CN116063465B - 针对h7亚型禽流感病毒的纳米抗体m111及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及针对H7亚型禽流感病毒的纳米抗体M111及其应用，属于分子生物学领域，本发明利用酵母双杂交技术成功筛选出针对H7亚型禽流感病毒的纳米抗体，构建真核表达系统，并验证所筛选出的纳米抗体对H7亚型禽流感病毒的结合能力，为该病毒的中和抗体的研究及快速诊断方法的开发提供技术支持和抗体材料。

Description

针对H7亚型禽流感病毒的纳米抗体M111及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及针对H7亚型禽流感病毒的纳米抗体M111及其应用。

背景技术

禽流感病毒属于正黏病毒科，分为A、B、C、D四种不同型的流感病毒。其中A型流感病毒变异最快，根据流感病毒的表面糖蛋白血凝素和神经氨酸酶抗原不同，将A型流感病毒HA分为18种亚型(H1～H18)，NA分为11种亚型(N1～N11)。而不同的HA和NA理论上可形成18×11种亚型病毒。禽流感病毒可以感染野鸟和家禽，H7亚型首次在意大利传播并流行，随后在德国、巴基斯坦、美国、澳大利亚等地相继爆发H7亚型禽流感疫情，导致数百万只鸡死亡，给家禽养殖业造成了重大的经济损失。虽然目前还没有发现人传人的病例，但禽流感H7亚型已经严重威胁了人类健康与社会公共卫生安全。

近年来，为减少疫病的传播，抗体发挥着重要的作用。抗体的发展经历了多克隆抗体、单克隆抗体，到目前的基因工程抗体三个阶段。单克隆抗体克服了多克隆抗体特异性低，均一性差的缺点；基因工程抗体是在单克隆抗体基础上，利用基因工程手段对抗体进行改造和修饰，通过构建嵌合抗体、小分子抗体、人源化抗体、多特异性抗体等，以改善抗体效力和功能。

纳米抗体也称为VHH抗体，最早被Hamers-Casterman等人发现，是存在于骆驼科动物内的天然缺乏轻链特殊类型的抗体，后来又在羊驼、大羊驼和鲨鱼等动物也发现了纳米抗体。由于纳米抗体只有常规抗体的单个N-末端结构，因此其重链分子量低于常规分子量。纳米抗体之所以能受到广泛的关注，是由于它具有以下优点：(1)分子量小，约15ku，仅为常规IgG抗体1/10；(2)稳定性强，水溶性高，不易聚集，且能在细胞内发挥作用；(3)亲和力高，纳米抗体与抗原结合的亲和力可达nM，甚至pM级；(4)能耐受极端理化环境，如在90℃高温或胃蛋白酶存在下仍具有活性；(5)可识别半抗原、隐蔽表位，甚至酶的凹槽部等常规抗体不能识别的位点；(6)易于制备，可在多种原核细胞、真核中表达，表达量高，成本低廉；(7)组织穿透性强，能穿过实体瘤和血脑屏障；(8)比常规的抗体更易于进行工程化改造。

在动物疫病上，可以通过噬菌体展示技术、酵母杂交和细菌展示技术筛选多种病原的纳米抗体，推动动物疫病防控技术的发展。

其中，酵母双杂交技术是检测蛋白质与蛋白质之间相互作用的首选方法，利用该方法从cDNA文库中寻找与已知蛋白相互作用的未知蛋白。酵母细胞中的Gal4结构具有两个不同的功能域：N端的DAN结合域(BD)和C端的激活域(AD)，BD和AD二者相互独立，互不干扰。若在诱饵蛋白(含有已知蛋白的基因序列)上加上BD的结构域，在猎物蛋白(含有未知蛋白的基因序列)上加上AD的结构域，诱饵蛋白和猎物蛋白相互作用时，BD和AD两个结构域在空间上相互靠近并与激活序列结合，从而使酵母特定的基因如LzcZ、HIS3、MEL1、ABAr等表达，使酵母能够在特定在营养缺陷培养基上进行生长并水解培养基上的无色透明的X-α-Gal，从而导致菌落出现蓝斑，筛选出目的蛋白。

该技术是在活细胞中进行的，避免了以往的研究技术中外界因素所造成的干扰，能够检测细胞内稳定的相互作用蛋白，也能检测到微弱和短暂蛋白间的相互作用，具有较高的灵敏度。同时也具有操作方便、成本低廉、应用广泛等诸多优势。

发明内容

针对现有技术中H7亚型禽流感病毒检测过程中灵敏度低、效率低等问题，本发明利用酵母双杂交技术成功筛选出针对H7亚型禽流感病毒的纳米抗体，构建真核表达系统，并验证所筛选出的纳米抗体对H7亚型禽流感病毒的结合能力，为该病毒的中和抗体的研究及快速诊断方法的开发提供技术支持和抗体材料。

本发明的第一方面，是提供一种针对H7亚型禽流感病毒的纳米抗体M111，所述纳米抗体M111的氨基酸序列如SEQ ID NO：02所示。

本发明的第二方面，是提供一种编码上述纳米抗体M11的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：01所示。

本发明的第三方面，是提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含编码上述纳米抗体M111的基因。

本发明的第四方面，是提供一种转化体，所述转化体是将上述重组表达载体转化宿主细胞所得。

本发明的第四方面，是提供上述纳米抗体M111在制备检测H7亚型禽流感病毒药物中的应用。

本发明的第五方面，是提供一种检测H7亚型禽流感病毒的试剂盒，所述试剂盒包含上述纳米抗体M111。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明提供一种通过真核表达系统表达的抗H7亚型禽流感病毒的纳米抗体蛋白。从而解决在原核系统中不可溶的难题，提高了准确性和重复性。

(2)本发明提供的抗H7禽流病毒感纳米抗体蛋白的生产方法操作简单、成本低，可实现抗H7禽流感病毒纳米抗体规模化生产。

(3)本发明生产的抗H7禽流感病毒纳米抗体蛋白纯度较高、检测过程中灵敏度低高，具有良好的稳定性和生物学活性，对H7禽流感的监测具有重大的意义。

附图说明

图1是抗H7禽流感纳米抗体M111的重组表达载体的图。

图2是将实施例4中保存的抗H7禽流感病毒纳米抗体蛋白质粒M111 in pPICZαA转化至受体毕赤酵母感受态内的PCR验证结果图；图中，泳道1为Yeasen 2000 Marker；泳道2为目的基因扩增片段；泳道3为阴对照。

图3是SDS-PAGE电泳检测蛋白结果分析结果图；图中，泳道1为Vazyme MP102Maker；泳道2为蛋白表达结果。

图4是针对不同抗原的血凝抑制(HI)图；第一行抗原为H7，第二行抗原为H5，第三行抗原为H9；第11列为阴对照，第12列为空白对照；HI结果显示，抗H7禽流感纳米抗体对H7抗原效价为4log2，对H5、H9无血凝抑制。

图5是表达的抗H7禽流感纳米抗体蛋白与不同的包被抗原的ELISA反应折线图；横坐标为表达的抗H7禽流感纳米抗体蛋白稀释倍数，纵坐标是加入显色液后在650nm的波长下的读数。

具体实施方式

本发明的第一个目的在于通过酵母双杂交系统筛选针对H7亚型禽流感病毒的纳米抗体，同时提供一种编码上述抗H7亚型禽流感纳米抗体蛋白的基因。

鉴于禽流感抗体在原核表达系统中以包涵体形式存在，具有产量低和生产成本高等不足，限制了其在生产的运用，同时考虑到原核生物对蛋白加工以及修饰等方面的功能不如真核生物，因此，本发明的第二个目的在于提供一种通过真核表达系统表达的抗H7亚型禽流感病毒的纳米抗体蛋白。

本发明的第三个目的在于验证该发明中所筛选出的抗H7亚型禽流感病毒的纳米抗体进行功能及活性。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

1、诱饵载体的构建。

选取GenBank:MG739458.1序列，作为本次实验的目的序列，命名为F-H7，用于构建诱饵质粒。用限制性核酸内切酶EcoR I和限制性核酸内切酶Sal I对目的片段F-H7-Bait以及pGBKT7进行双酶切实验，将目的片段F-H7-Bait插入到pGBKT7载体的酶切位点EcoR I和酶切位点Sal I中，最终得到含有目的片段F-H7的pGBKT7载体是本次实验的酵母双杂交体系中的诱饵载体(诱饵质粒)，命名为pGBKT-H7。

2、诱饵酵母的制备。

利用含目的片段F-H7-Bait的pGBKT7载体的DH5α大肠杆菌制备诱饵质粒，将质粒转化至酵母Y2HGold，挑选生理状况良好的单菌落进行PCR、电泳及测序以进行验证。验证正确后，将获得的诱饵菌株，即导入诱饵质粒pGBKT7-H7的Y2HGold酵母菌株，命名为Y2HGold-H7。进一步进行自激活及毒性检测。

3、纳米抗体文库的筛选。

诱饵菌株Y2HGold-H7与纳米抗体文库的Mating，将候选阳性克隆在酵母双杂交蓝白斑(150mm的SD/-Trp/-Leu/-ABA-X板)筛选平板培养基上划线培养，并设置阳性对照组和阴性对照组，在30℃的培养箱中放置4～8天，观察其生长情况。弃去一些作用相对较弱的候选阳性克隆，留下仍然表现为蓝色的候选阳性克隆进行下一步的验证，将阳性克隆送去测序，即可得到抗H7亚型禽流感病毒纳米抗体序列。

4、真核表达载体的构建。

将获得的目的基因片段和pPICZαA载体分别进行Acc65 I和Sac II双酶切并连接，得到重组表达载体，命名为M111 in pPICZαA。

下面将结合本发明实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述。

下述实施例中，如无特别说明，所用方法均为常规方法，所用试剂均为市售常规试剂。

实施例1诱饵载体pGBKT7-H7的构建。

(1)选取H7亚型禽流感病毒序列。

在NCBI网站的GenBank板块公布的序列中查找H7亚型禽流感病毒的序列，利用DNAman软件对多个H7亚型禽流感病毒序列进行序列比对后，选取GenBank:MG739458.1序列，作为本次实验的目的序列，命名为F-H7。

(2)将H7亚型禽流感病毒序列通过双酶切实验连接到pGBKT7载体中。

将目的片段F-H7-Bait插入到pGBKT7载体的酶切位点EcoR I和酶切位点Sal I中，最终得到含有目的片段F-H7的pGBKT7载体是本次实验的酵母双杂交体系中的诱饵载体(诱饵质粒)，命名为pGBKT-H7。合成的基因和pGBKT7载体分别用EcoRI和Sal I双酶切，酶切体系：EcoRI 2ul；Sal I 2ul；10×buffer 5ul；F-H7/载体(pGBKT7)15ul；无菌蒸馏水26ul；在37℃水浴锅中进行双酶切实验。在酶切反应了1.5h后，加入2.0μL10×loading buffer起到终止酶切反应的作用。将酶切实验所得产物，进行凝胶电泳，通过凝胶成像系统判断产物的片段大小；截取目的条带，进行胶回收后，利用T4连接酶是目的条带中的片段与载体pGBKT7，在16℃金属连接仪中链接8～14小时。连接体系：T4Ligase 1ul；10×T4buffer2ul；双酶切后pGBKT7 2ul；双酶切后的片段6ul；无菌蒸馏水9ul。

(3)将含有目的片段F-H7的pGBKT7载体转化入DH5α大肠杆菌感受态中。

将50ul DH5α大肠杆菌感受态、0.5ul含有目的片段F-H7-Bait的pGBKT7载体、1ul5×KCM和30ul无菌蒸馏水混合；将混合物在冰箱4℃静置15min，然后在20℃～37℃环境中静置8min；将混合物轻轻地加入到1.0mL的新鲜配制的LB液体培养基(无抗生素)中，用移液枪轻轻吹打，放在37℃摇床中培养1h；低速离心3min，只保留30μL液体以及底层菌体沉淀；将保留菌液均匀涂布到LB固体培养基平板(含卡那霉素)上，37℃培养箱倒置培养9～15h。长出的菌落为含有目的片段F-H7-Bait的pGBKT7载体的DH5α大肠杆菌，并挑选生理状况良好的单菌落进行PCR、电泳及测序以进行验证。验证正确后，即成功构建诱饵质粒，命名为pGBKT7-H7。

实施例2诱饵酵母的制备。

(1)利用含目的片段F-H7-Bait的pGBKT7载体的DH5α大肠杆菌制备诱饵质粒。

在实施例1(3)中导入了目的片段F-H7-Bait的pGBKT7载体的DH5α大肠杆菌感受态的平板上选取生理状态好的的单菌落，加入到新鲜配制的LB液体培养基中(含卡那霉素)，在37℃摇床中培养10～15h；使用TIANGEN试剂盒提取质粒：取10ml的菌液低速离心90s，弃上清；加入300μL溶液I，用移液枪轻轻吹打混匀；加入300μL溶液II，用移液枪轻轻吹打混匀，静置90s；加入400μL溶液III，上下摇晃8次，有白色物质生成，高速离心8min；轻轻吸取上清液，过柱，高速离心2min；弃上清，往柱子中添加500μL Buffer HB，然后高速离心2min；弃上清，往柱子中添加700μL Wash Buffer DNA,然后高速离心2min；重复上一步骤；将柱子在离心机内高速离心3min；将柱子转移至新的1.5mL EP离心管上，往柱子中添加50μL sdwater，静置90s后，高速离心2min；从离心液中抽取3μL并加入到47μL无菌超纯水中，送至公司进行测序，质粒测序正确后即为诱饵载体。

(2)制备酵母感受态。

从-80℃冰箱中快速取出酵母菌株，置于4℃中等待其解冻融化，用接种环蘸取酵母在YPDA固体培养基板(含卡那霉素)划线接种，然后放在培养箱中倒置培养3～4天，挑取生理状态较好的单菌至3mL YPDA液体培养基(含卡那霉素)中，轻轻吹打混匀后放至30℃摇床中培养10h；吸取10μL菌液加入到新鲜配制的100mL YPDA液体培养基(含卡那霉素)中，放置30℃摇床中培养至菌液OD600值为0.2～0.4；将菌液低速离心4min，弃去上清，在250mL锥形瓶中加入100mL新鲜配制的YPDA液体培养基(含卡那霉素)和底层菌体，并轻轻吹打混匀；然后继续将菌液放置30℃摇床中培养至菌液OD600值为0.5～0.7，将菌液分装至2个50mL的离心管中，低速离心4min，弃去上清；往离心管加入20mL无菌超纯水并轻轻吹打混匀，低速离心4min，弃去上清；吸取1.0mL TE/LiAc并轻轻吹打，然后将菌液转移到无菌的1.5mL EP管；高速离心15s，弃上清；往E P管中加入600μL TE/LiAc1 mL并用移液枪轻轻吹打混匀，将此酵母感受态快速放到冰箱-20℃中5～12h，然后再转移到冰箱-80℃保存。

(3)制备诱饵菌株Y2HGold-H7。

取Carrier DNA在4℃环境中融化，置于99℃水浴锅中加热6min，然后放在冰水混合物中2min，然后放入99℃水浴锅中加热6min，然后放在冰水混合物中2min，最后放在4℃环境下备用；将质粒H7-NBH7-Bait和Carrier DNA分别先后加入含有无菌的1.5mL EP管中，轻轻摇晃混匀；吸取30μL的酵母感受态菌液到上述含有质粒H7-NBH7-Bait和Carrier DNA的EP管中，再吸取600μL的PEG/LiAC，轻轻摇晃混匀；将EP管置于42℃水浴锅中10min然后取出上下混匀，然后再放入42℃水浴锅中10min，然后取出来轻轻摇匀；常温下低速离心2min，弃去上清，吸取800μL的新鲜配制的YPDA液体培养基(含卡那霉素)至EP管中，将EP管放置摇床中培养50min；低速离心2min，弃上清，吸取30μL新鲜配制的YPD液体培养基(含卡那霉素)并用接种环在SD/-Trp固体培养基板(含卡那霉素)上划线接种，培养箱中培养2～4天；挑选生理状况良好的单菌落进行PCR、电泳及测序以进行验证。验证正确后，将获得的诱饵菌株，即导入诱饵质粒pGBKT7-H7的Y2HGold酵母菌株，命名为Y2HGold-H7。

(4)诱饵质粒pGBKT7-H7的自激活。

将诱饵质粒pGBKT7-H7转化至酵母Y2HGold中，然后分别吸取50μL菌液均匀涂板在新鲜配制的SD/-Trp固体培养基平板(含有卡那霉素)和新鲜配制的SD/-Trp/AbA/X-a-Gal固体培养基平板(含有卡那霉素)，放入培养箱中倒置培养4-6天。观察固体培养基中是否出现白色或者蓝色菌落，以此检测诱饵质粒的自激活作用；同时，设立空载体pGBKT7对照组、阳性对照组以及阴性对照组。

实施例3纳米抗体文库的筛选。

(1)诱饵菌株Y2HGold-H7与纳米抗体文库的Mating。

快速取出一管酵母文库菌株(每管1.0mL)，置于冰上自然融化；将酵母文库菌株(每管1.0mL)与1.0mL诱饵菌株Y2HGold(OD600为0.6的菌液)在新鲜配制的50mL2×YPDA液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)在2L的锥形瓶中混合均匀，用1～2mL2×YPDA灌洗文库小瓶，并加入2L的锥形瓶中，让放入培养箱中30℃50r/min振荡培养约16h，使诱饵菌株Y2HGold与纳米抗体文库菌株进行充分杂交；20～22h后，吸取一滴菌液，利用相差显微镜(40×)观察菌液，如果发现看起来像三叶草或者米老鼠的结合物，且数目不小于5，则可继续下一步，否则需要再培养4h；收集菌液，在室温下3000r/min离心10min，弃去上清收集菌体，并且用50mL 0.5×YPDA(with 50μg/mL kanamycin)灌洗培养瓶两次，用该混合物重悬离心后的酵母细胞；低速离心5min，弃去上清，吸取3mL的1×YPDA(含卡那霉素)液体培养基加入到离心管内并且轻轻吹打；在提前准备好的新鲜配制的酵母双杂交蓝白斑(150mm的SD/-Trp/-Leu/-ABA-X板)筛选平板培养基上涂布剩余mating获得的酵母接合生殖培养物，置于30℃培养箱中避光培养3～5天；在第3天将平板取出，将蓝色的单菌落进行标记，在第5天时挑取直径大于1.0mm的蓝色单菌落，标记为候选阳性克隆。

(2)候选阳性克隆的划线筛选。

将候选阳性克隆在酵母双杂交蓝白斑(150mm的SD/-Trp/-Leu/-ABA-X板)筛选平板培养基上划线培养，并设置阳性对照组和阴性对照组，在30℃的培养箱中放置4～8天，观察其生长情况。弃去一些作用相对较弱的候选阳性克隆，留下仍然表现为蓝色的候选阳性克隆进行下一步的验证。

(3)候选阳性克隆PCR鉴定。

pGBKT7载体上自带的T7-F、T7-R和AD-F、AD-R两对引物，分别对步骤(2)中划线筛选获得的阳性克隆进行PCR扩增目的片段，然后将PCR的产物进行凝胶电泳实验，最终观察扩增出来的片段大小来判断候选阳性克隆是否假阳性。将阳性克隆送去测序，即可得到抗H7亚型禽流感病毒纳米抗体序列。

实施例4抗H7禽流感病毒纳米抗体蛋白质粒M111 in pPICZαA的构建。

(1)所筛选出的抗H7禽流感纳米抗体的基因序列(SEQ ID NO：01)：GACAATCAAGTACAACTTGTTGAATCGGGCGGGGGCTTAGTACAGCCTGGTGGGAGTCTCCGTCTCAGTTGTACTGCCTCCGGTAATACAGGTAGTCGTTTTTGTATGGGCTGGTTGCGGGAGGCTCCAGGTAAAGAACGGGAGGTAGTCGCCGCGATCGACATCGACGGCTCGACCCATTATGCTGATTCGGTAAAAGGTCGCTTTACAATCTCACAAGACAACGTTGAAAACACGTTGACTCTGGAGATGAACAGTCTCAAGCCTGAGGATACAGCACGGTACTACTGTGCGGCTGGGGGCTCCTGGTACTGCCCACGTTTGACAACGACTGAATACAACTACTGGGGTCCAGGGACGCAAGTTACGGTCTCATCT。

所筛选出的抗H7禽流感纳米抗体的氨基酸序列(SEQ ID NO：02)：DNQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGNTGSRFCMGWLREAPGKEREVVAAIDIDGSTHYADSVKGRFTISQDNVENTLTLEMNSLKPEDTARYYCAAGGSWYCPRLTTTEYNYWGPGTQVTVSS。

通过基因合成，合成上述基因序列并在基因两端加上Acc65 I和Sac II酶切位点(由上海通用公司合成)，然后将获得的目的基因片段和pPICZαA载体分别进行Acc65 I和Sac II双酶切并连接，得到重组表达载体，命名为M111 in pPICZαA，该重组表达载体大小约为3966pb(图1)。

(2)质粒抽提，双酶切确认质粒并送测序。

将步骤(1)得到的重组表达载体M111 in pPICZαA转化至受体菌DH5α，菌液涂含博来霉素的LB(含15mg/L的博来霉素)板进行复苏活化，37℃培养16h后，挑取单个菌落重新转接涂板；将转接后的菌落，挑取一部分菌落转接至100mL的液体LB培养基中，37℃、200rpm的摇床上摇菌16h，先将部分菌液暂时分装放4℃保存；再取一部分菌液使用50mL离心管进行收集，8000rpm离心10min，弃去上清，进行质粒抽提；将测序正确的阳性克隆扩大培养，抽取质粒保存至-20℃冰箱，将菌液用含有体积分数为15～20％甘油的LB溶液放置-80℃进行保种。

实施例5抗H7禽流感病毒纳米抗体蛋白的诱导表达。

(1)将实施例4中抽提的M111 in pPICZαA质粒转化到毕赤酵母。

采用coolaber毕赤酵母转化试剂盒(产品编号SK2430)进行转化。

1、取0.1-5ug质粒DNA(线性化质粒加入量5-50ug)和10ul预变性Carrier DNA加入到未融化的感受态细胞上，置于30℃水浴，每隔15s颠倒混匀，直至感受态细胞刚好完全融化。(融化后及时取出)。

2、加入1.4mlB2溶液颠倒混匀。30℃水浴60min。

3、3000rpm离心3min弃上清留菌液沉淀，加入1mlB3溶液重悬菌体。

4、3000rpm离心3min弃上清留菌液沉淀，加入100ulB3溶液重悬菌体。

5、将100ul菌液全部涂布到相应的平板培养基，30℃恒温培养3-5天，直至平板出现酵母克隆。

(2)挑取单个菌落利用AOX1引物(正向引物aox1-f和反向引物aox1-r)进行菌落PCR确认，如图2所示。将大小为639bp左右的目的条带的克隆菌落重新转接涂板，并保存；其中，PPIC引物序列如下所示：

正向引物(aox1-f)：5’-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3’；

反向引物(aox1-r)：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’。

PCR反应体系和条件如下所示：

扩增体系：2×PCR Master Mix酶25μL，正向引物(10pmol/μL)1μL，反向引物(10pmol/μL)1μL，基因模板2μL，ddH₂O补足至50μL；

扩增反应条件：98℃3min；98℃15s、58℃15s、72℃60s，34个循环；72℃5min。

PCR反应完成之后，使用1％琼脂糖凝胶电泳。凝胶电泳显示大小为639bp左右的目的条带。

(3)挑取含目的条带的单菌落，置于装有20mlBMGY(含1％甘油)培养基的250ml摇瓶中，用封口纸封口，放置于30℃，250rpm摇床中培养至OD600＝2-6。室温下1500-3000g离心5min，收集菌体，用25mlBMMY(含0.5％甲醇)重悬菌体，所得的菌液置于250ml的摇瓶中，用封口纸封口，放置于30℃，250rpm摇床上继续生长96h。每24h向培养基中添加100％甲醇至终浓度为0.5％。收集菌液样品，8000g离心20min，保留样品的上清液。

(4)取少量的上清加入4×SDS上样缓冲液，混匀后，至沸水中煮10min，取上清上样于购自金斯瑞的SDS-PAGE胶孔，同时加入等量的蛋白Vazyme MP102 Maker，以电泳电压调节至100V跑胶，跑胶100min。将凝胶块从玻璃板中取出，轻放于摇床上含有考马斯亮蓝溶液的染色槽30min；然后将染色槽的考马斯亮蓝溶液倒出，加入清水冲洗干净后，凝胶块放于摇床中的染色槽中，用清水对凝胶块进行脱色30min即可见清洗条带，抗H7禽流感病毒纳米抗体蛋白表达成功(如图3)。

实施例6抗H7禽流感纳米抗体的蛋白功能验证。

抗H7禽流感纳米抗有抑制血凝的功能，因此我们通过血凝抑制(HI)实验检验该抗体，过程如下：先通过血凝(HA)试验测得病毒效价，配置四单位，再进行HI实验。

(1)HA实验：

①在96孔板1-11孔加入25μL PBS，第12孔加入50μL PBS；

②第1孔加重组AIV H7亚型Re-1株HI试验抗原(购自哈尔滨维科生物技术开发公司)25μL，混匀吸至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，混匀后弃去25μL，第12孔不加；③从1～11孔，每空加稀释好的25μL PBS；

④将1％的红细胞轻轻摇动混匀，在1～12孔中每孔加入25μL；震荡，室温(24-25℃)静置40min后观察结果；其中，1％鸡红细胞悬液的制备：抽取抗凝血鸡血，700rpm,5min离心；用PBS清洗。再离心，吸取沉淀红细胞表面的白细胞，不断清洗直至红细胞表面无白细胞，PBS洗液呈透亮无颜色。以PBS：红细胞＝99：1的比例轻轻混匀，制得1％鸡红细胞悬液。

(2)四单位配置：测得HA效价后，按照原液稀释2n-2倍的方法配置四单位抗原(4HAU)，配好后，进行HA的步骤进行四单位验证，配好的四单位在验证时，前两孔出现血凝现象。

(3)HI实验：

①在96孔板1-11孔加入25μL PBS，第12孔加入50μL PBS；

②第1孔加抗H7禽流感病毒纳米抗体蛋白25μL，混匀吸至第2孔，依次倍比稀释至第10孔，混匀后弃去25μL PBS，第11、12孔不加；

③从1～11孔，每空加稀释好的25μL AIV H7亚型Re-1株4单位抗原悬液，室温(24-25℃)静置至少30min，第12孔不加；

④将1％的红细胞轻轻摇动混匀，在1～12孔中每孔加入25μL；震荡，室温(24-25℃)静置40min后观察结果。

H5、H9血凝抑制实验步骤与H7亚型Re-1株的血凝抑制实验相同。H5、H7、H9禽流感血凝抑制试验抗原分别为Re-8株、H7-Re1株、H9亚型，均为购自哈尔滨维科生物技术有限公司的禽流感血凝抑制试验抗原。

HI结果显示，抗H7禽流感纳米抗体融合蛋白抗体对H7抗原效价为4log2，对H5、H9无血凝抑制，是特异性结合的抗H7禽流感纳米蛋白抗体。(如图4)。

实施例7抗H7禽流感病毒纳米抗体蛋白对抗原的特异性检测应用。

该抗体是针对H7禽流感的特异性抗体，为此通过包被不同的抗原，用筛选表达的纳米抗体对包被的抗原进行检测。具体实验方案如下：

1、抗原包被：分别取H5、H7、H9禽流感血凝抑制试验抗原(分别为Re-8株、H7-Re1株、H9亚型)10μL，按照第一孔抗原(抗原：碳酸盐包被缓冲液＝1:9)按照10倍稀释，第二孔开始4倍稀释，将抗原吸附在固相载体聚苯乙烯。即第一孔将抗原和包被液稀释均匀后，吸取25μL至第二孔，一次稀释至第七孔，第八孔只加包被液做为空白对照，每孔最终75μL，37℃孵育2h或者4℃过夜孵育后，弃去板内液体；

2、封闭：加300μL 3％BSA封闭1h；

3、一抗：抗H7禽流感病毒纳米抗体蛋白即为一抗，按照1:100的比例用PBS稀释加75μL稀释后抗体至每孔；

4、洗涤：用含0.5％的Tween-20的PBS洗涤液洗涤3-5次，每次洗涤浸泡时间5min洗5次；

5、二抗：以金斯瑞公司的鼠源抗his多抗按照1:3000比例用PBS稀释，稀释加75μL稀释后抗体至每孔孵育1h；

6、洗涤：用含0.5％的Tween-20的PBS洗涤液洗涤3-5次，每次洗涤浸泡时间5min，洗5次；

7、三抗：以上海生工公司的羊抗鼠-HRP抗体按照1:5000比例用PBS稀释，稀释加75μL稀释后抗体至每孔，孵育1h；

8、洗涤：用含0.5％的Tween-20的PBS洗涤液洗涤3-5次，每次洗涤浸泡时间5min，洗5次；

9、显色：加入HRP底物显色液进行显色20min，用酶标仪的波长650nm进行读数。

ELISA结果显示：随着H7抗原(Re-1)梯度递减的包被抗原(一定范围内)，P/N比值也梯度递减，其中空白对照数值为0.05，P/N最大比值大于3，证明真核表达的抗H7亚型禽流感病毒的纳米抗体具有良好的生物活性；对比H5抗原、H9抗原，P/N最大比值均小于3，证明真核表达的抗H7亚型禽流感病毒的纳米抗体具有良好的特异性。(如图5)。

需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种针对H7亚型禽流感病毒的纳米抗体M111，其特征在于：所述纳米抗体M111的氨基酸序列如SEQ ID NO：02所示。

2.一种编码权利要求1所述纳米抗体M111的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：01所示。

3.一种重组表达载体，所述重组表达载体包含编码权利要求1所述纳米抗体M111的基因。

4.一种转化体，其特征在于：所述转化体是将权利要求3所述重组表达载体转化宿主细胞所得。

5.权利要求1所述的纳米抗体M111在制备检测H7亚型禽流感病毒药物中的应用。

6.一种检测H7亚型禽流感病毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含权利要求1所述的纳米抗体M111。