KR20050010040A - 면역원성 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 면역학적 융합 파트너로서, 발현 인핸서로서 작용하는 융합 파트너, 바람직하게는 상기 두 기능을 모두 할 수 있는 융합 파트너에 관한 것이다. 상세하게는, 소위 콜린 결합 도메인, 예컨대 폐렴연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae) 유래의 LytA를 함유하는 융합체 또는 이종 T-헬퍼 에피토프의 병입을 위해 콜린 결합 도메인을 변형시킨 폐렴구균의 파지 CP1 리소자임(CPL1)을 함유하고, 항원, 구체적으로 종양 특이 항원이나 조직 특이 항원과 같은 자가항원 등의 불량면역원성 항원에 융합된 융합 파트너를 제공한다. 또한, 본 발명은 이러한 융합 파트너를 함유하는 융합 단백질, 이의 제조방법, 이 융합 단백질의 면역원성 조성물 및 백신으로서의 용도 및 의약으로서의 용도에 관한 것이다.
Description
폐렴연쇄상구균은 세포벽의 펩티도글리칸 주쇄를 특이적으로 분해하여 사실상 세포용해를 유도하는 자가용해소인 N-아세틸-L-알라닌 아미다제, LytA를 합성한다. LytA의 폴리펩타이드는 2개의 도메인을 갖고 있다. Lyt의 N-말단 도메인은촉매 활성에 역할을 하고, LytA의 C-말단 도메인은 콜린 친화성 및 세포벽 고착에 역할을 한다. LytA의 C-말단 도메인은 콜린 및 콜린 유사체에 결합하는 것으로 알려져 있고, 또한 크로마토그래피에 일반적으로 사용되는 DEAE(디에틸 아미노 에틸) 등의 3차 아민에도 결합할 것이다.
LytA는 318개의 아미노산으로 이루어진 단백질이고, C-말단부는 각각 20개 또는 21개 아미노산으로 이루어진 일련의 6가지 불완전 반복체를 포함한다. 이 반복체는 다음과 같은 위치에 존재한다:
R1: 177-191
R2: 192-212
R3: 213-234
R4: 235-254
R5: 255-275
R6: 276-298
이러한 반복체는 베타-턴(beta-turn) 형태로 추정되고 있다. C-말단은 콜린 결합에 역할을 한다. 이와 유사하게, CPL1의 C-말단은 결합 친화성에 역할을 하고, 이러한 결합에는 반복체 중의 방향족 잔기가 기여한다. 이 단백질들은 신속한 정제를 도모하는 친화성 태그(tag)로서 사용되고 있다(Sanchez Puelles, Eur J Biochem. 1992, 203, 153-9).
콜린 결합 도메인을 가진 다른 단백질도 폐렴연쇄상구균에서 연구되었다.
이 중 하나인, PspA(또는 폐렴구균 표면 단백질 A)는 독성 인자이다(YotherJ and Briles(1992) J Bacteriol 174(2) P 601). 이 단백질은 항원성이며 면역원성이다. 이 단백질은 LytA의 반복체와 상동성인 20개 아미노산의 10개의 반복체로 이루어진 C-말단 도메인을 보유한다.
CbpA(또는 콜린 결합 단백질 A)는 인간 세포에 대한 폐렴구균의 부착에 관여한다(Resenow et al(1997) Mol Microbiol 25(5) p 819). 이 단백질은 C-말단 도메인에 PspA와 거의 동일한 20개 아미노산의 10개 반복체를 나타낸다.
LytB 및 LytC는 각자 콜린 결합 도메인으로서 전술한 단백질과 다른 양식의 단위 기구를 보유하여, 각각 15개와 11개의 반복체로 구성되며, C-말단 단부가 아닌 N-말단 단부에 위치한다(Garcia P Mol Microbiol(1999) 31(4) p1275 and Garcia P et al(1999) Mol Microbiol 33(1) p128). 서열을 비교해보면, LytB가 글루코스아미다제 활성이 있는 것으로 나타나고, LytC는 시험관내에서 리소자임형 활성을 나타낸다. 또한, PepA, PepB 및 PepC라고 하는 3개의 유전자는 1995년에 이미 클로닝되었다. 이 유전자들의 기능은 알려져 있지 않지만, LytA의 반복체와 상동성인 다양한 수의 반복체를 보유하고 있다.
파지는 감염사에서 박테리아 중으로의 통과를 용이하게 하는 뮤레인 가수분해효소를 합성한다. 이 가수분해효소는 콜린 결합 도메인을 보유한다. 파지 Cp-1의 뮤라미다제(muramidase) CPL1은 익히 알려져 있다. 이 단백질은 콜린의 특이적 인식에 관여하는 C 말단에 각각 20개 아미노산으로 이루어진 6개의 반복체를 보유한다(Garcia J.L. J.Virol 61(8) p2573-80; (1987) 및 Garcia E Prol Natl Acad Sci(1988) p914). LytA와 CPL1 반복체 비교를 통해, 이 반복체들의 시작부 콘센서스(consensus)가 이루어지게 할 수 있다.
또한, 파지 Dp-1(Garcia P et al(1983) J Gen Microbiol 129(2) p489), CpI-9(Garcia P et al(1989) Biochem Biophys Res Commun 158(1) p251, HB-3 Romero et al 1990 J Bacteriol 172(9) p5064-5070) 및 EJ-1(Diaz(1992) J Bacteriol 174(17) p 5516)의 뮤레인 가수분해효소들도 콜린 결합 도메인의 특징을 나타낸다.
이러한 성질은 또한 폐렴구균 파지 CP-1에 의해 암호화된 리소자임에도 존재한다. WO 99/10375는 특히 His 태그와 LytA의 C-말단 부(여기서는 C-LytA)에 결합된 인간 유두종 바이러스 단백질 E6 또는 E7 및 차등 친화성 크로마토그래피에 의한 이 단백질들의 정제에 대해 개시하고 있다. 또한, WO 99/40188에서도 특히 His 테일과 분자의 N-말단에 C-LytA 부를 보유하는 MAGE 항원을 포함하는 융합 단백질에 대해 설명하고 있다.
본 발명자들은 놀랍게도 본 발명에 따른 융합 파트너가 이종 단백질에 융합되었을 때 부착된 이종 단백질의 면역원성을 향상시킬 수 있음을 발견하였다. 또한, 부착된 이종 단백질의 발현율도 향상될 수 있음을 발견하였다. 따라서, 본 발명은 바람직한 구체예로 발현 인핸서로서 작용할 수 있는 향상된 면역원성 융합 파트너를 제공한다.
본 발명은 면역학적 융합 파트너로서, 발현 인핸서로서 작용하는 융합 파트너, 바람직하게는 상기 두 기능을 모두 할 수 있는 융합 파트너에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 융합 파트너를 포함하는 융합 단백질, 이의 제조방법, 이 융합 단백질의 백신으로서의 용도 및 의약으로서의 용도에 관한 것이다. 상세하게는, 소위 콜린 결합 도메인, 예컨대 폐렴연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae) 유래의 LytA를 포함하는 융합체 또는 이종 T-헬퍼 에피토프의 병입을 위해 콜린 결합 도메인을 변형시킨 폐렴구균의 파지 CP1 리소자임(CPL1)을 포함하는 융합 파트너를 제공한다. 이러한 융합 파트너는 여기에 부착된 이종 단백질의 발현율을 증가시키고, 특히 백신 항원으로서도 유용한 면역원성불량 단백질이나 펩타이드에 융합시킨 경우에 유용한 것으로 확인되었다. 보다 상세하게는, 이러한 융합 파트너는 자기항원, 예컨대 종양 특이 항원이나 조직 특이 항원을 포함하는 작제물에 유용하다.
도 1: C-LytA의 서열 정보. 각 반복체는 다음과 같은 정렬 프로그램을 통해 다중 서열 정렬과 2차 구조 예측에 기초하여 정의하였다: 1) MatchBox(Depiereux E et al.,(1992) Comput Applic Biosci 8:501-9); 2) ClustalW(Thompson JD et al.(1994) Nucl Acid Res 22:4673-80); 3) Block-Maker(Henikoff S et al(1995) Gene 163:gc17-26).
도 2: CPC 및 천연 작제물(서열번호 27-36).
도 3: S.세레비지에에서 발현된 CPC-p501 His 융합 단백질의 개략적 구조.
도 4: CPC-P501 His 융합 단백질의 1차 구조(서열번호 41)
도 5: CPC P501 His(pRIT15201)의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 42)
도 6: 플라스미드 pRIT 15201 제조를 위한 클로닝 전략
도 7: pRIT 15201의 플라스미드 맵
도 8: S.세레비지에 균주 DC5에서 CPC P501과 P501의 비교 발현
도 9: CPC-P501S HIS(Y1796)의 소량 생산. 도 9A는 은 염색을 이용한 SDS-PAGE를 통해 추정되는 항원 생산성을 나타내고, 도 9B는 웨스턴 블롯으로 추정되는 항원 생산성을 나타낸 것이다.
도 10: Y1796에 의해 생산되는 CPC-P501-His의 정제 도식
도 11: CPC P501 His 정제 단백질의 패턴(4 내지 12% Novex Nu-Page 폴리아크릴아마이드 예비주조된 겔)
도 12: 천연 전장의 P501S 서열(서열번호 17)
도 13: JNW735의 CPC-P501S 발현 카세트의 서열(서열번호 18)
도 14: 2개의 코돈 최적화 P501S 서열(서열번호 19-20)
도 15: 재조작된 코돈 최적화 서열 19(서열번호 21)
도 16: 재조작된 코돈 최적화 서열 20(서열번호 22)
도 17: CPC 최적화를 위한 개시 서열(서열번호 23)
도 18: 대표적인 코돈 최적화 CPC 서열(서열번호 24-25)
도 19: 조작된 CPC 코돈 최적화 서열(서열번호 26)
도 20: P501S CPC 융합 후보 작제물 및 서열(서열번호 37-40 및 45-48)
도 21: P501S(JNW680), CPC-P501S(JNW735) 및 대조 벡터로의 순간 형질감염 후의 CHO 세포의 웨스턴 블롯 분석
도 22: pVAC-P501S(JNW680, 마우스 B1-9) 또는 대조 벡터(pVAC, 마우스 A1-6)로 0일, 21일 및 42일째 면역화 후 나타나는 항P501S 항체 반응. -1일째 사전혈액을 채취했다. 이어서, 28일과 49일째(마우스 A1-3, B1-3) 및 56일째(마우스 A4-6, B4-9) 혈액을 채취했다. 모든 혈청은 1/100 희석하에 실험했다. pVAC 면역화된 마우스가 나타내는 결과를 평균을 내고, 각각의 pVAC-P501S 면역화 마우스의 결과는 제시한 바와 같다. 양성 대조군으로 아데노-P501S 면역화 마우스의 혈청(Corixa Corp., 1/100 희석)을 사용하였다.
도 23: 0일, 21일, 42일 및 70일째 pVAC-P501S(JNW680)로 면역화한 C57BL/6 마우스를 이용한 펩타이드 라이브러리 스크린. 모든 펩타이드는 50㎍/ml의 최종 농도로 사용했다. 펩타이드 1 내지 50은 코릭사에서 입수한 중첩성 15 내지 20mer이다. 펩타이드 51-70은 추론된 8-9mer Kb 및 Db 에피토프이고, 미모토프스(UK)에게 주문한 것이다. 샘플 71-72 및 73-78은 DMSO 대조군으로서 각각 펩타이드가 무첨가된 대조군이다. 그래프 A는 IFN-γ 반응을 도시한 것이고, 그래프 B는 IL-2 반응을 도시한 것이다. 후속 면역분석법에 사용하기 위해 선발한 펩타이드는 흑색으로 표시한 것이다.
도 24: 0일, 21일, 42일 및 70일째 pVAC-P501S(JNW680, B6-9) 및 대조 pVAC(A4-6)로 PMID 면역화 후 77일째 ELISPOT으로 시험한 세포 반응. 펩타이드 18, 22 및 48은 50㎍/ml로 사용했다. CPC-P501S 단백질은 20㎍/ml로 사용했다. 그래프 A는 IFN-γ 반응을 도시한 것이고, 그래프 B는 IL-2 반응을 도시한 것이다.
도 25: P501S와 CPC-P501S의 비교. 세포 반응은 28일째 펩타이드 22(10㎍/ml)를 사용하여 IL-2 ELISPOT로 측정했다. 마우스는 0일과 21일째 대조 pVAC(대조군), pVAC-P501S(JNW680) 및 CPC-P501S(JNW735)로 PMID 면역화시켰다.
도 26: CPC-P501S로 단백질 면역화 후 나타나는 면역 반응(비장 세포에서의 림프증식)
도 27: 여러 CPC-P501S 작제물에 대한 면역 반응의 평가. 세포 반응은 28일째 IL-2 ELISPOT로 측정했다. 마우스 면역화는 0일과 21일째 p7313, 즉 무첨가(대조군), JNW735 및 CPC-P501S 작제물(JNW770, 771 및 773)로 PMID로 실시했다.
도 28: MUC-1 CPC 서열(서열번호 49 및 50)
도 29: ss-CPC-MUC-1 서열(서열번호 51 및 52)
본 발명은 다음 실시예를 참조로 하여 보다 상세히 설명될 것이다.
발명의 개요
따라서, 본 발명은 콜린 결합 도메인 또는 이의 단편 또는 이의 유사체, 및 이종의 무차별 T 헬퍼 에피토프, 바람직하게는 무차별 MHC II형 T-에피토프를 포함하는 융합 파트너 분자를 포함한다. 여기서, 융합 파트너 분자는 면역학적 융합 파트너 또는 발현 인핸서로서 작용할 수 있고, 바람직하게는 면역학적 파트너 뿐만 아니라 발현 인핸서로서 작용할 수 있는 특성을 보유한 것이다. 무차별 T-헬퍼 에피토프는 1종 이상의 MHC II형 대립유전자, 바람직하게는 3종 이상의 MHC II형 대립유전자에 결합하는 에피토프이다. 특히, 이러한 에피토프들은 각종 MHC 일배체형을 발현하는 다수의 개체에서 헬퍼 T 세포 반응을 유도할 수 있다. 경우에 따라, 융합 단백질은 콜린에 결합하는 특성을 보유할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 콜린 결합 잔기(moiety)는 LytA의 C 말단에서 유래한다. 바람직하게, C-LytA 또는 이의 유도체는 도 1에 제시한 반복체 R1 내지 R6(서열번호 1 내지 6) 중에서 선택되는 임의의 적어도 4개의 반복체를 포함하는 것이 좋다. 가장 바람직한 구체예에서, C-LytA는 제1 반복체의 일부와 나머지 5개 반복체 전체를 포함하는 아미노산 177-298인 것이다.
추가의 양태로, 본 발명은 이종 단백질을 추가로 포함하는, 본 명세서에 정의한 바와 같은 융합 파트너를 제공한다. 여기서, 이종 단백질은 융합 파트너에 화학적으로 접합 또는 융합할 수 있다. 이종 단백질은 종양 관련 항원 또는 이의 면역원성 단편인 것이 바람직하다.
추가의 양태로, 본 발명은 본 명세서에 정의한 바와 같은 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 제공한다. 또한, 이 핵산을 포함하는 발현 벡터 및 이 핵산이나 벡터로 형질전환된 숙주도 제공한다.
추가 양태로, 본 발명은 본 명세서에 기술된 단백질이나 핵산과 함께 약제학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 이 면역원성 조성물은 추가로 Th-1 유도 보강제를 포함하는 것이 바람직하다.
추가 양태로, 본 발명은 의약용인 면역원성 조성물 또는 단백질 및 핵산을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 감염 질환이나 암 질환의 치료 또는 예방에 사용하거나 환자의 면역반응을 유도하는 약제의 제조에 사용하기 위한 본 발명의 단백질이나 핵산을 제공한다.
추가 양태로, 본 발명은 본 명세서에 기술한 바와 같은 조성물이나 핵산을 안전하고 유효한 양으로 투여하여 감염 질환이나 암 질환, 구체적으로 유방, 폐(특히 비소형 세포 폐 암종), 결장직장, 난소, 전립선, 위 및 기타 GI(위장)의 암종을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
추가 양태로, 본 발명은 본 발명의 핵산이나 단백질을 약제학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체와 혼합하여 본 명세서에 기술한 바와 같은 면역원성 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
발명의 상세한 설명
본 명세서에 기술한 바와 같이, 본 발명의 일 구체예에서 변형된 콜린 결합 도메인(융합 파트너)는 발현 인핸서로서 작용하는 특성을 보유하여, 수득되는 최종 융합 단백질은 비융합 단백질과 비교하여 SDS-PAGE 이후 쿠마시 블루 염색이나 은 염색한 다음, 선택적으로 겔 스캐닝을 통해 측정했을 때, 보다 높은 수율, 바람직하게는 약 100%(2배) 또는 150% 이상의 높은 수율로 숙주 세포에서 발현될 수 있는것이다. 본 발명에 따라 변형된 콜린 결합 도메인은 또한 면역학적 파트너로서 작용할 수 있어, 수득되는 이종 단백질을 보유한 최종 융합 단백질은 미융합된 이종 단백질과 비교했을 때 숙주 내에서 보다 면역원성이 강한 것이다.
본 발명의 다른 구체예에서, 변형된 콜린 결합 도메인은 면역학적 융합 파트너로서 작용할 수 있는 특성을 보유하여, 이종 단백질 단독물과 비교했을 때 향상된 면역반응을 융합 단백질을 통해 제공한다.
바람직한 구체예에서, 변형된 콜린 결합 도메인은 면역학적 융합 파트너로서 뿐만 아니라 발현 인핸서로서 작용하는 능력을 보유한 이중 기능이 있는 것이다.
바람직한 구체예에서, 콜린 결합 잔기는 LytA의 C 말단에서 유래되는 것이다. 바람직하게는, C-LytA 또는 이의 유도체는 적어도 2개의 반복체, 바람직하게는 적어도 4개의 반복체를 포함한다. 여기서, C-LytA 유도체는 본 발명에 따른 C-LytA의 변형체, 즉 면역학적 파트너 및 발현 인핸서로서 작용하는 특성을 보유한 변형체를 의미한다. 바람직한 변형체에는, 예컨대 도 1에 제시한 반복체 R1 내지 R6(서열번호 1 내지 6) 중 임의의 반복체와 적어도 85% 동일성, 바람직하게는 적어도 90% 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 95% 동일성, 가장 바람직하게는 적어도 97 내지 99% 동일성을 보유한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 또는 도 1에 게시한 아미노산 서열(서열번호 1 내지 8)에서 유래하는 적어도 15개, 20개, 30개, 40개, 50개 또는 100개의 인접 아미노산을 보유하는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드가 포함된다.
따라서, 일 양태로서 본 발명은 변형된 콜린 결합 도메인 및 이종의 무차별T 헬퍼 에피토프를 포함하되, 상기 콜린 결합 도메인이
a) 서열번호 7에 기술한 LytA의 C-말단 도메인;
b) 서열번호 8의 서열;
c) 서열번호 1 내지 6 중 임의의 서열과 적어도 85% 동일성, 바람직하게는 적어도 90% 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 95% 동일성, 가장 바람직하게는 적어도 97 내지 99% 동일성을 보유한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 서열;
d) 서열번호 7 또는 서열번호 8의 아미노산 서열에서 유래하는 적어도 15개, 20개, 30개, 40개, 50개 또는 100개의 인접 아미노산을 보유하는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 서열을 포함하는 그룹 중에서 선택되는, 융합 파트너 단백질을 제공한다.
가장 바람직한 구체예에서, C-LytA는 도 1에 제시한 바와 같이, 제1 반복체의 일부와 나머지 5개 반복체 전체를 포함하는 아미노산 177-298인 것이다.
융합 파트너의 제2 성분인 이종 T-세포 에피토프는 인간 중에서 1종 이상의 MHC II 분자를 발현하는 다수의 개체에 결합하는 에피토프 그룹 중에서 선택되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 파상풍 변성독소 유래의 P2 에피토프 및 P30 에피토프가 있다[Panina-Bordignon Eur.J.Immunol. 19(12), 2237 (1989)]. 바람직한 구체예에서, 이종 T-세포 에피토프는 파상풍독소 유래의 P2 또는 P30이다.
P2 에피토프는 QYIKANSKFIGITE 서열을 갖고 있고 파상풍 독소의 아미노산 830 내지 843에 해당한다. P30 에피토프(파상풍 독소의 잔기 947-967)는 FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE 서열을 갖고 있다. FNNFTV 서열은 선택적으로 결실될 수있다. 또 다른 보편적인 T-세포 에피토프는 열대열원충(Plasmodium falciparum)의 포자소체 단백질에서 유래하는 것으로서, 특히 서열 DIEKKIAKMEKASSVFNVVNS을 갖는 영역 378-398인 것이다(Alexander J, (1994) Immunity 1(9), p 751-761). 다른 에피토프는 홍역 바이러스 융합 단백질에서 유래하는, 잔기 288 내지 302의 LSEIKGVIVHRLEGV(Partidos CD, 1990, J.Gen.Virol. 71(9), 2099-2105) 서열을 갖는 것이다. 또 다른 에피토프는 B형 간염 바이러스 표면 항원에서 유래하는 것으로서, 특히 FFLLTRILTIPQSLD 서열을 갖는 아미노산이다. 또 다른 에피토프 군으로는 디프테리아 독소에서 유래하는 것이 있다. 이러한 펩타이드들 중 4개(아미노산 271-290, 321-340, 331-350, 351-370)는 독소 중 단편 B의 T 도메인에 위치하고, 나머지 2개는 R 도메인에 위치한다(411-430, 431-450):
PVFAGANYAAWAVNVAQVI
VHHNTEEIVAQSIALSSLMV
QSIALSSLMVAQAIPLVGEL
VDIGFAAYNFVESIINLFQV
QGESGHDIKITAENTPLPIA
GVLLPTIPGKLDVNKSKTHI
(Raju R., Navaneetham D., Okita D., Diethlm-Okita B., McCormick D., Conti-Fine B.M.(1995) Eur. J. Immunol. 25:3207-14).
이종 T-에피토프는 적어도 4개의 반복체, 바람직하게는 반복체 2 내지 5개를 포함하는 C-LytA에 융합되는 것이 바람직하다. 경우에 따라, 이 T-에피토프의 C-말단에는 1종 이상의 후속 반복체가 융합될 수도 있다. 대안적으로, 이종 T-에피토프는 총 4개 이상의 반복체를 포함하는 C-LytA의 2개의 연속 반복체 사이에 삽입되거나, 또는 총 4개 이상의 반복체를 포함하는 C-LytA의 반복체들 중 하나에 삽입되는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, C-LytA가 6개의 반복체를 포함하고, 이 C-LytA의 6번째 반복체의 개시부 및 그 반복체 내에 이종 에피토프가 삽입된 것이 좋다.
본 발명은 다른 양태로서, 전술한 적어도 하나의 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질, 뿐만 아니라 이 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를, 일반적으로 생리학적 허용성 담체 및/또는 면역자극제를 포함하는 백신 조성물 등의 약학적 조성물 형태로 제공한다. 따라서, 상기 융합 파트너의 N-말단이나 C-말단 중 어느 한 단부에는 자기단백질이나 다른 불량면역원성 단백질을 융합시킬 수 있다. 대안적으로, 융합 파트너 내에 자기단백질이나 불량면역원성 단백질을 삽입시킬 수도 있다. 선택적 구체예에서는, 대안적인 불량면역원성 단백질의 단부에 히스티딘 태그, 또는 적어도 4개, 바람직하게는 6개 이상의 히스티딘 잔기를 융합시킬 수도 있다. 이로써, 일반적으로 적어도 4개, 바람직하게는 6개 이상의 잔기를 포함하는 히스티딘 테일(tail)이 금속 이온에 결합하기 때문에 친화성 크로마토그래피 단계를 통한 단백질의 정제가 가능해지며, 금속 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피(IMAC)에 적합하다.
따라서, 전형적인 작제물의 예는 다음과 같다:
- 불량면역원성 단백질 ―C-LytA 반복체1-4- P2에피토프(C-LytA 반복체5에 삽입되거나 치환됨) ―C-LytA 반복체6
- C-LytA 반복체1-4- P2에피토프(C-LytA 반복체5에 삽입되거나 치환됨)―C-LytA 반복체6―불량면역원성 단백질
- 불량면역원성 단백질 ―C-LytA 반복체2-5- P2에피토프(C-LytA 반복체6에 삽입됨)
- C-LytA 반복체2-5- P2에피토프(C-LytA 반복체6에 삽입됨) ―불량면역원성 단백질
- 불량면역원성 단백질―C-LytA 반복체1-5- P2에피토프(C-LytA 반복체6에 삽입됨)
- C-LytA 반복체1-5- P2에피토프(C-LytA 반복체6에 삽입됨) ―불량면역원성 단백질
- 불량면역원성 단백질 - C-LytA 반복체1에 삽입된 P2에피토프 - C-LytA 반복체1-5-
- C-LytA 반복체1에 삽입된 P2에피토프 ―C-LytA 반복체2-5- 불량면역원성 단백질
- 불량면역원성 단백질―C-LytA 반복체1에 삽입된 P2에피토프―C-LytA 반복체2-6
- C-LytA 반복체1에 삽입된 P2에피토프 ―C-LytA 반복체2-5―불량면역원성 단백질
- 불량면역원성 단백질 ―C-LytA 반복체1- C-LytA 반복체2에 삽입된 P2에피토프 ―C-LytA 반복체3-6
- C-LytA 반복체1- C-LytA 반복체2에 삽입된 P2에피토프―C-LytA 반복체3-6―불량면역원성 단백질;
여기서, "∼에 삽입된"이란 표현은 잔기 1과 2 사이, 또는 잔기 2와 3 사이 등과 같이 반복체 내의 임의의 위치를 의미한다.
무차별 T 헬퍼 에피토프는, 예를 들어 P2 에피토프가 6번째 반복체 내에 삽입되어 있는, C-LytA 반복체2-5―C-LytA 반복체 6a―P2에피토프―C-LytA 반복체 6b와 같은 반복 영역에 삽입될 수 있다(도 2 참조).
다른 바람직한 구체예에서, CPL1의 C-말단 단부(C-CPL1)은 C-LytA 대신에 사용될 수 있다.
또는, 상기 작제물의 P2 에피토프는 다른 무차별 T 에피토프, 예컨대 P30 등으로 대체될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 2종 이상의 무차별 에피토프가 융합 작제물의 일부이지만, 융합 파트너는 가능한 한 작게 유지하는 것이 잠재적방해성 CD8+ 에피토프 및 B 에피토프의 수를 제한하므로 바람직하다. 따라서, 융합 파트너는 100 내지 140개 아미노산 보다 크지 않은 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 120개 아미노산 보다 크지 않은 것이며, 전형적인 것은 약 100개 아미노산이다.
융합 파트너가 융합되는 항원의 소스(source)는 박테리아, 바이러스, 원생생물, 진균류 또는 인간 등의 포유동물일 수 있다.
본 발명의 융합 파트너는 전립선, 유방, 결장직장, 폐, 췌장, 난소, 신장 또는 흑색종의 암들에 대한 항원과 같은 종양 관련 항원이나 조직 특이 항원 등의 자기항원에 융합시키는 것이 바람직하다. 따라서, 이러한 자기항원이나 종양 항원의 단편도 본 발명의 융합 파트너에 융합시킬 수 있음은 자명한 것이다. 일반적으로, 단편은 전장 서열 중 적어도 20개, 바람직하게는 50개, 보다 바람직하게는 100개의 인접 아미노산을 포함하는 것이다. 일반적으로, 이러한 단편은 1 이상의 트랜스멤브레인 도메인이 제거되거나 또는 약 3개, 5개, 8개, 10개, 15개, 20개, 28개, 33개, 50개, 54개 아미노산으로 이루어진 N-말단이나 C-말단 결실부를 보유하는 것일 수 있다. 적당한 단편이 사용되었을 때, 이러한 단편은 전장 단백질을 인식하는 면역반응을 유발할 수 있다. 특히 바람직한 본 발명의 폴리펩타이드의 예는 융합 파트너에 융합된 종양 관련 단백질이나 조직 특이 단백질 중 적어도 10개, 바람직하게는 20개, 보다 바람직하게는 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개의 아미노산을 포함하는 것이다.
본 발명의 폴리펩타이드는 면역원성으로서, 크립토(cripto) 발현암을 보유한 환자의 항혈청 및/또는 T-세포를 이용하는 면역분석(예, ELISA 또는 T-세포 자극 분석)에서 검출가능하게 반응한다. 이러한 면역원성 활성의 선별은 당업자에게 익히 공지된 기술을 통해 수행할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]에 기술된 방법 등을 통해 상기 선별을 수행할 수 있다. 하나의 예로서, 폴리펩타이드는 고체 지지체에 고정시키고 환자의 혈청과 접촉시키면 혈청 내의 항체가 상기 고정된 폴리펩타이드에 결합하게 된다. 그 다음, 미결합 혈청은 제거하고, 결합된 항체는 예컨대125I-표지된 프로테인(Protein) A를 사용하여 검출할 수 있다. 당업자라면 이미 인식하였을 것으로, 종양 관련 항원이나 종양 특이 항원의 면역원성 부 역시 본 발명에 포함된다. 여기에 사용된 "면역원성 부"란 폴리펩타이드를 인식하는 B-세포 및/또는 T-세포 표면 항원 수용체들과 면역학적으로 반응성인(즉, 특이적으로 결합성인) 단편을 의미한다. 면역원성 부는 일반적으로 공지의 기술, 예컨대 문헌[Paul, Fundamental Immunology, 3rd ed., 243-247(Raven Press, 1993)] 및 여기에 인용된 문헌들에 요약된 기술 등을 이용하여 확인할 수 있다. 이러한 기술로는 항원 특이 항체, 항혈청 및/또는 T-세포주 또는 클론과의 반응성에 대한 폴리펩타이드의 선별 방법 등이 있다. 본 명세서에 사용된, 항혈청 및 항체는 항원에 특이적으로 결합한다면(즉, ELISA 또는 기타 다른 면역분석에서 상기 단백질과는 반응하지만 다른 미관련 단백질에 의해서는 검출가능한 반응성을 보이지 않는다면)"항원 특이성"인 것이다. 이러한 항혈청 및 항체는 본 명세서에 기술된 바와 같이, 공지의 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 바람직한 일 구체예에서, 폴리펩타이드의 면역원성 부는 전장 폴리펩타이드가 나타내는 반응성 보다 실질적으로 적지 않은 반응성으로 항혈청 및/또는 T-세포와 반응하는 부를 의미한다(예컨대 ELISA 및/또는 T-세포 반응성 분석에서). 이러한 면역원성 부의 면역원성 활성 수준은 바람직하게는 전장 폴리펩타이드의 면역원성의 적어도 약 50%, 보다 바람직하게는 적어도 약 70%, 가장 바람직하게는 약 90% 이상인 것이다. 일부 경우에는, 해당 전장 폴리펩타이드의 면역원성 보다 초과된 면역원성 활성의 수준을 보유하는, 예컨대 약 100% 이상 또는 150% 이상의 면역원성 활성을 보유하는 바람직한 면역원성 부도 확인되기도 한다.
특정 다른 구체예에서, 면역원성 부의 예는 N-말단 리더 서열 및/또는 트랜스멤브레인 도메인이 결실된 펩타이드를 포함하는 것일 수 있다. 다른 면역원성 부의 예는 성숙 단백질에 비해 작은 N-말단 및/또는 C-말단 결실(예컨대, 약 1 내지 50개 아미노산, 바람직하게는 약 1 내지 30개 아미노산, 보다 바람직하게는 약 5 내지 15개 아미노산 결실)을 포함하는 것일 수 있다.
항원이나 이로부터 유래되는 단편의 예로는 MAGE1, MAGE3 및 MAGE4 또는 WO 99/40188에 개시된 바와 같은 다른 MAGE 항원들, PRAME(WO 96/10577), BAGE, RAGE, LAGE 1(WO 98/32855), LAGE 2(NY-ESO-1로도 알려져 있음, WO 98/14464), XAGE(Liu et al., Cancer Res, 2000, 60:4752-4755; WO 02/18584), SAGE 및 HAGE(WO 99/53061) 또는 GAGE(Robbins and Kawakami, 1996, Current Opinions inImmunology 8, pps 628-636; Van den Eynde et al., International Journal of Clinical & Laboratory Research (submitted 1997); Correale et al.(1997), Journal of the National Cancer Institute 89, p293)가 있다. 이러한 항원들은 사실상 다양한 종류의 종양, 예컨대 흑색종, 폐암종, 육종 및 방광 암종 등에서 발현된다.
바람직한 구체예에서는 전립선 항원들이 이용되는데, 그 예로는 전립선 특이 항원(PSA), PAP, PSCA(PNAS 95(4) 1735-1740 1998), PSMA 또는 프로스타제(prostase)로 알려진 항원 등이 있다.
특히 바람직한 구체예에서, 전립선 항원은 P501S 또는 이의 단편이다. 프로스테인(prostein)으로도 불린(Xu et al., Cancer Res. 61, 2001, 1563-1568) P501S는 WO98/37814에 개시된 서열번호 113으로 공지된 서열을 가진 553개 아미노산의 단백질이다. 특히, 이 특허 출원에 개시된 바와 같은 적어도 20개, 바람직하게는 50개, 보다 바람직하게는 100개의 인접 아미노산을 포함하는 면역원성 단편 및 면역원성 부도 본 발명에 이용된다. 바람직한 단편은 WO 98/50567(PS108 항원)에 개시된 것과 전립선 암 관련 단백질(WO 99/67384의 서열번호 9)로서 개시된 것이다. 다른 바람직한 단편은 전장 P501S 단백질의 아미노산 51-553, 34-553 또는 55-553이다. 특히, 작제물 1, 2 및 3(도 2 참조, 서열번호 27 내지 32)은 특별히 고찰하였는데, 이는 효모계에서 발현시킬 수 있었다. 예를 들어, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열은 효모계에서 발현시킬 수 있다.
프로스타제는 보존성 세린 프로테아제 촉매작용의 3원소(triad)인 H-D-S와아미노 말단의 프리프로펩타이드 서열을 보유하는 254개 아미노산 길이의 전립선 특이성인 세린 프로테아제(트립신 유사)로서, 잠재적 분비 기능을 나타낸다(P. Nelson, Lu Gan, C.Ferguson, P.Moss, R.linas, L.Hood & K.Wand, "Molecular cloning and characterisation of prostase, an androgen-regulated serine protease with prostate restricted expression, In Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999) 96, 3114-3119). 추정되는 글리코실화 부위도 설명되어 있다. 예상 구조는 다른 공지의 세린 프로테아제와 매우 유사하여, 성숙 폴리펩타이드는 하나의 도메인에 접혀질 것임을 암시한다. 성숙 단백질은 자연 가공처리되는 것으로 확인된 하나의 A2 에피토프를 보유하는 224개 아미노산 길이를 갖고 있다. 프로스타제 뉴클레오타이드 서열과 이로부터 추론된 폴리펩타이드 서열 및 상동체는 문헌[Ferguson et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999, 3114-3119) 및 국제특허출원 WO98/12302(또한, 이에 상응하는 특허허여된 US 5,955,306), WO 98/20117(또한 이에 상응하는 특허허여된 US 5,840,871 및 US 5,786,148)(전립선 특이 칼리크레인) 및 WO 00/04149(P703P)에 개시되어 있다.
다른 전립선 특이 항원은 WO 98/37418 및 WO00/04149에 공지되어 있다. 또 다른 항원은 STEAP(PNAS 96 14523 14528, 7-12, 1999)이다.
본 발명의 상황에 유용한 다른 종양 관련 항원으로는 Plu-1(J.Biol.Chem. 274(22) 15633-15645, 1999), HASH-1, HASH-2(Alders, M. et al., Hum.Mol.Genet. 1997, 6, 859-867), 크립토(Salomon et al. Bioassays 199, 21 61-70, US 특허 5654140), CASB616(WO 00/53216), 크립틴(Criptin)(US5,981,215)이 있다. 또한,암치료용 백신으로서 특별한 관련이 있는 항원으로는 타이로시나제, 텔로머라제, P53, NY-Br1.1(WO 01/47959) 및 이의 단편들(WO 00/43420), B726(WO 00/60076, 서열번호 469 및 463; WO 01/79286, 서열번호 474 및 475), P510(WO 01/34802, 서열번호 537 및 538) 및 설비빈(survivin)이 있다.
또한, 본 발명은 유방암 항원, 예컨대 Her-2/neu, 맘마글로빈(mammaglobin) (US 특허 5,668,267), B305D(WO 00/61753, 서열번호 299, 304, 305 및 315), 또는 WO 00/52165, WO 99/33869, WO 99/19479, WO 98/45328에 개시된 항원들과 조합되어도 유용하다. Her-2/neu 항원은 특히 US 특허 5,801,005호에 개시되어 있다. Her-2/neu는 전체 세포외 도메인(약 아미노산 1 내지 645번 포함) 또는 이의 단편과 대략 C 말단의 580개 아미노산인 전체 세포내 도메인이나 적어도 이의 면역원성 부를 포함하는 것이 바람직하다. 특히, 세포내 부는 인산화 도메인 또는 이의 단편을 함유해야만 한다. 이러한 작제물은 WO 00/44899에 개시되어 있다. 특히 바람직한 작제물은 ECD-PhD로 알려진 것이고, 그 다음은 ECD 델타PhD(WO 00/44899)로 알려진 것이다. 본 명세서에 사용된 Her-2/neu는 래트, 마우스 또는 인간에서 유래하는 것일 수 있다.
특정 종양 항원은 작은 펩타이드 항원(즉, 약 50개 미만의 아미노산)이다. 이 항원들은 본 발명의 변형된 콜린 결합 단백질에 화학적으로 접합될 수 있다.
펩타이드의 예로는 뮤신 유래의 펩타이드, 예컨대 MUC-1(예컨대, US 5,744,144; US 5,827,666; WO 88/05054, US 4,963,484 참조)가 있다. 특별히 고찰된 것은 MUC-1 펩타이드의 적어도 하나의 반복 단위(unit), 바람직하게는 2개 이상의 상기 반복체를 포함하고 SM3 항체(US 6,054,438)에 의해 인식되는 MUC-1 유래의 펩타이드이다. 다른 뮤신 유래의 펩타이드로서, MUC-5 유래의 펩타이드가 있다.
또는, 상기 항원에는 IL13 및 IL14와 같은 인터루킨이 있으며, 이 또한 바람직하다. 또한, 상기 항원은 각종 암 치료 또는 면역거세에 유용한 짧은 10개 아미노산 길이의 펩타이드인 전장의 생식샘자극호르몬 방출 호르몬(GnRH, WO 95/20600)과 같은 자기펩타이드 호르몬일 수 있다.
다른 종양 특이 항원도 본 발명의 변형된 콜린 결합 단백질과 커플링하기에 적합한데, 그 예로는 GM2 및 GM3과 같은 종양 특이 강글리오사이드 등이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다.
이러한 펩타이드의 변형된 콜린 결합 단백질에 대한 공유 커플링은 당해 기술분야에 공지된 방법으로 수행할 수 있다. 예를 들어, 직접 공유 커플링 반응에는, 카르보디이미드, 글루타르알데하이드 또는 (N-[γ-말레이미도부티릴옥시]숙신이미드 에스테르를 이용할 수 있으며, 일반적으로 CDAP 및 SPDP와 같은 시중에서 입수용이한 헤테로이작용성 링커(제조자의 지시에 따라)를 사용할 수 있다. 커플링 반응 후에는, 투석, 겔 여과, 분별법 등을 통해 면역원을 용이하게 분리 및 정제할 수 있다.
항원은 또한 인간에게 병원성인 소스에서 유래하는 것일 수 있는데, 그 예로는 인간 면역결핍증 바이러스 HIV-1(예, tat, nef, 역전사효소, gag, gp120 및 gp160), 인간 단순 헤르페스 바이러스(예, HSV1 또는 HSV2 유래의 ICP27과 같은 인접 조기 단백질 또는 gD 또는 이의 유도체), 사이토메갈로바이러스(특히 인간, 예gB 또는 이의 유도체), 로타바이러스(예, 생약독화 바이러스 포함), 엡스타인 바르 바이러스(예, gp350 또는 이의 유도체), 바리셀라 조스터 바이러스(예, gpI, II 및 IE63), 또는 다른 간염 바이러스 유래, 예컨대 B형 간염 바이러스(예, B형 간염 바이러스 표면 항원 또는 이의 유도체), A형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스 및 E형 간염 바이러스 유래이거나 또는 다른 바이러스 병원균, 예컨대 파라믹소바이러스류, 즉 호흡기세포융합바이러스(예, F 및 G 단백질 또는 이의 유도체), 파라인플루엔자 바이러스, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 인간 유두종 바이러스(예, HPV6, 11, 16, 18, ..), 플라비바이러스(예, 황열병 바이러스, 뎅기 바이러스, 진드기 매개 뇌염 바이러스, 일본뇌염 바이러스) 또는 인플루엔자 바이러스(계란이나 MDCK 세포에서 증식시킨 완전 생바이러스 또는 불활성 바이러스, 부분 인플루엔자 바이러스); 또는 완전 플루 바이로좀(R.Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920 참조) 또는 이의 정제 단백질이나 재조합 단백질, 예컨대 HA, NP, NA 또는 M 단백질이나, 이의 복합물); 또는 박테리아 병원균, 예컨대 N.고노레아(N.gonorrhea) 및 N.메닝지티디스(N.meningitidis)(예컨대, 협막 다당류 및 이의 접합체, 트란스페린 결합 단백질, 락토페린 결합 단백질, PilC, 부착소)을 비롯한 나이제리아 종; S.피오제네스(S. pyogenes)(예, M 단백질 또는 이의 단편, C5A 프로테아제, 리포테이코산), S.아갈락티애(S. agalactiae), S. 뮤탄스(S.mutans); H. 두크레이(H. ducreyi); 모락셀라(Moraxella) 종, 예컨대 브란하멜라 카타랄리스(Branhamella catarrhalis)로도 알려진 M. 카타랄리스(cararrhalis)(예, 고분자량 및 저분자량의 부착소 및 침입소); 보르데텔라 종, 예컨대 B.페르투시스(B.pertussis)(예컨대, 퍼탁틴, 페르투시스 독소 또는 이의 유도체, 섬유상 헤마글루티닌, 아데닐레이트 사이클라제, 핌프리애(fimbriae)), B.파라페르투시스(B.parapertussis) 및 B.브론치셉티카(B.bronchiseptica); 마이코박테리움 종, 예컨대 M.튜베르큘로시스(예, ESAT6, 항원 85A, 85B 또는 85C), M.보비스(M.bovis), M.레프라에(M.leprae), M.아비움(M.avium), M.파라튜베르큘로시스(M.paratuberculosis), M.스메그마티스(M.smegmatis); 레지오넬라 종, 예컨대 L.뉴모필라(L.pneumophila); 에세리히아 종, 예컨대 내독소 대장균(예, 집락화 인자, 열불안정성 독소 또는 이의 유도체, 열안정성 독소 또는 이의 유도체), 장출혈성 대장균, 장병원성 대장균(예, 시가 독소 유독소 또는 이의 유도체); 비브리오 종, 예컨대 V.콜레라(예, 콜레라 독소 또는 이의 유도체); 시겔라 종, 예컨대 S.손네이(S.sonnei), S.디센테이애(S.dysenteriae), S.플렉스네리(S.flexnerii); 에르시니아 종, 예컨대 Y.엔테로콜리티카(Y.enterocolitica)(예, Yop 단백질), Y.페스티스(Y.pestis); Y.슈도튜베르큘로시스(Y.pseudotuberculosis); 캄필로박터 종, 예컨대 C.제주니(C.jejuni)(예, 독소, 부착소 및 침입소) 및 C.콜리(C.coli); 살모넬라 종, 예컨대. S.티피(S.typhi), S.파라티피(S.paratyphi), S.콜레라에슈스(S.choleraesuis), S.엔테리티디스(S.enteritidis); 리스테리아 종, 예 L.모노사이토제네스(L.monocytogenes); 헬리코박터 종, 예컨대 H.피롤리(예, 우레아제, 카탈라제, 공포 독소); 슈도모나스 종, 예컨대 P.아에루기노사; 스타필로코커스 종, 예컨대 S.아우레우스, S.에피디르미디스; 엔테로코커스 종, 예컨대 E.페칼리스, E.페슘(E.faecium); 클로스트리듐 종, 예컨대 C.테타니(예컨대 파상풍 독소 및 이의 유도체), C.보툴리눔(예, 보툴리눔 독소 및 이의 유도체), C.디피실(예컨대, 클로스트리듐 독소 A 또는 B 및 이의 유도체); 바실러스 종, 예컨대 B.안트라시스(예, 보툴리눔 독소 및 이의 유도체); 코리네박테리움 종, 예컨대 C.디프테리애(예, 디프테리아 독소 및 이의 유도체); 보르렐리아 종, 예컨대 B.버그도르페리(B.burgdorferi)(예, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B.가리니(B.garinii)(예, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B.아프젤리(B.afzelii)(예, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B.안데르소니(B.andersonii)(예, OsaA, OspC, DbpA, DbpB), B.헤름시(B.hermsii); 에를리키아 종(Ehrlichia), 예컨대 E.에퀴(E.equi) 및 인간 과립구 에를리키아증의 원인제; 리케치아 종, 예, R.리케치(R.rickettsii); 클라미디아 종, 예컨대 C.트라코마티스(예, MOMP, 헤파린 결합 단백질), C.뉴모니애(예, MOMP, 헤파린 결합 단백질), C.프시타시(C.psittaci); 렙토스피라 종, 예컨대 L.인테로간스(L.interrogans); 트레포네마(Treponema) 종, 예컨대 T.팔리듐(예, 희귀 외막 단백질), T.덴티콜라, T.하이오디센테리애; 또는 기생충 유래, 예컨대 플라스모듐 종, 예컨대 P.팔시파럼; 톡소플라스마 종, 예컨대, T. 곤디(예, SAG2, SAG3, Tg34); 엔타모에바 종, 예컨대 E.히스톨리티카(histolytica); 바베시아 종, 예컨대 B.마이크로티(B.microti); 트리파노소마(Trypanosoma) 종, 예컨대 T.크루지(T.cruzi); 지아르디아(Giardia) 종, 예컨대 G.람블리아(G.lamblia); 레쉬마니아 종, 예컨대 L.메이저; 뉴모시스티스(Pneumocystis) 종, 예컨대 P.카리니; 트리코모나스 종, 예컨대 T.바지날리스; 쉬소스토마(Chisostoma) 종, 예컨대 S.만소니; 또는 효모 유래, 예컨대 칸디다 종, 예, C.알비칸스; 크립토코커스 종, 예 C.네오포르만스(C.neoformans) 등이 있다.
M.튜베르큘로시스(M.tuberculosis)의 다른 바람직한 구체적 항원으로는 예컨대 Tb Ra12, Tb H9, Tb Ra35, Tb38-1, Erd 14, DPV, MTI, MSL, mTTC2 및 hTCC1(WO 99/51748)이 있다. 또한, M.튜베르큘로시스의 단백질에는 M.튜베르큘로시스의 적어도 2개의 폴리펩타이드, 바람직하게는 3개의 폴리펩타이드가 보다 큰 단백질에 융합된 융합 단백질 및 이의 변형체가 포함된다. 바람직한 융합체로는 Ra12-TbH9-Ra35, Erd14-DPV-MTI, DPV-MTI-MSL, Erd14-DPV-MTI-MSL-mTCC2, Erd14-DPV-MTI-MSL, DPV-MTI-MSL-mTCC2, TbH9-DPV-MTI(WO 99/51749)가 있다.
클라미디아의 가장 바람직한 항원으로는 예컨대 고분자량 단백질(HWMP) (WO 99/17741), ORF3(EP 366 412) 및 추정상의 막 단백질(Pmp)이 있다. 백신 제조용의 다른 클라미디아 항원은 WO 99/28475에 기술된 그룹 중에서 선택할 수 있다.
바람직한 박테리아 항원에는 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 유래의 것(예컨대, 협막 다당류 및 이의 접합체, PsaA, PspA, 스트렙토리신, 콜린 결합 단백질) 및 단백질 항원 뉴모리신(Pneumolysin)(Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007; Rubins et al., Microbial Pathogenesis, 25, 337-342) 및 이의 돌연변이 무독화 유도체(WO 90/06951; WO 99/03884)가 있다. 다른 바람직한 박테리아 항원에는 B형 헤모필러스 인플루엔자를 비롯한 헤모필러스 종 유래의 것(예컨대, PRP 및 이의 접합체), 비형별성 H.인플루엔자 유래의 것(예, OMP26, 고분자량 부착소, P5, P6, 단백질 D 및 지단백질 D, 및 핌브린과 핌브린 유래의 펩타이드(US 5,843,464) 또는 이의 다중 카피 변형체 또는 융합 단백질)이 있다.
B형 간염 표면 항원의 유도체는 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 특히 유럽 특허 출원 EP-A-414 374; EP-A-0304 578 및 EP 198-474에 기술된 전술한 PreS1, PreS2 S 항원을 예로 들 수 있다. 바람직한 일 구체예에서, HBV 항원은 HBV 폴리머라제이다(Ji Hoon Jeong et al., 1996, BBRC 223, 264-271; Lee H.J. et al., Biotechnol. Lett. 15, 821-826). 다른 바람직한 구체예에서, 융합체 내의 항원은 특히 CHO 세포에서 발현되었을 때의 HIV-1 항원, gp120이다. 또 다른 구체예에서, 항원은 전술한 바와 같은 gD2t를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 융합체에는 인간 유두종 바이러스 유래의 항원(HPV 6a, 6b, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 및 68), 특히 생식기 사마귀의 원인으로 추정되는 HPV 혈청형(HPV 6 또는 HPV11 등), 및 경부암의 원인인 HPV 바이러스(HPV16, HPV18 등)가 포함된다.
적합한 HPV 항원은 E1, E2, E4, E5, E6, E7, L1 및 L2이다. 특히 바람직한 생식기 사마귀의 예방적 또는 치료적 융합체의 유형에는 L1 입자 또는 캡소머(capsomer) 및 HPV 6과 HPV11 단백질 E6, E7, L1 및 L2 중에서 선택되는 1종 이상의 항원을 포함하는 융합 단백질이 있다.
가장 바람직한 융합 단백질의 형태는 WO 96/26277에 개시된 바와 같은 L2E7 및 GB 9717953.5(PCT/EP98/05285)에 개시된 바와 같은 단백질D(1/3)-E7이다.
바람직한 HPV 경부 감염이나 암의 예방이나 치료용 백신 조성물은 HPV16 항원 또는 HPV18 항원을 포함할 수 있다. 예를 들어, L1 또는 L2 항원 단량체 또는 L1 항원이나 L2 항원이 바이러스 유사 입자(VLP)로서 함쎄 제공되거나 L1 단독 단백질이 VLP 또는 캡소머 구조로 단독으로 제공되었다. 이와 같은 항원들과, 바이러스 유사 입자 및 캡소머는 이미 공지되어 있다. 예컨대, WO94/00152, WO94/20137, WO94/05792 및 WO93/02184를 참조할 수 있다.
또 다른 조기 단백질이 단독으로 또는 융합 단백질로서 포함될 수 있는데, 그 예로는 E7, E2 또는 바람직하게는 E5가 있으며, 특히 바람직한 예로 L1E7 융합 단백질을 포함하는 VLP가 제시된 바 있다(WO 96/11272). 특히 바람직한 HPV16 항원에는 조기 단백질 E6 또는 E7이 단백질 D 담체와 융합하여 형성된 HPV16 유래의 단백질 D-E6 또는 E7 융합체, 이의 복합물; 또는 E6 또는 E7과 L2의 복합물(WO 96/26277)이 포함된다. 또는, HPV16 또는 HPV18 조기 단백질 E6 및 E7은 단분자, 바람직하게는 단백질 D- E6/E7 융합체로 제공될 수 있다. 다른 융합체는 경우에 따라 HPV18 유래의 E6 및 E7 단백질을 어느 하나만 또는 둘 모두를, 바람직하게는 단백질 D-E6 또는 단백질 D-E7 융합 단백질 또는 단백질 D E6/E7 융합 단백질 형태로 포함하기도 한다. 융합체는 다른 HPV 균주 유래의 항원, 바람직하게는 HPV31 또는 HPV33 유래의 균주를 포함할 수도 있다.
본 발명에 따른 융합체는 말라리아를 일으키는 기생충 유래의 항원을 포함한다. 예를 들어, 플라스모디아 팔시파럼(Plasmodia faclciparum) 유래의 바람직한 항원으로는 RTS, S 및 TRAP가 있다. RTS는 P.팔시파럼의 포자소체(CS) 단백질 중 거의 모든 C-말단 부가 B형 간염 표면 항원의 프리S2 부의 4개의 아미노산을 통해 B형 간염 바이러스의 표면(S) 항원에 결합된 하이브리드 단백질이다. 이것의 전체 구조는 국제특허출원번호 PCT/EP92/02591(공개번호 WO 93/10152, 우선권 번호 UK9124390.7)에 개시되어 있다. 효모 RTS에서 발현되는 경우에는 지단백질 입자로서 생성되고 HBV 유래의 S 항원과 공동발현되는 경우에는 RTS,S로 알려진 혼합 입자로서 생성된다. TRAP 항원은 국제특허출원번호 PCT/GB89/00895(WO 90/01496)에 개시되어 있다. 본 발명의 바람직한 구체예는 항원 제조물에 RTS,S 및 TRAP 항원의 복합물을 포함하는 융합체이다. 융합체의 성분이 될 수 있는 가능한 후보인 다른 말라리아원충의 항원은 P.팔시파럼 MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, 시쿼스트린(Sequestrin), PfEMP1, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXP1, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs16, Pfs48/45, Pfs230 및 플라스모듐 종 내의 기타 다른 유사체들이다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 융합 파트너를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 또한, 본 발명은 본 명세서에서 도 1에 제시한 폴리뉴클레오타이드 서열(서열번호 9 내지 16)에 하이브리드하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 이와 관련하여, 본 발명은 특히 본 명세서에 기술된 폴리뉴클레오타이드와 엄중 조건하에서 하이브리드하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, "엄중 조건" 및 "엄중 하이브리드 조건"은 서열 사이에 적어도 95% 동일성, 바람직하게는 적어도 97% 동일성이 있는 경우에만 발생하는 하이브리드화를 의미한다. 엄중 하이브리드화 조건의 구체적 예는 42℃에서 50% 포름아미드, 5x SSC(150mM NaCl, 15mM 구연산삼나트륨), 50mM 인산나트륨(pH 7.6), 5x 덴하르드트 용액(Denhardt's solution), 10% 덱스트란설페이트 및 20㎍/ml의 변성 전단된 연어 정자 DNA를 포함하는 용액에서 하룻밤 배양한 뒤, 하이브리드화 지지체를약 65℃에서 0.1xSSC로 세척하는 것이다. 하이브리드화 및 세척 조건은 공지되어 있으며, 문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y.,(1989), 특히 11장]에 예시되어 있다. 또한, 본 발명에 의해 제공되는 폴리뉴클레오타이드 서열에는 용액 하이브리드화를 사용할 수도 있다.
또한, 본 발명은 종양 관련 항원 또는 이의 단편에 본 발명에 따른 융합 파트너가 융합되어 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 콜린 결합 도메인과 이종의 무차별 T 헬퍼 에피토프를 포함하는 융합 파트너 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공하며, 이 때 콜린 결합 도메인은 LytA의 C 말단에서 유래하는 것이 바람직하다. 보다 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드의 C-LytA 잔기는 서열번호 9 내지 14 중 임의 서열의 적어도 4개의 반복체를 포함하고, 보다 바람직하게는 서열번호 15의 서열을 포함하고, 보다 더 바람직하게는 서열번호 16의 서열을 포함하는 것이다. 다른 관련 구체예에서, 본 발명은 본 명세서에 서열번호 9 내지 16으로 개시한 서열과 실질적인 동일성이 있는 폴리뉴클레오타이드 변형체, 예컨대 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열과 통상적인 방법(예, 표준 변수를 이용하는 BLAST 분석)을 통해 비교했을 때 서열 동일성이 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상인 폴리뉴클레오타이드 변형체를 제공한다. 또 다른 구체예에서, 권리주장된 폴리뉴클레오타이드는 추가로 이종 단백질을 포함하기도 한다.
이러한 폴리뉴클레오타이드 서열은 적당한 발현 벡터에 삽입되어 적당한 숙주에서 발현될 수도 있다. 벡터로는 본 발명의 변형된 콜린 결합 단백질을 암호화하고 융합 단백질의 생산을 위해 불량면역원성 단백질 암호화 DNA를 삽입할 수 있는 적당한 제한 부위를 포함하는 것을 사용할 수 있다. 본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩타이드 융합체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열이나 이의 단편은 적당한 숙주 세포에서 폴리펩타이드를 직접 발현시키는 재조합 DNA 분자로 사용될 수 있다. 유전자 코드 고유의 축퇴성으로 인해, 거의 동일하거나 기능적으로 등가의 아미노산 서열을 암호화하는 다른 DNA 서열이 생산될 수 있고, 이러한 서열을 소정의 폴리펩타이드의 클로닝과 발현에 사용할 수 있다.
당업자라면 잘 알고 있는 바와 같이, 몇몇 경우에는 비자연발생의 코돈을 보유하는 폴리펩타이드 암호성 뉴클레오타이드 서열을 제조하는 것이 유리한 경우도 있다. DNA 코드는 4문자(A, T, C 및 G)를 이용하여 유기체 유전자에서 단백질을 암호화하는 아미노산을 나타내는 3문자 "코돈"을 형성한다. DNA 분자를 따라 형성된 코돈의 선형 서열은 이 유전자들에 의해 암호화된 단백질(들) 중의 아미노산의 선형 서열로 해독된다. 이 코드는 고도로 축퇴성이어서, 61개의 코돈은 20개의 천연 아미노산을 암호화하고 3개의 코돈은 "종결" 시그널을 나타낸다. 따라서, 대부분의 아미노산은 1개 이상의 코돈에 의해 암호화되며, 사실상 몇몇 아미노산은 4개 이상의 다른 코돈들에 의해 암호화된다.
소정의 아미노산을 암호화하는데 있어서 1개 이상의 코돈을 이용할 수 있는 경우에, 유기체의 코돈 사용량 패턴이 고도로 일관적임이 관찰된 바 있다. 종이다르면, 코돈 선택에 있어서도 다른 성향을 보이고, 단일 종에서도 특히 유전자 발현율의 고저에 따라 사용 코돈이 매우 다를 수 있다. 이러한 성향은 바이러스, 식물, 박테리아 및 포유동물 세포에서 다르며, 일부 종은 다른 종 보다도 불규칙 코돈 선택과 상이한 더 강한 성향을 보인다. 예를 들어, 인간 및 다른 포유동물은 특정 박테리아 또는 바이러스 보다 강한 성향을 보이지 않는다. 이러한 이유로 인해, 대장균에서 발현되는 포유동물 유전자 또는 포유동물 세포에서 발현되는 바이러스 유전자는 효율적인 발현에 부적당한 코돈 분포가 나타날 수 있는 가능성이 상당하다. 따라서, 발현이 나타나야 하는 숙주에서 드물게 관찰되는 이종성 DNA 서열의 코돈 클러스터의 존재는 그 숙주에서의 낮은 이종성 발현율의 전조인 것으로 추정된다.
결과적으로, 특정 원핵(예컨대, 대장균 또는 효모) 또는 진핵 숙주에서 선호되는 코돈은 최적화, 즉 단백질 발현율을 증가시키거나, 자연 발생 서열로부터 생성된 전사체의 반감기 보다 긴 반감기 등과 같은 바람직한 성질을 보유하는 재조합 RNA 전사체를 생성하거나 또는 인간에서 나타나는 면역 반응을 최적화하는 것으로 선택될 수 있다. 코돈 최적화 과정은 수작업이나 컴퓨터 소프트웨어로 제조한 모든 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 천연 서열의 코돈 중 일부 또는 전체 코돈은 변형되기도 한다. 그 방법으로는 몇 가지가 공지되어 있다(Nakamura et al., Nucleic Acids Research 1996, 24:214-215; WO98/34640). 본 발명에 따른 바람직한 1가지 방법은 칼크젠(Calcgene)법의 변형인 신젠(Syngene)법이다(R.S.Hale and G.Thompson, Protein Expression and Purification Vol. 12 pp.185-188(1998)).
따라서, 바람직한 구체예에서 단백질의 DNA 서열은 RSCU(상대적 동의어 코돈 사용량(코돈 지수, CI로도 알려져 있음))이 적어도 0.65이고, 상응하는 야생형 영역과 동일성이 85% 미만인 것이다.
이러한 코돈 최적화 방법과 그 결과 얻어지는 작제물은 다음과 같은 장점 중 몇 가지 또는 모든 장점을 가질 수 있으므로 유리하다: 1) 드물게 사용되거나 자주 사용되지 않는 코돈을 보다 자주 사용되는 코돈으로 대체하여 유전자 산물의 발현을 향상시키고; 2) 하류 클로닝을 도모하는 제한효소 부위가 제거되거나 삽입되며; 3) 게놈 서열과 DNA 벡터 내의 삽입체 서열 간의 상동성 재조합의 가능성을 감소시키고; 4) 표적 항원에 대한 세포 및/또는 항체 반응(바람직하게는 두 반응 모두)을 유발하여 인간의 면역 반응을 상승시킨다. 본 발명의 서열은 재조합능이 감소된 것이 유리하지만, 적어도 야생형 서열과 동일 수준으로 발현하는 것이 좋다. 코돈 최적 서열을 제조하는 신젠 프로그램에서 사용되는 알고리듬의 성질로 인하여 유사한 기능을 수행하는 여러 가지 코돈 최적 서열을 최대의 수로 제조하는 것이 가능하다. 간략히 설명하면, 통계법을 사용하여 고도 발현 대장균 및 인간 유전자에서 자연 발생되는 빈도수에 더욱 근접한 코돈 빈도수를 나타내는 합성 유전자를 제공하는 코돈 지정을 수행한다. 구체적으로, 통계법을 사용하여 β-액틴과 같은 고도 발현성 인간 유전자에서 자연 발생되는 빈도수에 더욱 근접한 코돈 빈도수를 나타내는 합성 유전자를 제공하는 코돈을 지정한다. 적합한 코돈 최적화 서열의 예시적 실례는 서열번호 19 내지 22와 서열번호 24 내지 26에 제시한 서열이지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드에서 코돈 사용량 패턴은 표적 유기체에서 고도로 발현되는 유전자, 예컨대 인간 β-액틴 유전자의 코돈 성향에 보다 근접하도록 표적 항원에 전형적인 패턴에서 변형시킨다. "코돈 사용량 계수"는 소정의 폴리뉴클레오타이드 서열의 코돈 패턴이 표적 종의 패턴과 얼마나 근접한지의 척도이다. 코돈 빈도수는 많은 종들의 고도 발현성 유전자들에 대한 문헌 정보로부터 수득할 수 있다(예컨대, Nakamura et al., Nucleic Acids Research 1996, 24:214-215). 61개 각 코돈들에 대한 코돈 빈도수(선택한 유전자류의 1000개 코돈 당 발생 횟수로 나타냄)를 20개의 천연 아미노산 마다 규정화하여, 각 아미노산 마다 가장 빈번하게 사용되는 코돈 값은 1로 하고, 이보다 덜 일반적인 코돈의 빈도수는 0 내지 1 사이에 등급화한다. 이와 같이 하여, 표적 종의 고도 발현 유전자 마다 61개 코돈 각각의 값을 1 또는 그 이하로 지정한다. 특정 폴리뉴클레오타이드에 대한 코돈 사용량 계수를 그 종의 고도 발현성 유전자에 상대적으로 계산하기 위하여, 특정 폴리뉴클레오타이드 각 코돈의 등급화된 값을 기록하고, 이 값들의 기하평균값을 계산한다(이 값의 자연 대수의 총합을 총 코돈수로 나누고 역대수를 취하여 계산함). 이 계수는 0 내지 1 사이의 값이며 계수값이 높을수록 폴리뉴클레오타이드 내의 보다 많은 코돈이 빈번하게 사용되는 코돈이다. 폴리뉴클레오타이드 서열의 코돈 사용량 계수가 1이면 표적 종의 고도 발현성 유전자에서 모든 코돈이 "가장 빈번한" 코돈인 것이다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드의 코돈 사용량 패턴에서는 특정 아미노산에 사용되는 코돈의 <10%을 나타내는 코돈은 제외되는 것이 바람직하다. 상대적동의어 코돈 사용량(RSCU) 값은 관찰된 코돈 수를 당해 아미노산에 대한 모든 코돈들이 동일한 빈도수로 사용된 경우에 예상되는 수로 나눈 값이다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 표적 유기체의 고도 발현성 유전자 중에서 RSCU 값이 0.2 미만인 코돈은 제외하는 것이 바람직하다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 고도 발현성 인간 유전자들에 대한 코돈 사용량 계수가 0.6 초과, 바람직하게는 0.65 초과, 가장 바람직하게는 0.7 초과인 것이 좋다. 인간의 코돈 사용량 표는 진뱅크에서 수득할 수도 있다.
비교용으로 고도 발현성 베타 액틴 유전자의 RSCU는 0.747이다.
호모사피엔스의 코돈 사용량 표(표 1)는 다음과 같다:
표 1. 인간(고도 발현성) 유전자 1/24/91(human_high.cod)의 코돈 사용량
본 발명의 융합 단백질 또는 변형된 콜린 결합 단백질을 암호화하는 DNA 서열은 표준 DNA 합성 기술, 예컨대 문헌[D.M.Roberts et al. in Biochemistry 1985, 24, 5090-5098]에 기술된 바와 같은 효소 결합법, 화학적 합성법, 시험관내 효소 중합법 또는 열 안정성 폴리머라제 등을 이용하는 PCR 기술 또는 이 기술들의 조합을 통해 합성할 수 있다.
DNA의 효소 중합은 10 내지 37℃의 온도에서 일반적으로 50㎕ 또는 그 이하의 용량 중에 뉴클레오사이드 트리포스페이트 dATP, dCTP, dGTP 또는 dTTP를 필요한 만큼 포함하는 적당한 완충액에서 DNA 폴리머라제 I(클리나우 단편) 또는 Taq 폴리머라제와 같은 DNA 폴리머라제를 이용하여 시험관내에서 수행할 수 있다. DNA 단편의 효소 결합은 4℃ 내지 상온에서, 일반적으로 50㎕ 또는 그 이하의 용량 중에 0.05M Tris(pH 7.4), 0.01M MgCl2, 0.01M 디티오트레이톨, 1mM 스퍼미딘, 1mM ATP 및 0.1mg/ml 소혈청 알부민과 같은 적당한 완충액에서 T4 DNA 리가제와 같은 DNA 리가제를 사용하여 수행할 수 있다. DNA 중합체 또는 단편의 화학적 합성은 이하에 기술된 문헌에 설명된 바와 같은 고상 기술을 사용하여 통상적인 포스포트리에스테르, 포스페이트 또는 포스포아미다이트 화학을 통해 수행할 수 있다: 'Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments - A Laboratory Manual'(ed. H.G.Gassen and A.Lang), Verlag Chemie, Weinheim(1982), 또는 다른 과학 간행물, 예컨대 M.J.Gait, H.W.D.Matthes, M.Singh, B.S.Sproat and R.C.Titmas, Nucleic Acids Research, 1982, 10, 6243; B.S.Sproat andW.Bannwarth, Tetrahedron Letters, 1983, 24, 5771; M.D.Matteucci and M.H.Caruthers, Tetrahedron Letters, 1980, 21, 719; M.D.Matteucci and M.H.Caruthers, Journal of the American Chemical Society, 1981, 103, 3185; S.P.Adams et al., Journal of the American Chemical Society, 1983, 105, 661; N.D.Sinha, J.Biernat, J.McMannus, and H.Koester, Nucleic Acids Research, 1984, 12, 4539; 및 H.W.D.Matthes et al., EMBO Journal, 1984, 3, 801.
본 발명의 방법은 매니아티스 문헌[Maniatis et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, 1982-1989]에 기술된 것과 같은 통상적인 재조합 기술을 통해 수행될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 방법은
i) 숙주 세포 내에서, 본 발명의 단백질이나 이의 면역원성 유도체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 중합체를 발현할 수 있는 복제성 또는 통합성 발현 벡터를 제조하는 단계;
ii) 이 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계;
iii) 이와 같이 형질전환된 숙주 세포를 상기 DNA 중합체의 발현을 허용하는 조건하에서 배양하여 상기 단백질을 생산하는 단계; 및
iv) 상기 단백질을 회수하는 단계를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 '형질전환시키는'이라는 용어는 이종 DNA를 숙주 세포로 도입시키는 것을 의미한다. 이것은 문헌[Genetic Engineering; Eds. S.M.Kingman and A.J.Kingman; Blackwell Scientific Publications; Oxford, England, 1988]에기술된 바와 같은 통상적인 기술을 이용한 적당한 플라스미드 또는 바이러스 벡터로의 형질전환, 형질감염 또는 감염을 통해 수행될 수 있다. 이하에 사용되는 '형질전환된' 또는 '형질전환체'라는 용어는 당해 이종 유전자를 포함하고 발현하는 수득된 숙주 세포에 적용된 것이다.
발현 벡터는 신규한 것으로서, 본 발명의 일부를 구성한다.
복제성 발현 벡터는 숙주 세포와 화합성인 벡터를 절단하여 본래의 레플리콘(replicon)을 보유하는 선형 DNA 분절을 수득한 뒤, 이 선형 분절과 함께 목적 산물, 예컨대 본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA 중합체 또는 이의 유도체 등을 암호화하는 1종 이상의 DNA 분자와 상기 선형 분절을 결합 조건하에 배합함으로써, 본 발명에 따라 제조할 수 있다.
따라서, DNA 중합체는 벡터의 작제 동안 필요한 만큼 제조할 수 있다.
벡터의 선택은 부분적으로 숙주 세포에 따라, 즉 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있지만, 대장균, 효모 또는 CHO 세포가 바람직한 숙주 세포에 따라 결정한다. 적당한 벡터에는 플라스미드, 박테리오파지, 코스미드 및 재조합 바이러스가 있다. 발현 및 클로닝 벡터는 선택 조건하에서 마커를 발현하는 숙주 세포만이 생존할 수 있도록 선택성 마커를 포함하는 것이 바람직하다. 선택 유전자에는 앰피실린, 테트라사이클린 또는 가나마이신에 대한 내성을 부여하는 단백질을 암호화하는 유전자가 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다. 발현 벡터는 또한 제시된 숙주와 화합성인 조절 서열을 포함하기도 한다. 예를 들어, 대장균, 보다 일반적으로 원핵세포의 발현 조절 서열에는 프로모터와 리보솜 결합 부위가 있다. 프로모터 서열은자연 발생형, 예컨대 β-락타메이스(페니실리나제)(Weissman 1981, In Interferon 3(ed.L.Gresser)), 락토스(lac)(Chang et al., Nature, 1977, 198:1056) 및 트립토판(trp)(Goeddel et al., Nucl.Acids Res. 1980, 8, 4057) 및 람다계 PL프로모터 시스템일 수 있다. 또한, 자연에서 나타나지 않는 합성 프로모터도 박테리아 프로모터로서 사용된다. 이의 예로는 trp 및 lac 프로모터의 서열에서 유도되는 tac 합성 하이브리드 프로모터가 있다(De Boer et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1983, 80, 21-26). 이러한 시스템은 특히 대장균에 적합하다.
효모 화합성 벡터는 영양요구성 돌연변이체에 원영양균성을 부여하거나 야생형 균주에 중금속 내성을 부여하여 성공적인 형질전환체를 선택할 수 있도록 허용하는 마커를 보유하기도 한다. 효모 벡터의 발현 조절 서열에는 해당작용 효소의 프로모터(Hess et al., J.Adv.Enzyme Reg. 1968, 7, 149), 산 포스파타제를 암호화하는 PHO5 유전자, CUP1 유전자, ARG3 유전자, GAL 유전자 프로모터 및 합성 프로모터 서열이 있다. 효모 발현에 유용한 다른 조절 인자는 종결인자 및 mRNA 리더 서열이다. 5' 암호 서열은 일반적으로 세포로부터 단백질의 분비를 유도하는 소수성 아미노산으로 이루어진 시그널 펩타이드를 암호하기 때문에 특히 유용하다. 적당한 시그널 서열은 분비형 효모 단백질에 대한 유전자, 예컨대 효모 인버타제 유전자 및 a-인자 유전자, 산 포스파타제, 킬러 독소, 알파 교배 인자 유전자 및 최근 개시된 클루이베로마이세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus)의 INU1A 유전자 유래의 이종 이눌리나제 시그널 서열에 의해 암호될 수 있다. 벡터는 피키아파스토리스(Pichia pastoris) 및 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)에서의 발현에 적당한 것이 개발되어 있다.
각종 P.파스토리스 발현 벡터는 각종 유도형 또는 구성형 프로모터에 기초하여 활용할 수 있다(Cereghino and Cregg, FEMS Microbiol.Rev. 2000, 24:45-66). 시토졸 단백질과 분비형 단백질 생산에 유용한, 가장 일반적으로 사용된 P.파스토리스 벡터에는 매우 강력하고 빈틈없이 조절되는 알코올 산화효소(AOX1) 프로모터가 포함된다. 벡터는 또한, his4 숙주에서 선택하기 위해 P. 파스토리스 히드티디놀 데하이드로게나아제(HIS4) 유전자를 포함한다. 이종 단백질의 분비에는 시그널 서열이 필요로 되는데, 피치아 발현계에 널리 성공적으로 사용되는 시그널 서열은 S.세레비지에 프리프로 알파 교배 인자 시그널 서열이다. 발현 벡터는 발현 균주의 안정성을 최대화하기 위하여 P.파스토리스 게놈 내로 통합된다. S.세레비지에에서와 같이, 숙주 게놈이 공유하는 서열(AOX1 또는 HIS4) 내에서의 P.파스토리스 발현 벡터의 절단은 그 게놈 유전자좌로 벡터의 통합을 효과적으로 표적화하는 상동성 재조합 사건을 자극한다. 일반적으로, 발현 카세트의 다중 통합 카피를 포함하는 재조합 균주는 단카피 균주 보다 더욱 많은 이종 단백질을 생산할 수 있다. 높은 카피수의 형질전환체를 수득하는 가장 효과적인 방법에는 스페로플라스트 기술을 이용한 피키아 수용체 균주의 형질전환을 필요로 한다(Cregg et al., 1985, Mol.Cell.Biol. 5:3376-3385).
복제성 발현 벡터는 DNA의 제한분해, 중합 및 결합에 적당한 효소를 이용하여, 상기 인용된 매니아티스 외 다수의 문헌 등에 기술된 절차를 통해 통상적 방식으로 제조할 수 있다.
재조합 숙주 세포는 본 발명에 따르면, 형질전환 조건 하에서 본 발명의 복제성 발현 벡터를 이용하여 숙주 세포를 형질전환시킴으로써 제조한다. 적당한 형질전환 조건은 통상적인 것으로서, 예컨대 상기 인용된 매니아티스 외 다수의 문헌이나 문헌["DNA Cloning" Vol.II, D.M.Glover ed., IRL Press Ltd., 1985]에 기술되어 있다.
형질전환 조건은 형질전환되는 숙주 세포에 따라 선택한다. 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 대한 형질전환 매체로서 생바이러스 벡터를 이용하는 생체내 형질전환은 전술한 바와 같다. 대장균과 같은 숙주의 박테리아 형질전환은 숙주를 CaCl2 용액(Cohen et al., Proc.Natl.Acad.Sci. 1973, 69, 2110)이나 염화루비듐(RbC1), MnCl2, 아세트산칼륨 및 글리세롤의 혼합물을 포함하는 용액으로 처리한 뒤, 3-[N-모르폴리노]-프로판-설폰산, RbC1 및 글리세롤로 처리한 후 폴리뉴클레오타이드(목적 서열을 포함하는 발현 벡터일 수 있음)를 직접 흡수시키는 방법이나 전기침투법을 이용하여 수행할 수 있다. 하급 진핵세포 유기체의 직접 흡수를 통한 배양물에서의 형질전환은 예를 들어, 힌넨 등[Hinnen et al., Proc.Natl.Acad.Sci. 1978, 75:1929-1933]의 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 포유동물 세포의 배양물에서의 형질전환은 세포 상에 벡터 DNA의 인산칼슘 공동 침전법을 이용하여 수행할 수 있다(Graham & Van der Eb, Virology, 1978, 52, 546). 포유동물 세포에 폴리뉴클레오타이드를 도입시키는 다른 방법에는 덱스트란 매개의형질감염, 폴리브렌 매개의 형질감염, 원형질 융합, 전기침투, 폴리뉴클레오타이드의 리포좀 내로의 캡슐화, 및 폴리뉴클레오타이드의 핵 내로의 직접적인 미량주사 등이 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 단백질을 암호화하는 핵산이나 본 발명의 복제성 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.
형질전환된 숙주 세포의 DNA 중합체 발현을 허용하는 조건하에서의 배양은 전술한 매니아티스 외 다수의 문헌과 "DNA Cloning" 문헌에 기술된 바와 같이 통상적 방식으로 수행할 수 있다. 즉, 세포에 영양소를 공급하고 50℃ 미만, 바람직하게는 25℃ 내지 42℃, 보다 바람직하게는 25℃ 내지 35℃, 가장 바람직하게는 30℃에서 배양하는 것이 좋다. 배양 시간은 SDS-PAGE 또는 웨스턴 블롯으로 측정되는 박테리아 세포 내의 폴리펩타이드의 비율에 따라 수분에서부터 수시간에 이르기까지 다양할 수 있다.
산물은 숙주 세포 및 발현 산물의 국재화에 따라(세포내인지 또는 배양 배지로 분비되는지 또는 세포 원형질로 분비되는지에 따라) 통상적인 방법으로 회수할 수 있다. 즉, 숙주 세포가 대장균과 같은 박테리아인 경우에는 예컨대 물리적, 화학적 또는 효소적으로 용균시킨 뒤, 그 용균물로부터 단백질 산물을 분리할 수 있다. 숙주 세포가 포유동물인 경우에는, 산물은 일반적으로 영양배지 또는 무세포 추출물로부터 분리할 수 있다. 숙주 세포가 사카로마이세스 세레비지에 또는 피치아 파스토리스와 같은 효모인 경우에는, 일반적으로 용균 세포 또는 배양배지로부터 산물을 분리한 뒤 통상의 기법을 통해 추가 정제할 수 있다. 발현계의 특이성은 당해 폴리펩타이드에 대해 지향성인 항체를 이용한 ELISA 또는 웨스턴 블롯을 통해 평가할 수 있다.
통상적인 단백질 분리 기술로는 선택적 침전, 흡착 크로마토그래피 및 모노클론 항체 친화성 컬럼을 비롯한 친화성 크로마토그래피가 있다. 본 발명의 단백질이 히스티딘 테일(His 태그)과 함께 발현되는 경우에는, 이 단백질은 이온 금속 친화성 크로마토그래피 컬럼(IMAC)을 이용한 친화성 크로마토그래피로 용이하게 정제할 수 있다. 금속 이온은 적합한 임의의 이온, 예컨대 아연, 니켈, 철, 마그네슘 또는 구리일 수 있으나, 특히 아연 또는 니켈이 바람직하다. 바람직하게는, IMAC 완충액은 세정제, 바람직하게는 SDS와 같은 음이온성 세정제, 보다 바람직하게는 Tween 80과 같은 비이온성 세정제, 또는 Empigen BB와 같은 쯔비터이온 세정제를 포함하는 것이 좋은데, 그 이유는 이러한 세정제가 최종 산물 중에 내독소의 함량을 낮출 수 있기 때문이다.
또 다른 크로마토그래피 단계로는 예컨대 IMAC 컬럼 이전이나 이후에 수행될 수 있는 Q-세파로스 단계가 있다. pH는 7.5 내지 10 범위가 바람직하고, 보다 바람직하게는 7.5 내지 9.5 사이이며, 최적으로는 8 내지 9 사이이다.
따라서, 본 발명의 단백질은 다음과 같은 프로토콜에 따라 정제할 수 있다. 세포 붕괴 후, 단백질을 포함하는 세포 추출물을 우레아(예컨대, 8.0M)와 SDS(예컨대, 0.5 내지 1%)를 포함하는 Tris 완충액(pH 8.5) 중에서 용해시킨다. 원심분리 후, 수득되는 상청액을 그 다음, pH 8.5 Tris 완충액으로 평형화된 IMAC(니켈) 세파로스 FF 컬럼 위에 로딩한다. 이 컬럼을 그 다음 고염 함유 완충액(예, 0.75 내지 1.5M NaCl 15mM pH 8.5)으로 세척할 수 있다. 경우에 따라, 염 없이 인산염 완충액으로 컬럼을 재세척할 수도 있다. 본 발명의 단백질은 이미다졸 함유 완충 용액을 통해 컬럼으로부터 용출될 수 있다. 이 단백질을 그 다음 추가 크로마토그래피 단계, 예컨대 음이온 교환 크로마토그래피(예, Q 세파로스)를 통해 처리할 수 있다.
본 발명의 단백질은 용해성인 액체 형태로 또는 동결건조된 형태(바람직한 형태)로 제공한다. 일반적으로, 각 인간의 용량은 1 내지 1000㎍의 단백질, 바람직하게는 30 내지 300㎍의 단백질을 포함할 것으로 추정된다. 정제 방법은 또한 카르복시아미드화 단계를 포함할 수 있어서, 단백질이 먼저 글루타치온의 존재하에 환된 다음, 요오도아세트아미드의 존재하에 카르복시메틸화될 수 있다. 이 단계는 분자의 산화 응집을 자체적으로 또는 이황화 결합에 의한 공유 가교를 통해 숙주 세포 단백질 오염물로 조절할 수 있는 장점을 제공한다.
또한, 본 발명은 약제학적으로 허용가능한 부형제 중에 본 발명의 단백질을 함유하는 약학적 조성물 및 면역원성 조성물을 제공한다. 바람직한 백신 조성물은 본 발명에 따른 1종 이상의 단백질을 포함하는 것이다. 여기서, 단백질은 차단된 티올 기를 보유하고 고도로 정제된, 예컨대 숙주 세포 오염도가 5% 미만인 것이 바람직하다. 이와 같은 백신은 경우에 따라 1종 이상의 다른 종양 관련 항원 및 유도체를 함유할 수 있다. 예컨대, 적당한 다른 관련 항원으로는 프로스타제, PAP-1, PSA(전립선 특이 항원), PSMA(전립선 특이 막 항원), PSCA(전립선 줄기 세포 항원), STEAP가 있다.
다른 구체예에서, 본 발명에 따른 면역원성 조성물, 예컨대 백신 조성물의 예로는 전술한 1종 이상의 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA를 함유하여 융합 폴리펩타이드를 동일계에서 생성할 수 있는 것이 있다. 전술한 바와 같이, 이러한 폴리뉴클레오타이드는 당업자에게 공지된 다양한 임의의 전달 시스템을 통해 투여될 수 있다. 사실상 유전자 전달 기술에는 다수가 당해 기술분야에 공지되어 있는데, 그 예로는 문헌[Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15:143-198, 1998 및 여기에 인용된 문헌]에 설명된 기술들이 있다. 적당한 폴리뉴클레오타이드 발현 시스템은 물론 환자 내에서 발현에 필요한 조절 DNA 조절 서열(예컨대, 적당한 프로모터 및 종결 시그널)을 포함하는 것이다. 또는, 박테리아 전달계는 세포 표면 상에 폴리펩타이드의 면역원성 부를 발현하거나 이러한 에피토프를 분비하는 박테리아(예, 바실러스-칼메트-구에린)의 투여를 포함할 수 있다.
따라서, 특정 구체예에서 본 명세서에 기술된 면역원성 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 다수의 공지된 바이러스계 시스템 중 임의의 시스템을 통해 발현에 적당한 포유동물 숙주 세포로 도입된다. 예시적 일 구체예에서, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템의 편리하고 효과적인 기반을 제공한다. 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 선택된 뉴클레오타이드 서열은 벡터에 삽입된 후 당해 기술분야에 공지된 기술을 통해 레트로바이러스 입자에 패키징될 수 있다. 이 재조합 바이러스는 그 다음 분리하여 피검체에게 전달할 수 있다. 다음과 같은 문헌들에는 수많은 레트로바이러스 시스템의 예가 기술되어 있다: 미국 특허 5,219,740; Miller and Rosman(1989) BioTechniques 7:980-990; Miller,A.D.(1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al.(1991) Virology 180: 849-852; Burns et al.(1993) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8033-8037; 및 Boris-Lawrie and Temin(1993) Curr.Opin.Genet.Develop. 3:102-109.
또한, 다양한 예시적 아데노바이러스계 시스템도 개시된 바 있다. 숙주 게놈 중으로 통합되는 레트로바이러스와는 달리, 아데노바이러스는 삽입 돌연변이유발과 관련된 위험을 최소화하는 염색체외적으로 지속된다(Haj-Ahmad and Graham(1986) J.Virol. 57: 264-274; Bett et al. (1993) J.Virol. 67:5911-5921; Mittereder et al.(1994) Human Gene Therapy 5:717-729; Seth et al.(1994) J.Virol. 68:933-940; Barr et al.(1994) Gene Therapy 1:51-58; Berkner, K.L.(1988) BioTechniques 6:616-629; 및 Rich et al.(1993) Human Gene Therapy 4:461-476). 인간은 때로 AdHu5와 같은 일반적인 인간 아데노바이러스 혈청형에 의해 감염되기도 하는데, 이 개체의 유의적 비율은 아데노바이러스에 대한 중화 항체 반응을 나타내어, 재조합 백신계 시스템에서 이종 항원에 대한 면역반응을 일으킬 가능성이 있다. 침팬지 아데노바이러스 68(AdC68, Fitzgerald et al.(2003) J.Immunol. 170(3): 1416-22))과 같은 인간을 제외한 영장류의 아데노바이러스 벡터는 기존의 중화 항체 반응의 단점이 제거된 대안적인 아데노바이러스 시스템을 제공할 수 있다.
각종 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터 시스템도 폴리뉴클레오타이드 전달 목적으로 개발되었다. AAV 벡터는 당해 기술분야에 공지된 기술을 통해 용이하게 작제할 수 있다: 미국 특허 5,173,414 및 5,139,941; 국제공개번호 WO 92/01070 및WO93/03769; Lebkowski et al.(1988) Molec.Cell.Biol. 8:3988-3996; Vincent et al.(1990) Vaccines 90(Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter,B.J.(1992) Current Opinion in Biotechnology 3:533-539; Muzyczka, N.(1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129; Kotin, R.M.(1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Shelling and Smith(1994) Gene Therapy 1:165-169; 및 Zhou et al.(1994) J.Exp.Med. 179:1867-1875.
유전자 전이를 통한 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자의 전달에 유용한 추가 바이러스 벡터에는 수두류의 바이러스, 예컨대 우두 바이러스 및 조류 수두바이러스 유래의 벡터를 포함한다. 예컨대, 신규 분자를 발현하는 우두 바이러스 재조합체는 다음과 같이 작제할 수 있다. 먼저, 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA를 우두 프로모터와 인접한 우두 DNA 서열, 예컨대 티미딘 키나제(TK) 암호 서열에 근접하게 위치하도록 적당한 벡터에 삽입한다. 그 다음, 이 벡터를 사용하여 우두로 동시 감염되는 세포를 형질감염시킨다. 동종 재조합은 우두 프로모터와 당해 폴리펩타이드 암호 유전자를 바이러스 게놈으로 삽입시키는 작용을 한다. 새포를 5-브로모데옥시우리딘의 존재하에 배양하고 이에 저항성인 바이러스 플라크를 채취하여 최종 TK.sup.(-) 재조합체를 선발할 수 있다.
우두계 감염/형질감염 시스템은 유기체 숙주 세포에서 본 명세서에 기술한 1종 이상의 폴리펩타이드를 유도적으로 일시 발현시키거나 공발현시키기 위한 목적에 편리하게 사용될 수 있다. 이러한 특정 시스템에서, 세포는 먼저 박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제를 암호화하는 우두 바이러스 재조합체를 이용하여 시험관내에서감염시킨다. 이 폴리머라제는 T7 프로모터를 보유하는 주형만을 전사한다는 점에서 정교한 특이성을 나타낸다. 감염 후, 세포는 T7 프로모터에 의해 구동되는 당해 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드들로 형질감염시킨다. 우두 바이러스 재조합체의 세포질에서 발현되는 폴리머라제는 형질감염된 DNA를 RNA로 전사하고, 뒤이어 숙주 해독 기구를 통해 폴리펩타이드로 해독된다. 이 방법은 다량의 RNA와 그 해독 산물을 세포질에서 고농도로 일시적으로 수득할 수 있는 방법이다. [예컨대 Elroy-Stein and Moss, Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990) 87:6743-6747; Fuerst et al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986) 83:8122-8126].
대안적으로, 가금수두 및 카나리수두 바이러스와 같은 조류수두바이러스도 당해의 암호 서열을 전달하는데 사용할 수 있다. 포유동물 병원균 유래의 면역원을 발현하는 재조합 조류수두 바이러스는 비조류종에게 투여했을 때에는 예방 면역성을 제공하는 것으로 알려져 있다. 조류수두 벡터의 사용은 조류수두 속의 구성원들이 민감한 조류종에서만 생산적으로 복제할 수 있고 포유동물 세포에서는 비감염성이어서 인간 및 다른 포유동물 종에 특히 바람직하다. 재조합 조류수두 바이러스를 제조하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 전술한 수두 바이러스의 제조에서와 같은 유전자 재조합을 이용할 수 있다.[예컨대 WO 91/12882; WO 89/03429; 및 WO 92/03545 참조].
수많은 알파바이러스 벡터 중 임의의 벡터도 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 조성물을 전달하는데 사용할 수 있으며, 그 예로는 미국 특허 5,843,723; 6,015,686; 6,008,035; 및 6,015,694에 기술된 벡터가 있다. 베네주엘라 말 뇌염(VEE)계의 특정 벡터도 사용할 수 있으며, 그 예는 미국 특허 5,505,947 및 5,643,576에 기술되어 있다.
본 발명의 조성물은 근육내, 피하, 복강내 또는 정맥내와 같은 다수의 경로를 통해 전달할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예로서, 폴리펩타이드는 문헌[Ulmer et al., Science 259:1745-1749, 1993]에 기술되고 문헌[Cohen, Science 259:1691-1692, 1993]에서 검토한 바와 같이 "나출형" DNA로서 투여/전달한다. 나출형 DNA는 DNA를 생체분해성 비드(bead) 상에 코팅하면 세포내로 효과적으로 수송되어 흡수가 증가될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 조성물은 피내로 전달된다. 구체적으로, 비드(예, 금) 상에 벡터를 코팅하고, 이어서 고압 하에 상피로 투여하는 유전자 총(특히 입자 충격) 투여 기술을 이용하면 조성물이 전달된다[예컨대, Haynes et al., J.Biotechnology 44:37-42(1996)].
예시적 일 예로서, 기체 구동식 입자 가속법은 파우더젝트 파마슈티컬스 피엘씨(Oxford, UK) 및 파우더젝트 백신스 인크.(Madison, WI)에서 제조한 장치 등을 이용하여 수행할 수 있으며, 그 일부 예는 미국 특허 5,846,796; 6,010,478; 5,865,796; 5,584,807 및 유럽 특허 0500 799에 기술되어 있다. 이러한 기술은 무침 전달법을 제공하는데, 이 방법은 미시적 입자의 무수 분말 제제, 예컨대 폴리뉴클레오타이드를 수동식 장치에서 발생되는 헬륨 기체 분사물 내에서 고속으로 가속시켜 당해의 표적 조직, 일반적으로 피부로 입자를 추진시킨다. 입자는 직경이 바람직하게는 0.4 내지 4.0㎛, 보다 바람직하게는 0.6 내지 2.0㎛의 금 비드로서, 이위에 DNA 접합체가 코팅된 후, "유전자 총"에 장착되는 카트리지 또는 카세트에 포장된다.
관련 구체예로서, 본 발명의 조성물을 기체 구동식 무침 주사법으로 이용할 수 있는 다른 장치와 방법으로는 바이오젝트, 인크(Portland, OR)에서 제공하는 것이 있으며, 그 일부 예는 미국 특허 4,790,824; 5,064,413; 5,312,335; 5,383,851; 5,399,163; 5,520,639; 및 5,993,412에 기술되어 있다.
항원성 펩타이드를 암호하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 면역원 성분은 약 1일 내지 약 18개월 사이의 간격으로, 예컨대 1 내지 7회, 바람직하게는 1 내지 4회씩 반복 투여하거나 1회 기준으로 투여할 수 있다. 하지만, 이러한 치료 체계는 환자의 크기, 치료/예방처리되는 질병, 투여되는 뉴클레오타이드 서열의 양, 투여 경로 및 숙련된 의술 시행자에게 명백한 기타 다른 요인에 따라 크게 달라질 수 있다.
따라서, 본 발명은 다른 양태로 본 명세서에 기술된 바와 같은 단백질이나 이를 암호화하는 DNA를, 환자 중에서 면역반응을 유도하기 위한 면역원성 조성물의 제조에 사용하는 방법을 제공한다. 이러한 면역 반응은 i) 상기 단백질과 뒤이어 상기 DNA 서열을 연속 투여하여 유도하거나; 또는 ii) 상기 DNA 서열과 뒤이어 상기 단백질을 연속 투여하여 유도하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, DNA 서열을 생체분해성 비드 상에 코팅하거나 입자 충격법을 통해 전달하는 것이다. 보다 더 바람직하게는, 단백질에 보강제, 바람직하게는 TH-1 유도 보강제, 보다 바람직하게는 CpG/QS21계 보강성 제제가 처리되는 것이 좋다.
항원성 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터는 예방적 또는 치료적 유효량 정도의 양으로 투여한다. 투여량은 복용량 당 뉴클레오타이드를, 입자 매개 전달인 경우 일반적으로 1pg(피코그램) 내지 16mg 범위, 바람직하게는 1pg 내지 10㎍ 범위, 다른 경로인 경우 10㎍ 내지 16mg 범위로 함유한다. 정확한 양은 면역처리되는 환자의 체중과 투여 경로에 따라 상당히 달라질 수 있다.
나출형 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터를 환자에게 전달하는 적당한 기술에는 또한 적당한 비히클(vehicle)을 이용한 국소 투여가 포함된다. 핵산은 예컨대 비내, 구강, 질내 또는 직장내 투여를 통해 피부 또는 점막 표면으로 국소 투여할 수 있다. 이 때, 나출형 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터는 인산염 완충 식염수(PBS)와 같은 약제학적으로 허용가능한 부형제와 함께 제공될 수 있다. 이러한 DNA 제제에 포함시키거나 별도로 부피바카인(bupivacaine)과 같은 촉진제를 이용하면 DNA 흡수를 더욱 촉진시킬 수 있다. 핵산을 수용체에게 직접 투여하는 또 다른 방법에는 초음파, 진기 자극, 전기침투 및 US5,697,901에 기술된 마이크로시딩(microseeding) 등이 있다.
핵산 작제물의 흡수는 공지된 여러 가지 형질감염 기술, 예컨대 형질감염제의 사용 등을 통해 증강될 수 있다. 이러한 제제의 예에는 인산칼슘 및 DEAE-덱스트란과 같은 양이온제와 리포펙탐(lipofectam) 및 트란스펙탐(transfectam)과 같은 리포펙턴트(lipofectant)가 있다. 투여되는 핵산의 투여량은 조정될 수 있다.
본 발명에 따른 융합 단백질 및 암호성 폴리펩타이드도 또한 약학적/면역원성 조성물, 예컨대 백신으로 조제될 수 있다. 따라서, 본 발명은 약제학적으로 허용가능한 부형제에 본 발명의 융합 단백질을 함유하는 약학적/면역원성 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 융합 단백질이나 암호성 폴리뉴클레오타이드를 적합한 보강제, 희석제 또는 다른 약제학적으로 허용가능한 담체와 혼합하는 것을 포함하는, 본 발명에 따른 면역원성 조성물의 제조방법도 제공한다.
본 발명의 융합 단백질은 SDS PAGE로 가시화되었을 때 바람직하게는 적어도 80%의 순도, 보다 바람직하게는 90%의 순도인 것이다. 단백질은 SDS PAGE에 의해 단일 밴드로 나타나는 것이 바람직하다.
백신 제제는 백신 디자인("The subunit and adjuvant approach"(eds. Powell M.F. & Newman M.J.)(1995) Plenum Press New York)에 일반적으로 기술되어 있다. 리포좀으로의 캡슐화는 풀러톤(Fullerton, 미국 특허 4,235,877)에 의해 기술된 바 있다.
본 발명의 융합 단백질 및 암호성 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 백신 제제에서 보강처리되는 것이 바람직하다. 시판되는 특정 보강제는 다음과 같다: 프로인트 불완전 보강제 및 완전 보강제(Difco Laboratories, Detroit, MI); Merck 보강제 65(Merck and Company, Inc., Rahway, NJ); AS-2(SmithKline Beecham, Philadelphia, PA); 수산화알루미늄 겔(명반)이나 인산알루미늄과 같은 알루미늄염; 칼슘, 철 또는 아연의 염; 아실화된 타이로신의 불용성 현탁제; 아실화된 당; 양이온 또는 음이온 유도체화된 다당류; 폴리포스파젠; 생체분해성 미소구; 모노포스포릴 지질 A 및 퀼(quil) A. 또한, 시토킨, 예컨대 GM-CSF, 인터루킨-2, -7, -12및 다른 유사 성장인자도 보강제로서 사용될 수 있다.
본 발명의 특정 구체예에서, 보강제 조성물은 주로 Th1 형의 면역반응을 유도하는 것이 바람직하다. 다량의 Th1 형 시토킨(예, IFN-γ, TNFα, IL-2 및 IL-12)은 투여된 항원에 대한 세포 매개된 면역반응을 유도하는 경향이 있다. 반대로, 다량의 Th2 형 시토킨(예, IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-10)은 체액 면역반응을 유도하는 경향이 있다. 따라서, 본 명세서에 제공된 바와 같은 백신의 투여 후 환자는 Th1 형 반응과 Th2 형 반응을 유도하는 면역반응을 유지할 것이다. 바람직한 구체예에서, 주로 Th1 형 반응인 경우, Th1 형 시토킨의 농도는 Th1 형 시토킨의 농도 보다 훨씬 많은 양으로 증가할 것이다. 이러한 시토킨의 농도는 표준 분석법을 통해 쉽게 측정할 수 있다. 이러한 시토킨류에 대한 검토는 문헌[Mosmann and Coffman, Ann.Rev.Immunol. 7:145-173, 1989]을 참조할 수 있다.
바람직한 TH-1 유도성 보강제는 3D-MPL, QS21, QS21과 콜레스테롤의 혼합물 및 CpG 올리고뉴클레오타이드 또는 이러한 보강제 2종 이상의 혼합물을 포함하는 보강제 그룹 중에서 선택한다. 주로 Th1 형 반응을 유도하기에 바람직한 특정 보강제로는, 예컨대 모노포스포릴 지질 A, 바람직하게는 3-탈-O-아실화 모노포스포릴 지질 A와 알루미늄염의 배합물이 있다. MPL®보강제는 코릭사 코포레이션(Seattle, WA; 예컨대 미국 특허 4,436,727; 4,877,611; 4,866,034; 및 4,912,094 참조)으로부터 입수용이하다. CpG 함유 올리고뉴클레오타이드(CpG 디뉴클레오타이드가 비메틸화된 것) 또한 주로 Th1 반응을 유도한다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 공지되어 있으며, 예컨대 WO 96/02555, WO 99/33488 및 미국 특허 6,008,200 및 5,856,462에 기술되어 있다. 면역자극성 DNA 서열에 대해서는 또한 문헌[Sato et al., Science 273:352, 1996]에도 기술되어 있다. 또 다른 바람직한 보강제에는 사포닌, 예컨대 퀼(Quil) A 또는 이의 유도체, 예컨대 QS21 및 QS7(Aquila Biophamaceuticals Inc., Framingham, MA); 에신(Escin); 디기토닌(Digitonin); 또는 집소필라(Gypsophila) 또는 체노포듐 퀴노아(Chenopodium quinoa) 사포닌이 있다. 다른 바람직한 제제는 본 발명의 보강제 배합물에 1종 이상의 사포닌을 포함하기도 하며, 그 예로는 QS21, QS7, Quil, β-에신 또는 디기토닌을 포함하는 그룹 중에서 선택되는 2종 이상의 배합물이 있다.
또는, 사포닌 제제는 키토산 또는 다른 다양이온 중합체, 폴리락타이드 및 폴리락타이드-코-글리콜라이드 입자, 폴리-N-아세틸 글루코사민계 중합체 매트릭스, 다당류 또는 화학적 변형된 다당류로 구성된 입자, 리포좀 및 지질계 입자, 글리세롤 모노에스테르로 구성된 입자 등을 포함하는 백신 비히클과 배합될 수 있다. 사포닌은 또한 콜레스테롤의 존재하에 조제되어 리포좀이나 ISCOM 등과 같은 미립자 구조를 형성할 수도 있다. 또한, 사포닌은 폴리옥시에틸렌 에테르 또는 에스테르와 함께 배합되어 비미립자형 용액이나 현탁액으로 또는 미립자 구조물, 예컨대 포시라멜라(paucilamelar) 리포좀 또는 ISCOM 등으로 제조될 수 있다. 이외에도, 사포닌은 점도 증강을 위해 Carbopol®과 같은 부형제와 배합되거나 또는 락토스와 같은 분말 부형제와 무수 분말 형태로 제조될 수도 있다.
바람직한 일 구체예에서, 보강제 시스템은 모노포스포릴 지질 A와 사포닌 유도체의 배합물, 예컨대 QS21과 3D-MPL®보강제 배합물(WO 94/00153 참조), 또는 QS21이 콜레스테롤로 반응정지되는 반응원성이 감소된 조성물(WO 96/33739 참조)이 포함된다. 다른 바람직한 제제에는 수중유 에멀젼 및 토코페롤이 포함된다. 수중유 에멀젼에 QS21, 3D-MPL®보강제 및 토코페롤을 이용하는 특히 바람직한 다른 보강제 배합물은 WO 95/17210에 기술되어 있다.
또 다른 증강된 보강제 시스템에는 CpG-함유 올리고뉴클레오타이드와 사포닌 유도체의 배합물, 특히 CpG와 QS21의 배합물(WO 00/09159 및 WO 00/62800 참조)이 있다. 이 제제는 또한 수중유 에멀젼과 토코페롤을 함유하는 것이 바람직하다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 융합 단백질과, 추가로 D3-MPL, 사포닌, 바람직하게는 QS21 및 CpG 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 경우에 따라 수중유 에멀젼으로 배합되는 면역원성 조성물을 제공한다.
이러한 본 발명의 약학적 조성물에 사용할 수 있는 또 다른 보강제의 예에는 다음과 같은 것이 있다: Montanide ISA 720(Seppic, 프랑스), SAF(Chiron, 미국 캘리포니아), ISCOMS(CSL), MF-59(Chiron), SBAS류의 보강제(예, SBAS-2 또는 SBAS-4, 벨기에 렉신사르트 소재의 스미드클라인 비참에서 입수용이), Detox(Enhanzyn®(Corixa, 미국 몬타나주 해밀톤 소재), RC-529(Corixa, 미국 몬타나주 해밀톤 소재) 및 기타 다른 아미노알킬 글루코사미나이드 4-인산염(AGP)[예컨대, 본원에 전체적으로 참고인용한 공계류중인 미국 특허 출원일련번호 08/853,826 및09/074,720에 기술된 것] 및 WO99/52549A1에 기술된 것과 같은 폴리옥시에틸렌 에테르 보강제.
다른 바람직한 보강제에는 화학식 (I), HO(CH2CH2O)n-A-R[여기서, n은 1 내지 50, A는 결합 또는 -C(O)-이고, R은 C1-50알킬 또는 페닐 C1-50알킬임]로 표시되는 보강제 분자가 포함된다. 본 발명의 바람직한 일 구체예에서, 화학식 (I)로 표시되는 폴리옥시에틸렌 에테를 포함하는 백신 제제를 제공한다[식에서, n은 1 내지 50, 바람직하게는 4 내지 24, 가장 바람직하게는 9이고; R 성분은 C1-50, 바람직하게는 C4-20알킬, 가장 바람직하게는 C12알킬이며, A는 결합임]. 폴리옥시에틸렌 에테르의 농도는 0.1 내지 20% 범위, 바람직하게는 0.1 내지 10%, 가장 바람직하게는 0.1 내지 1% 범위이어야 한다. 바람직한 폴리옥시에틸렌 에테르는 다음과 같은 그룹 중에서 선택되는 것이다: 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-9-스테오릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-8-스테오릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-4-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-35-라우릴 에테르 및 폴리옥시에틸렌-23-라우릴 에테르. 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르와 같은 폴리옥시에틸렌 에테르류는 머크 인덱스(12판; 엔트리1717)에 기술되어 있다. 이러한 보강제 분자는 WO 99/52549에 기술되어 있다. 전술한 화학식 (I)로 표시되는 폴리옥시에틸렌 에테르는 경우에 따라 다른 보강제와 배합될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 보강제 배합물은 공계류중인 영국 특허 출원번호 GB 9820956.2에 기술된 것과 같은 CpG를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 핵산 벡터를 비롯한 항원은 면역자극제와 함께 이용되는 것도 본발명의 일 구체예이다. 이러한 면역자극제는 본 발명의 항원과 동시에 투여되는 것이 바람직하며, 바람직한 구체예에서는 함께 배합되기도 한다. 본 발명의 다른 구체예에서는, 상기 항원과 면역자극제(또는 그 반대로)를 동일 부위 또는 인접 부위에 0 내지 100 시간의 범위 동안 분할하여 잇달아서 투여하기도 한다. 이러한 면역자극제에는 다음과 같은 것이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다: 합성 이미다조퀴놀린, 예컨대 이미퀴모드(imiquimod)[S-26308, R-837](Harrison et al., Vaccine 19; 1820-1826, 2001); 및 레시퀴모드(resiquimod)[S-28463, R-848](Vasilakos, et al., Cellular immunology, 204: 64-74, 2000); 항원 발현 세포 및 T-세포 표면에서 구성형적으로 발현되는 카르보닐류 및 아민류의 쉬프 염기, 예컨대 투카레솔(tucaresol)(Rhodes, J. et al., Nature 377: 71-75, 1995), 시토킨, 케모킨 및 단백질이나 펩타이드로서의 공자극성 분자, 예컨대 인터페론, GM-CSF, IL-1 알파, IL-1 베타, TGF-알파 및 TGF-베타와 같은 염증전 시토킨, 인터페론 감마, IL-2, IL-12, IL-15, IL-18 및 IL-21과 같은 Th1 유도인자, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 및 IL-13과 같은 Th2 유도인자, 및 MCP-1, MIP-1 알파, MIP-1 베타, RANTES, TCA-3, CD80, CD86 및 CD40L과 같은 다른 케모킨 및 공자극성 유전자, CTLA-4 및 L-셀렉틴과 같은 다른 면역자극성 표적 리간드, Fas, (49)와 같은 아폽토시스 자극 단백질 및 펩타이드, 합성 지질계 보강제, 예컨대 박스펙틴(vaxfectin)(Reyes et al., Vaccine 19: 3778-3786, 2001), 스쿠알렌, 알파-토코페롤, 폴리소르베이트 80, DOPC 및 콜레스테롤, 내독소, [LPS], (Beutler, B., Current Opinion in Microbiology 3: 23-30, 2000); CpG 올리고뉴클레오타이드 및디뉴클레오타이드(Sato, Y. et al., Science 273(5273): 352-354, 1996; Hemmi, H. et al., Nature 408: 740-745, 2000) 및 Toll 수용체를 자극하여 Th1 유도성 시토킨을 생산하는 다른 잠재적 리간드, 예컨대 합성 미코박테리아 지단백질, 미코박테리아 단백질 p19, 펩티도글리칸, 테이코산 및 지질 A.
다른 적합한 보강제에는 CT(콜레라 독소, 서브유닛 A 및 B) 및 LT(대장균의 열불안정성 장독소, 서브유닛 A 및 B), 열충격 단백질류(HSPs), 및 LLO(리스테리오리신 O; WO 01/72329)가 있다.
면역자극제가 단백질인 경우에, 제제는 단백질로서 또는 이 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로서 투여될 수 있다.
다른 적합한 전달 시스템으로는 항원성 물질이 생분해성 중합체/미소구에 포함되거나 접합되어 있어서 적당한 약학적 담체와 혼합하여 백신으로 사용할 수 있는 미소구를 포함한다. "미소구"란 용어는 일반적으로 직경이 10nm 내지 2mm 범위이고 실질적으로 구형인 콜로이드성 입자를 나타낼 때 사용된다. 매우 다양한 종류의 천연 및 합성 중합체로 제조한 미소구는 다양한 생체의학 분야에서 사용되고 있다. 이러한 전달 시스템은 특히 생체내 반감기가 짧아서 효능을 얻기 위해 다수회 치료를 필요로 하거나, 또는 비교적 고분자량이어서 위장관에서 완전히 흡수되지 않거나 체액에서 불안정한 단백질인 경우에 특히 유리하다. 단백질 방출의 매트릭스로는 여러 가지 중합체가 개시되어 있다. 적당한 중합체에는 젤라틴, 콜라겐, 알긴산염, 덱스트란이 있다. 바람직한 전달 시스템에는 생체분해성 폴리(DL-락트산)(PLA), 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)(PLG), 폴리(글리콜산)(PGA), 폴리(ε-카프로락톤)(PCL) 및 공중합체 폴리(DL-락트산-코-글리콜산)(PLGA)이 있다. 다른 바람직한 시스템에는 이종성 하이드로겔, 예컨대 친수성 폴리(에틸렌글리콜)(PEG)과 소수성 폴리(부틸렌 테레프탈레이트)(PBT), 또는 폴리(에틸렌글리콜)-테레프탈레이트/폴리(부틸렌테레프탈레이트)(PEGT/PBT)를 주성분으로 하는 반복 블록을 함유하는 폴리(에테르 에스테르) 다중블럭 공중합체(Sohier et al., Eur.J.Pharm and Biopharm, 2003, 55, 221-228)가 있다. 1 내지 3개월 동안 지속 방출을 제공하는 시스템, 예컨대 PLGA, PLA 및 PEGT/PBT 등의 시스템이 바람직하다.
면역원성 조성물 또는 백신 조성물은 1회 기준으로 투여하거나 또는 바람직하게는 약 1일 내지 약 18개월 사이의 간격, 바람직한 1개월 간격으로 1 내지 7회, 바람직하게는 1 내지 4회씩 필요한 횟수만큼 반복 투여하는 것이 가능하다. 그 이후에는, 선택적으로 최대한 환자의 남은 여생까지의 기간 동안 1 내지 12개월 사이의 일정 간격으로 투여할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 항원은 "초회 자극" 섭생에서 다른 형태로 환자에게 투여될 수 있다. 즉, 예컨대 융합 단백질과 같은 항원을 먼저 단백질 보강제를 기제로 한 제제로 투여한 다음, 이어서 DNA계 백신으로 투여할 수 있다. 이러한 투여 방식이 바람직하다. 바람직한 보강제는 CpG 함유 올리고뉴클레오타이드 및 사포닌 유도체의 배합물, 특히 WO 00/09159 및 WO 00/62800에 개시된 바와 같은 CpG와 QS21의 배합물이다. 나출형 DNA의 흡수는 세포에 효율적으로 수송되는 생체분해성 비드 상에 DNA를 코팅하여 증강시킬 수 있다. 또는, DNA는 입자 충격술, 예컨대 본 명세서에 교시된 바와 같이 파우더젝트파마슈티컬스 피엘씨(Oxford, UK) 및 파우더젝트 백신스 인크.(Madison, WI)에서 제조한 장치 등을 이용하는 기체 구동식 입자 가속법을 통해 전달할 수 있다. 이러한 기술은 무침 전달법을 제공하는데, 이 방법은 폴리뉴클레오타이드 입자 또는 폴리펩타이드 입자와 같은 미시적 입자의 무수 분말 제제를 수동식 장치에서 발생되는 헬륨 기체 분사물 내에서 고속으로 가속시켜 당해의 표적 조직으로 피부로 입자를 추진시킨다.
또 다른 바람직한 구체예에서는 DNA계 백신을 먼저 투여한 다음 단백질 보강제를 기제로 한 제제를 투여하기도 한다. 또 다른 구체예는 DNA 작제물은 특정 전달 벡터, 바람직하게는 바이러스 시스템, 가장 바람직하게는 아데노바이러스계 시스템을 이용하여 전달하는 것에 관한 것이다. 다른 적합한 바이러스계 DNA 전달 시스템으로는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 바이러스 및 우두 바이러스계 시스템이 있다.
다른 바람직한 구체예에서, 단백질 보강제를 기제한 제제 및 DNA 계 백신은 인접 부위 또는 동일 부위에 공동으로 투여될 수도 있다. 이 예는 DNA 백신 제제의 성질에 따라서, 투여 전에 DNA 및 단백질 보강제 제제를 혼합하거나 DNA 및 단백질 보강제 제제를 동시 투여하여 수행할 수 있다.
치료 체계는 당해 환자의 크기와 종류, 투여되는 핵산 백신 및/또는 단백질 조성물의 양, 투여 경로, 사용된 임의 보강제 화합물의 효능 및 복용량, 및 숙련된 의술 시행자에게 명백한 기타 다른 요인에 따라 크게 달라질 수 잇다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 약학적 조성물을 투여하는것을 포함하여, 환자 내의 면역반응, 바람직하게는 인간 환자내의 T 세포 반응을 자극하는 방법을 제공한다. 여기서, 환자는 폐 또는 결장암이나 결장직장암 또는 유방암에 걸린 환자일 수 있는데, 이러한 경우에 이 방법은 질병의 치료용으로 제공되고, 또는 이러한 질병의 위험성이 예고되는 환자에게는 예방적으로 치료될 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 전술한 바와 같이 약학적 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 환자 중의 암의 발달을 억제하는 방법을 제공한다. 여기서, 환자는 예컨대 육종, 전립선암, 난소암, 방광암, 폐암, 결장암, 결장직장암 또는 유방암에 걸린 환자일 수 있고, 이러한 경우에 본 방법은 질병 치료용이고, 또는 환자가 이러한 질병에 걸릴 위험성이 있는 환자인 경우에는 예방적으로 치료될 수 있다.
본 발명은 또한, 다른 양태로서, 본 발명의 폴리펩타이드와 특이적으로 반응하는 T 세포와 생체 시료를 접촉시키는 것을 포함하되, 이 접촉 단계가 시료로부터 단백질을 발현하는 세포의 제거를 허용하기에 충분한 시간과 조건 하에 수행되는 것인, 생체 시료로부터 종양 세포를 제거하는 방법을 제공한다.
이와 관련된 양태로서, 전술한 바와 같이 치료된 생체 시료를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자 암의 발달을 억제하는 방법도 제공한다.
다른 추가 양태로, 본 발명은 (i) 전술한 폴리펩타이드; (ii) 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 및/또는 (iii) 이러한 폴리펩타이드를 발현하는 항원 전달 세포 중 1종 이상을 T 세포의 자극 및/또는 팽창을 허용하기에충분한 시간과 조건하에 T 세포와 접촉시키는 것을 포함하여, 본 발명의 폴리펩타이드에 특이적인 T 세포를 자극 및/또는 팽창시키는 방법을 제공한다. 전술한 바와 같이 제조한 T 세포를 포함하는 분리된 T 세포 집단물도 제공한다.
또 다른 양태로, 본 발명은 전술한 바와 같은 T 세포 집단물의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 환자 중의 암의 발달을 억제하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 (a) 환자에게서 분리한 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 (i) 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드, (ii) 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및 (iii) 이러한 폴리펩타이드를 발현하는 항원 전달 세포 중 1종 이상과 항온배양하는 단계; 및 (b) 이와 같이 증식된 T 세포의 유효량을 환자에게 투여하여 환자 중의 암의 발달을 억제하는 단계를 포함하는, 환자 중의 암 발달을 억제하는 방법을 제공한다. 증식된 세포는 환자에게 투여하기 전에 클로닝할 수 있지만 반드시 해야 하는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구체예에 있어서, 본 명세서에 개시된 면역원성 조성물은 항원 전달 세포(APC), 예컨대 수지상 세포, 대식세포, B 세포, 단핵구 및 기타 유효 APC로 유전자조작될 수 있는 세포로 전달된다. 이러한 세포는 항원 전달능의 증강, T 세포 반응의 활성화 및/또는 유지성 향상, 항암 효과 자체 및/또는 수용체(즉, 짝을 이룬 HLA 일배체형)와의 면역학적 상용성을 나타내도록 유전자 변형이 수행될 수 있으나, 반드시 필요한 것은 아니다. APC는 일반적으로 종양 조직 및 종양주위 조직을 비롯한 각종 체액 및 기관 중 임의의 소스에서 분리할 수 있으며, 자가 세포, 동종이형 세포, 동계 또는 이계 세포일 수 있다.
본 발명의 바람직한 특정 구체예는 항원 전달 세포로서 수지상 세포 또는 이의 선조를 이용한다. 수지상 세포는 매우 강력한 APC이며(Banchereau and Steinman, Nature 392: 245-251, 1998), 예방적 또는 치료적 항종양 면역성의 유도에 생리적 보강제로서 효과적으로 밝혀져 있다(Timmerman and Levy, Ann.Rev.Med. 50:507-529, 1999). 일반적으로, 수지상 세포는 이의 일반적 형태(동일계 내에서 방사형, 세포질 돌기(수지상돌기)를 시험관내에서 확인할 수 있음), 높은 효율로 항원을 흡수하고 처리하여 전달하는 능력 및 본래의 T 세포 반응을 활성화시키는 능력에 근거하여 확인될 수 있다. 수지상 세포는 물론 생체내 또는 생체외 수지상 세포에서 일반적으로 발견되지 않는 특정 세포 표면 수용체 또는 리간드를 발현하도록 유전자조작할 수 있고, 이와 같이 변형된 수지상 세포도 본 발명에 포함되는 것이다. 수지상 세포의 대안으로, 분비형 소포 항원이 로딩된 수지상 세포(엑소좀이라 불림)도 백신에 사용될 수 있다(Zitvogel et al., Nature Med. 4:594-600, 1998).
수지상 세포 및 선조는 말초 혈액, 골수, 종양 침윤 세포, 종양주위 조직-침윤 세포, 림프절, 비장, 피부, 제대혈 또는 다른 적합한 조직이나 체액으로부터 수득할 수 있다. 예를 들어, 수지상 세포는 말초혈액에서 수득한 단핵구 배양물에 GM-CSF, IL-4, IL-13 및/또는 TNFα와 같은 시토킨 배합물을 첨가하여 생체외에서 분화시킬 수 있다. 또는, 말초혈액, 제대혈 또는 골수에서 수득한 CD34 양성 세포를, 그 배양 배지에 수지상 세포의 분화, 성숙 및 증식을 유도하는 GM-CSF, IL-3, TNFα, CD40 리간드, LPS, flt3 리간드 및/또는 다른 화합물의 배합물을 첨가함으로써 수지상 세포로 분화시킬 수 있다.
수지상 세포는 편리하게는 "미숙" 세포와 "성숙" 세포로 분류되는데, 이것은 특성이 잘 규명되어 있는 두 표현형을 서로 구분할 수 있는 간단한 방법이다. 하지만, 이러한 명명법이 분화의 가능한 모든 중간 단계를 배제하는 것으로 간주되어서는 안된다. 미숙한 수지상 세포는 항원 흡수 및 처리능이 뛰어난 APC를 특징으로 하며, 이것은 Fcγ수용체 및 만노스 수용체의 다량 발현과 상관관계가 있다. 성숙 표현형은 일반적으로 이러한 마커들의 발현율은 보다 낮지만, 제I형 및 제II형 MHC와 같은 T 세포 활성화에 기여하는 세포 표면 분자, 부착 분자(예, CD54 및 CD11), 및 공자극 분자(예, CD40, CD80, CD86 및 4-1BB)의 발현율은 높은 것을 특징으로 한다.
APC는 일반적으로 본 발명의 폴리뉴클레오타이드(또는 이의 일부 또는 다른 변형체)로 형질감염될 수 있어서 그 세포 표면에서 암호화된 폴리펩타이드 또는 이의 면역원성 부가 발현되기도 한다. 이러한 형질감염은 생체외에서 수행될 수 있고, 이와 같이 형질감염된 세포를 함유하는 약학적 조성물은 본 명세서에 기술된 바와 같이 치료 목적으로 사용될 수 있다. 또는, 수지상 세포 또는 다른 항원 전달 세포를 표적으로 하는 유전자 전달 비히클을 환자에게 투여하여 생체내에서 형질감염을 일으킬 수도 있다. 수지상 세포의 생체내 및 생체외 형질감염은 일반적으로 당해 기술분야에 공지된 임의의 방법, 예컨대 WO 97/24447에 기술된 방법이나 문헌[Mahvi et al., Immunology and cell Biology 75:456-460, 1997]에 기술된 유전자 총 기술을 통해 수행할 수 있다. 수지상 세포의 항원 로딩은 수지상 세포 또는 선조 세포를 종양 폴리펩타이드, DNA(나출형 또는 플라스미드 벡터내 존재) 또는 RNA와; 또는 항원 발현 재조합 박테리아 또는 바이러스(예, 우두, 가금수두, 아데노바이러스 또는 렌티바이러스 벡터)와 항온처리하여 수행할 수 있다. 로딩 이전에, 폴리펩타이드는 T 세포 헬퍼(예, 담체 분자)를 제공하는 면역학적 파트너와 공유접합시킬 수도 있다. 또는, 수지상 세포는 폴리펩타이드의 존재하에 또는 별도로 비접합성 면역학적 파트너로 펄스처리할 수 있다.
정의
또한, 본 발명은 특징적인 서열 또는 스트링, 구체적으로 유전자 서열이나 암호화된 단백질 서열을 분석하는 방법을 제공한다. 서열 분석의 바람직한 방법으로는, 예컨대 서열 상동성 분석법, 예를 들어 동일성 및 유사성 분석, DNA, RNA 및 단백질 구조 분석, 서열 어셈블리, 분기학 분석, 서열 모티프 분석, 오픈 리딩 프레임 측정, 핵산 염기 콜링, 코돈 사용량 분석, 핵산 염기 트리밍 및 서열분석 크로마토그램 피크 분석 등이 있다.
상동성 확인을 수행하는 방법으로는 전산화된 방법이 있다. 이 방법은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드이 서열을 함유하는 제1 폴리뉴클레오타이드 서열을 컴퓨터 판독가능한 매체에 제공하는 단계; 및 이 제1 폴리뉴클레오타이드 서열과 1종 이상의 제2 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열과 비교하여 상동성을 확인하는 단계를 포함한다. 또한, 상동성 확인을 수행하는 전산화된 방법으로서, 본 발명의 폴리펩타이드 서열을 함유하는 제1 폴리펩타이드 서열을 컴퓨터 판독가능한매체에 제공하는 단계; 및 이 제1 폴리펩타이드 서열을 1종 이상의 제2 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열과 비교하여 상동성을 확인하는 단계를 포함하는 방법도 제공한다.
"동일성"은 당해 기술분야에 공지된 바와 같이, 2종 이상의 폴리펩타이드 서열 또는 2종 이상의 폴리뉴클레오타이드 사이에 있을 수 있는 관계로서, 서열 비교를 통해 측정할 수 있다. 당해 기술분야에서, "동일성"은 또한 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열 사이에 있을 수 있는 서열 관련성 정도를 의미하기도 하며, 이 때 동일성은 이러한 일련의 서열들을 서로 정합(match)을 이루어 측정할 수 있다. "동일성"은 다음 문헌에 기술된 것을 비롯한 공지의 방법으로 쉽게 계산할 수 있다: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988: Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin,A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; Carillo,H., and Lipman,D., SIAM J.Applied Math., 48:1073(1988). 동일성 측정 방법은 시험 서열이 서로 가장 많은 정합을 이루도록 디자인한다. 또한, 동일성 측정 방법은 시중에서 입수용이한 컴퓨터 프로그램으로 코드화한다. 두 서열 사이의 동일성을 측정하는 컴퓨터 프로그램 방법에는 GCG 프로그램 패키지의 GAP 프로그램(Devereux, J., et al., Nucleic AcidsResearch 12(1): 387(1984)), BLASTP, BLASTN(Altschul, S.F. et al., J.Molec.Biol. 215: 403-410(1990)) 및 FASTA(Pearson and Lipman, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85; 2444-2448(1988))가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. BLAST류의 프로그램은 NCBI 및 기타 소스에서 입수용이하다(BLAST Manual, Altschul,S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J.Mol.Biol. 215:403-410(1990)). 또한, 공지의 스미드 워터만 알고리듬도 동일성 측정에 사용할 수 있다.
폴리펩타이드 서열 비교의 변수에는 다음과 같은 것이 있다:
알고리듬: Needleman and Wunsch, J.Mol Biol. 48:443-453(1970)
비교 매트릭스: BLOSSUM62, Henikoff and Henikoff, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 89:10915-10919(1992).
갭 패널티: 8
갭 길이 패널티:2
이러한 변수들로 이용할 수 있는 프로그램은 "갭(gap)" 프로그램(Genetics Computer Group, Madison WI)으로 입수용이한 것이다. 전술한 변수들은 펩타이드 비교용의 디폴트(default) 변수들이다(말단 갭에는 패널티 0).
폴리뉴클레오타이드 비교용 변수에는 다음과 같은 것이 있다:
알고리듬: Needleman and Wunsch, J.Mol Biol. 48:443-453(1970)
비교 매트릭스: 정합 = +10, 부정합 = 0
갭 패널티: 50
갭 길이 패널티: 3
"갭(gap)" 프로그램(Genetics Computer Group, Madison WI)으로 이용가능. 이 변수들은 핵산 비교용의 디폴트(default) 변수들이다.
폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드에 있을 수 있는 "동일성"의 바람직한 의미는 다음 (1)과 (2)에 제시한 바와 같다:
(1) 폴리뉴클레오타이드 구체예는 추가로 서열번호 9 내지 서열번호 16의 참조 서열 중에서 임의의 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 100%의 동일성을 보유하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 이러한 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 9 내지 서열번호 16의 참조 서열 중 임의 서열과 동일하거나 또는 참조 서열과 비교했을 때 일정 수(정수) 이하의 뉴클레오타이드 변형을 포함할 수 있으며, 여기서 변형은 적어도 하나의 뉴클레오타이드 결실, 치환(전이 및 전위 치환 포함), 또는 삽입으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이며, 참조 뉴클레오타이드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서 나타나거나 또는 두 말단 위치 사이의 임의의 위치에서, 참조 서열 중의 뉴클레오타이드들 중에서 개별적으로 산재하거나 참조 서열 중의 1 이상의 인접기들에서 나타날 수 있고, 상기 뉴클레오타이드 변형의 수는 서열번호 9 내지 서열번호 16에 제시된 뉴클레오타이드의 총 수를, 100으로 나눈 동일성 퍼센트를 나타내는 정수와 곱한 뒤 그 값을 상기 서열번호 9 내지 서열번호 16의 서열 중 임의의 서열에 존재하는 뉴클레오타이드의 총 수에서 감산하여 결정하거나 또는 다음과 같은 식으로 결정한다:
nn≤xn·(xn·y)
이 식에서, nn은 뉴클레오타이드 변형의 수이고, xn은 서열번호 9 내지 서열번호 16 중 임의 서열의 뉴클레오타이드 총 수이며, y는 50%인 경우에는 0.50, 60%인 경우에는 0.60, 70%인 경우에는 0.70, 80%인 경우에는 0.80, 85%인 경우에는 0.85, 90%인 경우에는 0.90, 95%인 경우에는 0.95, 97%인 경우에는 0.97 또는 100%인 경우에는 1.00이며, ·는 곱셈 연산자의 기호이며, xn과 y의 곱 중 임의의 비정수 값은 이 값을 xn으로부터 빼기 전에 가장 근사치 정수로 우수리를 제거한다. 서열번호 1 내지 서열번호 8 중 임의 서열의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 변형은 이 암호 서열 중에 논센스, 미스센스 또는 프레임쉬프트 돌연변이를 산출할 수 있어서, 이러한 변형 이후 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드를 변형시킬 수 있다.
일 예로서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 9 내지 서열번호 16의 참조 서열 중 임의 서열과 동일한, 즉 100% 동일성일 수 있거나 또는 동일성 퍼센트가 100% 미만인, 참조 서열과 비교했을 때 특정 정수 이하의 핵산 변형을 포함할 수 있다. 이러한 변형은 적어도 하나의 핵산 결실, 치환(전이 및 전위 치환 포함), 또는 삽입으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이며, 참조 뉴클레오타이드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서 나타나거나 또는 두 말단 위치 사이의 임의의 위치에서, 참조 서열의 핵산 중에서 개별적으로 산재하거나 참조 서열 중의 1 이상의 인접기들에서 나타날 수 있다. 소정 동일성 퍼센트에서 핵산 변형의 수는 서열번호 9 내지 서열번호 16에 제시된 핵산의 총 수를, 100으로 나눈 동일성 퍼센트를 나타내는 정수와 곱한 뒤 그 값을 상기 서열번호 9 내지 서열번호 16 중 임의 서열의 핵산의 총 수에서 감산하여 결정하거나 또는 다음과 같은 식으로 결정한다:
nn≤xn·(xn·y)
이 식에서, nn은 핵산 변형의 수이고, xn은 서열번호 9 내지 서열번호 16 중 임의 서열의 핵산의 총 수이며, y는 70%인 경우에는 0.70, 80%인 경우에는 0.80, 85%인 경우에는 0.85 등이며, ·는 곱셈 연산자의 기호이며, xn과 y의 곱 중 임의의 비정수 값은 이 값을 xn으로부터 빼기 전에 가장 근사치 정수로 우수리를 제거한다.
(2) 또한, 폴리펩타이드 구체예는 추가로 서열번호 1 내지 서열번호 8의 폴리펩타이드 참조 서열 중에서 임의의 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 100%의 동일성을 보유하는 폴리펩타이드를 함유하는 분리된 폴리펩타이드를 포함하며, 이러한 폴리펩타이드 서열은 서열번호 1 내지 서열번호 8의 참조 서열 중 임의 서열과 동일하거나 또는 참조 서열과 비교했을 때 일정 수(정수) 이하의 뉴클레오타이드 변형을 포함할 수 있으며, 여기서 변형은 적어도 하나의 아미노산 결실, 치환(보존적 및 비보존적 치환 포함), 또는 삽입으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이며, 참조 폴리펩타이드 서열의 아미노 말단 또는 카르복시 말단 위치에서 나타나거나 또는 두 말단 위치 사이의 임의의 위치에서 참조 서열의 아미노산들 중에서 개별적으로 산재하거나 참조 서열 중의 1 이상의 인접기들에서 나타날 수 있고, 상기 아미노산 변형의 수는 서열번호 1 내지 서열번호 8에제시된 아미노산 총 수를, 100으로 나눈 동일성 퍼센트를 나타내는 정수와 곱한 뒤 그 값을 상기 서열번호 1 내지 서열번호 8 중 임의 서열의 아미노산 총 수에서 감산하여 결정하거나 또는 다음과 같은 식으로 결정한다:
na≤xa·(xa·y)
이 식에서, na는 아미노산 변형의 수이고, xa는 서열번호 2의 아미노산 총수이며, y는 50%인 경우에는 0.50, 60%인 경우에는 0.60, 70%인 경우에는 0.70, 80%인 경우에는 0.80, 85%인 경우에는 0.85, 90%인 경우에는 0.90, 95%인 경우에는 0.95, 97%인 경우에는 0.97 또는 100%인 경우에는 1.00이며, ·는 곱셈 연산자의 기호이며, xa와 y의 곱 중 임의의 비정수 값은 이 값을 xa로부터 빼기 전에 가장 근사치 정수로 우수리를 제거한다.
일 예로서, 본 발명의 폴리펩타이드 서열은 서열번호 1 내지 서열번호 8의 참조 서열 중 임의 서열과 동일한, 즉 100% 동일성일 수 있거나 또는 동일성 퍼센트가 100% 미만인, 참조 서열과 비교했을 때 특정 정수 이하의 아미노산 변형을 포함할 수 있다. 이러한 변형은 적어도 하나의 아미노산 결실, 치환(보존적 및 비보존적 치환 포함), 또는 삽입으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이며, 참조 폴리펩타이드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서 나타나거나 또는 두 말단 위치 사이의 임의의 위치에서, 참조 서열의 아미노산 중에서 개별적으로 산재하거나 참조 서열 중의 1 이상의 인접기들에서 나타날 수 있다. 소정 동일성 퍼센트에서 아미노산 변형의 수는 서열번호 1 내지 서열번호 8에 제시된 아미노산의 총 수를, 100으로 나눈 동일성 퍼센트를 나타내는 정수와 곱한 뒤 그 값을 상기 서열번호 1 내지 서열번호 8 중 임의 서열의 아미노산의 총 수에서 감산하여 결정하거나 또는 다음과 같은 식으로 결정한다:
na≤xa·(xa·y)
이 식에서, na는 아미노산 변형의 수이고, xa는 서열번호 1 내지 서열번호 8중 임의 서열의 아미노산의 총 수이며, y는 70%인 경우에는 0.70, 80%인 경우에는 0.80, 85%인 경우에는 0.85 등이며, ·는 곱셈 연산자의 기호이며, xa와 y의 곱 중 임의의 비정수 값은 이 값을 xa로부터 빼기 전에 가장 근사치 정수로 우수리를 제거한다.
실시예 I: 융합 파트너로서 C-LytA-P2-C-LytA(CPC)를 함유하는 P501 융합 단백질 발현성 재조합 효모 균주 Y1796의 제조
1. 단백질 디자인
S.세레비지에에서 발현되는 융합 단백질 C-P2-C-p501(또는 CPC-P501 로 약칭함)의 구조는 도 3에 도시하였다. 이 융합 단백질은 유전자 LytA의 C-말단 영역(잔기 187 내지 306)을 함유하며, 여기에는 파상풍 독소의 P2 단편(잔기 830 내지 843)이 삽입되어 있다. P2 단편은 C-Lyt-A의 잔기 277 내지 278 사이에 위치한 것이다. P2 삽입체를 함유하는 C-LytA 단편 다음에는 P501(아미노산 잔기 51 내지 553)과 His 테일이 이어서 위치한다.
그 결과 얻어지는 융합 단백질의 1차 구조는 도 4에 도시한 서열을 갖고 있으며, 이 단백질 디자인에 상응하는 암호 서열은 도 5에 도시하였다.
2. CPC-P501(51-553)-His 융합 단백질을 발현하는 효모 플라스미드 제조를 위한 클로닝 전략
· 출발 물질은 효모 벡터 pRIT15068(영국 특허 출원번호 0015619.0)이다.
· 이 벡터는 효모 Cup1 프로모터, 효모 알파 프리프로 시그널 암호 서열 및 P501S의 잔기 55 내지 553에 상응하는 암호 서열 및 이어서 His 테일을 함유한다.
· 도 6에 개략한 클로닝 전략은 다음과 같은 단계를 포함한다:
a) 제1 단계는 C-lytA 암호 서열 중에 프레임에 맞게 이루어지는 P2 서열(효모 발현에 최적화된 코돈)의 삽입이다. C-lytA 암호 서열은 플라스미드 pRIT 14662(PCT/EP99/00660)에 보유된 것이다. 이러한 삽입은 P21 및 P22로 명명되는 2개의 상보성 올리고뉴클레오타이드로 이루어진 어댑터(adaptor)를 사용하여, NcoI로 사전에 개열시킨 플라스미드 pRIT 14662 중으로 수행한다.
P21과 P22의 서열은 다음과 같다:
P21 5' catgcaatacatcaaggctaactctaagttcattggtatcactgaaggcgt 3'
P22 3' gttatgtagttccgattgagattcaagtaaccatagtgacttccgcagtac 5'
결합, 대장균 형질전환 및 형질전환체 특성규명 후, pRIT 15199라는 플라스미드를 수득했다.
b) 제2 단계는 PCR 증폭을 통한 C-lytA-P2-C-lytA DNA 단편의 제조이다. 이 증폭은 주형으로 pRIT 15199와 C-LytANOTATG 및 C-LytA-aa55라는 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 수행했다. 두 올리고뉴클레오타이드의 서열은 다음과 같다:
C-LytANOTATG
= 5' aaaaccatggcggccgcttacgtacattccgacggctcttatccaaaagacaag 3'
C-LytA-aa55 = 5' aaacatgtacatgaacttttctggcctgtctgccagtgttc 3'
증폭된 플라스미드는 제한효소 NcoI 및 A리 III으로 처리하여 각각 응집성 말단을 생산했다.
c) 제3 단계는 상기 단편과 벡터 pRIT 15068(NcoI 처리 후 수득되는 가장 큰 단편)을 결합시켜 완전한 융합 단백질 암호 서열을 수득하는 것이다. 결합 및 대장균 형질전환 후, pRIT 15200이라는 플라스미드를 수득하였다. 이 플라스미드에서 남아있는 고유의 Nco1 부위는 개시 코돈을 암호하는 ATG를 함유한다.
d) 제4 단계는 플라스미드 pRIT 15202로부터 CUP1 프로모터와 2μ 플라스미드 서열의 일부를 함유하는 NcoI 단편을 제조했다. 플라스미드 pRIT 15202는 ATG에 NcoI 부위를 보유한 CUP1 프로모터를 함유하는 효모 2μ 유도체이다(ATG 서열: AAACC ATG)
e) 제5 단계에서는 pRIT 15202에서 분리한 NcoI 단편을 pRIT15200(사전에 NcoI으로 개열시킴)에, pCUP1 프로모터가 암호 서열의 5' 측에 위치하도록 정확한 배향으로 결합시켰다. 그 결과, pRIT 15201 이라는 최종 발현 플라스미드가 수득되었다.
3. 재조합 효모 균주 Y1796(RIX4440)의 제조
S.세레비지에 균주 DC5(ATCC 20820)의 형질전환을 위해 플라스미드 pRIT15201을 사용하였다. 플라스미드 pRIT 15201을 함유하는 효모 형질전환체를 선발하여 특성분석한 후, CPC-P501-His 융합 단백질을 발현하는 Y1796 으로 명명한 재조합 효모 균주를 수득하였다. 환원 및 카르복시아미드화 후 단백질을 분리하고 친화성 크로마토그래피(IMAC)와, 이어서 음이온 교환 크로마토그래피(Q 세파로스 FF)로 정제했다.
실시예 II
유사 방식으로, 도 2에 도시한 바와 같은 단백질 작제물은 여기에 제시된 대응하는 DNA 서열을 이용하여 발현시킬 수 있다. 구체적으로, 효모 균주 SC333(작제물 2)은 Y1796 균주에 상응하는 균주이지만, CPC 융합 파트너 없이 P50155-553을 발현한다. 효모 균주 Y1800(작제물 3)은 Y1796 균주에 상응하는 균주이지만, 추가로 P501S의 천연 서열 시그널(aa1 내지 aa34)을 포함하며, 효모 균주 Y1802(작제물 4)는 알파 프리 시그널 서열 상류 CPC-P501S 서열을 포함한다. 효모 균주 Y1790(작제물 5)은 CPC 없이 P501S 작제물을 발현하고 알파 프리프로 시그널 서열을 보유하고 있다.
실시예 III. 정제 CPC-P501 제조
1. CPC-P501S HIS(Y1796) 소량 생산
Y1796은 히스티딘이 보충된 최소 배지에서 증식시키고, 대수기에 100 내지 500μM의 CuSO4를 첨가하여 발현을 유도하고, 30℃에서 계속 배양했다. 8시간 또는 24시간 유도 후 세포를 수거했다. 구리는 사용 직전에 첨가했으며 미리 배지에 첨가하지 않았다.
SDS PAGE 분석을 위한 효모 세포 추출은 구연산염 인산염 완충액 pH 4.0+130mM NaCl에서 수행했다. 추출은 소량의 세포인 경우에는 유리 비드로 실시하고 이 보다 많은 양의 세포인 경우에는 프렌치 프레스를 사용했으며, 그 다음 시료 완충액과 혼합한 뒤 SDS-PAGE로 분석했다. 여러 작제물의 SDS PAGE 비교 분석 결과는 도 8에 도시한 바와 같고, 이하 표 2에 정리했다.
하기 표 2에 제시한 바와 같이, 배양물의 발현양은 모균주인 SC333(CPC 파트너 없이 상응하는 P501S-His을 발현하는 균주) 보다 Y1796 균주에서 더 높게 나타났다. 이와 마찬가지로, 시그널 서열(알파 프리)의 존재는 전술한 결과에 영향을 미치지 않았는데, 즉 배양물의 발현양이 CPC 파트너 없이 상응하는 P501S-His를 발현하는 균주인 Y1790 대응 균주의 발현양에 비해 Y1802 균주의 배양물 발현양이 훨씬 높았다.
표 2
재조합 균주 | 플라스미드 | 프로모터 | 시그널 서열 | 융합 파트너 | P501 aa 서열 | 발현양 |
SC333 | Ma333 | CUP1 | - | - | 55-553-His | ND |
Y1796 | pRIT 15201 | CUP1 | - | CPC | 51-553-His | +++ |
Y1802 | pRIT 15219 | CUP1 | α프리 | CPC | 51-553-His | ++++ |
Y1790 | pRIT 15068 | CUP1 | α프리프로 | - | 55-553-His | + |
CPC = clyta P2 clytaND = 검출안됨, 웨스턴 블롯에서도.+ = 웨스턴 블롯에서 검출가능+++/++++ = 웨스턴 블롯에서 검출가능하며 은 염색한 겔에서도 관찰가능 |
2. Y1796(RIX4440)의 대량 발효
사용중인 종균 100㎕를 고체 배지에 도말하고 30℃에서 약 24시간 동안 증식시켰다. 그 다음 이 고체 전배양물을 진탕 플라스크 중의 액체 전배양물에 접종했다.
이 액체 전배양물을 30℃에서 20시간 동안 증식시킨 후, 20L 발효기로 옮겼다. 유가-회분식 발효는 약 44시간의 성장기와 약 22시간의 유도기를 포함한다.
탄소원(글루코스)은 배양물에 연속 주입하여 보충했다. 그 결과, 글루코스 농도는 발효에 의한 에탄올 생산을 최소화하기 위해 매우 낮은 농도(≤50mg/L)로 유지시켰다. 이것은 제한된 글루코스 공급율을 통해 미생물 성장을 제한함으로써 달성했다. 성장기 말에 CuSO4를 첨가하여 CUP1 프로모터를 유도하여 항원을 생산시켰다.
오염의 존재는 나이스타틴이 보충된 표준 TSB 및 THI 바이엘에 106세포를 접종한 뒤, 각각 20 내지 25℃와 30 내지 35℃에서 14일 동안 배양하여 검사했다. 예상대로 오염 미생물의 성장은 관찰되지 않았다.
3. 항원 특성분석과 생산성
유도기 동안의 발효 시료를 수회 수거하여 프렌치 프레스로 압착시켜 세포 파쇄액을 제조하고 이를 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석하였다. 원심분리후 세포 파쇄액으로부터 수득된 불용성 분획 중에 당해 단백질의 주요부분이 존재하는 것으로 확인되었다. 하기 도면에 제시한 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석은 이러한 세포 파쇄액을 원심분리한 후 수득한 펠릿에 대한 것이다.
도 8A 및 도 8B는 배양물 PRO127의 유도기 동안의 항원 생산 동역학을 도시한 것이다. 성장기 동안에는 항원 발현이 일어나지 않는 것으로 확인되었다. 비항원 생산성은 유도기 초기부터 최고 6시간까지 증가하는 것으로 보이며, 그 이후에는 말기까지 상당히 안정된 상태를 유지했다. 하지만, 동일 기간 동안 관찰된 균체량 축적으로 인해 부피 생산성은 1.5 내지 2계수 정도 증가했다. 항원 생산성은 정제된 항원 참조물과 조추출물을 은염색하의 SDS-PAGE(도 9A)와 항P501S 항체(1/1000로 희석 사용된 P501S aa439-aa459에 대해 지향성인 뮤린 복수)를 이용한 WB 분석을 통해 비교한 결과 발효액 1리터당 약 500mg으로 계산되었다.
실시예 IV. Y1796에 의해 생산된 CPC-P501(51-553)-His 융합 단백질의 정제
세포 파쇄 후 단백질은 펠릿 분획에 결합되어 있다. 따라서, 단백질 분자 자체의 산화적 응집이나 이황화 결합에 의한 공유 가교를 통해 숙주 세포 단백질 오염물과의 산화적 응집에 대처하기 위하여 공정 중에 분자의 카르브아미도-메틸화를 도입시켰다. 또한 이 단백질의 소수성 특성(12개의 트랜스멤브레인 도메인이 예상됨)을 처리하기 위해 세정제도 필요했다.
OD(광학밀도) 120인 배양물 1L에 대해 개발한 정제 프로토콜은 도 10에 기술하였다. 모든 작업은 실온(RT)에서 수행된다. DOC TCA BCA 단백질 분석법에 따라, 총 정제수율은 OD120 배양물 1L당 정제항원 30 내지 70mg이었다. 이 수율은 배양물의 발현양과 연관된 것으로서, 비융합 P501S-His를 발현하는 모균주의 정제수율과 비교했을 때 보다 높은 것이다. 단백질 분석은 다음과 같이 수행했다: 먼저 DOC(데오시콜레이트)의 존재하에 TCA(트리클로로아세트산)를 사용하여 단백질을 침전시키고, SDS 존재하의 알칼리성 배지에 용해시켰다. 그 다음 단백질을 BCA(비신코닌산)(Pierce)와 반응시켜 562nm에서 높은 흡광도(시료에 존재하는 단백질 양에 비례함)를 나타내는 보라색 가용성 복합체를 형성시켰다. 3개의 정제 벌크를 SDS-PAGE 분석(도 11)한 결과 환원 조건과 비환원 조건하에서의 차이는 없었다(레인 2,3 및 4 대 5,6 및 7 참조). 패턴은 70kDa에서의 주 밴드와, 이보다 높은 MW의 스미어 및 희미한 분해 밴드로 이루어진다. 모든 밴드는 비항 P501S 모노클론 항체에 의해 검출되었다.
실시예 V. CPC-P501S His 단백질을 이용한 백신 제조
실시예 3 또는 4의 단백질은 수중유 에멀젼에 QS21 및 3D-MPL을 함유하는 백신으로 제조할 수 있다.
1. 백신 제조
항원은 실시예 I 내지 III에 도시한 바와 같이 생산했다(C-LytA-P2-P501S His). 보강제로서 제제에 3-탈-O-아실화 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL) 및 QS21의 혼합물을 수중유 에멀젼으로 첨가했다. 보강제 시스템 SBAS2는 WO 95/17210에 이미 기술된 바 있다.
3D-MPL은 그람음성균 살모넬라 민네소타의 지다당류(LPS) 유래의 면역자극제이다. MPL은 탈아실화되어 있고 지질 A 잔기에 인산염기가 결실되어 있다. 이러한 화학적 처리는 면역자극성을 보존시키면서 독성을 급격하게 감소시킨다(Ribi, 1986). 리비(Ribi) 임뮤노케미스트리는 MPL을 생산하여 SB-바이올로지컬스에 공급한다. 스미스클라인 비첨 바이올로지컬스에서 수행한 실험 결과, 각종 비히클과 혼합된 3D-MPL이 체액면역 및 TH1형의 세포면역도 상당히 증강시키는 것으로 확인되었다.
QS21은 남미의 나무인 퀼라자 사포나리아 몰리나(Quillaja saponaria Molina)의 수피에서 추출한 천연 사포닌 분자이다. 개발한 정제 기술로 수피의 조추출물로부터 각 사포닌을 분리하고, 모성분과 비교했을 때 독성이 낮고 보강제 활성은 보다 강력한 것으로 확인된 트리테르펜 배당체인 특정 사포닌인 QS21을 분리하였다. QS21은 Ag 특이적 림프구 증식을 자극할 뿐만 아니라 여러 서브유닛 Ag들에 대해서 MHC I형 제한적 CTL을 활성화시키는 것으로 밝혀져 있다(Kensil, 1992). 아퀼라(공식 명칭 캠브리지 바이오테크 코포레이션)는 QS21을 생산하여 SB-바이올로지컬스에 공급한다.
스미스클라인 비첨 바이올로지컬스에서 수행한 실험 결과, 체액면역 및 TH1형 세포면역반응의 유도 시에 MPL과 QS21 배합물의 상승 효과가 명백한 것으로 확인되었다.
수중유(O/W) 에멀젼은 2가지 오일(토코페롤과 스쿠아렌)으로 만든 유기상과, 유화제로서 Tween 80을 함유하는 PBS 수성상으로 구성된다. 이 에멀젼은 5% 스쿠알렌, 5% 토코페롤, 0.4% Tween 80을 함유하며 평균 입경이 180nm이고 SB62로 알려져 있다(WO 95/17210 참조).
스미스클라인 비첨 바이올로지컬스에서 수행한 실험 결과, 이러한 O/W 에멀젼을 3D-MPL/QS21(SBAS2)에 부가하면 각종 서브유닛 항원에 대한 후자의 면역자극 성질을 더욱 증강시킨다는 것을 확인했다.
2. 에멀젼 SB62(2배 농축물) 제조
Tween80은 인산염 완충 식염수(PBS)에 용해시켜 만든 PBS 중의 2% 용액이다.2배 농축 에멀젼 100ml을 만들기 위해 DL 알파 토코페롤 5g과 스쿠알렌 5ml을 볼텍싱하여 충분히 혼합시켰다. PBS/Tween 용액 90ml을 첨가하고 충분히 혼합했다. 그 결과 얻어지는 에멀젼을 실린지를 통해 통과시키고, 마지막으로 M110S 마이크로플루이딕스(microfluidics) 기기를 통해 미세유동화시켰다. 그 결과 얻어지는 오일 소적은 크기가 약 180nm였다.
3. 제형
수중유 에멀젼에 3D-MPL과 QS21을 함유하는 일반적인 제제는 다음과 같이 제조했다. 10배 농축 PBS(pH6.8)와 H2O에 20 내지 25㎍의 C-LytA P2-P501S를 희석한 다음 SB62(50㎕), MPL(20㎍), QS21(20㎍)을 연속 첨가하고, 경우에 따라 보존제로서 1㎍/ml 티오메살과 CpG 올리고뉴클레오타이드(100㎍)를 첨가하였다. 각 성분의 양은 필요에 따라 달라질 수 있다. 모든 항온처리는 진탕하에 실온에서 수행했다.
실시예 VI. 코돈 최적화 P501S 서열
1. 대조 재조합체 플라스미드의 제조
전장의 P501S 서열은 pVAC(Thomson, Immunology, 1998; 95:51OP105)에 클로닝하여 발현 플라스미드 JNW680을 제조했다. 서열번호 17은 플라스미드 JNW680에 존재하는 인간 P501S 발현 카세트를 나타낸 것이며, 도 12에 예시하였다. 서열번호 17의 단백질 서열은 단문자 형식으로 기술했고, 진한 글씨는 개시 코돈과 종결 코돈이다. 코작 서열은 해쉬 기호로 표시하였다. 인간 P501S 서열(서열번호 17)의 코돈 사용량 지수는 신젠 프로그램으로 계산했을 때 0.618이었다.
신젠 프로그램
기본적으로, 천연적으로 고도 발현성 대장균과 인간 유전자에서 발견되는 코돈과 보다 근접한 코돈 빈도수의 합성 유전자를 얻기 위해, 코돈 지정에는 통계적 방법을 사용했다.
신젠은 R.S.Hale과 G.Thompson(Protein Expression and Purification Vol.12 pp.185-188(1998))이 만든 칼크진(Calcgene)이라는 비주얼 베이직 프로그램의 최신판이다. 원서열의 각 아미노산 잔기에 대한 코돈 지정은 고도 발현성 대장균 유전자에서 발견되는 확률에 근거하여 수행했다. 마이크로소프트 윈도우즈 3.1하에 구동되는 칼크진 프로그램의 상세한 내용은 상기 저자들로부터 입수할 수 있다. 이 프로그램은 합성 유전자에 대한 코돈 지정에 통계적 방법을 적용하기 때문에 산출되는 모든 코돈이 표적 유기체에서 가장 빈번하게 사용되는 코돈은 아니다. 오히려, 합성 서열에는 정확한 비율로 코돈을 지정하여 표적 유기체에서 빈번하게 사용되는 코돈과 그렇지 않은 코돈의 비가 반영되어 있다. 하지만, 서열내의 특정 위치에 특정 코돈을 지정하는 데에는 명확한 규칙이 없으므로, 프로그램이 운영될 때마다 다른 합성 유전자가 산출될 것이다. 하지만 각 유전자는 동일한 코돈 사용량 패턴을 나타내며 동일한 아미노산 서열을 암호화할 것이다. 프로그램이 소정의 아미노산 서열과 소정의 표적 유기체 마다 수회 운영된다면, 제한 부위의 수, 종류 및 위치와 인트론 접목 시그널 등이 다를 수 있는 여러 가지 상이한 뉴클레오타이드 성려이 산출될 수 있고, 이 중 일부는 바람직하지 않을 수 있다. 당업자라면 이러한 특징에 근거하여 폴리펩타이드의 발현에 사용하기에 적당한 서열을 선택할수 있을 것이다.
또한, 코돈은 통계적 기준에 근거하여 무작위로 지정되기 때문에 표적 유기체에 비교적 드물게 사용되는 2개 이상의 코돈이 근접해 있는 클러스터가 생길 수 있다. 이러한 클러스터는 해독 기구에 혼란을 주어 특히 낮은 발현율을 초래할 수 있어서, 최적화 유전자 중의 코돈을 선택하는 알고리듬은 임의의 드문 코돈 클러스터가 우연히 선택되지 않도록 고도 발현성 유전자에 대해 RSCU값이 0.2 미만인 임의의 코돈은 제외시킨다. 그 다음, 나머지 코돈의 분포는 고도 발현성 대장균에서 나타나는 빈도수에 따라 배치하여 이러한 유전자(지수 = 0.85)와 고도 발현성 인간 유전자(지수 = 0.50)에 일반적인 것처럼 합성 유전자 전반에 분포시킨다.
칼크진 프로그램의 최신판인 신젠(Peter Ertl, 미공개)인 드문 코돈이 선택되지 않도록 하며 고도 발현성 인간 유전자의 코돈 빈도수 패턴에 따른 코돈 배치에도 사용된다.
벡터 pRTI15201(도 7 참조)로부터 pVAC로 클로닝되어 플라스미드 JNW735를 산출한 CPC-P501S 카세트 서열은 서열번호 18에 기술하고 도 13에 예시하였다. 이 서열은 His 태그가 없고 코작 서열(GCCACC)과 적당한 제한효소 부위가 첨가된 것을 제외하고는 pRIT15201 서열과 동일하다. 서열번호 18의 아미노산 서열은 단문자 형식으로 나타냈으며, 개시 코돈과 종결 코돈은 진하게 표시하였다. 박스친 잔기는 파상풍 변성독소의 P2 헬퍼 에피토프이다. 밑줄친 잔기는 클라이타(Clyta) 정제 태그이다. 코작 서열은 해쉬 기호로 표시했다.
2. P501S 코돈 최적화 서열을 보유한 재조합 플라스미드의 제조
P501S 천연 서열의 코돈 지수(CI)는 이미 높지만(0.618), CI값을 더욱 증가시킬 수도 있다. 이와 같이 증가시키면 2가지 잠재적 장점이 있는데, 그 하나는 항원 발현 및/또는 면역원성의 증강이고 다른 하나는 P501S 벡터와 게놈 서열 사이의 재조합 가능성의 감소이다.
신젠 프로그램을 사용하여 코돈 최적화 서열을 선발하였다(서열번호 19 및 20)(도 14). 최초 P501S 서열과, 적당한 제한효소 부위 프로필과 양호한 CI 지수에 근거하여 선발한 2개의 대표적인 코돈 최적화 서열의 코돈 지수를 비교하여 표 3에 나타냈다.
표 3
2개의 코돈 최적화된 P501S 유전자의 코돈 지수 비교
서열 | 코돈 지수(CI) |
P501S | 0.618 |
서열번호 19 | 0.725 |
서열번호 20 | 0.755 |
3. 코돈 최적화 서열의 추가 분석
서열번호 19
서열번호 19는 양호한 CI 지수(0.725)를 갖고 있지만, 아미노산 위치 202와 203에 드문 코돈을 쌍으로 보유하고 있다. 이러한 코돈은 수작업으로 DNA 서열을 TTGTTG에서 CTGCTG로 변화시켜 보다 빈번한 코돈으로 치환시켰다. 클로닝과 발현을 용이하게 하기 위해 제한효소 부위와 코작 서열을 첨가했다. 최종 조작된 서열(서열번호 21)은 도 15에 도시하였다. 신젠 프로그램을 사용하여 이 서열을 최소 중첩 염기가 19 내지 20개인 올리고뉴클레오타이드로 단편화하였다. 그 결과, 도15에는 재조작된 P501S 코돈 최적화 서열번호 19를 도시한다. 제한효소 부위는 밑줄친 부위이고, 코작 서열은 진하게 표시된 부분이며, 드문 코돈 쌍을 제거한 재조작된 DNA서열은 박스친 부분이다.
2단계 PCR 프로토콜을 사용했는데, 먼저 PCR 어셈블리 프로토콜(이하에 상세히 설명됨)을 사용하여 신젠 프로그램으로 제조한 중첩 프라이머를 어셈블리했다. 어셈블리 반응은 다양한 단편의 집단을 생산한다. 정확한 전장의 단편은 PCR 회수 프로토콜과 말단 프라이머를 사용하여 회수/증폭시켰다. 그 결과 얻어지는 PCR 단편은 아가로스 겔에서 떼어내어 정제하고 NheI 및 XhoI로 제한분해한 뒤 pVAC에 클로닝했다. 제한효소 분석으로 양성 클론을 동정하고 이본쇄 서열분석으로 확인했다. 그 결과, 플라스미드 JNW766이 수득되었고, 이것은 PCR법의 에러프론(error-prone)성 때문에 하나의 침묵 돌연변이를 함유하고 있다(서열번호 21의 위치 360에서 T 대신 C).
1. 어셈블리 반응 - PCR 조건, 일반 프로토콜
반응 혼합물(총 부피 = 50㎕):
- 1x 반응 완충액(Pfx 또는 Proofstart)
- 1㎕ 올리고 푸울(모든 중첩성 올리고들의 동량 혼합물)
- 0.5mM dNTPs
- DNA 폴리머라제(Pfx 또는 Proofstart, 2.5-5U)
- +/- 1mM MgSO4
- +/- 1x 인핸서 용액(Pfx 인핸서 또는 Proofstart 완충액 Q)
1. 94℃, 120s(Proofstart만)
2. 94℃, 30s
3. 40℃, 120s
4. 72℃, 10s
5. 94℃, 15s
6. 40℃, 30s
7. 72℃, 20s + 3s/주기
8. 단계 5로 순환, 25회
9. 4℃에서 유지.
2. 회수 반응 - PCR 조건(일반 프로토콜)
반응 혼합물(총 부피 = 50㎕):
- 1x 반응 완충액(Pfx 또는 Proofstart)
- 5 내지 10㎕ 어셈블리 반응 혼합물
- 0.3 내지 0.75mM dNTP
- 50pmol 프라이머(5' 말단 프라이머, 센스 배향)
- 50pmol 프라이머(3' 말단 프라이머, 안티센스 배향)
- DNA 폴리머라제(Pfx 또는 Proofstart, 2.5-5U)
- +/- 1mM MgSO4
- +/- 1x 인핸서 용액(Pfx 인핸서 또는 Proofstart 완충액 Q)
1. 94℃, 120s(Proofstart만)
2. 94℃, 45s
3. 60℃, 30s
4. 72℃, 120s
5. 단계 2로 순환, 25회
6. 72℃, 240s
7. 4℃에서 유지
서열번호 20
서열번호 20은 매우 양호한 CI 지수(0.755)를 갖고 있지만, 아미노산 위치 131과 132에 드문 코돈을 쌍으로 보유하고 있음을 확인했다. 이러한 코돈은 수작업으로 DNA 서열을 TTGTTG에서 CTGCTG로 변화시켜 보다 빈번한 코돈으로 치환시켰다. 클로닝을 용이하게 하기 위해 G를 C로 변이시켜 내부 BamHI 부위는 제거했다(도 16의 이중밑줄친 뉴클레오타이드). 클로닝과 발현을 용이하게 하기 위해 제한효소 부위와 코작 서열을 첨가했다. 최종 조작된 서열(서열번호 22)은 도 16에 도시하였다. 신젠 프로그램을 사용하여 이 서열을 최소 중첩 염기가 19 내지 20개인 올리고뉴클레오타이드로 단편화하였다.
그 결과, 도 16에는 재조작된 P501S 코돈 최적화 서열 20(서열번호 번호 22)를 도시한다. 제한효소 부위는 밑줄친 부위이고, 코작 서열은 진하게 표시된 부분이며, 드문 코돈 쌍을 제거한 재조작된 DNA서열은 박스친 부분이며, BamHI 부위를제거하기 위한 침묵 점 돌연변이는 이중밑줄친 부분이다.
전술한 것과 유사한 2단계 PCR 프로토콜을 사용했는데, 먼저 전장의 P501S 단편을 증폭시켜 pVAC 중으로 클로닝했다. 제한효소 분석으로 양성 클론을 동정하고 이본쇄 서열분석으로 확인했다. 그 결과, 플라스미드 JNW764를 수득했다. P501S 암호 카세트 서열은 도 16에 도시하였다(서열번호 22).
DNA 서열 유사성
클러스털V(가중법)법에 따라 정렬한 후 쌍 간격은 하기 표 4에 제시하였다. 하기 표 4는 출발 인간 P501S 서열과 추가 연구용으로 선발한 2개의 코돈 최적화된 서열, 서열번호 21과 22 사이의 유사성%를 제시한 것이다. 이 데이터는 코돈 최적화된 DNA 서열이 본래의 P501S 서열과 약 80%의 유사성이 있음을 보여준다.
표 4
서열번호 | P501S 개시 서열과의 유사성% |
21 | 79.6 |
22 | 79.4 |
실시예 VII. 코돈 최적화 CPC 서열
1. 계획
본래의 CPC 서열은 근본적으로 효모에서의 최적화 발현을 위해 디자인된 것이므로, 본 실시예에서는 인간 발현용으로 최적화된 코돈을 제조하는 방법을 설명하기로 한다.
2. 서열 디자인
CPC 최적화의 출발 서열은 도 17(서열번호 23)에 도시하였다. 이 서열은 전적으로 pRIT15201에서 유래된 것으로서, CPC 전체 암호 서열과 하류 클로닝을 용이하게 하는 P501S의 4개의 아미노산을 함유한다. 신젠 프로그램을 사용하여 코돈 최적화 서열을 선발했고, 이 중에서 대표 서열을 도 18(서열번호 24 및 25)에 도시하였다. 이 출발 CPC 서열과 2개의 코돈 최적화된 대표 서열의 코돈 지수를 비교하여 하기 표 5에 정리했다.
표 5
2개의 CPC 최적화된 서열의 코돈 지수
서열 | 코돈 지수(CI) |
본래의 CPC = 서열번호 23 | 0.506 |
서열번호 24 | 0.809 |
서열번호 25 | 0.800 |
코돈 최적화 외에도, 모든 서열은 제한효소 클로닝 부위를 통해 선별했다. 최고의 CI값과 바람직한 제한효소부위 프로필에 근거하여 서열번호 24를 작제용으로 선택했다. 클로닝과 발현을 용이하게 하기 위해, 5' 및 3' 클로닝 부위를 첨가하고 코작 서열(GCCACC)을 최소 ATG 개시 코돈의 5'에 삽입했다. 이와 같이 조작된 서열은 도 19(서열번호 26)에 도시했다. 이 서열은 P501S의 4개의 아미노산(박스친 부분), 제한효소 클로닝 부위(NheI 및 XhoI, 밑줄친 부분), 코작 서열(진한 글씨), 종결 코돈(이탤리체) 및 클로닝을 용이하게 하기 위한 인접 무관련 DNA 4bp를 포함한다.
신젠 프로그램을 사용하여, 이 서열을 최소 중첩 염기가 18 내지 20개인 50 내지 60mer 올리고뉴클레오타이드로 단편화했다. 전술한 것과 유사한 2단계 PCR 프로토콜을 사용했는데, 정확한 단편을 회수/증폭시키고 pVAC에 클로닝했다. 제한효소 분석으로 양성 클론을 분리하고 서열을 확인하여 벡터 JNW759를 수득했다.
4. DNA 유사성
클러스털V(가중법)에 따른 정렬 후 쌍 간격은 하기 표 6에 제시하였다. 이 표에는 CPC 출발 서열과 코돈 최적화 서열 사이의 DNA 수준에서의 유사성%를 제시했으며, 이를 통해 코돈 최적화 서열이 본래 CPC 서열과 약 80%의 유사성이 있음을 알 수 있다.
표 6
서열번호 | CPC 개시 서열과의 유사성% |
24 | 80.2 |
25 | 81.6 |
실시예 VIII. P501S 융합체 후보의 작제
이하에 개략적으로 나타낸 모든 후보는 코돈 최적화되고, 주형으로서 플라스미드 JNW764와 JNW759(각각 서열번호 22와 26)로부터 중첩성 PCR법을 사용하여 작제하여, 발현 벡터 p7313 ie에 클로닝했다.
이하에 개략적으로 나타낸 4개의 후보는 CPC-P501S에 기초하여 제조했다. 코돈 최적화된 CPC-P501S는 작제물 A이다. 후보 B, C 및 D에는 P501S의 N 말단 50개 아미노산을 암호하는 서열을 CPC-P501S의 N 말단(작제물 D), CPC-P501S의 C 말단(작제물 C), 또는 CPC와 P501S 사이(작제물 B)에 위치시켰다. 이 작제물들의 개략도는 도 20에 제시하였다.
4개 작제물 각각의 뉴클레오타이드 서열과 단백질 서열은 각각 서열번호 37 내지 40(뉴클레오타이드 서열)과 이에 대응하는 서열번호 45 내지 48(폴리펩타이드서열)에 제시했다. 작제물 A, C 및 D에서 밑줄친 코돈은 주로 타이로신(TAC 또는TAT)을 암호하지만 이 뉴클레오타이드 서열은 트레오닌(ACA, ACC, ACG 또는 ACT)를 암호하도록 변형시킬 수 있다. 작제물 B에서, 밑줄친 코돈은 주로 트레오닌(ACA, ACC, ACG 또는 ACT)을 암호하지만, 이 뉴클레오타이드 서열은 타이로신(TAC 또는 TAT)을 암호하도록 변형시킬 수 있다. 모든 작제물에서, 암호 서열은 적당한 제한효소 클로닝 부위(이 경우에는 NotI 및 BamHI) 옆에 위치시키고, 코작 서열은 최초 ATG의 상류측의 접하는 위치에 배치했다. 하기 도 7은 상기 설명된 작제물의 플라스미들 확인시켜 준다.
표 7
작제물 | 밑줄친 코돈의 아미노산 | 코돈 서열 | 플라스미드 ID |
A | 타이로신 | TAC | JNW771 |
B | 트레오닌 | ACA | JNW773 |
B | 타이로신 | TAC | JNW770 |
C | 타이로신 | TAC | JNW777 |
D | 타이로신 | TAC | JNW769 |
0일째 PMID로 1차 면역화하고, 21일, 42일 및 70일째 추가 3회 면역화하여 p7313-ie(무첨가 벡터), pVAC-P501S(JNW735), JNW770, JNW771 및 JNW773 면역화 후의 세포 반응을 ELISPOT 분석으로 평가했다. 도 27은, JNW770, JNW771 및 JNW773으로 면역화시킨 마우스에서 양호한 IL-2 ELISPOT 반응이 검출되었음을 보여준다.
실시예 IX. 입자 매개의 피내 전달(PMID) 연구를 이용한 면역원성 실험
입자 매개의 피내 전달(PMID)로 전달하는 경우 전장 P501S는 양호한 항체 및 세포 반응을 산출한다. 이 데이터는 PMID가 매우 효과적인 전달 경로임을 입증한다. 또한, P501S 및 CPC-P501S를 비교해보면 펩타이드 ELISPOT으로 측정했을 때CPC-P501S가 보다 강한 면역 반응을 유도함을 알 수 있다.
1. 재료 및 방법
1.1 피부 유전자 총 면역화
플라스미드 DNA는 염화칼슘과 스퍼미딘을 사용하여 2㎛ 직경의 금 비드 상에 침전시켰다. 로딩된 비드를 문헌(Eisenbraum et al., 1993; Pertmer et al., 1996)에 기술된 바와 같이 테프젤 관(Tefzel tubing) 위에 코팅했다. 액셀(Accell) 유전자 전달 시스템(PCT WO 95/19799)을 사용하여 입자 충격법을 수행했다. 각 플라스미드에 대해, C57BL/6 암컷 마우스를 0일, 21일, 42일 및 70일째 면역화했다. 각 투여는 DNA/금의 2회 충격으로 이루어지며, 이에 따른 플라스미드 총 투여량은 약 4 내지 5㎍이었다.
1.2 P501S 유전자 산물에 대한 T 세포 반응의 ELISPOT 분석
a) 비장세포 제조
추가 항원 투여 후 7 내지 14일째 면역화된 동물로부터 비장세포를 수득했다. 이 비장세포는 유리 슬라이드 사이에 놓고 연마 처리하여 세포 현탁액으로 만들었다. 염화암모늄 처리로 적혈구세포를 용해시키고 찌꺼기를 제거하여 비장세포의 미세현탁액을 수득했다. 세포는 ELISPOT 분석에 사용하기 위해 RPMI 완전 배지에 8x106/ml 농도로 재현탁시켰다.
b) 펩타이드 라이브러리 선별
대부분의 P501S 서열을 포함하는 펩타이드 라이브러리는 코릭사 코포레이션에서 입수했다. 이 라이브러리는 4 내지 11개의 아미노산 펩타이드가 중첩된 15 내지 20mer 펩타이드를 50개 함유한다. 또한, 예상 프로그램(H-G.Rammensee et al.: Immunogenetics, 1999, 50:213-219) (http://syfpeithi.bmi-heidelberg.com/)을 사용하여 P501S 서열 유래의 추정상의 Kb 및 Db 에피토프를 예측했다. Kb 및 Db에 대한 최상의 10개 에피토프를 미모토프스(UK)에 주문하여 본 라이브러리에 포함시켰다(펩타이드 51-70). 펩타이드 라이브러리를 선별하기 위해 펩타이드를 하기 기술되는 프로토콜에 따라 IFNγ와 IL-2 ELISPOTS 중에 최종 농도 50㎍/ml(약 25 내지 50μM)로 사용했다. IFNγ ELISPOTS에서는 IL-2를 10ng/ml의 농도로 분석법에 첨가했다. 선별에 사용된 비장세포는 0일, 21일, 42일 및 70일째 면역화한 C57BL/6 마우스로부터 84일째 채취했다. 라이브러리 선별로부터 3개의 펩타이드, 즉 펩타이드 18(HCRQAYSVYAFMISLGGCLG), 22(GLSAPSLSPHCCPCRARLAF) 및 48(VCLAAGITYVPPLLLEVGV)을 분리했다. 이 펩타이드들을 이어서 ELISPOT 분석에 사용했다.
c) ELISPOT 분석
평판을 15㎍/ml(PBS 중에)의 래트 항마우스 IFNγ 또는 래트 항마우스 IL-2(Pharmingen)으로 코팅했다. +4℃에서 평판을 하룻밤동안 코팅했다. 사용하기 전에 평판을 PBS로 3회 세척했다. 비장세포는 4x105세포/웰 농도로 상기 평판에 첨가했다. 라이브러리 선별에서 확인된 펩타이드는 지네메드 신테시스(Genemed Synthesis)에서 재주문하여 50㎍/ml의 최종 농도로 사용했다. CPC-P501S 단백질(GSKBio)은 이 분석법에서 20㎍/ml 농도로 사용했다. ELISPOT 분석은 IL-2(10ng/ml), IL-7(10ng/ml) 존재 하에 또는 시토킨 무첨가 하에 수행했다. 각 웰의 총 부피는 200㎕였다. 펩타이드에 의해 자극된 세포를 함유하는 평판은 가습된 37℃ 항온배양기에서 16시간 동안 배양했다.
e) ELISPOT 분석 평판의 발색
평판을 물로 1회(세포의 확실한 용균을 위해 10분간 침지), PBS로 3회 세척하여 평판으로부터 세포를 제거했다. 비오틴이 접합된 래트 항마우스 IFNg 또는 IL-2(Phamingen)를 PBS 중에 1㎍/ml의 농도로 첨가했다. 평판을 실온에서 2시간 동안 진탕하면서 항온처리했다. 그 다음 PBS로 평판을 3회 세척한후, 1/1000 희석율의 스트렙트아비딘 알칼리성 포스파타제(Caltag)를 첨가했다. PBS로 3회 세척 후, BCICP 기질(Biorad)와 15 내지 45분간 항온처리하여 스폿(spot)을 발현시켰다. 기질은 물로 세척해내고 평판은 건조시켰다. 브라이언 하예스(Asthma Cell Biology unit, GSK)가 고안한 영상 분석 시스템을 사용하여 스폿을 계수했다.
1.3 P501S 유전자 산물에 대한 항체의 ELISA 분석
혈청 시료는 분석하기 하루전(-1), 28일, 49일 및 56일째 정맥천자를 통해 동물로부터 수득하여, 항-P501S 항체의 존재에 대해 분석했다. 중탄산나트륨 완충액 중의 CPC-P501S 단백질(GSKBio) 0.5㎍/ml을 이용하여 4℃에서 하룻밤 동안 코팅시킨 Nunc Maxisorp 평판을 사용하여 ELISA를 수행했다. TBS-Tween(트리스 완충 식염수, pH 7.4, 0.05% Tween 20 함유)으로 세척한 후, 평판을 실온에서 2시간 동안 차단 완충액(TBS-Tween 완충액 중에 3% BSA)으로 차단시켰다. 모든 혈청은 차단 완충액에 1:100 희석율로 희석하여 RT에서 1시간 동안 항온처리했다. 차단 완충액에 1:2000 희석율로 희석한 HRP-접합된 래빗 항마우스 면역글로불린(#P0260, Dako)을 사용하여 항체 결합을 검출했다. 평판을 다시 세척하고 결합된 접합체를 Fast OPD 발색 시약(Sigma, UK)을 사용하여 검출했다. 3M 황산을 첨가하여 반응을 정지시키고 490nm에서 흡광도 측정으로 OPD 산물을 정량했다.
1.4 순간 형질감염 분석
각종 DNA 작제물로부터의 인간 P501S 발현은 상기 플라스미드들로 CHO(중국 햄스터 세포) 세포를 순간 형질감염시킨 뒤 총 세포 단백질을 웨스턴 블롯팅하여 분석했다. 순간 형질감염은 Transfectam 시약(Promega)을 사용하여 제조자의 안내서에 따라 수행했다. 간략히 설명하면, 1ml DMEM 완전 배지(DMEM, 10% FCS, 2mM L-글루타민, 페니실린, 100 IU/ml, 스트렙토마이신 100㎍/ml) 중의 5x104CHO 세포/웰을 24웰 조직 배양판에 접종하고 37℃에서 16시간 동안 항온배양했다. DNA 0.5㎍을 0.3M NaCl 25㎕에 첨가하고(1웰에 충분함), Transfectam 2㎕를 Milli-Q 25㎕에 첨가했다. DNA와 Transfectam 용액을 부드럽게 혼합하고 실온에서 15분 동안 항온처리했다. 이 항온처리 단계 동안 세포는 PBS로 1회 세척하고 무혈청 배지(DMEM, 2mM L-글루타민) 150㎕를 도포했다. 이 세포에 DNA-Transfectam 용액을 적가하고 평판을 부드럽게 진탕시키면서 37℃에서 4 내지 6시간 동안 항온처리했다. DMEM 완전 배지 500㎕를 첨가하고 세포를 37℃에서 추가 48 내지 72시간 동안 항온처리했다.
2. P501S 플라스미드로 순간 형질감염된 CHO 세포의 웨스턴 블롯 분석
순간 형질감염된 CHO 세포를 PBS로 세척하고 Versene(1:5000)/0.025% 트립신 용액으로 처리하여 세포를 현탁화시켰다. 트립신처리 후, CHO 세포를 펠릿화한 다음, 다시 PBS 50㎕에 재현탁시켰다. 동량의 2x NP40 용균 완충액을 첨가하고, 30분 동안 얼음 상에서 세포를 항온배양했다. 50mM DTT를 함유하는 2xTRIS-글리신 SDS 시료 완충액(Invitrogen) 100㎕를 첨가한 후, 이 용액을 95℃에서 5분 동안 가열했다. 시료 1 내지 20㎕를 4 내지 20% 트리스-글리신 겔 1.5mm(Invitrogen) 상에 로딩하고 일정 전압하에(125V)하에 1x 트리스-글리신 완충액(Invitrogen) 중에서 90분 동안 전기영동시켰다. 시료의 크기 측정을 위해 사전염색된 다양한 범위의 마커(New England Biolabs, #P7708S)를 사용했다. 전기영동 후, 시료를 Xcell III Blot Module(Invitrogen), 20% 메탄올을 함유하는 1x 전이 완충액(Invitrogen) 및 25V의 일정 전압을 90분 동안 사용하여, 메탄올에 사전습윤화시킨 Immobilon-P PVDF 막(Millipore)으로 전이시켰다. 이 막을 3% 탈지분유(Marvel)를 함유하는 TBS-Tween(Tris 완충 식염수, pH 7.4, 0.05% Tween 20 함유)에서 4℃에서 하룻밤 동안 차단시켰다. 1차 항체(10E3)은 1:1000으로 희석하여 상기 막과 실온에서 1시간 동안 항온처리했다. TBS-Tween으로 충분히 세척한 후, 2차 항체(HRP-접합된 래빗 항마우스 면역글로불린(#P0260, Dako)을 3% 탈지분유를 함유하는 TBS-Tween에 1:2000으로 희석한 뒤 상기 막과 실온에서 1시간 동안 항온처리했다. 충분히 세척한 후, 막을 Supersigna West Pico 화학발광성 기질(Pierce)와 5분 동안 항온처리했다. 과량의 액체는 제거하고 막은 접착성 필름 2장 사이에 밀봉한 뒤,Hyperfilm ECL 필름(Amersham-PharmaciaBiotech)에 1 내지 30분 동안 노출시켰다.
3. 전장의 인간 P501S 발현 카세트의 작제
P501S 발현 카세트 작제의 출발점은 EcoRI과 NotI 부위 사이에 클로닝된 전장의 인간 P501S cDNA 카세트를 함유하는 pcDNA3.1 백본(Invitrogen)을 보유한 플라스미드 pcDNA3.1-P501S(Corixa Corp.)이다. 이 벡터는 JNW673으로도 불린다. P501S의 존재는 형광 서열분석으로 확인했다. cDNA 카세트의 서열은 NCBI/진뱅크 서열(수탁 번호 AY033593)에서 입수했다. 인간 P501S는 JNW673 주형 DNA로부터 PCR 증폭한 뒤, XbaI 및 SalI으로 제한분해하고 pVAC의 NheI/XhoI 부위에 클로닝하여 벡터 JNW680을 산출했다. CMV 프로모터에 대해 단편의 정확한 배향은 PCR 및 DNA 서열분석으로 확인했다. 발현 카세트의 서열은 도 12(서열번호 17)에 제시했다.
CPC-P501S 발현 카세트의 작제를 위해, CPC-P501S 는 벡터 pRIT 15201로부터 PCR 증폭시키고(도 7), XbaI 및 SalI으로 제한분해한 뒤 pVAC의 NheI/XhoI 부위에 클로닝하여 벡터 JNW735를 산출했다. 정확한 배향은 PCR 및 DNA 서열분석으로 확인했다. CPC-P501S 발현 카세트의 서열은 도 13(서열번호 18)에 제시했다.
4. 플라스미드 JNW680 및 JNW735로부터 인간 P501S의 발현
P501S 발현 플라스미드를 이용하여 CHO 세포를 순간 형질감염시키고 총 세포 용균물을 전술한 방법에 기술한 바와 같이 제조했다. 총 세포 용균물의 웨스턴 블롯 결과, JNW680 및 JNW735로 각각 형질감염된 시료에서 약 55kDa 및 62kDa의 단일 밴드가 확인되었다(도 21). 이것은 P501S와 CPC-P501S의 예상분자량 59.3kDa 및63.3kDa과 각각 일치하였다. CPC 태그의 첨가는 P501S 발현에 영향을 미치지 않았다.
5. 결과
5.1 PMID 면역화 후 인간 P501S에 대한 항체 반응
pVAC(무첨가 벡터) 및 pVAC-P501S(JNW680)을 이용한 면역화 후의 항체 반응은, 0일째 PMID로 1차 면역화한 후 21일, 42일 및 70일째 추가 3회 항원투여한 다음 ELISA로 평가했다. 도 22는 -1일, 28일 및 49일(마우스 A1-3, B1-3)에 채취한 혈청과 56일(마우스 A4-6, B4-9)째 채취한 혈청의 항체 반응을 보여주는 것이다. pVAC 무첨가 벡터에 대해서는 비특이적 반응이 약간 관찰되었고, P501S 작제물에 대해서는 특이적 반응이 9마리 마우스 중 5마리에서 관찰되었다.
5.2 P501S 펩타이드 라이브러리 선별에 의한 C57BL/6 마우스 중의 인간 P501S 유래의 신규 T 세포 에피토프의 동정
JNW680(pVAC-P501S)을 0일째 PMID로 면역화하고, 21일, 42일 및 70일째 추가 3회 투여하여 면역화한 다음, 84일째 ELISPOT 분석을 수행했다. P501S 라이브러리 유래의 펩타이드는 50㎍/ml 최종 농도로 실험했다. 이러한 1차 선별에서는 3가지 펩타이드가 IFNγ 및/또는 IL-2 분비를 자극하는 것으로 관찰되었다(펩타이드 18, 22 및 48, 도 23). 이 펩타이드들을 사용하여 후속 세포 분석을 수행했다.
5.3 PMID 면역화 후 pVAC-P501S(JNW680)에 대한 세포 반응
0일째 PMID로 1차 면역화하고, 21일, 42일 및 70일째 추가 3회 면역화하여 pVAC(무첨가 벡터) 및 pVAC-P501S) 면역화 후의 세포 반응을 ELISPOT 분석으로 평가했다. 추가 면역화 후 7일 째 분석을 수행했다. 분석에는 2가지 다른 조건을 사용했다: 1) 50㎍/ml의 최종 농도로 사용된, 펩타이드 라이브러리 선별에서 확인된 펩타이드 18, 22 및 48; 및 2) 20㎍/ml 최종 농도로 사용된 CPC-P501S 단백질. 도 24A로부터 알 수 있듯이, 무첨가 벡터에 대해서는 P501S 특이적 반응이 관찰되지 않지만(A4-6), pVAC-P501S 작제물은 모든 마우스(B6-9)에서 펩타이드 18 및 22에 대해 특이적인 IFN-γ 반응을 유도한 한편, 한 마우스(B7)는 펩타이드 48에 대해 IFN-γ반응을 보였다. 도 24B는 모든 마우스가 펩타이드 18, 22 및 48에 대해 특이적 IL-2 반응을 나타낸다는 것을 보여준다. 또한, pVAC-P501S 면역화 마우스(B6-9)는 CPC-P501S에 대해 보통 수준의 IL-2 반응을 나타낸 반면, 무첨가 벡터로 면역화된 마우스(A4-6)는 어떤 반응도 나타내지 않았다.
5.4 PMID 면역화 후 P501S 및 CPC-P501S에 대한 세포 반응의 비교
pVAC(무첨가 벡터), pVAC-P501S(JNW680) 및 CPC-P501S(JNW735)로 면역화 후의 세포 반응은 0일째 PMID로 1차 면역화하고, 21일과 42일째 추가 면역화한 다음 ELISPOT 분석으로 평가했다. 분석은 추가 면역화 후 7일째 수행했다. 분석에는 2가지 다른 조건을 사용했다: 1) 50㎍/ml의 최종 농도로 사용된, 펩타이드 라이브러리 선별에서 확인된 펩타이드 18, 22 및 48; 및 2) 20㎍/ml 최종 농도로 사용된 CPC-P501S 단백질. 도 25로부터 알 수 있듯이, 28일째 CPC-P501S는 펩타디드 22 10㎍/ml에 대해 양호한 IL-2 반응을 유도한 반면, 무첨가 벡터 또는 pVAC-P501S에 대해서는 P501S 특이적 반응이 유도되지 않았다. 이러한 결과는 비장세포 재자극에 사용한 CPC-P501S 단백질의 경우에도 마찬가지였다. 49일째(2차 추가 면역화후),P501S 및 CPC-P501S에 의해 유도된 반응을 동등했다. 이러한 데이터는 CPC 태그 첨가가 P501S에 대한 반응의 동역학 및/또는 정도를 증강시킨다는 것을 암시한다.
실시예 X. P501S 단백질 + 보강제 연구를 이용한 마우스의 면역원성 실험
1. 디자인 및 보강제 제제
보강제에 배합된 재조합 정제된 CPC-P501S 단백질을 이용한 백신접종으로 유도된 면역 반응은 마우스에서 수행되는 실험들을 통해 특성분석했다. 5 내지 10주령의 C57BL6 암컷 마우스 그룹에 여러 보강제 시스템에 배합된 CPC-P501S 단백질 10㎍을 2주 간격으로 2 내지 6회 근육내로 백신 접종했다. 투여된 부피는 인간 용량(50㎕)의 1/10에 해당된다.
혈청 반응(총 Ig 반응) 및 세포 반응(T 세포 림프증식 및 시토킨 생산)은 최종 백신접종 후 6 내지 14일이 경과한 후 비장 세포를 가지고, 문헌[Gerard, C. et al., 2001, Vaccine 19, 2583-2589]에 기술된 바와 같은 표준 프로토콜에 따라 분석했다.
대표적인 한가지 실험 데이터는 다음과 같다. 실험에는 0일, 14일, 28일 및 42일째 CPC P501(10㎍) + 보강제(A, B, C)를 4회 근육내 주사한 8마리 C57BI/6 암컷 마우스 5 그룹을 사용했다. 실시예 V는 배합 수행 방법의 실험 프로토콜을 제시하고 있다. 간략히 설명하면, 보강제 배합은 다음과 같이 실시했다(양은 100㎕의 1회 투여량에 대한 것이다):
-보강제 A: QS21(10㎍), MPL(10㎍) 및 CpG7909(100㎍)(WO 00/62800에 개시된 방법에 따라 제조);
-보강제 B: QS21(20㎍), MPL(20㎍), CpG7909(100㎍) 및 SB62 수중유 에멀젼 50㎕의 배합(WO 95/17210);
-보강제 C: QS21(10㎍), MPL(10㎍), CpG7909(100㎍) 및 SB62 수중유 에멀젼 10㎕의 배합(WO 99/12565);
2. 혈청 반응
백신접종으로 유도된 총 Ig 반응은 CPC-P501 또는 RA12 -P501을 사용하여 ELISA로 측정했다(C term은 P501 단백질의 C 말단에 해당하는 P501 단백질의 절두 형태로서, TB 유래의 단백질 RA12의 N 말단에 융합됨- Ra12는 문헌 Skeiky et al., Infection and Immun.(1999) 67:3998-4007)에 기술된 MTB32A 항원에서 유래된 것).
보강된 CPC-P501S 단백질은 백신접종 후 양호한 항체 반응을 제공한다.
3. 세포 반응
3.1 림프증식
최종 백신 접종 후 7일째, 비장 세포에 대해 각각 림프증식 실험을 수행했다. 2.105비장 세포를, 1% 정상 마우스 혈청을 함유하는 RPMI 배지를 첨가한 96웰 미량평판에 4반복으로 주입했다. 여러 농도의 면역원(CPC-P501) 또는 절두형 단백질(RA12 P501)로 재자극한지 72시간 후 1μCi 3H 티미딘(Amersham 5Ci/ml)을 첨가했다. 16시간 후, 세포를 여과 판위에 수거했다. 병입된 방사능은 β계수기로 계수했다. 결과는 CPM 또는 자극 지수*(항원 함유 배양물 중의 기하 평균(geomean) CPM/항원 무함유 배양물 중의 기하 평균(CPM)으로 나타냈다. 양성 대조군은ConA(2㎍/ml)를 이용하여 재자극한 것을 사용했다.
도 26에 도시한 바와 같이 P501 특이적 림프증식은 보강처리된 단백질을 투여한 마우스의 모든 그룹에서, 다른 발현 시스템(대장균)에서 제조한 다른 P501 단백질이나 면역원으로 재자극한 후에 관찰되었는데, 이것은 백신접종으로 T세포가 생체내에서 촉발되었음을 시사한다.
3.2 비장 세포의 세포내 염색을 통해 측정한 IFNg 생산
골수 수지상 세포(BMDC)는 GMCSF의 존재하에 7일 동안 마우스 PBL을 배양한 후 수득했다.
최종 백신접종 후 7일째, 비장세포 또는 PBL을 수거하고 세포 현탁액을 제조했다. 106세포(그룹당 1푸울)를 CPCp501 단백질 또는 RA12 10㎍/ml로 하룻밤 동안펄싱된 105BMDC와 +/- 18시간 동안 항온배양했다.
2.4.G.2 항체 처리 후, 형광성 항CD4 및 CD8 항체(항CD4-APC 및 항CD8PerCP)를 사용하여 비장 세포를 염색했다. 침투 및 고정화 단계 후, 세포를 형광성 항IFNg-FITC 항체로 염색했다.
여러 보강제 중의 CPC P501을 백신접종한 마우스에서는, CD4 및 CD8 T 세포가 면역원 및 대장균에서 만든 C-term p501로 펄싱된 DC에 대한 반응으로 IFNg를 생산하는 것으로 관찰되었다(비장 세포와 PBL의 세포내 염색으로 확인). 단백질 만을 투여한 그룹에 비해 보강된 CPC-P501S를 투여한 그룹에서는 상기 시토킨 제조 세포율이 4 내지 10배 증가했고, CD4 또는 CD8 T 세포의 0.1 내지 10%가 IFNg를 생산하는 것으로 관찰되었다.
결론적으로, 보강처리된 CPC-P501 단백질은 마우스에서 면역원성임을 확인할 수 있었다. CD4 및 CD8 T 세포에 의한 IFNg 생산을 비롯한 P501 특이적 체액 반응 및 세포 반응은 모두 보강제 중의 CPC P501로 수회 근육내 백신접종된 후 확인할 수 있다.
실시예 XI. CPC-MUC-1 작제물 및 서열
CPC 서열은 뉴클레오타이드 서열 28로부터 수득했다. MUC1 서열은 진뱅크 데이터베이스(수탁번호 NM_002456)에서 입수했다.
1. MUC1-CPC 작제물
해독 후 절단되는 MUC1 중의 시그널 서열의 존재로 인해, CPC 모티프는 C-말단에 배치했다. 그 결과 얻어지는 MUC1-CPC DNA 서열은 서열번호 xx(도 28A)에 제시하고 대응하는 MUC1-CPC 단백질 서열은 서열번호 yy(도 28B)에 제시했다.
2. ss-CPC-MUC1 작제물
해독 후 절단되는 MUC1 중의 시그널 서열의 존재로 인해, MUC1 시그널 서열은 이종 리더 서열(인간 면역글로불린 중쇄 유래)로 치환시키고 CPC 모티프는 이종 리더 서열과 MUC1 서열 사이에 삽입하여 도 29에 도시한 ss-CPC-MUC1로 명명한 서열을 수득했다.
SEQUENCE LISTING
<110> GlaxosmithKline Biologicals sa
Glaxo Group Ltd
<120> Immunogenic compositions
<130> B45311
<160> 52
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> Streptococcus pneumoniae
<400> 1
Gly Trp Gln Lys Asn Asp Thr Gly Tyr Trp Tyr Val His Ser Asp
1 5 10 15
<210> 2
<211> 21
<212> PRT
<213> Streptococcus pneumoniae
<400> 2
Gly Ser Tyr Pro Lys Asp Lys Phe Glu Lys Ile Asn Gly Thr Trp Tyr
1 5 10 15
Tyr Phe Asp Ser Ser
20
<210> 3
<211> 22
<212> PRT
<213> Streptococcus pneumoniae
<400> 3
Gly Tyr Met Leu Ala Asp Arg Trp Arg Lys His Thr Asp Gly Asn Trp
1 5 10 15
Tyr Trp Phe Asp Asn Ser
20
<210> 4
<211> 20
<212> PRT
<213> Streptococcus pneumoniae
<400> 4
Gly Glu Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys Ile Ala Asp Lys Trp Tyr Tyr
1 5 10 15
Phe Asn Glu Glu
20
<210> 5
<211> 21
<212> PRT
<213> Streptococcus pneumoniae
<400> 5
Gly Ala Met Lys Thr Gly Trp Val Lys Tyr Lys Asp Thr Trp Tyr Tyr
1 5 10 15
Leu Asp Ala Lys Glu
20
<210> 6
<211> 23
<212> PRT
<213> Streptococcus pneumoniae
<400> 6
Gly Ala Met Val Ser Asn Ala Phe Ile Gln Ser Ala Asp Gly Thr Gly
1 5 10 15
Trp Tyr Tyr Leu Lys Pro Asp
20
<210> 7
<211> 142
<212> PRT
<213> Streptococcus pneumoniae
<400> 7
Gly Trp Gln Lys Asn Asp Thr Gly Tyr Trp Tyr Val His Ser Asp Gly
1 5 10 15
Ser Tyr Pro Lys Asp Lys Phe Glu Lys Ile Asn Gly Thr Trp Tyr Tyr
20 25 30
Phe Asp Ser Ser Gly Tyr Met Leu Ala Asp Arg Trp Arg Lys His Thr
35 40 45
Asp Gly Asn Trp Tyr Trp Phe Asp Asn Ser Gly Glu Met Ala Thr Gly
50 55 60
Trp Lys Lys Ile Ala Asp Lys Trp Tyr Tyr Phe Asn Glu Glu Gly Ala
65 70 75 80
Met Lys Thr Gly Trp Val Lys Tyr Lys Asp Thr Trp Tyr Tyr Leu Asp
85 90 95
Ala Lys Glu Gly Ala Met Val Ser Asn Ala Phe Ile Gln Ser Ala Asp
100 105 110
Gly Thr Gly Trp Tyr Tyr Leu Lys Pro Asp Gly Thr Leu Ala Asp Arg
115 120 125
Pro Glu Phe Thr Val Glu Pro Asp Gly Leu Ile Thr Val Lys
130 135 140
<210> 8
<211> 112
<212> PRT
<213> Streptococcus pneumoniae
<400> 8
Tyr Val His Ser Asp Gly Ser Tyr Pro Lys Asp Lys Phe Glu Lys Ile
1 5 10 15
Asn Gly Thr Trp Tyr Tyr Phe Asp Ser Ser Gly Tyr Met Leu Ala Asp
20 25 30
Arg Trp Arg Lys His Thr Asp Gly Asn Trp Tyr Trp Phe Asp Asn Ser
35 40 45
Gly Glu Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys Ile Ala Asp Lys Trp Tyr Tyr
50 55 60
Phe Asn Glu Glu Gly Ala Met Lys Thr Gly Trp Val Lys Tyr Lys Asp
65 70 75 80
Thr Trp Tyr Tyr Leu Asp Ala Lys Glu Gly Ala Met Val Ser Asn Ala
85 90 95
Phe Ile Gln Ser Ala Asp Gly Thr Gly Trp Tyr Tyr Leu Lys Pro Asp
100 105 110
<210> 9
<211> 45
<212> DNA
<213> Streptococcus pneumoniae
<400> 9
ggctggcaga agaatgacac tggctactgg tacgtacatt cagac 45
<210> 10
<211> 63
<212> DNA
<213> Streptococcus pneumoniae
<400> 10
ggctcttatc caaaagacaa gtttgagaaa atcaatggca cttggtacta ctttgacagt 60
tca 63
<210> 11
<211> 66
<212> DNA
<213> Streptococcus pneumoniae
<400> 11
ggctatatgc ttgcagaccg ctggaggaag cacacagacg gcaactggta ctggttcgac 60
aactca 66
<210> 12
<211> 60
<212> DNA
<213> Streptococcus pneumoniae
<400> 12
ggcgaaatgg ctacaggctg gaagaaaatc gctgataagt ggtactattt caacgaagaa 60
<210> 13
<211> 63
<212> DNA
<213> Streptococcus pneumoniae
<400> 13
ggtgccatga agacaggctg ggtcaagtac aaggacactt ggtactactt agacgctaaa 60
gaa 63
<210> 14
<211> 69
<212> DNA
<213> Streptococcus pneumoniae
<400> 14
ggcgccatgg tatcaaatgc ctttatccag tcagcggacg gaacaggctg gtactacctc 60
aaaccagac 69
<210> 15
<211> 429
<212> DNA
<213> Streptococcus pneumoniae
<400> 15
ggctggcaga agaatgacac tggctactgg tacgtacatt cagacggctc ttatccaaaa 60
gacaagtttg agaaaatcaa tggcacttgg tactactttg acagttcagg ctatatgctt 120
gcagaccgct ggaggaagca cacagacggc aactggtact ggttcgacaa ctcaggcgaa 180
atggctacag gctggaagaa aatcgctgat aagtggtact atttcaacga agaaggtgcc 240
atgaagacag gctgggtcaa gtacaaggac acttggtact acttagacgc taaagaaggc 300
gccatggtat caaatgcctt tatccagtca gcggacggaa caggctggta ctacctcaaa 360
ccagacggaa cactggcaga caggccagaa ttcacagtag agccagatgg cttgattaca 420
gtaaaataa 429
<210> 16
<211> 336
<212> DNA
<213> Streptococcus pneumoniae
<400> 16
tacgtacatt ccgacggctc ttatccaaaa gacaagtttg agaaaatcaa tggcacttgg 60
tactactttg acagttcagg ctatatgctt gcagaccgct ggaggaagca cacagacggc 120
aactggtact ggttcgacaa ctcaggcgaa atggctacag gctggaagaa aatcgctgat 180
aagtggtact atttcaacga agaaggtgcc atgaagacag gctgggtcaa gtacaaggac 240
acttggtact acttagacgc taaagaaggc gccatggtat caaatgcctt tatccagtca 300
gcggacggaa caggctggta ctacctcaaa ccagac 336
<210> 17
<211> 1674
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 17
gccaccatgg tccagaggct gtgggtgagc cgcctgctgc ggcaccggaa agcccagctc 60
ttgctggtca acctgctaac ctttggcctg gaggtgtgtt tggccgcagg catcacctat 120
gtgccgcctc tgctgctgga agtgggggta gaggagaagt tcatgaccat ggtgctgggc 180
attggtccag tgctgggcct ggtctgtgtc ccgctcctag gctcagccag tgaccactgg 240
cgtggacgct atggccgccg ccggcccttc atctgggcac tgtccttggg catcctgctg 300
agcctctttc tcatcccaag ggccggctgg ctagcagggc tgctgtgccc ggatcccagg 360
cccctggagc tggcactgct catcctgggc gtggggctgc tggacttctg tggccaggtg 420
tgcttcactc cactggaggc cctgctctct gacctcttcc gggacccgga ccactgtcgc 480
caggcctact ctgtctatgc cttcatgatc agtcttgggg gctgcctggg ctacctcctg 540
cctgccattg actgggacac cagtgccctg gccccctacc tgggcaccca ggaggagtgc 600
ctctttggcc tgctcaccct catcttcctc acctgcgtag cagccacact gctggtggct 660
gaggaggcag cgctgggccc caccgagcca gcagaagggc tgtcggcccc ctccttgtcg 720
ccccactgct gtccatgccg ggcccgcttg gctttccgga acctgggcgc cctgcttccc 780
cggctgcacc agctgtgctg ccgcatgccc cgcaccctgc gccggctctt cgtggctgag 840
ctgtgcagct ggatggcact catgaccttc acgctgtttt acacggattt cgtgggcgag 900
gggctgtacc agggcgtgcc cagagctgag ccgggcaccg aggcccggag acactatgat 960
gaaggcgttc ggatgggcag cctggggctg ttcctgcagt gcgccatctc cctggtcttc 1020
tctctggtca tggaccggct ggtgcagcga ttcggcactc gagcagtcta tttggccagt 1080
gtggcagctt tccctgtggc tgccggtgcc acatgcctgt cccacagtgt ggccgtggtg 1140
acagcttcag ccgccctcac cgggttcacc ttctcagccc tgcagatcct gccctacaca 1200
ctggcctccc tctaccaccg ggagaagcag gtgttcctgc ccaaataccg aggggacact 1260
ggaggtgcta gcagtgagga cagcctgatg accagcttcc tgccaggccc taagcctgga 1320
gctcccttcc ctaatggaca cgtgggtgct ggaggcagtg gcctgctccc acctccaccc 1380
gcgctctgcg gggcctctgc ctgtgatgtc tccgtacgtg tggtggtggg tgagcccacc 1440
gaggccaggg tggttccggg ccggggcatc tgcctggacc tcgccatcct ggatagtgcc 1500
ttcctgctgt cccaggtggc cccatccctg tttatgggct ccattgtcca gctcagccag 1560
tctgtcactg cctatatggt gtctgccgca ggcctgggtc tggtcgccat ttactttgct 1620
acacaggtag tatttgacaa gagcgacttg gccaaatact cagcgtaggt cgag 1674
<210> 18
<211> 1947
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hybrid gene between St. pneum. C-LytA, P2 T helper
epitope and human P501S.
<400> 18
gccaccatgg cggccgctta cgtacattcc gacggctctt atccaaaaga caagtttgag 60
aaaatcaatg gcacttggta ctactttgac agttcaggct atatgcttgc agaccgctgg 120
aggaagcaca cagacggcaa ctggtactgg ttcgacaact caggcgaaat ggctacaggc 180
tggaagaaaa tcgctgataa gtggtactat ttcaacgaag aaggtgccat gaagacaggc 240
tgggtcaagt acaaggacac ttggtactac ttagacgcta aagaaggcgc catgcaatac 300
atcaaggcta actctaagtt cattggtatc actgaaggcg tcatggtatc aaatgccttt 360
atccagtcag cggacggaac aggctggtac tacctcaaac cagacggaac actggcagac 420
aggccagaaa agttcatgta catggtgctg ggcattggtc cagtgctggg cctggtctgt 480
gtcccgctcc taggctcagc cagtgaccac tggcgtggac gctatggccg ccgccggccc 540
ttcatctggg cactgtcctt gggcatcctg ctgagcctct ttctcatccc aagggccggc 600
tggctagcag ggctgctgtg cccggatccc aggcccctgg agctggcact gctcatcctg 660
ggcgtggggc tgctggactt ctgtggccag gtgtgcttca ctccactgga ggccctgctc 720
tctgacctct tccgggaccc ggaccactgt cgccaggcct actctgtcta tgccttcatg 780
atcagtcttg ggggctgcct gggctacctc ctgcctgcca ttgactggga caccagtgcc 840
ctggccccct acctgggcac ccaggaggag tgcctctttg gcctgctcac cctcatcttc 900
ctcacctgcg tagcagccac actgctggtg gctgaggagg cagcgctggg ccccaccgag 960
ccagcagaag ggctgtcggc cccctccttg tcgccccact gctgtccatg ccgggcccgc 1020
ttggctttcc ggaacctggg cgccctgctt ccccggctgc accagctgtg ctgccgcatg 1080
ccccgcaccc tgcgccggct cttcgtggct gagctgtgca gctggatggc actcatgacc 1140
ttcacgctgt tttacacgga tttcgtgggc gaggggctgt accagggcgt gcccagagct 1200
gagccgggca ccgaggcccg gagacactat gatgaaggcg ttcggatggg cagcctgggg 1260
ctgttcctgc agtgcgccat ctccctggtc ttctctctgg tcatggaccg gctggtgcag 1320
cgattcggca ctcgagcagt ctatttggcc agtgtggcag ctttccctgt ggctgccggt 1380
gccacatgcc tgtcccacag tgtggccgtg gtgacagctt cagccgccct caccgggttc 1440
accttctcag ccctgcagat cctgccctac acactggcct ccctctacca ccgggagaag 1500
caggtgttcc tgcccaaata ccgaggggac actggaggtg ctagcagtga ggacagcctg 1560
atgaccagct tcctgccagg ccctaagcct ggagctccct tccctaatgg acacgtgggt 1620
gctggaggca gtggcctgct cccacctcca cccgcgctct gcggggcctc tgcctgtgat 1680
gtctccgtac gtgtggtggt gggtgagccc accgaggcca gggtggttcc gggccggggc 1740
atctgcctgg acctcgccat cctggatagt gccttcctgc tgtcccaggt ggccccatcc 1800
ctgtttatgg gctccattgt ccagctcagc cagtctgtca ctgcctatat ggtgtctgcc 1860
gcaggcctgg gtctggtcgc catttacttt gctacacagg tagtatttga caagagcgac 1920
ttggccaaat actcagcgta ggtcgag 1947
<210> 19
<211> 1662
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Codon optimised human P501S
<400> 19
atggtgcagc ggctctgggt gagccgcctc ctgcggcatc gcaaggccca gctcctgctg 60
gtgaatctgc tcacattcgg cctggaggtg tgcctggccg ccggcatcac ctacgtgccc 120
cccctcctgc tggaggtggg agtcgaggag aagttcatga ccatggtgct gggcattggg 180
cccgtcctgg gcctcgtgtg cgtgcctctc ctcggcagcg cttccgacca ttggcgcggc 240
cggtatggcc gcaggagacc cttcatctgg gctctgagtc tcggcatcct gctgagcctg 300
ttcctgatcc ctcgggccgg ctggctggcc gggctgctgt gccccgatcc tcggcccctg 360
gagctggccc tgctgatcct cggcgtgggc ctgctggact tctgcggcca ggtgtgcttc 420
acgcccctgg aggcactgct gagcgacctg ttccgggacc ccgaccattg ccgccaggcg 480
tacagcgtgt acgccttcat gatctccctg ggaggctgcc tgggctacct gctccccgcc 540
atcgattggg acaccagcgc actcgccccc tatctcggaa cacaggagga atgcctgttc 600
ggattgttga cgctcatctt cctcacgtgc gtcgcggcca ccctgttggt ggccgaggag 660
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tgctgccctt gccgggcccg cctggccttc cgtaatctgg gcgccctcct gcctcggctc 780
catcagctgt gttgcagaat gcctaggacg ctgcggcgcc tgttcgtcgc tgagttgtgc 840
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taccaggggg tgccgcgcgc cgagcccggg acagaggcgc gccgccacta cgacgaggga 960
gtgcgtatgg gctccctggg cctcttcttg cagtgcgcca tcagtctggt tttctctctg 1020
gtcatggaca ggctggtgca gcgcttcgga acccgggcgg tgtacctggc gagcgtggcc 1080
gccttccccg tggctgccgg cgccacctgc ctctctcact cggtggccgt ggtcaccgcc 1140
agcgccgccc tgaccgggtt caccttctct gccctgcaga ttctgcctta caccctggcc 1200
agcctgtacc atcgcgagaa acaggtgttt ctccccaagt acagaggcga caccgggggc 1260
gcctccagcg aggacagcct catgacctcc ttcctgcctg gccccaagcc cggcgcccct 1320
ttccccaacg ggcacgtggg cgccggcggg agtgggctcc tgcccccccc tcctgcgctg 1380
tgcggggcca gcgcctgcga cgtgagcgtg cgcgtggtgg tgggcgagcc caccgaggcc 1440
cgcgtggtgc cgggcagagg catttgtctg gacctggcca tcctcgactc cgccttcctc 1500
ctcagccagg tggccccgtc cctcttcatg ggctctatcg tccagctgtc tcagagcgtc 1560
accgcttaca tggtgtccgc tgctggactg ggcttggtgg ctatttattt cgccacccag 1620
gtggtgttcg acaagagcga cctggccaaa tactccgcct ga 1662
<210> 20
<211> 1662
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Codon optimised human P501S
<400> 20
atggtgcagc ggctgtgggt gtcccggctg ctgcgccata gaaaggccca gttgctgctg 60
gtgaacctgc tgactttcgg actggaggtg tgcctggctg ccgggatcac gtacgtgccc 120
cccctgctgc tggaggtggg cgtggaggag aagttcatga caatggtgct gggcatcggc 180
cccgtcctgg gcctcgtgtg tgtgcccctc ctcgggagtg cgtccgatca ttggcggggc 240
cgctacggcc gccgcagacc gttcatctgg gccctgagcc tggggatcct gctctctctc 300
ttcctgatcc cccgggccgg ctggctggcc ggcctgctgt gtcccgaccc ccgccctctg 360
gagctggccc tcctgatcct gggcgtgggc ttgttggact tctgcggcca ggtgtgtttc 420
actcccctgg aggctctgct ctccgacctc ttccgcgacc ccgaccactg taggcaggct 480
tacagcgtgt acgccttcat gatcagtctg gggggatgcc tgggctatct gctgcccgct 540
atcgactggg acaccagcgc cctggccccc tacctgggga ctcaggagga gtgcctgttc 600
ggcctgctca ccttgatctt cctgacgtgc gtcgccgcca ccctgctggt ggccgaggag 660
gcggccctgg ggcccaccga gcccgccgag ggcctgagcg ctcccagcct gagcccccat 720
tgctgcccgt gcagggctag gctcgccttc aggaatctgg gcgctttgct gccccgcctg 780
catcagctgt gctgtcgcat gcctcgcacc ctgcgccgcc tgttcgtcgc tgagctctgt 840
tcctggatgg ccctgatgac gttcaccctc ttctacaccg acttcgtggg ggagggcctg 900
taccagggcg tgcccagggc cgagcccggc accgaggcta ggcgccatta cgacgagggc 960
gtcaggatgg gctctctggg cctcttcctg cagtgcgcca tcagtctggt gttctctctg 1020
gtgatggacc ggctggtgca gcgcttcggc acccgggccg tgtacctcgc ctctgtggcg 1080
gctttccccg tcgccgccgg cgcgacctgc ctgtctcatt ctgtcgccgt ggtgaccgcc 1140
agcgccgccc tgaccggctt caccttcagt gcgctccaga ttctgcccta caccctggcg 1200
tctctgtacc atcgcgagaa gcaggtgttc ctgcccaagt accgcgggga cacaggggga 1260
gcttcctctg aggacagcct gatgaccagc ttcttgcccg gccccaagcc gggggcccct 1320
ttccccaacg gccatgtcgg ggcgggcggc agcggcctgc tccctccccc ccccgccctg 1380
tgcggcgcta gtgcctgcga cgtgagcgtg cgggtggtgg tgggggagcc caccgaggct 1440
agggtcgtgc ctggccgggg gatctgcctg gacctggcca tcctcgactc cgccttcctg 1500
ctctcccagg tggcgcccag cctgttcatg ggcagtatcg tgcagctgag ccagagcgtg 1560
accgcctaca tggtgagcgc cgccggcctg gggttggtgg ccatctactt tgccacccag 1620
gtcgtgttcg acaagagcga tctcgccaag tatagcgcct ga 1662
<210> 21
<211> 1688
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Codon optimised human P501S
<400> 21
gacggctagc gccaccatgg tgcagcggct ctgggtgagc cgcctcctgc ggcatcgcaa 60
ggcccagctc ctgctggtga atctgctcac attcggcctg gaggtgtgcc tggccgccgg 120
catcacctac gtgccccccc tcctgctgga ggtgggagtc gaggagaagt tcatgaccat 180
ggtgctgggc attgggcccg tcctgggcct cgtgtgcgtg cctctcctcg gcagcgcttc 240
cgaccattgg cgcggccggt atggccgcag gagacccttc atctgggctc tgagtctcgg 300
catcctgctg agcctgttcc tgatccctcg ggccggctgg ctggccgggc tgctgtgccc 360
cgatcctcgg cccctggagc tggccctgct gatcctcggc gtgggcctgc tggacttctg 420
cggccaggtg tgcttcacgc ccctggaggc actgctgagc gacctgttcc gggaccccga 480
ccattgccgc caggcgtaca gcgtgtacgc cttcatgatc tccctgggag gctgcctggg 540
ctacctgctc cccgccatcg attgggacac cagcgcactc gccccctatc tcggaacaca 600
ggaggaatgc ctgttcggac tgctgacgct catcttcctc acgtgcgtcg cggccaccct 660
gttggtggcc gaggaggccg ccctggggcc caccgagccg gccgagggac tgagcgcccc 720
gagcctgagt ccacactgct gcccttgccg ggcccgcctg gccttccgta atctgggcgc 780
cctcctgcct cggctccatc agctgtgttg cagaatgcct aggacgctgc ggcgcctgtt 840
cgtcgctgag ttgtgctcct ggatggctct catgaccttc accctgtttt atacggactt 900
cgtcggggag ggcctgtacc agggggtgcc gcgcgccgag cccgggacag aggcgcgccg 960
ccactacgac gagggagtgc gtatgggctc cctgggcctc ttcttgcagt gcgccatcag 1020
tctggttttc tctctggtca tggacaggct ggtgcagcgc ttcggaaccc gggcggtgta 1080
cctggcgagc gtggccgcct tccccgtggc tgccggcgcc acctgcctct ctcactcggt 1140
ggccgtggtc accgccagcg ccgccctgac cgggttcacc ttctctgccc tgcagattct 1200
gccttacacc ctggccagcc tgtaccatcg cgagaaacag gtgtttctcc ccaagtacag 1260
aggcgacacc gggggcgcct ccagcgagga cagcctcatg acctccttcc tgcctggccc 1320
caagcccggc gcccctttcc ccaacgggca cgtgggcgcc ggcgggagtg ggctcctgcc 1380
cccccctcct gcgctgtgcg gggccagcgc ctgcgacgtg agcgtgcgcg tggtggtggg 1440
cgagcccacc gaggcccgcg tggtgccggg cagaggcatt tgtctggacc tggccatcct 1500
cgactccgcc ttcctcctca gccaggtggc cccgtccctc ttcatgggct ctatcgtcca 1560
gctgtctcag agcgtcaccg cttacatggt gtccgctgct ggactgggct tggtggctat 1620
ttatttcgcc acccaggtgg tgttcgacaa gagcgacctg gccaaatact ccgcctgact 1680
cgaggcag 1688
<210> 22
<211> 1688
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Codon optimised human P501S
<400> 22
gacggctagc gccaccatgg tgcagcggct gtgggtgtcc cggctgctgc gccatagaaa 60
ggcccagttg ctgctggtga acctgctgac tttcggactg gaggtgtgcc tggctgccgg 120
gatcacgtac gtgccccccc tgctgctgga ggtgggcgtg gaggagaagt tcatgacaat 180
ggtgctgggc atcggccccg tcctgggcct cgtgtgtgtg cccctcctcg ggagtgcgtc 240
cgatcattgg cggggccgct acggccgccg cagaccgttc atctgggccc tgagcctggg 300
catcctgctc tctctcttcc tgatcccccg ggccggctgg ctggccggcc tgctgtgtcc 360
cgacccccgc cctctggagc tggccctcct gatcctgggc gtgggcctgc tggacttctg 420
cggccaggtg tgtttcactc ccctggaggc tctgctctcc gacctcttcc gcgaccccga 480
ccactgtagg caggcttaca gcgtgtacgc cttcatgatc agtctggggg gatgcctggg 540
ctatctgctg cccgctatcg actgggacac cagcgccctg gccccctacc tggggactca 600
ggaggagtgc ctgttcggcc tgctcacctt gatcttcctg acgtgcgtcg ccgccaccct 660
gctggtggcc gaggaggcgg ccctggggcc caccgagccc gccgagggcc tgagcgctcc 720
cagcctgagc ccccattgct gcccgtgcag ggctaggctc gccttcagga atctgggcgc 780
tttgctgccc cgcctgcatc agctgtgctg tcgcatgcct cgcaccctgc gccgcctgtt 840
cgtcgctgag ctctgttcct ggatggccct gatgacgttc accctcttct acaccgactt 900
cgtgggggag ggcctgtacc agggcgtgcc cagggccgag cccggcaccg aggctaggcg 960
ccattacgac gagggcgtca ggatgggctc tctgggcctc ttcctgcagt gcgccatcag 1020
tctggtgttc tctctggtga tggaccggct ggtgcagcgc ttcggcaccc gggccgtgta 1080
cctcgcctct gtggcggctt tccccgtcgc cgccggcgcg acctgcctgt ctcattctgt 1140
cgccgtggtg accgccagcg ccgccctgac cggcttcacc ttcagtgcgc tccagattct 1200
gccctacacc ctggcgtctc tgtaccatcg cgagaagcag gtgttcctgc ccaagtaccg 1260
cggggacaca gggggagctt cctctgagga cagcctgatg accagcttct tgcccggccc 1320
caagccgggg gcccctttcc ccaacggcca tgtcggggcg ggcggcagcg gcctgctccc 1380
tccccccccc gccctgtgcg gcgctagtgc ctgcgacgtg agcgtgcggg tggtggtggg 1440
ggagcccacc gaggctaggg tcgtgcctgg ccgggggatc tgcctggacc tggccatcct 1500
cgactccgcc ttcctgctct cccaggtggc gcccagcctg ttcatgggca gtatcgtgca 1560
gctgagccag agcgtgaccg cctacatggt gagcgccgcc ggcctggggt tggtggccat 1620
ctactttgcc acccaggtcg tgttcgacaa gagcgatctc gccaagtata gcgcctgact 1680
cgaggcag 1688
<210> 23
<211> 435
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hybrid gene between St. pneum. C-LytA, P2 T helper
epitope and a small portion of the 5' end of human
P501S
<400> 23
atggcggccg cttacgtaca ttccgacggc tcttatccaa aagacaagtt tgagaaaatc 60
aatggcactt ggtactactt tgacagttca ggctatatgc ttgcagaccg ctggaggaag 120
cacacagacg gcaactggta ctggttcgac aactcaggcg aaatggctac aggctggaag 180
aaaatcgctg ataagtggta ctatttcaac gaagaaggtg ccatgaagac aggctgggtc 240
aagtacaagg acacttggta ctacttagac gctaaagaag gcgccatgca atacatcaag 300
gctaactcta agttcattgg tatcactgaa ggcgtcatgg tatcaaatgc ctttatccag 360
tcagcggacg gaacaggctg gtactacctc aaaccagacg gaacactggc agacaggcca 420
gaaaagttca tgtac 435
<210> 24
<211> 435
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hybrid gene between St. pneum. C-LytA, P2 T helper
epitope and a small portion of the 5' end of human
P501S - codon-optimised
<400> 24
atggccgccg cctacgtgca tagcgacggg agctacccca aggacaagtt cgagaagatc 60
aacgggacat ggtactactt cgactcctcc ggctacatgc tcgccgaccg ctggcggaag 120
cacaccgacg gcaactggta ctggttcgat aactcgggag agatggccac cggctggaag 180
aagatcgcgg acaagtggta ctatttcaac gaggagggcg ccatgaagac cggctgggtg 240
aagtataagg acacctggta ctacctcgac gccaaggagg gcgccatgca gtatatcaag 300
gccaacagca agttcatcgg catcaccgag ggagtgatgg tcagcaacgc ctttatccag 360
agcgccgacg gcaccggatg gtactacttg aagccggacg gcaccctcgc ggatcggccc 420
gagaagttca tgtac 435
<210> 25
<211> 435
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hybrid gene between St. pneum. C-LytA, P2 T helper
epitope and a small portion of the 5' end of human
P501S - codon-optimised
<400> 25
atggccgccg cctacgtgca cagcgacggg tcctacccaa aggacaagtt cgagaagatc 60
aacggcacgt ggtactattt cgacagcagc ggctacatgc tcgccgatcg ctggcgcaag 120
cacaccgacg ggaactggta ctggttcgac aactctggcg agatggctac ggggtggaag 180
aagatcgccg acaagtggta ctacttcaac gaggagggcg ccatgaagac cgggtgggtg 240
aagtacaagg acacctggta ctacctggac gctaaggagg gcgccatgca gtacatcaag 300
gccaactcga agttcatcgg gatcaccgag ggcgtgatgg tcagtaacgc tttcatccag 360
agcgcggacg gcacaggctg gtattacctg aagcccgatg gcaccctggc ggacagacct 420
gagaaattca tgtac 435
<210> 26
<211> 464
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hybrid gene between St. pneum. C-LytA, P2 T helper
epitope and a small portion of the 5' end of human
P501S - codon-optimised
<400> 26
gacggctagc gccaccatgg ccgccgccta cgtgcatagc gacgggagct accccaagga 60
caagttcgag aagatcaacg ggacatggta ctacttcgac tcctccggct acatgctcgc 120
cgaccgctgg cggaagcaca ccgacggcaa ctggtactgg ttcgataact cgggagagat 180
ggccaccggc tggaagaaga tcgcggacaa gtggtactat ttcaacgagg agggcgccat 240
gaagaccggc tgggtgaagt ataaggacac ctggtactac ctcgacgcca aggagggcgc 300
catgcagtat atcaaggcca acagcaagtt catcggcatc accgagggag tgatggtcag 360
caacgccttt atccagagcg ccgacggcac cggatggtac tacttgaagc cggacggcac 420
cctcgcggat cggcccgaga agttcatgta ctgactcgag gcag 464
<210> 27
<211> 652
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hybrid protein between St. pneum. C-LytA, P2 T
helper epitope and amino acids 51-553 of human
P501S
<400> 27
Met Ala Ala Ala Tyr Val His Ser Asp Gly Ser Tyr Pro Lys Asp Lys
1 5 10 15
Phe Glu Lys Ile Asn Gly Thr Trp Tyr Tyr Phe Asp Ser Ser Gly Tyr
20 25 30
Met Leu Ala Asp Arg Trp Arg Lys His Thr Asp Gly Asn Trp Tyr Trp
35 40 45
Phe Asp Asn Ser Gly Glu Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys Ile Ala Asp
50 55 60
Lys Trp Tyr Tyr Phe Asn Glu Glu Gly Ala Met Lys Thr Gly Trp Val
65 70 75 80
Lys Tyr Lys Asp Thr Trp Tyr Tyr Leu Asp Ala Lys Glu Gly Ala Met
85 90 95
Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Gly Val
100 105 110
Met Val Ser Asn Ala Phe Ile Gln Ser Ala Asp Gly Thr Gly Trp Tyr
115 120 125
Tyr Leu Lys Pro Asp Gly Thr Leu Ala Asp Arg Pro Glu Lys Phe Met
130 135 140
Tyr Met Val Leu Gly Ile Gly Pro Val Leu Gly Leu Val Cys Val Pro
145 150 155 160
Leu Leu Gly Ser Ala Ser Asp His Trp Arg Gly Arg Tyr Gly Arg Arg
165 170 175
Arg Pro Phe Ile Trp Ala Leu Ser Leu Gly Ile Leu Leu Ser Leu Phe
180 185 190
Leu Ile Pro Arg Ala Gly Trp Leu Ala Gly Leu Leu Cys Pro Asp Pro
195 200 205
Arg Pro Leu Glu Leu Ala Leu Leu Ile Leu Gly Val Gly Leu Leu Asp
210 215 220
Phe Cys Gly Gln Val Cys Phe Thr Pro Leu Glu Ala Leu Leu Ser Asp
225 230 235 240
Leu Phe Arg Asp Pro Asp His Cys Arg Gln Ala Tyr Ser Val Tyr Ala
245 250 255
Phe Met Ile Ser Leu Gly Gly Cys Leu Gly Tyr Leu Leu Pro Ala Ile
260 265 270
Asp Trp Asp Thr Ser Ala Leu Ala Pro Tyr Leu Gly Thr Gln Glu Glu
275 280 285
Cys Leu Phe Gly Leu Leu Thr Leu Ile Phe Leu Thr Cys Val Ala Ala
290 295 300
Thr Leu Leu Val Ala Glu Glu Ala Ala Leu Gly Pro Thr Glu Pro Ala
305 310 315 320
Glu Gly Leu Ser Ala Pro Ser Leu Ser Pro His Cys Cys Pro Cys Arg
325 330 335
Ala Arg Leu Ala Phe Arg Asn Leu Gly Ala Leu Leu Pro Arg Leu His
340 345 350
Gln Leu Cys Cys Arg Met Pro Arg Thr Leu Arg Arg Leu Phe Val Ala
355 360 365
Glu Leu Cys Ser Trp Met Ala Leu Met Thr Phe Thr Leu Phe Tyr Thr
370 375 380
Asp Phe Val Gly Glu Gly Leu Tyr Gln Gly Val Pro Arg Ala Glu Pro
385 390 395 400
Gly Thr Glu Ala Arg Arg His Tyr Asp Glu Gly Val Arg Met Gly Ser
405 410 415
Leu Gly Leu Phe Leu Gln Cys Ala Ile Ser Leu Val Phe Ser Leu Val
420 425 430
Met Asp Arg Leu Val Gln Arg Phe Gly Thr Arg Ala Val Tyr Leu Ala
435 440 445
Ser Val Ala Ala Phe Pro Val Ala Ala Gly Ala Thr Cys Leu Ser His
450 455 460
Ser Val Ala Val Val Thr Ala Ser Ala Ala Leu Thr Gly Phe Thr Phe
465 470 475 480
Ser Ala Leu Gln Ile Leu Pro Tyr Thr Leu Ala Ser Leu Tyr His Arg
485 490 495
Glu Lys Gln Val Phe Leu Pro Lys Tyr Arg Gly Asp Thr Gly Gly Ala
500 505 510
Ser Ser Glu Asp Ser Leu Met Thr Ser Phe Leu Pro Gly Pro Lys Pro
515 520 525
Gly Ala Pro Phe Pro Asn Gly His Val Gly Ala Gly Gly Ser Gly Leu
530 535 540
Leu Pro Pro Pro Pro Ala Leu Cys Gly Ala Ser Ala Cys Asp Val Ser
545 550 555 560
Val Arg Val Val Val Gly Glu Pro Thr Glu Ala Arg Val Val Pro Gly
565 570 575
Arg Gly Ile Cys Leu Asp Leu Ala Ile Leu Asp Ser Ala Phe Leu Leu
580 585 590
Ser Gln Val Ala Pro Ser Leu Phe Met Gly Ser Ile Val Gln Leu Ser
595 600 605
Gln Ser Val Thr Ala Tyr Met Val Ser Ala Ala Gly Leu Gly Leu Val
610 615 620
Ala Ile Tyr Phe Ala Thr Gln Val Val Phe Asp Lys Ser Asp Leu Ala
625 630 635 640
Lys Tyr Ser Ala Gly Gly His His His His His His
645 650
<210> 28
<211> 1959
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA encoding the Hybrid protein between St. pneum.
C-LytA, P2 T helper epitope and amino acids 51-553
of human P501S
<400> 28
atggcggccg cttacgtaca ttccgacggc tcttatccaa aagacaagtt tgagaaaatc 60
aatggcactt ggtactactt tgacagttca ggctatatgc ttgcagaccg ctggaggaag 120
cacacagacg gcaactggta ctggttcgac aactcaggcg aaatggctac aggctggaag 180
aaaatcgctg ataagtggta ctatttcaac gaagaaggtg ccatgaagac aggctgggtc 240
aagtacaagg acacttggta ctacttagac gctaaagaag gcgccatgca atacatcaag 300
gctaactcta agttcattgg tatcactgaa ggcgtcatgg tatcaaatgc ctttatccag 360
tcagcggacg gaacaggctg gtactacctc aaaccagacg gaacactggc agacaggcca 420
gaaaagttca tgtacatggt gctgggcatt ggtccagtgc tgggcctggt ctgtgtcccg 480
ctcctaggct cagccagtga ccactggcgt ggacgctatg gccgccgccg gcccttcatc 540
tgggcactgt ccttgggcat cctgctgagc ctctttctca tcccaagggc cggctggcta 600
gcagggctgc tgtgcccgga tcccaggccc ctggagctgg cactgctcat cctgggcgtg 660
gggctgctgg acttctgtgg ccaggtgtgc ttcactccac tggaggccct gctctctgac 720
ctcttccggg acccggacca ctgtcgccag gcctactctg tctatgcctt catgatcagt 780
cttgggggct gcctgggcta cctcctgcct gccattgact gggacaccag tgccctggcc 840
ccctacctgg gcacccagga ggagtgcctc tttggcctgc tcaccctcat cttcctcacc 900
tgcgtagcag ccacactgct ggtggctgag gaggcagcgc tgggccccac cgagccagca 960
gaagggctgt cggccccctc cttgtcgccc cactgctgtc catgccgggc ccgcttggct 1020
ttccggaacc tgggcgccct gcttccccgg ctgcaccagc tgtgctgccg catgccccgc 1080
accctgcgcc ggctcttcgt ggctgagctg tgcagctgga tggcactcat gaccttcacg 1140
ctgttttaca cggatttcgt gggcgagggg ctgtaccagg gcgtgcccag agctgagccg 1200
ggcaccgagg cccggagaca ctatgatgaa ggcgttcgga tgggcagcct ggggctgttc 1260
ctgcagtgcg ccatctccct ggtcttctct ctggtcatgg accggctggt gcagcgattc 1320
ggcactcgag cagtctattt ggccagtgtg gcagctttcc ctgtggctgc cggtgccaca 1380
tgcctgtccc acagtgtggc cgtggtgaca gcttcagccg ccctcaccgg gttcaccttc 1440
tcagccctgc agatcctgcc ctacacactg gcctccctct accaccggga gaagcaggtg 1500
ttcctgccca aataccgagg ggacactgga ggtgctagca gtgaggacag cctgatgacc 1560
agcttcctgc caggccctaa gcctggagct cccttcccta atggacacgt gggtgctgga 1620
ggcagtggcc tgctcccacc tccacccgcg ctctgcgggg cctctgcctg tgatgtctcc 1680
gtacgtgtgg tggtgggtga gcccaccgag gccagggtgg ttccgggccg gggcatctgc 1740
ctggacctcg ccatcctgga tagtgccttc ctgctgtccc aggtggcccc atccctgttt 1800
atgggctcca ttgtccagct cagccagtct gtcactgcct atatggtgtc tgccgcaggc 1860
ctgggtctgg tcgccattta ctttgctaca caggtagtat ttgacaagag cgacttggcc 1920
aaatactcag cgggtggaca ccatcaccat caccattaa 1959
<210> 29
<211> 507
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human P501S (amino acids 55-553) fused to 6
histidine residues
<400> 29
Met Val Leu Gly Ile Gly Pro Val Leu Gly Leu Val Cys Val Pro Leu
1 5 10 15
Leu Gly Ser Ala Ser Asp His Trp Arg Gly Arg Tyr Gly Arg Arg Arg
20 25 30
Pro Phe Ile Trp Ala Leu Ser Leu Gly Ile Leu Leu Ser Leu Phe Leu
35 40 45
Ile Pro Arg Ala Gly Trp Leu Ala Gly Leu Leu Cys Pro Asp Pro Arg
50 55 60
Pro Leu Glu Leu Ala Leu Leu Ile Leu Gly Val Gly Leu Leu Asp Phe
65 70 75 80
Cys Gly Gln Val Cys Phe Thr Pro Leu Glu Ala Leu Leu Ser Asp Leu
85 90 95
Phe Arg Asp Pro Asp His Cys Arg Gln Ala Tyr Ser Val Tyr Ala Phe
100 105 110
Met Ile Ser Leu Gly Gly Cys Leu Gly Tyr Leu Leu Pro Ala Ile Asp
115 120 125
Trp Asp Thr Ser Ala Leu Ala Pro Tyr Leu Gly Thr Gln Glu Glu Cys
130 135 140
Leu Phe Gly Leu Leu Thr Leu Ile Phe Leu Thr Cys Val Ala Ala Thr
145 150 155 160
Leu Leu Val Ala Glu Glu Ala Ala Leu Gly Pro Thr Glu Pro Ala Glu
165 170 175
Gly Leu Ser Ala Pro Ser Leu Ser Pro His Cys Cys Pro Cys Arg Ala
180 185 190
Arg Leu Ala Phe Arg Asn Leu Gly Ala Leu Leu Pro Arg Leu His Gln
195 200 205
Leu Cys Cys Arg Met Pro Arg Thr Leu Arg Arg Leu Phe Val Ala Glu
210 215 220
Leu Cys Ser Trp Met Ala Leu Met Thr Phe Thr Leu Phe Tyr Thr Asp
225 230 235 240
Phe Val Gly Glu Gly Leu Tyr Gln Gly Val Pro Arg Ala Glu Pro Gly
245 250 255
Thr Glu Ala Arg Arg His Tyr Asp Glu Gly Val Arg Met Gly Ser Leu
260 265 270
Gly Leu Phe Leu Gln Cys Ala Ile Ser Leu Val Phe Ser Leu Val Met
275 280 285
Asp Arg Leu Val Gln Arg Phe Gly Thr Arg Ala Val Tyr Leu Ala Ser
290 295 300
Val Ala Ala Phe Pro Val Ala Ala Gly Ala Thr Cys Leu Ser His Ser
305 310 315 320
Val Ala Val Val Thr Ala Ser Ala Ala Leu Thr Gly Phe Thr Phe Ser
325 330 335
Ala Leu Gln Ile Leu Pro Tyr Thr Leu Ala Ser Leu Tyr His Arg Glu
340 345 350
Lys Gln Val Phe Leu Pro Lys Tyr Arg Gly Asp Thr Gly Gly Ala Ser
355 360 365
Ser Glu Asp Ser Leu Met Thr Ser Phe Leu Pro Gly Pro Lys Pro Gly
370 375 380
Ala Pro Phe Pro Asn Gly His Val Gly Ala Gly Gly Ser Gly Leu Leu
385 390 395 400
Pro Pro Pro Pro Ala Leu Cys Gly Ala Ser Ala Cys Asp Val Ser Val
405 410 415
Arg Val Val Val Gly Glu Pro Thr Glu Ala Arg Val Val Pro Gly Arg
420 425 430
Gly Ile Cys Leu Asp Leu Ala Ile Leu Asp Ser Ala Phe Leu Leu Ser
435 440 445
Gln Val Ala Pro Ser Leu Phe Met Gly Ser Ile Val Gln Leu Ser Gln
450 455 460
Ser Val Thr Ala Tyr Met Val Ser Ala Ala Gly Leu Gly Leu Val Ala
465 470 475 480
Ile Tyr Phe Ala Thr Gln Val Val Phe Asp Lys Ser Asp Leu Ala Lys
485 490 495
Tyr Ser Ala Gly Gly His His His His His His
500 505
<210> 30
<211> 1524
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA encoding Human P501S (amino acids 55-553)
fused to 6 histidine residues
<400> 30
atggtgctgg gcattggtcc agtgctgggc ctggtctgtg tcccgctcct aggctcagcc 60
agtgaccact ggcgtggacg ctatggccgc cgccggccct tcatctgggc actgtccttg 120
ggcatcctgc tgagcctctt tctcatccca agggccggct ggctagcagg gctgctgtgc 180
ccggatccca ggcccctgga gctggcactg ctcatcctgg gcgtggggct gctggacttc 240
tgtggccagg tgtgcttcac tccactggag gccctgctct ctgacctctt ccgggacccg 300
gaccactgtc gccaggccta ctctgtctat gccttcatga tcagtcttgg gggctgcctg 360
ggctacctcc tgcctgccat tgactgggac accagtgccc tggcccccta cctgggcacc 420
caggaggagt gcctctttgg cctgctcacc ctcatcttcc tcacctgcgt agcagccaca 480
ctgctggtgg ctgaggaggc agcgctgggc cccaccgagc cagcagaagg gctgtcggcc 540
ccctccttgt cgccccactg ctgtccatgc cgggcccgct tggctttccg gaacctgggc 600
gccctgcttc cccggctgca ccagctgtgc tgccgcatgc cccgcaccct gcgccggctc 660
ttcgtggctg agctgtgcag ctggatggca ctcatgacct tcacgctgtt ttacacggat 720
ttcgtgggcg aggggctgta ccagggcgtg cccagagctg agccgggcac cgaggcccgg 780
agacactatg atgaaggcgt tcggatgggc agcctggggc tgttcctgca gtgcgccatc 840
tccctggtct tctctctggt catggaccgg ctggtgcagc gattcggcac tcgagcagtc 900
tatttggcca gtgtggcagc tttccctgtg gctgccggtg ccacatgcct gtcccacagt 960
gtggccgtgg tgacagcttc agccgccctc accgggttca ccttctcagc cctgcagatc 1020
ctgccctaca cactggcctc cctctaccac cgggagaagc aggtgttcct gcccaaatac 1080
cgaggggaca ctggaggtgc tagcagtgag gacagcctga tgaccagctt cctgccaggc 1140
cctaagcctg gagctccctt ccctaatgga cacgtgggtg ctggaggcag tggcctgctc 1200
ccacctccac ccgcgctctg cggggcctct gcctgtgatg tctccgtacg tgtggtggtg 1260
ggtgagccca ccgaggccag ggtggttccg ggccggggca tctgcctgga cctcgccatc 1320
ctggatagtg ccttcctgct gtcccaggtg gccccatccc tgtttatggg ctccattgtc 1380
cagctcagcc agtctgtcac tgcctatatg gtgtctgccg caggcctggg tctggtcgcc 1440
atttactttg ctacacaggt agtatttgac aagagcgact tggccaaata ctcagcgggt 1500
ggacaccatc accatcacca ttaa 1524
<210> 31
<211> 685
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human P501S (amino acids 1-34 fused to 55-553)
fused to 6 histidine residues
<400> 31
Met Ala Ala Val Gln Arg Leu Trp Val Ser Arg Leu Leu Arg His Arg
1 5 10 15
Lys Ala Gln Leu Leu Leu Val Asn Leu Leu Thr Phe Gly Leu Glu Val
20 25 30
Cys Leu Ala Ala Ala Tyr Val His Ser Asp Gly Ser Tyr Pro Lys Asp
35 40 45
Lys Phe Glu Lys Ile Asn Gly Thr Trp Tyr Tyr Phe Asp Ser Ser Gly
50 55 60
Tyr Met Leu Ala Asp Arg Trp Arg Lys His Thr Asp Gly Asn Trp Tyr
65 70 75 80
Trp Phe Asp Asn Ser Gly Glu Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys Ile Ala
85 90 95
Asp Lys Trp Tyr Tyr Phe Asn Glu Glu Gly Ala Met Lys Thr Gly Trp
100 105 110
Val Lys Tyr Lys Asp Thr Trp Tyr Tyr Leu Asp Ala Lys Glu Gly Ala
115 120 125
Met Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Gly
130 135 140
Val Met Val Ser Asn Ala Phe Ile Gln Ser Ala Asp Gly Thr Gly Trp
145 150 155 160
Tyr Tyr Leu Lys Pro Asp Gly Thr Leu Ala Asp Arg Pro Glu Lys Phe
165 170 175
Met Tyr Met Val Leu Gly Ile Gly Pro Val Leu Gly Leu Val Cys Val
180 185 190
Pro Leu Leu Gly Ser Ala Ser Asp His Trp Arg Gly Arg Tyr Gly Arg
195 200 205
Arg Arg Pro Phe Ile Trp Ala Leu Ser Leu Gly Ile Leu Leu Ser Leu
210 215 220
Phe Leu Ile Pro Arg Ala Gly Trp Leu Ala Gly Leu Leu Cys Pro Asp
225 230 235 240
Pro Arg Pro Leu Glu Leu Ala Leu Leu Ile Leu Gly Val Gly Leu Leu
245 250 255
Asp Phe Cys Gly Gln Val Cys Phe Thr Pro Leu Glu Ala Leu Leu Ser
260 265 270
Asp Leu Phe Arg Asp Pro Asp His Cys Arg Gln Ala Tyr Ser Val Tyr
275 280 285
Ala Phe Met Ile Ser Leu Gly Gly Cys Leu Gly Tyr Leu Leu Pro Ala
290 295 300
Ile Asp Trp Asp Thr Ser Ala Leu Ala Pro Tyr Leu Gly Thr Gln Glu
305 310 315 320
Glu Cys Leu Phe Gly Leu Leu Thr Leu Ile Phe Leu Thr Cys Val Ala
325 330 335
Ala Thr Leu Leu Val Ala Glu Glu Ala Ala Leu Gly Pro Thr Glu Pro
340 345 350
Ala Glu Gly Leu Ser Ala Pro Ser Leu Ser Pro His Cys Cys Pro Cys
355 360 365
Arg Ala Arg Leu Ala Phe Arg Asn Leu Gly Ala Leu Leu Pro Arg Leu
370 375 380
His Gln Leu Cys Cys Arg Met Pro Arg Thr Leu Arg Arg Leu Phe Val
385 390 395 400
Ala Glu Leu Cys Ser Trp Met Ala Leu Met Thr Phe Thr Leu Phe Tyr
405 410 415
Thr Asp Phe Val Gly Glu Gly Leu Tyr Gln Gly Val Pro Arg Ala Glu
420 425 430
Pro Gly Thr Glu Ala Arg Arg His Tyr Asp Glu Gly Val Arg Met Gly
435 440 445
Ser Leu Gly Leu Phe Leu Gln Cys Ala Ile Ser Leu Val Phe Ser Leu
450 455 460
Val Met Asp Arg Leu Val Gln Arg Phe Gly Thr Arg Ala Val Tyr Leu
465 470 475 480
Ala Ser Val Ala Ala Phe Pro Val Ala Ala Gly Ala Thr Cys Leu Ser
485 490 495
His Ser Val Ala Val Val Thr Ala Ser Ala Ala Leu Thr Gly Phe Thr
500 505 510
Phe Ser Ala Leu Gln Ile Leu Pro Tyr Thr Leu Ala Ser Leu Tyr His
515 520 525
Arg Glu Lys Gln Val Phe Leu Pro Lys Tyr Arg Gly Asp Thr Gly Gly
530 535 540
Ala Ser Ser Glu Asp Ser Leu Met Thr Ser Phe Leu Pro Gly Pro Lys
545 550 555 560
Pro Gly Ala Pro Phe Pro Asn Gly His Val Gly Ala Gly Gly Ser Gly
565 570 575
Leu Leu Pro Pro Pro Pro Ala Leu Cys Gly Ala Ser Ala Cys Asp Val
580 585 590
Ser Val Arg Val Val Val Gly Glu Pro Thr Glu Ala Arg Val Val Pro
595 600 605
Gly Arg Gly Ile Cys Leu Asp Leu Ala Ile Leu Asp Ser Ala Phe Leu
610 615 620
Leu Ser Gln Val Ala Pro Ser Leu Phe Met Gly Ser Ile Val Gln Leu
625 630 635 640
Ser Gln Ser Val Thr Ala Tyr Met Val Ser Ala Ala Gly Leu Gly Leu
645 650 655
Val Ala Ile Tyr Phe Ala Thr Gln Val Val Phe Asp Lys Ser Asp Leu
660 665 670
Ala Lys Tyr Ser Ala Gly Gly His His His His His His
675 680 685
<210> 32
<211> 2058
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA encoding Human P501S (amino acids 1-34 fused
to 55-553) fused to 6 histidine residues
<400> 32
atggcggccg tgcagaggct atgggtatcg agactgctaa gacaccgcaa agctcagttg 60
ttgttggtta acttgttgac cttcgggctg gaagtctgtt tggcggccgc ttacgtacat 120
tccgacggct cttatccaaa agacaagttt gagaaaatca atggcacttg gtactacttt 180
gacagttcag gctatatgct tgcagaccgc tggaggaagc acacagacgg caactggtac 240
tggttcgaca actcaggcga aatggctaca ggctggaaga aaatcgctga taagtggtac 300
tatttcaacg aagaaggtgc catgaagaca ggctgggtca agtacaagga cacttggtac 360
tacttagacg ctaaagaagg cgccatgcaa tacatcaagg ctaactctaa gttcattggt 420
atcactgaag gcgtcatggt atcaaatgcc tttatccagt cagcggacgg aacaggctgg 480
tactacctca aaccagacgg aacactggca gacaggccag aaaagttcat gtacatggtg 540
ctgggcattg gtccagtgct gggcctggtc tgtgtcccgc tcctaggctc agccagtgac 600
cactggcgtg gacgctatgg ccgccgccgg cccttcatct gggcactgtc cttgggcatc 660
ctgctgagcc tctttctcat cccaagggcc ggctggctag cagggctgct gtgcccggat 720
cccaggcccc tggagctggc actgctcatc ctgggcgtgg ggctgctgga cttctgtggc 780
caggtgtgct tcactccact ggaggccctg ctctctgacc tcttccggga cccggaccac 840
tgtcgccagg cctactctgt ctatgccttc atgatcagtc ttgggggctg cctgggctac 900
ctcctgcctg ccattgactg ggacaccagt gccctggccc cctacctggg cacccaggag 960
gagtgcctct ttggcctgct caccctcatc ttcctcacct gcgtagcagc cacactgctg 1020
gtggctgagg aggcagcgct gggccccacc gagccagcag aagggctgtc ggccccctcc 1080
ttgtcgcccc actgctgtcc atgccgggcc cgcttggctt tccggaacct gggcgccctg 1140
cttccccggc tgcaccagct gtgctgccgc atgccccgca ccctgcgccg gctcttcgtg 1200
gctgagctgt gcagctggat ggcactcatg accttcacgc tgttttacac ggatttcgtg 1260
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tatgatgaag gcgttcggat gggcagcctg gggctgttcc tgcagtgcgc catctccctg 1380
gtcttctctc tggtcatgga ccggctggtg cagcgattcg gcactcgagc agtctatttg 1440
gccagtgtgg cagctttccc tgtggctgcc ggtgccacat gcctgtccca cagtgtggcc 1500
gtggtgacag cttcagccgc cctcaccggg ttcaccttct cagccctgca gatcctgccc 1560
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gacactggag gtgctagcag tgaggacagc ctgatgacca gcttcctgcc aggccctaag 1680
cctggagctc ccttccctaa tggacacgtg ggtgctggag gcagtggcct gctcccacct 1740
ccacccgcgc tctgcggggc ctctgcctgt gatgtctccg tacgtgtggt ggtgggtgag 1800
cccaccgagg ccagggtggt tccgggccgg ggcatctgcc tggacctcgc catcctggat 1860
agtgccttcc tgctgtccca ggtggcccca tccctgttta tgggctccat tgtccagctc 1920
agccagtctg tcactgccta tatggtgtct gccgcaggcc tgggtctggt cgccatttac 1980
tttgctacac aggtagtatt tgacaagagc gacttggcca aatactcagc gggtggacac 2040
catcaccatc accattaa 2058
<210> 33
<211> 671
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> St. pneum. C-LytA portion fused to P2 T helper
epitope fused to Human P501S (amino acids 55-553)
fused to 6 histidine residues downstream of yeast
alphaprepro signal sequence
<400> 33
Met Ala Ala Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala
1 5 10 15
Ser Ser Ala Leu Ala Ala Ala Tyr Val His Ser Asp Gly Ser Tyr Pro
20 25 30
Lys Asp Lys Phe Glu Lys Ile Asn Gly Thr Trp Tyr Tyr Phe Asp Ser
35 40 45
Ser Gly Tyr Met Leu Ala Asp Arg Trp Arg Lys His Thr Asp Gly Asn
50 55 60
Trp Tyr Trp Phe Asp Asn Ser Gly Glu Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys
65 70 75 80
Ile Ala Asp Lys Trp Tyr Tyr Phe Asn Glu Glu Gly Ala Met Lys Thr
85 90 95
Gly Trp Val Lys Tyr Lys Asp Thr Trp Tyr Tyr Leu Asp Ala Lys Glu
100 105 110
Gly Ala Met Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr
115 120 125
Glu Gly Val Met Val Ser Asn Ala Phe Ile Gln Ser Ala Asp Gly Thr
130 135 140
Gly Trp Tyr Tyr Leu Lys Pro Asp Gly Thr Leu Ala Asp Arg Pro Glu
145 150 155 160
Lys Phe Met Tyr Met Val Leu Gly Ile Gly Pro Val Leu Gly Leu Val
165 170 175
Cys Val Pro Leu Leu Gly Ser Ala Ser Asp His Trp Arg Gly Arg Tyr
180 185 190
Gly Arg Arg Arg Pro Phe Ile Trp Ala Leu Ser Leu Gly Ile Leu Leu
195 200 205
Ser Leu Phe Leu Ile Pro Arg Ala Gly Trp Leu Ala Gly Leu Leu Cys
210 215 220
Pro Asp Pro Arg Pro Leu Glu Leu Ala Leu Leu Ile Leu Gly Val Gly
225 230 235 240
Leu Leu Asp Phe Cys Gly Gln Val Cys Phe Thr Pro Leu Glu Ala Leu
245 250 255
Leu Ser Asp Leu Phe Arg Asp Pro Asp His Cys Arg Gln Ala Tyr Ser
260 265 270
Val Tyr Ala Phe Met Ile Ser Leu Gly Gly Cys Leu Gly Tyr Leu Leu
275 280 285
Pro Ala Ile Asp Trp Asp Thr Ser Ala Leu Ala Pro Tyr Leu Gly Thr
290 295 300
Gln Glu Glu Cys Leu Phe Gly Leu Leu Thr Leu Ile Phe Leu Thr Cys
305 310 315 320
Val Ala Ala Thr Leu Leu Val Ala Glu Glu Ala Ala Leu Gly Pro Thr
325 330 335
Glu Pro Ala Glu Gly Leu Ser Ala Pro Ser Leu Ser Pro His Cys Cys
340 345 350
Pro Cys Arg Ala Arg Leu Ala Phe Arg Asn Leu Gly Ala Leu Leu Pro
355 360 365
Arg Leu His Gln Leu Cys Cys Arg Met Pro Arg Thr Leu Arg Arg Leu
370 375 380
Phe Val Ala Glu Leu Cys Ser Trp Met Ala Leu Met Thr Phe Thr Leu
385 390 395 400
Phe Tyr Thr Asp Phe Val Gly Glu Gly Leu Tyr Gln Gly Val Pro Arg
405 410 415
Ala Glu Pro Gly Thr Glu Ala Arg Arg His Tyr Asp Glu Gly Val Arg
420 425 430
Met Gly Ser Leu Gly Leu Phe Leu Gln Cys Ala Ile Ser Leu Val Phe
435 440 445
Ser Leu Val Met Asp Arg Leu Val Gln Arg Phe Gly Thr Arg Ala Val
450 455 460
Tyr Leu Ala Ser Val Ala Ala Phe Pro Val Ala Ala Gly Ala Thr Cys
465 470 475 480
Leu Ser His Ser Val Ala Val Val Thr Ala Ser Ala Ala Leu Thr Gly
485 490 495
Phe Thr Phe Ser Ala Leu Gln Ile Leu Pro Tyr Thr Leu Ala Ser Leu
500 505 510
Tyr His Arg Glu Lys Gln Val Phe Leu Pro Lys Tyr Arg Gly Asp Thr
515 520 525
Gly Gly Ala Ser Ser Glu Asp Ser Leu Met Thr Ser Phe Leu Pro Gly
530 535 540
Pro Lys Pro Gly Ala Pro Phe Pro Asn Gly His Val Gly Ala Gly Gly
545 550 555 560
Ser Gly Leu Leu Pro Pro Pro Pro Ala Leu Cys Gly Ala Ser Ala Cys
565 570 575
Asp Val Ser Val Arg Val Val Val Gly Glu Pro Thr Glu Ala Arg Val
580 585 590
Val Pro Gly Arg Gly Ile Cys Leu Asp Leu Ala Ile Leu Asp Ser Ala
595 600 605
Phe Leu Leu Ser Gln Val Ala Pro Ser Leu Phe Met Gly Ser Ile Val
610 615 620
Gln Leu Ser Gln Ser Val Thr Ala Tyr Met Val Ser Ala Ala Gly Leu
625 630 635 640
Gly Leu Val Ala Ile Tyr Phe Ala Thr Gln Val Val Phe Asp Lys Ser
645 650 655
Asp Leu Ala Lys Tyr Ser Ala Gly Gly His His His His His His
660 665 670
<210> 34
<211> 2477
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA encoding St. pneum. C-LytA portion fused to P2
T helper epitope fused to Human P501S (amino acids
55-553) fused to 6 histidine residues downstream
of yeast alphaprepro signal sequence
<400> 34
tacgtacatt ccgacggctc ttatccaaaa gacaagtttg agaaaatcaa tggcacttgg 60
tactactttg acagttcagg ctatatgctt gcagaccgct ggaggaagca cacagacggc 120
aactggtact ggttcgacaa ctcaggcgaa atggctacag gctggaagaa aatcgctgat 180
aagtggtact atttcaacga agaaggtgcc atgaagacag gctgggtcaa gtacaaggac 240
acttggtact acttagacgc taaagaaggc gccatgcaat acatcaaggc taactctaag 300
ttcattggta tcactgaagg cgtcatggta tcaaatgcct ttatccagtc agcggacgga 360
acaggctggt actacctcaa accagacgga acactggcag acaggccaga aatggcggcc 420
agatttcctt caatttttac tgcagtttta ttcgcagcat cctccgcatt agcggccgct 480
tacgtacatt ccgacggctc ttatccaaaa gacaagtttg agaaaatcaa tggcacttgg 540
tactactttg acagttcagg ctatatgctt gcagaccgct ggaggaagca cacagacggc 600
aactggtact ggttcgacaa ctcaggcgaa atggctacag gctggaagaa aatcgctgat 660
aagtggtact atttcaacga agaaggtgcc atgaagacag gctgggtcaa gtacaaggac 720
acttggtact acttagacgc taaagaaggc gccatgcaat acatcaaggc taactctaag 780
ttcattggta tcactgaagg cgtcatggta tcaaatgcct ttatccagtc agcggacgga 840
acaggctggt actacctcaa accagacgga acactggcag acaggccaga agctggtatt 900
acttacgttc caccattgtt gttggaagtt ggtgttgaag aaaagttcat gtacatggtg 960
ctgggcattg gtccagtgct gggcctggtc tgtgtcccgc tcctaggctc agccagtgac 1020
cactggcgtg gacgctatgg ccgccgccgg cccttcatct gggcactgtc cttgggcatc 1080
ctgctgagcc tctttctcat cccaagggcc ggctggctag cagggctgct gtgcccggat 1140
cccaggcccc tggagctggc actgctcatc ctgggcgtgg ggctgctgga cttctgtggc 1200
caggtgtgct tcactccact ggaggccctg ctctctgacc tcttccggga cccggaccac 1260
tgtcgccagg cctactctgt ctatgcttca tgatcagtct tgggggctgc ctgggctacc 1320
tcctgcctgc cattgactgg gacaccagtg ccctggcccc ctacctgggc acccaggagg 1380
agtgcctctt tggcctgctc accctcatct tcctcacctg cgtagcagcc acactgctgg 1440
tggctgagga ggcagcgctg ggccccaccg agccagcaga agggctgtcg gccccctcct 1500
tgtcgcccca ctgctgtcca tgccgggccc gcttggcttt ccggaacctg ggcgccctgc 1560
ttccccggct gcaccagctg tgctgccgca tgccccgcac cctgcgccgg ctcttcgtgg 1620
ctgagctgtg cagctggatg gcactcatga ccttcacgct gttttacacg gatttcgtgg 1680
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atgatgaagg cgttcggatg ggcagcctgg ggctgttcct gcagtgcgcc atctccctgg 1800
tcttctctct ggtcatggac cggctggtgc agcgattcgg cactcgagca gtctatttgg 1860
ccagtgtggc agctttccct gtggctgccg gtgccacatg cctgtcccac agtgtggccg 1920
tggtgacagc ttcagccgcc ctcaccgggt tcaccttctc agccctgcag atcctgccct 1980
acacactggc ctccctctac caccgggaga agcaggtgtt cctgcccaaa taccgagggg 2040
acactggagg tgctagcagt gaggacagcc tgatgaccag cttcctgcca ggccctaagc 2100
ctggagctcc cttccctaat ggacacgtgg gtgctggagg cagtggcctg ctcccacctc 2160
cacccgcgct ctgcggggcc tctgcctgtg atgtctccgt acgtgtggtg gtgggtgagc 2220
ccaccgaggc cagggtggtt ccgggccggg gcatctgcct ggacctcgcc atcctggata 2280
gtgccttcct gctgtcccag gtggccccat ccctgtttat gggctccatt gtccagctca 2340
gccagtctgt cactgcctat atggtgtctg ccgcaggcct gggtctggtc gccatttact 2400
ttgctacaca ggtagtattt gacaagagcg acttggccaa atactcagcg ggtggacacc 2460
atcaccatca ccattaa 2477
<210> 35
<211> 595
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human P501S (amino acids 55-553) fused to 6
histidine residues downstream of yeast alphaprepro
signal sequence
<400> 35
Met Ser Phe Leu Asn Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser Ala
1 5 10 15
Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln Ile
20 25 30
Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe Asp
35 40 45
Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu Phe
50 55 60
Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val Ser
65 70 75 80
Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Met Val Leu Gly Ile Gly Pro Val
85 90 95
Leu Gly Leu Val Cys Val Pro Leu Leu Gly Ser Ala Ser Asp His Trp
100 105 110
Arg Gly Arg Tyr Gly Arg Arg Arg Pro Phe Ile Trp Ala Leu Ser Leu
115 120 125
Gly Ile Leu Leu Ser Leu Phe Leu Ile Pro Arg Ala Gly Trp Leu Ala
130 135 140
Gly Leu Leu Cys Pro Asp Pro Arg Pro Leu Glu Leu Ala Leu Leu Ile
145 150 155 160
Leu Gly Val Gly Leu Leu Asp Phe Cys Gly Gln Val Cys Phe Thr Pro
165 170 175
Leu Glu Ala Leu Leu Ser Asp Leu Phe Arg Asp Pro Asp His Cys Arg
180 185 190
Gln Ala Tyr Ser Val Tyr Ala Phe Met Ile Ser Leu Gly Gly Cys Leu
195 200 205
Gly Tyr Leu Leu Pro Ala Ile Asp Trp Asp Thr Ser Ala Leu Ala Pro
210 215 220
Tyr Leu Gly Thr Gln Glu Glu Cys Leu Phe Gly Leu Leu Thr Leu Ile
225 230 235 240
Phe Leu Thr Cys Val Ala Ala Thr Leu Leu Val Ala Glu Glu Ala Ala
245 250 255
Leu Gly Pro Thr Glu Pro Ala Glu Gly Leu Ser Ala Pro Ser Leu Ser
260 265 270
Pro His Cys Cys Pro Cys Arg Ala Arg Leu Ala Phe Arg Asn Leu Gly
275 280 285
Ala Leu Leu Pro Arg Leu His Gln Leu Cys Cys Arg Met Pro Arg Thr
290 295 300
Leu Arg Arg Leu Phe Val Ala Glu Leu Cys Ser Trp Met Ala Leu Met
305 310 315 320
Thr Phe Thr Leu Phe Tyr Thr Asp Phe Val Gly Glu Gly Leu Tyr Gln
325 330 335
Gly Val Pro Arg Ala Glu Pro Gly Thr Glu Ala Arg Arg His Tyr Asp
340 345 350
Glu Gly Val Arg Met Gly Ser Leu Gly Leu Phe Leu Gln Cys Ala Ile
355 360 365
Ser Leu Val Phe Ser Leu Val Met Asp Arg Leu Val Gln Arg Phe Gly
370 375 380
Thr Arg Ala Val Tyr Leu Ala Ser Val Ala Ala Phe Pro Val Ala Ala
385 390 395 400
Gly Ala Thr Cys Leu Ser His Ser Val Ala Val Val Thr Ala Ser Ala
405 410 415
Ala Leu Thr Gly Phe Thr Phe Ser Ala Leu Gln Ile Leu Pro Tyr Thr
420 425 430
Leu Ala Ser Leu Tyr His Arg Glu Lys Gln Val Phe Leu Pro Lys Tyr
435 440 445
Arg Gly Asp Thr Gly Gly Ala Ser Ser Glu Asp Ser Leu Met Thr Ser
450 455 460
Phe Leu Pro Gly Pro Lys Pro Gly Ala Pro Phe Pro Asn Gly His Val
465 470 475 480
Gly Ala Gly Gly Ser Gly Leu Leu Pro Pro Pro Pro Ala Leu Cys Gly
485 490 495
Ala Ser Ala Cys Asp Val Ser Val Arg Val Val Val Gly Glu Pro Thr
500 505 510
Glu Ala Arg Val Val Pro Gly Arg Gly Ile Cys Leu Asp Leu Ala Ile
515 520 525
Leu Asp Ser Ala Phe Leu Leu Ser Gln Val Ala Pro Ser Leu Phe Met
530 535 540
Gly Ser Ile Val Gln Leu Ser Gln Ser Val Thr Ala Tyr Met Val Ser
545 550 555 560
Ala Ala Gly Leu Gly Leu Val Ala Ile Tyr Phe Ala Thr Gln Val Val
565 570 575
Phe Asp Lys Ser Asp Leu Ala Lys Tyr Ser Ala Gly Gly His His His
580 585 590
His His His
595
<210> 36
<211> 1788
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA encoding Human P501S (amino acids 55-553)
fused to 6 histidine residues downstream of yeast
alphaprepro signal sequence
<400> 36
atgagtttcc tcaattttac tgcagtttta ttcgcagcat cctccgcatt agctgctcca 60
gtcaacacta caacagaaga tgaaacggca caaattccgg ctgaagctgt catcggttac 120
tcagatttag aaggggattt cgatgttgct gttttgccat tttccaacag cacaaataac 180
gggttattgt ttataaatac tactattgcc agcattgctg ctaaagaaga aggggtatct 240
ctcgagaaaa gagaggctga agccatggtg ctgggcattg gtccagtgct gggcctggtc 300
tgtgtcccgc tcctaggctc agccagtgac cactggcgtg gacgctatgg ccgccgccgg 360
cccttcatct gggcactgtc cttgggcatc ctgctgagcc tctttctcat cccaagggcc 420
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ctgggcgtgg ggctgctgga cttctgtggc caggtgtgct tcactccact ggaggccctg 540
ctctctgacc tcttccggga cccggaccac tgtcgccagg cctactctgt ctatgccttc 600
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gccctggccc cctacctggg cacccaggag gagtgcctct ttggcctgct caccctcatc 720
ttcctcacct gcgtagcagc cacactgctg gtggctgagg aggcagcgct gggccccacc 780
gagccagcag aagggctgtc ggccccctcc ttgtcgcccc actgctgtcc atgccgggcc 840
cgcttggctt tccggaacct gggcgccctg cttccccggc tgcaccagct gtgctgccgc 900
atgccccgca ccctgcgccg gctcttcgtg gctgagctgt gcagctggat ggcactcatg 960
accttcacgc tgttttacac ggatttcgtg ggcgaggggc tgtaccaggg cgtgcccaga 1020
gctgagccgg gcaccgaggc ccggagacac tatgatgaag gcgttcggat gggcagcctg 1080
gggctgttcc tgcagtgcgc catctccctg gtcttctctc tggtcatgga ccggctggtg 1140
cagcgattcg gcactcgagc agtctatttg gccagtgtgg cagctttccc tgtggctgcc 1200
ggtgccacat gcctgtccca cagtgtggcc gtggtgacag cttcagccgc cctcaccggg 1260
ttcaccttct cagccctgca gatcctgccc tacacactgg cctccctcta ccaccgggag 1320
aagcaggtgt tcctgcccaa ataccgaggg gacactggag gtgctagcag tgaggacagc 1380
ctgatgacca gcttcctgcc aggccctaag cctggagctc ccttccctaa tggacacgtg 1440
ggtgctggag gcagtggcct gctcccacct ccacccgcgc tctgcggggc ctctgcctgt 1500
gatgtctccg tacgtgtggt ggtgggtgag cccaccgagg ccagggtggt tccgggccgg 1560
ggcatctgcc tggacctcgc catcctggat agtgccttcc tgctgtccca ggtggcccca 1620
tccctgttta tgggctccat tgtccagctc agccagtctg tcactgccta tatggtgtct 1680
gccgcaggcc tgggtctggt cgccatttac tttgctacac aggtagtatt tgacaagagc 1740
gacttggcca aatactcagc gggtggacac catcaccatc accattaa 1788
<210> 37
<211> 1955
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA encoding codon-optimised Human P501S (amino
acids 51-553) fused to St.pneum. C-LytA P2 helper
epitope C-Lyta
<400> 37
gcggccgcgc caccatggcc gccgcctacg tgcatagcga cgggagctac cccaaggaca 60
agttcgagaa gatcaacggg acatggtact acttcgactc ctccggctac atgctcgccg 120
accgctggcg gaagcacacc gacggcaact ggtactggtt cgataactcg ggagagatgg 180
ccaccggctg gaagaagatc gcggacaagt ggtactattt caacgaggag ggcgccatga 240
agaccggctg ggtgaagtat aaggacacct ggtactacct cgacgccaag gagggcgcca 300
tgcagtatat caaggccaac agcaagttca tcggcatcac cgagggagtg atggtcagca 360
acgcctttat ccagagcgcc gacggcaccg gatggtacta cttgaagccg gacggcaccc 420
tcgcggatcg gcccgagaag ttcatgtaca tggtgctggg catcggcccc gtcctgggcc 480
tcgtgtgtgt gcccctcctc gggagtgcgt ccgatcattg gcggggccgc tacggccgcc 540
gcagaccgtt catctgggcc ctgagcctgg gcatcctgct ctctctcttc ctgatccccc 600
gggccggctg gctggccggc ctgctgtgtc ccgacccccg ccctctggag ctggccctcc 660
tgatcctggg cgtgggcctg ctggacttct gcggccaggt gtgtttcact cccctggagg 720
ctctgctctc cgacctcttc cgcgaccccg accactgtag gcaggcttac agcgtgtacg 780
ccttcatgat cagtctgggg ggatgcctgg gctatctgct gcccgctatc gactgggaca 840
ccagcgccct ggccccctac ctggggactc aggaggagtg cctgttcggc ctgctcacct 900
tgatcttcct gacgtgcgtc gccgccaccc tgctggtggc cgaggaggcg gccctggggc 960
ccaccgagcc cgccgagggc ctgagcgctc ccagcctgag cccccattgc tgcccgtgca 1020
gggctaggct cgccttcagg aatctgggcg ctttgctgcc ccgcctgcat cagctgtgct 1080
gtcgcatgcc tcgcaccctg cgccgcctgt tcgtcgctga gctctgttcc tggatggccc 1140
tgatgacgtt caccctcttc tacaccgact tcgtggggga gggcctgtac cagggcgtgc 1200
ccagggccga gcccggcacc gaggctaggc gccattacga cgagggcgtc aggatgggct 1260
ctctgggcct cttcctgcag tgcgccatca gtctggtgtt ctctctggtg atggaccggc 1320
tggtgcagcg cttcggcacc cgggccgtgt acctcgcctc tgtggcggct ttccccgtcg 1380
ccgccggcgc gacctgcctg tctcattctg tcgccgtggt gaccgccagc gccgccctga 1440
ccggcttcac cttcagtgcg ctccagattc tgccctacac cctggcgtct ctgtaccatc 1500
gcgagaagca ggtgttcctg cccaagtacc gcggggacac agggggagct tcctctgagg 1560
acagcctgat gaccagcttc ttgcccggcc ccaagccggg ggcccctttc cccaacggcc 1620
atgtcggggc gggcggcagc ggcctgctcc ctcccccccc cgccctgtgc ggcgctagtg 1680
cctgcgacgt gagcgtgcgg gtggtggtgg gggagcccac cgaggctagg gtcgtgcctg 1740
gccgggggat ctgcctggac ctggccatcc tcgactccgc cttcctgctc tcccaggtgg 1800
cgcccagcct gttcatgggc agtatcgtgc agctgagcca gagcgtgacc gcctacatgg 1860
tgagcgccgc cggcctgggg ttggtggcca tctactttgc cacccaggtc gtgttcgaca 1920
agagcgatct cgccaagtat agcgcctgag gatcc 1955
<210> 38
<211> 2045
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA encoding codon-optimised Human P501S (amino acids 1-553)
fused to St.pneum. C-LytA P2 helper epitope C-Lyta
<400> 38
gcggccgcgc caccatggcc gccgcctacg tgcatagcga cgggagctac cccaaggaca 60
agttcgagaa gatcaacggg acatggtact acttcgactc ctccggctac atgctcgccg 120
accgctggcg gaagcacacc gacggcaact ggtactggtt cgataactcg ggagagatgg 180
ccaccggctg gaagaagatc gcggacaagt ggtactattt caacgaggag ggcgccatga 240
agaccggctg ggtgaagtat aaggacacct ggtactacct cgacgccaag gagggcgcca 300
tgcagtatat caaggccaac agcaagttca tcggcatcac cgagggagtg atggtcagca 360
acgcctttat ccagagcgcc gacggcaccg gatggtacta cttgaagccg gacggcaccc 420
tcgcggatcg gcccgagatg gtgcagcggc tgtgggtgtc ccggctgctg cgccatagaa 480
aggcccagtt gctgctggtg aacctgctga ctttcggact ggaggtgtgc ctggctgccg 540
tggtgctggg catcggcccc gtcctgggcc tcgtgtgtgt gcccctcctc gggagtgcgt 600
ccgatcattg gcggggccgc tacggccgcc gcagaccgtt catctgggcc ctgagcctgg 660
gcatcctgct ctctctcttc ctgatccccc gggccggctg gctggccggc ctgctgtgtc 720
ccgacccccg ccctctggag ctggccctcc tgatcctggg cgtgggcctg ctggacttct 780
gcggccaggt gtgtttcact cccctggagg ctctgctctc cgacctcttc cgcgaccccg 840
accactgtag gcaggcttac agcgtgtacg ccttcatgat cagtctgggg ggatgcctgg 900
gctatctgct gcccgctatc gactgggaca ccagcgccct ggccccctac ctggggactc 960
aggaggagtg cctgttcggc ctgctcacct tgatcttcct gacgtgcgtc gccgccaccc 1020
tgctggtggc cgaggaggcg gccctggggc ccaccgagcc cgccgagggc ctgagcgctc 1080
ccagcctgag cccccattgc tgcccgtgca gggctaggct cgccttcagg aatctgggcg 1140
ctttgctgcc ccgcctgcat cagctgtgct gtcgcatgcc tcgcaccctg cgccgcctgt 1200
tcgtcgctga gctctgttcc tggatggccc tgatgacgtt caccctcttc tacaccgact 1260
tcgtggggga gggcctgtac cagggcgtgc ccagggccga gcccggcacc gaggctaggc 1320
gccattacga cgagggcgtc aggatgggct ctctgggcct cttcctgcag tgcgccatca 1380
gtctggtgtt ctctctggtg atggaccggc tggtgcagcg cttcggcacc cgggccgtgt 1440
acctcgcctc tgtggcggct ttccccgtcg ccgccggcgc gacctgcctg tctcattctg 1500
tcgccgtggt gaccgccagc gccgccctga ccggcttcac cttcagtgcg ctccagattc 1560
tgccctacac cctggcgtct ctgtaccatc gcgagaagca ggtgttcctg cccaagtacc 1620
gcggggacac agggggagct tcctctgagg acagcctgat gaccagcttc ttgcccggcc 1680
ccaagccggg ggcccctttc cccaacggcc atgtcggggc gggcggcagc ggcctgctcc 1740
ctcccccccc cgccctgtgc ggcgctagtg cctgcgacgt gagcgtgcgg gtggtggtgg 1800
gggagcccac cgaggctagg gtcgtgcctg gccgggggat ctgcctggac ctggccatcc 1860
tcgactccgc cttcctgctc tcccaggtgg cgcccagcct gttcatgggc agtatcgtgc 1920
agctgagcca gagcgtgacc gcctacatgg tgagcgccgc cggcctgggg ttggtggcca 1980
tctactttgc cacccaggtc gtgttcgaca agagcgatct cgccaagtat agcgcctgag 2040
gatcc 2045
<210> 39
<211> 2105
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA encoding St.pneum. C-LytA P2 helper epitope
C-Lyta fused to Human P501S (amino acids 51-553)
fused to Human P501S (amino acids 1-50) -
Codon-optimised
<400> 39
gcggccgcgc caccatggcc gccgcctacg tgcatagcga cgggagctac cccaaggaca 60
agttcgagaa gatcaacggg acatggtact acttcgactc ctccggctac atgctcgccg 120
accgctggcg gaagcacacc gacggcaact ggtactggtt cgataactcg ggagagatgg 180
ccaccggctg gaagaagatc gcggacaagt ggtactattt caacgaggag ggcgccatga 240
agaccggctg ggtgaagtat aaggacacct ggtactacct cgacgccaag gagggcgcca 300
tgcagtatat caaggccaac agcaagttca tcggcatcac cgagggagtg atggtcagca 360
acgcctttat ccagagcgcc gacggcaccg gatggtacta cttgaagccg gacggcaccc 420
tcgcggatcg gcccgagaag ttcatgtaca tggtgctggg catcggcccc gtcctgggcc 480
tcgtgtgtgt gcccctcctc gggagtgcgt ccgatcattg gcggggccgc tacggccgcc 540
gcagaccgtt catctgggcc ctgagcctgg gcatcctgct ctctctcttc ctgatccccc 600
gggccggctg gctggccggc ctgctgtgtc ccgacccccg ccctctggag ctggccctcc 660
tgatcctggg cgtgggcctg ctggacttct gcggccaggt gtgtttcact cccctggagg 720
ctctgctctc cgacctcttc cgcgaccccg accactgtag gcaggcttac agcgtgtacg 780
ccttcatgat cagtctgggg ggatgcctgg gctatctgct gcccgctatc gactgggaca 840
ccagcgccct ggccccctac ctggggactc aggaggagtg cctgttcggc ctgctcacct 900
tgatcttcct gacgtgcgtc gccgccaccc tgctggtggc cgaggaggcg gccctggggc 960
ccaccgagcc cgccgagggc ctgagcgctc ccagcctgag cccccattgc tgcccgtgca 1020
gggctaggct cgccttcagg aatctgggcg ctttgctgcc ccgcctgcat cagctgtgct 1080
gtcgcatgcc tcgcaccctg cgccgcctgt tcgtcgctga gctctgttcc tggatggccc 1140
tgatgacgtt caccctcttc tacaccgact tcgtggggga gggcctgtac cagggcgtgc 1200
ccagggccga gcccggcacc gaggctaggc gccattacga cgagggcgtc aggatgggct 1260
ctctgggcct cttcctgcag tgcgccatca gtctggtgtt ctctctggtg atggaccggc 1320
tggtgcagcg cttcggcacc cgggccgtgt acctcgcctc tgtggcggct ttccccgtcg 1380
ccgccggcgc gacctgcctg tctcattctg tcgccgtggt gaccgccagc gccgccctga 1440
ccggcttcac cttcagtgcg ctccagattc tgccctacac cctggcgtct ctgtaccatc 1500
gcgagaagca ggtgttcctg cccaagtacc gcggggacac agggggagct tcctctgagg 1560
acagcctgat gaccagcttc ttgcccggcc ccaagccggg ggcccctttc cccaacggcc 1620
atgtcggggc gggcggcagc ggcctgctcc ctcccccccc cgccctgtgc ggcgctagtg 1680
cctgcgacgt gagcgtgcgg gtggtggtgg gggagcccac cgaggctagg gtcgtgcctg 1740
gccgggggat ctgcctggac ctggccatcc tcgactccgc cttcctgctc tcccaggtgg 1800
cgcccagcct gttcatgggc agtatcgtgc agctgagcca gagcgtgacc gcctacatgg 1860
tgagcgccgc cggcctgggg ttggtggcca tctactttgc cacccaggtc gtgttcgaca 1920
agagcgatct cgccaagtat agcgccatgg tgcagcggct gtgggtgtcc cggctgctgc 1980
gccatagaaa ggcccagttg ctgctggtga acctgctgac tttcggactg gaggtgtgcc 2040
tggctgccgg gatcacgtac gtgccccccc tgctgctgga ggtgggcgtg gaggagtgag 2100
gatcc 2105
<210> 40
<211> 2105
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA encoding Human P501S (amino acids 1-50) fused
to St.pneum. C-LytA P2 helper epitope C-Lyta fused
to Human P501S (amino acids 51-553) -
Codon-optimised
<400> 40
gcggccgcgc caccatggtg cagcggctgt gggtgtcccg gctgctgcgc catagaaagg 60
cccagttgct gctggtgaac ctgctgactt tcggactgga ggtgtgcctg gctgccggga 120
tcacgtacgt gccccccctg ctgctggagg tgggcgtgga ggagatggcc gccgcctacg 180
tgcatagcga cgggagctac cccaaggaca agttcgagaa gatcaacggg acatggtact 240
acttcgactc ctccggctac atgctcgccg accgctggcg gaagcacacc gacggcaact 300
ggtactggtt cgataactcg ggagagatgg ccaccggctg gaagaagatc gcggacaagt 360
ggtactattt caacgaggag ggcgccatga agaccggctg ggtgaagtat aaggacacct 420
ggtactacct cgacgccaag gagggcgcca tgcagtatat caaggccaac agcaagttca 480
tcggcatcac cgagggagtg atggtcagca acgcctttat ccagagcgcc gacggcaccg 540
gatggtacta cttgaagccg gacggcaccc tcgcggatcg gcccgagaag ttcatgtaca 600
tggtgctggg catcggcccc gtcctgggcc tcgtgtgtgt gcccctcctc gggagtgcgt 660
ccgatcattg gcggggccgc tacggccgcc gcagaccgtt catctgggcc ctgagcctgg 720
gcatcctgct ctctctcttc ctgatccccc gggccggctg gctggccggc ctgctgtgtc 780
ccgacccccg ccctctggag ctggccctcc tgatcctggg cgtgggcctg ctggacttct 840
gcggccaggt gtgtttcact cccctggagg ctctgctctc cgacctcttc cgcgaccccg 900
accactgtag gcaggcttac agcgtgtacg ccttcatgat cagtctgggg ggatgcctgg 960
gctatctgct gcccgctatc gactgggaca ccagcgccct ggccccctac ctggggactc 1020
aggaggagtg cctgttcggc ctgctcacct tgatcttcct gacgtgcgtc gccgccaccc 1080
tgctggtggc cgaggaggcg gccctggggc ccaccgagcc cgccgagggc ctgagcgctc 1140
ccagcctgag cccccattgc tgcccgtgca gggctaggct cgccttcagg aatctgggcg 1200
ctttgctgcc ccgcctgcat cagctgtgct gtcgcatgcc tcgcaccctg cgccgcctgt 1260
tcgtcgctga gctctgttcc tggatggccc tgatgacgtt caccctcttc tacaccgact 1320
tcgtggggga gggcctgtac cagggcgtgc ccagggccga gcccggcacc gaggctaggc 1380
gccattacga cgagggcgtc aggatgggct ctctgggcct cttcctgcag tgcgccatca 1440
gtctggtgtt ctctctggtg atggaccggc tggtgcagcg cttcggcacc cgggccgtgt 1500
acctcgcctc tgtggcggct ttccccgtcg ccgccggcgc gacctgcctg tctcattctg 1560
tcgccgtggt gaccgccagc gccgccctga ccggcttcac cttcagtgcg ctccagattc 1620
tgccctacac cctggcgtct ctgtaccatc gcgagaagca ggtgttcctg cccaagtacc 1680
gcggggacac agggggagct tcctctgagg acagcctgat gaccagcttc ttgcccggcc 1740
ccaagccggg ggcccctttc cccaacggcc atgtcggggc gggcggcagc ggcctgctcc 1800
ctcccccccc cgccctgtgc ggcgctagtg cctgcgacgt gagcgtgcgg gtggtggtgg 1860
gggagcccac cgaggctagg gtcgtgcctg gccgggggat ctgcctggac ctggccatcc 1920
tcgactccgc cttcctgctc tcccaggtgg cgcccagcct gttcatgggc agtatcgtgc 1980
agctgagcca gagcgtgacc gcctacatgg tgagcgccgc cggcctgggg ttggtggcca 2040
tctactttgc cacccaggtc gtgttcgaca agagcgatct cgccaagtat agcgcctgag 2100
gatcc 2105
<210> 41
<211> 652
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> St.pneum. C-LytA P2 helper epitope C-Lyta fused to
Human P501S
<400> 41
Met Ala Ala Ala Tyr Val His Ser Asp Gly Ser Tyr Pro Lys Asp Lys
1 5 10 15
Phe Glu Lys Ile Asn Gly Thr Trp Tyr Tyr Phe Asp Ser Ser Gly Tyr
20 25 30
Met Leu Ala Asp Arg Trp Arg Lys His Thr Asp Gly Asn Trp Tyr Trp
35 40 45
Phe Asp Asn Ser Gly Glu Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys Ile Ala Asp
50 55 60
Lys Trp Tyr Tyr Phe Asn Glu Glu Gly Ala Met Lys Thr Gly Trp Val
65 70 75 80
Lys Tyr Lys Asp Thr Trp Tyr Tyr Leu Asp Ala Lys Glu Gly Ala Met
85 90 95
Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Gly Val
100 105 110
Met Val Ser Asn Ala Phe Ile Gln Ser Ala Asp Gly Thr Gly Trp Tyr
115 120 125
Tyr Leu Lys Pro Asp Gly Thr Leu Ala Asp Arg Pro Glu Lys Phe Met
130 135 140
Tyr Met Val Leu Gly Ile Gly Pro Val Leu Gly Leu Val Cys Val Pro
145 150 155 160
Leu Leu Gly Ser Ala Ser Asp His Trp Arg Gly Arg Tyr Gly Arg Arg
165 170 175
Arg Pro Phe Ile Trp Ala Leu Ser Leu Gly Ile Leu Leu Ser Leu Phe
180 185 190
Leu Ile Pro Arg Ala Gly Trp Leu Ala Gly Leu Leu Cys Pro Asp Pro
195 200 205
Arg Pro Leu Glu Leu Ala Leu Leu Ile Leu Gly Val Gly Leu Leu Asp
210 215 220
Phe Cys Gly Gln Val Cys Phe Thr Pro Leu Glu Ala Leu Leu Ser Asp
225 230 235 240
Leu Phe Arg Asp Pro Asp His Cys Arg Gln Ala Tyr Ser Val Tyr Ala
245 250 255
Phe Met Ile Ser Leu Gly Gly Cys Leu Gly Tyr Leu Leu Pro Ala Ile
260 265 270
Asp Trp Asp Thr Ser Ala Leu Ala Pro Tyr Leu Gly Thr Gln Glu Glu
275 280 285
Cys Leu Phe Gly Leu Leu Thr Leu Ile Phe Leu Thr Cys Val Ala Ala
290 295 300
Thr Leu Leu Val Ala Glu Glu Ala Ala Leu Gly Pro Thr Glu Pro Ala
305 310 315 320
Glu Gly Leu Ser Ala Pro Ser Leu Ser Pro His Cys Cys Pro Cys Arg
325 330 335
Ala Arg Leu Ala Phe Arg Asn Leu Gly Ala Leu Leu Pro Arg Leu His
340 345 350
Gln Leu Cys Cys Arg Met Pro Arg Thr Leu Arg Arg Leu Phe Val Ala
355 360 365
Glu Leu Cys Ser Trp Met Ala Leu Met Thr Phe Thr Leu Phe Tyr Thr
370 375 380
Asp Phe Val Gly Glu Gly Leu Tyr Gln Gly Val Pro Arg Ala Glu Pro
385 390 395 400
Gly Thr Glu Ala Arg Arg His Tyr Asp Glu Gly Val Arg Met Gly Ser
405 410 415
Leu Gly Leu Phe Leu Gln Cys Ala Ile Ser Leu Val Phe Ser Leu Val
420 425 430
Met Asp Arg Leu Val Gln Arg Phe Gly Thr Arg Ala Val Tyr Leu Ala
435 440 445
Ser Val Ala Ala Phe Pro Val Ala Ala Gly Ala Thr Cys Leu Ser His
450 455 460
Ser Val Ala Val Val Thr Ala Ser Ala Ala Leu Thr Gly Phe Thr Phe
465 470 475 480
Ser Ala Leu Gln Ile Leu Pro Tyr Thr Leu Ala Ser Leu Tyr His Arg
485 490 495
Glu Lys Gln Val Phe Leu Pro Lys Tyr Arg Gly Asp Thr Gly Gly Ala
500 505 510
Ser Ser Glu Asp Ser Leu Met Thr Ser Phe Leu Pro Gly Pro Lys Pro
515 520 525
Gly Ala Pro Phe Pro Asn Gly His Val Gly Ala Gly Gly Ser Gly Leu
530 535 540
Leu Pro Pro Pro Pro Ala Leu Cys Gly Ala Ser Ala Cys Asp Val Ser
545 550 555 560
Val Arg Val Val Val Gly Glu Pro Thr Glu Ala Arg Val Val Pro Gly
565 570 575
Arg Gly Ile Cys Leu Asp Leu Ala Ile Leu Asp Ser Ala Phe Leu Leu
580 585 590
Ser Gln Val Ala Pro Ser Leu Phe Met Gly Ser Ile Val Gln Leu Ser
595 600 605
Gln Ser Val Thr Ala Tyr Met Val Ser Ala Ala Gly Leu Gly Leu Val
610 615 620
Ala Ile Tyr Phe Ala Thr Gln Val Val Phe Asp Lys Ser Asp Leu Ala
625 630 635 640
Lys Tyr Ser Ala Gly Gly His His His His His His
645 650
<210> 42
<211> 1959
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA encoding St.pneum. C-LytA P2 helper epitope
C-Lyta fused to Human P501S (plus his tag)
<400> 42
atggcggccg cttacgtaca ttccgacggc tcttatccaa aagacaagtt tgagaaaatc 60
aatggcactt ggtactactt tgacagttca ggctatatgc ttgcagaccg ctggaggaag 120
cacacagacg gcaactggta ctggttcgac aactcaggcg aaatggctac aggctggaag 180
aaaatcgctg ataagtggta ctatttcaac gaagaaggtg ccatgaagac aggctgggtc 240
aagtacaagg acacttggta ctacttagac gctaaagaag gcgccatgca atacatcaag 300
gctaactcta agttcattgg tatcactgaa ggcgtcatgg tatcaaatgc ctttatccag 360
tcagcggacg gaacaggctg gtactacctc aaaccagacg gaacactggc agacaggcca 420
gaaaagttca tgtacatggt gctgggcatt ggtccagtgc tgggcctggt ctgtgtcccg 480
ctcctaggct cagccagtga ccactggcgt ggacgctatg gccgccgccg gcccttcatc 540
tgggcactgt ccttgggcat cctgctgagc ctctttctca tcccaagggc cggctggcta 600
gcagggctgc tgtgcccgga tcccaggccc ctggagctgg cactgctcat cctgggcgtg 660
gggctgctgg acttctgtgg ccaggtgtgc ttcactccac tggaggccct gctctctgac 720
ctcttccggg acccggacca ctgtcgccag gcctactctg tctatgcctt catgatcagt 780
cttgggggct gcctgggcta cctcctgcct gccattgact gggacaccag tgccctggcc 840
ccctacctgg gcacccagga ggagtgcctc tttggcctgc tcaccctcat cttcctcacc 900
tgcgtagcag ccacactgct ggtggctgag gaggcagcgc tgggccccac cgagccagca 960
gaagggctgt cggccccctc cttgtcgccc cactgctgtc catgccgggc ccgcttggct 1020
ttccggaacc tgggcgccct gcttccccgg ctgcaccagc tgtgctgccg catgccccgc 1080
accctgcgcc ggctcttcgt ggctgagctg tgcagctgga tggcactcat gaccttcacg 1140
ctgttttaca cggatttcgt gggcgagggg ctgtaccagg gcgtgcccag agctgagccg 1200
ggcaccgagg cccggagaca ctatgatgaa ggcgttcgga tgggcagcct ggggctgttc 1260
ctgcagtgcg ccatctccct ggtcttctct ctggtcatgg accggctggt gcagcgattc 1320
ggcactcgag cagtctattt ggccagtgtg gcagctttcc ctgtggctgc cggtgccaca 1380
tgcctgtccc acagtgtggc cgtggtgaca gcttcagccg ccctcaccgg gttcaccttc 1440
tcagccctgc agatcctgcc ctacacactg gcctccctct accaccggga gaagcaggtg 1500
ttcctgccca aataccgagg ggacactgga ggtgctagca gtgaggacag cctgatgacc 1560
agcttcctgc caggccctaa gcctggagct cccttcccta atggacacgt gggtgctgga 1620
ggcagtggcc tgctcccacc tccacccgcg ctctgcgggg cctctgcctg tgatgtctcc 1680
gtacgtgtgg tggtgggtga gcccaccgag gccagggtgg ttccgggccg gggcatctgc 1740
ctggacctcg ccatcctgga tagtgccttc ctgctgtccc aggtggcccc atccctgttt 1800
atgggctcca ttgtccagct cagccagtct gtcactgcct atatggtgtc tgccgcaggc 1860
ctgggtctgg tcgccattta ctttgctaca caggtagtat ttgacaagag cgacttggcc 1920
aaatactcag cgggtggaca ccatcaccat caccattaa 1959
<210> 43
<211> 553
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 43
Met Val Gln Arg Leu Trp Val Ser Arg Leu Leu Arg His Arg Lys Ala
1 5 10 15
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20 25 30
Ala Ala Gly Ile Thr Tyr Val Pro Pro Leu Leu Leu Glu Val Gly Val
35 40 45
Glu Glu Lys Phe Met Thr Met Val Leu Gly Ile Gly Pro Val Leu Gly
50 55 60
Leu Val Cys Val Pro Leu Leu Gly Ser Ala Ser Asp His Trp Arg Gly
65 70 75 80
Arg Tyr Gly Arg Arg Arg Pro Phe Ile Trp Ala Leu Ser Leu Gly Ile
85 90 95
Leu Leu Ser Leu Phe Leu Ile Pro Arg Ala Gly Trp Leu Ala Gly Leu
100 105 110
Leu Cys Pro Asp Pro Arg Pro Leu Glu Leu Ala Leu Leu Ile Leu Gly
115 120 125
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130 135 140
Ala Leu Leu Ser Asp Leu Phe Arg Asp Pro Asp His Cys Arg Gln Ala
145 150 155 160
Tyr Ser Val Tyr Ala Phe Met Ile Ser Leu Gly Gly Cys Leu Gly Tyr
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
Arg Leu Phe Val Ala Glu Leu Cys Ser Trp Met Ala Leu Met Thr Phe
275 280 285
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305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
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545 550
<210> 44
<211> 644
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> St.pneum. C-LytA P2 helper epitope C-Lyta fused to
Human P501S
<400> 44
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1 5 10 15
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20 25 30
Met Leu Ala Asp Arg Trp Arg Lys His Thr Asp Gly Asn Trp Tyr Trp
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Lys Tyr Lys Asp Thr Trp Tyr Tyr Leu Asp Ala Lys Glu Gly Ala Met
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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195 200 205
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245 250 255
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435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
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595 600 605
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610 615 620
Ala Ile Tyr Phe Ala Thr Gln Val Val Phe Asp Lys Ser Asp Leu Ala
625 630 635 640
Lys Tyr Ser Ala
<210> 45
<211> 644
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Codon-optimised hybrid protein between St.pneum. C-LytA P2
helper epitope C-Lyta fused to Human P501S
amino acids 51-553)
<400> 45
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1 5 10 15
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210 215 220
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225 230 235 240
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
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405 410 415
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450 455 460
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545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
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Lys Tyr Ser Ala
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<211> 694
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> St.pneum. C-LytA P2 helper epitope C-Lyta fused to
Human P501S (amino acids 1-553)- codon optimised
<400> 46
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165 170 175
Ile Thr Tyr Val Pro Pro Leu Leu Leu Glu Val Gly Val Glu Glu Lys
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225 230 235 240
Leu Phe Leu Ile Pro Arg Ala Gly Trp Leu Ala Gly Leu Leu Cys Pro
245 250 255
Asp Pro Arg Pro Leu Glu Leu Ala Leu Leu Ile Leu Gly Val Gly Leu
260 265 270
Leu Asp Phe Cys Gly Gln Val Cys Phe Thr Pro Leu Glu Ala Leu Leu
275 280 285
Ser Asp Leu Phe Arg Asp Pro Asp His Cys Arg Gln Ala Tyr Ser Val
290 295 300
Tyr Ala Phe Met Ile Ser Leu Gly Gly Cys Leu Gly Tyr Leu Leu Pro
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Ala Ile Asp Trp Asp Thr Ser Ala Leu Ala Pro Tyr Leu Gly Thr Gln
325 330 335
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340 345 350
Ala Ala Thr Leu Leu Val Ala Glu Glu Ala Ala Leu Gly Pro Thr Glu
355 360 365
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370 375 380
Cys Arg Ala Arg Leu Ala Phe Arg Asn Leu Gly Ala Leu Leu Pro Arg
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Val Ala Glu Leu Cys Ser Trp Met Ala Leu Met Thr Phe Thr Leu Phe
420 425 430
Tyr Thr Asp Phe Val Gly Glu Gly Leu Tyr Gln Gly Val Pro Arg Ala
435 440 445
Glu Pro Gly Thr Glu Ala Arg Arg His Tyr Asp Glu Gly Val Arg Met
450 455 460
Gly Ser Leu Gly Leu Phe Leu Gln Cys Ala Ile Ser Leu Val Phe Ser
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Leu Val Met Asp Arg Leu Val Gln Arg Phe Gly Thr Arg Ala Val Tyr
485 490 495
Leu Ala Ser Val Ala Ala Phe Pro Val Ala Ala Gly Ala Thr Cys Leu
500 505 510
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515 520 525
Thr Phe Ser Ala Leu Gln Ile Leu Pro Tyr Thr Leu Ala Ser Leu Tyr
530 535 540
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545 550 555 560
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580 585 590
Gly Leu Leu Pro Pro Pro Pro Ala Leu Cys Gly Ala Ser Ala Cys Asp
595 600 605
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610 615 620
Pro Gly Arg Gly Ile Cys Leu Asp Leu Ala Ile Leu Asp Ser Ala Phe
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Leu Leu Ser Gln Val Ala Pro Ser Leu Phe Met Gly Ser Ile Val Gln
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Leu Ala Lys Tyr Ser Ala
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<210> 47
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> St.pneum. C-LytA P2 helper epitope C-Lyta fused to
Human P501S (amino acids 51-553) fused to Human
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100 105 110
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115 120 125
Tyr Leu Lys Pro Asp Gly Thr Leu Ala Asp Arg Pro Glu Lys Phe Met
130 135 140
Tyr Met Val Leu Gly Ile Gly Pro Val Leu Gly Leu Val Cys Val Pro
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Leu Leu Gly Ser Ala Ser Asp His Trp Arg Gly Arg Tyr Gly Arg Arg
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Leu Ile Pro Arg Ala Gly Trp Leu Ala Gly Leu Leu Cys Pro Asp Pro
195 200 205
Arg Pro Leu Glu Leu Ala Leu Leu Ile Leu Gly Val Gly Leu Leu Asp
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Leu Phe Arg Asp Pro Asp His Cys Arg Gln Ala Tyr Ser Val Tyr Ala
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Asp Trp Asp Thr Ser Ala Leu Ala Pro Tyr Leu Gly Thr Gln Glu Glu
275 280 285
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Glu Gly Leu Ser Ala Pro Ser Leu Ser Pro His Cys Cys Pro Cys Arg
325 330 335
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660 665 670
Glu Val Cys Leu Ala Ala Gly Ile Thr Tyr Val Pro Pro Leu Leu Leu
675 680 685
Glu Val Gly Val Glu Glu
690
<210> 48
<211> 694
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human P501S (amino acids 1-50) fused to St.pneum.
C-LytA P2 helper epitope C-Lyta fused to Human
P501S (amino acids 51-553) - codon optimised
<400> 48
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340 345 350
Ala Ala Thr Leu Leu Val Ala Glu Glu Ala Ala Leu Gly Pro Thr Glu
355 360 365
Pro Ala Glu Gly Leu Ser Ala Pro Ser Leu Ser Pro His Cys Cys Pro
370 375 380
Cys Arg Ala Arg Leu Ala Phe Arg Asn Leu Gly Ala Leu Leu Pro Arg
385 390 395 400
Leu His Gln Leu Cys Cys Arg Met Pro Arg Thr Leu Arg Arg Leu Phe
405 410 415
Val Ala Glu Leu Cys Ser Trp Met Ala Leu Met Thr Phe Thr Leu Phe
420 425 430
Tyr Thr Asp Phe Val Gly Glu Gly Leu Tyr Gln Gly Val Pro Arg Ala
435 440 445
Glu Pro Gly Thr Glu Ala Arg Arg His Tyr Asp Glu Gly Val Arg Met
450 455 460
Gly Ser Leu Gly Leu Phe Leu Gln Cys Ala Ile Ser Leu Val Phe Ser
465 470 475 480
Leu Val Met Asp Arg Leu Val Gln Arg Phe Gly Thr Arg Ala Val Tyr
485 490 495
Leu Ala Ser Val Ala Ala Phe Pro Val Ala Ala Gly Ala Thr Cys Leu
500 505 510
Ser His Ser Val Ala Val Val Thr Ala Ser Ala Ala Leu Thr Gly Phe
515 520 525
Thr Phe Ser Ala Leu Gln Ile Leu Pro Tyr Thr Leu Ala Ser Leu Tyr
530 535 540
His Arg Glu Lys Gln Val Phe Leu Pro Lys Tyr Arg Gly Asp Thr Gly
545 550 555 560
Gly Ala Ser Ser Glu Asp Ser Leu Met Thr Ser Phe Leu Pro Gly Pro
565 570 575
Lys Pro Gly Ala Pro Phe Pro Asn Gly His Val Gly Ala Gly Gly Ser
580 585 590
Gly Leu Leu Pro Pro Pro Pro Ala Leu Cys Gly Ala Ser Ala Cys Asp
595 600 605
Val Ser Val Arg Val Val Val Gly Glu Pro Thr Glu Ala Arg Val Val
610 615 620
Pro Gly Arg Gly Ile Cys Leu Asp Leu Ala Ile Leu Asp Ser Ala Phe
625 630 635 640
Leu Leu Ser Gln Val Ala Pro Ser Leu Phe Met Gly Ser Ile Val Gln
645 650 655
Leu Ser Gln Ser Val Thr Ala Tyr Met Val Ser Ala Ala Gly Leu Gly
660 665 670
Leu Val Ala Ile Tyr Phe Ala Thr Gln Val Val Phe Asp Lys Ser Asp
675 680 685
Leu Ala Lys Tyr Ser Ala
690
<210> 49
<211> 1971
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA encoding Human MUC-1 fused to St.pneum. C-LytA
P2 helper epitope C-Lyta
<400> 49
atgacaccgg gcacccagtc tcctttcttc ctgctgctgc tcctcacagt gcttacagtt 60
gttacaggtt ctggtcatgc aagctctacc ccaggtggag aaaaggagac ttcggctacc 120
cagagaagtt cagtgcccag ctctactgag aagaatgctg tgagtatgac cagcagcgta 180
ctctccagcc acagccccgg ttcaggctcc tccaccactc agggacagga tgtcactctg 240
gccccggcca cggaaccagc ttcaggttca gctgccacct ggggacagga tgtcacctcg 300
gtcccagtca ccaggccagc cctgggctcc accaccccgc cagcccacga tgtcacctca 360
gccccggaca acaagccagc cccgggctcc accgcccccc cagcccacgg tgtcacctcg 420
gccccggaca ccaggccgcc cccgggctcc accgcccccc cagcccacgg tgtcacctcg 480
gccccggaca ccaggccgcc cccgggctcc accgcgcccg cagcccacgg tgtcacctcg 540
gccccggaca ccaggccggc cccgggctcc accgcccccc cagcccatgg tgtcacctcg 600
gccccggaca acaggcccgc cttggcgtcc accgcccctc cagtccacaa tgtcacctcg 660
gcctcaggct ctgcatcagg ctcagcttct actctggtgc acaacggcac ctctgccagg 720
gctaccacaa ccccagccag caagagcact ccattctcaa ttcccagcca ccactctgat 780
actcctacca cccttgccag ccatagcacc aagactgatg ccagtagcac tcaccatagc 840
acggtacctc ctctcacctc ctccaatcac agcacttctc cccagttgtc tactggggtc 900
tctttctttt tcctgtcttt tcacatttca aacctccagt ttaattcctc tctggaagat 960
cccagcaccg actactacca agagctgcag agagacattt ctgaaatgtt tttgcagatt 1020
tataaacaag ggggttttct gggcctctcc aatattaagt tcaggccagg atctgtggtg 1080
gtacaattga ctctggcctt ccgagaaggt accatcaatg tccacgacgt ggagacacag 1140
ttcaatcagt ataaaacgga agcagcctct cgatataacc tgacgatctc agacgtcagc 1200
gtgagtgatg tgccatttcc tttctctgcc cagtctgggg ctggggtgcc aggctggggc 1260
atcgcgctgc tggtgctggt ctgtgttctg gttgcgctgg ccattgtcta tctcattgcc 1320
ttggctgtct gtcagtgccg ccgaaagaac tacgggcagc tggacatctt tccagcccgg 1380
gatacctacc atcctatgag cgagtacccc acctaccaca cccatgggcg ctatgtgccc 1440
cctagcagta ccgatcgtag cccctatgag aaggtttctg caggtaatgg tggcagcagc 1500
ctctcttaca caaacccagc agtggcagcc acttctgcca acttgatggc ggccgcttac 1560
gtacattccg acggctctta tccaaaagac aagtttgaga aaatcaatgg cacttggtac 1620
tactttgaca gttcaggcta tatgcttgca gaccgctgga ggaagcacac agacggcaac 1680
tggtactggt tcgacaactc aggcgaaatg gctacaggct ggaagaaaat cgctgataag 1740
tggtactatt tcaacgaaga aggtgccatg aagacaggct gggtcaagta caaggacact 1800
tggtactact tagacgctaa agaaggcgcc atgcaataca tcaaggctaa ctctaagttc 1860
attggtatca ctgaaggcgt catggtatca aatgccttta tccagtcagc ggacggaaca 1920
ggctggtact acctcaaacc agacggaaca ctggcagaca ggccagaatg a 1971
<210> 50
<211> 656
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human MUC-1 fused to St.pneum. C-LytA P2 helper
epitope C-Lyta
<400> 50
Met Thr Pro Gly Thr Gln Ser Pro Phe Phe Leu Leu Leu Leu Leu Thr
1 5 10 15
Val Leu Thr Val Val Thr Gly Ser Gly His Ala Ser Ser Thr Pro Gly
20 25 30
Gly Glu Lys Glu Thr Ser Ala Thr Gln Arg Ser Ser Val Pro Ser Ser
35 40 45
Thr Glu Lys Asn Ala Val Ser Met Thr Ser Ser Val Leu Ser Ser His
50 55 60
Ser Pro Gly Ser Gly Ser Ser Thr Thr Gln Gly Gln Asp Val Thr Leu
65 70 75 80
Ala Pro Ala Thr Glu Pro Ala Ser Gly Ser Ala Ala Thr Trp Gly Gln
85 90 95
Asp Val Thr Ser Val Pro Val Thr Arg Pro Ala Leu Gly Ser Thr Thr
100 105 110
Pro Pro Ala His Asp Val Thr Ser Ala Pro Asp Asn Lys Pro Ala Pro
115 120 125
Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr
130 135 140
Arg Pro Pro Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser
145 150 155 160
Ala Pro Asp Thr Arg Pro Pro Pro Gly Ser Thr Ala Pro Ala Ala His
165 170 175
Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala
180 185 190
Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Asn Arg Pro Ala Leu
195 200 205
Ala Ser Thr Ala Pro Pro Val His Asn Val Thr Ser Ala Ser Gly Ser
210 215 220
Ala Ser Gly Ser Ala Ser Thr Leu Val His Asn Gly Thr Ser Ala Arg
225 230 235 240
Ala Thr Thr Thr Pro Ala Ser Lys Ser Thr Pro Phe Ser Ile Pro Ser
245 250 255
His His Ser Asp Thr Pro Thr Thr Leu Ala Ser His Ser Thr Lys Thr
260 265 270
Asp Ala Ser Ser Thr His His Ser Thr Val Pro Pro Leu Thr Ser Ser
275 280 285
Asn His Ser Thr Ser Pro Gln Leu Ser Thr Gly Val Ser Phe Phe Phe
290 295 300
Leu Ser Phe His Ile Ser Asn Leu Gln Phe Asn Ser Ser Leu Glu Asp
305 310 315 320
Pro Ser Thr Asp Tyr Tyr Gln Glu Leu Gln Arg Asp Ile Ser Glu Met
325 330 335
Phe Leu Gln Ile Tyr Lys Gln Gly Gly Phe Leu Gly Leu Ser Asn Ile
340 345 350
Lys Phe Arg Pro Gly Ser Val Val Val Gln Leu Thr Leu Ala Phe Arg
355 360 365
Glu Gly Thr Ile Asn Val His Asp Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln Tyr
370 375 380
Lys Thr Glu Ala Ala Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asp Val Ser
385 390 395 400
Val Ser Asp Val Pro Phe Pro Phe Ser Ala Gln Ser Gly Ala Gly Val
405 410 415
Pro Gly Trp Gly Ile Ala Leu Leu Val Leu Val Cys Val Leu Val Ala
420 425 430
Leu Ala Ile Val Tyr Leu Ile Ala Leu Ala Val Cys Gln Cys Arg Arg
435 440 445
Lys Asn Tyr Gly Gln Leu Asp Ile Phe Pro Ala Arg Asp Thr Tyr His
450 455 460
Pro Met Ser Glu Tyr Pro Thr Tyr His Thr His Gly Arg Tyr Val Pro
465 470 475 480
Pro Ser Ser Thr Asp Arg Ser Pro Tyr Glu Lys Val Ser Ala Gly Asn
485 490 495
Gly Gly Ser Ser Leu Ser Tyr Thr Asn Pro Ala Val Ala Ala Thr Ser
500 505 510
Ala Asn Leu Met Ala Ala Ala Tyr Val His Ser Asp Gly Ser Tyr Pro
515 520 525
Lys Asp Lys Phe Glu Lys Ile Asn Gly Thr Trp Tyr Tyr Phe Asp Ser
530 535 540
Ser Gly Tyr Met Leu Ala Asp Arg Trp Arg Lys His Thr Asp Gly Asn
545 550 555 560
Trp Tyr Trp Phe Asp Asn Ser Gly Glu Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys
565 570 575
Ile Ala Asp Lys Trp Tyr Tyr Phe Asn Glu Glu Gly Ala Met Lys Thr
580 585 590
Gly Trp Val Lys Tyr Lys Asp Thr Trp Tyr Tyr Leu Asp Ala Lys Glu
595 600 605
Gly Ala Met Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr
610 615 620
Glu Gly Val Met Val Ser Asn Ala Phe Ile Gln Ser Ala Asp Gly Thr
625 630 635 640
Gly Trp Tyr Tyr Leu Lys Pro Asp Gly Thr Leu Ala Asp Arg Pro Glu
645 650 655
<210> 51
<211> 2037
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA encoding St.pneum. C-LytA P2 helper epitope
C-Lyta fused to Human MUC-1
<400> 51
atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactcccag 60
gtccaaatgg cggccgctta cgtacattcc gacggctctt atccaaaaga caagtttgag 120
aaaatcaatg gcacttggta ctactttgac agttcaggct atatgcttgc agaccgctgg 180
aggaagcaca cagacggcaa ctggtactgg ttcgacaact caggcgaaat ggctacaggc 240
tggaagaaaa tcgctgataa gtggtactat ttcaacgaag aaggtgccat gaagacaggc 300
tgggtcaagt acaaggacac ttggtactac ttagacgcta aagaaggcgc catgcaatac 360
atcaaggcta actctaagtt cattggtatc actgaaggcg tcatggtatc aaatgccttt 420
atccagtcag cggacggaac aggctggtac tacctcaaac cagacggaac actggcagac 480
aggccagaaa tgacaccggg cacccagtct cctttcttcc tgctgctgct cctcacagtg 540
cttacagttg ttacaggttc tggtcatgca agctctaccc caggtggaga aaaggagact 600
tcggctaccc agagaagttc agtgcccagc tctactgaga agaatgctgt gagtatgacc 660
agcagcgtac tctccagcca cagccccggt tcaggctcct ccaccactca gggacaggat 720
gtcactctgg ccccggccac ggaaccagct tcaggttcag ctgccacctg gggacaggat 780
gtcacctcgg tcccagtcac caggccagcc ctgggctcca ccaccccgcc agcccacgat 840
gtcacctcag ccccggacaa caagccagcc ccgggctcca ccgccccccc agcccacggt 900
gtcacctcgg ccccggacac caggccgccc ccgggctcca ccgccccccc agcccacggt 960
gtcacctcgg ccccggacac caggccgccc ccgggctcca ccgcgcccgc agcccacggt 1020
gtcacctcgg ccccggacac caggccggcc ccgggctcca ccgccccccc agcccatggt 1080
gtcacctcgg ccccggacaa caggcccgcc ttggcgtcca ccgcccctcc agtccacaat 1140
gtcacctcgg cctcaggctc tgcatcaggc tcagcttcta ctctggtgca caacggcacc 1200
tctgccaggg ctaccacaac cccagccagc aagagcactc cattctcaat tcccagccac 1260
cactctgata ctcctaccac ccttgccagc catagcacca agactgatgc cagtagcact 1320
caccatagca cggtacctcc tctcacctcc tccaatcaca gcacttctcc ccagttgtct 1380
actggggtct ctttcttttt cctgtctttt cacatttcaa acctccagtt taattcctct 1440
ctggaagatc ccagcaccga ctactaccaa gagctgcaga gagacatttc tgaaatgttt 1500
ttgcagattt ataaacaagg gggttttctg ggcctctcca atattaagtt caggccagga 1560
tctgtggtgg tacaattgac tctggccttc cgagaaggta ccatcaatgt ccacgacgtg 1620
gagacacagt tcaatcagta taaaacggaa gcagcctctc gatataacct gacgatctca 1680
gacgtcagcg tgagtgatgt gccatttcct ttctctgccc agtctggggc tggggtgcca 1740
ggctggggca tcgcgctgct ggtgctggtc tgtgttctgg ttgcgctggc cattgtctat 1800
ctcattgcct tggctgtctg tcagtgccgc cgaaagaact acgggcagct ggacatcttt 1860
ccagcccggg atacctacca tcctatgagc gagtacccca cctaccacac ccatgggcgc 1920
tatgtgcccc ctagcagtac cgatcgtagc ccctatgaga aggtttctgc aggtaatggt 1980
ggcagcagcc tctcttacac aaacccagca gtggcagcca cttctgccaa cttgtag 2037
<210> 52
<211> 678
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> St.pneum. C-LytA P2 helper epitope C-Lyta fused
to Human MUC-1
<400> 52
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Met Ala Ala Ala Tyr Val His Ser Asp Gly
20 25 30
Ser Tyr Pro Lys Asp Lys Phe Glu Lys Ile Asn Gly Thr Trp Tyr Tyr
35 40 45
Phe Asp Ser Ser Gly Tyr Met Leu Ala Asp Arg Trp Arg Lys His Thr
50 55 60
Asp Gly Asn Trp Tyr Trp Phe Asp Asn Ser Gly Glu Met Ala Thr Gly
65 70 75 80
Trp Lys Lys Ile Ala Asp Lys Trp Tyr Tyr Phe Asn Glu Glu Gly Ala
85 90 95
Met Lys Thr Gly Trp Val Lys Tyr Lys Asp Thr Trp Tyr Tyr Leu Asp
100 105 110
Ala Lys Glu Gly Ala Met Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile
115 120 125
Gly Ile Thr Glu Gly Val Met Val Ser Asn Ala Phe Ile Gln Ser Ala
130 135 140
Asp Gly Thr Gly Trp Tyr Tyr Leu Lys Pro Asp Gly Thr Leu Ala Asp
145 150 155 160
Arg Pro Glu Met Thr Pro Gly Thr Gln Ser Pro Phe Phe Leu Leu Leu
165 170 175
Leu Leu Thr Val Leu Thr Val Val Thr Gly Ser Gly His Ala Ser Ser
180 185 190
Thr Pro Gly Gly Glu Lys Glu Thr Ser Ala Thr Gln Arg Ser Ser Val
195 200 205
Pro Ser Ser Thr Glu Lys Asn Ala Val Ser Met Thr Ser Ser Val Leu
210 215 220
Ser Ser His Ser Pro Gly Ser Gly Ser Ser Thr Thr Gln Gly Gln Asp
225 230 235 240
Val Thr Leu Ala Pro Ala Thr Glu Pro Ala Ser Gly Ser Ala Ala Thr
245 250 255
Trp Gly Gln Asp Val Thr Ser Val Pro Val Thr Arg Pro Ala Leu Gly
260 265 270
Ser Thr Thr Pro Pro Ala His Asp Val Thr Ser Ala Pro Asp Asn Lys
275 280 285
Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala
290 295 300
Pro Asp Thr Arg Pro Pro Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly
305 310 315 320
Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Pro Pro Gly Ser Thr Ala Pro
325 330 335
Ala Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly
340 345 350
Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Asn Arg
355 360 365
Pro Ala Leu Ala Ser Thr Ala Pro Pro Val His Asn Val Thr Ser Ala
370 375 380
Ser Gly Ser Ala Ser Gly Ser Ala Ser Thr Leu Val His Asn Gly Thr
385 390 395 400
Ser Ala Arg Ala Thr Thr Thr Pro Ala Ser Lys Ser Thr Pro Phe Ser
405 410 415
Ile Pro Ser His His Ser Asp Thr Pro Thr Thr Leu Ala Ser His Ser
420 425 430
Thr Lys Thr Asp Ala Ser Ser Thr His His Ser Thr Val Pro Pro Leu
435 440 445
Thr Ser Ser Asn His Ser Thr Ser Pro Gln Leu Ser Thr Gly Val Ser
450 455 460
Phe Phe Phe Leu Ser Phe His Ile Ser Asn Leu Gln Phe Asn Ser Ser
465 470 475 480
Leu Glu Asp Pro Ser Thr Asp Tyr Tyr Gln Glu Leu Gln Arg Asp Ile
485 490 495
Ser Glu Met Phe Leu Gln Ile Tyr Lys Gln Gly Gly Phe Leu Gly Leu
500 505 510
Ser Asn Ile Lys Phe Arg Pro Gly Ser Val Val Val Gln Leu Thr Leu
515 520 525
Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ile Asn Val His Asp Val Glu Thr Gln Phe
530 535 540
Asn Gln Tyr Lys Thr Glu Ala Ala Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile Ser
545 550 555 560
Asp Val Ser Val Ser Asp Val Pro Phe Pro Phe Ser Ala Gln Ser Gly
565 570 575
Ala Gly Val Pro Gly Trp Gly Ile Ala Leu Leu Val Leu Val Cys Val
580 585 590
Leu Val Ala Leu Ala Ile Val Tyr Leu Ile Ala Leu Ala Val Cys Gln
595 600 605
Cys Arg Arg Lys Asn Tyr Gly Gln Leu Asp Ile Phe Pro Ala Arg Asp
610 615 620
Thr Tyr His Pro Met Ser Glu Tyr Pro Thr Tyr His Thr His Gly Arg
625 630 635 640
Tyr Val Pro Pro Ser Ser Thr Asp Arg Ser Pro Tyr Glu Lys Val Ser
645 650 655
Ala Gly Asn Gly Gly Ser Ser Leu Ser Tyr Thr Asn Pro Ala Val Ala
660 665 670
Ala Thr Ser Ala Asn Leu
675
Claims (27)
- 콜린 결합 도메인과 이종의 무차별 T 헬퍼 에피토프를 포함하는 융합 파트너 단백질.
- 제 1항에 있어서, 콜린 결합 도메인이 LytA의 C 말단으로부터 유래됨을 특징으로 하는 융합 파트너 단백질.
- 제 2항에 있어서, C-LytA 또는 이의 유도체가 서열번호 1 내지 6중 어느 하나를 반복체로서 4개 이상 포함함을 특징으로 하는 융합 파트너 단백질.
- 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 콜린 결합 도메인이a) 서열번호 7에 기술한 LytA의 C-말단 도메인;b) 서열번호 8의 서열;c) 서열번호 1 내지 6중 어느 하나의 서열에 대해 85% 이상의 동일성, 바람직하게는 90% 이상의 동일성, 보다 바람직하게는 95% 이상의 동일성, 가장 바람직하게는 97 내지 99% 이상의 동일성을 보유하는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 서열; 및d) 서열번호 7 또는 서열번호 8의 아미노산 서열로부터 유래된 15개, 20개, 30개, 40개, 50개 또는 100개 이상의 인접 아미노산을 보유하는 아미노산 서열을포함하는 펩타이드 서열을 포함하는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 융합 파트너 단백질.
- 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로 이종 단백질을 포함함을 특징으로 하는 융합 파트너 단백질.
- 제 5항에 있어서, 이종 단백질이 융합 파트너에 화학적으로 접합됨을 특징으로 하는 융합 파트너 단백질.
- 제 5항 또는 제 6항에 있어서, 이종 단백질이 인간 면역결핍증 바이러스 HIV-1, 인간 단순 헤르페스 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 로타바이러스, 엡스타인 바르 바이러스, 바리셀라 조스터 바이러스, 또는 다른 간염 바이러스, 예컨대 B형 간염 바이러스, A형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스 및 E형 간염 바이러스, 또는 호흡기세포융합바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 인간 유두종 바이러스, 플라비바이러스, 또는 인플루엔자 바이러스; 또는 나이제리아(Neisseria) 종; 모락셀라(Moraxella) 종; 보르데텔라(Bordetella) 종; M.튜베르큘로시스(M.tuberculosis)를 포함하는 마이코박테리움(Mycobacterium) 종; 내독소 대장균을 포함하는 에세리히아(Escherichia) 종; 살모넬라(Salmonella) 종; 리스테리아(Listeria) 종; 헬리코박터(Helicobacter) 종; S.아우레우스(S. aureus), S.에피더미스(S.epidermids)를 포함하는 스타필로코커스(Staphylococcus) 종; 보렐리아(Borrelia) 종; C.트라코마티스(C.trachomatis), C.뉴모니애(C.pneumoniae)를 포함하는 클라미디아(Chlamydia) 종; P.팔시파럼(P.falciparum)을 포함하는 플라스모듐(Plasmodium) 종; 톡소플라스마(Toxoplasma) 종; 칸디다(Candida) 종으로 구성된 그룹 중에서 선택되는 유기체로부터 유래됨을 특징으로 하는 융합 파트너 단백질.
- 제 5항 또는 제 6항에 있어서, 이종 단백질은 종양 관련 단백질 또는 조직 특이 단백질 또는 이의 면역원성 단편임을 특징으로 하는 융합 파트너 단백질.
- 제 8항에 있어서, 이종 단백질 또는 이의 단편이 MAGE 1, MAGE 3, MAGE 4, PRAME, BAGE, LAGE 1, LAGE 2, SAGE, HAGE, XAGE, PSA, PAP, PSCA, 프로스테인, P501S, HASH2, 크립토(Cripto), B726, NY-BR1.1, P510, MUC-1, 프로스타제(Prostase), STEAP, 타이로시나제(tyrosinase), 텔로머라제(telomerase), 설비빈(survivin), CASB616, P53 또는 her 2 neu 중에서 선택됨을 특징으로 하는 융합 파트너 단백질.
- 제 6항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로 4개 이상의 히스티딘 잔기로 이루어진 친화성 태그를 포함함을 특징으로 하는 융합 파트너 단백질.
- 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 단백질을 암호화하는 핵산 서열.
- 제 11항에 따른 핵산 서열을 함유하는 발현 벡터.
- 제 11항에 따른 핵산 서열 또는 제 12항에 따른 발현 벡터로 형질전환된 숙주.
- 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 단백질 또는 제 11항에 따른 DNA 서열과 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 면역원성 조성물.
- 제 14항에 있어서, 추가로 TH-1 유도 보강제를 포함함을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
- 제 15항에 있어서, TH-1 유도 보강제가 3D-MPL, QS21, QS21과 콜레스테롤의 혼합물, CpG 올리고뉴클레오타이드 또는 이러한 보강제의 2종 이상의 혼합물로 이루어진 보강제 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
- 제 6항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질 또는 제 11항에 따른 암호성 폴리뉴클레오타이드와 적당한 보강제, 희석제 또는 다른 약제학적으로 허용되는 담체를 혼합하는 것을 포함하여, 제 14항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물을 제조하는 방법.
- 제 13항에 따른 숙주 세포를 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 생성시키기에 충분한 조건하에서 배양하는 단계 및 이러한 배양 배지로부터 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함하여, 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 제조하는 방법.
- 약제 제조를 위한 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 단백질 또는 제 11항에 따른 DNA 서열.
- 환자에게서 면역 반응을 유도하기 위한 면역원성 조성물의 제조에 유용한 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 단백질 또는 제 11항에 따른 DNA 서열의 용도.
- 제 20항에 있어서, 면역 반응이 i) 단백질에 이어 DNA 서열의 연속 투여에 의해 유도되거나; ii) DNA 서열에 이어 단백질의 연속 투여에 의해 유도됨을 특징으로 하는 용도.
- 제 21항에 있어서, DNA 서열이 생체분해성 비드상에 코팅되거나 입자 충격술을 통해 전달됨을 특징으로 하는 용도.
- 제 21항 또는 제 22항에 있어서, 단백질이 보강제 처리됨을 특징으로 하는 용도.
- 암에 걸려있거나 암에 걸리기 쉬운 환자를 면역치료법으로 치료하기 위한 면역원성 조성물의 제조에 유용한 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 단백질 또는 제 11항에 따른 DNA 서열의 용도.
- 제 24항에 있어서, 암이 전립선암, 결장암, 폐암, 유방암 또는 흑색종임을 특징으로 하는 용도.
- 안전하고 유효한 양의 제 12항에 따른 조성물을 투여하여, 암에 걸린 환자를 치료하는 방법.
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