CN116375851B - 一种抗禽流感病毒np蛋白的纳米抗体及其制备方法与应用 - Google Patents

一种抗禽流感病毒np蛋白的纳米抗体及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的VHH链，该VHH链的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明以H9N2亚型禽流感病毒为研究对象，将其灭活后免疫羊驼，利用噬菌体展示技术筛选得到一株广谱型抗禽流感病毒NP蛋白的纳米抗体。本发明通过该抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的制备，为建立广谱型诊断方法提供了材料。

Description

一种抗禽流感病毒NP蛋白的纳米抗体及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种抗禽流感病毒NP蛋白的纳米抗体及其制备方法与应用。
背景技术
在羊驼外周血液中存在一种天然缺失轻链的抗体，该抗体只包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3区，分子量只有15KDa，因此也被称作纳米抗(Nanobody，Nb)。纳米抗体结构简单，抗原特异性好，组织穿透力强，在疾病的诊断及治疗方面具有广阔的应用前景。由于纳米抗体结构的特殊性，故产生了一些独特的性质。首先，纳米抗体是通过对动物外周血中B淋巴细胞的外显子进行PCR扩增得到的一个紧凑的整体结构，通过对其亲和力测定的结果显示，纳米抗体以纳摩尔甚至是皮摩尔的亲和力与抗原相结合，意味着纳米抗体有与单克隆抗体相当的亲和力；其次，纳米抗体具有较高的稳定性，经验证显示，大多数纳米抗体的热稳定强于单克隆抗体和多克隆抗体，同时纳米抗体对有机溶剂耐受度强于单克隆抗体；最后，纳米抗体极易表达，可以在微生物系统、哺乳动物或植物中进行高效表达和批量制备。
纳米抗体的开发不同于传统单克隆抗体通过杂交瘤制备的方法，它一般通过免疫羊驼、构建噬菌体文库和通过噬菌体展示来筛选出候选纳米抗体，再通过纳米抗体表达和纯化后与相应抗原进行验证。噬菌体展示技术是一种研究蛋白质与蛋白质或肽之间相互作用的实验技术，主要为了筛选和工程化所需特异性结合的多肽，其原理为噬菌体的衣壳蛋白基因可以和外源蛋白质或者多肽基因片段遗传融合，从而将外源基因的性状在噬菌体表面表达，这些携带不同外源基因的噬菌体组合成一个庞大的合集，即为噬菌体文库。利用噬菌体展示技术可以构建抗体库、随机肽库和cDNA文库等。通过简单的分子生物学技术，可以从此庞大的噬菌体文库中筛选出特异性强、亲和力高的纳米抗体。
H9N2亚型禽流感病毒可危害鸡的呼吸系统、消化系统、生殖系统，造成肉鸡生长迟缓，蛋鸡产蛋下降，并且还易与其它病原微生物发生混合感染，在免疫压力和抗原漂移作用下，禽流感病毒容易发生抗原变异，最终导致免疫失败，导致症状加重，死亡率显著上升，危害严重。禽流感病毒核蛋白(nuclear protein，NP)高度保守，为禽流感分型和鉴定的基础。NP蛋白是流感病毒vRNP复合体的关键成分，在病毒复制中发挥重要作用。目前，对于此病的防控关键是以预防和早期诊断为主，当前用于诊断禽流感的主要检测方法是血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验，HA试验可用来测定病毒的血凝价，HI试验可用来鉴定血凝素亚型，也可用HI试验检测机体免疫后的抗体水平。该检测方法特异性较好、灵敏度较高，但在实际应用中易受到一些因素的干扰，比如禽类血清中的非特异性因子引起的非特异性反应，导致不能准确测定其抗体水平；由于血凝素的亚型特异性，易出现漏检现象；每次试验前都需要制备红细胞的4单位抗原，这些因素均使得该试验存在一定的缺陷。基于纳米抗体具有分子量小和易于基因工程改造的优点，可以将抗NP蛋白纳米抗体与酶等报告基因进行融合表达，从而直接获得纳米抗体与酶的融合蛋白，避免对抗体的标记和使用二抗，从而简化生产工艺，降低生产成本，在流感病毒的诊断制品研究中具有非常广阔的市场前景。
发明内容
基于此，本发明提供了一种抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的VHH链，该VHH链的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
根据本发明的另一个方面，提供了一种抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体，其是针对禽流感病毒NP蛋白抗原表位的纳米抗体，并且具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的VHH链。
进一步地，该氨基酸序列被选自以下的氨基酸序列所替换：
a)该氨基酸序列与SEQ ID NO：1所示氨基酸的序列同一性程度为至少大约为95％、96％、97％、98％或至少99％；
b)由核苷酸序列编码的氨基酸序列，该核苷酸序列在严格条件下，与编码SEQ IDNO：1所示的氨基酸的核苷酸序列杂交；
c)该氨基酸序列与SEQ ID NO：1所示的氨基酸的序列差异不超过5、4、3、2或不超过1个氨基酸；
和/或
d)该氨基酸序列具有SEQ ID NO：1所示的，包括取代、缺失和/或插入1至5个氨基酸残基的氨基酸序列。
根据本发明的另一个方面，提供了一种与上述抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的VHH链、或上述抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体相关的生物材料，该生物材料为A1)至A12)中的任一种：A1)编码上述抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的VHH链、或上述抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的核酸分子；
A2)含有A1)该核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)该核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)该表达盒的重组载体；
A5)含有A1)该核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)该表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)该重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)该重组载体的重组微生物；
A9)含有A1)该核酸分子的转基因动物细胞系；
A10)含有A2)该表达盒的转基因动物细胞系；
A11)含有A3)该重组载体的转基因动物细胞系；
A12)含有A4)该重组载体的转基因动物细胞系。
进一步地，该核酸分子的核苷酸序列选自：
a)该核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
b)在严格条件下，与SEQ ID NO：2所示的核苷酸杂交的核苷酸序列；
c)与SEQ ID NO：2所示的核苷酸具有至少大约95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的核苷酸序列；
d)编码氨基酸的核苷酸序列，该氨基酸与SEQ ID NO：1所示的氨基酸的同一性程度为至少大约95％、96％、97％、98％或至少99％；
e)编码氨基酸的核苷酸序列，该氨基酸的序列与SEQ ID NO：1的差异不超过5、4、3、2或1个氨基酸残基；
和/或
f)编码氨基酸的核苷酸序列，该氨基酸具有SEQ ID NO：1所示的，包括取代、缺失和/或插入1至5个氨基酸残基的氨基酸序列。
根据本发明的另一个方面，提供了一种产生抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的VHH链或抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将编码上述抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的VHH链、或上述抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的核酸分子导入受体细胞，得到表达该抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的VHH链或该抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的转基因细胞；以及
(2)培养该转基因细胞，得到该抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的VHH链或该抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体。
进一步地，该禽流感病毒为H1N1亚型、H3N2亚型、H5N6亚型、H6N6亚型、H7N9亚型和/或H9N2亚型禽流感病毒。
根据本发明的另一个方面，提供了一种筛选抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的VHH链或抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将灭活后的禽流感病毒进行蔗糖密度梯度离心，将一定量的纯化后的该禽流感病毒与等体积佐剂乳化后，免疫羊驼4～6次，然后采集羊驼外周血，分离外周血淋巴细胞，构建抗禽流感病毒的噬菌体展示文库；以及
(2)利用噬菌体展示技术，经过3～5轮筛淘，筛选获得该抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的VHH链或该抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体。
进一步地，该禽流感病毒为H1N1亚型、H3N2亚型、H5N6亚型、H6N6亚型、H7N9亚型和/或H9N2亚型禽流感病毒。
根据本发明的另一个方面，提供了一种药物组合物，该药物组合物包含(a)权利要求1或3该的抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的VHH链、或权利要求2或3该的抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体；以及(b)药学上可接受的载体。
根据本发明的另一个方面，提供了一种重组蛋白，该重组蛋白包含(a)权利要求1或3该的抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的VHH链的序列、或权利要求2或3该的抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的序列；以及(b)协助表达和/或纯化的标签序列。
进一步地，该标签序列包括6His标签和/或HA标签。
根据本发明的另一个方面，提供了一种权利要求1或3该的抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的VHH链、或权利要求2或3该的抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的用途，用于制备(a)用于检测抗禽流感病毒NP蛋白分子的药剂、试剂、检测板或试剂盒；或者(b)用于制备预防和/或治疗禽流感病毒感染的药物；或者(c)用于区分禽流感病毒和新城疫病毒；
进一步地，该禽流感病毒为H1N1亚型、H3N2亚型、H5N6亚型、H6N6亚型、H7N9亚型和/或H9N2亚型禽流感病毒。
本发明的有益效果：
本发明公开了一种抗禽流感病毒NP蛋白的纳米抗体制备方法和应用，该纳米抗体的VHH链的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明通过蔗糖密度梯度离心超离纯化灭活的H9N2亚型禽流感病毒，将其作为免疫原免疫羊驼，构建噬菌体展示文库，通过Phage-ELISA方法筛选获得了1株高亲和力、广谱型的抗禽流感病毒NP蛋白的纳米抗体，该纳米抗体能够良好结合不同亚型禽流感病毒NP蛋白。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图，而并不超出本发明要求保护的范围。
图1为噬菌体展示文库基因插入效率检测结果示意图。
图2为本发明的纳米抗体纯化结果示意图。
图3为本发明的纳米抗体亲和力检测结果示意图。
图4为本发明的纳米抗体特异性检测结果示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另外说明，本文所用的所有技术和科学术语和缩略语具有本发明领域或该术语应用领域中普通技术人员通常所理解的含义。虽然本发明实施过程中可使用类似于或等价于本文公开的那些的任何方法、条件、物质或材料，但本文描述了优选的方法、条件物质或材料。
本发明有预期地涵盖所有的选择余地、变体和同等物，这些可能如权利要求所定义的那样包含在现有发明领域。所属领域的技术人员将识别许多类似或等同于在此所描述的方法和物质，这些可以应用于本发明的实践中去。本发明绝非限于方法和物质的描述。
需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂和仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
在一定程度上，具体实施方式和/或权利要求中使用术语“包含”、“包括(including，includes)”和“具有(having，has，with)”或其变体，这些术语意在包括与术语“包含(comprising)”类似的方式。
正如背景技术部分所描述的，当前HA和HI试验存在禽类血清中的非特异性因子引起的非特异性反应，导致不能准确测定其抗体水平；此外，血凝素的亚型特异性，易出现漏检现象及每次试验前都需要制备红细胞和4单位抗原等问题。为了解决上述问题，本发明提供了一种抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的VHH链，该VHH链的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示。
其中，SEQ ID NO：1的序列如下所示：
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGRAGDTYRMAWFRQAPGKEREFVAVITWTSTDYADSVKGRFTISRDGTKNTVYLQMDSLRPEDTAIYYCAADPTTYYGSASSENRDRFTYWGQGTQVTVSS
根据本发明的另一个方面，提供了一种抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体，其是针对禽流感病毒NP蛋白抗原表位的纳米抗体，并且具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的VHH链。
在本发明中的术语“纳米抗体”(nanobody)指克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体(VHH)，它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。
在一种优选的实施方式中，该氨基酸序列被选自以下的氨基酸序列所替换：
a)该氨基酸序列与SEQ ID NO：1所示氨基酸的序列同一性程度为至少大约为95％、96％、97％、98％或至少99％；
b)由核苷酸序列编码的氨基酸序列，该核苷酸序列在严格条件下，与编码SEQ IDNO：1所示的氨基酸的核苷酸序列杂交；
c)该氨基酸序列与SEQ ID NO：1所示的氨基酸的序列差异不超过5、4、3、2或不超过1个氨基酸；
和/或
d)该氨基酸序列具有SEQ ID NO：1所示的，包括取代、缺失和/或插入1至5个氨基酸残基的氨基酸序列。
根据本发明的另一个方面，提供了一种与上述抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的VHH链、或上述抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体相关的生物材料，该生物材料为A1)至A12)中的任一种：A1)编码上述抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的VHH链、或上述抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的核酸分子；
A2)含有A1)该核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)该核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)该表达盒的重组载体；
A5)含有A1)该核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)该表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)该重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)该重组载体的重组微生物；
A9)含有A1)该核酸分子的转基因动物细胞系；
A10)含有A2)该表达盒的转基因动物细胞系；
A11)含有A3)该重组载体的转基因动物细胞系；
A12)含有A4)该重组载体的转基因动物细胞系。
进一步地，该核酸分子的核苷酸序列选自：
a)该核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
b)在严格条件下，与SEQ ID NO：2所示的核苷酸杂交的核苷酸序列；
c)与SEQ ID NO：2所示的核苷酸具有至少大约95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的核苷酸序列；
d)编码氨基酸的核苷酸序列，该氨基酸与SEQ ID NO：1所示的氨基酸的同一性程度为至少大约95％、96％、97％、98％或至少99％；
e)编码氨基酸的核苷酸序列，该氨基酸的序列与SEQ ID NO：1的差异不超过5、4、3、2或1个氨基酸残基；
和/或
f)编码氨基酸的核苷酸序列，该氨基酸具有SEQ ID NO：1所示的，包括取代、缺失和/或插入1至5个氨基酸残基的氨基酸序列。
其中，SEQ ID NO：2的序列如下所示：
CAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTACAGCCTCTGGACGCGCCGGGGATACATATCGCATGGCCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAACGTGAGTTTGTAGCGGTTATTACGTGGACGAGTACAGACTATGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACGGCACGAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGGACAGCCTGAGACCTGAGGACACGGCCATTTATTACTGTGCAGCAGATCCCACGACGTACTATGGAAGTGCTTCGAGCGAAAATAGGGACCGGTTTACCTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA
在本发明中，术语“具有”、“包含”或“包括”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。然而在用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。
本发明所用的术语“约”或“大约”在此处使用来修饰数值并表明那个值附近的一个限定的范围。如果“X”是该值的话，“约X”通常是表明从0.95X至1.05X的一个值。每当提到“约X”或“大约X”时，最少表明至少这些值X、0.95X、0.96X、0.97X、0.98X、0.99X、1.01X、1.02X、1.03X、1.04X、1.05X。“约”或“大约”还可包括该量中药品监管机构(例如NMPA、FDA或EMEA)会视作生物等效于所要求的量的各种变化。
根据本发明的另一个方面，提供了一种产生抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的VHH链或抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将编码上述抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的VHH链、或上述抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的核酸分子导入受体细胞，得到表达该抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的VHH链或该抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的转基因细胞；以及
(2)培养该转基因细胞，得到该抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的VHH链或该抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体。
在一种优选的实施方式中，该禽流感病毒为H1N1亚型、H3N2亚型、H5N6亚型、H6N6亚型、H7N9亚型和/或H9N2亚型禽流感病毒。
根据本发明的另一个方面，提供了一种筛选抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的VHH链或抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将灭活后的禽流感病毒进行蔗糖密度梯度离心，将一定量的纯化后的该禽流感病毒与等体积佐剂乳化后，免疫羊驼4～6次，然后采集羊驼外周血，分离外周血淋巴细胞，构建抗禽流感病毒的噬菌体展示文库；以及
(2)利用噬菌体展示技术，经过3～5轮筛淘，筛选获得该抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的VHH链或该抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体。
在一种优选的实施方式中，该禽流感病毒为H1N1亚型、H3N2亚型、H5N6亚型、H6N6亚型、H7N9亚型和/或H9N2亚型禽流感病毒。
根据本发明的另一个方面，提供了一种药物组合物，该药物组合物包含(a)权利要求1或3该的抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的VHH链、或权利要求2或3该的抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体；以及(b)药学上可接受的载体。
根据本发明的另一个方面，提供了一种重组蛋白，该重组蛋白包含(a)权利要求1或3该的抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的VHH链的序列、或权利要求2或3该的抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的序列；以及(b)协助表达和/或纯化的标签序列。
在一种优选的实施方式中，该标签序列包括6His标签和/或HA标签。
根据本发明的另一个方面，提供了一种权利要求1或3该的抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的VHH链、或权利要求2或3该的抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的用途，用于制备(a)用于检测抗禽流感病毒NP蛋白分子的药剂、试剂、检测板或试剂盒；或者(b)用于制备预防和/或治疗禽流感病毒感染的药物；或者(c)用于区分禽流感病毒和新城疫病毒；
在一种优选的实施方式中，该禽流感病毒为H1N1亚型、H3N2亚型、H5N6亚型、H6N6亚型、H7N9亚型和/或H9N2亚型禽流感病毒。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本专利说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
实施例1抗H9N2亚型禽流感病毒抗NP蛋白的纳米抗体的噬菌体展示文库的构建
1 实验方法
1.1 免疫羊驼
利用蔗糖密度梯度离心超离纯化灭活的H9N2亚型禽流感病毒(AIV)，将50μg纯化的H9N2 AIV与相同体积的弗氏佐剂混合、乳化后，通过颈部皮下多点注射免疫羊驼。首次免疫，选用弗氏完全佐剂；此后，每隔两周用弗氏不完全佐剂进行乳化，免疫共5次。最后一次免疫之后第7天采血，利用间接ELISA(以纯化的H9N2 AIV为包被抗原，100ng/孔)检测5次免疫之后羊驼血清中的抗体效价。当血清中抗H9N2AIV的抗体效价不低于1:64000时，进行噬菌体展示抗体库的构建。
1.2VHH噬菌体抗体文库的构建及淘选
1.2.1外周血淋巴细胞的分离
利用人外周血淋巴细胞分离液分离羊驼外周血淋巴细胞(PBMC)，具体操作按照试剂盒按说明书，分离获得的PBMC用于细胞总RNA的提取。
1.2.2VHH基因片段的扩增
利用RNA提取试剂盒(OMEGA公司，货号R6834-01)提取PBMC的总RNA，并利用反转录试剂盒(TaKaRa公司，货号R026A)，以提取的总RNA为模板，反转录获得cDNA，再通过巢式PCR扩增VHH基因。第一步PCR的产物使用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定、分离，回收分子量大小～700bp的PCR产物；再以此回收产物为模板，进行第二轮PCR扩增，获得分子量大小～400bp的VHH片段，再行切胶回收。
1.2.3VHH噬菌体展示载体的构建
将上述VHH产物和线性化的噬菌粒载体，通过同源重组的方法进行连接，具体操作按照同源重组试剂盒说明书进行(诺唯赞，货号C113-01)。
1.2.4SS320电转感受态细胞的制备
将SS320大肠杆菌(预感染M13KO7 Helper Phage)培养至OD600nm为0.4后，将其迅速冷却，4℃，6000g，5-10min，用预冷的ddH2O(无菌)反复洗涤3-5次，最后一次离心结束后用10％甘油水(无菌)重悬SS320感受态细胞，200μl/管，-80℃保存备用。
1.2.5连接产物转化及噬菌体抗体文库的收获
从-80℃超低温保存箱取出1管SS320大肠杆菌感受态细胞，冰上放置5min使其融化，然后将连接产物轻轻加入到SS320感受态细胞中，轻轻混匀加入到电转杯中，用Eppendorf电穿孔仪，设置参数为2.5kV，25μF，200Ω，2mm，进行电击转化。将转化后的感受态细胞立即重悬、转入到20mL的37℃预热的SOC培养基中，37℃、120r/min，震荡培养1h后，取100μl原液(备用)，其余培养物转接到500ml的2×YT/Amp-Kan培养基，37℃培养12-14h，培养结束后，将培养液离心，10000g/min，10min，4℃，收集上清，并加入1/4体积预冷的PEG/NaCl溶液，充分混匀，放入4℃冰箱静置30～60min；最后将混合液离心，用1ml PBT悬浮沉淀，测定并稀释至特定浓度，分装保存于-80℃备用。
1.2.6噬菌体展示文库库容和多样性的测定
将电转活化后的重组菌(上述100μl原液)进行10倍比梯度稀释，选择10-3-10-5的稀释液分别取10μl滴涂于LB/Amp-Kan平板，37℃培养12h，计算转化效率，最终得到库容为2×109CFU(colony-forming units)的噬菌体文库。随机挑取15个单克隆，利用VHH-F和VHH-R引物进行PCR鉴定，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，目的片段大小约400bp，并将阳性克隆进行测序，以确定纳米抗体的多样性。
1.3抗NP蛋白的特异性纳米抗体的筛选
1.3.1抗NP蛋白特异性重组噬菌体的淘选
将纯化的NP蛋白包被ELISA板，1％ PVA为无抗原对照。取上述制备的噬菌体溶液，加入ELISA板中，室温孵育2h，弃去噬菌体样品。然后，每孔中加入新鲜配制的0.1M HCl，室温轻轻震荡10min，将洗脱液迅速用等体积1M Tris-HCl(pH 8.0)中和。取洗脱液加入到1mL的对数期的NEB5aF’细菌中，37℃200r/min培养1h，然后加入M13辅助噬菌体，继续37℃200r/min培养1h，转接到40mL的2×YT/Amp-Kan培养基中。重复上述操作，收集得到噬菌体文库；将获得的筛选后第一轮噬菌体文库，利用上述1.3.1的操作进行第二轮和第三轮的筛淘，每轮通过滴定的方法，确定噬菌体的富集情况。
1.3.2纳米抗体的筛选
从富集的平板上随机挑取90个单菌落，接种于96孔深孔板中，每孔一个单菌落，加入到2×YT/Amp-Kan培养基培养过夜；将菌液离心收获上清中噬菌体，用ELISA方法筛选NP蛋白对应的纳米抗体，Phage ELISA鉴定挑选阳性菌液进行测序，得到纳米抗体序列，具体操作如下：
(1)用NP蛋白包被ELISA板，100ng/孔，4℃包被过夜；
(2)将ELISA酶标板倒扣去掉上清，每孔加入200μl 1％PVA，同时未包被NP蛋白的阴性对照组也加入200μl 1％PVA，37℃封闭1小时；
(3)将96深孔板离心，4000rpm/min，4℃离心10min；
(3)1.5h后，弃掉ELISA酶标板中的上清液，用PBST清洗酶标板3遍后甩干，加入50μl的噬菌体(即96深孔板的上清)，室温轻轻摇晃2h；
(4)清洗ELISA酶标板，用PBST清洗4遍后加入HRP-M13抗体100μl，37℃孵育1h；
(5)显色弃掉ELISA酶标板中的上清液，用PBST清洗酶标板3遍后甩干，加入100μlTMB显色液，室温放置10～15min，观察显色；
(6)终止反应每孔加入100μl硫酸终止液终止反应；以及
(7)用酶标仪测量在450nm波长处测定各孔OD450值。选取吸光度值较高的10-15个阳性克隆菌液保菌，并进行测序验证。
1.3.3纳米抗体的克隆与表达
将抗体序列克隆至pcDNA 3.1-Fc(包含人Fc的CH2和CH3基因片段)真核表达载体，提取质粒并转染至293F悬浮细胞，7天后收集上清，PBS缓冲液透析过夜，利用Ni-NTA纯化介质纯化出目的抗体，进行SDS-PAGE试验，分析结果。
2实验结果
2.1第一轮PCR扩增
琼脂糖凝胶电泳结果显示，使用oligo dT+随机引物反引物转录后进行第一轮扩增使用2μl作为模板扩增条带强清晰且无杂带，切胶并回收目的条带。
2.2第二轮PCR扩增
在第一轮PCR扩增后，回收约700bp的目的条带，然后以其为模板，进行第二轮PCR扩增，最后得到的目的片段大小约450bp。
2.3噬菌体文库构建结果
成功建立噬菌体展示文库，库容为2×109/ml。
2.4阳性克隆菌落PCR
菌落PCR琼脂糖凝胶电泳结果显示，挑选的15个单克隆均为为阳性克隆，阳性率为100％(结果如图1所示)，抗体库阳性克隆率符合要求。
2.5序列多样性
随机挑选20个单克隆测序后使用GENtle软件转录翻译成蛋白质序列，序列多样性比对显示19个序列均为独立序列，多样性95％，抗体库多样性符合要求要求。
2.6纳米抗体筛选结果
利用Phage ELISA实验方法，成功得到1株纳米抗体的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)。
2.7纳米抗体的克隆与表达试验结果
通过测序发现，纳米抗体基因成功克隆至pcDNA 3.1-Fc真核表达载体。将构建好的纳米抗体质粒转染至293F悬浮细胞，培养6天后收集细胞上清，并对抗体进行纯化，试验结果表明，成功纯化到纳米抗体(结果如图2所示)。
实施例2抗H9N2亚型禽流感病毒抗NP蛋白的纳米抗体特性鉴定
1 实验方法
1.1 纳米抗体亲和力检测
将H9N2亚型禽流感蛋白100ng/孔包被ELISA板，将抗H9N2亚型禽流感病毒NP蛋白纳米抗体(NP-Nb1)进行2倍倍比多次稀释后加入ELISA板，37℃孵育1h，PBST洗涤ELISA板3次，加入商品化His-HRP二抗，37℃孵育1h，PBST洗涤ELISA板3次，TMB显色10min，读取OD450值，并根据已报道方法计算EC50值，计算纳米抗体的亲和力。
1.2纳米抗体特异性检测
通过间接免疫荧光实验，对所得的NP-Nb1特异性进行分析。具体步骤为：分别用不同亚型的禽流感病毒(H1N1，H3N2，H5N1，H5N6，H6N6，H7N9，H9N2)的NP-PCAGG质粒转染MDCK细胞，并设置新城疫病毒阴性对照，在转染后24h，使用PBS洗涤细胞2次；加入4％多聚甲醛固定细胞15min；PBS洗涤细胞3次后加入由PBS配制的2％的BSA溶液，37℃封闭30min；PBS缓冲液充分洗涤后加入0.1％ Triton X-100透膜15min，PBS缓冲液充分洗涤；加入使用1％BSA溶液稀释的NP-Nb1纳米抗体，孵育1h，洗涤，然后加入anti-Fc-FITC二抗，孵育30min，洗涤，加入DAPI，用激光共聚焦显微镜检测并拍摄照片。
2实验结果
2.1纳米抗体的亲和力检测试验结果
亲和力试验结果表明：经ELISA测得NP-Nb1具有较高的亲和活性，计算EC50为4.94nM(结果如图3所示)。
2.2纳米抗体的间接免疫荧光试验结果
在转染后24h后进行间接免疫荧光(IFA)试验，并设置空白细胞对照。试验结果证明筛选的NP-Nb1与不同亚型禽流感病毒NP蛋白均可以结合，与新城疫病毒(NDV)无反应(结果如图4所示)。
以上对本发明实施例进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明仅用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。同时，本领域技术人员依据本发明的思想，基于本发明的具体实施方式及应用范围上做出的改变或变形之处，都属于本发明保护的范围。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (8)

1.一种抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的VHH链，其特征在于，所述VHH链的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.与权利要求1所述的抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的VHH链相关的生物材料，其特征在于，所述生物材料为A1)至A12)中的任一种：A1)编码权利要求1所述的抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的VHH链的核酸分子；
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
A9)含有A1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；
A10)含有A2)所述表达盒的转基因动物细胞系；
A11)含有A3)所述重组载体的转基因动物细胞系；
A12)含有A4)所述重组载体的转基因动物细胞系。
3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示。
4.一种产生抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的VHH链或抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将编码权利要求1所述的抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的VHH链的核酸分子导入受体细胞，得到表达所述抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的VHH链或所述抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的转基因细胞；以及
(2)培养所述转基因细胞，得到所述抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的VHH链或所述抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述禽流感病毒为H9N2亚型禽流感病毒。
6.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含(a)权利要求1所述的抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的VHH链；以及(b)药学上可接受的载体。
7.一种重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白由(a)权利要求1所述的抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的VHH链的序列；以及(b)协助表达和/或纯化的标签序列组成，其中所述标签序列为6His标签或HA标签。
8.权利要求1所述的抗禽流感病毒NP蛋白纳米抗体的VHH链在制备用于检测抗禽流感病毒NP蛋白分子的药剂、试剂、检测板或试剂盒的用途，其中所述禽流感病毒为H9N2亚型禽流感病毒。
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