagaaggt ctgctgctgc tcctcacagt gcttacagtt 60 ccaggtggag aaaaggagac ttcggctacc 120 aagaatgctg tgagtatgac cagcagcgta 180 tccaccactc agggacagga tgtcactctg 240 gctgccacct ggggacagga tgtcacctcg 300 accaccccgc cagcccacga tgtcacctca 360 accgcccccc cagcccacgg tgtcacctcg 420 accgcccccc cagcccacgg tgtcacctcg 480 accgcgcccg cagcccacgg tgtcacctcg 540 accgcccccc cagcccatgg tgtcacctcg 600 accgcccctc cagtccacaa tgtcacctcg 660 actctggtgc acaacggcac ctctgccagg 720 ccattctcaa ttcccagcca ccactctgat 780 aagactgatg ccagtagcac tcaccatagc 840 agcacttctc cccagttgtc tactggggtc 900 aacctccagt ttaattcctc tctggaagat 960 agagacattt ctgaaatgtt tttgcagatt 1020 aatattaagt tcaggccagg atctgtggtg 1080 accatcaatg tccacgacgt ggagacacag 1140 158 ttcaatcagt ataaaacgga agcagcctct cgatataacc tgacgatctc agacgtcagc 1200 gtgagtgatg tgccatttcc tttctctgcc cagtctgggg ctggggtgcc aggctggggc 1260 atcgcgctgc tggtgctggt ctgtgttctg gttgcgctgg ccattgtcta tctcattgcc 1320 ttggctgtct gtcagtgccg ccgaaagaac tacgggcagc tggacatctt tccagcccgg 1380 gatacctacc atcctatgag cgagtacccc acctaccaca cccatgggcg ctatgtgccc 1440 cctagcagta ccgatcgtag cccctatgag aaggtttctg caggtaatgg tggcagcagc 1500 ctctcttaca caaacccagc agtggcagcc acttctgcca acttgatggc ggccgcttac 1560 gtacattccg acggctctta tccaaaagac aagtttgaga aaatcaatgg cacttggtac 1620 tactttgaca gttcaggcta tatgcttgca gaccgctgga ggaagcacac agacggcaac 1680 tggtactggt tcgacaactc aggcgaaatg gctacaggct ggaagaaaat cgctgataag 1740 tggtactatt tcaacgaaga aggtgccatg aagacaggct gggtcaagta caaggacact 1800 tggtactact tagacgctaa agaaggcgcc atgcaataca tcaaggctaa ctctaagttc 1860 attggtatca ctgaaggcgt catggtatca aatgccttta tccagtcagc ggacggaaca 1920 ggctggtact acctcaaacc agacggaaca ctggcagaca ggccagaatg a 1971

<210> 50 <2ll> 656 <212> PRT <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> MUC-1 humano fundido a C-LytA de St. pneum. epitopo P2 auxiliar C-Lyta <400> 50

Met Thr Pro Gly Thr Gin Ser Pro Phe Phe Leu Leu Leu Leu Leu Thr 1 5 10 15 vai Leu Thr Vai Vai Thr Gly Ser Gly His Ala Ser Ser Thr Pro Gly 20 25 30 Gly Glu Lys Glu Thr Ser Ala Thr Gin Arg Ser Ser Vai Pro Ser Ser 35 40 45 Thr Glu Lys Asn Ala Vai Ser Met Thr Ser Ser Vai Leu Ser Ser His 50 55 60 Ser Pro Gly Ser Gly Ser Ser Thr Thr Gin Gly Gin Asp Vai Thr Leu 65 70 75 80 Ala Pro Ala Thr Glu Pro Ala Ser Gly Ser Ala Ala Thr Trp Gly Gin 85 90 95 Asp Vai Thr Ser Vai Pro Vai Thr Arg Pro Ala Leu Gly Ser Thr Thr 100 105 110 Pro Pro Ala His Asp Vai Thr Ser Ala Pro Asp Asn Lys Pro Ala Pro 115 120 125 Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Vai Thr Ser Ala Pro Asp Thr 130 135 140 159

Arg Pro Pro Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser 145 150 155 160 Alá Pro Asp Thr Arg Pro Pro Pro Gly Ser Thr Ala Pro Ala Ala His 165 170 175 Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala 180 185 190 Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Asn Arg Pro Ala Leu 195 200 205 Ala Ser Thr Ala Pro Pro Val His Asn Val Thr Ser Ala Ser Gly Ser 210 215 220 Ala Ser Gly Ser Ala Ser Thr Leu Val His Asn Gly Thr Ser Ala Arg 225 230 235 240 Ala Thr Thr Thr Pro Ala Ser Lys Ser Thr Pro Phe Ser Ile Pro Ser 245 250 255 His His Ser Asp Thr Pro Thr Thr Leu Ala Ser His Ser Thr Lys Thr 260 265 270 Asp Ala Ser Ser Thr His His Ser Thr Val Pro Pro Leu Thr Ser Ser 275 280 285 Αεη His Ser Thr Ser Pro Gin Leu Ser Thr Gly Val Ser Phe Phe Phe 290 295 300 Leu Ser Phe His Ile Ser Asn Leu Gin Phe Asn Ser Ser Leu Glu Asp 305 310 315 320 Pro Ser Thr Asp Tyr Tyr Gin Glu Leu Gin Arg Asp Ile Ser Glu Met 325 330 335 Phe Leu Gin Ile Tyr Lys Gin Gly Gly Phe Leu Gly Leu Ser Asn Ile 340 345 350 Lys Phe Arg Pro Gly Ser Val Val Val Gin Leu Thr Leu Ala Phe Arg 355 360 365 Glu Gly Thr Ile Asn Val His Asp Val Glu Thr Gin Phe Asn Gin Tyr 370 375 380 Lys Thr Glu Ala Ala Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asp Val Ser 385 390 395 400 val Ser Asp val Pro Phe Pro Phe Ser Ala Gin Ser Gly Ala Gly Val 405 410 415 Pro Gly Trp Gly Ile Ala Leu Leu Val Leu Val Cys Val Leu Val Ala 420 425 430 Leu Ala Ile Val Tyr Leu Ile Ala Leu Ala Val Cys Gin Cys Arg Arg 435 440 445 Lys Asn Tyr Gly Gin Leu Asp Ile Phe Pro Ala Arg Αβρ Thr Tyr His 450 455 460 Pro Met Ser Glu Tyr Pro Thr Tyr His Thr His Gly Arg Tyr Val Pro 465 470 475 480 Pro Ser Ser Thr Asp Arg Ser Pro Tyr Glu Lys Val Ser Ala Gly Asn 4B5 490 495 Gly Gly Ser Ser Leu Ser Tyr Thr Asn Pro Ala Val Ala Ala Thr Ser 500 505 510 Ala Asn Leu Met Ala Ala Ala Tyr Val His Ser Asp Gly Ser Tyr Pro 515 520 525 Lys Asp Lys Phe Glu Lys Ile Asn Gly Thr Trp Tyr Tyr Phe Asp Ser 530 535 540 Ser Gly Tyr Met Leu Ala Asp Arg Trp Arg Lys His Thr Asp Gly Asn 545 550 555 560 160

Trp Tyr Trp Phe Asp Asn Ser Gly Glu Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys 565 570 575

Ile Ala Asp Lys Trp Tyr Tyr Phe Asn Glu Glu Gly Ala Met Lys Thr 580 585 590

Gly Trp Vai Lys Tyr Lys Asp Thr Trp Tyr Tyr Leu Asp Ala Lys Glu 595 600 605

Gly Ala Met Gin Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr 610 615 620

Glu Gly Vai Met Vai Ser Asn Ala Phe ile Gin Ser Ala Asp Gly Thr 625 630 635 640

Gly Trp Tyr Tyr Leu Lys Pro Asp Gly Thr Leu Ala Asp Arg Pro Glu 645 650 655

<210> 51 <211> 2037 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> ADN codificando C-LytA de St. pneum. epitopo P2 auxiliar C-LytA fundido a MUC-1 humano <400> 51 atgggatgga gctgtatcat gtccaaatgg cggccgctta aaaatcaatg gcacttggta aggaagcaca cagacggcaa tggaagaaaa tcgctgataa tgggtcaagt acaaggacac atcaaggcta actctaagtt atccagtcag cggacggaac aggccagaaa tgacaccggg cttacagttg ttacaggttc tcggctaccc agagaagttc agcagcgtac tctccagcca gtcactctgg ccccggccac gtcacctcgg tcccagtcac gtcacctcag ccccggacaa gtcacctcgg ccccggacac gtcacctcgg ccccggacac gtcacctcgg ccccggacac gtcacctcgg ccccggacaa gtcacctcgg cctcaggctc tctgccaggg ctaccacaac cactctgata ctcctaccac cctcttcttg gtagcaacag cgtacattcc gacggctctt ctactttgac agttcaggct ctggtactgg ttcgacaact gtggtactat ttcaacgaag ttggtactac ttagacgcta cattggtatc actgaaggcg aggctggtac tacctcaaac cacccagtct cctttcttcc tggtcatgca agctctaccc agtgcccagc tctactgaga cagccccggt tcaggctcct ggaaccagct tcaggttcag caggccagcc ctgggctcca caagccagcc ccgggctcca caggccgccc ccgggctcca caggccgccc ccgggctcca caggccggcc ccgggctcca caggcccgcc ttggcgtcca tgcatcaggc tcagcttcta cccagccagc aagagcactc ccttgccagc catagcacca ctacaggtgt ccactcccag 60 atccaaaaga caagtttgag 120 atatgcttgc agaccgctgg 180 caggcgaaat ggctacaggc 240 aaggtgccat gaagacaggc 300 aagaaggcgc catgcaatac 360 tcatggtatc aaatgccttt 420 cagacggaac actggcagac 480 tgctgctgct cctcacagtg 540 caggtggaga aaaggagact 600 agaatgctgt gagtatgacc 660 ccaccactca gggacaggat 720 ctgccacctg gggacaggat 780 ccaccccgcc agcccacgat 840 ccgccccccc agcccacggt 900 ccgccccccc agcccacggt 960 ccgcgcccgc agcccacggt 1020 ccgccccccc agcccatggt 1080 ccgcccctcc agtccacaat 1140 ctctggtgca caacggcacc 1200 cattctcaat tcccagccac 1260 agactgatgc cagtagcact 1320 161 caccatagca cggtacctcc tctcacctcc tccaatcaca gcacttctcc ccagttgtct 1380 actggggtct ctttcttttt cctgtctttt cacatttcaa acctccagtt taattcctct 1440 ctggaagatc ccagcaccga ctactaccaa gagctgcaga gagacatttc tgaaatgttt 1500 ttgcagattt ataaacaagg gggttttctg ggcctctcca atattaagtt caggccagga 1560 tctgtggtgg tacaattgac tctggccttc cgagaaggta coatcaatgt ccacgacgtg 1620 gagacacagt tcaatcagta taaaacggaa gcagcctctc gatataacct gacgatctca 1680 gacgtcagcg tgagtgatgt gccatttcct ttctctgccc agtctggggc tggggtgcca 1740 ggctggggca tcgcgctgct ggtgctggtc tgtgttctgg ttgcgctggc cattgtctat 1800 ctcattgcct tggctgtctg tcagtgccgc cgaaagaact acgggcagct ggacatcttt 1860 ccagcccggg atacctacca tcctatgagc gagtacccca cctaccacac ccatgggcgc 1920 tatgtgcccc ctagcagtac cgatcgtagc ccctatgaga aggtttctgc aggtaatggt 1980 ggcagcagcc tctcttacac aaacccagca gtggcagcca cttctgccaa cttgtag 2037

<210> 52 <211> 678 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> C-LytA de St. pneum. epitopo P2 auxiliar C-LytA fundido a MUC-1 humano <400> 52

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Vai Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Vai His Ser Gin Vai Gin Met Ala Ala Ala Tyr Vai His Ser Asp Gly 20 25 30 Ser Tyr Pro Lys Asp Lys Phe Glu Lys Ile Asn Gly Thr Trp Tyr Tyr 35 40 45 Phe Asp Ser Ser Gly Tyr Met Leu Ala Asp Arg Trp Arg Lys His Thr 50 55 60 Asp Gly Asn Trp Tyr Trp Phe Asp Asn Ser Gly Glu Met Ala Thr Gly 65 70 75 80 Trp Lys Lys Ile Ala Asp Lys Trp Tyr Tyr Phe Asn Glu Glu Gly Ala 85 90 95 Met Lys Thr Gly Trp Vai Lys Tyr Lys Asp Thr Trp Tyr Tyr Leu Asp 100 105 110 Ala Lys Glu Gly Ala Met Gin Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile 115 120 125 Gly Ile Thr Glu Gly Vai Met Vai Ser Asn Ala Phe Ile Gin Ser Ala 130 135 140 Asp Gly Thr Gly Trp Tyr Tyr Leu Lys Pro Asp Gly Thr Leu Ala Asp 145 150 155 160 Arg Pro Glu Met Thr Pro Gly Thr Gin Ser Pro Phe Phe Leu Leu Leu 165 170 175 162

Leu Leu Thr Val Leu Thr < ft> Val Thr Gly Ser Gly His Ala Ser Ser 180 185 190 Thr Pro Gly Gly Glu Lys Glu Thr Ser Ala Thr Gin Arg Ser Ser Val 195 200 205 Pro Ser Ser Thr Glu Lys Asn Ala Val Ser Met Thr Ser Ser Val Leu 210 215 220 Ser Ser Hls Ser Pro Gly Ser Gly Ser Ser Thr Thr Gin Gly Gin Asp 225 230 235 240 Vai Thr Leu Ala Pro Ala Thr Glu Pro Ala Ser Gly Ser Ala Ala Thr 245 250 255 Trp Gly Gin Asp Val Thr Ser Val Pro Val Thr Arg Pro Ala Leu Gly 260 265 270 Ser Thr Thr Pro Pro Ala His Asp Val Thr Ser Ala Pro Asp Asn Lys 275 280 285 Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala 290 295 300 Pro Asp Thr Arg Pro Pro Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly 305 310 315 320 Vai Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Pro Pro Gly Ser Thr Ala Pro 325 330 335 Ala Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly 340 345 350 Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Asn Arg 355 360 365 Pro Ala Leu Ala Ser Thr Ala Pro Pro Val His Asn Val Thr Ser Ala 370 375 380 Ser Gly Ser Ala Ser Gly Ser Ala Ser Thr Leu Val His Asn Gly Thr 385 390 395 400 Ser Ala Arg Ala Thr Thr Thr Pro Ala Ser Lys Ser Thr Pro Phe Ser 405 410 415 ile Pro Ser His His Ser Asp Thr Pro Thr Thr Leu Ala Ser His Ser 420 425 430 Thr Lys Thr Asp Ala Ser ser Thr His His Ser Thr Val Pro Pro Leu 435 440 445 Thr Ser Ser Asn His Ser Thr Ser Pro Gin Leu Ser Thr Gly Val Ser 450 455 460 Phe Phe Phe Leu Ser Phe His Ile Ser Asn Leu Gin Phe Asn Ser Ser 465 470 475 480 Leu Glu Asp Pro Ser Thr Asp Tyr Tyr Gin Glu Leu Gin Arg Asp Ile 485 490 495 Ser Glu Met Phe Leu Gin Ile Tyr Lys Gin Gly Gly Phe Leu Gly Leu 500 505 510 Ser Asn Ile Lys Phe Arg Pro Gly Ser Val Val Val Gin Leu Thr Leu 515 520 525 Ala Phe Arg Glu Gly Thr ile Asn val His Asp Val Glu Thr Gin Phe 530 535 540 Asn Gin Tyr Lys Thr Glu Ala Ala Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile Ser 545 550 555 560 Asp Vai Ser Val Ser Asp Val Pro Phe Pro Phe Ser Ala Gin Ser Gly 565 570 575 Ala Gly Val Pro Gly Trp Gly Ile Ala Leu Leu Val Leu Val Cys Val 580 585 590 Leu Val Ala Leu Ala Ile Val Tyr Leu Ile Ala Leu Ala Val Cys Gin 595 600 605 163

Cys Arg Arg Lys Asn Tyr Gly Gin 610 615

Thr Tyr His Pro Met Ser Glu Tyr 625 630

Tyr Vai Pro Pro Ser Ser Thr Asp 645

Ala Gly Asn Gly Gly Ser Ser Leu 660

Ala Thr Ser Ala Asn Leu 675

Leu Asp Ile Phe Pro Ala Arg Asp 620

Pro Thr Tyr His Thr His Gly Arg 635 640

Arg Ser Pro Tyr Glu Lys Vai Ser 650 655

Ser Tyr Thr Asn Pro Ala Vai Ala 665 670

Lisboa, 4 de Julho de 2007

REIVINDICAÇÕES 164

Claims

1. Proteína parceira de fusão compreendendo um domínio de ligação à colina e um epitopo heterólogo auxiliar T promíscuo.

2. Proteína parceira de fusão de acordo com a reivindicação 1, em que o domínio de ligação à colina é o C-terminal de LytA ou um seu derivado, em que o derivado do C-terminal de LytA retém a capacidade de actuar como um parceiro imunológico e como um intensificador de expressão.

3. Proteína parceira de fusão de acordo com a reivindicação 2, em que o C-LytA ou seu derivado compreende, pelo menos, quatro repetições de qualquer das SEQ ID N°:l a 6.

4. Proteína parceira de fusão de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, em que o domínio de ligação à colina é seleccionado do grupo compreendendo: a) o domínio do C-terminal de LytA como apresentado em SEQ ID N°:7; ou b) a sequência de SEQ ID N°:8; ou c) uma sequência peptídica compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo, pelo menos, 85% de identidade, de um modo preferido, pelo menos, 90% de identidade, de um modo mais preferido, pelo menos, 95% de identidade, de um modo muito preferido, pelo menos, 97-99% de identidade, com qualquer de SEQ ID N°:l a 6; ou d) uma sequência peptídica compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem, pelo menos, 15, 20, 30, 40, 50 2 ou 100 aminoácidos contíguos da sequência de aminoácidos de SEQ ID a N°:7 ou SEQ ID N°:8.

5. Proteína de fusão compreendendo uma proteína parceira de fusão como reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 4 e uma proteína heteróloga.

6. Proteína de fusão como reivindicado na reivindicação 5, em que a proteína heteróloga é quimicamente conjugada ao parceiro de fusão.

7. Proteína de fusão como reivindicado na reivindicação 5 ou 6, em que a proteína heteróloga é derivado de um organismo seleccionado do seguinte grupo: Vírus da imunodeficiência humana HIV-1, vírus herpes simplex humano, citomegalovírus, Rotavírus, vírus de Epstein Barr, Vírus da Varicella Zoster, de um vírus da hepatite, tal como o vírus da hepatite B, vírus da hepatite A, vírus da hepatite C e vírus da hepatite E, de vírus Sincicial Respiratório, vírus da parainfluenza, vírus do sarampo, vírus da parotidite, vírus do papiloma humano, flavivírus ou vírus de Influenza, de Neisseria spp, Moraxella spp, Bordetella spp; Mycobacterium spp., incluindo M. tuberculosis; Escherichia spp, incluindo E. coli enterotóxica; Salmonella spp; Listeria spp; Helicobacter spp; Staphylococcus spp., incluindo S. aureus, S. epidermidis; Borrelia spp; Chlamydia spp., incluindo C. trachomatis, C. pneumoniae; Plasmodium spp., incluindo P. falciparum; Toxoplasma spp., Candida spp.

8. Proteína de fusão como reivindicado na reivindicação 5 ou 6, em que a proteína heteróloga é uma proteína associada a tumor ou proteína específica de tecido ou seu fragmento imunogénico. 3

9. Proteína de fusão como reivindicado na reivindicação 8, em que a proteína heteróloga ou seu fragmento é seleccionada de MAGE 1, MAGE 3, MAGE 4, PRAME, BAGE, LAGE 1, LAGE 2, SAGE, HAGE, XAGE, PSA, PAP, PSCA, prosteína, P501S, HASH2, Cripto, B726, NY-BR1.1, P510, MUC-1, Prostase, STEAP, tirosinase, telomerase, survivina, CASB616, P53 ou her 2 neu.

10. Proteína de fusão como reivindicado em qualquer das reivindicações 6 a 9 compreendendo ainda um marcador de afinidade ou, pelo menos, 4 resíduos de histidina.

11. Sequência de ácido nucleico codificando uma proteína da reivindicação 1 a 10.

12. Vector de expressão compreendendo uma sequência de ácido nucleico da reivindicação 11.

13. Célula hospedeira transformada com uma sequência de ácido nucleico da reivindicação 11 ou com um vector de expressão da reivindicação 12.

14. Composição imunogénica compreendendo uma proteína como reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 10 ou uma sequência de ADN como reivindicado na reivindicação 11 e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

15. Composição imunogénica como reivindicado na reivindicação 14 que compreende ainda um adjuvante indutor de TH-1.

16. Composição imunogénica como reivindicado na reivindicação 15, em que o adjuvante indutor de TH-1 é seleccionado do grupo de adjuvantes compreendendo: 3D-MPL, QS21, uma mistura 4 de QS21 e colesterol, um oligonucleótido CpG ou uma mistura de dois ou mais dos referidos adjuvantes.

17. Processo para a preparação de uma composição imunogénica como reivindicado em qualquer das reivindicações 14 a 16, compreendendo a mistura da proteína de fusão de qualquer das reivindicações 6 a 10 ou do polinucleótido codificante da reivindicação 11 com um adjuvante, diluente ou outro veículo farmaceuticamente aceitável adequado.

18. Processo para a produção de uma proteína de fusão de qualquer das reivindicações 1 a 10, compreendendo a cultura de uma célula hospedeira da reivindicação 13 sob condições suficientes para a produção da referida proteína de fusão e a recuperação da proteína de fusão do meio de cultura.

19. Proteína de qualquer das reivindicações 1 a 10 ou uma sequência de ADN da reivindicação 11 para utilização em medicina.

20. Utilização de uma proteína como reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 10 ou uma sequência de ADN da reivindicação 11 na produção de uma composição imunogénica para induzir uma resposta imunológica num doente.

21. Utilização de acordo com a reivindicação 20, em que referida resposta imunológica é para ser induzida por administração sequencial i) da referida proteína seguida por pela referida sequência de ADN; ou ii) da referida sequência de ADN seguida pela referida proteína.

22. Utilização de acordo com a reivindicação 21, em que a referida sequência de ADN é revestida sobre esferas 5 biodegradáveis ou distribuída através de uma abordagem de bombardeamento de partículas.

23. Utilização de acordo com a reivindicação 21 ou reivindicação 22, em que a referida proteína é adjuvantada.

24. Utilização de uma proteína como reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 10 ou uma sequência de ADN da reivindicação 11 na produção de uma composição imunogénica para tratar imunoterapeuticamente um doente que sofre ou é susceptível ao cancro.

25. Utilização de acordo com a reivindicação 24, em que o referido cancro é o cancro da próstata, cancro do cólon, cancro do pulmão, cancro da mama ou melanoma. Lisboa, 4 de Julho de 2007 6