CN117683125A - 抗h7亚型禽流感纳米抗体d67及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于抗体技术领域，公开了抗H7亚型禽流感纳米抗体D67及其应用。该抗H7亚型禽流感纳米抗体或其抗原结合片段对H7抗原的特异性强、亲和力高，可用于检测H7亚型禽流感病毒，诊断H7亚型禽流感感染所引起的疾病，治疗和/或预防H7亚型禽流感感染所引起的疾病的药物筛选。
Description
技术领域
本发明属于抗体技术领域，具体涉及抗H7亚型禽流感纳米抗体D67及其应用。
背景技术
禽流感是一种由A型流感病毒(avian influenza virus,AIV)引发的禽类急性、烈性传染病，是在家禽、鸟类中常见的一种流行性感冒。禽流感病毒属于正黏病毒科、A型流感病毒属，是一种单股负链RNA病毒。根据表面血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的差异，禽流感病毒可分为18个H亚型(H1-H18)和11个N亚型(N1-N11)。依据病毒致病性差异，禽流感可被分为高致病性、低致病性及非致病性三类。在家禽中流行较广泛的为H5、H6、H7、H9四种亚型病毒，其中H5和H7亚型流感病毒引起禽类较高的发病率和死亡率，属于高致病性禽流感病毒，又称为HPAI病毒。禽流感病毒通过表面HA与宿主细胞唾液酸(SA)受体特异性结合而感染宿主，而禽类和人类分别以表达SA-2、3-Gal受体和SAα-2、6-Gal受体为主。
血凝素(HA)又称红血球凝集素，细胞内质网上形成的蛋白前体HA0是血凝素形成的先决条件，HA0随后裂解为HA1和HA2，使病毒产生感染性。根据X射线晶体衍射技术显示，血凝素是由3个HA蛋白构成的三聚体，其结构可分为纤细杆状基底和球状头部两部分，基底部分由HA蛋白组成，而头部则主要为HA1的肽链。血凝素在病毒入侵宿主细胞的过程中具有关键作用，尽管不同亚型病毒中，HA0蛋白的裂解位点存在差异，但位于HA蛋白头部的唾液酸受体结合位点却高度保守。在侵染过程中，病毒HA蛋白与宿主表面的特异受体结合，促进病毒与宿主细胞膜融合的发生，介导病毒遗传物质进入宿主细胞诱发感染。
随着禽流感病毒不断升级，禽流感的易感率和致死率不断变化，传统抗体逐渐显露出不足。1993年科学家在骆驼体内发现了纳米抗体，其轻链天然缺失，只包含一个VHH和两个常规的重链恒定(CH2与CH3区)，纳米抗体通过重链可变区的结构变化与抗原结合，可弥补传统抗体分子量大、穿透力有限、特异性低、稳定性不足等缺点，现已被广泛应用：
(1)筛选针对特定亚型的禽流感病毒纳米抗体，其可用于鉴定AIV抗原表位，建立快速、高效、简便的AIV诊断技术；
(2)纳米抗体可作为中和病毒试剂的材料来源，阻止病毒入侵、病毒释放或膜融合等过程的进行，从而达到治疗禽流感的效果；
(3)纳米抗体可与辣根过氧化物酶(HRP)共同组成融合蛋白探针，应用于禽流感等疫病的抗体竞争ELISA检测；
(4)纳米抗体经生物素或胶体金标记后，可用于建立病原的夹心ELISA和胶体金检测试纸条，相比于传统抗体建立的方法，用纳米抗体进行相关检测与诊断，具有成本低、环境要求低、操作难度低的优点；
(5)纳米抗体分子量小，在生物体中扩散速度快，可与酶、放射性同位素、荧光探针等结合，形成示踪剂，进行体内或体外成像，优化分子成像技术；
(6)由于纳米抗体的结构独特性，其可与His标签等多种标签融合形成复合物，对细胞或生物体内的蛋白质进行定位，从而了解目标蛋白的功能或使蛋白质定向失活，也可作为靶向生物分子，应用在靶向药物治疗领域。因此，有必要开发抗H7亚型禽流感纳米抗体。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供抗H7亚型禽流感纳米抗体或其抗原结合片段。
本发明第二方面的目的，在于提供一种重组蛋白。
本发明第三方面的目的，在于提供与本发明第一方面的抗H7亚型禽流感纳米抗体或其抗原结合片段或第二方面的重组蛋白相关的生物材料。
本发明第四方面的目的，在于提供一种偶联物。
本发明第五方面的目的，在于提供固相载体。
本发明第六方面的目的，在于提供本发明第一方面的抗H7亚型禽流感纳米抗体或其抗原结合片段、第二方面的重组蛋白、第三方面的生物材料、和/或第四方面的偶联物在制备产品中的应用。
本发明第七方面的目的，在于提供一种产品。
本发明第八方面的目的，在于提供本发明第一方面的抗H7亚型禽流感纳米抗体或其抗原结合片段、或第二方面的重组蛋白的制备方法。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供抗H7亚型禽流感纳米抗体或其抗原结合片段，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：
重链可变区，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的重链可变区中的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。
优选地，所述CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4所示，所述CDR是以IMGT定义方案定义的。
优选地，所述CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.7所示，所述CDR是以Kabat定义方案定义的。
优选地，所述CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.7所示，所述CDR是以Chothia定义方案定义的。
优选地，所述CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.11、SEQ ID NO.12所示，所述CDR是以Contact定义方案定义的。
优选地，所述重链可变区的氨基酸序列包含：
a1)SEQ ID NO.1；或
a2)将SEQ ID NO.1经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID NO.1所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a3)与SEQ ID NO.1具有至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％的同源性且与SEQ ID NO.1所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列。
优选地，所述抗H7亚型禽流感纳米抗体或其抗原结合片段还包含Fc片段。
本发明的第二个方面，提供一种重组蛋白，包含：本发明第一个方面的抗H7亚型禽流感纳米抗体或其抗原结合片段；和
任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
优选地，所述的标签序列选自下组中的至少一种：His标签、GGGS序列、FLAG标签。
本发明的第三个方面，提供与本发明第一个方面的抗H7亚型禽流感纳米抗体或其抗原结合片段、或本发明第二个方面的重组蛋白相关的生物材料，所述生物材料包含b1)～b8)中至少一种：
b1)编码本发明第一个方面的抗H7亚型禽流感纳米抗体或其抗原结合片段、或第二个方面的重组蛋白的核酸分子；
b2)包含b1)所述核酸分子的表达盒；
b3)包含b1)所述核酸分子的载体；
b4)包含b2)所述表达盒的载体；
b5)包含b1)所述核酸分子的转基因细胞系；
b6)包含b2)所述表达盒的转基因细胞系；
b7)包含b3)所述载体的转基因细胞系；
b8)包含b4)所述载体的转基因细胞系。
优选地，所述转基因细胞系不包含繁殖材料。
优选地，所述细胞包含真核细胞和原核细胞中的至少一种；进一步包含真核细胞；更进一步为酵母细胞；再进一步为毕赤酵母。
优选地，所述编码本发明第一个方面的抗H7亚型禽流感纳米抗体或其抗原结合片段的核酸分子的核苷酸序列包含：
c1)如SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列；或
c2)将SEQ ID NO.13经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQID NO.13所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列；或
c3)与SEQ ID NO.13具有至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％的同源性，且与SEQ ID NO.13所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列。
本发明的第四个方面，提供一种偶联物，包含：本发明第一个方面的抗H7亚型禽流感纳米抗体或其抗原结合片段和本发明第二个方面的重组蛋白中的至少一种；
以及偶联部分，所述偶联部分包含可检测标记物、药物、毒素、电子致密标记、生物素/抗生物素蛋白、自旋标记、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、放射性同位素、酶、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒和病毒外壳蛋白中的至少一种。
优选地，所述可检测标记物为荧光或发光标记物。
优选地，所述可检测标记物选自吖啶酯、吖啶磺酰胺、鲁米诺、异鲁米诺、辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶中的任意一种。
优选地，所述放射性同位素选自Tc-99m、Ga-68、F-18、I-123、I-125、I-131、In-111、Ga-67、Cu-64、Zr-89、C-11、Lu-177和Re-188中的至少一种。
优选地，所述药物为其他抗H7亚型禽流感的药物。
本发明的第五个方面，提供固相载体，其表面偶联有本发明第一个方面的抗H7亚型禽流感纳米抗体或其抗原结合片段和/或第二个方面的重组蛋白。
本发明的第六个方面，提供发明第一个方面的抗H7亚型禽流感纳米抗体或其抗原结合片段、第二个方面的重组蛋白、第三个方面的生物材料、第四个方面的偶联物、和/或第五个方面的固相载体在制备产品中的应用。
优选地，所述产品包含药物、试剂、检测板、试剂盒、检测芯片中的至少一种。
优选地，所述药物具有d1)～d2)中至少一种功能：
d1)预防H7亚型禽流感病毒感染；
d2)治疗和/或预防H7亚型禽流感感染所引起的疾病。
优选地，所述药物还包含药学上可接受的辅料。
优选地，所述药学上可接受的辅料选自稀释剂、粘合剂、致湿剂、表面活性剂、润滑剂和崩解剂中的至少一种。
优选地，所述试剂、检测板、检测芯片或试剂盒具有e1)～e3)中至少一种功能：
e1)检测H7亚型禽流感病毒；
e2)诊断H7亚型禽流感感染所引起的疾病；
e3)药物筛选，所述药物用于治疗和/或预防H7亚型禽流感感染所引起的疾病。
优选地，所述疾病包含禽流感。
本发明的第七个方面，提供一种产品，所述产品包含f1)～f4)中至少一种：
f1)本发明第一个方面的抗H7亚型禽流感纳米抗体或其抗原结合片段；
f2)本发明第二个方面的重组蛋白；
f3)本发明第四个方面的偶联物；
f4)本发明第五个方面的固相载体。
优选地，所述产品包含药物、试剂、检测板、试剂盒、检测芯片中的至少一种。
优选地，所述药物具有d1)～d2)中至少一种功能：
d1)预防H7亚型禽流感病毒感染；
d2)治疗和/或预防H7亚型禽流感感染所引起的疾病。
优选地，所述药物还包含药学上可接受的辅料。
优选地，所述药学上可接受的辅料选自稀释剂、粘合剂、致湿剂、表面活性剂、润滑剂和崩解剂中的至少一种。
优选地，所述试剂、检测板、检测芯片或试剂盒具有e1)～e3)中至少一种功能：
e1)检测H7亚型禽流感病毒；
e2)诊断H7亚型禽流感感染所引起的疾病；
e3)药物筛选，所述药物用于治疗和/或预防H7亚型禽流感感染所引起的疾病。
优选地，所述疾病包含禽流感。
本发明第八个方面，在于提供本发明第一个方面的纳米抗体或其抗原结合片段、或第二方面的重组蛋白的制备方法，通过培养本发明第三个方面中的转基因细胞系得到。
本发明的有益效果是：
本发明提供了抗H7亚型禽流感纳米抗体或其抗原结合片段，该抗H7亚型禽流感纳米抗体或其抗原结合片段对H7抗原的特异性强、亲和力高，可用于检测H7亚型禽流感病毒，诊断H7亚型禽流感感染所引起的疾病，治疗和/或预防H7亚型禽流感感染所引起的疾病的药物筛选。
附图说明
图1是实施例4中的D67 in pPICZαA的质粒图谱。
图2是实施例5中抗H7亚型禽流感病毒纳米抗体D67的SDS-PAGE电泳检测蛋白结果分析结果图：其中，泳道1为VazymeMP102Maker；泳道2为抗H7亚型禽流感病毒纳米抗体D67表达结果。
图3是实施例6中抗H7亚型禽流感纳米抗体D67对不同抗原的血凝抑制(HI)图：其中，第一行抗原为H7(H7-Re-1株)，第二行抗原为H5(Re-8株)，第三行抗原为H9(H9亚型)；第1～10列为实验组(包含不同浓度的抗H7禽流感纳米抗体D67、4单位抗原原液以及鸡红细胞)，第11列为阴性对照(与实验组相比，区别在于不包含抗H7禽流感纳米抗体D67)，第12列为空白对照(与实验组相比，区别在于不包含抗H7禽流感纳米抗体D67以及4单位抗原原液)。
图4是实施例7中抗H7亚型禽流感病毒纳米抗体D67与H7亚型的包被抗原的ELISA反应折线图：横坐标为抗H7亚型禽流感病毒纳米抗体D67的浓度，纵坐标是加入显色液后在450nm的波长下的读数。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1诱饵载体pGBKT7-H7的构建
(1)选取H7亚型禽流感病毒序列
在NCBI网站的GenBank板块公布的序列中查找H7亚型禽流感病毒的序列，利用DNAman软件对多个H7亚型禽流感病毒序列进行序列比对后，选取GenBank:MG739458.1序列，作为本次实验的目的序列，命名为F-H7。
(2)将H7亚型禽流感病毒序列通过双酶切实验连接到pGBKT7载体中
将目的片段F-H7插入到pGBKT7载体的酶切位点EcoRI和酶切位点SalI中，最终得到含有目的片段F-H7的pGBKT7载体是本次实验的酵母双杂交体系中的诱饵载体(诱饵质粒)，命名为pGBKT7-H7，具体如下：合成的基因和pGBKT7载体分别用EcoRI和SalI双酶切，酶切体系：EcoRI 2μL；SalI 2μL；10×buffer 5μL；F-H7/载体(pGBKT7)15μL；无菌蒸馏水26μL；在37℃水浴锅中进行双酶切实验，在酶切反应了1.5h后，加入2.0μL10×loadingb uffer起到终止酶切反应的作用，将酶切实验所得产物，进行凝胶电泳，通过凝胶成像系统判断产物的片段大小；截取目的条带，进行胶回收后，利用T4连接酶是目的条带中的片段与载体pGBKT7，在16℃金属连接仪中连接11小时，连接体系：T4Ligase 1μL；10×T4buffer 2μL；双酶切后pGBKT7 2μL；双酶切后的片段6μL；无菌蒸馏水9μL。
(3)将含有目的片段F-H7的pGBKT7载体转化入DH5α大肠杆菌感受态中
将50μL DH5α大肠杆菌感受态、0.5μL含有目的片段F-H7的pGBKT7载体、1μL 5×KCM和30μL无菌蒸馏水混合；将得到的混合物在冰箱4℃静置15min，然后在20℃～37℃环境中静置8min；将混合物轻轻地加入到1.0mL的新鲜配制的LB液体培养基(无抗生素)中，用移液枪轻轻吹打，放在37℃摇床中培养1h；低速离心3min，只保留30μL液体以及底层菌体沉淀；将保留菌液均匀涂布到LB固体培养基平板(含卡那霉素)上，37℃培养箱倒置培养9～15h。长出的菌落为含有目的片段F-H7的pGBKT7载体的DH5α大肠杆菌，并挑选生理状况良好的单菌落进行PCR、电泳及测序以进行验证，验证正确后，即成功构建诱饵质粒，命名为pGBKT7-H7。
实施例2诱饵酵母的制备
(1)利用含目的片段F-H7的pGBKT7载体的DH5α大肠杆菌制备诱饵质粒
在实施例1(3)中导入了目的片段F-H7的pGBKT7载体的DH5α大肠杆菌感受态的平板上选取生理状态好的的单菌落，加入到新鲜配制的LB液体培养基中(含卡那霉素)，在37℃摇床中培养12h；使用TIANGEN试剂盒提取质粒：取10mL的菌液低速离心90s，弃上清；加入300μL溶液I，用移液枪轻轻吹打混匀；加入300μL溶液II，用移液枪轻轻吹打混匀，静置90s；加入400μL溶液III，上下摇晃8次，有白色物质生成，高速离心8min；轻轻吸取上清液，过柱，高速离心2min；弃上清，往柱子中添加500μL BufferHB，然后高速离心2min；弃上清，往柱子中添加700μL WashBufferDNA,然后高速离心2min；重复上一步骤；将柱子在离心机内高速离心3min；将柱子转移至新的1.5mL EP离心管上，往柱子中添加50μL sdwater，静置90s后，高速离心2min；从离心液中抽取3μL并加入到47μL无菌超纯水中，送至公司进行测序，质粒测序正确后即为诱饵质粒。
(2)制备诱饵菌株Y2HGold-H7
取CarrierDNA在4℃环境中融化，置于100℃水浴锅中加热6min，然后放在冰水混合物中2min，然后放入100℃水浴锅中加热6min，然后放在冰水混合物中2min，最后放在4℃环境下备用；将质粒pGBKT7-H7和CarrierDNA分别先后加入含有无菌的1.5mLEP管中，轻轻摇晃混匀；吸取30μL的酵母感受态菌液到上述含有质粒pGBKT7-H7和CarrierDNA的EP管中，再吸取600μL的PEG/LiAC，轻轻摇晃混匀；将EP管置于42℃水浴锅中10min然后取出上下混匀，然后再放入42℃水浴锅中10min，然后取出来轻轻摇匀；常温下低速离心2min，弃去上清，吸取800μL的新鲜配制的YPDA液体培养基(含卡那霉素)至EP管中，将EP管放置摇床中培养50min；低速离心2min，弃上清，吸取30μL新鲜配制的YPD液体培养基(含卡那霉素)并用接种环在SD/-Trp固体培养基板(含卡那霉素)上划线接种，培养箱中培养2～4天；挑选生理状况良好的单菌落进行PCR、电泳及测序以进行验证。验证正确后，将获得的诱饵菌株，即导入诱饵质粒pGBKT7-H7的Y2HGold酵母菌株，命名为Y2HGold-H7。
实施例3纳米抗体文库的筛选
(1)诱饵菌株Y2HGold-H7与纳米抗体文库的Mating
快速取出一管酵母文库菌株(购于宝日医生物技术(北京)有限公司，每管1.0mL)，置于冰上自然融化；将酵母文库菌株(每管1.0mL)与1.0mL诱饵菌株Y2HGold(OD600为0.6的菌液)在新鲜配制的50mL 2×YPDA液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)在2L的锥形瓶中混合均匀，用2mL2×YPDA灌洗文库小瓶，并加入2L的锥形瓶中，让放入培养箱中30℃50r/min振荡培养约16h，使诱饵菌株Y2HGold与纳米抗体文库菌株进行充分杂交；21h后，吸取一滴菌液，利用相差显微镜(40×)观察菌液，如果发现看起来像三叶草或者米老鼠的结合物，且数目不小于5，则可继续下一步，否则需要再培养4h；收集菌液，在室温下3000r/min离心10min，弃去上清收集菌体，并且用50mL0.5×YPDA(含50μg/mL卡那霉素)灌洗培养瓶两次，用该混合物重悬离心后的酵母细胞；低速离心5min，弃去上清，吸取3mL的1×YPDA(含卡那霉素)液体培养基加入到离心管内并且轻轻吹打；在提前准备好的新鲜配制的酵母双杂交蓝白斑(150mm的SD/-Trp/-Leu/-ABA-X板)筛选平板培养基上涂布剩余mating获得的酵母接合生殖培养物，置于30℃培养箱中避光培养5天；在第3天将平板取出，将蓝色的单菌落进行标记，在第5天时挑取直径大于1.0mm的蓝色单菌落，标记为候选阳性克隆。
(2)候选阳性克隆的划线筛选
将候选阳性克隆在酵母双杂交蓝白斑(150mm的SD/-Trp/-Leu/-ABA-X板)筛选平板培养基上划线培养，在30℃的培养箱中放置6天，观察其生长情况。弃去一些作用相对较弱的候选阳性克隆，留下仍然表现为蓝色的候选阳性克隆进行下一步的验证。
(3)候选阳性克隆PCR鉴定
pGBKT7载体上自带的T7-F、T7-R和AD-F、AD-R两对引物，分别对步骤(2)中划线筛选获得的阳性克隆进行PCR扩增目的片段，然后将PCR的产物进行凝胶电泳实验，最终观察扩增出来的片段大小来判断候选阳性克隆是否假阳性。将阳性克隆送去测序，即可得到抗H7亚型禽流感病毒纳米抗体D67序列，其重链可变区的氨基酸序列为：MDNQVQLVESGGGSVQVGGSLTLSCVASGYTDNYCSMGWYRQAPGQPRELVSAIISTGRT VYAESAKGRFTIFQNNAKNTVYLQMNSLRSEDTAMYYCNIAVWNGGSCDSGGRGRYNYW GQGTQVTVSS(SEQ ID NO.1)。该重链可变区中以不同定义CDR方案的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3如表1所示。
表1重链可变区中以不同定义CDR方案的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3
实施例4抗H7亚型禽流感病毒纳米抗体蛋白质粒D67 in pPICZαA的构建
(1)对编码抗H7亚型禽流感纳米抗体D67的重链可变区的氨基酸序列的基因进行密码子优化，优化后的序列如下：ATGGATAATCAAGTGCAACTTGTCGAGAGTGGTGGGGGCT CTGTACAAGTAGGCGGTTCCTTGACGCTCTCATGCGTAGCAAGTGGTTATACCGACAACTATTGCTCAATGGGGTGGTATCGGCAAGCACCGGGGCAACCGCGCGAATTGGTCAGTGCGATCATCTCGACGGGTCGTACCGTTTACGCGGAAAGTGCAAAAGGCCGCTTCACAATCTTCCAGAACAACGCAAAGAATACTGTATATTTGCAGATGAACTCTCTCCGCTCGGAGGATACTGCAATGTATTACTGCAACATTGCCGTATGGAATGGTGGTTCATGCGACAGTGGTGGGCGTGGGCGTTACAATTATTGGGGGCAAGGTACACAAGTTACTGTTTCATCG(SEQ ID NO.13)，通过基因合成，合成上述优化后的基因序列并在基因两端加上EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点(由上海通用公司合成)，然后将获得的目的基因片段和pPICZαA载体分别进行EcoRⅠ和NotⅠ双酶切并连接，得到1个重组表达载体，命名为D67 in pPICZαA，该重组表达载体大小约为5635pb(图1)。
(2)质粒抽提，双酶切确认质粒并送测序
将步骤(1)得到的重组表达载体D67 in pPICZαA转化至受体菌DH5α，菌液涂含博来霉素的LB(含15mg/L的博来霉素)板进行复苏活化，37℃培养16h后，挑取单个菌落重新转接涂板；将转接后的菌落，挑取一部分菌落转接至100mL的液体LB培养基中，37℃、200rpm的摇床上摇菌16h，先将部分菌液暂时分装放4℃保存；再取一部分菌液使用50mL离心管进行收集，8000rpm离心10min，弃去上清，进行质粒抽提；将测序正确的阳性克隆扩大培养，抽取质粒保存至-20℃冰箱，将菌液用含有体积分数为20％甘油的LB溶液放置-80℃进行保种。
实施例5抗H7亚型禽流感病毒纳米抗体蛋白的诱导表达
(1)将实施例4中抽提的D67 in pPICZαA质粒转化到毕赤酵母
采用coolaber毕赤酵母转化试剂盒(产品编号SK2430)进行转化。
1)、取5ug质粒DNA(线性化质粒加入量50ug)和10μL预变性Carrier DNA加入到未融化的感受态细胞上，置于30℃水浴，每隔15s颠倒混匀，直至感受态细胞刚好完全融化(融化后及时取出)。
2)、加入1.4mLB2溶液颠倒混匀。30℃水浴60min。
3)、3000rpm离心3min弃上清留菌液沉淀，加入1mLB3溶液重悬菌体。
4)、3000rpm离心3min弃上清留菌液沉淀，加入100μLB3溶液重悬菌体。
5)、将100μL菌液全部涂布到相应的平板培养基，30℃恒温培养4天，直至平板出现酵母克隆。
(2)挑取单个菌落利用AOX1引物(正向引物aox1-f和反向引物aox1-r)进行菌落PCR确认，并保存；其中，AOX1引物序列如下所示：
正向引物(aox1-f)：5’-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3’(SEQ ID NO.14)；
反向引物(aox1-r)：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’(SEQ ID NO.15)。
PCR反应体系和条件如下所示：
扩增体系：PCR MasterMix酶25μL，正向引物(10pmol/μL)1μL，反向引物(10pmol/μL)1μL，基因模板2μL，ddH2O补足至50μL。
扩增反应条件：98℃3min；98℃15s、58℃15s、72℃60s，34个循环；72℃5min。
PCR反应完成之后，使用1％琼脂糖凝胶电泳。凝胶电泳显示大小为634bp和632bp左右的目的条带。
(3)挑取含目的条带的单菌落，置于装有20mlBMGY(含1％甘油)培养基的250mL摇瓶中，用封口纸封口，放置于30℃，250rpm摇床中培养至OD600＝6。室温下3000g离心5min，收集菌体，用25mL BMMY(含0.5％甲醇)重悬菌体，所得的菌液置于250mL的摇瓶中，用封口纸封口，放置于30℃，250rpm摇床上继续生长96h。每24h向培养基中添加100％甲醇至终浓度为0.5％。收集菌液样品，8000g离心20min，保留样品的上清液。
(4)取少量的上清加入4×SDS上样缓冲液，混匀后，至沸水中煮10min，取上清上样于购自金斯瑞的SDS-PAGE胶孔，同时加入等量的蛋白Vazyme MP102Maker，以电泳电压调节至100V跑胶，跑胶100min。将凝胶块从玻璃板中取出，轻放于摇床上含有考马斯亮蓝溶液的染色槽30min；然后将染色槽的考马斯亮蓝溶液倒出，加入清水冲洗干净后，凝胶块放于摇床中的染色槽中，用清水对凝胶块进行脱色30min即可见清洗条带，抗H7亚型禽流感病毒纳米抗体D67表达成功(如图2)。
实施例6抗H7亚型禽流感纳米抗体D67的蛋白功能验证
抗H7亚型禽流感纳米抗体有抑制血凝的功能，因此通过血凝抑制(HI)实验检验该抗H7亚型禽流感纳米抗体D67，过程如下：先通过血凝(HA)试验测得病毒效价，配置四单位，再进行HI实验。
(1)HA实验：
①在96孔板1～11孔加入25μLPBS，第12孔加入50μLPBS；
②第1孔加重组AIVH7亚型Re-1株HI试验抗原(购自哈尔滨维科生物技术开发公司)25μL，混匀吸至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，混匀后弃去25μL，第12孔不加；
③从1～11孔，每空加稀释好的25μLPBS；
④将1％的鸡红细胞轻轻摇动混匀，在1～12孔中每孔加入25μL；震荡，室温(24～25℃)静置40min后观察结果；其中，1％鸡红细胞悬液的制备：抽取抗凝血鸡血，700rpm,5min离心；用PBS清洗；再离心，吸取沉淀红细胞表面的白细胞，不断清洗直至红细胞表面无白细胞，PBS洗液呈透亮无颜色；以PBS：红细胞＝99：1的比例轻轻混匀，制得1％鸡红细胞悬液。
(5)四单位配置：测得HA效价后，按照原液稀释2n-2倍的方法配置四单位抗原(4HAU)，配好后，进行HA的步骤进行四单位验证，配好的四单位在验证时，前两孔出现血凝现象。
(2)HI实验：
①在96孔板1～11孔加入25μLPBS，第12孔加入50μLPBS；
②第1孔加抗H7亚型禽流感病毒纳米抗体D67(1mg/mL)25μL，混匀吸至第2孔，依次倍比稀释至第10孔，混匀后弃去25μLPBS，第11、12孔不加；
③从1～11孔，每空加稀释好的25μL AIV H7亚型Re-1株4单位抗原悬液，室温(24～25℃)静置至少30min，第12孔不加；
④将1％的鸡红细胞轻轻摇动混匀，在1～12孔中每孔加入25μL；震荡，室温(24～25℃)静置40min后观察结果。
H5、H9血凝抑制实验步骤与H7亚型Re-1株的血凝抑制实验相同。H5、H7、H9禽流感血凝抑制试验抗原分别为Re-8株、H7-Re-1株、H9亚型，均为购自哈尔滨维科生物技术有限公司的禽流感血凝抑制试验抗原。
HI结果显示，抗H7亚型禽流感纳米抗体D67对H7抗原效价为9log2，对H5、H9无血凝抑制(图3)，说明其为特异性结合的抗H7亚型禽流感纳米蛋白抗体。
实施例7抗H7亚型禽流感病毒纳米抗体D67对抗原的特异性检测应用
抗原包被：取H7亚型禽流感血凝抑制试验抗原H7-Re1株10μL，按照第一孔抗原(抗原：碳酸盐包被缓冲液＝1:9，v/v)按照10倍稀释，第二孔开始4倍稀释，将抗原吸附在固相载体聚苯乙烯；即第一孔将抗原和包被液稀释均匀后，吸取25μL至第二孔，一次稀释至第七孔，第八孔只加包被缓冲液做为空白对照，每孔最终75μL，4℃过夜孵育后，弃去板内液体；
封闭：加300μL3％BSA封闭1h；
一抗：抗H7亚型禽流感病毒纳米抗体蛋白即为一抗，按照1:100的比例用PBS稀释加75μL稀释后抗体(初始浓度为1mg/mL)至每孔；
洗涤：用含0.5％的Tween-20的PBS洗涤液洗涤4次，每次洗涤浸泡时间5min洗5次；
二抗：以金斯瑞公司的鼠源抗his多抗按照1:3000比例用PBS稀释，稀释加75μL稀释后抗体至每孔孵育1h；
洗涤：用含0.5％的Tween-20的PBS洗涤液洗涤4次，每次洗涤浸泡时间5min，洗5次；
三抗：以上海生工公司的羊抗鼠-HRP抗体按照1:5000比例用PBS稀释，稀释加75μL稀释后抗体至每孔，孵育1h；
洗涤：用含0.5％的Tween-20的PBS洗涤液洗涤4次，每次洗涤浸泡时间5min，洗5次；
显色：加入HRP底物显色液进行显色20min，用酶标仪的波长450nm进行读数。
ELISA结果(图4)显示：随着H7抗原(Re-1)梯度递减的包被抗原(一定范围内)，P/N比值也梯度递减，证明真核表达的可溶性抗H7亚型禽流感病毒纳米抗体D67具有良好的生物活性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.抗H7亚型禽流感纳米抗体或其抗原结合片段，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：
重链可变区，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的重链可变区中的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。
2.根据权利要求1所述的抗H7亚型禽流感纳米抗体或其抗原结合片段，其特征在于：
所述CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4所示，所述CDR是以IMGT定义方案定义的；或
所述CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7所示，所述CDR是以Kabat定义方案定义的；或
所述CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.7所示，所述CDR是以Chothia定义方案定义的；或
所述CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQID NO.12所示，所述CDR是以Contact定义方案定义的；
优选地，所述重链可变区的氨基酸序列包含：
a1)SEQ ID NO.1；或
a2)将SEQ ID NO.1经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ IDNO.1所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a3)与SEQ ID NO.1具有至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％的同源性且与SEQ ID NO.1所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
优选地，所述抗H7亚型禽流感纳米抗体或其抗原结合片段还包含Fc片段。
3.一种重组蛋白，包含：权利要求1～2中任一项所述的抗H7亚型禽流感纳米抗体或其抗原结合片段；和
任选的协助表达和/或纯化的标签序列；
优选地，所述的标签序列选自下组中的至少一种：His标签、GGGS序列、FLAG标签。
4.与权利要求1～2中任一项所述的抗H7亚型禽流感纳米抗体或其抗原结合片段、或权利要求3所述的重组蛋白相关的生物材料，所述生物材料包含b1)～b8)中至少一种：
b1)编码权利要求1～2中任一项所述的抗H7亚型禽流感纳米抗体或其抗原结合片段、或权利要求3所述的重组蛋白的核酸分子；
b2)包含b1)所述核酸分子的表达盒；
b3)包含b1)所述核酸分子的载体；
b4)包含b2)所述表达盒的载体；
b5)包含b1)所述核酸分子的转基因细胞系；
b6)包含b2)所述表达盒的转基因细胞系；
b7)包含b3)所述载体的转基因细胞系；
b8)包含b4)所述载体的转基因细胞系；
优选地，所述编码权利要求1～2中任一项所述的抗H7亚型禽流感纳米抗体或其抗原结合片段的核酸分子的核苷酸序列包含：
c1)如SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列；或
c2)将SEQ ID NO.13经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ IDNO.13所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列；或
c3)与SEQ ID NO.13具有至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％的同源性，且与SEQ ID NO.13所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列。
5.一种偶联物，包含：权利要求1～2中任一项所述的抗H7亚型禽流感纳米抗体或其抗原结合片段和权利要求3所述的重组蛋白中的至少一种；
以及偶联部分，所述偶联部分包含可检测标记物、药物、毒素、电子致密标记、生物素/抗生物素蛋白、自旋标记、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、放射性同位素、酶、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒和病毒外壳蛋白中的至少一种；
优选地，所述可检测标记物为荧光或发光标记物；
优选地，所述可检测标记物选自吖啶酯、吖啶磺酰胺、鲁米诺、异鲁米诺、辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶中的任意一种；
优选地，所述放射性同位素选自Tc-99m、Ga-68、F-18、I-123、I-125、I-131、In-111、Ga-67、Cu-64、Zr-89、C-11、Lu-177和Re-188中的至少一种。
6.固相载体，其表面偶联有权利要求1～2中任一项所述的抗H7亚型禽流感纳米抗体或其抗原结合片段、和/或权利要求3所述的重组蛋白。
7.(1)～(5)中至少一种在制备产品中的应用；
(1)权利要求1～2中任一项所述的抗H7亚型禽流感纳米抗体或其抗原结合片段；
(2)权利要求3所述的重组蛋白；
(3)权利要求4所述的生物材料；
(4)权利要求5所述的偶联物；
(5)权利要求6所述的固相载体；
所述产品包含药物、试剂、检测板、试剂盒、检测芯片中的至少一种；
优选地，所述药物具有d1)～d2)中至少一种功能：
d1)预防H7亚型禽流感病毒感染；
d2)治疗和/或预防H7亚型禽流感感染所引起的疾病；
优选地，所述试剂、检测板、检测芯片或试剂盒具有e1)～e3)中至少一种功能：
e1)检测H7亚型禽流感病毒；
e2)诊断H7亚型禽流感感染所引起的疾病；
e3)药物筛选，所述药物用于治疗和/或预防H7亚型禽流感感染所引起的疾病。
8.一种产品，所述产品包含f1)～f4)中至少一种：
f1)权利要求1～2中任一项所述的抗H7亚型禽流感纳米抗体或其抗原结合片段；
f2)权利要求3所述的重组蛋白；
f3)权利要求5所述的偶联物；
f4)权利要求6所述的固相载体。
9.根据权利要求8所述的产品，其特征在于：
所述产品包含药物、试剂、检测板、试剂盒、检测芯片中的至少一种；
优选地，所述药物具有d1)～d2)中至少一种功能：
d1)预防H7亚型禽流感病毒感染；
d2)治疗和/或预防H7亚型禽流感感染所引起的疾病；
优选地，所述试剂、检测板、检测芯片或试剂盒具有e1)～e3)中至少一种功能：
e1)检测H7亚型禽流感病毒；
e2)诊断H7亚型禽流感感染所引起的疾病；
e3)药物筛选，所述药物用于治疗和/或预防H7亚型禽流感感染所引起的疾病。
10.权利要求1～2中任一项所述的抗H7亚型禽流感纳米抗体或其抗原结合片段和/或权利要求3所述的重组蛋白的制备方法，通过培养权利要求4中所述的转基因细胞系得到。
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