CN115947833A - 一种抗h7亚型禽流感病毒的纳米抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种抗H7亚型禽流感病毒的纳米抗体及其应用。该抗H7亚型禽流感病毒的纳米抗体选自纳米抗体Q74或纳米抗体L125b；所述纳米抗体L125b中3个CDR区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：6‑8所示；所述纳米抗体Q74中3个CDR区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：10‑12所示。所述纳米抗体具有良好的稳定性和生物学活性，可应用于H7亚型禽流感病毒的诊断和检测，并具备优异的检测灵敏度和准确性。

Description

一种抗H7亚型禽流感病毒的纳米抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗H7亚型禽流感病毒的纳米抗体及其应用。

背景技术

流感病毒是一种单股、负链、有囊膜、分节段的RNA病毒，属于正黏病毒科流感病毒属，其基因组包含分段的8股负链核糖核酸。流感病毒的核蛋白与基质蛋白，即NP与M1，根据二者的抗原性将流感病毒分为甲、乙、丙、丁四个亚型。禽流感病毒属于其中的甲型，其抗原性由表位上的HA和NA结构决定，而这两者经常发生变异，导致禽流感产生多种分型，其中影响最广泛和危害最大的是H5亚型、H7亚型以及H9亚型。

对于禽流感防控，关键在于感染早期做出诊断。鉴定AIV的传统方法有细胞培养以及鸡胚培养，通过MDCK传代分离培养H7亚型AIV，然后利用显微观察病变情况可做出判断。血清学以及生物工程的发展促进了禽流感诊断领域的发展。H7亚型禽流感病毒在大多数诊断中的初步诊断结果与其他亚型的禽流感病毒相类似，所以通常需要通过诊断确诊禽流感病毒，再通过分子学实验进行验证。对于禽流感的主流诊断方法包括病原检测、流感血清检测以及分子生物学的检测。

禽流感病毒的所有亚型中危害较大的是H5、H7以及H9三种亚型，其中关于H7亚型禽流感相关的研究以及抗体筛选较少。在目前的诊断检测领域，纳米抗体体现了它可观的发展前景以及巨大的应用价值。原因是由于纳米抗体具有以下优点：

1、水溶性好：纳米抗体因为FR2区域上的疏水性氨基酸数量占该段氨基酸的比例较小而亲水性分子物质较大，从而使得纳米抗体在理化性质上具有更好的溶解性。如果将纳米抗体制成药物，高溶解性能够提高药物的利用率。

2、耐热性强：纳米抗体结构上存在的二硫键大大增强了纳米抗体的耐热能力，在37℃下经过1周时间，生物活性最少可只降低20％。

3、易复性好：纳米抗体在90℃以上的条件下的长期放置后，依然可以重新获得生物活性。而传统抗体在这样的条件下会发生不可逆的热聚合。

4、与抗原结合力高。CDR3的凸形结构，让其可深入抗原并与抗原结合稳固，而且纳米抗体不仅可以结合小分子半抗原和肽，还可以与大分子蛋白和病毒结合，甚至当识别位点较难被其他抗体识别时，小分子的纳米抗体也可识别特异性表位。

5、容易生产：因为结构简单、可以被单个基因编码以及分子质量小等特点，可以通过基因工程技术成功用酵母菌、大肠杆菌等大量表达纳米抗体。

6、具有表面效应：纳米抗体的表面效应，让其在电化学性免疫传感器领域具有重大应用价值，有研究表明，纳米抗体可以制成一种以间接发测定黄曲霉毒素的传感器，当应用在饲料生产领域中，又可以在对AFT的脱毒工艺中发挥作用，有效地降低了AFT带来的巨大危害。

7、易于改造与修饰：使用基因工程技术改造VHH，不但成熟而且速度相对较快，这促进了纳米抗体在治疗领域的发展。

8、穿透性强：纳米抗米的穿透能力远比比单克隆抗体强，这一优势使纳米抗体在疾病的影像诊断领域有着重大意义和巨大的发展潜力。

因此，本发明希望提出具有H7亚型禽流感病毒血凝抑制活性及病毒结合能力的纳米抗体，从而在H7亚型禽流感病毒的诊断和检测领域发挥作用。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种抗H7亚型禽流感病毒的纳米抗体及其应用。所述纳米抗体具有良好的稳定性和生物学活性，可应用于H7亚型禽流感病毒的诊断和检测，并具备优异的检测灵敏度和准确性。

本发明提供了一种抗H7亚型禽流感病毒的纳米抗体，选自纳米抗体Q74或纳米抗体L125b；

所述纳米抗体L125b中3个CDR区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：6-8所示；

所述纳米抗体Q74中3个CDR区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：10-12所示。

优选地，所述纳米抗体L125b的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

优选地，所述纳米抗体Q74的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。

本发明还提供了一种分离的核酸分子，编码上述抗H7亚型禽流感病毒的纳米抗体。

优选地，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14所示。

本发明还提供了一种重组表达载体，包含上述核酸分子。

本发明还提供了一种重组菌，包含上述核酸分子或重组表达载体。该重组菌可用于表达和生产上述抗H7亚型禽流感病毒的纳米抗体，具有产量高和生产成本低等优势，有着广阔的应用前景。

优选地，所述重组菌为重组酵母菌。

本发明还提供了上述纳米抗体在制备H7亚型禽流感病毒诊断/检测试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种H7亚型禽流感病毒诊断/检测试剂盒，包含上述纳米抗体。

相对于现有技术，本发明的有益效果如下：

(1)本发明所提出的抗H7亚型禽流感病毒的纳米抗体具有良好的稳定性和生物学活性，可应用于H7亚型禽流感病毒的诊断和检测，并具备优异的检测灵敏度、重复性和准确性。

(2)本发明采用真核表达系统构建得到表达抗H7亚型禽流感病毒的纳米抗体的重组菌，有效降低了纳米抗体的生产成本，并提高了准确性和重复性，且所生产的纳米抗体蛋白纯度较高，可实现抗H7禽流感病毒纳米抗体规模化生产。

附图说明

图1为抗H7禽流感纳米抗体Q74的重组表达载体的示意图。

图2为抗H7禽流感纳米抗体L125b的重组表达载体的示意图。

图3是将实施例4中保存的抗H7禽流感病毒纳米抗体蛋白质粒Q74 in pPICZαA和L125bin pPICZαA转化至受体毕赤酵母感受态内的PCR验证结果图；其中，泳道1为Yeasen2000Marker；泳道2为含有质粒Q74 in pPICZαA的目的基因扩增片段；泳道3为含有质粒L125bin pPICZαA的目的基因扩增片段；泳道4为阴性对照。

图4是SDS-PAGE电泳检测蛋白结果分析结果图；其中，泳道1为Vazyme MP102Maker；泳道2为纳米抗体Q74表达结果；泳道3为纳米抗体L125b表达结果。

图5为针对不同抗原的血凝抑制(HI)图；其中，第一行抗原为H7，第二行抗原为H5，第三行抗原为H9，第11列为阴性对照，第12列为空白对照。

图6为针对不同抗原的血凝抑制(HI)图。第一行抗原为H7，第二行抗原为H5，第三行抗原为H9，第11列为阴性对照，第12列为空白对照。

图7为抗H7禽流感纳米抗体蛋白Q74与不同的包被抗原的ELISA反应折线图；横坐标为表达的抗H7禽流感纳米抗体蛋白Q74稀释倍数，纵坐标是加入显色液后在650nm的波长下的读数。

图8为抗H7禽流感纳米抗体蛋白L125b与不同的包被抗原的ELISA反应折线图；横坐标为表达的抗H7禽流感纳米抗体蛋白L125b稀释倍数，纵坐标是加入显色液后在650nm的波长下的读数。

具体实施方式

为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例仅为本发明的优选实施例，对本发明要求的保护范围不构成限制作用，任何未违背本发明的精神实质和原理下所做出的修改、替代、组合，均包含在本发明的保护范围内。

以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。

实施例1：诱饵载体pGBKT7-H7的构建

(1)选取H7亚型禽流感病毒序列

在NCBI网站的GenBank板块公布的序列中查找H7亚型禽流感病毒的序列，利用DNAman软件对多个H7亚型禽流感病毒序列进行序列比对后，选取GenBank:MG739458.1序列，作为本次实验的目的片段，并将其命名为F-H7。

(2)将H7亚型禽流感病毒序列通过双酶切实验连接到pGBKT7载体中

将目的片段F-H7和pGBKT7载体分别用EcoRI和SalI双酶切，酶切体系：EcoRI 2μL；SalI 2μL；10×buffer 5μL；F-H7/载体(pGBKT7)15μL；无菌蒸馏水26μL；在37℃水浴锅中进行双酶切实验。在酶切反应了1.5h后，加入2.0μL 10×loadingbuffer起到终止酶切反应的作用。将酶切实验所得产物，进行凝胶电泳，通过凝胶成像系统判断产物的片段大小；截取目的条带，进行胶回收后，利用T4连接酶将目的条带中的片段与载体pGBKT7，在16℃金属连接仪中链接8～14小时，得到含有目的片段F-H7的pGBKT7载体。连接体系：T4 Ligase1μL；10×T4 buffer 2μL；双酶切后pGBKT7 2μL；双酶切后的片段6μL；无菌蒸馏水9μL。

(3)将含有目的片段F-H7的pGBKT7载体转化入DH5α大肠杆菌感受态中

将50μL DH5α大肠杆菌感受态、0.5μL含有目的片段F-H7的pGBKT7载体、1μL 5×KCM和30μL无菌蒸馏水混合；将混合物在冰箱4℃静置15min，然后在20℃～37℃环境中静置8min；将混合物轻轻地加入到1.0mL的新鲜配制的LB液体培养基(无抗生素)中，用移液枪轻轻吹打，放在37℃摇床中培养1h；低速离心3min，只保留30μL液体以及底层菌体沉淀；将保留菌液均匀涂布到LB固体培养基平板(含卡那霉素)上，37℃培养箱倒置培养9～15h。长出的菌落为含有目的片段F-H7的pGBKT7载体的DH5α大肠杆菌，并挑选生理状况良好的单菌落进行PCR、电泳及测序以进行验证。验证正确后，即成功构建诱饵质粒，命名为pGBKT7-H7。

实施例2：诱饵酵母的制备

(1)利用含有目的片段F-H7的pGBKT7载体的DH5α大肠杆菌制备诱饵质粒

在实施例1的步骤(3)中含有目的片段F-H7的pGBKT7载体的DH5α大肠杆菌感受态的平板上选取生理状态好的的单菌落，加入到新鲜配制的LB液体培养基中(含卡那霉素)，在37℃摇床中培养10～15h；使用Magen质粒快速小提试剂盒(产品编号：P1001-03)提取质粒：13000×g离心1min，收集1-5mL菌体。倒弃培养基，在吸水纸上轻轻拍打吸尽残液，加入250μL Buffer P1/RNase A混合液，高速涡旋重悬细菌。往重悬液中加入250μL Buffer P2，颠倒混匀8-10次，加入350μL Buffer NP3，立即颠倒8-10次让溶液彻底中和。13000×g离心2min，将柱子装在收集管中，把上清液转移至柱子中，13000×g离心30-60s。倒弃滤液，把柱子套回集合管中，加入500μL Buffer PW1至柱子中，13000×g离心30-60s。倒弃滤液，把柱子套回收集管中，加入600μL Buffer PW2(已用无水乙醇稀释)至柱子中13000×g离心30-60s。倒弃滤液，把柱子套回收集管中，13000×g离心3min干燥柱子。把柱子套在灭菌的1.5ml离心管中，加入30-100μL Elution Buffer或灭菌水至柱子的膜中央，静置1min，13000×g离心1min洗脱DNA。弃去柱子，把质粒保存于-20℃。将质粒送至公司进行测序，质粒测序正确后即为诱饵载体。

(2)制备诱饵菌株Y2HGold-H7

取Carrier DNA在4℃环境中融化，置于100℃水浴锅中加热6min，然后放在冰水混合物中2min，然后放入100℃水浴锅中加热6min，然后放在冰水混合物中2min，最后放在4℃环境下备用；将质粒pGBKT7-H7和Carrier DNA分别先后加入含有无菌的1.5mL EP管中，轻轻摇晃混匀；吸取30μL的酵母感受态菌液到上述含有质粒pGBKT7-H7和Carrier DNA的EP管中，再吸取600μL的PEG/LiAC，轻轻摇晃混匀；将EP管置于42℃水浴锅中10min然后取出上下混匀，然后再放入42℃水浴锅中10min，然后取出来轻轻摇匀；常温下低速离心2min，弃去上清，吸取800μL的新鲜配制的YPDA液体培养基(含卡那霉素)至EP管中，将EP管放置摇床中培养50min；低速离心2min，弃上清，吸取30μL新鲜配制的YPD液体培养基(含卡那霉素)并用接种环在SD/-Trp固体培养基板(含卡那霉素)上划线接种，培养箱中培养2～4天；挑选生理状况良好的单菌落进行PCR、电泳及测序以进行验证。验证正确后，将获得的诱饵菌株，即导入诱饵质粒pGBKT7-H7的Y2HGold酵母菌株，命名为Y2HGold-H7。

实施例3：纳米抗体文库的筛选

(1)诱饵菌株Y2HGold-H7与纳米抗体文库的Mating

快速取出一管酵母文库菌株(每管1.0mL)，置于冰上自然融化；将酵母文库菌株(每管1.0mL)与1.0mL诱饵菌株Y2HGold-H7(OD600为0.6的菌液)在新鲜配制的50mL 2×YPDA液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)在2L的锥形瓶中混合均匀，用1～2mL 2×YPDA灌洗文库小瓶，并加入2L的锥形瓶中，让放入培养箱中30℃、50r/min振荡培养约16h，使诱饵菌株Y2HGold-H7与酵母文库菌株进行充分杂交；20～22h后，吸取一滴菌液，利用相差显微镜(40×)观察菌液，如果发现看起来像三叶草或者米老鼠的结合物，且数目不小于5，则可继续下一步，否则需要再培养4h；收集菌液，在室温下3000r/min离心10min，弃去上清收集菌体，并且用50mL 0.5×YPDA(含50μg/mL卡那霉素)灌洗培养瓶两次，用该混合物重悬离心后的酵母细胞；低速离心5min，弃去上清，吸取3mL的1×YPDA(含卡那霉素)液体培养基加入到离心管内并且轻轻吹打；在提前准备好的新鲜配制的酵母双杂交蓝白斑(150mm的SD/-Trp/-Leu/-ABA-X板)筛选平板培养基上涂布剩余mating获得的酵母接合生殖培养物，置于30℃培养箱中避光培养3～5天；在第3天将平板取出，将蓝色的单菌落进行标记，在第5天时挑取直径大于1.0mm的蓝色单菌落，标记为候选阳性克隆。

(2)候选阳性克隆的划线筛选

将候选阳性克隆在酵母双杂交蓝白斑(150mm的SD/-Trp/-Leu/-ABA-X板)筛选平板培养基上划线培养，并设置阳性对照组和阴性对照组，在30℃的培养箱中放置4～8天，观察其生长情况。弃去一些作用相对较弱的候选阳性克隆，留下仍然表现为蓝色的候选阳性克隆进行下一步的验证。

(3)候选阳性克隆PCR鉴定

采用T7-F、T7-R和AD-F、AD-R两对引物分别对步骤(2)中划线筛选获得的阳性克隆进行PCR扩增目的片段，然后将PCR的产物进行凝胶电泳实验，最终观察扩增出来的片段大小来判断候选阳性克隆是否假阳性。将阳性克隆送去测序，即可得到抗H7亚型禽流感病毒纳米抗体序列。

其中，T7-R的核苷酸序列为：5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’(SEQ ID NO：1)；T7-F的核苷酸序列为：5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’(SEQ ID NO：2)；

AD-R的核苷酸序列为：5’-AGATGGTGCACGATGCACAG-3’(SEQ ID NO：3)；

AD-F的核苷酸序列为：5’-TACCACTACAATGGATGATG-3’(SEQ ID NO：4)。

经筛选，得到纳米抗体Q74和纳米抗体L125b。纳米抗体L125b的氨基酸序列为：QVQLVESGGGSVQAGGSLILSCASSVVANWCMGWFRQAPGKEREGIAAIDIDGTTHYAASVKGRFTITQDKAKSTVFLQMNTLKPEDTAMYFCAAGGSWYCPHLTRYEYNYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：5)，其中下划线部分表示纳米抗体L125b的3个互补决定区(CDR区)，其序列依次标记为SEQ ID NO：6-8。

纳米抗体Q74的氨基酸序列为：QVQLVESGGDSVQAGGSLRLSCAASVSPNWCMGWFRQAPGKEREVISAIDIDGSTHYAGAVKGRFTISQDKAKNAVYLQMDGLKPEDTAMYYCAAGGSWYCPVLTISEYNYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：9)，其中下划线部分表示纳米抗体Q74的3个互补决定区(CDR区)，其序列依次标记为SEQ ID NO：10-12。

实施例4：抗H7禽流感病毒纳米抗体蛋白质粒Q74 in pPICZαA和抗H7禽流感病毒纳米抗体蛋白质粒L125b in pPICZαA的构建

(1)通过密码子优化，得到可编码实施例3中纳米抗体Q74和纳米抗体L125b的核酸分子，具体序列信息如下所示：

编码抗H7亚型禽流感病毒纳米抗体蛋白L125b的核酸分子的核苷酸序列：5’-ATGGATAACCAGGTGCAACTCGTTGAGAGCGGCGGGGGGTCTGTGCAGGCAGGGGGTTCCTTGATTTTGAGTTGCGCCAGCTCAGTGGTAGCCAACTGGTGTATGGGGTGGTTTCGTCAAGCACCTGGGAAGGAACGTGAAGGGATTGCAGCAATCGACATTGATGGGACCACGCACTACGCAGCAAGTGTCAAGGGCCGCTTTACCATTACCCAGGATAAGGCGAAATCTACGGTTTTCCTGCAGATGAATACCTTAAAACCAGAGGACACAGCTATGTACTTCTGTGCCGCCGGCGGCTCGTGGTACTGTCCACATTTAACACGCTACGAATACAATTATTGGGGCCAAGGGACGCAGGTAACTGTTAGTTCT-3’(SEQID NO：13)；

编码抗H7亚型禽流感病毒纳米抗体蛋白Q74的核酸分子的核苷酸序列：5’-ATGGATAACCAGGTCCAGCTTGTTGAGTCGGGCGGGGACAGTGTTCAAGCAGGTGGTTCCCTCCGGCTCTCCTGTGCGGCCTCCGTATCACCTAATTGGTGTATGGGCTGGTTTCGCCAAGCCCCAGGGAAGGAGCGGGAAGTCATCAGCGCGATTGACATCGACGGGTCTACACATTATGCTGGCGCCGTCAAGGGGCGGTTTACTATTTCTCAGGATAAGGCCAAAAATGCTGTGTATCTTCAAATGGACGGGCTCAAACCAGAGGACACTGCCATGTACTACTGCGCTGCCGGTGGGAGCTGGTATTGCCCAGTCCTCACCATTTCCGAGTACAACTATTGGGGCCAGGGGACTCAAGTCACGGTCTCTTCA-3’(SEQ IDNO：14)。

将上述核酸分子进行基因合成，并在序列两端加上EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点(由上海通用公司合成)，然后将获得的目的基因片段和pPICZαA载体分别进行EcoRⅠ和NotⅠ双酶切并连接，得到2个重组表达载体，分别命名为Q74 in pPICZαA质粒(该重组表达载体大小约为3946bp)和L125b in pPICZαA质粒(该重组表达载体大小约为3946bp)。

图1-2为抗H7禽流感纳米抗体Q74、纳米抗体L125b的重组表达载体的示意图。

(2)质粒抽提，双酶切确认质粒并测序

将步骤(1)得到的重组表达载体Q74 in pPICZαA和L125b in pPICZαA分别转化至受体菌DH5α，菌液涂含博来霉素的LB(含15mg/L的博来霉素)板进行复苏活化，37℃培养16h后，挑取单个菌落重新转接涂板；将转接后的菌落，挑取一部分菌落转接至100mL的液体LB培养基中，37℃、200rpm的摇床上摇菌16h，先将部分菌液暂时分装放4℃保存；再取一部分菌液使用50mL离心管进行收集，8000rpm离心10min，弃去上清，进行质粒抽提；将测序正确的阳性克隆扩大培养，抽取质粒保存至-20℃冰箱，将菌液用含有体积分数为15～20％甘油的LB溶液放置-80℃进行保种。

实施例5：抗H7禽流感病毒纳米抗体蛋白的诱导表达

(1)将实施例4中抽提的Q74 in pPICZαA质粒和L125b in pPICZαA质粒分别转化到毕赤酵母，采用coolaber毕赤酵母转化试剂盒(产品编号SK2430)进行转化。

1、取0.1-5μg质粒DNA(线性化质粒加入量5-50μg)和10μg预变性Carrier DNA加入到未融化的感受态细胞上，置于30℃水浴，每隔15s颠倒混匀，直至感受态细胞刚好完全融化(融化后及时取出)。

2、加入1.4mL B2溶液颠倒混匀。30℃水浴60min。

3、3000rpm离心3min弃上清留菌液沉淀，加入1mL B3溶液重悬菌体。

4、3000rpm离心3min弃上清留菌液沉淀，加入100μL B3溶液重悬菌体。

将100μL菌液全部涂布到相应的平板培养基，30℃恒温培养3-5天，直至平板出现酵母克隆。

(2)挑取单个菌落利用aox1引物(正向引物aox1-f和反向引物aox1-r)进行菌落PCR确认，如图3所示。将大小约为634bp和632bp大小的目的条带的克隆菌落重新转接涂板，并保存；其中，AOX1引物序列如下所示：

正向引物(aox1-f)：5’-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3’(SEQ ID NO：15)；

反向引物(aox1-r)：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’(SEQ ID NO：16)。

PCR反应体系和条件如下所示：

扩增反应体系：

PCR Master Mix酶25μL，正向引物(10pmol/μL)1μL，反向引物(10pmol/μL)1μL，基因模板2μL，ddH₂O补足至50μL。

扩增反应条件：98℃3min；98℃15s、58℃15s、72℃60s，34个循环；72℃5min。

PCR反应完成之后，使用1％琼脂糖凝胶电泳。凝胶电泳显示大小为634bp和632bp左右的目的条带。

(3)挑取含目的条带的单菌落，置于装有20mL BMGY(含1％甘油)培养基的250mL摇瓶中，用封口纸封口，放置于30℃，250rpm摇床中培养至OD600＝2-6。室温下1500-3000g离心5min，收集菌体，用25mL BMMY(含0.5％甲醇)重悬菌体，所得的菌液置于250mL的摇瓶中，用封口纸封口，放置于30℃，250rpm摇床上继续生长96h。每24h向培养基中添加100％甲醇至终浓度为0.5％。收集菌液样品，8000g离心20min，保留样品的上清液。

(4)取少量的上清加入4×SDS上样缓冲液，混匀后，至沸水中煮10min，取上清上样于购自金斯瑞的SDS-PAGE胶孔，同时加入等量的蛋白Vazyme MP102 Maker，以电泳电压调节至100V跑胶，跑胶100min。将凝胶块从玻璃板中取出，轻放于摇床上含有考马斯亮蓝溶液的染色槽30min；然后将染色槽的考马斯亮蓝溶液倒出，加入清水冲洗干净后，凝胶块放于摇床中的染色槽中，用清水对凝胶块进行脱色30min即可见清晰条带，即抗H7禽流感病毒纳米抗体蛋白表达成功(如图4所示)。

实施例6：抗H7禽流感纳米抗体的蛋白功能验证

抗H7禽流感纳米抗体有抑制血凝的功能，因此本实施例通过血凝抑制(HI)实验检验该抗体。过程如下：先通过血凝(HA)试验测得病毒效价，配置四单位，再进行HI实验。

(1)HA实验：

①在96孔板1-11孔加入25μL PBS，第12孔加入50μL PBS；

②第1孔加重组AIV H7亚型Re-1株HI试验抗原(购自哈尔滨维科生物技术开发公司)25μL，混匀吸至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，混匀后弃去25μL，第12孔不加；

③从1～11孔，每孔加稀释好的25μL PBS；

④将1％的红细胞轻轻摇动混匀，在1～12孔中每孔加入25μL；震荡，室温(24-25℃)静置40min后观察结果；其中，1％鸡红细胞悬液的制备：抽取抗凝血鸡血，700rpm、5min离心；用PBS清洗。再离心，吸取沉淀红细胞表面的白细胞，不断清洗直至红细胞表面无白细胞，PBS洗液呈透亮无颜色。以PBS：红细胞＝99：1的比例轻轻混匀，制得1％鸡红细胞悬液。

四单位配置：测得HA效价后，按照原液稀释2n-2倍的方法配置四单位抗原(4HAU)，配好后，进行HA的步骤进行四单位验证，配好的四单位在验证时，前两孔出现血凝现象。

(1)HI实验：

①在96孔板1-11孔加入25μL PBS，第12孔加入50μL PBS；

②第1孔加抗H7禽流感病毒纳米抗体蛋白25μL，混匀吸至第2孔，依次倍比稀释至第10孔，混匀后弃去25μLPBS，第11、12孔不加；

③从1～11孔，每孔加稀释好的25μL AIV H7亚型Re-1株4单位抗原悬液，室温(24-25℃)静置至少30min，第12孔不加；

④将1％的红细胞轻轻摇动混匀，在1～12孔中每孔加入25μL；震荡，室温(24-25℃)静置40min后观察结果。

H5、H9血凝抑制实验步骤与H7亚型Re-1株的血凝抑制实验相同。H5、H7、H9禽流感血凝抑制试验抗原分别为Re-8株、H7-Re1株、H9亚型，均为购自哈尔滨维科生物技术有限公司的禽流感血凝抑制试验抗原。

HI结果显示，抗H7禽流感纳米抗体Q74对H7抗原效价为9log₂，对H5、H9无血凝抑制(如图5所示)；抗H7禽流感纳米抗体L125b对H7抗原效价为8log₂，对H5、H9无血凝抑制(如图6所示)。两个蛋白抗体Q74和L125b均为特异性结合的抗H7禽流感纳米蛋白抗体。

实施例7：抗H7禽流感病毒纳米抗体蛋白对抗原的特异性检测应用

纳米抗体Q74和纳米抗体L125b均是针对H7禽流感的特异性抗体，为此通过包被不同的抗原，用筛选表达的纳米抗体对包被的抗原进行检测。具体实验方案如下：

抗原包被：分别取H5、H7、H9禽流感血凝抑制试验抗原(分别为Re-8株、H7-Re1株、H9亚型)10μL，按照第一孔抗原(抗原：碳酸盐包被缓冲液＝1:9)按照10倍稀释，第二孔开始4倍稀释，将抗原吸附在固相载体聚苯乙烯。即第一孔将抗原和包被液稀释均匀后，吸取25μL至第二孔，一次稀释至第七孔，第八孔只加包被液做为空白对照，每孔最终75μL，37℃孵育2h或者4℃过夜孵育后，弃去板内液体；

封闭：加300μL 3％BSA封闭1h；

一抗：抗H7禽流感病毒纳米抗体蛋白即为一抗，按照1:100的比例用PBS稀释加75μL稀释后抗体至每孔；

洗涤：用含0.5％的Tween-20的PBS洗涤液洗涤3-5次，每次洗涤浸泡时间5min洗5次；

二抗：以金斯瑞公司的鼠源抗his多抗按照1:3000比例用PBS稀释，稀释加75μL稀释后抗体至每孔孵育1h；

洗涤：用含0.5％的Tween-20的PBS洗涤液洗涤3-5次，每次洗涤浸泡时间5min，洗5次；

三抗：以上海生工公司的羊抗鼠-HRP抗体按照1:5000比例用PBS稀释，稀释加75μL稀释后抗体至每孔，孵育1h；

洗涤：用含0.5％的Tween-20的PBS洗涤液洗涤3-5次，每次洗涤浸泡时间5min，洗5次；

显色：加入HRP底物显色液进行显色20min，用酶标仪的波长650nm进行读数。

ELISA结果显示：随着H7抗原(Re-1)梯度递减的包被抗原(一定范围内)，P/N比值也梯度递减。对比H5抗原、H9抗原，真核表达的抗H7亚型禽流感病毒的纳米抗体Q74(如图7所示)和L125b(如图8所示)对H7亚型AIV均有良好的抗原结合能力。

上面结合附图对本申请实施例作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.一种抗H7亚型禽流感病毒的纳米抗体，其特征在于，选自纳米抗体Q74或纳米抗体L125b；所述纳米抗体L125b中3个CDR区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：6-8所示；

所述纳米抗体Q74中3个CDR区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：10-12所示。

2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体L125b的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

3.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体Q74的氨基酸序列如SEQID NO：9所示。

4.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1-3中任一项所述的抗H7亚型禽流感病毒的纳米抗体。

5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ IDNO：13或SEQ ID NO：14所示。

6.一种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求4-5中任一项所述的核酸分子。

7.一种重组菌，其特征在于，包含权利要求4-5中任一项所述的核酸分子或权利要求6所述的重组表达载体。

8.根据权利要求7所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌为重组酵母菌。

9.权利要求1-3中任一项所述的纳米抗体在制备H7亚型禽流感病毒诊断/检测试剂盒中的应用。

10.一种H7亚型禽流感病毒诊断/检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-3中任一项所述的纳米抗体。

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