TWI491731B

TWI491731B - 用以表現和／或製備細菌視紫紅質融合膜蛋白的載體、系統與方法

Info

Publication number: TWI491731B
Application number: TW102136162A
Authority: TW
Inventors: Andrew H J Wang; Min Feng Hsu; Chii Shen Yang; Hsu Yuang Fu
Original assignee: Academia Sinica
Priority date: 2012-10-06
Filing date: 2013-10-07
Publication date: 2015-07-11
Also published as: US9067985B2; US20140099667A1; TW201414839A

Description

用以表現和/或製備細菌視紫紅質融合膜蛋白的載體、系統與方法

本發明是有關於膜蛋白之技術領域，且特別是有關於一種用來表現膜蛋白的表現系統。

穿膜蛋白(integral membrane proteins)是一種涉及多種生物功能、不可或缺的蛋白類型，包括G蛋白耦合受體(G-protein coupled receptors,GPCRs)、通道(channels)、運輸蛋白(transporters)及酵素(enzymes)。在人類基因組中，經預測有約20-35%的開放式閱讀框架(open reading frames,ORFs)可編碼產生穿膜蛋白。目前超過50%的藥物標的為穿膜蛋白。這些具有藥理意義的穿膜蛋白之結構資訊，有助於設計出更佳的藥物分子。然而，即使相關領域存在對於辨識穿膜蛋白結構的需求，目前可得到的膜蛋白結構數量還是遠少於可溶性蛋白(soluble proteins)。與穿膜蛋白純化相關的主要障礙包含產量不足，以及無法得到可進行繞射分析的優質晶體(diffraction quality crystals)。

本發明一方面是有關於一種表現載體，包含：a)一第一核酸，用以編碼出一細菌視紫紅質(bacteriorhodopsin)，該細菌視紫紅質的胺基酸序列至少80%相同於序列編號：3或5之序列；b)一第二核酸，用以編碼出一組胺酸標籤(polyhistidine tag)，其係位於該第一核酸之下游；c)一多重轉殖點(multiple cloning site)，其係位於該第二核酸之下游，其中該多重轉殖點配置成可插入一第一蛋白酶切割點(protease cleavage site)之核酸序列，與一標的蛋白(target protein)之核酸序列；以及d)一啟動子(promoter)，其係可操作式地連結至該第一核酸、該第二核酸以及該多重轉殖點。

依據本發明的不同實施方式，該細菌視紫紅質為80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%相同於序列編號：3或5之序列。雖然在此處是基於特定胺基酸序列以及指定的序列相似度來描述本發明提出的胺基酸，當可想見，本發明亦涵蓋與具體所述胺基酸序列具有保留性變異(conservative variation)的胺基酸序列。因此，相對於序列編號：3或5具有保留性變異的胺基酸序列亦落在本發明之範疇內。

在本發明的較佳實施方式中，該細菌視紫紅質對應於序列編號：5的第94個殘基被突變為天冬醯胺(Asn)。舉例來說，在一實施方式中，將序列編號：5的第94個殘基由天門冬胺酸(Asp)突變為天冬醯胺(Asn)，因此所得到的細菌視紫紅質具有序列編號：1之胺基酸序列。

在本發明的某些實施方式中，該組胺酸標籤包含六或更多個組胺酸殘基。舉例來說，該組胺酸標籤可能由6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30或更多組胺酸殘基所組成。

依據某些例示的實施方式，該第一蛋白酶切割點為一煙草蝕紋病毒(Tobacco Etch Virus)蛋白酶切割點。

在某些可任選的實施方式中，該表現載體可更包含一第二蛋白酶切割點之核酸序列，其係位於該第一核酸與該第二核酸之間。在一實施例中，該第二蛋白酶切割點為一Xa因子切割點。

同樣可任選地，該表現載體可更包含一連結子(linker)，其係位於該第一蛋白酶切割點之核酸序列，與該標的蛋白之核酸序列之間。

依據本發明之不同實施方式，該第一核酸至少80%相同於序列編號：6或7之序列。舉例來說，該序列相似度可為80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%。在一實施方式中，該第一核酸的核苷酸序列為序列編號：8之序列。

在本發明的另一實施方式中，該多重轉殖點包含BamH1及Xho1之限制酶位點(restriction enzyme sites)。

在本發明的另一實施方式中，該標的膜蛋白為一穿膜蛋白。

另一方面，本發明是有關於一融合膜蛋白表現系統，包含在依據上述實施方式製造的表現載體之該多重轉殖點中插入該第一蛋白酶切割點之核酸序列，以及該標的蛋白之核酸序列，其中該標的蛋白為一穿膜蛋白。

依據本發明之某些可任選的實施方式，該細菌視紫紅質的胺基酸序列為序列編號：1、3或5之胺基酸序列。在某些實施方式中，該第一核酸具有序列編號：6、7或8之核苷酸序列。

依據某些可任選的實施方式，該啟動子為一T7啟動子(T7 promoter)。

同樣可任選地，該融合膜蛋白表現系統之表現載體具有一第二蛋白酶切割點之核酸，其係位於該第一核酸與該第二核酸之間。此外，該融合膜蛋白表現系統之表現載體具有一連結子，其係位於該第一蛋白酶切割點之核酸序列與該標的蛋白之核酸序列之間。

舉列來說，依據下述某些操作例，該細菌視紫紅質為Hm BRI/D94N突變型(mutant)，其係具有序列編號：1之胺基酸序列，該啟動子為一T7啟動子，該第一蛋白酶切割點為一煙草蝕紋病毒蛋白酶切割點，該第二蛋白酶切割點為一Xa因子切割點，且該組胺酸標籤由12個組胺酸殘基所組成。在其餘操作例中，該細菌視紫紅質為Hm BRI野生型(wildtype)，其係具有序列編號：5之胺基酸序列，或為Hw BR野生型，其係具有序列編號：3之胺基酸序列。

於另一態樣中，本發明是有關於一包含前述表現載體或融合膜蛋白表現系統之宿主細胞。

在本發明的一實施方式中，該宿主細胞表現一融合蛋白，其係包含該細菌視紫紅質及該標的膜蛋白，其中該標的膜蛋白之N端(N-terminus)位於細胞質(cytoplasm)，且該宿主細胞呈現紫色。

於又一態樣中，本發明是有關於一種用以表現一標的膜蛋白之方法，包含在一宿主(如，一大腸桿菌細胞(E.coli cell))細胞膜內，誘發上述融合膜蛋白表現系統同時表現並折疊一融合蛋白。舉例來說，該融合蛋白包含一細菌視紫紅質及一與該細菌視紫紅質耦合之標的蛋白，其中該細菌視紫紅質可以是野生型嗜鹽古生菌(Haloarcula marismortui )細菌視紫紅質(Hm BRI)，突變型嗜鹽古生菌細菌視紫紅質(Hm BRI/D94N)，或是野生型鹽方扁平古菌(Haloquadratum walsbyi )細菌視紫紅質(Hw BR)其中任一種。

在本發明的一實施方式中，該誘發步驟包含加入視黃醛(retinal)使位於宿主細胞(如大腸桿菌細胞)細胞膜內之該融合蛋白來產生折疊。

於再一態樣中，本發明是有關於一用以生產一標的膜蛋白之方法，包含下述步驟：a)藉由如請求項1所述之表現載體中的多重轉植點，插入該第一蛋白酶切割點之核酸，與該標的膜蛋白之核酸，來建構出一融合膜蛋白表現系統，其中該融合蛋白包含細菌視紫紅素以及與之耦合的標的膜蛋白；b)以該融合膜蛋白表現系統來轉形(transform)一宿主細胞；c)誘發該轉形的宿主細胞於其細胞膜上同時表現及折疊該融合蛋白；d)由該轉形的宿主細胞中分離出該融合蛋白；e)以一清潔劑(detergent)萃取出步驟(d)之該融合蛋白；f)純化步驟(e)中所萃出的該融合蛋白；g)以一第一蛋白酶分解步驟(f)中所純化的該融合蛋白，此第一蛋白酶可針對該第一蛋白酶切割點作用，進而自該融合蛋白中釋放出該標的膜蛋白；以及h)收集該標的膜蛋白。

在本發明的一實施方式中，該宿主細胞為一大腸桿菌細胞，且步驟(c)包含加入視黃醛使位於大腸桿菌細胞膜內之該融合蛋白可產生折疊。

舉例來說，步驟(d)是藉由超速離心法(ultracentrifugation)來執行；然而，本方法並不侷限於此，且可經由其他分離該融合蛋白之方法而得。

在本發明的一實施方式中，步驟(f)包含以下步驟：將該融合蛋白載入至一第一親和管柱(affinity column)；以及由該第一親和管柱溶析出該融合蛋白。

在本發明的一實施方式中，步驟(h)包含以下步驟：將步驟(g)所得的分解產物載入至一第二親和管柱；並收集流經該第二親和管柱中的流通液(flow-through)。

在本發明的一實施方式中，上述的方法更包含，在步驟(h)之後，將所收集之該標的膜蛋白載入至一分子篩選層析管柱(size exclusion column)中；並由此分子篩選層析管柱溶析出該標的膜蛋白。

在本發明的一實施方式中，上述方法更包含，在步驟(h)之後，將該標的膜蛋白結晶。

在本發明的一實施方式中，步驟(e)所使用的清潔劑不是月桂基二甲基氧化胺(lauryldimethylamine-N-oxide,LDAO)。依據本發明不同實施方式，步驟(e)所使用的清潔劑可以是正癸基-β-D-麥芽糖苷(n-decyl-β-D-maltoside,DM)、正十一基-β-D-麥芽糖苷(n-undecyl-β-D-Maltoside,UDM)、正十二基-β-D-麥芽糖苷(n-dodecyl-β-D-maltoside,DDM)、正辛基-β-D-葡萄糖苷(n-octyl-β-D-glucoside,OG)或是正壬基-β-D-葡萄糖苷(n-nonyl-β-D-glucoside,NG)。

在本發明另一實施方式中，步驟(g)所使用的該第一蛋白酶為一帶有組胺酸標籤的TEV蛋白酶。

藉由較佳實施方式的說明與附隨圖式，將可使本發明的各種態樣更為清楚，且可在不悖離本揭示內容提出之新穎概念的精神與範疇之前提下，對其進行不同的變異與修飾。

附隨圖式說明本發明中一或多種實施方式，佐以文字敍述，用以解釋本發明之原理。在不同圖式間，儘可能利用相同的元件符號來指稱實施例中相同或相似的元件。

第1圖繪示出一演化樹狀圖(phylogenic tree)，以及細菌視紫紅質的多重序列比對(alignment)。(A)嗜鹽古生菌細菌視紫紅質之演化樹狀圖。(B)利用ClustalW(Thompson et al.(1994)CLUSTAL W：“Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting,position-specific gap penalties and weight matrix choice”Nucleic Acids Res 22：4673-4680)比對Hs BR(PDB編碼：1C3W)、Hm BRI、BRII及Hw BR。以A到G來標記七個穿透膜(transmembrane)的雙螺旋(helices)。以圓形標記質子受體(proton acceptor)殘基(Asp)。以三角形標記Hm BRI/D94N的位置，且以星號標記藉由希夫鹼作用(Schiff base interaction)而鍵結至視黃醛的該離胺酸(Lys)殘基；第2圖為一pHmbop1 /D94N-uppP 系統之轉殖策略示意圖。(A)將所有bop基因建構於pET21b，其C端(Cterminal)帶有(組胺酸)₆ 標籤。(B)將標的基因，即大腸桿菌之uppP 基因，建構於pET28a，其5’端具有6個組胺酸標籤、凝血酶(thrombin)切割點及T7標籤。將Hmbop1 /D94N(bop1 為BRI的基因)建構於pET21b，其3’ 端具有一6個組胺酸標籤。將建構於pET28a中之該6個組胺酸-凝血酶切割點-T7標籤-uppP 片段次轉殖(subclone)至Hmbop1 /D94N的3’端。經數次改進後，製備出可用於融合蛋白表現的pHmbop1 /D94N-uppP 。為建構pHmbop1 /D94N-caiT ，將鏈球菌標籤(strep tag)插入至該caiT 基因之3’端；第3圖為(A)經表現的大腸桿菌細胞沉澱物(pellets)。以pET21b(左)、HmBRI(中)及HmBRI/D94N(右)轉形大腸桿菌C43(DE3)，經異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)及視黃醛誘發，而得到經表現的細胞沉澱物。(B)HmBRI/D94N的清潔劑篩選。檢測各式常用的清潔劑，包含DM、UDM、DDM、OG、NG以及LDAO。灰色柱狀代表經清潔劑萃取的膜分層(membrane fraction)總蛋白(A280)，而開放柱狀代表經清潔劑萃取的膜分層中在A552的HmBRI/D94N之專一吸收部分；第4圖為BR之定性分析結果。(A)BR之吸收光譜。所繪製的紫外光-可見光(UV-Vis)掃描範圍包括250至750nm，且吸收高峰為552nm。(B)該純化的HmBRI/D94N於聚丙烯醯胺膠體電泳(SDS-PAGE)上顯示為單一亮帶(band)，且為一紫色溶液。純化的HmBRI/D94N之分子篩選層析法(SEC)結果(C)與晶體(D)，以及HwBR之分子篩選層析法結果(E)與晶體(F)。(G)HmBRI/D94N的X光繞射(X-ray diffraction)圖式及(H)HmBRI/D94N的結構模型；第5圖為融合蛋白的表現結果。(A)純化該 HmBRI/D94N融合膜蛋白之流程圖。步驟I：大腸桿菌C43或C41(DE3)表現。步驟II：以超速離心法收集該紫色的膜分層。步驟III：以清潔劑萃取萃取該紫膜。步驟IV：將該紫蛋白溶液載入至該第一金屬固定化親和性層析(Immobilized metal ion affinity chromatography,IMAC)管柱，並收集該溶析出的融合蛋白。步驟V：利用TEV蛋白酶分解該融合蛋白。步驟VI：反相IMAC管柱純化，由流通液收集該標的蛋白。步驟VII：由分子篩選層析法(Size exclusion column(SEC)chromatography)得到一單一分散高峰(monodispersed peak)。步驟VIII：結晶。(B)該HmBRI/D94N-UppP融合蛋白之結構預測(topology prediction)。(C)HmBRI/D94N(DN)、DN-UppP及DN-CaiT之表現細胞沉澱物。(D)UppP(深紫色柱狀)與CaiT(淡紫色柱狀)在不同系統的表現量；1.基因建構於pET51；2.由HmBRI/D94N融合系統純化的蛋白；以及3.已知文獻中的蛋白表現量，a資料是取自於Ghachi et al.(2004)(J Biol Chem 279：30106-30113)，及b資料是取自於Vinothkumar et al.(2006)(J Biol Chem 281：4795-4801)；第6圖為UppP的純化與功能檢測結果。(A)UppP純化的最終步驟中，該單一分散高峰之分層在聚丙烯醯胺膠體電泳中顯示為單一亮帶。(B)利用Fpp作為受質(substrate)，UppP的磷酸酶活性(phosphatase activity)與時間相關；第7圖為CaiT的定性結果。(A)CaiT純化的分子篩選層析管柱。(B)結合了肉鹼(L-carnitine)的CaiT。(C)CaiT晶體。(D)晶體之X光繞射，箭頭所指處解析度高達6.5Å；以及第8圖為載體標示圖(maps)：(A)uppP轉殖於pET28a；(B)Hmbop1/D94N轉殖於pET21b；以及(C)Hmbop1/D94N-uppP轉殖於pET21b。

下文提出多種實施例以更具體地說明本發明，這些實施例僅為例示，因為相關領域中具有通常知識者可輕易想見各種修改與變異。在此將詳加敍述本發明之不同實施方式。除非另外指明，否則在本文及附隨之請求項範圍中所述及之單數型式詞，「一(“a“,“an”)或該(”the”)」均涵蓋其複數形式。另外，除非另外指明，否則在本文及附隨之請求項範圍中所述及之「在...其中(”in”)」包含「在...其中(”in”)」或是「在...之上(”on”)」。此外，為方便讀者，內文中會使用標題或副標題，其不影響本發明之範疇。再者，某些使用於本文的詞彙會於之後做更明確的定義。

定義

使用於此說明書中的詞彙通常具有相關領域中通用的定義，且符合本發明文脈與每一詞彙所處之特定脈絡。下文或本說明書的其他部分敘述了用以描述本發明的某些詞彙，以供從業人員在解讀本發明時作為額外的引導。為求方便，某些詞彙可能會以斜體/引文來做標記。使用此類標記並不影響一詞彙的範疇與涵意；不論標記與否，一詞彙在同一脈絡中的範疇與涵意皆相同。當可理解，同一事物可能有不只一種的闡述方式。因此，可能會用替代性的語言及同義字來指稱此處所用的詞彙；不論此處是否闡述或說明一詞彙，都不會使詞彙具有特殊的重要性。此處提供了某些詞彙的同義字。列舉一或多種同義字並不排除其餘同義字的使用。此說明書中所用的例示，包含此處討論的任何詞彙之例示，僅供說明用，而非用以限制本發明或任何例式詞彙之範疇與涵意。同樣地，本發明不受限於此說明書中所述的多種實施方式。

除非另有定義，文中所使用之所有技術及科學詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者慣用者相同。若有衝突，以本說明書包含其中的定義為準。

文中所使用的「約、大約(”around”、”about”或”approximately”)」應泛指一給定數值或範圍的20%內，較佳為10%；更佳為5%。此處提出的量值為約略值，意指若未明確表述「約、大約」等詞彙時，仍可推知其為概數。

一多重轉殖點(multiple cloning site,MCS)，亦被稱作一多連結子(polylinker)，為一包含許多(最多約達~20)限制酶位點的小片段DNA。位於一MCS中的限制酶位點通常有獨特性，在一指定質體(plasmid)中只會出現一次。

一穿膜蛋白(integral membrane protein,IMP)為一永久黏附於生物膜(biological membrane)的蛋白分子(或蛋白的組合)。穿透膜的蛋白會被「環狀的」脂質所包覆。僅使用清潔劑、非極性溶劑或變性劑，即可由生物膜上分離出該類蛋白。

「保留性變異(conservative variation)」一詞在此用以表示一胺基酸殘基被另一生物性相似的殘基所取代。保留性變異的例子包含疏水性殘基(如，異白胺酸(isoleucine)、纈胺酸(valine)、白胺酸(leucine)或是甲硫胺酸(methionine))間的相互取代；或是一極性殘基間的取代，如精胺酸(arginine)取代離胺酸(lysine)、麩胺酸(glutamic)取代天門冬胺酸(aspartic acids)、或是麩醯胺(glutamine)取代天冬醯胺(asparagine)，諸如此類。「保留性變異」一詞亦包含利用一取代的胺基酸置換一原生胺基酸，只要取代後多肽和未取代的多肽能和相同的抗體進行免疫反應。

文中所使用之特定化學物包含，正癸基-β-D-麥芽糖苷(n-decyl-β-D-maltoside,DM)、正十一基-β-D-麥芽糖苷(n-undecyl-β-D-Maltoside,UDM)、正十二基-β-D-麥芽糖苷(n-dodecyl-β-D-maltoside,DDM)、正辛基-β-D-葡萄糖苷(n-octyl-β-D-glucoside,OG)、正壬基-β-D-葡萄糖苷(n-nonyl-β-D-glucoside,NG)，以及月桂基二甲基氧化胺(lauryldimethylamine-N-oxide,LDAO)。

突變型細菌視紫紅質與野生型細菌視紫紅質的序列編號如下：Hm BRI/D94N(蛋白：序列編號：1；多核苷酸：序列編號：8)為一Hm BRI於Asp94突變的突變型；Hm BRII(蛋白：序列編號：2；多核苷酸：序列編號：9)；Hw BR(蛋白：序列編號：3；多核苷酸：序列編號：7)；Hs BR(蛋白：序列編號：4；多核苷酸：序列編號：10)；Hm BRI(蛋白：序列編號：5；多核苷酸：序列編號：6)。具體來說，該Hm BRI/D94N突變型與該Hm BRI野生型的差異只在於該Hm BRI野生型第94個殘基為天門冬胺酸(aspartic acid,D)突變為天冬醯胺(asparagine,N)。

依據文中提供之操作例，一Xa因子切割點為IEGR(切割點位於R後)；TEV蛋白酶切割點為ENLYFQG(序列編號：11；切割點介於Q與G之間)。

一連結子(linker)為一出現於蛋白區域(domains)之間的短肽序列。連結子常由具有撓性(flexible)的殘基，如甘胺酸(glycine)與絲胺酸(serine)所組成，如此該相鄰的蛋白區域相互間移動較為自由。當有必要時，使用較長的連結子可確保兩相鄰的區域在空間上不會彼此相互干擾。

「T7標籤(T7 tag)」與「T7抗原決定基標籤(T7 epitope tag)」等詞彙為可互換的。T7標籤約11-16個胺基酸，其係源自於自然界中很常見的T7噬菌體基因產物。舉例來說，該T7標籤為NOVAGEN^TM T7˙TAG^® 。

來自感光古細菌(photoreceptive archaebacteria)的細菌視紫紅質是研究最為詳盡的穿膜蛋白之一，感光古細菌常見於高鹽環境(3-5M NaCl)，如鹽湖、鹽池及海鹽場。目前為止，四種物種的完整基因組已完成定序：嗜鹽古生菌(Halobacterium salinarum )(Ng et al.(2000)Proc Natl Acad Sci U S A 97：12176-12181)，趨光古生菌(Haloarcula marismortui )(Baliga et al.(2004)Genome Res 14：2221-2234)，鹽方扁平古菌(Haloquadratum walsbyi )(Bolhuis H,Palm P,Wende A,Falb M,Rampp M,et al.(2006)BMC Genomics 7：169)，以及醛脫氫酶古菌(haloalkaliphileNatronomonas pharaonis )(Falb et al.(2005)Genome Res 15：1336-1343)。由基因組分析可得知，這些物種間的代謝差異很大，不論是從酸蛋白機械分析(acidic protein machineries)、呼吸鏈(respiratory chains)及視紫質(rhodopsins)的角度來看都是如此。在H.salinarum 中，唯一的細菌視紫紅質蛋白(Hs BR)佔了約75%的細胞表面積，形成一由三種相同原體(protomers)組成的六角對稱紫色膜。由高解析度的X光繞射顯示，該Hs BR結構具有七個穿透膜α-雙螺旋，及一個藉希夫鹼作用而共價鍵結於Lys216的視黃醛分子。在吸收一光子後，視黃醛由全反式(all-trans )異構(isomerize)為13-順式組態(13-cis configuration)。為研究Hs BR之光週期，針對位於85、96以及212天門冬胺酸殘基的定點突變(site-directed mutagenesis)証實該些突變型減少了質子泵作用力(pumping activity)。在希夫鹼作用的再質子化過程中，Asp96作為內部質子之供給者(donor)，且D96N突變增加M期衰變速率(Otto et al.(1989)Proc Natl Acad Sci U S A 86：9228-9232)。

與Hs BR相關實驗流程相對較為完備，使得研究者能夠採用其他BR來進行結構分析，並其他BR可能可以作為蛋白載體(carriers)。近期，Yang及其團隊已在大腸桿菌C43(DE3)轉殖並表現出嗜鹽古生菌的六個推定的光受體蛋白(Fu et al(2010)J Bacteriol 192：5866-5873)。在本揭示內容中，製備了具有一較長M期的Hm BRI/D94N突變型，用以分析Hm BRI的特定光週期。出乎意料地，Hm BRI/D94N可在大腸桿菌(40-70mg/L培養)中過量表現(overexpressed)。我們所設計的系統中，將標的膜蛋白與Hm BRI/D94N融合，並在標的蛋白之N端加上一組胺酸純化標籤(組胺酸標籤)以及一煙草蝕紋病毒蛋白酶(TEVp)切割點。此處選用大腸桿菌的十一異戊二烯焦磷酸磷酸酶(undecaprenyl pyrophosphate phosphatase,UppP)與肉鹼運輸蛋白(carnitine transporter,CaiT)作為標的膜蛋白，用以証實本設計之效果。我們已成功純化出毫克等級(每公升大腸桿菌培養物)、具有活性的UppP及CaiT穿膜蛋白，並佐以聚丙烯醯胺膠體電泳、基質輔助雷射脫附離子化質譜儀術(matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry,MALDI-MS)、功能性檢測及晶體化研究。因此，這種結構強韌且生化穩定的Hm BRI/D94N為一合適的融合膜蛋白融合標籤，可用於大規模製備穿膜蛋白。我們原有的系統還可更進一步加以改造成一新的平台，以客制化地應用於高通量分析(high-throughput analysis)，例如，合併使用額外融合標籤的平行轉殖載體。(Hsu M-F,Yu T-F,Chou C-C,Fu H-Y,Yang C-S,et al.(2013)“UsingHaloarcula marismortui Bacteriorhodopsin as a Fusion Tag for Enhancing and Visible Expression of Integral Membrane Proteins inEscherichia coli ”PLoS ONE 8(2)：e56363,which is incorporated herein by reference in its entirety)。本發明是有關於一種藉由一來自嗜鹽古生菌突變的細菌視紫紅質(如Hm BRI/D94N)作為一融合配偶體(partner)，使穿膜蛋白可在大腸桿菌中高度表現的系統。此處提出的純化策略是在標的膜蛋白上加入一組胺酸標籤，以進行親和性純化(affinity purification)，以及採用一適當的蛋白酶切點以產生該最終產物。在過量表現及純化的過程中，可藉由肉眼或直接監控其特有的光譜吸收，以該融合系統來偵測該標的膜蛋白。此方式可用來生產出具有功能性的穿膜蛋白。此項技術有助於開發出用以篩選出可改善正確折疊標的膜蛋白產率條件，同時使其他BR可被應用於此系統的高通量策略。

實施例

在不限制本發明範圍的前提下，下文提出根據本發明實施例的例示性工具、儀器、方法及其相關結果。當注意到，為了方便讀者可能在實施例中使用標題或副標題，但其不應限制本發明之範疇。此外，此處可能會提出及揭示某些理論；然而，不論該些理論是否正確，其都不應用以限制本發明之範疇，只要本發明是根據此處所述的方式來實施，而不考慮任何特定理論或作用方案。

材料與方法

質體建構與表現

將質體載體pHmbop1/D94N(該bop1為用以編碼BRI之基因)及Hwbop1(第2A圖)依前述方法所建構(Fu et al.(2010)“A novel six-rhodopsin system in a single archaeon”J Bacteriol 192：5866-5873,which is incorporated herein by reference)。大腸桿菌的uppP基因是由大腸桿菌BL21(DE3)染色體(chromosome)經聚合酶鏈鎖反應(polymeras chain reaction,PCR)放大而來。在5’及3’端分別引入BamHI與XhoI限制酶位點。再將基因插至pET28a載體(NOVAGEN)。以如下方式建構出可過量表現HmBRI/D94N-UppP融合蛋白之載體。將6個組胺酸標籤-凝血酶切割點-T7標籤-uppP片段由pET28a次轉殖至pET21b的Hmbop1/D94N之3’端。此外，數項改進用以生產出一有效率的表現載體，即pHmbop1/D94N-uppP，包含將一凝血酶切割點置換為一Xa因子點(IEGR↓)、將該6個組胺酸標籤延展為一12個組胺酸標籤，以及將TEV蛋白酶切割點插入(ENLYFQ↓G)至T7標籤之5’端(即，內部T7抗原決定基標籤，在第2B圖中縮寫為T7)。隨後，將用以編碼該標的蛋白之基因插入至BamHI及XhoI位點間(第2B圖)。為建構caiT，將一鏈球菌標籤插入至3’端，caiT基因接續其後，用以輔助額外的純化步驟。

蛋白表現與純化

將具有該Hmbop1 /D94N、Hwbop1 、Hmbop1 /D94N-uppP 和Hmbop1 /D94N-caiT 基因的表現載體轉形至大腸桿菌C43(DE3)，其係生長於37℃含有100 μg/ml安比西林(ampicillin)的LB培養基中。當該培養物的光密度(optical density)於OD₆₀₀ 到達1.0時，加入0.5mM異丙基-β -D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β -D-thiogalactoside,IPTG)與5-10mM全反式視黃醛在37℃培養5小時，以誘發該蛋白表現。為純化Hm BRI/D94N與Hw BR，我們直接將該瓦解的細胞溶解物(cell lysate)於50℃水浴處理30分鐘。經由20,000rpm離心30分鐘，可得到含有膜分層的沉澱物。使用含有2% DM的緩衝液A(50mM Tris，pH 7.5、150mM NaCl)作用整夜由膜分層中萃取出該蛋白後，利用Ni-NTA管柱，再以含有500mM咪唑(imidazole)及0.2% DM的緩衝液A溶析純化出該蛋白。最後，於包含50mM MES，pH 6.5、150mM NaCl及0.2% DM的透析液對該純化的蛋白進行透析。

為純化UppP與CaiT，將細胞收集並懸浮(re-suspended)於緩衝液A中。利用高壓細胞破碎儀(Constant Cell Disruption Systems,Constant Systems Ltd)瓦解該細胞，並藉由超速離心法於100,000×g 下離心1.5小時，分離出膜及可溶性蛋白。以含有20mM咪唑及1%(w/v)DDM清潔劑的緩衝液A回溶所得的沉澱物並於4℃下作用整夜。該回溶液離心(於一Beckman Ti45轉子中，4℃，35,000rpm，1小時)後，將上清液載入至Ni-NTA管柱，並以含20mM咪唑及0.05% DDM的緩衝液A清洗。將原緩衝液置換成緩衝液A後，以TEV蛋白酶進行分解，並讓該反應混合物於4℃下作用整夜。

以含有0.05% DDM的緩衝液A清洗，以溶析出天然UppP。利用一SUPERDEX^TM 200HR 10/30管柱(GE Healthcare)(其係以二倍管柱體積之含有0.05% DDM的緩衝液A加以平衝)，來進行分子篩選層析法。於280nm下追踪蛋白的溶析。將一500μl分量(aliquot)的蛋白樣本以0.3ml/min的流速載入至管柱中。

為純化CaiT，於SEC步驟前更包括引入並進行一STREP-TAG^TM (GE Healthcare)純化步驟。

清潔劑篩選

常用之清潔劑-DM、UDM、DDM、OG、NG以及LDAO係以緩衝液A製備成1~2%的濃度。以高壓細胞破碎儀瓦解該表現Hm BRI/D94N的大腸桿菌。將懸浮液的1毫升分量轉移至1.5ml小管中，並於50℃下作用30分鐘。收集含有紫色Hm BRI/D94N的膜，並以13,000rpm離心10分鐘。加入清潔劑溶液(每管1ml)至小管中，並於4℃下作用至少1小時，以溶解膜。將溶液以13,000rpm離心10分鐘以去除不溶的成份。上清液用Nanodrop 1000分光光度計(Nanodrop 1000 spectrophotometer,Thermo)在UV-VIS光譜280nm及552nm進行分析。所有的清潔劑測試皆以三重複進行。

蛋白監控

利用一NuPAGE電泳系統(NuPAGE electrophoresis system,INVITROGEN^TM )於聚丙烯醯胺膠體電泳上進行電泳，且依膜蛋白調整條件。以Nanodrop 1000分光光度計(Thermo)在UV-VIS光譜280nm及552 nm下定量蛋白濃度。

磷酸酶檢測

使用購買自BioVision的磷酸鹽比色檢測試劑組(Phosphate Colorimetric Assay Kit)，以孔雀石綠檢測(Malachite Green assay)來判定UppP之活性。酵素檢測反應混合液(200μl)包含50mM Tris-HCl，pH 7.5、150mM NaCl、0.2% DDM、100μ M受質(Fpp)，以及經適當稀釋的純化UppP，於37℃下作用。加入30μ l的孔雀石綠試劑(Malachite Green Reagent)以淬熄反應，且將小管置於室溫下30分鐘。靜置後，將反應混合液轉移至96-孔盤，釋出的磷酸鹽會與孔雀石綠反應，於650nm下測定反應依照時間的變化情形。釋出的磷酸鹽以相對之磷酸鹽標準曲線(standard curve)作定量。

CaiT活性檢測

改良先前方法，來檢測CaiT活性。以339.50nm下測定的螢光強度來計算表面親和常數(apparent affinity constant)，即K0.5，其係反應出造成CaiT螢光一半最大(half-maximum)改變之配體(ligand)濃度。

晶體化及X光繞射資料收集

利用坐式蒸氣擴散法(sitting drop vapor diffusion method)，使Hm BRI/D94N晶體生成於20℃。將蛋白(~3mg/ml)以1：1比例與一貯存溶液(reservoir solution)作混合，該貯存溶液由50mM HEPES，pH 7.8及26%(v/v)PEG600所組成。X光繞射資料係在日本Spring-8，BL44XU處進行，並以HKL2000作後續資料處理。利用坐式蒸氣擴散法，使Hw BR晶體生成於20℃。將蛋白(~10mg/ml)以1：1比例與一貯存溶液作混合，該貯存溶液由0.1M Tris-HCl，pH 8.0、0.2M calcium chloride及44%(v/v)PEG400所組成。

以等體積比例混合5.7mg/ml的蛋白與一由50mM magnesium acetate，pH 4.5、26%-28%(v/v)PEG 400及50-200mM NaCl所組成的貯存溶液，在20℃利用坐式蒸氣擴散法來生成天然CaiT晶體。X光繞射資料則是於台灣(Taiwan)，新竹(HsinChu)，國家同步輻射研究中心(National Synchrotron Radiation Research Center,NSRRC)，以BL13B光束線(beamline)的ADSC Quantum315 CCD-檢測器(detector)進行。利用大腸桿菌CaiT與γ-丁基甜菜鹼(γ-butyrobetaine)複合作為一模版(2WSX)進行分子取代得到位相(phases)。利用PHENIX與COOT程式進行分子取代及結構觀察。

結果

細菌視紫紅質之篩選

嗜鹽古生菌細菌視紫紅質(Haloarchaeal bacteriorhodopsins,BRs)為眾人所熟知的紫色穿膜蛋白。此外，BR處於80℃以上及pH條件介於1.0至12.0的水性環境中非常安定。視黃醛色基(chromophore)緊密結合在位於凹穴(pocket)的Lys殘基。BRs可以分為三群組(第1A圖)，而HsBR(群組I)、Hm BRI(群組II)及Hm BRII與Hw BR(群組III)的序列比對指出該些BRs具有約50%序列相似度(第1B圖)。具體來說，由比對序列蛋白BLAST序列相似度(第1B圖)。具體來說，由比對序列蛋白BLAST(Align Sequences Protein BLAST)所得之序列比對指出Hw BR(序列編號：3)與Hm BRI(序列編號：5)之間的序列相似度為53%。在此研究中，將BRs轉殖至3’端具有一6個組胺酸標籤的pET21b，且於大腸桿菌C43(DE3)中過量表現(第2A圖)。Hs BR為研究最為詳盡的BR，以大腸桿菌為宿主時，於膜分層中具有低表現量。此外，已有文獻揭示純化自天然來源的Hs BR與其突變型之結構(Pebay-Peyroula et al.(1997)Science 277：1676-1681；Luecke et al.(1999)Science 286：255-261)。

BR，一個穿透膜七次的紫色穿膜蛋白，藉由希夫鹼作用由一位於G螺旋(helix G)的Lys殘基與視黃醛共價鍵結。對於質子轉移而言不可或缺的BRs殘基，即，Hs BR的Asp85、96及212(第1B圖)，為保留性殘基，不應輕易置換。初步結果顯示，Hm BRI或Hw BR的表現量高於Hs BR的表現量(資料未顯示)，因此，使用前兩BRs作進一步的分析。此外，為使光週期停留在M期並減緩光週期的速率，因此製備了Hm BRI的D94N突變型。當Hm BRI/D94N以全反式視黃醛表現時，發現Hm BRI/D94N的表現量非常高(每公升培育物中高達40-70mg)，造成一深紫色的細胞沉澱物(第3A圖)。由第3A圖可解釋，Hm BRI/D94N的表現量高於Hm BRI的表現量。Hm BRI/D94N之高量表現、穩定性及可見的紫色沉澱物使Hm BRI/D94N在將穿膜蛋白標定至膜時，使其成為一種極有利的工具。此外，野生型Hw BR在我們系統中

以不同標的膜蛋白建構BR融合系統

第2B圖示出用來建構BR融合系統的策略。將標的基因，即大腸桿菌uppP ，建構於pET28a，其5’端具有6個組胺酸標籤、凝血酶切割點及T7標籤。由於C端具有6個組胺酸標籤的Hm BRI/D94N在pET21b中的表現良好，我們設計了具有特定限制酶位點的引子，並將該凝血酶切割點T7標籤-uppP 片段由pET28a次轉殖至Hmbop1 /D94N的3’端。首先，引入一個Xa因子切割點(IEGR↓)至Hmbop1 /D94N與組胺酸標籤之間。將6個組胺酸標籤延展成12個組胺酸標籤，可以增加融合蛋白在Ni-NTA管柱中的鍵結親和性。TEV蛋白酶(TEVp)是一種常用的蛋白酶，對由標的蛋白切割親和性標籤具有高度專一性)(Kapust et al.(2001)Protein Eng 14：993-1000)。在此，為製備天然標的蛋白，以凝血切割點置換一TEVp切割點(ENLYFQ↓G)。若需要對標的蛋白進行高通量篩選，源自pET28a中的T7標籤(11胺基酸)可作為一TEVp鍵結位的連結子。可依據各蛋白之特性調整該連結子的長度。

第8A圖繪示出一內含uppP 轉殖基因的pET28a載體圖。將該大腸桿菌uppP 基因建構在pET28a的多重轉殖點。uppP 的5’端為6個組胺酸標籤，其後接續一凝血切割點及T7標籤。第8B圖繪示出一內含Hmbop1 /D94N轉殖基因的pET21b的載體圖。嗜鹽古生菌bop1 基因被建構在pET21b多重轉殖點的NdeI與HindIII之間。為後續純化，在蛋白產物的C端接續有一 6個組胺酸標籤。第8C圖繪示出一內含有Hmbop1 /D94N-uppP 轉殖基因的pET21b載體圖。轉殖Hmbop1 /D94N-uppP 基因作為一融合蛋白。將載體改良成為一Hmbop1/D94N融合標籤，其後連接有一12個組胺酸標籤、一Xa因子切割點、一作為連結子之T7標籤及一TEVp切割點。將標的基因(例如，uppP )建構於BamHI與XhoI之間，並帶有一停止密碼子(stop codon)。

為增加CaiT的純度，將一鏈球菌純化標籤插入至CaiT的C端，以進一步純化。

蛋白之表現與純化

為避免大腸桿菌中異源性膜蛋白的過度表現造成毒性，我們使用大腸桿菌突變株，C41(DE3)及C43(DE3)，其係常規作為成功表現BR膜蛋白之宿主細胞(Miroux et al.(1996)J Mol Biol 260：289-298)。在我們策略中，為求一致性地比較各樣本的表現量，我們為所有的建構物設立相同的表現及純化步驟；然而，各建構物的表現條件可依特性作調整，以得到最大的表現量。

在此研究中，所有的蛋白皆依據相同的生產流程來表現。當各培養物的細胞密度於OD₆₀₀ 到達1.0時，在5-10mM全反式視黃醛存在下，以0.5mM異丙基-β -D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β -D-thiogalactoside,IPTG)於37℃下作用5小時，以誘發蛋白表現。將Hm BR1及突變型Hm BRI/D94N轉殖至具有一C端有6個組胺酸標籤之pET21b中，並於大腸桿菌C43(DE3)中表現。經表現的大腸桿菌細胞沉澱物可以直觀地被偵測(第3A圖)。加入全反式視黃醛，會使在大腸桿菌C43(DE3)表現的pET21b、Hm BRI及Hm BRI/D94N產生白色、紫色及深紫色的細胞沉澱物。

為純化Hm BRI/D94N，基於細胞瓦解後BR熱穩定的特性(Yokoyama et al.(2002)J Biochem 131：785-790)，我們將細胞溶解物於50℃下水浴處理30分鐘。含有膜分層的沉澱物以2%正癸基-β -D-麥芽糖苷(n-decyl-β -D-maltoside,DM)萃取，並接續著Ni-NTA管柱純化，及以500mM咪唑溶析出Hm BRI/D94N。可得到約每公升培育物中70mg的純化Hm BRI/D94N，以進行晶體化。

清潔劑為萃取穿膜蛋白時重要的成份。為找尋適當的清潔劑來純化Hm BRI/D94N及改善融合標籤系統的廣範使用性，有數個常用的清潔劑可用來萃取出Hm BRI/D94N蛋白。正癸基-β -D-麥芽糖苷(n-decyl-β -D-maltoside,DM)、正十一基-β -D-麥芽糖苷(n-undecyl-β -D-Maltoside,UDM)、正十二基-β -D-麥芽糖苷(n-dodecyl-β -D-maltoside,DDM)、正辛基-β -D-葡萄糖苷(n-octyl-β -D-glucoside,OG)、正壬基-β -D-葡萄糖苷(n-nonyl-β -D-glucoside,NG)及月桂基二甲基氧化胺(lauryldimethylamine-N-oxide,LDAO)具有不同的臨界微胞濃度(critical micelle concentrations,CMCs)及化學與物理性質，並曾被用來測試具有活性之Hm BRI/D94N的溶解度。可由該清潔劑-溶解膜在A₂₈₀ (全蛋白)及A₅₅₂ (具有功能性的Hm BRI/D94N)下的吸光值來評估清潔劑溶解度的產率(第3B圖)。結果顯示，於膜分層中，六種清潔劑可溶解等量的蛋白。除LDAO外，大多數的清潔劑皆可溶解具有活性的Hm BRI/D94N蛋白。使用LDAO可能會造成Hm BRI/D94N像視蛋白(opsin)一樣折疊，且不會與視黃醛形成鍵結，LDAO可能使視黃醛被淬熄。另一方面，在適當緩衝液條件下，DM、UDM、DDM、OG及NG可用於萃取Hm BRI/D94N融合蛋白，以進行具活性之標的蛋白的後續純化。

BRs之定性分析

以UV-VIS光譜掃描純化的Hm BRI、Hm BRI/D94N及Hw BR，顯示其專一吸收高峰為552nm(第4A圖)，定性地指出該些BRs具有功能性。Hm BRI/D94N的大規模表現及純化，可於聚丙烯醯胺膠體電泳上顯示為一單一亮帶(第4B圖)。為得到高品質蛋白，由一分子篩選層析管柱單一分散以達到一單一溶析高峰對於穿膜蛋白結構的鑑定是必要的。純化的Hm BRI/D94N之SEC結果顯示在無效體積(void volume)中含有某些凝集的視蛋白(沒有視黃醛的視紫質)，且此Hm BRI/D94N蛋白的兩種構形(conformations)同時達到平衡(第4C圖)。數種穿膜蛋白的商品試劑組(Molecular Dimensions,Inc.)都提供利用蒸氣擴散法，於50mM MES，pH 6.5、150mM NaCl及0.2% DM中，對純化的Hm BRI/D94N進行機械化、結晶條件篩選)。生成於50mM醋酸鈉，pH 4.2、30% PEG 600及0.2M氯化鈣之六角形紫色晶體(第4D圖)，利用Spring-8的BL44XU，顯示出解析度高達7Å的最佳X光繞射結果(第4G圖)。即使由於低解析度資料及清潔劑包覆於晶體中(強繞射約在40Å)，使得我們無法得到Hm BRI/D94N的結構，但我們仍可得到以Hs BR(1C3W)作為模版之一同源模型(第4H圖)。Hm BRI/D94N的N端位於細胞間質，而其C端位於細胞質。經由一希夫鹼作用與視黃醛鍵結的K220殘基，以及主要帶電質子化殘基，即D83、D216與N94突變型，位於蛋白的中央通道。有趣地，在以一系列緩衝液與清潔劑進行篩選後，純化的Hw BR於50mM醋酸鈉，pH 4.5、150mM NaCl及0.2% DM中呈現一單一分散高峰(第4E圖)。利用結晶篩選試劑組，於0.2M氯化鈣、0.1M Tris-HCl，pH 8.0、44% PEG 400中生成的六角形紫色晶體，其X光繞射模式解析度可達10Å(資料以內部的Rigaku FR-E X光產生器(Rigaku FR-E X-ray generator)收集)(第4F圖)。

標的穿膜蛋白UppP及CaiT之定性

多數穿膜蛋白具有可作為如通道、受體、運輸蛋白及訊息傳導元素(signal transduction elements)之類的功效。為檢驗由我們Hm BRI/D94N融合標籤系統所得之標的蛋白是否可正確折疊，我們選擇穿膜酵素十一異戊二烯焦磷酸磷酸酶(undecaprenyl pyrophosphate phosphatase,UppP)及肉鹼/丁基甜菜鹼反向共同運輸器(carnitine/butyrobetaine antiporter,CaiT)兩種作為標的膜蛋白，因這兩種蛋白質都可被檢測。基於我們選擇的轉殖策略，建立出利用融合純化系統來純化各標的蛋白的流程圖(第5A圖)。為增加融合蛋白的鍵結親合性，我們引入一12個組胺酸標籤。在第一IMAC管柱純化步驟中，以500mM咪唑溶析出融合蛋白。在融合蛋白中，用以鍵結親和管柱之組胺酸標籤下游，我們在標的蛋白的N端引入一TEVp切割點，藉由蛋白分解可獲得其天然形式。以TEVp切割後，以一第二IMAC管柱來移除未切割的融合蛋白、具組胺酸標籤的TEVp，以及Hm BRI/D94N。於流通液分層中收集標的蛋白。由於在得到同源穿膜蛋白時，常使用SEC來純化穿膜蛋白，在純化的最終步驟使用SUPERDEX^TM 200 HR 10/30管柱。第5B圖呈現該融合膜蛋白-Hm BRI/D94N-UppP的預測結構圖，其有助於純化步驟的視覺化(visualization)。

Hm BRI/D94N-UppP與Hm BRI/D94N-CaiT融合後的表現沉澱物，皆呈現紫色(第5C圖)。相較於使用缺少一融合標籤之pET51表現載體時的表現量(0.1 and 0.2mg/L)來說，利用該融合系統來表現UppP及CaiT會分別增加整體表現量達50-及17倍(4.9 and 3.4mg/L)。純化後UppP及CaiT的產量，高於之前研究報告的產量(4及2.5mg/L)(Ghachi et al.(2004)J Biol Chem 279：30106-30113；Vinothkumar et al.(2006)J Biol Chem 281：4795-4801)(第5D圖)。

純化的UppP於SEC顯示出一單一分散高峰，且在聚丙烯醯胺膠體電泳顯示成一單一亮帶(第6A圖)。為測試UppP的焦磷酸酶活性，利用孔雀石綠檢測法在不同受質存在下進行檢測。由於預期受質，即Upp，難以合成及純化(Ghachi et al.Id.)，我們因而利用法尼基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate,Fpp)作為一模型受質。先前報告指出另一大腸桿菌十一異戊二烯焦磷酸磷酸酶，即PgpB，其與UppP不具序列同源性，且相對於二酸甘油脂焦磷酸鹽(diacylglycerol pyrophosphate)與法尼基焦磷酸脂質受質來說，其催化Upp去磷酸化(dephosphorylation)的效率較低。在我們的活性測試中，Fpp為一UppP的合適受質。一時間相關的磷酸酶檢測指出，純化的UppP為一具有功能的蛋白，能夠釋放出自由磷酸鹽(第6B圖)。

純化的CaiT顯示一單一分散SEC高峰(第7A圖)。第7B圖呈現肉鹼於CaiT的鍵結親合性。我們生成具有功能的CaiT晶體(第7C圖)，且X光繞射的最佳點高達6.5Å(第7D圖)，該繞射資料呈現於表1。

基於同源模型之研究，Hm BRI具有七個可穿透細胞膜的α雙螺旋及兩個β 股(strands)的構形，並與視黃醛色基結合。數個來自不同嗜鹽細菌(halobacteria)的視紫質在大腸桿菌中，被表現成帶有一組胺酸標籤，產生不穩定、包涵體(inclusion body)或低異源性表現的視紫質(Braiman et al(1987)J Biol Chem 262：9271-9276；Dunn et al.(1987)J Biol Chem 262：9246-9254；Schmies et al.(2000)FEBS Lett 466：67-69)。本發明是有關於在改善表現條件下，於大腸桿菌中利用最常見的pET表現系統使Hm BRI/D94N具有最高表現產率(~70mg/L)。巨觀的Hm BRI/D94N的出現，有助於快速測量蛋白表現量，因其可藉由UV/VIS吸收來定量測量。在我們的紫色BR-融合膜蛋白表現系統中，標的膜蛋白的N端位於細胞質，而Hm BRI/D94N為一GPCR，其通常具有位於細胞質的C端。為測試新穎、巨觀的Hm BRI/D94N融合標籤系統，以UppP及CaiT作為實施例，以証明我們的策略確實可生產具有功能性的蛋白。此外，Hw BR表現量高，且純化後於一SEC管柱上具有一單一分散高峰。單一分散性對產生穿膜蛋白結晶十分重要。能夠產生一單一分散高峰的融合標籤，可用來評估合適的清潔劑，且有助於晶體的包覆，這點與諸如GFP與T4溶菌酶(lysozyme之類的其他系統相似)。我們的結果暗示Hw BR 可能是下一代BR-融合膜蛋白表現標籤。

總結，我們設計出一種具有數項優勢可用來製備穿膜蛋白的平台。Hm BRI、Hm BRI/D94N及Hw BR可將有興趣的蛋白標定至膜上，且有助於該些穿膜蛋白被正確地折疊。由於正確折疊的光受體可形成紫色膜，我們可以直接觀測經表現的蛋白並評估融合蛋白的表現量。標的膜蛋白的表現量可經由Hm BRI/D94N或Hw BR的高表現量刺激而增加。以蛋白酶分解可有效分離融合標籤與標的蛋白，產生標的膜蛋白。利用Hm BRI、Hm BRI/D94N或Hw BR作為一新穎的膜蛋白表現標籤，將使研究者可表現並生產天然的穿膜蛋白。

本發明前述範例式實施方式是為說明與敍述之目的而提供，本發明並不限於該些實例。基於上述教示內容，本領域習知技藝人士可對這些實例進行許多修飾或改變。

此處選用及描述多種實施方式與實施例來解釋本發明之原理及應用性，藉使本技術領域中熟習此技藝者可據以實現本發明，並基於所欲的特定用途來利用本發明的各種實施方式與各種適當的變形。本領域習知技藝人士可輕易顯見替代性的實施方式，而不至於背離本發明的精神與範圍。因此，本發明的範圍應由附隨的申請專利範圍來界定，而非以上文的實施方式與例示性的實施例來定義。

在本發明的實施方式中引用且討論某些文獻，包含專利、專利申請案及多種公開文獻。引用且/或討論這些文獻的目的僅在闡明本發明之實施方式，而非承認該文獻為此處所述之本發明的「先前技術」。在此將此說明書中所有引用及討論之文獻以其全文納入作為參照，且視同各文獻獨立納入作為參照。

<110> 中央研究院

<120> 用以表現和/或製備細菌視紫紅質融合膜蛋白的載體、系統與方法

<130> P2771-TW

<150> 61710681

<151> 2012-10-06

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 250

<212> PRT

<213> Haloarcula marismortui

<400> 1

<210> 2

<211> 250

<212> PRT

<213> Haloarcula marismortui

<400> 2

<210> 3

<211> 254

<212> PRT

<213> Haloquadratum walsbyi

<400> 3

<210> 4

<211> 248

<212> PRT

<213> Halobacterium salinarum

<400> 4

<210> 5

<211> 250

<212> PRT

<213> Haloarcula marismortui

<400> 5

<210> 6

<211> 750

<212> DNA

<213> Haloarcula marismortui

<400> 6

<210> 7

<211> 762

<212> DNA

<213> Haloquadratum walsbyi

<400> 7

<210> 8

<211> 750

<212> DNA

<213> Haloarcula marismortui

<400> 8

<210> 9

<211> 750

<212> DNA

<213> Haloarcula marismortui

<400> 9

<210> 10

<211> 747

<212> DNA

<213> Halobacterium salinarum

<400> 10

<210> 11

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Protease cleavage site

<400> 11

Claims

一種表現載體，包含：a)一用以編碼一細菌視紫紅質之第一核酸，該細菌視紫紅質具有序列編號：1之胺基酸序列或與序列編號：1具有保留性變異的胺基酸序列；b)一用以編碼一組胺酸標籤之第二核酸，其係位於該第一核酸之下游；c)一多重轉殖點，其係位於該第二核酸之下游，其中該多重轉殖點配置成可插入一用以編碼第一蛋白酶切割點之核酸，與一用以編碼一標的蛋白之核酸；以及d)一啟動子，其係可操作式地連結至該第一核酸、該第二核酸以及該多重轉殖點。
如請求項1所述之表現載體，其中該組胺酸標籤包含了6個組胺酸殘基。
如請求項1所述之表現載體，其中該第一蛋白酶切割點為一煙草蝕紋病毒之蛋白酶切割點。
如請求項1所述之表現載體，更包含一用以編碼一第二蛋白酶切割點之核酸，其係位於該第一核酸與該第二核酸之間。
如請求項4所述之表現載體，其中該第二蛋白酶切割點為一Xa因子切割點。
如請求項1所述之表現載體，更包含一連結子，其係位於該用以編碼第一蛋白酶切割點之核酸與該用以編碼標的蛋白之核酸之間。
如請求項6所述之表現載體，其中該連結子為一T7標籤。
如請求項1所述之表現載體，其中該第一核酸具有序列編號8之核苷酸序列。
一種融合膜蛋白表現系統，包含如請求項1所述之表現載體，其中該多重轉殖點中插入了該用以編碼第一蛋白酶切割點之核酸，及該用以編碼標的蛋白之核酸，且該標的蛋白為一穿膜蛋白。
如請求項9所述之融合膜蛋白表現系統，更包含：一用以編碼第二蛋白酶切割點之核酸，其係位於該第一核酸與該第二核酸之間；及一連結子，其係位於該用以編碼第一蛋白酶切割點之核酸，與該用以編碼標的蛋白之核酸間。
一種生產一標的膜蛋白之方法，包含下述步驟： a)藉由在如請求項1所述之表現載體中的多重轉植點中插入該用以編碼第一蛋白酶切割點之核酸，與該用以編碼標的膜蛋白之核酸，來建構出一融合膜蛋白表現系統，其中該融合蛋白包含彼此相互耦接的細菌視紫紅素以及標的膜蛋白；b)以該融合膜蛋白表現系統來轉形一宿主細胞；c)誘發該轉形的宿主細胞於其細胞膜上同時表現及折疊該融合蛋白；d)由該轉形的宿主細胞中分離出該融合蛋白；e)以一清潔劑(detergent)從步驟(d)中萃取出該融合蛋白，其中該清潔劑不是月桂基二甲基氧化胺(lauryldimethylamine-N-oxide,LDAO)；f)純化步驟(e)中所萃取出的該融合蛋白；g)以一第一蛋白酶分解步驟(f)中的所純化的該融合蛋白，此第一蛋白酶可針對該第一蛋白酶切割點作用，進而自該融合蛋白中釋放出該標的膜蛋白；以及h)收集該標的膜蛋白。
如請求項11所述之方法，其中步驟(f)包含以下步驟：將該融合蛋白載入至一第一親和管柱；以及由該第一親和管柱溶析出該融合蛋白。
如請求項11所述之方法，其中步驟(h)包含以下步驟：將步驟(g)所得的分解產物載入至一第二親和管柱；並收集流經該第二親和管柱中的該流通液。
如請求項11所述之方法，更包含步驟如下：將步驟(h)所收集之標的膜蛋白載入至一分子篩選層析管柱(size exclusion column)；並由此分子篩選層析管柱溶析出該標的膜蛋白。
如請求項11所述之方法，更包含將該標的膜蛋白結晶之步驟。