ES2321788B1 - Dominios proteicos de afinidad a colina para mejorar la expresion, inmovilizacion y purificacion de polipetidos. - Google Patents
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Abstract
Dominios proteicos de afinidad a colina para
mejorar la expresión, inmovilización y purificación de
polipétidos.
Son objetos de la presente invención una
secuencia polipeptídica derivada de la del módulo de unión a colina
de la amidasa LytA de Streptococcus pneumoniae, así como un
conjunto de vectores de expresión destinados a la obtención, de
fusiones traduccionales a la secuencias codificante de dicho
polipéptido en bacterias y en levaduras. Son también objetos de
invención diversas mejoras estructurales y del procedimiento de
purificación, que permiten mejorar la expresión y estabilidad de
las fusiones, además de minimizar interferencias con el polipéptido
fusionado y optimizar la separación proteolítica del citado módulo.
Como ejemplos de realización se describe la construcción de un
conjunto de vectores plasmídicos con las señales operativas
necesarias para la expresión en bacterias o en levaduras de una de
estas secuencias, y que permiten su fusión a genes heterólogos para
obtener proteínas híbridas que pueden inmovilizarse en una variedad
de soportes, y eventualmente purificarse mediante cromatografía de
afinidad.
Description
Dominios proteicos de afinidad a colina para
mejorar la expresión, inmovilización y purificación de
polipéptidos.
La presente invención se refiere a la
utilización de una secuencia polipeptídica que, fusionada a una
proteína de interés, permite su inmovilización en determinados
soportes mediante afinidad específica por los mismos, y su
posterior purificación a partir de éstos en un sólo paso. Se
describe también un conjunto de vectores plasmídicos con los
elementos genéticos adecuados para facilitar la expresión
recombinante de proteínas fusionadas a la mencionada secuencia
polipeptídica, tanto en bacterias como en levaduras, así como los
procedimientos necesarios para llevar a cabo los procesos de
inmovilización y purificación citados. El sector de la técnica al
que puede aplicarse esta invención comprende por tanto la
producción, inmovilización y purificación de polipéptidos y
proteínas de interés biotecnológico, ya sea con fines industriales,
agronómicos, terapéuticos o de diagnóstico en biomedicina, o como
herramienta de investigación y análisis en el ámbito de las ciencias
de la vida.
La inmovilización de enzimas en soportes
sólidos, así como la purificación de proteínas en un sólo paso
cromatográfico son dos procesos de esencial interés en Biotecnología
que muchas veces comparten un procedimiento previo común: la fusión
de la proteína de interés con un polipéptido o "tag" de
afinidad que posibilita una interacción fuerte con un soporte sólido
(Uhlén, M. et al (1992). Curr. Op. Biotechnol. 3,
363-369; Waugh. (2005). Trends Biotechnol.
23, 316-320). La adición a dicho soporte de un
extracto celular de un organismo en el que se ha producido la
expresión de la proteína híbrida posibilita la unión específica de
la fusión al soporte, y la eliminación del resto de proteínas
mediante el lavado exhaustivo del mismo. En este punto puede
optarse, bien por utilizar la actividad enzimática así retenida,
bien por eluir de manera selectiva la proteína híbrida mediante la
adición de un ligando competidor (base de la cromatografia de
afinidad), con el resultado de un alto grado de pureza en la
preparación final de la proteína de interés.
La inmovilización de una enzima en una fase
sólida facilita su recuperación y reutilización en un reactor
(Trevan, M.D. et al (1990). En: Biotecnología Básica.
Ed. Acribia, Zaragoza, España.). Además, las interacciones que el
soporte mantiene con la enzima y su capacidad para resguardarla del
disolvente pueden incrementar la estabilidad de la misma, y por
tanto su rendimiento. Dentro de los métodos de inmovilización que se
utilizan, los procedimientos de unión no covalente al soporte
presentan varias ventajas frente a los procedimientos de unión
covalente. En el primer caso, se pueden utilizar soportes muy
variados que no es necesario activar, reduciéndose al mínimo las
posibilidades de distorsión estructural de la proteína al no
modificarla covalentemente. Además, la unión no covalente es en
general un proceso reversible, permitiendo la regeneración de los
soportes, de los cuales existe una amplia gama disponible
comercialmente como puede comprobar cualquier experto en la
materia.
En cuanto a la cromatografía de afinidad, es
obvio que la reducción en el número de pasos de purificación de una
proteína se traduce no sólo en un mayor rendimiento, sino además en
un incremento de la pureza y un estimable ahorro de tiempo y
esfuerzo.
Los módulos de unión a colina (ChBM,
"choline-binding modules") constituyen una
familia de polipéptidos que forman parte de las denominadas
proteínas de unión a colina (ChBP,
"choline-binding proteins"), presentes en una
variedad de microorganismos (Swiatlo, E. et al (2004).
En: The Pneumococcus. American Society for
Microbiology Press, Washington DC). Los ChBMs constan a su vez de
la repetición de secuencias muy conservadas de aproximadamente 20
aminoácidos (ChBR o "choline-binding repeats";
código Pfam PF01473:
http://www.sanger.ac.uk//cgi-bin/Pfam/getacc?PF01473.),
que forman estructuras del tipo
bucle-horquilla-\beta
(Fernández-Tornero, C. et al (2001). Nat.
Struct. Biol. 8, 1020-1024.). Dos ChBRs
consecutivas configuran un sitio de unión a colina. La afinidad de
los ChBMs por colina y análogos estructurales de la misma (Sanz,
J.M. et al. (1988). FEBS Lett. 232,
308-312.), ha permitido poner a punto un sistema
eficaz de purificación de proteínas de fusión con algunos de estos
ChBMs (Sánchez-Puelles, J.M. et al. (1992)
Eur. J. Biochem. 203, 153-159.). Básicamente,
el procedimiento consiste en aplicar un extracto celular
conteniendo la proteína de fusión sobre un soporte derivatizado con
aminas terciarias o cuaternarias. La proteína así inmovilizada
mantiene su funcionalidad, y puede ser eluída fácilmente mediante la
adición de un ligando competidor, como la colina. El procedimiento
así descrito es la base de una patente anterior (ES 2 032 717).
La Tabla 1 muestra un estudio comparativo de las
características de los "tags" de afinidad más comúnmente
utilizados junto con el sistema de los módulos de unión a colina
(Sánchez-Puelles, J.M. et al. (1992) Eur.
J. Biochem. 203, 153-159; Lichty, J.J. et
al (2005) Protein Expression and Purification 41,
98-105; Waugh, D.S. (2005) Trends Biotechnol.
23, 316-320). Según se desprende del estudio,
el procedimiento objeto de esta patente posee una serie de ventajas
específicas que lo hace altamente competitivo, y que justifica su
explotación para convertirse en un procedimiento extendido de
inmovilización y purificación de proteínas. Fundamentalmente, el
sistema es altamente específico, puede utilizar una gran variedad de
soportes ya disponibles comercialmente (resinas, papel, placas
multipocillo, etc...), muestra muy pocas incompatibilidades, y
posee todas las atribuciones necesarias para pensar en un escalado
eficiente para su empleo en biorreactores a nivel industrial.
La presente invención es útil para la expresión,
inmovilización y purificación de proteínas de interés mediante
fusión a las secuencias polipeptídicas descritas. Por tanto, puede
servir para elaborar productos de utilidad para industrias de
reactivos y herramientas de investigación en ciencias de la vida.
Además, se puede aplicar a la industria química para la purificación
de enzimas útiles, para la construcción de biorreactores
enzimáticos para síntesis o análisis químicos, o procesos que
requieran biotransformación, incluso dentro del ámbito
agroalimentario. También es igualmente aplicable a la industria
farmacéutica y sanitaria en general, para producir y purificar
proteínas recombinantes aplicables al diagnóstico y terapias, así
como para la elaboración de matrices de proteínas inmovilizadas de
aplicación en proteómica.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
El objeto de la presente invención comprende la
inmovilización por unión no covalente y la purificación de
proteínas recombinantes basándose en su fusión a unas secuencias
polipeptídicas derivadas de la del dominio de unión a colina de la
amidasa lítica LytA de S. pneumoniae
(C-LytA), mediante sistemas genéticos que permiten
su expresión en bacterias y en levaduras. La presente invención
describe mejoras del método general descrito en una patente
anterior (ES 2 032 717), ya que define el uso de una región concreta
del dominio C-LytA y abre un abanico de
posibilidades de utilización de este sistema en condiciones no
estándar de temperatura y pH.
La presente invención comprende el uso de una
versión recortada de una secuencia de DNA (SEQ ID Nº 1, codificante
de C-LytA, SEQ ID Nº 2), así como de una variante
mutante de la misma, que codifican polipéptidos más pequeños y con
niveles de expresión superiores a los del polipéptido original
C-LytA completo, manteniendo o mejorando sus
propiedades para la inmovilización y purificación de polipéptidos
recombinantes de fusión en soportes sólidos derivatizados con
aminas terciarias y cuaternarias.
El polipéptido recortado derivado de
C-LytA, LYTAG2 (SEQ ID Nº 3) posee 131
aminoácidos y un peso molecular de 14.62 kDa. Los aminoácidos
1-104 del polipéptido LYTAG2 corresponden a los
residuos 59-163 de la SEQ ID Nº 2. Los aminoácidos
105-131 del polipéptido LYTAG2 corresponden a una
secuencia artificial con capacidad demostrada para formar una
hélice-\alpha.
El polipéptido LYTAG2t (LYTAG2
termorresistente, SEQ ID Nº 4) posee también 131 aminoácidos y un
peso molecular de 14.73 kDa, y se diferencia del polipéptido LYTAG2
únicamente en las sustituciones Asn19 \rightarrow Lys, Ser20
\rightarrow Lys, Thr53 \rightarrow Lys y Thr76 \rightarrow
Lys.
Las características novedosas de los objetos de
la presente invención se pueden resumir en 4 puntos:
1.- El dominio minimizado LYTAG2 mejora las
características de expresión y solubilidad observadas para el
dominio C-LytA completo, a la vez que su menor
tamaño disminuye la probabilidad de interferencia con las funciones
de la proteína fusionada al mismo. Además, se ha descrito que la
región de C-LytA excluida de LYTAG2 está
parcialmente desplegada en solución (Maestro y Sanz (2005)
Biochem J. 387, 479-88), por lo que su
eliminación minimiza el riesgo de agregación y de ataque
inespecífico por proteasas.
2.- Con el fin de reducir aún más la posible
interacción estructural con el polipéptido fusionado, el sistema
objeto de la presente invención incorpora una secuencia aminoacídica
espaciadora capaz de adoptar una conformación rígida en hélice
\alpha (Arai, R. et al. (2001) Prot. Eng. 14,
529-532), separando así ambos polipéptidos de manera
permanente, en contraposición a otros conectores de estructura más
laxa que se utilizan comercialmente. La separación efectiva entre
polipéptidos podría facilitar asimismo la accesibilidad a las
distintas endopeptidasas de corte específico que se pretendan
emplear para la separación proteolítica del "tag" de afinidad,
dado que es bastante conocido que en un buen número de ocasiones el
sitio de reconocimiento de la endopeptidasa queda oculto debido a
interacciones inespecíficas entre los dominios fusionados. En
definitiva, esta mejora del sistema es especialmente útil cuando la
proteína de fusión expresada va a ser utilizada directamente, en
solución o inmovilizada en uno de los soportes cromatográficos
aminados descritos anteriormente, para cualquier tipo de ensayo o
aplicación biotecnológica, y además facilita la eliminación del
"tag" de afinidad cuando su presencia en la proteína de
interés sea incompatible con determinadas aplicaciones o
ensayos.
3- Se propone una mejora en el procedimiento de
purificación consistente en la utilización de concentraciones
moderadas de detergentes con el fin de ayudar a la solubilidad de
proteínas hidrofóbicas. En la configuración objeto de la presente
invención, la secuencia codificante de la proteína a expresar puede
ser fusionada a continuación de una secuencia codificante de la
diana reconocible por una endopeptidasa específica, que se sitúa a
continuación de la secuencia espaciadora, permitiendo la
recuperación de la proteína de interés sin la presencia de residuos
aminoacídicos no deseados en su extremo amino terminal. La adición
de ciertos detergentes como el dodecil sulfato sódico a una
concentración determinada permite desplegar selectivamente el
módulo LYTAG2, facilitando así el acceso de la endopeptidasa a su
sitio de corte.
4- Por último, la funcionalidad del dominio
minimizado LYTAG2 puede ser mejorada mediante la sustitución de
determinados aminoácidos localizados en la superficie de la proteína
(variante LYTAG2t), incrementándose apreciablemente el rendimiento
de inmovilización/purificación a altas temperaturas y a pH
ácido.
En la configuración descrita, la expresión de la
proteína de fusión resultante se produce bajo el control de una
versión mutante mejorada del promotor procariótico Pm, regulable por
el sistema NahR/XylS2, inducible por salicilato (Cebolla et
al. (2001) Nucleic Acids Res. 29,
759-766). Otra configuración preferente es situar la
secuencia codificante de la fusión bajo el control de un promotor
compatible con organismos eucarióticos como levaduras, células de
insectos, mamíferos, etc, de forma que pueda purificarse la
proteína de fusión expresada en este tipo de células.
Mediante el empleo de técnicas usuales de
biología molecular, pueden diseñarse proteínas híbridas que
contengan las secuencias LYTAG2 ó LYTAG2t con el objeto de:
1.- Su expresión heteróloga en bacterias,
levaduras, cultivos celulares, etc.
2.- Su inmovilización en soportes derivatizados
con aminas terciarias y cuaternarias, y cuyas matrices pueden
consistir en:
- 2.1)
- Resinas cromatográficas (dextrano, agarosa, celulosa, metacrilato, etc..);
- 2.2)
- Papel o membranas;
- 2.3)
- Placas multipocillo;
- 2.4)
- Micro o nanoparticulas.
3.- La utilización de la proteína de fusión así
inmovilizada para los siguientes procesos:
- 3.1.)
- La purificación de la proteína de fusión desde los soportes arriba mencionados mediante la elución específica con colina o análogos de ésta;
- 3.2.)
- La construcción de biorreactores para llevar a cabo biotransformaciones y reacciones químicas catalizadas enzimáticamente;
- 3.3.)
- El diseño de biosensores;
- 3.4.)
- La construcción de "arrays" de proteínas para ensayos de alto rendimiento en proteómica.
4.- La separación de los polipéptidos LYTAG2 ó
LYTAG2t mediante una combinación de proteolisis limitada y
tratamiento suave con dodecil sulfato sódico, y la purificación
resultante de la proteína de interés.
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El presente ejemplo describe como pueden
seleccionarse y modificarse fragmentos recortados del dominio de
unión a colina C-LytA manteniendo e incluso
superando las propiedades del fragmento completo para la expresión
y purificación de proteínas de fusión. Los estudios descritos en
este ejemplo han tenido como objeto, por una parte, la
identificación de una secuencia polipeptídica, derivada de la del
dominio de afinidad a colina de la proteína LytA
(C-LytA), pero más pequeña que ésta, que permita ser
utilizada como "tag" de purificación, manteniendo una afinidad
por los soportes utilizados para inmovilizar y/o purificar proteínas
fusionadas a la misma similar a la observada para la de fusiones al
dominio C-LytA completo.
Al mismo tiempo, las construcciones genéticas
necesarias para llevar a cabo la expresión de las proteínas de
fusión objeto de estos estudios se han realizado utilizando una
serie de vectores bacterianos construidos a tal fin, y que están
basados en el sistema de activación en cascada descrito y patentado
por A. Cebolla y colaboradores (Cebolla, A. et al (2001)
Nucleic Acids Res, 29, 759-766; Cebolla, A.,
et al (2002). Appl Environ Microbiol, 68,
5034-5041; Patente W000/78976). Los plásmidos
desarrollados incorporan mejoras importantes con respecto a los
vectores de expresión y purificación de proteínas de la serie pALEX
ya comercializados por Biomedal (www.biomedal.com), tales como el
uso de un promotor Pm mutante con menor actividad basal, y la
presencia de una región de clonación múltiple más versátil. Otras
ventajas son la incorporación de un sitio de unión a ribosomas más
eficiente y dos terminadores de la trascripción consecutivos,
situados a continuación de la región de clonación múltiple y de
tres codones de parada, uno en cada una de las tres fases de lectura
traduccional.
La construcción de estos plásmidos se ha
realizado según se describe a continuación. En el primer paso se
seleccionó una versión mejorada del promotor Pm. Para ello, a partir
del plásmido pCCD5 (Cebolla, A., et al (2002). Appl
Environ Microbiol, 68, 5034-5041), y utilizando
como cebadores los oligonucleótidos PMMu5 (SEQ ID Nº 5) y PMNh3 (SEQ
ID Nº 6), se amplificó, en condiciones mutagénicas, una mezcla de
productos de PCR de 112 pb conteniendo versiones mutantes del
promotor Pm, el cual es activado por el producto del alelo mutante
xylS2 del gen xylS de Pseudomonas en presencia
de salicilato (Cebolla, A. et al (2001) Nucleic Acids Res,
29, 759-766; Cebolla, A., et al (2002).
Appl Environ Microbiol, 68, 5034-5041). La
mezcla de productos de PCR fue digerida con MunI y
NheI, y los fragmentos resultantes se clonaron entre los
sitios EcoRI y XbaI del plásmido pJBA111 (Andersen, J.B. et
al (1998) Appl Environ Microbiol, 64,
2240-2246), previamente digerido con estos enzimas,
sustituyendo así al promotor original a partir del cual se expresa
una proteína verde-fluorescente (GFP). A partir de
la mezcla de plásmidos resultante, se seleccionó uno con un promotor
Pm mutante que, introducido en una cepa de E. coli
hospedadora para el mencionado sistema de expresión en cascada,
mostró un nivel especialmente reducido de actividad (detectado como
expresión de GFP), en condiciones basales (en ausencia del inductor,
salicilato), manteniendo un nivel de actividad tan elevado como el
del promotor silvestre en condiciones de inducción (presencia de 2
mM salicilato). A partir del plásmido seleccionado, pIZ1203, y con
el fin de aislar al promotor Pm y la región aguas abajo del mismo
de la actividad de un segundo promotor presente en el plásmido
(Plac, procedente del vector pUC 18Not del cual deriva el plásmido
pJBA111), se construyó el plásmido pIZ1203Rev8, en el cual el
fragmento NotI de 1878 pb que contiene al promotor Pm está
en la orientación inversa con respecto a pIZ1203. En el paso
siguiente, a partir de pIZ1203Rev8 se construyeron tres nuevos
plásmidos, denominados pMAB1, pMAB2 y pMAB3, obtenidos sustituyendo
en pIZ1203Rev8 el fragmento SphI-HindIII de 755 pb
que contiene la región codificante de la GFP, por dúplex sintéticos,
obtenidos respectivamente a partir de las parejas de
oligonucleótidos complementarios MAO19 (SEQ ID Nº 7) y MAO20 (SEQ
ID Nº 8), MAO21 (SEQ ID Nº 9) y MAO22 (SEQ ID Nº 10), ó MAO23 (SEQ
ID Nº 11) y MAO24 (SEQ ID Nº 12).
Los dúplex sintéticos insertados contienen
dianas para diversas enzimas de restricción, que pueden ser
utilizadas en la clonación de fragmentos de DNA y su expresión en
los nuevos vectores.
A continuación, y para validar el funcionamiento
de los nuevos vectores de expresión, se analizó la expresión de una
proteína modelo en uno de estos plásmidos. Para ello, se clonó un
fragmento BamHI-HindIII de 3116 pb del gen lacZ
de E. coli, con la secuencia codificante de la enzima
\beta-galactosidasa, entre los sitios BamHI
y HindIII del vector pMAB3 descrito anteriormente. En el
plásmido resultante, pMAB3-lacZ, la secuencia de
lacZ queda fusionada a la región de clonación múltiple de
pMAB3, en la fase de lectura correcta con respecto al primer codón
de inicio ATG situado a continuación de la región de unión a
ribosomas, y que forma parte de la diana para la enzima SphI
presente al comienzo de la región de clonación múltiple. El plásmido
pMAB3-lacZ se utilizó para transformar la cepa
comercial bacteriana REG-1 (Biomedal,
www.biomedal.com), hospedadora del módulo regulador del sistema en
cascada (Cebolla, A., et al (2002). Appl Environ
Microbiol, 68, 5034-5041), y se comprobó la
expresión de actividad \beta-galactosidasa en
extractos celulares de cultivos del transformante en condiciones de
inducción (resultados no mostrados).
En el siguiente paso, pMAB3-lacZ
se utilizó como punto de partida en la construcción de una serie de
plásmidos para la expresión de fusiones
"mini-C-LytA" (versiones
reducidas de C-LytA, representadas en la Figura 1A)
al extremo amino terminal de la
\beta-galactosidasa. Para ello, se utilizó como
plantilla la secuencia codificante completa de
C-LytA (SEQ ID Nº 1).
La construcción
"mini-C-LytA1", codificante del
polipéptido SEQ ID Nº 13, se obtuvo mediante PCR a partir de la
secuencia SEQ ID Nº 1 usando los oligonucleótidos MAO27 (SEQ ID Nº
14) y MAO29 (SEQ ID Nº 15).
La construcción
"mini-C-LytA2", codificante del
polipéptido SEQ ID Nº 16, se obtuvo mediante PCR a partir de la
secuencia SEQ ID Nº 1 usando los oligonucleótidos MAO28 (SEQ ID Nº
17) y MAO30 (SEQ ID Nº 18).
La construcción
"mini-C-LytA3", codificante del
polipéptido SEQ ID Nº 19 se obtuvo mediante PCR a partir de la
secuencia SEQ ID Nº 1 usando los oligonucleótidos MAO30 (ya
descrito) y MAO31 (SEQ ID Nº 20).
Por último, la construcción
"mini-C-LytA4", codificante del
polipéptido SEQ ID Nº 21 se obtuvo mediante PCR a partir de la
secuencia SEQ ID Nº 1 usando los oligonucleótidos MAO32 (SEQ ID Nº
22) y MAO33 (SEQ ID Nº 23).
En el paso siguiente, los productos de PCR
descritos se fusionaron, mediante una estrategia de PCR solapante
utilizando oligonucleótidos "puente" (MAO38 (SEQ ID Nº 24) para
"mini-C-LytA1"; MAO37 (SEQ ID
Nº 25) para "mini-C-LytA2";
MAO39 (SEQ ID Nº 26) para
"mini-C-LytA3", y MAO40 (SEQ ID
Nº 27) para "mini-C-LytA4"), a
la secuencia codificante de un polipéptido espaciador denominado
HL4GS (LAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAAAGS, SEQ ID Nº 28) fusionada
directamente en su extremo carboxilo terminal a la secuencia de la
diana de la proteasa de corte específico NIa, (NVVVHQA, SEQ ID Nº
29) (Perez-Martin, J., et al. (1997).
Protein Eng, 10, 725-730), la cual fue
obtenida mediante PCR con los oligonucleótidos MAO34 (SEQ ID Nº 30)
y MAO35 (SEQ ID Nº 31), complementarios en sus extremos 3'.
Finalmente, los productos de PCR obtenidos,
conteniendo los módulos
"mini-C-LytA1-HL4GSNIa",
"mini-C-LytA2-HL4GSNIa",
"mini-C-LytA3-HL4GSNIa"
y
"mini-C-LytA4-HL4GSNIa",
fueron digeridos con SphI e insertados en la orientación
adecuada en el sitio SphI de pMAB3-lacZ,
obteniéndose respectivamente los plásmidos
pMAB3-LIHN-LacZ-56,
pMAB3-L2HN-LacZ-16,
pMAB3-L3HN-LacZ-28 y
pMAB 3 -L4HN-LacZ-34.
Para analizar las propiedades de expresión y
purificación de las proteínas de fusión codificadas en los
plásmidos descritos, se transformó la cepa REG-1 ya
descrita con cada uno de ellos por separado, incluyéndose en estos
estudios el transformante de REG-1 con el plásmido
precursor pMAB3-lacZ. Los transformantes descritos
se cultivaron a 37ºC con agitación en medio LB líquido con 100
mg/ml de ampicilina (para seleccionar la presencia de los plásmidos,
que confieren resistencia a este antibiótico) hasta una densidad
óptica a 600 nanometros (D.O._{600 \ nm}) de entre 0.8 y 1.0, y
después durante 12 horas a 20ºC con agitación en el mismo medio, en
ausencia o en presencia de 2 mM salicilato. Para cada transformante,
las células procedentes de ambos cultivos fueron recogidas por
centrifugación y lisadas mediante sonicación en una solución tampón
20 mM fosfato potásico pH 7.0, 0.1% Tritón X-100,
1.5 M NaCl. El sobrenadante del extracto crudo, obtenido después de
centrifugar éste para eliminar los restos celulares, se aplicó a
una matriz de afinidad consistente en DEAE-Sepharose
(Sigma) incubándose con agitación suave a temperatura ambiente
durante 1 hora, tras lo cual se lavó la resina con el mismo tampón
utilizado en la lisis, se equilibró con 20 mM fosfato potásico pH
7.0, 0.1% Tritón X-100, y finalmente se eluyó la
proteína de fusión con un volumen de 250 mM colina en 20 mM fosfato
potásico pH 7.0, 0.1% Tritón X-100, repitiéndose dos
veces más este último paso. La Figura 1B muestra los resultados del
análisis de la proteína obtenida mediante SDS-PAGE
y tinción de Coomassie. Como puede observarse, todas las
construcciones analizadas se expresaron de manera significativa en
condiciones de inducción. Sin embargo, únicamente las fusiones
"mini-C-LytA1-HL4GSNIa-LacZ"
y
"mini-C-LytA2-HL4GSNIa-LacZ"
pudieron ser purificadas a partir de los extractos celulares en las
condiciones probadas. De estas dos, se eligió la construcción
"mini-C-LytA2-HL4GSNIa-LacZ"
para posteriores estudios, debido al elevado nivel de expresión
detectado para esta fusión con respecto a la
fusión"mini-C-LytA
1-HL4GSNIa-LacZ", y a su aparente
mayor afinidad por la resina empleada, lo que podría permitir
lavados en condiciones más drásticas y reducir así la contaminación
de la proteína eluida con proteína unida a la resina de manera no
específica. El módulo mini-C-LytA2
constituye por lo tanto la base de la secuencia LYTAG2.
El siguiente ejemplo muestra cómo pueden
obtenerse vectores de expresión bacterianos avanzados usando la
etiqueta LYTAG2. Se realiza la construcción de una serie de vectores
plasmídicos, para la expresión de fusiones traduccionales a la
secuencia codificante del dominio de afinidad a colina LYTAG2
descrito en el Ejemplo 1, que pueden ser empleados en la producción
y purificación de proteínas heterólogas en la bacteria E.
coli. En estos nuevos plásmidos se ha sustituido la secuencia
codificante de la diana de la endopeptidasa NIa por otra
codificante de la de otra endopeptidasa de corte específico, la
enteroquinasa, que reconoce la secuencia DDDDK (SEQ ID Nº 32)
(Choi, et al. (2001). Biotechnol Bioeng, 75,
718-724). Para ello, a partir del plásmido
pMAB3-L2HN-lacZ-16
descrito en el Ejemplo 1 y utilizando como cebadores los
oligonucleótidos MAO62 (SEQ ID Nº 33), que incluye la secuencia
complementaria inversa de la codificante de la diana DDDDK, y el
oligonucleótido MAO49 (SEQ ID Nº 34), se amplificó mediante PCR un
producto de 469 pb. Este producto fue digerido con SphI, y
el fragmento de 414 pb resultante se clonó en la orientación
adecuada en el sitio SphI de cada uno de los plásmidos pMAB1,
pMAB2 y pMAB3 descritos en el Ejemplo 1, obteniéndose,
respectivamente, los plásmidos pMAB7, pMAB8 y pMAB9, cuyo esquema se
representa en la Figura 2. pMAB7, pMAB8 y pMAB9 permiten la
expresión de polipéptidos fusionados al extremo carboxilo de la
secuencia MLADRWRKHTDGNWYW FDNSGEMATGWKKIADKWYYFNEEGAMKTGW VKYKDT
WYYLDAKEGAMVSNAFIQSADGTGWYYLKPDGTLADRPEFTVEPDGLITVKLAEAAAKEAAAK
EAAAKEAAAKAAAGSDDDDK (SEQ ID Nº 35).
EAAAKEAAAKAAAGSDDDDK (SEQ ID Nº 35).
Las secuencias de los plásmidos descritos se
diferencian únicamente en la presencia de una, o dos bases
insertadas inmediatamente a continuación de la diana SphI
localizada al comienzo de la región de clonación múltiple,
facilitándose así la fusión traduccional a LYTAG2, en la fase de
lectura apropiada, de cualquier fragmento que pueda clonarse en una
(o entre dos) de las dianas de restricción de dicha región de
clonación múltiple. La presencia de una diana para la enzima de
restricción de corte romo PshAI, solapante con la secuencia
que codifica para la diana de la enteroquinasa, permite asimismo la
fusión directa de fragmentos de DNA a la secuencia de dicha diana,
haciendo posible posteriormente escindir de manera precisa el tag de
purificación de la proteína expresada.
Para completar este ejemplo de realización, a
partir del vector pMAB9 se construyó un nuevo plásmido,
pMAB9-lacZ, para la expresión de una fusión
LYTAG2-\beta-galactosidasa,
insertando entre los sitios BamHI y HindIII de pMAB9
el fragmento BamHI-HindIII de 3116 pb del gen
lacZ de E. coli descrito en el Ejemplo 1. Asimismo, y
con el objetivo de comparar esta fusión a LYTAG2 con otra idéntica
al dominio C-LytA completo, y poder confirmar así
los datos obtenidos previamente, que indicaban una mejor expresión
del "tag" recortado LYTAG2, se construyó otro plásmido según
se describe a continuación. Un producto de PCR de 353 pb,
amplificado a partir del plásmido
pMAB3-LIHN-LacZ-56
descrito en el Ejemplo 1 con los oligonucleótidos MAO49 (ya
descrito) y MAO106 (SEQ ID Nº 36), y otro producto de PCR de 572
pb, de secuencia solapante con la del primero y amplificado a partir
del plásmido pMAB7, descrito en este ejemplo, con los
oligonucleótidos MAO107 (SEQ ID Nº 37) y MAO50 (SEQ ID Nº 38), se
utilizaron en una tercera PCR en la que se obtuvo un producto de 795
pb conteniendo la secuencia codificante del dominio
C-LytA completo fusionada a la del espaciador y la
diana para la enteroquinasa ya descritas (SEQ ID Nº 39). El
producto así obtenido se digirió con SphI, y el fragmento de
585 pb resultante se clonó, en la orientación adecuada, en el sitio
SphI del plásmido pMAB3-lacZ del Ejemplo 1,
dando como resultado el plásmido
pMAB3-LytA-HEK-lacZ.
Ambos plásmidos, pMAB9-lacZ y
pMAB3-LytA-HEK-lacZ,
se utilizaron para transformar la cepa hospedadora
REG-1 ya descrita, y los transformantes obtenidos se
cultivaron de manera similar a la descrita en el Ejemplo 1, en
presencia de distintas concentraciones del inductor salicilato. A
partir de los cultivos resultantes, se obtuvieron extractos
celulares de proteína total soluble que fueron analizados mediante
SDS-PAGE y tinción de Coomassie, y en paralelo,
utilizados en ensayos de actividad
-\beta-galactosidasa para determinar de manera más
cuantitativa la cantidad de proteína de fusión expresada en forma
activa, utilizando
o-nitrofenil-\beta-D-galactopiranósido
como sustrato (Miller, J. (1972). Experiments in Molecular
Genetics. Cold Spring Harbor, New York, EEUU). Los resultados
de ambos tipos de análisis, mostrados en la Figura 3, confirman que
la fusión LYTAG2-LacZ se expresa, en forma soluble y
activa, a un nivel considerablemente superior al de la fusión
C-LytA-LacZ, y por tanto que el
nuevo "tag" LYTAG2 constituye una mejora significativa con
respecto al dominio C-LytA completo. Las
diferencias observadas podrían deberse, entre otras razones, a que
el RNA mensajero que codifica la fusión LYTAG2-LacZ
tiene una mayor estabilidad (y por tanto una vida media más
prolongada), o se traduce a proteína de una manera más eficiente que
el RNA mensajero que codifica la fusión
C-LytA-LacZ. Asimismo, el
polipéptido LYTAG2 podría presentar una mayor resistencia que el
dominio C-LytA al ataque de la maquinaria
proteolítica celular, debiéndose en este caso la mejor expresión de
la fusión LYTAG2-LacZ a su mayor estabilidad una
vez sintetizada.
\vskip1.000000\baselineskip
En el presente ejemplo se muestra cómo se pueden
desarrollar vectores de levaduras que usen la etiqueta de
purificación LYTAG2. Se lleva a cabo la construcción de un vector ,
plasmídico, para la expresión de fusiones traduccionales a la
secuencia codificante del dominio de afinidad a colina LYTAG2, que
puede ser empleado en la producción y purificación de proteínas
heterólogas en la levadura S. cerevisiae.
La construcción de este vector de expresión
eucariótico, basado en el sistema Ga14-pGAL1 inducible por
galactosa (Johnston, M. (1992). En: The Molecular Biology of the
Yeast Saccharomyces . E. W. Jones, Pringle, J. R. and
Broach, J. R. Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory
Press. 2: 193-281), se ha llevado a cabo
insertando el módulo LYTAG2-región de clonación
múltiple del plásmido pMAB7 descrito en el Ejemplo 2, entre las
regiones correspondientes al promotor pGAL1 y el terminador
tCYC1 del plásmido p416-promGAL1 (Mumberg, D.
et al (1994) Nucleic Acids Res, 22,
5767-5768). Para ello, utilizando dos productos de
PCR independientes amplificados a partir de pMAB7 con las parejas de
oligonucleótidos MAO91(SEQ ID Nº 40) y MAO92 (SEQ ID Nº 41),
ó MAO93 (SEQ ID Nº 42) y MAO94 (SEQ ID Nº 43), se obtuvo, mediante
desnaturalización y renaturalización de la mezcla de ambos
productos de PCR, un producto híbrido con extremos compatibles con
los generados por el corte con las enzimas de restricción
XbaI y XhoI, que fue insertado en
p416-promGAL1 previamente digerido con estas
enzimas. El vector resultante pMAB10-5 (Figura 4)
puede ser utilizado de manera similar al plásmido parental pMAB7,
para la expresión de fusiones a LYTAG2 en levadura.
Para demostrar la utilidad del sistema de
expresión y purificación descrito en este ejemplo, se transformó la
cepa de levadura W303-1A (MATa
ura3-1 leu2-3, 112
trp1-1 can1-100
ade2-1 his3-11, 15) con un
plásmido derivado del vector pMAB 10-5, obtenido
clonando entre los sitios SphI y HindIII de éste un
fragmento SphI-HindIII de 3128 pb obtenido del
plásmido pMAB3-lacZ descrito en el Ejemplo 1, y que
porta la secuencia codificante de la
\beta-galactosidasa. El plásmido resultante,
pMAB10-LacZ, contiene una fusión traduccional entre
las secuencias codificantes del polipéptido LYTAG2 y de la
\beta-galactosidasa idéntica a la que expresa el
plásmido bacteriano pMAB9-lacZ descrito en el
Ejemplo 2.
Las células del transformante de la cepa
W303-1A con el plásmido pMAB10-LacZ,
cultivado en medio sintético SD sin uracilo (para seleccionar la
presencia del plásmido, que complementa la mutación ura3 de
la cepa de levadura), y con 2% galactosa como fuente de carbono, se
recogieron por centrifugación, y se lisaron por rotura mecánica con
esferas de vidrio. El extracto obtenido se procesó y la proteína de
fusión LYTAG2-LacZ se purificó y analizó de manera
similar a como se describe en el Ejemplo 1. Los resultados se
muestran en la Figura 5.
\vskip1.000000\baselineskip
En el presente ejemplo se muestra cómo una
secuencia de unión a colina que incluye LYTAG2, puede permitir la
purificación de polipéptidos fusionados en presencia de ciertos
detergentes de utilidad para purificar proteínas hidrofóbicas. En
ciertos casos, la hidrofobicidad de la proteína fusionada a un
derivado de C-LytA puede hacer necesario el uso de
detergentes con el fin de incrementar su solubilidad y/o evitar
interacciones no específicas de la misma con la matriz de afinidad
o con otras proteínas (Hjerten. S. et al (1988) Biochim.
Biophys. Acta. 939, 476-84; Moldes, C., et
al (2004), Appl. Environ. Microbiol. 70,
4642-4647; Ivanov, A.V. et al. (2004). J.
Biol. Chem. 279, 29832–29840; Yueh, S.C.H. et al, (2006)
J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. (en
prensa)). Por esta razón, se comprobó el efecto de la presencia
de varios de los detergentes más comúnmente empleados en la
solubilización de proteínas sobre el proceso de purificación de un
derivado de C-LytA en DEAE-celulosa.
El derivado de C-LytA utilizado (SEQ ID Nº 44) es
una versión recortada del mismo, que contiene los aminoácidos 32 a
162 de la secuencia SEQ ID Nº 2, y por tanto contiene a la secuencia
LYTAG2 descrita previamente (SEQ ID Nº 3), y puede ser expresado a
partir del plásmido pCE17 (Sánchez-Puelles, et
al (1990) Gene, 89, 69-75).
Cultivos de 200 ml de la cepa RB791 transformada con el plásmido
pCE 17, crecidos a 37ºC e inducidos con lactosa al 2% durante 16
horas se centrifugaron y se sonicaron en tampón 20 mM fosfato
potásico pH 7,0, 150 mM NaCl, y conteniendo los detergentes que se
muestran en la Tabla 2.
A continuación los extractos se añadieron sobre
una columna de DEAE-celulosa (Sigma), equilibrada
en el mismo tampón. La columna fue lavada exhaustivamente con un
tampón conteniendo 20 mM fosfato potásico pH 7,0 más 1,5 M NaCl y
el detergente utilizado, y finalmente la proteína se eluyó
utilizando un tampón conteniendo 20 mM fosfato potásico pH 7,0 más
150 mM NaCl, el detergente utilizado y 150 mM cloruro de colina.
Como se deduce de los resultados mostrados en la Tabla 2, el
procedimiento de purificación admite en general la presencia de una
moderada concentración de detergentes sin menoscabo significativo de
su rendimiento, lo que abre la puerta a la inmovilización y/o
purificación de proteínas hidrofóbicas como las de membrana.
\vskip1.000000\baselineskip
El presente ejemplo muestra cómo se puede
realizar un método para la separación de la etiqueta de
purificación de manera que el sitio de proteolisis específica quede
más expuesto a la endopeptidasa específica de sitio elegida para
separar la etiqueta del polipéptido fusionado. La figura 6 muestra
el espectro de dicroísmo circular en la región del ultravioleta
lejano de la proteína de secuencia SEQ ID Nº 44 registrado en
tampón fosfato 20 mM, pH 7,0, en ausencia de colina, y en presencia
o ausencia de SDS 2 mM. Puede verse que la proteína pierde
completamente su estructura tridimensional en presencia de la
concentración citada de SDS, la cual está por debajo de su
concentración micelar crítica en estas condiciones (3,25 mM). No se
tiene constancia en la literatura científica de ninguna proteína que
se despliegue completamente en presencia de una concentración tan
baja de SDS. Por otro lado, la separación de los "tags" de
afinidad mediante proteólisis suele estar dificultada por la
inaccesibilidad de la proteasa a su punto de corte debido a la
ocultación de éste último por el plegamiento de los propios
polipéptidos fusionados. Por lo tanto, nuestros resultados sugieren
que la escisión proteolítica de SEQ ID Nº 44 en una proteína de
fusión puede facilitarse gracias al desplegamiento específico del
módulo de unión a colina mediante el empleo de concentraciones
submicelares de SDS, las cuales no deberian afectar ni a la
estructura del polipéptido fusionado, ni a la actividad de muchas
proteasas, tales como el factor Xa (GST Gene Fusion System
Handbook, GE Healthcare), la endoproteinasa
Lys-C, endoproteinasa Glu-C
(proteasa V8), endoproteinasa Arg-C, pronasa,
tripsina, quimotripsina, elastasa (ver referencias en:
http.//www.cbs.cnrs.fr/MAJ/LOGICIELS/CLOE/cloedoc/PROWL_protease_profil.html),
etc...
\vskip1.000000\baselineskip
En el presente ejemplo se muestra cómo se puede
modificar la secuencia de la etiqueta de purificación para que
pueda resistir procesos de purificación por afinidad en condiciones
de altas temperaturas, así como métodos para hacerlo. La
utilización de enzimas inmovilizadas en biorreactores a altas
temperaturas posee un alto interés industrial, ya que en estas
condiciones i) la velocidad de reacción se incrementa
sustancialmente; ii) disminuye la viscosidad de reactivos y
productos, y iii) el biorreactor trabaja en condiciones adversas
para el crecimiento de microorganismos contaminantes. La figura 7
muestra el perfil de estabilidad de la proteína SEQ ID Nº 44 unida
a DEAE-celulosa en función de la temperatura. En
este experimento, 1 mg de proteína se inmovilizó en 1 ml de
DEAE-celulosa (Sigma). A continuación, la resina se
calentó durante 30 minutos, y se dejó enfriar durante 1 hora. Tras
un lavado con tampón fosfato 20 mM, pH 7,0, se procedió a eluir la
proteína con tampón fosfato 20 mM, pH 7,0 más 150 mM colina. Este
resultado indica que la eficacia de SEQ ID Nº 44 como "tag" de
afinidad disminuye bruscamente por encima de 65ºC. En este sentido,
se ha descrito que las proteínas de los organismos termófilos
adquieren su termoestabilidad frecuentemente gracias a la presencia
de interacciones electrostáticas favorables en la superficie
molecular (Vieille, C. y Zeikus, G.J. (2001). Microbiol. Mol.
Biol. Rev. 65, 1-43). Por este motivo, tras la
inspección de la estructura tridimensional descrita para la
proteína C-LytA (Fernández-Tornero,
C. et al (2001). Nat. Struct. Biol. 8,
1020-1024), observamos que las sustituciones Asn51
\rightarrow Lys, Ser52 \rightarrow Lys, Thr85 \rightarrow Lys
y Thr108 \rightarrow Lys podrían incrementar la estabilidad
térmica del módulo SEQ ID Nº 44. En consecuencia, tomando como base
el plásmido pCE17 (Sánchez-Puelles, et al
(1990) Gene, 89, 69-75) se procedió a
la introducción consecutiva de las mutaciones citadas mediante PCR
utilizando las parejas de oligonucleótidos SEQ ID Nº 45 y SEQ ID Nº
46, SEQ ID Nº 47 y SEQ , ID Nº 48, y SEQ ID Nº 49 y SEQ ID Nº 50,
obteniéndose de esta manera el plásmido pCE17m4, el cual permite la
expresión de la variante mutante SEQ ID Nº 51, que contiene al
módulo LYTAG2t (SEQ ID Nº 4). La proteína SEQ ID Nº 51 se purificó
mediante cromatografía de afinidad en DEAE celulosa con el mismo
procedimiento descrito en el Ejemplo 4. La proteína mantiene su
afinidad por la resina a temperaturas de hasta 90ºC en los mismos
ensayos que los realizados con SEQ ID Nº 44, con un aceptable
rendimiento de purificación (> 80%, Figura 7), y por lo tanto
podría ser utilizada para la inmovilización y/o purificación de
proteínas termoestables.
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En el siguiente ejemplo se muestra cómo la
etiqueta de purificación modificada en ciertos residuos puede
permitir su purificación a pHs más ácidos. El punto isoeléctrico
teórico del polipéptido SEQ ID Nº 44 es de 5,1, lo cual
implica que la solubilidad esperada para esta proteína adquiere su
valor mínimo a este valor de pH. Para investigar cómo podría afectar
esta circunstancia al procedimiento de purificación, se realizaron
tres purificaciones idénticas partiendo de cultivos de 200 ml de la
cepa RB791 [pCE17m4] crecidos e inducidos tal y como se especifica
en el Ejemplo 4. Tras la centrifugación de las muestras, el
precipitado celular se resuspendió y sonicó en tampón fosfato
sódico 20 mM, pH 7,0, en tampón acetato sódico 20 mM, pH 5,0, o en
tampón glicina 20 mM, pH 3,0. Las purificaciones se llevaron a cabo
como se especifica en el Ejemplo 4, pero manteniendo el pH
especificado en cada caso, y en ausencia de Tritón
X-100. Los resultados se muestran en la Tabla 3.
Puede comprobarse que el rendimiento de purificación de la
secuencia SEQ ID Nº44 a pH 5,0 o inferior es prácticamente nulo.
\vskip1.000000\baselineskip
Por otro lado, la inserción de cuatro lisinas
incrementa el punto isoeléctrico de SEQ ID Nº 51 hasta 8,33, lo que
posibilita una recuperación de la solubilidad a pH ácido y por lo
tanto una evidente mejora en el rendimiento de purificación a
partir de la cepa RB791 [pCE 17m4] (Tabla 3). Estos resultados
abren la posibilidad de la utilización de LYTAG2t para la
inmovilización y/o purificación de proteínas en condiciones
moderadamente ácidas.
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Figura 1. (A), esquema de las versiones
reducidas de C-LytA analizadas. (B), expresión y
purificación de las fusiones
mini-C-LytA-HL4GSNIa
a LacZ (o de LacZ, como control). 1 proteína total del cultivo no
inducido; 2, proteína total del cultivo inducido; 3, fracción no
soluble del extracto del cultivo inducido; 4, fracción soluble del
extracto del cultivo inducido; 5, proteína no retenida en la
resina; 6, proteína lavada de la resina; 7, 8 y 9, fracciones
consecutivas de elución con colina; M, marcador de pesos moleculares
(BioRad).
Figura 2. Vectores bacterianos para la expresión
de fusiones a LYTAG2 en E. coli.
Figura 3. Expresión comparada de una fusión
LYTAG2-LacZ frente a una fusión a
C-LytA-LacZ en E. coli, bajo
el control del sistema nahR/Psal xylS2/Pm inducible por
salicilato, en presencia de distintas concentraciones de dicho
inductor en el medio de cultivo.
Figura 4. Vector eucariótico para la expresión
de fusiones a LYTAG2 en S. cerevisiae.
Figura 5. Expresión y purificación de una fusión
a LYTAG2-LacZ en S. cerevisiae. 1, marcador
de pesos moleculares (BioRad); 2, proteína total soluble del cultivo
inducido; 3, proteína no retenida en la resina; 4, proteína lavada
de la columna; 5, fracción de elución con colina.
Figura 6. Espectros de dicroísmo circular a 20ºC
en el ultravioleta lejano de la proteína LYTAG2 en tampón fosfato
20 mM, pH 7,0 (línea continua) y en el mismo tampón con 2,0 mM SDS
(línea discontinua).
Figura 7. Rendimiento de purificación de LYTAG2
(círculos oscuros) y LYTAG2t (círculos claros) en
DEAE-celulosa.
<110> UNIVERSIDAD MIGUEL HERNÁNDEZ
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<120> DOMINIOS PROTEICOS DE AFINIDAD A
COLINA PARA MEJORAR LA EXPRESIÓN, INMOVILIZACIÓN Y PURIFICACIÓN DE
POLIPÉPTIDOS
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<130> 200700281
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<160> 51
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<170> PatentIn version 3.4
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<210> 1
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<211> 481
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Secuencia completamente
artificial
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 162
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<212> PRT
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<223> Secuencia completamente
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\hfill30
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<210> 7
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artificial
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<210> 41
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\hskip-.1em\dddseqskiptcagctaatt aagcttggta ccg
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<210> 42
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<400> 46
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\hfill31
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\hfill35
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<211> 35
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Claims (21)
1. Secuencia nucleotídica aislada, derivada de
la SEQ1 ID Nº 1, que comprende una secuencia codificante de un
polipéptido derivado del dominio de afinidad a colina de la
proteína LytA de S. pneumoniae, caracterizado
porque:
- (a)
- tiene afinidad por soportes sólidos con aminas terciarias o cuaternarias en su superficie.
- (b)
- la interacción con los soportes puede interrumpirse por adición de colina eq. solución a una concentración superior a 30 mM,
- (c)
- tiene un máximo de 162 aminoácidos, y un máximo de 5 de las repeticiones de unión a colina (ChBRs) presentes en el polipéptido de la secuencia SEQ1 ID Nº 2:- codificado en la secuencia SEQ1 ID Nº 1.
- (d)
- fusionado a otro polipéptido puede permitir su purificación por afinidad a 10 soportes descritos en (a) en condiciones que incluyen la (b).
- (e)
- codifica un polipéptido cuyos niveles de expresión, solubilidad y/o estabilidad, y afinidad por los soportes descritos en (a) en condiciones extremas son superiores:. a los de la secuencia SEQ ID Nº 2 completa.
2. Secuencia nucleotídica según la
reivindicación 1 caracterizada porque, fusionada a la:
secuencia codificante de otro polipéptido, permite la expresión de
éste como un, polipéptido híbrido, a un nivel superior al del
polipéptido híbrido resultante de una, fusión equivalente con la
secuencia codificante de SEQ ID Nº 2 completa.
3. Secuencia nucleotídica según las
reivindicaciones 1 y 2 caracterizada porque contiene una
región, añadida a uno de sus extremos, y que codifica para una
secuencia polipeptídica con estructura en hélice \alpha.
4. Secuencia nucleotídica según las
reivindicaciones 1 a 3 caracterizada porque comprende una
secuencia codificante del polipéptido de secuencia SEQ ID Nº 3.
5. Mutantes de la secuencia nucleotídica que
codifica el polipéptido SEQ ID Nº 2, y que se caracterizan
porque:
- (a)
- mejoran las propiedades del polipéptido SEQ ID Nº 2 descritas en la reivindicación 1, a temperaturas elevadas, y/o
- (b)
- mejoran las propiedades del polipéptido SEQ ID Nº 2 descritas en la reivindicación 1, a valores extremos de pH.
6. Secuencia nucleotídica de las reivindicación
5 con mutaciones que determinan una, algunas o todas las
sustituciones siguientes con respecto a la secuencia SEQ ID Nº 2:
Asn5l a Lys, Ser52 a Lys, Thr85 a Lys y Thr108 a Lys.
7. Secuencia nucleotídica de la reivindicación 6
caracterizada porque comprende una secuencia codificante del
polipéptido de secuencia SEQ ID Nº 51.
8. Secuencia nucleotídica derivada de la de la
reivindicación 4 caracterizada porque comprende una
secuencia codificante del polipéptido de secuencia SEQ ID Nº 4.
9. Secuencia nucleotídica de las
reivindicaciones 1 a 3 que es al menos un 50% idéntica a las
secuencias que codifican los polipéptidos SEQ ID Nº 3 o SEQ ID Nº
4.
10. Secuencia nucleotídica derivada de la de la
reivindicación 4, caracterizada porque incorpora una región
codificante para una secuencia de aminoácidos reconocible por una
endopeptidasa de corte específico, y que se localiza en uno de los
extremos, el correspondiente a la secuencia codificante del
polipéptido con estructura en hélice \alpha.
11. Vectores de DNA que contienen una de las
secuencias de las reivindicaciones 1 a 10.
12. Vectores según la reivindicación 11,
caracterizados porque la secuencia de las reivindicaciones 1
a 10 se encuentra situada bajo el control de un promotor de la
transcripción, y adyacente a una región con dianas para enzimas de
restricción, o de un sitio de recombinación específica, que permite
la fusión traduccional de dicha secuencia a la del polipéptido que
se quiere inmovilizar o purificar, a sus extremos amino o
carboxilo.
13. Vectores según la reivindicación 12,
caracterizados porque el promotor es activo en células de
organismos procariotas o eucarióticas como levaduras, hongos
filamentosos, plantas, o animales.
14. Vectores según la reivindicación 13,
caracterizados porque el promotor es el promotor Pm de
Pseudomonas putida, o derivados del mismo.
15. Vectores según la reivindicación 14,
caracterizados porque el promotor es derivado de la región
promotora localizada entre los genes GAL12 y GAL10 de
S. cerevisiae.
16. Células transformadas que contengan vectores
según las reivindicaciones 11 a 15, en forma episómica o integrados
en DNA genómico de dichas células.
17. Procedimiento de inmovilización de
polipéptidos por fusión a una secuencia:. polipeptídica según las
reivindicaciones 1 a 10 que comprende:
- (a)
- el uso de un sustrato sólido con la superficie cubierta por aminas terciarias o cuaternarias al que se une por afinidad el polipéptido de las reivindicaciones 1 a 10.
- (b)
- una solución donde está solubilizado el polipéptido de fusión al polipéptido anterior, que puede tener una concentración de 0 mM a 1500 mM de NaCl, hasta 3 mM de colina, un detergente como SDS (hasta 2 mM) o Triton X-100 (hasta 1.5%) y un pH de 3 a 9.
- (c)
- una solución de lavado con una concentración de NaCl igual o más concentrada que en (b) y que puede aplicarse a la resina con el polipéptido de fusión a una temperatura de 4ºC a 95ºC.
- (d)
- una solución para eluir eventualmente la proteína de fusión que contiene colina a una concentración superior a 30 mM.
18. Procedimiento según la reivindicación 17
donde la amina terciaria o cuaternaria es dietilaminoetanol (DEAE),
trimetilamonio (QAE), colina, o cualquier compuesto similar.
19. Procedimiento según las reivindicaciones 17
y 18 donde el sustrato es un polímero del tipo de las agarosas, los
dextranos, las celulosas, las siliconas, el metacrilato, los
poliestirenos, u otros tipos de polímeros que puedan tener en su
superficie aminas terciarias o cuaternarias de las que unen la
secuencia polipeptídica de las reivindicaciones de 1 a 10.
20. Procedimiento de
sobre-expresión y purificación de polipéptidos
utilizando los vectores de las reivindicaciones 11 a 15, la
secuencia heteróloga fusionada a la secuencia del tipo de las
reivindicaciones 1 a 10, y el procedimiento de inmovilización de
proteínas de fusión de las reivindicaciones 17 a 19.
21. Uso de la secuencia de las reivindicaciones
1 a 10 y del procedimiento de las reivindicaciones 17 a 20 para la
inmovilización y purificación de polipéptidos de uso terapéutico,
diagnóstico y en cualquier tipo de industria donde se necesiten
proteínas recombinantes.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200700281A ES2321788B1 (es) | 2007-01-29 | 2007-01-29 | Dominios proteicos de afinidad a colina para mejorar la expresion, inmovilizacion y purificacion de polipetidos. |
| PCT/IB2008/051314 WO2008117259A1 (es) | 2007-01-29 | 2008-01-29 | Dominios proteicos de afinidad a colina para mejorar la expresion, inmovilizacion y purificacion de polipeptidos |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200700281A ES2321788B1 (es) | 2007-01-29 | 2007-01-29 | Dominios proteicos de afinidad a colina para mejorar la expresion, inmovilizacion y purificacion de polipetidos. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2321788A1 ES2321788A1 (es) | 2009-06-10 |
| ES2321788B1 true ES2321788B1 (es) | 2010-03-11 |
Family
ID=39788076
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200700281A Active ES2321788B1 (es) | 2007-01-29 | 2007-01-29 | Dominios proteicos de afinidad a colina para mejorar la expresion, inmovilizacion y purificacion de polipetidos. |
Country Status (2)
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|---|---|
| ES (1) | ES2321788B1 (es) |
| WO (1) | WO2008117259A1 (es) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2032717A6 (es) * | 1991-03-22 | 1993-02-16 | Consejo Superior Investigacion | Procedimiento para la inmovilizacion y/o purificacion en un solo paso de proteinas de fusion de interes bio-tecnologico. |
| JP2006512047A (ja) * | 2002-06-11 | 2006-04-13 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | 免疫原性組成物 |
-
2007
- 2007-01-29 ES ES200700281A patent/ES2321788B1/es active Active
-
2008
- 2008-01-29 WO PCT/IB2008/051314 patent/WO2008117259A1/es active Application Filing
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| ARAI, R. et al. "{}Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein"{}. PROTEIN ENGINEERING. 01.08.2001. Vol. 14, N$^{o}$. 8, páginas 529-532, todo el documento. * |
| MAESTRO, B. et al. "{}Accumulation of partly folded states in the equilibrium unfolding of the pneumococcal choline-binding module C-LytA"{}. BIOCHEMICAL JOURNAL. 15.04.2005. Vol. 387, N$^{o}$. 2, páginas 479-488, todo el documento. * |
| MAESTRO, B. et al. "{}Extensive unfolding of the C-LytA choline- binding module by submicellar concentrations of sodium dodecyl sulfate"{}. FEBS LETTERS. 06.02.2007 (disponible en línea 11.01.2007). Vol. 381, n$^{o}$ 3, páginas 375-381, todo el documento. * |
| MAESTRO, B. et al. "{}Inhibition of pneumococcal choline-binding proteins and cell growth by esters of bicyclic amines"{}. THE FEBS JOURNAL. Enero 2007. Vol. 274, N$^{o}$. 2, páginas 364-476, resultados y Tabla 1. * |
| USOBIAGA, P. et al. "{}Structural organization of the major autolysin from Streptococcus pneumoniae"{}. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY. 22.03.1996. Vol. 271, N$^{o}$. 12, páginas 6832-6838, figura 5. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2008117259A1 (es) | 2008-10-02 |
| ES2321788A1 (es) | 2009-06-10 |
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