CN109652433A

CN109652433A - 可视化的离子通道蛋白bR可溶性融合表达载体及其构建方法

Info

Publication number: CN109652433A
Application number: CN201811556737.6A
Authority: CN
Inventors: 宁金凤; 周敏; 冯昕妍; 王犇
Original assignee: Nanjing University of Science and Technology
Current assignee: Nanjing University of Science and Technology
Priority date: 2018-12-19
Filing date: 2018-12-19
Publication date: 2019-04-19

Abstract

本发明公开了一种可视化的离子通道蛋白bR可溶性融合表达载体及其构建方法。所述载体通过分别构建细菌视紫红质的可溶化表达载体pET28a‑ΔspMBP‑bR‑ApoAI*‑His和高度折叠的绿色荧光蛋白表达载体pET28a(+)‑sfGFP载体，经酶切将bR‑ApoAI*‑His整合到pET28a(+)‑sfGFP载体中，得到可视化的离子通道蛋白bR可溶性融合表达载体pET28a(+)‑sfGFP‑bR‑ApoAI*‑His载体。本发明构建的融合表达载体能够实现细菌视紫红质的水可溶性和可视化表达，并且表达量较高。

Description

可视化的离子通道蛋白bR可溶性融合表达载体及其构建方法

技术领域

本发明属于基因载体制备技术领域，涉及一种可视化的离子通道蛋白bR可溶性融合表达载体及其构建方法。

背景技术

微生物视紫红质(Microbial Rhodopsin)是原核生物和低等真核生物中普遍存在的光感受器，其中以古细菌视紫红质(Bactiorhodopsin，bR)为代表。bR是古细菌中的质子泵，主要负责捕获光能并利用此能量实现质子的跨细胞膜运输。当其配体，也就是视黄醇分子(Retinol)，吸收一个光子从反式变为顺式结构时，将导致视紫红质蛋白质发生构象变化并籍此实现质子的跨膜运输。然而由于视紫红质是一类由七个跨膜螺旋组成的整合膜蛋白，它的结构功能的研究受阻于其水不溶性以及来自表面活性剂的干扰，尤其是光化学循环中视紫红质蛋白质的构象变化细节及一系列中间态信息还有待深入研究。

但是从生物组织中提取的细菌视紫红质量非常少，若要达到一定的剂量，研究成本很高。文献1(POMPEJUS M,et al.High-yield production of bacteriorhodopsin viaexpression of a synthetic gene in Escherichia coli[J].The FEBS Journal,1993,211(1-2):27-35.)，在大肠杆菌中表达的细菌视紫红质以包涵体形式存在，其天然构象被破坏，而且表达量不高。因此需要寻找细菌视紫红质大量表达的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可视化的离子通道蛋白bR可溶性融合表达载体及其构建方法。该载体以pET28a(+)质粒作为骨架，在细菌视紫红质N端连接了高度折叠的绿色荧光蛋白sfGFP，在细菌视紫红质C端连接截短的人载脂蛋白ApoAI*包裹细菌视紫红质的脂溶性表面，使bR蛋白实现水溶性，且能使bR蛋白表达可视化。

实现本发明的目的的技术方案如下：

可视化的离子通道蛋白bR可溶性融合表达载体，利用PCR扩增pET19b-sfGFP质粒，得到sfGFP，将sfGFP整合到pET28a(+)质粒中得到pET28a(+)-sfGFP载体；PCR扩增pMBP-p质粒，得到除去N端信号肽的麦芽糖结合蛋白cDNA即ΔspMBP，将ΔspMBP整合到pET28a(+)质粒中得到pET28a(+)-ΔspMBP载体；PCR扩增pET28a(+)-ApoAI质粒，得到截短的人类载脂蛋白cDNA即ApoAI*，将ApoAI*整合到pET28a(+)-ΔspMBP载体中得到pET28a(+)-ΔspMBP-ApoAI*-His载体；PCR扩增密码子优化过的细菌视紫红质(Bacteriorhodopsin,bR)合成基因，将其整合到pET28a(+)-ΔspMBP-ApoAI*-His载体中，得到细菌视紫红质的可溶化表达载体pET28a-ΔspMBP-bR-ApoAI*-His；酶切pET28a(+)-ΔspMBP-bR-ApoAI*-His，得到bR-ApoAI*-His，将bR-ApoAI*-His整合到pET28a(+)-sfGFP载体中得到可视化的离子通道蛋白bR可溶性融合表达载体即pET28a(+)-sfGFP-bR-ApoAI*-His载体。

本发明进一步提供上述可视化的离子通道蛋白bR可溶性融合表达载体的构建方法，具体步骤如下：

步骤1，pET28a(+)-sfGFP载体的构建：

先将pET19b-sfGFP质粒进行PCR后得到sfGFP(SEQ.NO.1)片段，用NcoⅠ限制性核酸内切酶和NdeⅠ限制性核酸内切酶对sfGFP和pET28a(+)质粒进行酶切，连接反应得到pET28a(+)-sfGFP载体；

步骤2，pET28a(+)-ΔspMBP-bR-ApoAI*-His(SEQ.NO.2)载体的构建：

步骤2.1，先将pMBP-p质粒进行PCR扩增，得到除去N端信号肽的麦芽糖结合蛋白cDNA即ΔspMBP(SEQ.NO.3)，用NcoⅠ限制性核酸内切酶和NdeⅠ限制性核酸内切酶对ΔspMBP和pET28a(+)质粒进行酶切，连接反应得到pET28a(+)-ΔspMBP载体；

步骤2.2，将pET28a(+)-ApoAI质粒进行PCR扩增，得到截短的人类载脂蛋白cDNA即ApoAI*(SEQ.NO.4)，用HindⅢ限制性核酸内切酶和NotⅠ限制性核酸内切酶对ApoAI*和pET28a(+)-ΔspMBP质粒进行酶切，在ApoAI*末端无终止子的情况下，引入pET28a(+)本身所带的His标签，连接反应得到pET28a(+)-ΔspMBP-ApoAI*-His载体；

步骤2.3，将密码子优化过的细菌视紫红质DNA(SEQ.NO.5)进行PCR扩增，用NdeⅠ限制性核酸内切酶和HindⅢ限制性核酸内切酶对细菌视紫红质DNA和pET28a(+)-ΔspMBP-ApoAI*-His质粒进行酶切，连接反应得到pET28a(+)-ΔspMBP-bR-ApoAI*-His载体；

步骤3，pET28a(+)-sfGFP-bR-ApoAI*-His(SEQ.NO.6)载体的构建：

用PstⅠ限制性核酸内切酶和NotⅠ限制性核酸内切酶对ΔspMBP-bR-ApoAI*-His和pET28a(+)-sfGFP质粒进行酶切，连接反应得到可视化的离子通道蛋白bR可溶性融合表达载体即pET28a(+)-sfGFP-bR-ApoAI*-His载体。

步骤2.3中，所述的优化为将原有序列中的对于大肠杆菌K-12菌株而言的稀有密码子和不利于蛋白翻译的碱基替换成易于在宿主菌中翻译表达的碱基，即增强mRNA的稳定性、降低mRNA翻译成蛋白时中断的可能性。

进一地，本发明还提供上述可视化的离子通道蛋白bR可溶性融合表达载体的表达方法，具体步骤如下：将可视化的离子通道蛋白bR可溶性融合表达载体pET28a(+)-sfGFP-bR-ApoAI*-His载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，挑选阳性单克隆菌进行扩大培养和诱导表达，收集菌液，离心得到表达高度折叠的绿色荧光蛋白sfGFP和细菌视紫红质的菌体。

优选地，所述的诱导表达过程中，采用异丙基硫代半乳糖苷为诱导物，诱导时间为1h。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

(1)本发明的融合表达载体实现了脂溶性蛋白bR蛋白的水溶性表达；

(2)在表达载体中添加了高度折叠的绿色荧光蛋白sfGFP，其作为一个融合标签和报告基因片段，与其融合表达后的bR蛋白在表达蛋白时很好地折叠，提高蛋白的稳定性，同时sfGFP作为绿色荧光蛋白，在绿光激发下会显示绿色荧光，实现了bR蛋白的可视化表达，无需经过Western Blot验证试验。

附图说明

图1为psfGFP-p PCR琼脂糖凝胶电泳结果图。

图2为pET28a(+)-sfGFP双酶切验证结果图。

图3为构建完成的pET28a(+)-sfGFP质粒图谱。

图4为细菌视紫红质DNA的PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳图。

图5为细菌视紫红质和pET28a(+)-ΔspMBP-ApoAI*-6His载体酶切后琼脂糖凝胶电泳图。

图6为pET28a(+)-ΔspMBP-bR-ApoAI*-6His载体示意图。

图7为pET28a(+)-sfGFP质粒酶切的琼脂糖凝胶电泳结果图。

图8为pET28a(+)-sfGFP-bR-ApoAI*-His双酶切结果图。

图9为构建完成的pET28a(+)-sfGFP-bR-ApoAI*-His质粒图谱。

图10为可溶性验证的Western Blot结果图。

图11为可视化表达的荧光成像结果图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例中所用材料如下：

1.细胞来源

大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)细胞购自武汉灵淼生物公司。

2.质粒来源

pET19b-sfGFP质粒购自上海北诺生物科技公司；pMBP-p质粒购自武汉灵淼生物公司；pET28a(+)、pET28a(+)-ApoAI质粒购自MERK公司。

3.引物来源

合成引物SEQ.NO.7、SEQ.NO.8来自擎科生物有限公司，SEQ.NO.9、SEQ.NO.10、SEQ.NO.11、SEQ.NO.12来自上海生工有限公司。

4.主要试剂

胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl、Tris-baes均购自Sigma公司；限制性核酸内切酶购自Takara公司；rTaq酶、T4连接酶购自Takara公司。质粒小提试剂盒、凝胶回收试剂盒购自Axygen公司。兔源Anti-His mAb购自CST公司，兔抗HRP标记二抗购自Jackson公司；显影液及定影液购自Tanon公司。

实施例1

1、高折叠绿色荧光蛋白融合载体pET28a(+)-sfGFP构建方法：

a)根据pET19b-sfGFP质粒，设计1对引物。引物上游的寡核苷酸序列如SEQ.NO.7所示，引物下游的寡核苷酸序列如SEQ.NO.8所示。以psfGFP-p质粒为模板，经PCR反应，得到sfGFP片段。PCR反应体系配置如表1所示。

表1PCR反应体系配制表

试剂名称	储备液浓度	加入PCR反应体系的体积(μL)
			5×HF Buffer	5×	10
dNTP Mix	10mmol/L	2
			Forward primer	10μmol/L	1
Reverse primer	10μmol/L	1
			Phusion酶	5U/μL	0.5
DNA模板	50ng/μL	1
			MilliQ H<sub>2</sub>O		加MilliQ H<sub>2</sub>O至终体积50μL

PCR结果如图1所示。第一道为Marker，第二道为目的片段sfGFP.

b)回收PCR产物sfGFP片段后，用NcoⅠ和NdeⅠ双酶切回收产物和pET28a(+)载体，后进行琼脂糖凝胶电泳，回收酶切产物；将回收的sfGFP和pET28a(+)载体片段，按摩尔比为3:1比例加入小离心管中，加入T4连接酶，在22℃下连接1h。

c)以上连接产物用42℃热激法转化入100μL DH5α感受态细胞，加入700μL LB培养基后置于37℃摇床，在200转/分钟下培养40分钟。

d)上述菌液在12000转/分钟转速下离心1分钟后，吸去700μL上清；用移液器轻轻吹吸剩余培养基后涂布在含有卡那霉素的LB固体平板上，倒置于37℃培养箱中，培养12小时。

e)挑取上述平板中的单菌落，小量扩增后提取质粒，用NcoⅠ和NdeⅠ单酶切双酶切所提取质粒后经琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图2经测序鉴定正确后，得到pET28a(+)-sfGFP载体。构建得到的pET28a(+)-sfGFP质粒图谱如图3所示。

2、pET28a(+)-ΔspMBP-bR-ApoAI*-6His(MBA)载体的构建方法：

2.1.细菌视紫红质的PCR扩增。

按照表2构建PCR扩增反应体系：

表2细菌视紫红质PCR反应体系配制表

PCR结果如图4所示，lane1为DL5000DNAmarker，lane3、4为细菌视紫红质PCR产物。

2.2.pET28a(+)-ΔspMBP的构建方法：

a)根据从武汉淼灵生物所购得的pMBP-p质粒，以pMBP-p质粒为模板，经PCR反应，得到除去N端信号肽的麦芽糖结合蛋白cDNA。PCR反应体系配置如表3所示。

表3MBP-cDNA的PCR反应体系配制表

b)回收除去N端信号肽的麦芽糖结合蛋白cDNA，用NcoⅠ和NdeⅠ双酶切回收产物和pET28a(+)载体，后进行琼脂糖凝胶电泳，回收酶切产物；将回收的除去N端信号肽的麦芽糖结合蛋白cDNA和pET28a(+)载体片段，按浓度比为3:1比例加入小离心管中，加入T4连接酶，在22℃下连接2h。

c)以上连接产物取20μL用42℃热激法转化入100μL DH5α感受态细胞，加入700μLLB培养基后置于37℃摇床，在200转/分钟下培养45分钟。

d)上述菌液在4000转/分钟转速下离心1分钟后，吸去700μL上清；用移液器轻轻吹吸剩余培养基后涂布在含有卡那霉素的LB固体平板上，倒置于37℃培养箱中，培养12小时。

e)挑取上述平板中的单菌落，小量扩增后提取质粒，用NcoⅠ和NdeⅠ单酶切双酶切所提取质粒后经琼脂糖凝胶电泳鉴定，经测序鉴定正确后，得到pET28a(+)-ΔspMBP载体。

2.3.pET28a(+)-ΔspMBP-ApoAI*-His构建方法：

a)根据购自MERK的pET28a(+)-ApoAI质粒，根据pET28a(+)-ΔspMBP质粒的多克隆位点特点，在ApoAI*的上游设计引入HindⅢ限制性核酸内切酶位点，详细序列见SEQ.NO.13；下游设计引入NotⅠ限制性核酸内切酶位点，详细序列见SEQ.NO.14。在ApoAI*末端无终止子的情况下，可引入pET28a(+)本身所带的His标签。以原有pET28a(+)-ApoAI载体为模板，经PCR反应，得到截短的人类载脂蛋白ApoAI*(Δ1-43)的cDNA。

b)回收截短人类载脂蛋白ApoAI*(Δ1-43)的cDNA，用HindⅢ和NotⅠ双酶切回收产物和pET28a(+)-ΔspMBP载体，后进行琼脂糖凝胶电泳，回收酶切产物；将回收的截短人类载脂蛋白ApoAI*(Δ1-43)的cDNA和pET28a(+)-ΔspMBP载体片段，按浓度比为3:1比例加入小离心管中，加入T4连接酶，在22℃下连接2h。

e)挑取上述平板中的单菌落，小量扩增后提取质粒，用HindⅢ和NotⅠ单酶切双酶切所提取质粒后经琼脂糖凝胶电泳鉴定，经测序鉴定正确后，得到pET28a(+)-ΔspMBP-ApoAI*-His载体。

2.4.pET28a(+)-ΔspMBP-bR-ApoAI*-6His载体的构建

a)回收1中PCR得到的bR的cDNA，用NdeⅠ和HindⅢ双酶切回收产物和pET28a(+)-ΔspMBP-ApoAI*-His载体，后进行琼脂糖凝胶电泳，回收酶切产物；将回收的细菌视紫红质DNA(bR)的cDNA和pET28a(+)-ΔspMBP-ApoAI*-His载体片段，按浓度比为3:1比例加入小离心管中，加入T4连接酶，在22℃下连接2h。

b)以上连接产物取20μL用42℃热激法转化入100μL DH5α感受态细胞，加入700μLLB培养基后置于37℃摇床，在200转/分钟下培养45分钟。

c)上述菌液在4000转/分钟转速下离心1分钟后，吸去700μL上清；用移液器轻轻吹吸剩余培养基后涂布在含有卡那霉素的LB固体平板上，倒置于37℃培养箱中，培养12小时。

d)挑取上述平板中的单菌落，小量扩增后提取质粒，用NdeⅠ和HindⅢ单酶切双酶切所提取质粒后经琼脂糖凝胶电泳鉴定，经测序鉴定正确后，得到的pET28a(+)-ΔspMBP-bR-ApoAI*-His载体，其中ΔspMBP-bR-ApoAI*-His段核苷酸序列如序列表SEQ NO.15。构建得到的pET28a(+)-ΔspMBP-bR-ApoAI*-6His质粒图谱如图6所示。

3、目的蛋白融合载体pET28a(+)-sfGFP-bR-ApoAI*-His构建方法：

a)用PstⅠ限制性核酸内切酶和NotⅠ限制性核酸内切酶对pET28a(+)-ΔspMBP-bR-ApoAI*-6His质粒和pET28a(+)-sfGFP质粒进行酶切，进行琼脂糖凝胶电泳鉴定结果如图7。连接反应得到pET28a(+)-sfGFP-bR-ApoAI*-His载体；

结果如图7所示，第一道为Marker，第二道为bR-ApoAI*-His，目的片段长度为1415bp。

b)将pET28a(+)-sfGFP-bR-ApoAI*-His载体(酶连产物)进行42℃热激法转化入100μL DH5α感受态细胞后，加入700μL LB培养基后置于37℃摇床，在200转/分钟下培养40分钟。

c)上述菌液在12000转/分钟转速下离心1分钟后，吸去700μL上清；用移液器轻轻吹吸剩余培养基后涂布在含有卡那霉素的LB固体平板上，倒置于37℃培养箱中，培养12小时。

d)挑取上述平板中的单菌落，小量扩增后提取质粒，用NcoⅠ和NotⅠ单酶切双酶切后经琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图8。构建得到的pET28a(+)-sfGFP-bR-ApoAI*-His(MBA)质粒图谱如图9所示。

4、融合蛋白水溶性验证及可视化表达

选取对数生长期作为诱导起始点。37℃下培养至OD₆₀₀达到0.8-1.0，在培养的七瓶菌液中分别加入浓度为0mM、0.8mM、1mM、1.5mM、2mM、3mM的IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)，后每间隔一小时4000转/分钟离心15分钟收集菌体。将菌体重悬于PBS缓冲液中，加入2×Loading Buffer(含β-Me)后混合均匀，经过4000转/分钟离心30分钟，即得到可溶性融合表达离子通道蛋白sfGFP-bR-ApoAI*-His的样品。

选取对数生长期作为诱导起始点。37℃下培养至OD600达到0.8-1.0，收全菌按上述方法制备蛋白样品5。

加入1mM IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导一个半小时后收菌，加入100mM配制好的PMSF(苯甲基磺酰氟，一种蛋白酶抑制剂)溶液4000转/分钟、4℃离心15分钟后取沉淀(沉淀1)重悬于PBS缓冲液中，加入2×Loading Buffer(含β-Me)后混合均匀，95℃热变性7分钟，经过12000转/分钟离心30分钟，取上清液为蛋白样品6；

另将上清液取出加入100mM配制好的PMSF(苯甲基磺酰氟-蛋白酶抑制剂)溶液20000g、4℃离心两小时，取沉淀(沉淀2)按上述步骤制备蛋白样品7，取上清加入PBS混合均匀，2s一次，间隔4s超声破碎15分钟，取样按步骤2制备蛋白样品8。

与此同时，进行对照样品的制备。未诱导的转入sfGFP-bR-ApoAI*-His质粒的大肠杆菌BL21(DE3)按上述相同的方法制备四种蛋白样品1、2、3、4。

负对照为未转入sfGFP-bR-ApoAI*-His质粒的大肠杆菌二次接种收菌后制备的样品。

将制得的样品1、2、3、4、5、6、7、8进行SDS-PAGE跑胶后进行Western Blot得到图10。

上述样品在制备过程中每一步都会有PBS重悬的步骤，此时在CCD下进行荧光成像，绿色光激发。图11为荧光图像，由图中可以看出，空白对照和未诱导前全菌都没有荧光，说明bR蛋白未表达。而在已诱导全菌中可看到荧光，说明bR蛋白表达；在沉淀样品中无荧光，但是上清液中有荧光，说明bR蛋白是水溶性的。

序列表

<110> 南京理工大学

<120> 可视化的离子通道蛋白bR可溶性融合表达载体及其构建方法

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 711

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 1

tctaaaggtg aagaactgtt caccggtgtt gttccgatcc tggttgaact ggacggtgac 60

gttaacggtc acaaattctc tgttcgtggt gaaggtgaag gtgacgctac caacggtaaa 120

ctgaccctga aattcatctg caccaccggt aaactgccgg ttccgtggcc gaccctggtt 180

accaccctga cctacggtgt tcagtgcttc tctcgttacc cggaccacat gaaacgtcac 240

gacttcttca aatctgctat gccggaaggt tacgttcagg aacgtaccat ctctttcaaa 300

gacgacggta cctacaaaac ccgtgctgaa gttaaattcg aaggtgacac cctggttaac 360

cgtatcgaac tgaaaggtat cgacttcaaa gaagacggta acatcctggg tcacaaactg 420

gaatacaact tcaactctca caacgtttac atcaccgctg acaaacagaa aaacggtatc 480

aaagctaact tcaaaatccg tcacaacgtt gaagacggtt ctgttcagct ggctgaccac 540

taccagcaga acaccccgat cggtgacggt ccggttctgc tgccggacaa ccactacctg 600

tctacccagt ctgttctgtc taaagacccg aacgaaaaac gtgaccacat ggttctgctg 660

gaattcgtta ccgctgctgg tatcacccac ggtatggacg aactgtacaa a 711

<210> 2

<211> 7710

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccaccaccac cactgagatc cggctgctaa caaagcccga aaggaagctg agttggctgc 60

tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc tctaaacggg tcttgagggg 120

ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg attggcgaat gggacgcgcc ctgtagcggc 180

gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc 240

ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc 300

cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc 360

gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg 420

gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gttccaaact 480

ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt tataagggat tttgccgatt 540

tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa 600

atattaacgt ttacaatttc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt 660

tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgaattaatt cttagaaaaa 720

ctcatcgagc atcaaatgaa actgcaattt attcatatca ggattatcaa taccatattt 780

ttgaaaaagc cgtttctgta atgaaggaga aaactcaccg aggcagttcc ataggatggc 840

aagatcctgg tatcggtctg cgattccgac tcgtccaaca tcaatacaac ctattaattt 900

cccctcgtca aaaataaggt tatcaagtga gaaatcacca tgagtgacga ctgaatccgg 960

tgagaatggc aaaagtttat gcatttcttt ccagacttgt tcaacaggcc agccattacg 1020

ctcgtcatca aaatcactcg catcaaccaa accgttattc attcgtgatt gcgcctgagc 1080

gagacgaaat acgcgatcgc tgttaaaagg acaattacaa acaggaatcg aatgcaaccg 1140

gcgcaggaac actgccagcg catcaacaat attttcacct gaatcaggat attcttctaa 1200

tacctggaat gctgttttcc cggggatcgc agtggtgagt aaccatgcat catcaggagt 1260

acggataaaa tgcttgatgg tcggaagagg cataaattcc gtcagccagt ttagtctgac 1320

catctcatct gtaacatcat tggcaacgct acctttgcca tgtttcagaa acaactctgg 1380

cgcatcgggc ttcccataca atcgatagat tgtcgcacct gattgcccga cattatcgcg 1440

agcccattta tacccatata aatcagcatc catgttggaa tttaatcgcg gcctagagca 1500

agacgtttcc cgttgaatat ggctcataac accccttgta ttactgttta tgtaagcaga 1560

cagttttatt gttcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag 1620

accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct 1680

gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac 1740

caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgtccttc 1800

tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg 1860

ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt 1920

tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt 1980

gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc 2040

tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca 2100

gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata 2160

gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg 2220

ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct 2280

ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta 2340

ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag 2400

tgagcgagga agcggaagag cgcctgatgc ggtattttct ccttacgcat ctgtgcggta 2460

tttcacaccg catatatggt gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag 2520

ccagtataca ctccgctatc gctacgtgac tgggtcatgg ctgcgccccg acacccgcca 2580

acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta cagacaagct 2640

gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg 2700

aggcagctgc ggtaaagctc atcagcgtgg tcgtgaagcg attcacagat gtctgcctgt 2760

tcatccgcgt ccagctcgtt gagtttctcc agaagcgtta atgtctggct tctgataaag 2820

cgggccatgt taagggcggt tttttcctgt ttggtcactg atgcctccgt gtaaggggga 2880

tttctgttca tgggggtaat gataccgatg aaacgagaga ggatgctcac gatacgggtt 2940

actgatgatg aacatgcccg gttactggaa cgttgtgagg gtaaacaact ggcggtatgg 3000

atgcggcggg accagagaaa aatcactcag ggtcaatgcc agcgcttcgt taatacagat 3060

gtaggtgttc cacagggtag ccagcagcat cctgcgatgc agatccggaa cataatggtg 3120

cagggcgctg acttccgcgt ttccagactt tacgaaacac ggaaaccgaa gaccattcat 3180

gttgttgctc aggtcgcaga cgttttgcag cagcagtcgc ttcacgttcg ctcgcgtatc 3240

ggtgattcat tctgctaacc agtaaggcaa ccccgccagc ctagccgggt cctcaacgac 3300

aggagcacga tcatgcgcac ccgtggggcc gccatgccgg cgataatggc ctgcttctcg 3360

ccgaaacgtt tggtggcggg accagtgacg aaggcttgag cgagggcgtg caagattccg 3420

aataccgcaa gcgacaggcc gatcatcgtc gcgctccagc gaaagcggtc ctcgccgaaa 3480

atgacccaga gcgctgccgg cacctgtcct acgagttgca tgataaagaa gacagtcata 3540

agtgcggcga cgatagtcat gccccgcgcc caccggaagg agctgactgg gttgaaggct 3600

ctcaagggca tcggtcgaga tcccggtgcc taatgagtga gctaacttac attaattgcg 3660

ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc 3720

ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgcc agggtggttt ttcttttcac 3780

cagtgagacg ggcaacagct gattgccctt caccgcctgg ccctgagaga gttgcagcaa 3840

gcggtccacg ctggtttgcc ccagcaggcg aaaatcctgt ttgatggtgg ttaacggcgg 3900

gatataacat gagctgtctt cggtatcgtc gtatcccact accgagatat ccgcaccaac 3960

gcgcagcccg gactcggtaa tggcgcgcat tgcgcccagc gccatctgat cgttggcaac 4020

cagcatcgca gtgggaacga tgccctcatt cagcatttgc atggtttgtt gaaaaccgga 4080

catggcactc cagtcgcctt cccgttccgc tatcggctga atttgattgc gagtgagata 4140

tttatgccag ccagccagac gcagacgcgc cgagacagaa cttaatgggc ccgctaacag 4200

cgcgatttgc tggtgaccca atgcgaccag atgctccacg cccagtcgcg taccgtcttc 4260

atgggagaaa ataatactgt tgatgggtgt ctggtcagag acatcaagaa ataacgccgg 4320

aacattagtg caggcagctt ccacagcaat ggcatcctgg tcatccagcg gatagttaat 4380

gatcagccca ctgacgcgtt gcgcgagaag attgtgcacc gccgctttac aggcttcgac 4440

gccgcttcgt tctaccatcg acaccaccac gctggcaccc agttgatcgg cgcgagattt 4500

aatcgccgcg acaatttgcg acggcgcgtg cagggccaga ctggaggtgg caacgccaat 4560

cagcaacgac tgtttgcccg ccagttgttg tgccacgcgg ttgggaatgt aattcagctc 4620

cgccatcgcc gcttccactt tttcccgcgt tttcgcagaa acgtggctgg cctggttcac 4680

cacgcgggaa acggtctgat aagagacacc ggcatactct gcgacatcgt ataacgttac 4740

tggtttcaca ttcaccaccc tgaattgact ctcttccggg cgctatcatg ccataccgcg 4800

aaaggttttg cgccattcga tggtgtccgg gatctcgacg ctctccctta tgcgactcct 4860

gcattaggaa gcagcccagt agtaggttga ggccgttgag caccgccgcc gcaaggaatg 4920

gtgcatgcaa ggagatggcg cccaacagtc ccccggccac ggggcctgcc accataccca 4980

cgccgaaaca agcgctcatg agcccgaagt ggcgagcccg atcttcccca tcggtgatgt 5040

cggcgatata ggcgccagca accgcacctg tggcgccggt gatgccggcc acgatgcgtc 5100

cggcgtagag gatcgagatc tcgatcccgc gaaattaata cgactcacta taggggaatt 5160

gtgagcggat aacaattccc ctctagattt aagaaggaga tataccatgg gcaaattcga 5220

gaaagatacc ggaattaaag tcaccgttga gcatccggat aaactggaag agaaattccc 5280

acaggttgcg gcaactggcg atggccctga cattatcttc tgggcacacg accgctttgg 5340

tggctacgct caatctggcc tgttggctga aatcaccccg gacaaagcgt tccaggacaa 5400

gctgtatccg tttacctggg atgccgtacg ttacaacggc aagctgattg cttacccgat 5460

cgctgttgaa gcgttatcgc tgatttataa caaagatctg ctgccgaacc cgccaaaaac 5520

ctgggaagag atcccggcgc tggataaaga actgaaagcg aaaggtaaga gcgcgctgat 5580

gttcaacctg caagaaccgt acttcacctg gccgctgatt gctgctgacg ggggttatgc 5640

gttcaagtat gaaaacggca agtacgacat taaagacgtg ggcgtggata acgctggcgc 5700

gaaagcgggt ctgaccttcc tggttgacct gattaaaaac aaacacatga atgcagacac 5760

cgattactcc atcgcagaag ctgcctttaa taaaggcgaa acagcgatga ccatcaacgg 5820

cccgtgggca tggtccaaca tcgacaccag caaagtgaat tatggtgtaa cggtactgcc 5880

gaccttcaag ggtcaaccat ccaaaccgtt cgttggcgtg ctgagcgcag gtattaacgc 5940

cgccagtccg aacaaagagc tggcgaaaga gttcctcgaa aactatctgc tgactgatga 6000

aggtctggaa gcggttaata aagacaaacc gctgggtgcc gtagcgctga agtcttacga 6060

ggaagagttg gcgaaagatc cacgtattgc cgccaccgtg gaaaacgccc agaaaggtga 6120

aatcatgccg aacatcccgc agatgtccgc tttctggtat gccgtgcgta ctgcggtgat 6180

caacgccgcc agcggtcgtc agactgtcga tgaagccctg aaagacgcgc agactaatct 6240

gcagggatct ggcagtggtt ctctggtgcc gcgcggcagc catatgctgg aactgctgcc 6300

gaccgcggtg gaaggtgtga gccaggcgca gattaccggt cgtccggaat ggatctggct 6360

ggcgctgggt accgcgctga tgggcctggg taccctgtat tttctggtga aaggtatggg 6420

cgtgagcgat ccggatgcga aaaaatttta tgcgatcacc accctggtgc cggcgatcgc 6480

gtttaccatg tatctgagca tgctgctggg ttatggcctg accatggtgc cgtttggcgg 6540

cgaacagaac ccgatttatt gggcgcgcta tgcggattgg ctgtttacca ccccgctgct 6600

gctgctggat ctggcgctgc tggtggatgc ggatcagggc accatcctgg cgctggtggg 6660

cgcggatggc atcatgatcg gtaccggcct ggtgggcgcg ctgaccaaag tgtatagcta 6720

tcgttttgtg tggtgggcga ttagcaccgc ggcgatgctg tatattctgt atgtgctgtt 6780

ttttggtttt accagcaaag cggaaagcat gcgtccggaa gtggcgagca cctttaaagt 6840

gctgcgtaac gtgaccgtgg tgctgtggag cgcgtatccg gtggtgtggc tgattggtag 6900

cgaaggcgcg ggtattgtgc cgctgaatat cgaaaccctg ctgtttatgg tgctggatgt 6960

gagcgcgaaa gtgggttttg gcctgattct gctgcgtagc cgtgcgattt ttggtgaagc 7020

ggaagcgccg gaaccgagcg cgggtgatgg cgcggcggcg accagcgata agcttgatga 7080

cgacgacaag atgaagctcc ttgacaactg ggacagcgtg acctctacct tcagtaaact 7140

tcgcgaacaa ctgggccccg tgacgcagga attctgggac aacctggaaa aagaaaccga 7200

gggactgcgt caggaaatgt ccaaagattt agaagaggtg aaggccaagg ttcagccata 7260

tctcgatgac tttcagaaaa aatggcagga agagatggaa ttatatcgtc aaaaggtgga 7320

accgctgcgt gcggaactgc aagagggggc acgccaaaaa ctccatgagc tccaagagaa 7380

gctcagccca ttaggcgaag aaatgcgcga tcgcgcccgt gcacatgttg atgcactccg 7440

gactcatttg gcgccgtatt cggatgaact tcgccagcgt ttggccgcac gtctcgaggc 7500

gctgaaagaa aacgggggtg cccgcttggc tgagtaccac gcgaaagcga cagaacacct 7560

gagcaccttg agcgaaaaag cgaaaccggc gctggaagat ctacgccagg gcttattgcc 7620

tgttcttgag agctttaaag tcagttttct gtcagctctg gaagaatata ctaaaaagct 7680

gaatacccag gcggccgcac tcgagcacca 7710

<210> 3

<211> 1039

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 3

atgggcaaat tcgagaaaga taccggaatt aaagtcaccg ttgagcatcc ggataaactg 60

gaagagaaat tcccacaggt tgcggcaact ggcgatggcc ctgacattat cttctgggca 120

cacgaccgct ttggtggcta cgctcaatct ggcctgttgg ctgaaatcac cccggacaaa 180

gcgttccagg acaagctgta tccgtttacc tgggatgccg tacgttacaa cggcaagctg 240

attgcttacc cgatcgctgt tgaagcgtta tcgctgattt ataacaaaga tctgctgccg 300

aacccgccaa aaacctggga agagatcccg gcgctggata aagaactgaa agcgaaaggt 360

aagagcgcgc tgatgttcaa cctgcaagaa ccgtacttca cctggccgct gattgctgct 420

gacgggggtt atgcgttcaa gtatgaaaac ggcaagtacg acattaaaga cgtgggcgtg 480

gataacgctg gcgcgaaagc gggtctgacc ttcctggttg acctgattaa aaacaaacac 540

atgaatgcag acaccgatta ctccatcgca gaagctgcct ttaataaagg cgaaacagcg 600

atgaccatca acggcccgtg ggcatggtcc aacatcgaca ccagcaaagt gaattatggt 660

gtaacggtac tgccgacctt caagggtcaa ccatccaaac cgttcgttgg cgtgctgagc 720

gcaggtatta acgccgccag tccgaacaaa gagctggcga aagagttcct cgaaaactat 780

ctgctgactg atgaaggtct ggaagcggtt aataaagaca aaccgctggg tgccgtagcg 840

ctgaagtctt acgaggaaga gttggcgaaa gatccacgta ttgccgccac cgtggaaaac 900

gcccagaaag gtgaaatcat gccgaacatc ccgcagatgt ccgctttctg gtatgccgtg 960

cgtactgcgg tgatcaacgc cgccagcggt cgtcagactg tcgatgaagc cctgaaagac 1020

gcgcagacta atctgcagg 1039

<210> 4

<211> 600

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 4

atgaagctcc ttgacaactg ggacagcgtg acctctacct tcagtaaact tcgcgaacaa 60

ctgggccccg tgacgcagga attctgggac aacctggaaa aagaaaccga gggactgcgt 120

caggaaatgt ccaaagattt agaagaggtg aaggccaagg ttcagccata tctcgatgac 180

tttcagaaaa aatggcagga agagatggaa ttatatcgtc aaaaggtgga accgctgcgt 240

gcggaactgc aagagggggc acgccaaaaa ctccatgagc tccaagagaa gctcagccca 300

ttaggcgaag aaatgcgcga tcgcgcccgt gcacatgttg atgcactccg gactcatttg 360

gcgccgtatt cggatgaact tcgccagcgt ttggccgcac gtctcgaggc gctgaaagaa 420

aacgggggtg cccgcttggc tgagtaccac gcgaaagcga cagaacacct gagcaccttg 480

agcgaaaaag cgaaaccggc gctggaagat ctacgccagg gcttattgcc tgttcttgag 540

agctttaaag tcagttttct gtcagctctg gaagaatata ctaaaaagct gaatacccag 600

<210> 5

<211> 786

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 5

atgctggaac tgctgccgac cgcggtggaa ggtgtgagcc aggcgcagat taccggtcgt 60

ccggaatgga tctggctggc gctgggtacc gcgctgatgg gcctgggtac cctgtatttt 120

ctggtgaaag gtatgggcgt gagcgatccg gatgcgaaaa aattttatgc gatcaccacc 180

ctggtgccgg cgatcgcgtt taccatgtat ctgagcatgc tgctgggtta tggcctgacc 240

atggtgccgt ttggcggcga acagaacccg atttattggg cgcgctatgc ggattggctg 300

tttaccaccc cgctgctgct gctggatctg gcgctgctgg tggatgcgga tcagggcacc 360

atcctggcgc tggtgggcgc ggatggcatc atgatcggta ccggcctggt gggcgcgctg 420

accaaagtgt atagctatcg ttttgtgtgg tgggcgatta gcaccgcggc gatgctgtat 480

attctgtatg tgctgttttt tggttttacc agcaaagcgg aaagcatgcg tccggaagtg 540

gcgagcacct ttaaagtgct gcgtaacgtg accgtggtgc tgtggagcgc gtatccggtg 600

gtgtggctga ttggtagcga aggcgcgggt attgtgccgc tgaatatcga aaccctgctg 660

tttatggtgc tggatgtgag cgcgaaagtg ggttttggcc tgattctgct gcgtagccgt 720

gcgatttttg gtgaagcgga agcgccggaa ccgagcgcgg gtgatggcgc ggcggcgacc 780

agcgat 786

<210> 6

<211> 7411

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aatgggacgc gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg 60

tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc 120

tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc 180

gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga ttagggtgat ggttcacgta 240

gtgggccatc gccctgatag acggtttttc gccctttgac gttggagtcc acgttcttta 300

atagtggact cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc tatctcggtc tattcttttg 360

atttataagg gattttgccg atttcggcct attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa 420

aatttaacgc gaattttaac aaaatattaa cgtttacaat ttcaggtggc acttttcggg 480

gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc 540

tcatgaatta attcttagaa aaactcatcg agcatcaaat gaaactgcaa tttattcata 600

tcaggattat caataccata tttttgaaaa agccgtttct gtaatgaagg agaaaactca 660

ccgaggcagt tccataggat ggcaagatcc tggtatcggt ctgcgattcc gactcgtcca 720

acatcaatac aacctattaa tttcccctcg tcaaaaataa ggttatcaag tgagaaatca 780

ccatgagtga cgactgaatc cggtgagaat ggcaaaagtt tatgcatttc tttccagact 840

tgttcaacag gccagccatt acgctcgtca tcaaaatcac tcgcatcaac caaaccgtta 900

ttcattcgtg attgcgcctg agcgagacga aatacgcgat cgctgttaaa aggacaatta 960

caaacaggaa tcgaatgcaa ccggcgcagg aacactgcca gcgcatcaac aatattttca 1020

cctgaatcag gatattcttc taatacctgg aatgctgttt tcccggggat cgcagtggtg 1080

agtaaccatg catcatcagg agtacggata aaatgcttga tggtcggaag aggcataaat 1140

tccgtcagcc agtttagtct gaccatctca tctgtaacat cattggcaac gctacctttg 1200

ccatgtttca gaaacaactc tggcgcatcg ggcttcccat acaatcgata gattgtcgca 1260

cctgattgcc cgacattatc gcgagcccat ttatacccat ataaatcagc atccatgttg 1320

gaatttaatc gcggcctaga gcaagacgtt tcccgttgaa tatggctcat aacacccctt 1380

gtattactgt ttatgtaagc agacagtttt attgttcatg accaaaatcc cttaacgtga 1440

gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc 1500

tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt 1560

ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc 1620

gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc 1680

tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg 1740

cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg 1800

gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga 1860

actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc 1920

ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg 1980

gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg 2040

atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt 2100

tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc 2160

tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg 2220

aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcctga tgcggtattt 2280

tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca ccgcatatat ggtgcactct cagtacaatc 2340

tgctctgatg ccgcatagtt aagccagtat acactccgct atcgctacgt gactgggtca 2400

tggctgcgcc ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgctcc 2460

cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg tctccgggag ctgcatgtgt cagaggtttt 2520

caccgtcatc accgaaacgc gcgaggcagc tgcggtaaag ctcatcagcg tggtcgtgaa 2580

gcgattcaca gatgtctgcc tgttcatccg cgtccagctc gttgagtttc tccagaagcg 2640

ttaatgtctg gcttctgata aagcgggcca tgttaagggc ggttttttcc tgtttggtca 2700

ctgatgcctc cgtgtaaggg ggatttctgt tcatgggggt aatgataccg atgaaacgag 2760

agaggatgct cacgatacgg gttactgatg atgaacatgc ccggttactg gaacgttgtg 2820

agggtaaaca actggcggta tggatgcggc gggaccagag aaaaatcact cagggtcaat 2880

gccagcgctt cgttaataca gatgtaggtg ttccacaggg tagccagcag catcctgcga 2940

tgcagatccg gaacataatg gtgcagggcg ctgacttccg cgtttccaga ctttacgaaa 3000

cacggaaacc gaagaccatt catgttgttg ctcaggtcgc agacgttttg cagcagcagt 3060

cgcttcacgt tcgctcgcgt atcggtgatt cattctgcta accagtaagg caaccccgcc 3120

agcctagccg ggtcctcaac gacaggagca cgatcatgcg cacccgtggg gccgccatgc 3180

cggcgataat ggcctgcttc tcgccgaaac gtttggtggc gggaccagtg acgaaggctt 3240

gagcgagggc gtgcaagatt ccgaataccg caagcgacag gccgatcatc gtcgcgctcc 3300

agcgaaagcg gtcctcgccg aaaatgaccc agagcgctgc cggcacctgt cctacgagtt 3360

gcatgataaa gaagacagtc ataagtgcgg cgacgatagt catgccccgc gcccaccgga 3420

aggagctgac tgggttgaag gctctcaagg gcatcggtcg agatcccggt gcctaatgag 3480

tgagctaact tacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt 3540

cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc 3600

gccagggtgg tttttctttt caccagtgag acgggcaaca gctgattgcc cttcaccgcc 3660

tggccctgag agagttgcag caagcggtcc acgctggttt gccccagcag gcgaaaatcc 3720

tgtttgatgg tggttaacgg cgggatataa catgagctgt cttcggtatc gtcgtatccc 3780

actaccgaga tatccgcacc aacgcgcagc ccggactcgg taatggcgcg cattgcgccc 3840

agcgccatct gatcgttggc aaccagcatc gcagtgggaa cgatgccctc attcagcatt 3900

tgcatggttt gttgaaaacc ggacatggca ctccagtcgc cttcccgttc cgctatcggc 3960

tgaatttgat tgcgagtgag atatttatgc cagccagcca gacgcagacg cgccgagaca 4020

gaacttaatg ggcccgctaa cagcgcgatt tgctggtgac ccaatgcgac cagatgctcc 4080

acgcccagtc gcgtaccgtc ttcatgggag aaaataatac tgttgatggg tgtctggtca 4140

gagacatcaa gaaataacgc cggaacatta gtgcaggcag cttccacagc aatggcatcc 4200

tggtcatcca gcggatagtt aatgatcagc ccactgacgc gttgcgcgag aagattgtgc 4260

accgccgctt tacaggcttc gacgccgctt cgttctacca tcgacaccac cacgctggca 4320

cccagttgat cggcgcgaga tttaatcgcc gcgacaattt gcgacggcgc gtgcagggcc 4380

agactggagg tggcaacgcc aatcagcaac gactgtttgc ccgccagttg ttgtgccacg 4440

cggttgggaa tgtaattcag ctccgccatc gccgcttcca ctttttcccg cgttttcgca 4500

gaaacgtggc tggcctggtt caccacgcgg gaaacggtct gataagagac accggcatac 4560

tctgcgacat cgtataacgt tactggtttc acattcacca ccctgaattg actctcttcc 4620

gggcgctatc atgccatacc gcgaaaggtt ttgcgccatt cgatggtgtc cgggatctcg 4680

acgctctccc ttatgcgact cctgcattag gaagcagccc agtagtaggt tgaggccgtt 4740

gagcaccgcc gccgcaagga atggtgcatg caaggagatg gcgcccaaca gtcccccggc 4800

cacggggcct gccaccatac ccacgccgaa acaagcgctc atgagcccga agtggcgagc 4860

ccgatcttcc ccatcggtga tgtcggcgat ataggcgcca gcaaccgcac ctgtggcgcc 4920

ggtgatgccg gccacgatgc gtccggcgta gaggatcgag atctcgatcc cgcgaaatta 4980

atacgactca ctatagggga attgtgagcg gataacaatt cccctctaga aataattttg 5040

tttaacttta agaaggagat ataccatggg ctctaaaggt gaagaactgt tcaccggtgt 5100

tgttccgatc ctggttgaac tggacggtga cgttaacggt cacaaattct ctgttcgtgg 5160

tgaaggtgaa ggtgacgcta ccaacggtaa actgaccctg aaattcatct gcaccaccgg 5220

taaactgccg gttccgtggc cgaccctggt taccaccctg acctacggtg ttcagtgctt 5280

ctctcgttac ccggaccaca tgaaacgtca cgacttcttc aaatctgcta tgccggaagg 5340

ttacgttcag gaacgtacca tctctttcaa agacgacggt acctacaaaa cccgtgctga 5400

agttaaattc gaaggtgaca ccctggttaa ccgtatcgaa ctgaaaggta tcgacttcaa 5460

agaagacggt aacatcctgg gtcacaaact ggaatacaac ttcaactctc acaacgttta 5520

catcaccgct gacaaacaga aaaacggtat caaagctaac ttcaaaatcc gtcacaacgt 5580

tgaagacggt tctgttcagc tggctgacca ctaccagcag aacaccccga tcggtgacgg 5640

tccggttctg ctgccggaca accactacct gtctacccag tctgttctgt ctaaagaccc 5700

gaacgaaaaa cgtgaccaca tggttctgct ggaattcgtt accgctgctg gtatcaccca 5760

cggtatggac gaactgtaca aactgcaggg atctggcagt ggttctctgg tgccgcgcgg 5820

cagccatatg ctggaactgc tgccgaccgc ggtggaaggt gtgagccagg cgcagattac 5880

cggtcgtccg gaatggatct ggctggcgct gggtaccgcg ctgatgggcc tgggtaccct 5940

gtattttctg gtgaaaggta tgggcgtgag cgatccggat gcgaaaaaat tttatgcgat 6000

caccaccctg gtgccggcga tcgcgtttac catgtatctg agcatgctgc tgggttatgg 6060

cctgaccatg gtgccgtttg gcggcgaaca gaacccgatt tattgggcgc gctatgcgga 6120

ttggctgttt accaccccgc tgctgctgct ggatctggcg ctgctggtgg atgcggatca 6180

gggcaccatc ctggcgctgg tgggcgcgga tggcatcatg atcggtaccg gcctggtggg 6240

cgcgctgacc aaagtgtata gctatcgttt tgtgtggtgg gcgattagca ccgcggcgat 6300

gctgtatatt ctgtatgtgc tgttttttgg ttttaccagc aaagcggaaa gcatgcgtcc 6360

ggaagtggcg agcaccttta aagtgctgcg taacgtgacc gtggtgctgt ggagcgcgta 6420

tccggtggtg tggctgattg gtagcgaagg cgcgggtatt gtgccgctga atatcgaaac 6480

cctgctgttt atggtgctgg atgtgagcgc gaaagtgggt tttggcctga ttctgctgcg 6540

tagccgtgcg atttttggtg aagcggaagc gccggaaccg agcgcgggtg atggcgcggc 6600

ggcgaccagc gataagcttg atgacgacga caagatgaag ctccttgaca actgggacag 6660

cgtgacctct accttcagta aacttcgcga acaactgggc cccgtgacgc aggaattctg 6720

ggacaacctg gaaaaagaaa ccgagggact gcgtcaggaa atgtccaaag atttagaaga 6780

ggtgaaggcc aaggttcagc catatctcga tgactttcag aaaaaatggc aggaagagat 6840

ggaattatat cgtcaaaagg tggaaccgct gcgtgcggaa ctgcaagagg gggcacgcca 6900

aaaactccat gagctccaag agaagctcag cccattaggc gaagaaatgc gcgatcgcgc 6960

ccgtgcacat gttgatgcac tccggactca tttggcgccg tattcggatg aacttcgcca 7020

gcgtttggcc gcacgtctcg aggcgctgaa agaaaacggg ggtgcccgct tggctgagta 7080

ccacgcgaaa gcgacagaac acctgagcac cttgagcgaa aaagcgaaac cggcgctgga 7140

agatctacgc cagggcttat tgcctgttct tgagagcttt aaagtcagtt ttctgtcagc 7200

tctggaagaa tatactaaaa agctgaatac ccaggcggcc gcactcgagc accaccacca 7260

ccaccactga gatccggctg ctaacaaagc ccgaaaggaa gctgagttgg ctgctgccac 7320

cgctgagcaa taactagcat aaccccttgg ggcctctaaa cgggtcttga ggggtttttt 7380

gctgaaagga ggaactatat ccggattggc g 7411

<210> 7

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

catgccatgg gctctaaagg tgaagaactg ttcaccg 37

<210> 8

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggaattccat atgggcctgc agtttgtaca gttcgtccat accg 44

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggaattccat atgctggaac tgctgcc 27

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atcgctggtc gccgcatcgc tggtcgccgc 30

<210> 11

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

catgccatgg gccatcatca tcatcatcat catcatcatc acagcagcgg atccaaattc 60

gagaaagata ccgg 74

<210> 12

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tatcatatgg ctgccgcgcg gcaccagaga accactgcca gatccctgca gattagtctg 60

cgcgtctttc 70

<210> 13

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cgcaagctta tgaagctcct tgacaactgg gacagcg 37

<210> 14

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atttgcggcc gcctgggtat tcagcttttt agtatattc 39

<210> 15

<211> 2562

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 15

gcggataaca attcccctct agatttaaga aggagatata ccatgggcaa attcgagaaa 60

gataccggaa ttaaagtcac cgttgagcat ccggataaac tggaagagaa attcccacag 120

gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc 180

tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc accccggaca aagcgttcca ggacaagctg 240

tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct 300

gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg 360

gaagagatcc cggcgctgga taaagaactg aaagcgaaag gtaagagcgc gctgatgttc 420

aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg ctgattgctg ctgacggggg ttatgcgttc 480

aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa 540

gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt aaaaacaaac acatgaatgc agacaccgat 600

tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg 660

tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc 720

ttcaagggtc aaccatccaa accgttcgtt ggcgtgctga gcgcaggtat taacgccgcc 780

agtccgaaca aagagctggc gaaagagttc ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt 840

ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg ggtgccgtag cgctgaagtc ttacgaggaa 900

gagttggcga aagatccacg tattgccgcc accgtggaaa acgcccagaa aggtgaaatc 960

atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc tggtatgccg tgcgtactgc ggtgatcaac 1020

gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa gccctgaaag acgcgcagac taatctgcag 1080

ggatctggca gtggttctct ggtgccgcgc ggcagccata tgctggaact gctgccgacc 1140

gcggtggaag gtgtgagcca ggcgcagatt accggtcgtc cggaatggat ctggctggcg 1200

ctgggtaccg cgctgatggg cctgggtacc ctgtattttc tggtgaaagg tatgggcgtg 1260

agcgatccgg atgcgaaaaa attttatgcg atcaccaccc tggtgccggc gatcgcgttt 1320

accatgtatc tgagcatgct gctgggttat ggcctgacca tggtgccgtt tggcggcgaa 1380

cagaacccga tttattgggc gcgctatgcg gattggctgt ttaccacccc gctgctgctg 1440

ctggatctgg cgctgctggt ggatgcggat cagggcacca tcctggcgct ggtgggcgcg 1500

gatggcatca tgatcggtac cggcctggtg ggcgcgctga ccaaagtgta tagctatcgt 1560

tttgtgtggt gggcgattag caccgcggcg atgctgtata ttctgtatgt gctgtttttt 1620

ggttttacca gcaaagcgga aagcatgcgt ccggaagtgg cgagcacctt taaagtgctg 1680

cgtaacgtga ccgtggtgct gtggagcgcg tatccggtgg tgtggctgat tggtagcgaa 1740

ggcgcgggta ttgtgccgct gaatatcgaa accctgctgt ttatggtgct ggatgtgagc 1800

gcgaaagtgg gttttggcct gattctgctg cgtagccgtg cgatttttgg tgaagcggaa 1860

gcgccggaac cgagcgcggg tgatggcgcg gcggcgacca gcgataagct tgatgacgac 1920

gacaagatga agctccttga caactgggac agcgtgacct ctaccttcag taaacttcgc 1980

gaacaactgg gccccgtgac gcaggaattc tgggacaacc tggaaaaaga aaccgaggga 2040

ctgcgtcagg aaatgtccaa agatttagaa gaggtgaagg ccaaggttca gccatatctc 2100

gatgactttc agaaaaaatg gcaggaagag atggaattat atcgtcaaaa ggtggaaccg 2160

ctgcgtgcgg aactgcaaga gggggcacgc caaaaactcc atgagctcca agagaagctc 2220

agcccattag gcgaagaaat gcgcgatcgc gcccgtgcac atgttgatgc actccggact 2280

catttggcgc cgtattcgga tgaacttcgc cagcgtttgg ccgcacgtct cgaggcgctg 2340

aaagaaaacg ggggtgcccg cttggctgag taccacgcga aagcgacaga acacctgagc 2400

accttgagcg aaaaagcgaa accggcgctg gaagatctac gccagggctt attgcctgtt 2460

cttgagagct ttaaagtcag ttttctgtca gctctggaag aatatactaa aaagctgaat 2520

acccaggcgg ccgcactcga gcaccaccac caccaccact ga 2562

<210> 16

<211> 2235

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 16

ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atgggctcta aaggtgaaga actgttcacc 60

ggtgttgttc cgatcctggt tgaactggac ggtgacgtta acggtcacaa attctctgtt 120

cgtggtgaag gtgaaggtga cgctaccaac ggtaaactga ccctgaaatt catctgcacc 180

accggtaaac tgccggttcc gtggccgacc ctggttacca ccctgaccta cggtgttcag 240

tgcttctctc gttacccgga ccacatgaaa cgtcacgact tcttcaaatc tgctatgccg 300

gaaggttacg ttcaggaacg taccatctct ttcaaagacg acggtaccta caaaacccgt 360

gctgaagtta aattcgaagg tgacaccctg gttaaccgta tcgaactgaa aggtatcgac 420

ttcaaagaag acggtaacat cctgggtcac aaactggaat acaacttcaa ctctcacaac 480

gtttacatca ccgctgacaa acagaaaaac ggtatcaaag ctaacttcaa aatccgtcac 540

aacgttgaag acggttctgt tcagctggct gaccactacc agcagaacac cccgatcggt 600

gacggtccgg ttctgctgcc ggacaaccac tacctgtcta cccagtctgt tctgtctaaa 660

gacccgaacg aaaaacgtga ccacatggtt ctgctggaat tcgttaccgc tgctggtatc 720

acccacggta tggacgaact gtacaaactg cagggatctg gcagtggttc tctggtgccg 780

cgcggcagcc atatgctgga actgctgccg accgcggtgg aaggtgtgag ccaggcgcag 840

attaccggtc gtccggaatg gatctggctg gcgctgggta ccgcgctgat gggcctgggt 900

accctgtatt ttctggtgaa aggtatgggc gtgagcgatc cggatgcgaa aaaattttat 960

gcgatcacca ccctggtgcc ggcgatcgcg tttaccatgt atctgagcat gctgctgggt 1020

tatggcctga ccatggtgcc gtttggcggc gaacagaacc cgatttattg ggcgcgctat 1080

gcggattggc tgtttaccac cccgctgctg ctgctggatc tggcgctgct ggtggatgcg 1140

gatcagggca ccatcctggc gctggtgggc gcggatggca tcatgatcgg taccggcctg 1200

gtgggcgcgc tgaccaaagt gtatagctat cgttttgtgt ggtgggcgat tagcaccgcg 1260

gcgatgctgt atattctgta tgtgctgttt tttggtttta ccagcaaagc ggaaagcatg 1320

cgtccggaag tggcgagcac ctttaaagtg ctgcgtaacg tgaccgtggt gctgtggagc 1380

gcgtatccgg tggtgtggct gattggtagc gaaggcgcgg gtattgtgcc gctgaatatc 1440

gaaaccctgc tgtttatggt gctggatgtg agcgcgaaag tgggttttgg cctgattctg 1500

ctgcgtagcc gtgcgatttt tggtgaagcg gaagcgccgg aaccgagcgc gggtgatggc 1560

gcggcggcga ccagcgataa gcttgatgac gacgacaaga tgaagctcct tgacaactgg 1620

gacagcgtga cctctacctt cagtaaactt cgcgaacaac tgggccccgt gacgcaggaa 1680

ttctgggaca acctggaaaa agaaaccgag ggactgcgtc aggaaatgtc caaagattta 1740

gaagaggtga aggccaaggt tcagccatat ctcgatgact ttcagaaaaa atggcaggaa 1800

gagatggaat tatatcgtca aaaggtggaa ccgctgcgtg cggaactgca agagggggca 1860

cgccaaaaac tccatgagct ccaagagaag ctcagcccat taggcgaaga aatgcgcgat 1920

cgcgcccgtg cacatgttga tgcactccgg actcatttgg cgccgtattc ggatgaactt 1980

cgccagcgtt tggccgcacg tctcgaggcg ctgaaagaaa acgggggtgc ccgcttggct 2040

gagtaccacg cgaaagcgac agaacacctg agcaccttga gcgaaaaagc gaaaccggcg 2100

ctggaagatc tacgccaggg cttattgcct gttcttgaga gctttaaagt cagttttctg 2160

tcagctctgg aagaatatac taaaaagctg aatacccagg cggccgcact cgagcaccac 2220

caccaccacc actga 2235

Claims

1.可视化的离子通道蛋白bR可溶性融合表达载体，其特征在于，利用PCR扩增pET19b-sfGFP质粒，得到sfGFP，将sfGFP整合到pET28a(+)质粒中得到pET28a(+)-sfGFP载体；PCR扩增pMBP-p质粒，得到除去N端信号肽的麦芽糖结合蛋白cDNA即ΔspMBP，将ΔspMBP整合到pET28a(+)质粒中得到pET28a(+)-ΔspMBP载体；PCR扩增pET28a(+)-ApoAI质粒，得到截短的人类载脂蛋白cDNA即ApoAI*，将ApoAI*整合到pET28a(+)-ΔspMBP载体中得到pET28a(+)-ΔspMBP-ApoAI*-His载体；PCR扩增密码子优化过的细菌视紫红质合成基因，将其整合到pET28a(+)-ΔspMBP-ApoAI*-His载体中，得到细菌视紫红质的可溶化表达载体pET28a-ΔspMBP-bR-ApoAI*-His；酶切ΔspMBP-bR-ApoAI*-His，得到bR-ApoAI*-His，将bR-ApoAI*-His整合到pET28a(+)-sfGFP载体中得到可视化的离子通道蛋白bR可溶性融合表达载体即pET28a(+)-sfGFP-bR-ApoAI*-His载体。

2.根据权利要求1所述的可视化的离子通道蛋白bR可溶性融合表达载体的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：

步骤1，pET28a(+)-sfGFP载体的构建：

先将pET19b-sfGFP质粒进行PCR后得到sfGFP片段，用NcoⅠ限制性核酸内切酶和NdeⅠ限制性核酸内切酶对sfGFP和pET28a(+)质粒进行酶切，连接反应得到pET28a(+)-sfGFP载体；

步骤2，pET28a(+)-ΔspMBP-bR-ApoAI*-His载体的构建：

步骤2.1，先将pMBP-p质粒进行PCR扩增，得到除去N端信号肽的麦芽糖结合蛋白cDNA即ΔspMBP，用NcoⅠ限制性核酸内切酶和NdeⅠ限制性核酸内切酶对ΔspMBP和pET28a(+)质粒进行酶切，连接反应得到pET28a(+)-ΔspMBP载体；

步骤2.2，将pET28a(+)-ApoAI质粒进行PCR扩增，得到截短的人类载脂蛋白cDNA即ApoAI*，用HindⅢ限制性核酸内切酶和NotⅠ限制性核酸内切酶对ApoAI*和pET28a(+)-ΔspMBP质粒进行酶切，在ApoAI*末端无终止子的情况下，引入pET28a(+)本身所带的His标签，连接反应得到pET28a(+)-ΔspMBP-ApoAI*-His载体；

步骤2.3，将密码子优化过的细菌视紫红质DNA进行PCR扩增，用NdeⅠ限制性核酸内切酶和HindⅢ限制性核酸内切酶对细菌视紫红质DNA和pET28a(+)-ΔspMBP-ApoAI*-His质粒进行酶切，连接反应得到pET28a(+)-ΔspMBP-bR-ApoAI*-His载体；

步骤3，pET28a(+)-sfGFP-bR-ApoAI*-His载体的构建：

用PstⅠ限制性核酸内切酶和NotⅠ限制性核酸内切酶对pET28a(+)-ΔspMBP-bR-ApoAI*-His和pET28a(+)-sfGFP质粒进行酶切，连接反应得到可视化的离子通道蛋白bR可溶性融合表达载体即pET28a(+)-sfGFP-bR-ApoAI*-His载体。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤2.3中，所述的优化为将原有序列中的对于大肠杆菌K-12菌株而言的稀有密码子和不利于蛋白翻译的碱基替换成易于在宿主菌中翻译表达的碱基。

4.根据权利要求1所述的可视化的离子通道蛋白bR可溶性融合表达载体的表达方法，其特征在于，具体步骤如下：将可视化的离子通道蛋白bR可溶性融合表达载体pET28a(+)-sfGFP-bR-ApoAI*-His载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，挑选阳性单克隆菌进行扩大培养和诱导表达，收集菌液，离心得到表达融合了高度折叠的绿色荧光蛋白sfGFP的细菌视紫红质的菌体。

5.根据权利要求4所述的表达方法，其特征在于，所述的诱导表达过程中，采用异丙基硫代半乳糖苷为诱导物。

6.根据权利要求5所述的表达方法，其特征在于，所述的诱导时间为1h。