CN108289943A - 在肿瘤细胞中拮抗wnt信号传递的双互补位多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明提供新颖双互补位LRP5/LRP6交叉反应性结合多肽，且更特别是新颖双互补位LRP5/LRP6交叉反应性免疫球蛋白单一可变域构建体，其可抑制Wnt信号传递路径。本发明还涉及此多肽的特异性序列，其制造方法及其使用方法，包括治疗疾病诸如癌症的方法。

Description

在肿瘤细胞中拮抗WNT信号传递的双互补位多肽
技术领域
本发明涉及新颖低密度脂蛋白受体样蛋白5(LRP5)结合多肽及低密度脂蛋白受体样蛋白6(LRP6)结合多肽。本发明亦涉及编码此类多肽的核酸；制备此类多肽的方法；表达或能够表达此类多肽的宿主细胞；包含此类多肽的组合物；及此类多肽或此类组合物尤其针对癌症疾病领域中的治疗性目的之用途。
背景技术
Wnt信号传递路径的活化需要胞外Wnt配体结合至Frizzled受体且结合至共受体LRP5(登录号：UniProtKB-O75197/LRP5_HUMAN)或其紧密相关的同系物LRP6(登录号：UniProtKB-O75581/LRP6_HUMAN)。哺乳动物细胞中存在19种Wnt蛋白及10种Frizzled受体。在不存在Wnt配体的情况下，细胞质β-联蛋白通过由骨架蛋白质轴蛋白与APC及激酶GSK3β与CK1a组成的蛋白复合物磷酸化。藉由泛素连接酶β-TrcP的后续识别会引起β-联蛋白的经泛素介导的降解。在存在Wnt配体的情况下，Wnt结合至Frizzled及LRP5或LRP6会引起细胞质效应子蛋白Dvl的募集及LRP5或LRP6细胞质尾区的磷酸化，其为轴蛋白提供对接位点。藉由LRP5或LRP6的轴蛋白螯合作用会引起轴蛋白-APC-GSK3β复合物的失活，且因此引起胞内β-联蛋白稳定化及积聚。因此，β-联蛋白的细胞质水平上升，且β-联蛋白迁移至具有转录因子的T细胞因子(TCF)/淋巴增强子-结合因子(LEF)家族的成员的细胞核及复合物。随后募集基础转录机制及转录共活化剂，包括cAMP应答元件结合蛋白(CREB)-cAMP结合蛋白(CBP)或其同系物p300，引起各种靶基因的表达，包括轴蛋白2、细胞周期素D1及c-Myc。
额外水平的配体依赖性Wnt路径调节通过E3连接酶RNF43及其紧密相关同系物ZNRF3且藉由分泌性R-反应素蛋白质介导(de Lau等人，”The R-spondin/Lgr5/Rnf43module:regulator of Wnt signal strength”.Genes Dev.2014；28(4):305-16)。RNF43介导细胞表面处的Frizzled/LRP5或LRP6受体复合物的泛素化，引起其降解，且由此抑制配体依赖性Wnt路径活性。RNF43的活性通过R反应素家族成员(R-反应素1至4配体)削弱。当存在R-反应素配体时，其自细胞表面移除RNF43，使得在Wnt配体存在下，Frizzled/LRP5或LRP6复合物积聚且Wnt信号传递增强。
LRP5及LRP6充当配体依赖性Wnt信号传递活化的守门者(gatekeeper)，且因此，可视为达成经全部19种Wnt配体及10种Frizzled受体介导且经R-反应素配体强化的路径的完全阻断的靶向物。具体而言，Wnt配体可划分成Wnt1类及Wnt3a类，其各自与LRP5及LRP6的不同抗原决定基/区域结合以供信号传递。LRP5及LRP6的胞外域包含连接至EGF样域的β-螺旋桨的四个重复单元，之后为三个LDLR型A重复序列。对LRP5及LRP6进行的结构性及功能性组合分析表明，Wnt1(Wnt1类配体)与LRP6含有β-螺旋桨1及β-螺旋桨2的片段结合，且Wnt3a与含有β-螺旋桨3及β-螺旋桨4的片段结合。到目前为止，仅报导含有来自1至4区的β-螺旋桨(β-propeller)的LRP6胞外域的低解析度图片(Ahn等人“Structural basis of Wntsignaling inhibition by Dickkopf binding to LRP5/6”.Dev Cell.2011；21(5):862-73)。然而，这些低解析度重构建(40A°)的不确定性及缺乏具有Wnt配体的复合物中的LRP6胞外域的结构性数据使得无法限定出Wnt1或Wnt3a配体结合中所涉及的精确表位。
各种类型的癌症的发病机制中均涉及Wnt信号传递的过度活化。在一些癌症类型中，下游信号传递分子中的常见突变会促成组成性活化的Wnt路径(例如结肠直肠癌中的APC突变；肝细胞癌中的β-联蛋白活化突变)。对比而言，在三阴性乳腺癌(TNBC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌中且在一小类结肠直肠癌(CRC)及子宫内膜癌中，如藉由β-联蛋白胞内积聚所检测，Wnt信号传递活化通过配体依赖性机制(亦即藉由自分泌/旁分泌Wnt活化)来驱动。在NSCLC、TNBC及胰腺癌中，配体依赖性Wnt活化通过多种机制来介导，其包括Wnt配体和/或LRP5与LRP6受体的增加的表达，或LRP5及LRP6负调节因子DKK1沉默(TNBC：Liu等人“LRP6过度表现限定出一类乳腺癌次型且为疗法之靶向物”.Proc Natl Acad Sci U S A2010；107(11):5136-41；Khramtsov等人“Wnt/β-联蛋白路径活化富集于基底样乳腺癌中且预测不良后果”.Am J Pathol.2010；176(6):2911-20；NSCLC：Nakashima等人“Wnt1overexpression associated with tumor proliferation and a poor prognosisin non-small cell lung cancer patients”.Oncol Rep.2008；19(1):203-9；胰腺癌：Zhang等人“典型wnt信号传递为胰腺癌癌发生所必需的”.Cancer Res.2013；73(15):4909-22)。具体而言，所公开的数据已显示，在健康组织(例如乳腺及肺上皮)中，β-联蛋白仅定位于质膜处。对比而言，归因于异常Wnt信号传递，大多数TNBC、NSCLC及胰腺癌初级临床样本显示出β-联蛋白胞内积聚(亦即在细胞质/细胞核；Wnt信号传递活化的生物标记物中)。近期公开案已显示，在一小类CRC及子宫内膜癌中，配体依赖性Wnt信号传递活化通过突变/失活RNF43(Giannakis等人“RNF43常常在结肠直肠癌及子宫内膜癌中突变”.NatGenet.2014；46(12):1264-6)或藉由活化R-反应素融合转录物(编码藉由组成性活性强启动子驱动的R-反应素2或R-反应素3蛋白质；Seshagiri等人“Recurrent R-spondinfusions in colon cancer”.Nature 2012；488(7413):660-4)介导。失活RNF43突变及R-反应素融合转录物均已显示藉由增加细胞表面上的Frizzled的丰度而强化体外配体依赖性Wnt信号传递。已显示肿瘤中的配体依赖性Wnt活化会驱动肿瘤生长及对化学疗法或免疫疗法的抗性，且与临床前模型中的复发有关。
一些LRP5或LRP6结合分子能够调变Wnt信号传递路径在本领域中为已知的：
Dickkopf-1(DKK1)为LRP5及LRP6抑制因子。DKK1与Wnt共受体，LRP5及LRP6两者相关联，且跨膜蛋白Kremen抑制Wnt信号传递且引起LRP5与LRP6快速内化。显示DKK1会抑制经Wnt1及Wnt3a介导的信号传递。结构性模型化研究显示，单一DKK1分子会与LRP6胞外域的延伸区域(来自β-螺旋桨1至β-螺旋桨3)合作性地结合。结构性分析表明DKK1与LRP6的合作性结合相互作用，其中DKK1与β-螺旋桨3区初始结合，便于经由LRP6胞外域的构形变化与β-螺旋桨1区及β-螺旋桨2区相互作用/结合。然而，如所提及，归因于与DKK1结合的全部LRP6胞外域的结构性重构建的解析度较低，因此缺乏对DKK1与LRP6结合中所涉及的β-螺旋桨1区、β-螺旋桨2区及β-螺旋桨3区中的确定的表位的阐明。
DKK1体内治疗显示会在胃肠道中产生严重毒性。具体而言，DKK1在成年小鼠中的经腺病毒介导的表达显示显著抑制小肠及结肠中的增殖，其伴有由结肠炎及全身性感染导致的进行性架构退化、体重急剧下降及死亡。具体而言，LRP5及LRP6表现于肠道中的增殖上皮细胞中且为肠道上皮的增殖所必需的，表明LRP5及LRP6抑制对于此正常组织及其他正常组织可能具有毒性(Zhong等人“Lrp5及Lrp6在小鼠肠道进展中起补偿性作用”.J CellBiochem.2012；113(1):31-8)。此使得抑制LRP5及LRP6或一般而言，抑制Wnt(Wnt1及Wnt3a)信号传递路径的药剂是否可用于治疗性目的，例如，可研发作为抗癌药物为令人怀疑的。
WO2009/056634提及可与Wnt1信号传递路径或与Wnt3/Wnt3a信号传递路径相互作用的LRP6结合分子，其可为拮抗性或激动性的，且可用于诊断性目的或用于治疗”Wnt信号传递相关病症”，诸如骨关节炎、多囊性肾病或癌症。由其氨基酸序列限定的此类结合分子的特定实施例并未提供于此文献中。
WO2011/138391及WO2011/138392揭示多价LRP6结合抗体。WO2011/138391主张阻断一个Wnt信号传递路径(Wnt1或Wnt3)而不强化另一路径(Wnt3或Wnt1，分别)的抗体。以上WO2011/138392提供藉由LRP6受体簇集强化Wnt信号传递的抗体或抗体片段。
WO2011/138391解释LRP6结合分子需要格式化(format)至全长IgG抗体中以达成所需效应。提供了LRP6双互补位分子的实施例，其包括IgG分子，具有第一结合特异性，偶合至单链Fv部分，具有第二结合特异性。一些格式描述为具有显著降低的热稳定性(Tm为50℃至52℃)。Fc部分可赋予IgG分子效应功能，诸如补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
WO2013/067355揭示半衰期延长的双互补位LRP6结合scFv免疫球蛋白构建体，其衍生自WO2011/138391中所揭示的IgG分子。
WO2011/119661揭示结合至LRP6且抑制由第一Wnt同种型，尤其Wnt3或Wnt3a诱导的信号传递，但强化由第二Wnt同种型诱导的信号传递的抗体，该第二Wnt同种型可为Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt4、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a或Wnt10b同种型。揭示了结合至LRP6的E1至E2区且结合至LRP6的E3至E4区的双特异性分子。杵臼结构(knob-in-hole)技术用于产生双特异性抗体。
LRP6抗体的结合中所涉及的结合表位(LRP6胞外域/β-螺旋桨区中的确定的氨基酸残基)的鉴别并未提供于WO2009/056634及WO2011/138391或WO2013/067355中，且仅部分提供于WO2011/119661中。具体而言，LRP6结合抗体可经由根据与不同LRP6的区域结合的替代性机制抑制Wnt信号传递，包括直接与Wnt竞争或抑制三元受体复合物(Wnt-LRP6-Frizzled)的形成，然而其余可能藉由受体簇集强化信号传递(Ahn等人“Structural basisofWnt signaling inhibition by Dickkopf binding to LRP5/6”.Dev Cell.2011；21(5)：862-73)。
然而，到目前为止，本领域中描述的结合分子中无一者经卫生管理机构授权而供用作治疗任何疾病的药剂。具体而言，此类用途需要极具特异性的结合特性，适当的特异性，以使得此类分子结合或不结合、活化或抑制其他靶向物(例如，引起不合需要的活化或其他信号传递路径的抑制，或缺乏活化或对靶向同种型的抑制)，在双特异性或多特异性药剂的情况下，所述特性为：两个或大于两个结合特异性之间的适当平衡、适合的药物动力学及动力学特性、可接受的毒理学型态及理所当然的体内功效。
鉴于上文，需要允许对若干类型的癌症疾病及肿瘤进行高效治疗的新颖治疗剂。因此，本发明的目标在于提供可用于若干癌症疾病，包括NSCLC及TNBC的治疗中的此类药理学活性剂。
具体而言，本发明之目标在于提供此类药理学活性剂、组合物和/或治疗方法，其提供相较于当前所用和/或本领域中已知的药剂、组合物和/或方法的特定优点。这些优点包括尤其相较于本领域中已经已知的候选药物的体内功效、改善的治疗特性及药理学特性、较少副作用及其他有利特性，诸如改善之易于制备性或降低的制品成本。
发明内容
根据本发明的第一方面，本发明提供特异性结合至LRP5或LRP6的多肽，其中本发明之此类多肽包含第一免疫球蛋白单一可变域(a)，其选自藉由具有以下CDR序列而限定的免疫球蛋白单一可变域(i)至(iii)的组：
(i)：
CDR1：TYTVG(＝SEQ ID NO：1)
CDR2：AIRRRGSSTYYADSVKG(＝SEQ ID NO：2)
CDR3：DTRTVALLQYRYDY(＝SEQ ID NO：3)
(ii)：
CDR1：SYAMG(＝SEQ ID NO：4)
CDR2：AIRRSGRRTYYADSVKG(＝SEQ ID NO：5)
CDR3：ARRVRSSTRYNTGTWWWEY(＝SEQ ID NO：6)
(iii)：
CDR1：RYTMG(＝SEQ ID NO：7)
CDR2：AIVRSGGSTYYADSVKG(＝SEQ ID NO：8)
CDR3：DRRGRGENYILLYSSGRYEY(＝SEQ ID NO：9).
及第二免疫球蛋白单一可变域(b)，其选自藉由具有以下CDR序列而限定的免疫球蛋白单一可变域(iv)及(v)的组：
(iv)：
CDR1：SYAMG(＝SEQ ID NO：10)
CDR2：AISWSGGSTYYADSVKG(＝SEQ ID NO：11)
CDR3：SPIPYGSLLRRRNNYDY(＝SEQ ID NO：12)
(v)：
CDR1：SYAMG(＝SEQ ID NO：13)
CDR2：AISWRSGSTYYADSVKG(＝SEQ ID NO：14)
CDR3：DPRGYGVAYVSAYYEY(＝SEQ ID NO：15)。
关于所述免疫球蛋白单一可变域之术语”第一”及”第二”仅意欲指示这些域为两种不同域(因为其将至少包括不同CDR序列)。因此，这些术语不应理解为指代该多肽链中的域的精确次序或序列。
本发明的多肽任选地包含第三免疫球蛋白单一可变域，诸如尤其白蛋白结合免疫球蛋白单一可变域，诸如A1b11域，其包含以下CDR：
CDR1(A1b11)：SFGMS(＝SEQ ID NO：16)
CDR2(AIb11)：SISGSGSDTLYADSVKG(＝SEQ ID NO：17)
CDR3(A1b11)：GGSLSR(＝SEQ ID NO：18)。
根据一更具体实施方案，本发明的多肽包括为VHH域且优选人源化VHH域的免疫球蛋白单一可变域。
根据一甚至更具体实施方案，本发明的多肽包括第一免疫球蛋白单一可变域(a)，其选自具有以下序列的免疫球蛋白单一可变域(i)至(iii)的组：
(i)：
AVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSTYTVGWFRQAPGKEREFVAAIRRRGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAADTRTVALLQYRYDYWGQGTLVTVSS(＝SEQ ID NO：19)
(ii)：
AVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAAIRRSGRRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAARRVRSSTRYNTGTWWWEYWGQGTLVTVSS(＝SEQ ID NO：20)
(iii)：
AVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLTFSRYTMGWFRQAPGKEREFVAAIVRSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAADRRGRGENYILLYSSGRYEYWGQGTLVTVSS(＝SEQ ID NO：21)，
及第二免疫球蛋白单一可变域(b)，其选自由具有以下序列的免疫球蛋白单一可变域(iv)及(v)组成的组：
(iv)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAAISWSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAASPIPYGSLLRRRNNYDYWGQGTLVTVSS(＝SEQ ID NO：22)，及
(v)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAAISWRSGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAADPRGYGVAYVSAYYEYWGQGTLVTVSS(＝SEQ ID NO：23)。
根据一具体优选实施方案，本发明的多肽另外包括半衰期延长部分，其中该半衰期延长部分共价连接至该多肽且任选地选自由以下组成的组：白蛋白结合部分，诸如白蛋白结合肽或白蛋白结合免疫球蛋白域、优选白蛋白结合免疫球蛋白单一可变域、更佳A1b11域；转铁蛋白结合部分，诸如抗转铁蛋白免疫球蛋白域、聚乙二醇分子、人类血清白蛋白及人类血清白蛋白的片段。
具体优选地，除了如上文所概述的两个免疫球蛋白单一可变域(a)及(b)以外，多肽亦包括具有以下序列的A1b11域：
EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS(＝SEQ ID NO：24)
根据另一实施方案，具体而言，本发明包括包含或由以下三种多肽链中的任一者组成的多肽：
F13500575，其具有序列SEQ ID NO:25，
F13500571，其具有序列SEQ ID NO:26，及
F13500720，其具有序列SEQ ID NO:27。
根据其他方面，本发明涉及核酸分子、表达载体、宿主细胞及制造本发明的多肽中所用的制造方法。呈分离形式的编码本发明的多肽的核酸分子可用于构建相应表达载体，随后可转染至用于本发明的多肽的生物医药制造的宿主细胞中。该制造方法通常包含以下步骤：在允许表达多肽的条件下培养宿主细胞，根据本领域中已知的方法回收多肽且对其进行纯化。
涉及本发明的多肽的其他方面、实施方案、用途及方法将由以下本发明的详述及随附权利要求而变得清楚。
本发明提供允许对若干癌症类型，诸如TNBC、CRC及NSCLC进行较高效治疗而具有较少副作用的新颖分子。本发明的多肽在癌症患者的治疗中提供出人意料的治疗效应(亦即功效)，其可诱导引起病理性完全反应(pCR)的肿瘤消退。继而预期其引起无进展存活期及总存活期的显著改善，尤其在高度未满足的医学需要适应症中，诸如在乳腺癌中。因此，本发明的多肽在若干癌症类型，尤其显示失调Wnt信号传递路径及β-联蛋白积聚的癌症类型的治疗中提供新颖的治疗选择。
此外，本发明的多肽易于制造，具有高稳定性及低抗原性，且提供除了注射及输注以外的关于施用途径的各种选择。
附图说明
图1展示拮抗Wnt1及Wnt3a信号传递的双互补位多肽的示意图。其由三个域组成，其中两个域结合至LRP5及LRP6的相异表位(Wnt1及Wnt3a阻断物)且一个域用于半衰期延长(人类血清白蛋白结合物)。
图2展示针对衍生自美洲驼(llama)免疫接种的LRP6结合VHH的代表性数目进行的结合FACS及ELISA分析之间缺乏相关性。如藉由FACS结合分析所检测，VHH的编号”1”小图通过对在质膜上表达LRP6的细胞的高亲和力来表征(在y轴上报导MCF值)。如藉由ELISA结合分析所检测，VHH的编号”2”小图通过对重组人类LRP6胞外域(rhLRP6-Fc)的高亲和力来表征(在x轴上报导OD405值)。
图3展示当与由非靶向结合物组成的阴性对照(结合至未表达于HEK293细胞中的细菌性蛋白的VHH构建体)比较时，三个半衰期延长的双互补位LRP5/LRP6交叉反应性VHH构建体与人类LRP5(图3A)及人类LRP6(图3B)过表达HEK293细胞株的结合。
图4展示如藉由基于FACS的DKK1竞争分析所检测，结合至人类LRP5(图4A)及人类LRP6(图4B)过表达HEK293细胞株的三个半衰期延长的双互补位LRP5/LRP6交叉反应性VHH构建体的完整DKK1竞争。
图5展示在组合Wnt1及Wnt3a报导分析中，三个半衰期延长的双互补位LRP5/LRP6交叉反应性VHH构建体的Wnt1及Wnt3a路径的完全抑制(图5A)及与其他LRP6结合分子的对比(图5B：Knob HC YW210.09及MOR08168IgG1LALA 6475scfv；图5C：802T)。
图6展示如藉由相对轴蛋白2mRNA表达的抑制所检测，Wnt信号传递在癌细胞中的抑制(图6A)，及相较于F013500571及未经处理(对照)的细胞(图6B的左小图/右小图)，用三个半衰期延长的双互补位LRP5/LRP6交叉反应性VHH构建体(最终浓度为1mM)处理且藉由用802T处理之后，如藉由下降的活细胞百分比(％)所检测的细胞增殖(图6B)；针对用一个半衰期延长的双互补位LRP5/LRP6构建体(图6C)及802T(图6D)的处理显示剂量反应曲线。
图7展示在经Wnt驱动的肿瘤模型(MMTV-Wnt1异种移植模型)中，半衰期延长的双互补位LRP5/LRP6交叉反应性VHH构建体(图7A中为F013500571且图7B中为F013500720)的体内功效及Knob HC YW210.09(图7C)的体内功效。
图8展示如藉由轴蛋白2mRNA表达相对于对照组减少所检测，用半衰期延长的双互补位LRP5/LRP6交叉反应性VHH构建体F013500571(图8A)及F013500720(图8B)治疗的肿瘤中的Wnt路径抑制。
图9展示如藉由用半衰期延长的双互补位LRP5/LRP6交叉反应性VHH构建体处理后的干扰素-γ释放(图9B)所测定，经Wnt3a驱动的信号传递抑制对藉由树突状细胞释放的促炎性细胞激素TNFα(图9A)的作用及对T细胞活化的作用。各符号表示单一树突状细胞(DC)供体。所展示的数据标准化为未经处理的对照的TNFα水平(图9A)，且各符号表示针对DC及T细胞的单一供体对(图9B)。
发明详述
定义
本发明的以上及其他方面及实施方案将由本文中的进一步描述而变得清楚，其中：
a)除非另外指明或定义，否则所用全部术语均具有其在本领域中的常用含义，其对本领域技术人员将为清楚的。例如参照标准手册，诸如Sambrook等人,“MolecularCloning:A Laboratory Manual”(第2版),第1至3卷,Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989)；Lewin,“Genes IV”,Oxford University Press,New York,(1990)及Roitt等人,“Immunology”(第2版),Gower Medical Publishing,London,New York(1989)，以及本文中所列举之一般现有技术。此外，如本领域技术人员将清楚，除非另外指明，否则所有未特定详细描述的方法、步骤、技术及操作可以本身已知的方式进行且已以本身已知的方式进行。此外，针对实施例参照标准手册、上文所提及的一般现有技术及其中所引用的其他参考文献。
b)除非另外指明，否则术语”免疫球蛋白”及”免疫球蛋白序列”(无论在本文中是否用于指代重链抗体或常规4-链抗体)用作一般术语以包括全尺寸抗体、其个别链以及其所有部分、域或片段(包括但不限于抗原结合域或片段，诸如相应VHH域或VH/VL域)。此外，除非情形需要较具局限性的解释，否则如本文所用(例如在类似”免疫球蛋白序列”、”抗体序列”、”(单一)可变域序列”、”VHH序列”或”蛋白质序列”的术语中)，术语”序列”应通常理解为包括相关氨基酸序列以及编码其的核酸序列或核苷酸序列；
c)如本文所用，术语(多肽或蛋白质的)”域”系指具有独立于蛋白质的其余部分保留其三级结构的能力的折叠蛋白质结构。一般而言，域负责蛋白质的离散功能特性，且在许多情况下，在蛋白质和/或域的剩余部分无功能缺失的情况下，可将域添加、移除或转移至其他蛋白质。
d)如本文所用，术语”免疫球蛋白域”系指抗体链(诸如常规4-链抗体的链或重链抗体的链)的球状区域或系指基本上由此类球状区域组成的多肽。免疫球蛋白域的特征在于其保留抗体分子的免疫球蛋白折叠特征，该特征由配置于两个β片层中的约7个反向平行的β股链的2层夹层组成，任选地藉由保守的二硫键稳定化。
e)如本文所用，术语”免疫球蛋白可变域”意指基本上由四个”框架区”组成的免疫球蛋白域，所述”框架区”在本领域中且在下文中分别称为”框架区1”或”FR1”；”框架区2”或”FR2”；”框架区3”或”FR3”；及”框架区4”或”FR4”；其框架区间杂有三个”互补决定区”或”CDR”，所述”互补决定区”在本领域中且在下文中分别称为”互补决定区1”或”CDR1”；”互补决定区2”或”CDR2”；及”互补决定区3”或”CDR3”。因此，免疫球蛋白可变域的一般结构或序列可指示如下：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。免疫球蛋白可变域藉由携带抗原结合位点而赋予抗原的抗体特异性。
f)如本文所用，术语”免疫球蛋白单一可变域”意指能够特异性结合至抗原的表位而不与另外可变免疫球蛋白域配对的免疫球蛋白可变域。在本发明的含义中，免疫球蛋白单一可变域之一个实施例为”域抗体”，诸如免疫球蛋白单一可变域VH及VL(VH域及VL域)。免疫球蛋白单一可变域的另一重要实施例为如下文所定义的来自骆驼(camelids)的”VHH域”(或简言之”VHH”)。
鉴于以上定义，常规4-链抗体(诸如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE分子；本领域中已知)的抗原结合域或Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段(诸如二硫键连接Fv)或scFv片段的抗原结合域或衍生自所述常规4-链抗体的双功能抗体(均为本领域中已知)将通常不视为免疫球蛋白单一可变域，这是因为，在这些情况下，结合至抗原的相应表位将通常不会藉由一个(单一)免疫球蛋白域，而是藉由一对(缔合)免疫球蛋白域，诸如轻链可变域及重链可变域，亦即藉由免疫球蛋白域的VH-VL对进行，所述免疫球蛋白域的VH-VL对共同地结合至相应抗原的表位。
f1)亦称为VHH、VHH域、VHH抗体片段及VHH抗体的”VHH域”最初描述为”重链抗体”的抗原结合免疫球蛋白(可变)域(亦即”不含轻链的抗体”的抗原结合免疫球蛋白(可变)域；Hamers-Casterman C,Atarhouch T,Muyldermans S,Robinson G,Hamers C,Songa EB,Bendahman N,Hamers R.:“Naturally occurring antibodies devoid of lightchains”；Nature 363,446-448(1993))。已选定术语”VHH域”，以将这些可变域与常规4-链抗体中所存在的重链可变域(在本文中称为”VH域”或”VH域”)及常规4-链抗体中所存在的轻链可变域(在本文中称为”VL域”或”VL域”)区分开。VHH域可特异性结合至表位而不经另外抗原结合域(与常规4-链抗体中的VH或VL域相对，在此情况下表位藉由VL域与VH域共同识别)。VHH域为由单一免疫球蛋白域形成的小型、稳健及高效抗原识别单元。
在本发明的上下文中，术语VHH域、VHH、VHH域、VHH抗体片段、VHH抗体以及及”域”(“Nanobody”为公司Ablynx N.V.；Ghent；Belgium的商标)可互换使用且为免疫球蛋白单一可变域的代表(具有以下结构：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4且特异性结合至表位，而无需存在第二免疫球蛋白可变域)，且亦可如例如WO2009/109635，图1中所定义，藉由所谓”标志残基”区别于VH域。
当应用于来自骆驼的VHH域时，如例如Riechmann及Muyldermans,J.Immunol.Methods 231,25-38(1999)的图2中所示，根据由Kabat等人(“Sequence ofproteins of immunological interest”,US Public Health Services,NIH Bethesda,MD，第91版)所给定的针对VH域的一般编号来对VHH域的氨基酸残基进行编号。根据此编号，
-FR1包含位1至30处的氨基酸残基，
-CDR1包含位31至35处的氨基酸残基，
-FR2包含位36至49处的氨基酸，
-CDR2包含位50至65处的氨基酸残基，
-FR3包含位66至94处的氨基酸残基，
-CDR3包含位95至102处的氨基酸残基，且
-FR4包含位103至113处的氨基酸残基。
然而，应注意如本领域中对于VH域及VHH域所熟知，CDR中的每一者中的氨基酸残基的总数可变化且可不对应于由Kabat编号指示的氨基酸残基的总数(亦即，在实际序列中可不占据一或多个根据Kabat编号的位置，或实际序列可含有比Kabat编号所允许的数目多的氨基酸残基)。此意指一般而言，根据Kabat的编号可或可不对应于实际序列中的氨基酸残基的实际编号。
VH域的氨基酸残基的替代性编号方法为本领域中已知，所述方法亦可以类似方式应用于VHH域。然而，在本说明书、申请专利范围及图式中，除非另外指出，否则将遵循根据Kabat且应用于如上所述的VHH域的编号。
VHH域中的氨基酸残基之总数将通常在110至120范围内，通常在112与115之间。然而应注意，较小及较长序列亦可适合于本文所述的目的。
VHH域的其他结构性特征及功能性特性及含有其的多肽可概述如下：
VHH域(已藉由性质”设计”为功能性地结合至抗原，而不存在且无与轻链可变域的相互作用)可充当单一、相对较小、功能性抗原结合结构单元、域或多肽。此将VHH域与常规4-链抗体的VH及VL域区分开，对于实际应用而言，所述VH及VL域本身通常不适合于作为单一抗原结合蛋白或免疫球蛋白单一可变域，但需要以某种形式或另一种形式组合以提供功能性抗原结合单元(如例如常规抗体片段，诸如Fab片段中；scFv中，其由共价连接至VL域的VH域组成)。
由于这些独特性质，VHH域的使用(单独或作为大型多肽的部分)提供多种优于常规VH及VL域、scFv或常规抗体片段(诸如Fab片段或F(ab')2片段)的使用的明显优点：
-仅单一域需要以高亲和力及高度选择性结合抗原，以使得无需存在两个分开的域，亦无需确保这些两种域以合宜的空间构形及构象存在(亦即经由使用特别设计的接头，如同scFv)；
-VHH域可自单一基因表达且不需要翻译后折叠或修饰；
-VHH域可易于工程改造为多价及多特异性格式(如本文所进一步论述)；
-VHH域为高度可溶的且不具有聚集倾向(如同Ward等人,Nature 341:544-546(1989)所述的小鼠衍生抗原结合域)；
-VHH域对于加热、pH、蛋白酶及其他变性剂或条件为高度稳定的，且因此，可在不使用冷藏设备的情况下进行制备、储存或输送，实现成本、时间及环境节约；
-VHH域易于制备且相对便宜，即使以制造所需的规模量级。举例而言，VHH域及含有其的多肽可使用微生物发酵(例如如下文进一步描述)制造且不需要使用哺乳动物表达系统，如同例如常规抗体片段；
-相较于常规4-链抗体及其抗原结合片段，VHH域相对较小(大约15kDa，或比常规IgG小10倍)，且因此，与所述常规4-链抗体及其抗原结合片段相比
--显示(较)高组织渗透率，且
--可以较高剂量施用；
-VHH域可显示所谓的凹穴结合(cavity-binding)特性(尤其归因于其延长的CDR3环，相较于常规VH域)且可因此亦接近常规4-链抗体及其抗原结合片段不可接近的靶向物及表位。
早期，例如，在WO2006/040153及WO2006/122786中，已描述获得结合至特异性抗原或表位的VHH域的方法。亦如其中详细所述，可藉由由来自人类的常规4-链抗体的VH域中的对应位置处所出现的氨基酸残基中的一或多者取代初始VHH序列的氨基酸序列中的一或多个氨基酸残基使衍生自骆驼的VHH域”人源化”。人源化VHH域可含有一或多个完全人类框架区序列，且在甚至更特定的实施方案中，可含有衍生自DP-29、DP-47、DP-51或其部分的人类框架区序列，其任选地与JH序列，诸如JH5组合。
f2)”域抗体(Domain antibodies)”，亦称为”Dab”、”Domain Antibodies”及”dAb”(术语”Domain Antibodies”及”dAb”由GlaxoSmithKline集团公司用作商标)，描述于例如Ward,E.S.等人:“Binding activities of a repertoire of single immunoglobulinvariable domains secreted from Escherichia coli”；Nature 341:544-546(1989)；Holt,L.J.等人:“Domain antibodies:proteins for therapy”；TRENDS于Biotechnology21(11)中:484-490(2003)；及WO2003/002609中。
域抗体基本上与非骆驼哺乳动物的VH或VL域，尤其人类4-链抗体相对应。为了以单一抗原结合域形式结合表位，亦即不与VL或VH域分别配对，需要例如藉由使用人类单一VH或VL域序列库对此类抗原结合特性进行特定选择。类似VHH，域抗体的分子量为大约13kDa至大约16kDa，且若衍生自完全人类序列，则针对例如人类中的治疗用途不需要人源化。如在VHH域的情况下，其亦很好地表达于原核表达系统中，提供总制造成本的明显降低。
可藉由在一或多个CDR的氨基酸序列中引入一或多个变化对域抗体以及VHH域进行亲和力成熟，所述变化引起所得免疫球蛋白单一可变域对其相应抗原的亲和力相比于相应母分子得到改善。经亲和力成熟的本发明的免疫球蛋白单一可变域分子可藉由本领域中已知的方法，例如如Marks等人,1992,Biotechnology 10:779-783或Barbas等人,1994,Proc.Nat.Acad.Sci,USA 91:3809-3813.；Shier等人,1995,Gene 169:147-155；Yelton等人,1995,Immunol.155:1994-2004；Jackson等人,1995,J.Immunol.154(7):3310-9；及Hawkins等人,1992,J.Mol.Biol.226(3):889 896；KS Johnson及RE Hawkins,“Affinitymaturation of antibodies using phage display”,Oxford University Press 1996所述制备。
f3)此外，本领域技术人员也会清楚，可将上述CDR中的一或多者”移植”于其他”骨架”上，其包括(但不限于)人类骨架或非免疫球蛋白骨架。针对所述CDR移植的适合的骨架及技术为本领域中已知的。
g)可互换使用的术语”表位”及”抗原决定簇”系指藉由抗原结合分子，诸如常规抗体或本发明的多肽，且更具体而言，藉由所述分子的抗原结合位点识别的大分子，诸如多肽的一部分。表位限定免疫球蛋白的最小结合位点，且因此表示免疫球蛋白的特异性的靶向物。
识别表位的抗原结合分子(诸如常规抗体或本发明的多肽)的一部分称为互补位。
h)如本文所用，术语”双互补位”(抗原)结合分子或”双互补位”多肽应意指包含如本文所定义的第一免疫球蛋白单一可变域及第二免疫球蛋白单一可变域的多肽，其中这些两个可变域能够结合至一种抗原的两种不同表位，所述表位通常不会同时经一种单特异性免疫球蛋白，诸如常规抗体或一种免疫球蛋白单一可变域结合。根据本发明的双互补位多肽由具有不同表位特异性的可变域组成，且不含结合至同一表位的互补可变域对。因此，其不会彼此竞争结合至LRP5或LRP6。
i)可”结合”特定表位、抗原或蛋白质(或其至少一个部分、片段或表位)；”结合至”特定表位、抗原或蛋白质(或其至少一个部分、片段或表位)；”特异性结合”特定表位、抗原或蛋白质(或其至少一个部分、片段或表位)；或”特异性结合至”特定表位、抗原或蛋白质(或其至少一个部分、片段或表位)；对特定表位、抗原或蛋白质(或其至少一个部分、片段或表位)“具有亲和力”和/或对特定表位、抗原或蛋白质(或其至少一个部分、片段或表位)“具有特异性”的多肽(诸如免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单一可变域、本发明的多肽或通常抗原结合分子或其片段)称为”对抗”或”针对”该表位、抗原或蛋白质或为关于该表位、抗原或蛋白质的”结合”分子。
k)一般而言，术语”特异性”系指特定抗原结合分子或抗原结合蛋白(诸如免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单一可变域或本发明的多肽)可结合的不同类型的抗原或表位的数目。抗原结合蛋白的特异性可基于其亲和力和/或亲合力进行测定。由抗原与抗原结合蛋白的解离平衡常数(KD)表示的亲和力为表位与抗原结合蛋白上的抗原结合位点之间的结合强度的量度：KD值愈小，表位与抗原结合分子之间的结合强度愈强(或者，亲和力亦可表示为亲和力常数(KA)，其为1/KD)。如本领域技术人员将清楚(例如基于本文中进一步的公开内容)，亲和力可以本身已知的方式进行测定，其视相关特异性抗原而定。亲合力为抗原结合分子(诸如免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单一可变域或本发明的多肽)与相关抗原之间的结合强度的量度。亲合力与表位与抗原结合分子上的其抗原结合位点之间的亲和力及抗原结合分子上所存在的相关结合位点的数目两者有关。
通常，抗原结合蛋白(诸如本发明的多肽)将以10E-5至10E-14莫耳/公升(M)或小于10E-14莫耳/公升(M)，且优选10E-7至10E-14摩尔/升(M)或小于10E-14摩尔/升(M)，更优选10E-8至10E-14摩尔/升，且甚至更优选10E-11至10E-13的解离常数(KD)(如例如Kinexa分析中所测定；本领域中已知)，和/或以至少10E7ME-1、优选至少10E8ME-1、更优选至少10E9ME-1，诸如至少10E11ME-1的结合常数(KA)结合。大于10E-4M的任何KD值通常视为指示非特异性结合。优选地，本发明的多肽将以小于500nM、优选小于200nM、更优选小于10nM，诸如小于500pM的KD结合至所需抗原。可以本身已知的任何适合方式，包括(例如)本文所述的分析、斯卡查德分析(Scatchard analysis)和/或竞争性结合分析，诸如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)及夹心竞争分析，及本领域中本身已知的其不同变体来测定抗原结合蛋白与抗原或表位的特异性结合。
l)与能够结合至LRP5以及LRP6的结合分子有关的术语”交叉反应性”(“LRP5/LRP6交叉反应性”)意指所述结合分子可特异性结合至LRP5分子中所包含的表位，且亦可可替代地特异性结合至LRP6分子中所包含的表位。通常，可在所述结合分子所结合的不同蛋白质的表位具有相似结构和/或序列，例如表示保守表位，例如由属于同一蛋白质家族的蛋白质(例如LRP5及LRP6，其属于LRP蛋白质家族)共用的情况下产生所述交叉反应性。
m)如本领域中通常已知且同意，将根据标准三字母或单字母氨基酸编码指示氨基酸残基。当比较两个氨基酸序列时，术语”氨基酸差异”系指相较于第二序列，在参考序列的某一位置处插入、缺失或取代指定数目个氨基酸残基。在取代的情况下，这样的取代将优选为保守性氨基酸取代，其意指氨基酸残基经具有相似化学结构的另一氨基酸残基取代，且其几乎不会或基本上不会对多肽的功能、活性或其他生物特性造成影响。所述保守性氨基酸取代为本领域中熟知，例如根据WO 98/49185，其中保守氨基酸取代优选为其中以下组(i)至组(v)中的一个氨基酸经同一组中的另一氨基酸残基取代的取代：(i)小型脂族、非极性或轻微极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro及Gly；(ii)极性、带负电残基及其(不带电)酰胺：Asp、Asn、Glu及Gln；(iii)极性、带正电残基：His、Arg及Lys；(iv)大型脂族、非极性残基：Met、Leu、Ile、Val及Cys；及(v)芳族残基：Phe、Tyr及Trp。尤其优选的保守性氨基酸取代如下：
Ala取代为Gly或Ser；
Arg取代为Lys；
Asn取代为Gln或His；
Asp取代为Glu；
Cys取代为Ser；
Gln取代为Asn；
Glu取代为Asp；
Gly取代为Ala或Pro；
His取代为Asn或Gln；
Ile取代为Leu或Val；
Leu取代为Ile或Val；
Lys取代为Arg、Gln或Glu；
Met取代为Leu、Tyr或Ile；
Phe取代为Met、Leu或Tyr；
Ser取代为Thr；
Thr取代为Ser；
Trp取代为Tyr；
Tyr取代为Trp或Phe；
Val取代为Ile或Leu。
n)举例而言，当相较于自其获得核酸或多肽分子的该核酸或多肽分子的天然生物来源和/或反应介质或培养介质时，当该核酸或多肽分子已与至少一种其他组分，诸如另一核酸、另一蛋白质/多肽、另一生物组分或大分子或至少一种污染物、杂质或微量组分分离，其中该核酸或多肽分子通常与该至少一种其他组分结合于该来源或介质中时，该核酸或多肽分子视为”(呈)基本上分离(形式)”。具体而言，当以至少2倍，特别至少10倍、较特别至少100倍且高达1000倍或大于1000倍纯化核酸或多肽分子时，其视为”基本上分离”的。如使用适合技术，诸如适合的层析技术，诸如聚丙烯酰胺-凝胶电泳所测定，”呈基本上分离形式”的核酸或多肽分子优选为基本上均质的；
o)例如两个免疫球蛋白单一可变域序列之间的”序列同一性”指示这些两个序列之间一致的氨基酸百分比。可如WO2008/020079的第49页及第50页上的段落f)所述来对其进行计算或测定。”序列相似性”指示一致的或表示保守性氨基酸取代的氨基酸百分比。
靶特异性
本发明的多肽具有对LRP5以及LRP6的特异性，这是因为其包含特异性结合于这些分子(LRP5/LRP6交叉反应性结合分子)中所包括的表位的免疫球蛋白单一可变域。
本发明的分子应结合至LRP5及LRP6的人类形式，且亦优选结合至与药物研发相关的其他物种中的对应物，亦即食蟹猴及小鼠LRP5及LRP6。
本发明的多肽
在其最广泛意义中，本发明提供用于治疗癌症疾病的新颖药理学活性剂。根据本发明的药剂属于结合分子的新颖类别，亦即LRP5/LRP6交叉反应性双互补位多肽，其包含两个或大于两个在不同表位处结合至LRP5和/或LRP6的免疫球蛋白单一可变域。术语”交叉反应性”及”双互补位”如上文所解释，使得LRP5/LRP6交叉反应性双互补位分子可定义为能够在LRP5蛋白中所包含的两个不同表位处结合至LRP5，且亦能够在LRP6蛋白中所包含的两个相应表位处结合至LRP6的分子。
更具体而言，本发明的多肽包括：
-第一免疫球蛋白单一可变域，其能够经由表位/以引起对Wnt1信号传递路径的抑制的方式特异性结合至LRP5以及LRP6(LRP5/LRP6交叉反应性)，以使得经Wnt1驱动的靶基因转录受到抑制，及
-第二免疫球蛋白单一可变域，其能够经由表位/以引起对Wnt3a信号传递路径的抑制的方式特异性结合至LRP5以及LRP6(LRP5/LRP6交叉反应性)，以使得经Wnt3a驱动的靶基因转录受到抑制。
归因于该多肽中存在两个免疫球蛋白单一可变域，其中所述两个域结合至不同表位(Wnt1/Wnt3a信号传递相关性)，因此这些分子为双互补位结合分子。此双互补位结合模式示意性地展示于图1中。
在此情形中，应注意，如图1中所示，假定本发明的多肽可经由一个单一LRP5或LRP6分子的LRP5/LRP6结合域结合至该一个单一LRP5或LRP6分子(分子内结合模式)。然而，亦可出现其他结合模式。
最后，假定本发明的多肽能够与LRP5及LRP6的天然配体，且干扰Wnt1及Wnt3a信号传递的DKK1竞争结合至LRP5及LRP6，由此抑制Wnt1以及Wnt3a信号传递路径。然而，此理论亦不应理解为限制本发明的范围。
更具体而言，根据本发明的多肽特异性结合至LRP5或LRP6，其中所述多肽包含第一免疫球蛋白单一可变域(a)，其选自藉由具有以下CDR序列而限定的免疫球蛋白单一可变域(i)至(iii)的组：
(i)：
CDR1：TYTVG(＝SEQ ID NO：1)
CDR2：AIRRRGSSTYYADSVKG(＝SEQ ID NO：2)
CDR3：DTRTVALLQYRYDY(＝SEQ ID NO：3)
[＝Wnt1-333E06mod域的CDR]
(ii)：
CDR1：SYAMG(＝SEQ ID NO：4)
CDR2：AIRRSGRRTYYADSVKG(＝SEQ ID NO：5)
CDR3：ARRVRSSTRYNTGTWWWEY(＝SEQ ID NO：6)
[＝Wnt1-333G06域的CDR]
(iii)：
CDR1：RYTMG(＝SEQ ID NO：7)
CDR2：AIVRSGGSTYYADSVKG(＝SEQ ID NO：8)
CDR3：DRRGRGENYILLYSSGRYEY(＝SEQ ID NO：9)
[＝Wnt1-332D03mod域的CDR]，
及第二免疫球蛋白单一可变域(b)，其选自藉由具有以下CDR序列而限定的免疫球蛋白单一可变域(iv)及(v)的组：
(iv)：
CDR1：SYAMG(＝SEQ ID NO：10)
CDR2：AISWSGGSTYYADSVKG(＝SEQ ID NO：11)
CDR3：SPIPYGSLLRRRNNYDY(＝SEQ ID NO：12)
[＝Wnt3a-093A01域的CDR]
(v)：
CDR1：SYAMG(＝SEQ ID NO：13)
CDR2：AISWRSGSTYYADSVKG(＝SEQ ID NO：14)
CDR3：DPRGYGVAYVSAYYEY(＝SEQ ID NO：15)
[＝Wnt3a-367B10域的CDR]。
关于所述免疫球蛋白单一可变域的术语”第一”及”第二”的使用仅意欲指示这些域为不同的域，因为其将包括不同CDR序列且将结合至不同表位。然而，这些术语不应理解为指示该多肽链中所述域的精确次序或序列。换言之，以上免疫球蛋白单一可变域(a)及(b)在本发明的该多肽中可按次序(a)-(b)或按次序(b)-(a)排列。
术语”特异性结合至LRP5或LRP6”意指免疫球蛋白单一可变域(a)及(b)与LRP5及LRP6交叉反应。当然，所述分子的结合特性由其(CDR)序列决定，因此上文及申请专利范围中所述的特征”特异性结合至LRP5或LRP6”仅意欲说明本发明的效用，且不限制本发明的范围。
免疫球蛋白单一可变域通常基本上由四个框架区(分别为FR1至FR4)及三个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)组成。该第一免疫球蛋白单一可变域及该第二免疫球蛋白单一可变域需要直接或藉由接头肽共价连接以位于一种多肽或多肽链中。
因此，本发明分子的一般结构亦可描绘如下：
FR(a)1-CDR(a)1-FR(a)2-CDR(a)2-FR(a)3-CDR(a)3-FR(a)4-[接头肽]-FR(b)1-CDR(b)1-FR(b)2-CDR(b)2-FR(b)3-CDR(b)3-FR(b)4
其中
FR(a)表示第一免疫球蛋白单一可变域的框架区，
FR(b)表示第二免疫球蛋白单一可变域的框架区，
CDR(a)表示第一免疫球蛋白单一可变域的CDR，
CDR(b)表示第二免疫球蛋白单一可变域的CDR，
[接头肽]表示可任选地存在的接头肽，
其中CDR具有如上文所述的序列。
此外，应理解，(a)及(b)可互换，亦即具有以下一般结构的分子
FR(b)1-CDR(b)1-FR(b)2-CDR(b)2-FR(b)3-CDR(b)3-FR(b)4-[接头肽]-FR(a)1-CDR(a)1-FR(a)2-CDR(a)2-FR(a)3-CDR(a)3-FR(a)4
亦应由本发明涵盖在内。
接头肽任选地包含或由第三域组成，诸如白蛋白结合免疫球蛋白单一可变域，诸如Alb11域，其包含以下CDR：
CDR(Alb11)1：SFGMS(＝SEQ ID NO：16)
CDR(Alb11)2：SISGSGSDTLYADSVKG(＝SEQ ID NO：17)
CDR(Alb11)3：GGSLSR(＝SEQ ID NO：18)
这产生一组具有以下一般结构的本发明的多肽：
FR(a)1-CDR(a)1-FR(a)2-CDR(a)2-FR(a)3-CDR(a)3-FR(a)4-[接头肽]-FR(Alb11)1-CDR(Alb11)1-FR(Alb11)2-CDR(Alb11)2-FR(Alb11)3-CDR(Alb11)3-FR(Alb11)4-[接头肽]-FR(b)1-CDR(b)1-FR(b)2-CDR(b)2-FR(b)3-CDR(b)3-FR(b)4。
此外，三个免疫球蛋白单一可变域(a)、(b)及Alb11的次序并非不变，但其中以上域按以下次序排列的多肽：
(b)-Alb11-(a)
亦应涵盖在内。
此外，在多肽的N末端或C末端处具有Alb11域(例如Alb11-(a)-(b)、Alb11-(b)-(a)、(a)-(b)-Alb11或(b)-(a)-Alb11)的多肽亦应由本发明涵盖在内。
在三个优选实施方案中，本发明的多肽包括如下定义的免疫球蛋白单一可变域：
第一优选实施方案：多肽，其包含具有以下CDR序列的第一免疫球蛋白单一可变域：
CDR1：TYTVG(＝SEQ ID NO：1)
CDR2：AIRRRGSSTYYADSVKG(＝SEQ ID NO：2)
CDR3：DTRTVALLQYRYDY(＝SEQ ID NO：3)
及具有以下CDR序列的第二免疫球蛋白单一可变域：
CDR1：SYAMG(＝SEQ ID NO：10)
CDR2：AISWSGGSTYYADSVKG(＝SEQ ID NO：11)
CDR3：SPIPYGSLLRRRNNYDY(＝SEQ ID NO：12)。
第二优选实施方案：多肽，其包含具有以下CDR序列的第一免疫球蛋白单一可变域：
CDR1：SYAMG(＝SEQ ID NO：4)
CDR2：AIRRSGRRTYYADSVKG(＝SEQ ID NO：5)
CDR3：ARRVRSSTRYNTGTWWWEY(＝SEQ ID NO：6)
及具有以下CDR序列的第二免疫球蛋白单一可变域：
CDR1：SYAMG(＝SEQ ID NO：13)
CDR2：AISWRSGSTYYADSVKG(＝SEQ ID NO：14)
CDR3：DPRGYGVAYVSAYYEY(＝SEQ ID NO：15)。
第三优选实施方案：多肽，其包含具有以下CDR序列的第一免疫球蛋白单一可变域：
CDR1：RYTMG(＝SEQ ID NO：7)
CDR2：AIVRSGGSTYYADSVKG(＝SEQ ID NO：8)
CDR3：DRRGRGENYILLYSSGRYEY(＝SEQ ID NO：9)
及具有以下CDR序列的第二免疫球蛋白单一可变域：
CDR1：SYAMG(＝SEQ ID NO：13)
CDR2：AISWRSGSTYYADSVKG(＝SEQ ID NO：14)
CDR3：DPRGYGVAYVSAYYEY(＝SEQ ID NO：15)。
当然，如上文所述的亦即任选地包括接头肽和/或其他域，特别包括Alb11域，免疫球蛋白单一可变域的不同次序的变体应亦适用于这些三个优选实施方案。
在一具体优选实施方案中，白蛋白结合免疫球蛋白单一可变域位于两个LRP5/LRP6结合免疫球蛋白单一可变域之间。因此，三个具体优选实施方案可设想如下：
第一具体优选实施方案：多肽，其包含具有以下CDR序列的第一(LRP5/LRP6结合)免疫球蛋白单一可变域：
CDR1：TYTVG(＝SEQ ID NO：1)
CDR2：AIRRRGSSTYYADSVKG(＝SEQ ID NO：2)
CDR3：DTRTVALLQYRYDY(＝SEQ ID NO：3)
具有以下CDR序列的白蛋白结合免疫球蛋白单一可变域：
CDR1：SFGMS(＝SEQ ID NO：16)
CDR2：SISGSGSDTLYADSVKG(＝SEQ ID NO：17)
CDR3：GGSLSR(＝SEQ ID NO：18)；
及具有以下CDR序列的第二(LRP5/LRP6结合)免疫球蛋白单一可变域：
CDR1：SYAMG(＝SEQ ID NO：10)
CDR2：AISWSGGSTYYADSVKG(＝SEQ ID NO：11)
CDR3：SPIPYGSLLRRRNNYDY(＝SEQ ID NO：12).
所述域呈此次序或呈以上域的经改变的次序。
第二具体优选实施方案：多肽，其包含具有以下CDR序列的第一(LRP5/LRP6结合)免疫球蛋白单一可变域：
CDR1：SYAMG(＝SEQ ID NO：4)
CDR2：AIRRSGRRTYYADSVKG(＝SEQ ID NO：5)
CDR3：ARRVRSSTRYNTGTWWWEY(＝SEQ ID NO：6)；
具有以下CDR序列的白蛋白结合免疫球蛋白单一可变域：
CDR1：SFGMS(＝SEQ ID NO：16)
CDR2：SISGSGSDTLYADSVKG(＝SEQ ID NO：17)
CDR3：GGSLSR(＝SEQ ID NO：18)；
及具有以下CDR序列的第二(LRP5/LRP6结合)免疫球蛋白单一可变域：
CDR1：SYAMG(＝SEQ ID NO：13)
CDR2：AISWRSGSTYYADSVKG(＝SEQ ID NO：14)
CDR3：DPRGYGVAYVSAYYEY(＝SEQ ID NO：15)；
所述域呈此次序或呈以上域的经改变的次序。
第三具体优选实施方案：多肽，其包含具有以下CDR序列的第一(LRP5/LRP6结合)免疫球蛋白单一可变域：
CDR1：RYTMG(＝SEQ ID NO：7)
CDR2：AIVRSGGSTYYADSVKG(＝SEQ ID NO：8)
CDR3：DRRGRGENYILLYSSGRYEY(＝SEQ ID NO：9)；
具有以下CDR序列的白蛋白结合免疫球蛋白单一可变域：
CDR1：SFGMS(＝SEQ ID NO：16)
CDR2：SISGSGSDTLYADSVKG(＝SEQ ID NO：17)
CDR3：GGSLSR(＝SEQ ID NO：18)；
及具有以下CDR序列的第二(LRP5/LRP6结合)免疫球蛋白单一可变域：
CDR1：SYAMG(＝SEQ ID NO：13)
CDR2：AISWRSGSTYYADSVKG(＝SEQ ID NO：14)
CDR3：DPRGYGVAYVSAYYEY(＝SEQ ID NO：15)；
所述域呈此次序或呈以上域的经改变的次序。
上述CDR序列概述于表IA、表IB及表IC中：
表IA：干扰Wnt1信号传递的免疫球蛋白单一可变域的CDR序列：
表IB：干扰Wnt3a信号传递的免疫球蛋白单一可变域的CDR序列：
表IC：结合至血清白蛋白的免疫球蛋白单一可变域(Alb11域)的CDR序列：
除了如上文所述的CDR序列以外，本发明的多肽中所包含的免疫球蛋白单一可变域亦包括免疫球蛋白框架区(FR)序列。这些序列优选在人类中没有免疫原性，且因此优选为人类或人源化FR序列。适合的人类或人源化FR序列为本领域中已知的。具体优选的FR序列可取自下文所示的实施方案，其揭示全部免疫球蛋白单一可变域且由此揭示CDR序列以及FR序列。
根据一更具体实施方案，本发明的多肽包括为VHH域且优选人源化VHH域的免疫球蛋白单一可变域。
根据一甚至更具体实施方案，本发明的多肽包括第一免疫球蛋白单一可变域(a)，其选自由具有以下序列的免疫球蛋白单一可变域(i)至(iii)组成的组：
(i)
AVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSTYTVGWFRQAPGKEREFVAAIRRRGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAADTRTVALLQYRYDYWGQGTLVTVSS
[＝Wnt1-333E06mod域；＝SEQ ID NO：19]
(ii)
AVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAAIRRSGRRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAARRVRSSTRYNTGTWWWEYWGQGTLVTVSS
[＝Wnt1-333G06域；＝SEQ ID NO：20]，及
(iii)
AVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLTFSRYTMGWFRQAPGKEREFVAAIVRSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAADRRGRGENYILLYSSGRYEYWGQGTLVTVSS
[＝Wnt1-332D03mod域；＝SEQ ID NO：21]，
及第二免疫球蛋白单一可变域(b)，其选自由具有以下序列的免疫球蛋白单一可变域(iv)及(v)组成的组：
(iv)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAAISWSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAASPIPYGSLLRRRNNYDYWGQGTLVTVSS
[＝Wnt3a-093A01域；＝SEQ ID NO：22]，及
(v)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAAISWRSGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAADPRGYGVAYVSAYYEYWGQGTLVTVSS
[＝Wnt3a-367B10域；＝SEQ ID NO：23]。
优选实施方案为：多肽，其包含
-具有如SEQ ID NO：19中所示的氨基酸序列的第一免疫球蛋白单一可变域及具有如SEQ ID NO：22中所示的氨基酸序列的第二免疫球蛋白单一可变域；或
-具有如SEQ ID NO：20中所示的氨基酸序列的第一免疫球蛋白单一可变域及具有如SEQ ID NO：23中所示的氨基酸序列的第二免疫球蛋白单一可变域；或
-具有如SEQ ID NO：21中所示的氨基酸序列的第一免疫球蛋白单一可变域及具有如SEQ ID NO：23中所示的氨基酸序列的第二免疫球蛋白单一可变域。
因此，以上实施方案可示意性地展现为
isvd(a)-[接头肽]-isvd(b)，
其中”isvd”表示相应免疫球蛋白单一可变域，且其中另外，特别在存在任选地选用的接头肽和/或其他域，特别Alb11域方面，且在免疫球蛋白单一可变域的不同次序方面，相同定义及变体应如上文所述进行应用。
根据本发明的具体实施方案，以上多肽可另外包括半衰期延长部分，其中该半衰期延长部分共价连接至该多肽且任选地选自由以下组成的组：白蛋白结合部分，诸如白蛋白结合肽或白蛋白结合免疫球蛋白域、优选白蛋白结合免疫球蛋白单一可变域、更优选Alb11域；转铁蛋白结合部分，诸如抗转铁蛋白免疫球蛋白域、聚乙二醇分子、血清白蛋白(优选人类血清白蛋白)及(人类)血清白蛋白的片段。
上述Alb11免疫球蛋白单一可变域的序列如下：
EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS
(＝Alb11域；＝SEQ ID NO：24)
结合至人类血清白蛋白的免疫球蛋白单一可变域的其他实施例为本领域中已知的，且进一步详细地描述于例如国际专利公开案WO2006/122787及WO2008/028977中。结合至人类血清白蛋白的其他肽描述于例如WO2008/068280、WO2009/127691及WO2011/095545中。
因此，本发明的三个优选具体实施方案如下：
第一优选具体实施方案：多肽，其包含
-具有如SEQ ID NO:19中所示的氨基酸序列的第一(LRP5/LRP6结合)免疫球蛋白单一可变域；
-具有如SEQ ID NO:24中所示的氨基酸序列的白蛋白结合免疫球蛋白单一可变域；
-具有如SEQ ID NO:22中所示的氨基酸序列的第二(LRP5/LRP6结合)免疫球蛋白单一可变域；
所述域呈此次序或呈以上三个域的经改变的次序。
第二优选具体实施方案：多肽，其包含
-具有如SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列的第一(LRP5/LRP6结合)免疫球蛋白单一可变域；
-具有如SEQ ID NO:24中所示的氨基酸序列的白蛋白结合免疫球蛋白单一可变域；
-具有如SEQ ID NO:23中所示的氨基酸序列的第二(LRP5/LRP6结合)免疫球蛋白单一可变域；
所述域呈此次序或呈以上三个域的经改变的次序。
第三优选具体实施方案：多肽，其包含
-具有如SEQ ID NO:21中所示的氨基酸序列的第一(LRP5/LRP6结合)免疫球蛋白单一可变域；
-具有如SEQ ID NO:24中所示的氨基酸序列的白蛋白结合免疫球蛋白单一可变域；
-具有如SEQ ID NO:23中所示的氨基酸序列的第二(LRP5/LRP6结合)免疫球蛋白单一可变域；
所述域呈此次序或呈以上三个域的经改变的次序。
在甚至更具体优选实施方案中，白蛋白结合免疫球蛋白单一可变域位于两个LRP5/LRP6结合免疫球蛋白单一可变域之间。
上述免疫球蛋白单一可变域的序列概述于表IIA、表IIB及表IIC中：
表IIA：干扰Wnt1信号传递的免疫球蛋白单一可变域的序列：
表IIB：干扰Wnt3a信号传递的免疫球蛋白单一可变域的序列：
表IIC：结合至血清白蛋白的免疫球蛋白单一可变域(Alb11域)的序列：
如上文所述，本发明的多肽中所存在的(至少两个)免疫球蛋白单一可变域可直接而不使用接头或经由接头彼此连接。接头优选为接头肽且根据本发明，将加以选择以使至少两个不同免疫球蛋白单一可变域结合至其靶表位中的每一个。
适合的接头将特别依赖于表位，且具体而言，依赖于免疫球蛋白单一可变域应结合至的靶分子上的表位之间的距离。基于本文中的揭示内容，任选地在一定有限程度的常规实验之后，这对本领域技术人员将为清楚的。
因此，适合的接头可包含例如，具有9个或大于9个氨基酸，优选为至少17个氨基酸，诸如约20至40个氨基酸的长度的氨基酸序列。接头序列可为天然存在的序列或非天然存在的序列。若用于治疗性目的，接头优选在本发明的多肽所施用的个体中为非免疫原性的。
如WO1996/34103及WO1994/04678中所述，一组有用的接头序列为衍生自重链抗体的铰链区的接头。其他实施例为聚丙氨酸接头序列，诸如Ala-Ala-Ala。
接头序列的更优选实施例为具有不同长度的Gly/Ser接头，诸如(glyxsery)z接头，包括例如，(gly4ser)3、(gly4ser)5、(gly4ser)7、(gly3ser)3、(gly3ser)5、(gly3ser)7、(gly3ser2)3、(gly3ser2)5及(gly3ser2)7。
可替代地，或除了多肽接头，本发明的多肽中所存在的至少两个免疫球蛋白单一可变域可经由另一部分，诸如另一多肽彼此连接，在一优选但非限制性实施方案中，该另一部分可为如上已经描述的另一免疫球蛋白单一可变域。该部分可基本上为非活性的或可具有诸如改善多肽的所需特性或可赋予多肽一或多个另外所需特性的生物作用。如上文已经阐述，优选的另外多肽域将增加多肽，诸如(人类)血清白蛋白结合域，诸如Alb11域的半衰期。
因此，根据另一实施方案，本发明具体包括包含以下序列中的任一者的多肽，其中精确氨基酸序列可取自下表III：
SEQ ID NO:25(＝多肽F013500575的序列)，
SEQ ID NO:26(＝多肽F013500571的序列)，
及
SEQ ID NO:27(＝多肽F013500720的序列)。
根据甚至更具体实施方案，本发明的多肽选自以下分子的组：
多肽F013500575，其具有序列SEQ ID NO:25，
多肽F013500571，其具有序列SEQ ID NO:26，及
多肽F013500720，其具有序列SEQ ID NO:27。
表III：本发明的多肽的三个具体实施方案的序列
如先前所解释，除非另外指明，否则本发明的多肽可包括其他部分和/或另外多肽域，只要其与LRP5/LRP6的结合将不会受到该另外部分或域阻止即可。
本发明的多肽可另外含有修饰，诸如糖基残基或经修饰的氨基酸侧链，且其可经聚乙二醇化以便增加该分子的半衰期及其他特性。适用于聚乙二醇化双互补位免疫球蛋白单一可变域构建体的技术及试剂可获自例如WO2011/107507。
本发明的多肽可具有经修饰的N末端序列，例如，N末端氨基酸中的一或多者缺失或例如第一N末端氨基酸的交换(例如谷氨酸交换为丙氨酸)，以使分子最佳化以藉由使用某些表达系统(诸如特异性载体或宿主细胞)表达、或表达为包涵体或呈可溶形式、或分泌至介质或周质空间中或含于细胞内、或产生较均匀产物。本发明的多肽可具有经修饰的C末端序列，诸如额外的丙氨酸(如上表III中所展示的三个实施方案所示)和/或C末端部分中或框架区中的任一者中的其他限定位置处的其他氨基酸交换，如例如WO2012/175741、WO2011/075861或WO2013/024059中所解释，以例如进一步增强所述多肽的稳定性或降低所述多肽的免疫原性。
此外，本发明的多肽的半衰期可藉由添加白蛋白域，亦即藉由将其转化成白蛋白融合蛋白来提高。适用白蛋白部分及如何将其添加至结合分子中的实施例提供于例如WO2001/079271及WO2003/059934中。
优选地，本发明的多肽具有在如下文实施例7.1中所述的FACS结合分析中所测定的结合(EC50)值，其在10-6摩尔/升或小于10-6摩尔/升、更优选10-9摩尔/升或小于10-9摩尔/升范围内、且甚至更优选在10-10摩尔/升至10-13摩尔/升范围内，或具有如在如下文实施例7.3中所述的组合Wnt1及Wnt3a报导分析中所测定的IC50值，其为10-9摩尔/升或10-9摩尔/升，且优选在5×10-10摩尔/升至10-12摩尔/升范围内。
本发明的多肽允许对若干癌症类型，诸如TNBC、CRC及NSCLC进行较高效治疗。其具有改善的体外特征(亦即Wnt路径抑制的较高功效)(参见例如下文实施例7及实施例8)，及显著体内肿瘤生长抑制特性，产生比本领域中所述的其他LRP6结合分子高的体内功效(如例如下文实施例9及实施例10中所示)。
具体而言，如经Wnt驱动的肿瘤模型中的体内所示，LRP5/LRP6交叉反应性半衰期延长的双互补位人源化VHH构建体可抑制Wnt信号传递及体内肿瘤生长，且甚至提供实质性肿瘤缩小(亦即肿瘤生长抑制率高于100％)，其在相同实验环境下，使用本领域中已知的LRP6结合物可能不会达成。肿瘤缩小(亦即肿瘤消退)理所当然为癌症患者的治疗中所需的治疗性作用(亦即功效)。此外，引起病理性完全反应(pCR)的肿瘤消退为已确认的临床指标，其指示无进展存活期及总存活期得到显著改善。
在相同体内实验中，未观测到显著体重变化(<10％)，且来自胃肠道组织病理学分析的结果并未指示出以上本发明的多肽的任何毒性作用。鉴于上文所论述的体内DKK1表达研究(亦即引起肠黏膜溃烂及体重降低)，这点特别出人意料。
因此，本发明的多肽实际上提供用于治疗癌症疾病，且特别甚至供用于高度未满足的医学需要适应症，诸如(三阴性)乳腺癌中的新颖治疗性选择。
出人意料地，本发明人并未藉由常规途径，亦即尝试研发对一种给定靶向物，诸如LRP6(例如在WO2009/056634中，作为治疗”经Wnt信号传递介导的疾病”的靶向物提及)具有高度特异性/选择性的抑制剂或结合分子来达成此解决方案。与此相反，本发明人研发出了同时靶向两种相关蛋白质(LRP6及LRP5)，且由此达成由现有技术所不可预期的以上显著改善的体外及体内作用的分子。
此优越性的潜在分子机制并不完全清楚，但在不希望受特定理论束缚的情况下，可推测所述交叉反应性分子可具有对Wnt信号传递路径的高度复杂信号级联的额外且因此较强的作用。
以上有利作用将进一步在下文实施例中且藉助于其中所包括的比较数据加以说明。
此外，本发明的多肽易于制造且更具可溶性，其意指与常规抗体相比，所述多肽可以较高浓度储存和/或施用。其在室温下稳定且甚至在pH的极值下仍具有延长的稳定性，以使得可在不使用冷藏设备的情况下对其进行制备、储存和/或运输，实现成本、时间及环境节约。归因于上文且归因于其低免疫原性，其进一步提供关于除注射及输注以外的施用途径，以及关于施用疗程及特定装置的使用的多种选择。
核酸、载体、宿主细胞
根据其他方面，本发明涉及编码本发明的多肽的核酸分子及表达载体，以及表达其的宿主细胞。这些核酸、载体及宿主细胞适用于制造本发明的多肽，且其其他方面及实施方案将结合制造本发明的多肽的方法的概述进一步描述于下文。
治疗用途
归因于其生物特性，本发明的多肽适合于治疗藉由过量或异常细胞增殖表征的疾病，诸如癌症及特发性肺纤维化(IPF)。
举例而言，可用根据本发明的多肽治疗以下癌症、肿瘤及其他增生性疾病，但并不限于此：
头颈癌；肺癌，诸如非小细胞肺癌(NSCLC)及小细胞肺癌(SCLC)；纵隔赘瘤(neoplasm)，诸如神经性肿瘤及间叶细胞肿瘤；胃肠(GI)道癌，诸如食道癌、胃癌(stomachcancer/gastric cancer)、胰腺癌、肝癌及胆道癌(包括例如，肝细胞癌(HCC))及小肠及大肠癌(包括例如，结肠直肠癌)；前列腺癌；睪丸癌、妇科癌症，诸如卵巢癌；乳腺癌，诸如乳腺癌、激素受体阳性乳腺癌、Her2阳性乳腺癌及三阴性乳腺癌；内分泌系统的癌症；软组织肉瘤，诸如纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、血管肉瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)；骨骼肉瘤，诸如骨髓瘤、骨肉瘤、尤文氏肿瘤(Ewing's tumor)、纤维肉瘤、骨软骨瘤、骨母细胞瘤及软骨母细胞瘤；间皮瘤；皮肤癌，诸如基底细胞癌、鳞状细胞癌、梅克尔细胞癌(Merkel's cellcarcinoma)及黑素瘤；中枢神经系统及脑赘瘤，诸如星形细胞瘤、神经胶母细胞瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤及视网膜胚细胞瘤；淋巴瘤及白血病，诸如B细胞非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin lymphomas；NHL)、T细胞非霍奇金氏淋巴瘤、慢性B细胞淋巴细胞性白血病(B-CLL)、慢性T细胞淋巴细胞性白血病(T-CLL)、霍奇金氏疾病(HD)、大颗粒淋巴细胞白血病(LGL)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性骨髓性/骨髓白血病(AML)、急性淋巴/淋巴母细胞白血病(ALL)、多发性骨髓瘤(MM)、浆细胞瘤及骨髓发育不良症候组(MDS)；及未知原发部位的癌症。
藉由其在体内的特定位置/来源表征的上述所有癌症、肿瘤、赘瘤等意指包括原发肿瘤及自其衍生的转移性肿瘤。
更具体而言，本发明的多肽适用于治疗疾病，且特别癌症疾病，其中异常细胞增殖由异常(活化)Wnt信号传递引起或涉及异常(活化)Wnt信号传递。
因此，本发明的多肽特别适用于治疗实体肿瘤，且更具体而言，适用于治疗肺癌、肝癌、结肠癌、脑癌、甲状腺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌及前列腺癌，且甚至更具体而言，适用于治疗非小细胞肺癌(NSCLC)、三阴性乳腺癌(TNBC)及结肠直肠癌(CRC)。具体而言，本发明的多肽可用作单一药剂或用于组合中，以治疗患有局部晚期或转移性TNBC的患者、患有转移性NSCLC或局部晚期或转移性CRC的患者以延长无进展存活期(PFS)及总存活期(OS)。此外，本发明的多肽可用作乳腺癌患者的新辅助治疗以达成病理性完全反应(pCR；藉由完成新辅助全身性疗法后的完整的经切除的乳房样本及全部经取样的局部淋巴结的组织病理学评估定义为不存在残余侵袭性及原位癌症)。
本发明的多肽可用于一线、二线或任何其他线治疗的情形中的治疗疗程中。
本发明的多肽可用于预防、短期或长期治疗上述疾病，任选地亦与放射疗法和/或手术组合。
同样，本发明的多肽特别适用于治疗由涉及Wnt信号传递路径的异常细胞增殖引起的其他疾病，诸如特发性肺纤维化(IPF)(等人“功能性Wnt信号传递在特发性肺纤维化中会有所增加”.PLoS One 2008；3(5):e2142；Lam等人“Wnt共受体Lrp5为特发性肺纤维化的驱动子”.Am J Respir Crit Care Med.2014；190(2):185-95)。
此外，本发明的多肽特别适用于治疗视网膜病变，且特别是治疗糖尿病性视网膜病变，归因于内视网膜细胞中的异常Wnt活化，其使得引起糖尿病性视网膜病变的产生及进展的异常新视网膜血管形成增加(Chen,Y.等人“Wnt路径的活化在人类及动物模型中的糖尿病性视网膜病变中起致病性作用”The Am J Pathol.2009；175(6):2676-85.；Gao等人“升高的LRP6水平与增生性糖尿病性视网膜病变的玻璃体中的血管内皮生长因子相关”MolVis.2015；21:665-72)。
最后，由于可显示Wnt1/Wnt3a信号传递路径的抑制亦可对树突状细胞(DC)及树突状细胞功能产生作用，因此本发明的多肽亦可适用于治疗免疫性及感染性疾病，且适用于影响上文已经阐述的各种癌症疾病中的肿瘤微环境。肿瘤主动遏制抗肿瘤免疫性，且DC在癌症免疫逃逸机制中起重要作用。具体而言，研究已显示，肿瘤微环境中的Wnt配体亦可在免疫细胞内发起旁分泌信号传递且调节宿主抗肿瘤免疫(Hong等人“β-联蛋白藉由在树突状细胞中诱导维生素A代谢来促进肿瘤中的调节性T细胞反应”.Cancer Res.2015；75(4):656-65)。
当然，上文亦包括本发明的多肽在藉由向有需要的患者施用治疗有效剂量来治疗以上疾病的各种方法中的用途，以及这些多肽用于制造供用于治疗所述疾病的药物的用途，以及包括本发明的所述多肽的药物组合物，以及包括本发明的所述多肽的药物的制备和/或制造及类似者。
与其他活性物质的组合
本发明的多肽可独立或与其他药理学活性物质组合使用，所述活性物质诸如目前先进技术或标准照护化合物，诸如细胞生长抑制或细胞毒性物质，细胞增殖抑制剂、抗血管生成物质、类固醇、免疫调节剂/检查点抑制剂及类似者。
可与根据本发明的化合物组合施用的细胞生长抑制和/或细胞毒性活性物质包括(但不限于)激素、激素类似物及抗激素；芳香酶抑制剂；LHRH激动剂及拮抗剂；生长因子(诸如血小板衍生生长因子(PDGF)、纤维母细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、人类表皮生长因子(HER，例如，HER2、HER3、HER4)及肝细胞生长因子(HGF)的生长因子)的抑制剂，抑制剂为例如(抗)生长因子抗体、(抗)生长因子受体抗体及酪氨酸激酶抑制剂，诸如西妥昔单抗(cetuximab)、吉非替尼(gefitinib)、阿法替尼(afatinib)、尼达尼布(nintedanib)、伊马替尼(imatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、伯舒替尼(bosutinib)及曲妥珠单抗(trastuzumab)；抗代谢物(例如抗叶酸剂，诸如甲氨蝶呤、雷替曲塞(raltitrexed)、嘧啶类似物(诸如5-氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他滨(capecitabine)及吉西他滨(gemcitabine))、嘌呤及腺苷类似物(诸如巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、克拉屈滨(cladribine)及喷司他汀(pentostatin))、阿糖胞苷(ara C)、氟达拉滨(fludarabine))；抗肿瘤抗生素(例如蒽环霉素)；铂衍生物(例如顺铂、奥沙利铂、卡铂)；烷基化剂(例如雌莫司汀(estramustin)、氮芥(meclorethamine)、美法仑(melphalan)、氯芥苯丁酸、白消安、达卡巴嗪(dacarbazin)、环磷酰胺、异环磷酰胺、替莫唑胺、亚硝脲(诸如卡莫司汀(carmustin)及洛莫司汀(lomustin))、噻替派)；抗有丝分裂剂(例如长春花生物碱，诸如长春碱、长春地辛(vindesin)、长春瑞滨(vinorelbin)及长春新碱；及紫杉烷，诸如太平洋紫杉醇、多西他赛(docetaxel))；血管生成抑制剂；微管蛋白抑制剂；DNA合成抑制剂；PARP抑制剂；拓扑异构酶抑制剂(例如表鬼臼毒素，诸如依托泊苷(etoposide)及凡毕复(etopophos)、替尼泊甙(teniposide)、安吖啶(amsacrin)、拓朴替康(topotecan)、伊立替康(伊立替康)、米托蒽醌(mitoxantrone))；丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂(例如PDK1抑制剂、Raf抑制剂、A-Raf抑制剂、B-Raf抑制剂、C-Raf抑制剂、mTOR抑制剂、mTORC1/2抑制剂、PI3K抑制剂、PI3Kα抑制剂、双重mTOR/PI3K抑制剂、STK33抑制剂、AKT抑制剂、PLK1抑制剂(诸如伏拉塞替(volasertib))、CDK抑制剂、Aurora激酶抑制剂)；酪氨酸激酶抑制剂(例如PTK2/FAK抑制剂)；蛋白质-蛋白质相互作用抑制剂；MEK抑制剂；ERK抑制剂；FLT3抑制剂；BRD4抑制剂；IGF-1R抑制剂；TRAILR2激动剂；Bcl-xL抑制剂；Bcl-2抑制剂；Bcl-2/Bcl-xL抑制剂；ErbB受体抑制剂；BCR-ABL抑制剂；ABL抑制剂；Src抑制剂；雷帕霉素类似物(例如依维莫司(everolimus)、替西罗莫司(temsirolimus)、地磷莫司(ridaforolimus)、西罗莫司(sirolimus))；雄激素合成抑制剂；雄激素受体抑制剂；DNMT抑制剂；HDAC抑制剂；ANG1/2抑制剂；CYP17抑制剂；放射性药品；免疫治疗剂，诸如免疫检查点抑制剂(例如CTLA4、PD1、PD-L1、LAG3及TIM3结合分子/免疫球蛋白，诸如伊匹单抗(ipilimumab)、纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab))；癌症疫苗，诸如传统肿瘤疫苗(基于细胞的疫苗，例如用于治疗前列腺癌的西普鲁塞-T(Sipuleucel-T))、个体化新抗原疫苗及溶瘤病毒；及各种化学治疗剂，诸如阿米福汀(amifostin)、阿那格雷(anagrelid)、氯屈膦酸盐(clodronat)、非格司亭(filgrastin)、干扰素、干扰素α、甲酰四氢叶酸、利妥昔单抗(rituximab)、丙卡巴肼(procarbazine)、左旋咪唑(levamisole)、美司钠(mesna)、米托坦(mitotane)、帕米膦酸盐(pamidronate)及卟吩姆(porfimer)。
特别优选为包括使用本发明多肽与选自由以下组成的组的药物组合的治疗方法：
(i)在乳腺癌患者中，在存在或不存在化学疗法组合(包括新辅助设定(newadjuvant setting)中的阿霉素/环磷酰胺组合和/或卡培他滨/多西他赛组合；针对一线及后线治疗的紫杉烷/铂疗程)的情况下，抗VEGF抗体(贝伐单抗(bevacizumab)及其他抗血管生成物质)；
(ii)在肺癌患者中，在存在或不存在化学疗法组合(基于铂的细胞毒性组合疗法，其包括一线治疗中的吉西他滨/顺铂；二线治疗中的多西他赛或培美曲塞(pemetrexed))的情况下，针对EGFR突变NSCLC的EGFR TKI或针对ALK易位的NSCLC的克唑替尼(crizotinib)；
(iii)例如针对CRC患者的治疗，在存在或不存在化学疗法组合(包括伊立替康)、抗VEGF抗体组合(贝伐单抗及其他抗血管生成物质)或瑞戈非尼(regorafenib)组合的情况下，抗EGFR抗体(KRAS野生型肿瘤中的西妥昔单抗及帕尼单抗(panitumumab))；
(iv)例如针对乳腺癌、肺癌及CRC患者的治疗的免疫治疗剂，其包括抗PD-1剂(诸如派姆单抗及纳武单抗)、抗PD-L1剂、抗CTLA4剂、抗BTLA剂、抗LAG3剂及抗TIM3剂(诸如抗PDL1抗体等)；
(v)例如针对乳腺癌或CRC患者的治疗的化学治疗剂，诸如基于铂的抗肿瘤剂，或呈与FOLFOX化学疗法疗程的组合形式，其包括亚叶酸、5'-氟尿嘧啶及奥沙利铂；或呈与FOLFOXIRI化学疗法疗程的组合形式，其包括亚叶酸、5'-氟尿嘧啶、奥沙利铂及伊立替康。
当使用两种或大于两种物质或成分作为组合治疗疗程的一部分时，其可基本上在同一时间(亦即同时，并行)或在不同时间(例如依序、依次、交替、连续或根据任何其他类别的交替方案)经由同一施用途径或经由不同施用途径进行施用。
当经由同一施用途径同时施用所述物质或成分时，其可以不同药物配制剂或组合物形式或作为组合药物配制剂或组合物的一部分进行施用。此外，当使用两种或大于两种活性物质或成分作为组合治疗疗程的一部分时，可以相同量且根据与单独使用该化合物或成分时所用的疗程相同的疗程施用所述物质或成分中的每一者，且该组合使用可或可不引起协同效应。然而，当两种或大于两种活性物质或成分的组合使用引起协同效应时，亦可降低待施用的所述物质或成分中的一者、多者或全部的量，同时仍达成所需治疗性作用。此可例如适用于避免、限制或降低当以其常用量使用其时，任何与所述物质或成分中的一或多者的使用相关联的不合需要的副作用，同时仍获得所需药理学或治疗性作用。
当然，上文包括制备本发明的多肽以用于与以上组合搭配物进行组合使用的制剂及方法。制备上述组合搭配物以用于与本发明的多肽进行组合使用的制剂及方法亦包括在内。因此，本发明特此例如提供使用或制备免疫调节剂/检查点抑制剂，诸如抗PD1抗体(诸如派姆单抗或纳武单抗)以供用于与本发明的多肽组合施用，且更具体而言，用于与本发明的多肽的组合疗法疗程中的施用的方法。
此外，本发明亦涵盖包含至少一种本发明的多肽及一种或多种其他组分及如下文所述的装置的试剂盒，所述其他组分选自由用于治疗如上所述的疾病及病症的其他药物组成的组。
药物组合物、施用方法、剂量
本领域技术人员将清楚，以上疾病治疗方法包括供用于治疗该疾病的药剂的制备。因此，本发明进一步关于用于治疗上文所提及的疾病的药物组合物，其中所述组合物包含至少一种本发明的多肽。
可以任何适合的方式向有需要的患者施用本发明的多肽和/或包含其的组合物，其视待使用的特定药物配制剂或组合物而定。因此，本发明的多肽和/或包含其的组合物可例如以以下方式以有效量或剂量施用：静脉内(i.v.)、皮下(s.c.)、肌肉内(i.m.)、腹膜内(i.p.)、经皮、经口、舌下(例如呈置放于舌头下且经由黏膜吸收至舌头下的毛细血管网中的舌下锭剂、喷雾剂或滴剂形式)、经鼻(内)(例如呈鼻用喷雾剂形式和/或以气溶胶形式)、局部、借助于栓剂、藉由吸入或任何其他适合方式。
根据适合于治疗和/或缓解待治疗或缓解的疾病、病症或病状的治疗疗程来施用本发明的多肽和/或包含其的组合物。临床医师将通常能够确定适合的治疗疗程，其视诸如以下因素而定：待治疗或缓解的疾病、病症或病状、疾病的严重程度、其症状的严重程度、待使用的本发明的特定多肽、待使用的特定施用途径及药物配制剂或组合物、患者年龄、性别、体重、饮食、一般情况及临床医师所熟知的类似因素。一般而言，治疗疗程将包含一种或多种本发明的多肽或一种或多种包含其的组合物以治疗有效量或剂量的施用。
一般而言，对于本文中所提及的且视待治疗的特定疾病、病症或病状、待使用的本发明的特定多肽的效能、所用特定施用途径及特定药物配制剂或组合物而定的疾病、病症及病状的治疗和/或缓解而言，本发明的多肽将通常以每千克体重及每剂量0.005毫克与20.0毫克之间、优选0.05毫克/千克/剂量与10.0毫克/千克/剂量之间、且更优选0.5毫克/千克/剂量与10毫克/千克/剂量之间的量以连续方式(例如藉由输注)或更优选以单次剂量(诸如一周两次、每周一次或每月一次的剂量；参见下文)形式施用，但可显著变化，特别视先前提及的参数而定。因此，在一些情况下，使用小于上文给出的最小剂量可为足够的，而在其他情况下可能必须超过上限。当施用较大量时，在一天内将其分成多个较小剂量可为可取的。
视本发明的特定多肽及其特定药物动力学特性及其他特性而定，可每天一次、每两天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次或每六天一次、每周一次、每月一次及其类似方式施用该多肽。施用疗程可包括每周一次的长期治疗。”长期”意指持续时间为至少两周且优选数月或数年。
可使用任何适合的体外分析、基于细胞的分析、体内分析和/或本身已知的动物模型或其任何组合测试本发明的多肽及包含其的组合物的功效，其视所涉及的特定疾病而定。适合的分析及动物模型对本领域技术人员将为清楚的，且例如包括以下实施例中所用的分析及动物模型。
优选地，在这些分析或模型中的至少一者中，且优选在体内模型中的一或多者中，本发明的多肽具有比本领域中已知的常规抗体(诸如以上”现有技术”部分中所述的LRP6结合物)更优选的特征。
配制剂
出于医药用途，本发明的多肽可配制为包含以下的医药制剂：(i)至少一种本发明的多肽及(ii)至少一种药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、佐剂和/或稳定剂，及(iii)任选地选用的一种或多种其他药理学活性多肽和/或化合物。”医药学上可接受”意指当向个体施用时，相应物质不会显示任何生物或者不合需要的作用且不会以有害方式与药物组合物中所含有的其他组分(诸如医药学上活性成分)中的任一者相互作用。特定实施例可见于标准手册，诸如雷明顿氏医药科学(Remington's Pharmaceutical Sciences),第18版,Mack Publishing Company,USA(1990)。举例而言，可以常规抗体及抗体片段及其他医药学上活性蛋白质本身已知的任何方式配制且施用本发明的多肽。因此，根据另一实施方案，本发明涉及一种药物组合物或制剂，其含有至少一种本发明的多肽及至少一种药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、佐剂和/或稳定剂，及任选地选用的一种或多种其他药理学活性物质。
用于非经肠施用，诸如静脉内、肌肉内、皮下注射或静脉内输注的药物制剂可为例如无菌溶液、悬浮液、分散液、乳液或粉末，其包含活性成分且其任选地在另一溶解或稀释步骤之后适用于输注或注射。所述制剂的适合载剂或稀释剂例如包括(但不限于)无菌水及医药学上可接受的缓冲剂水溶液及溶液，诸如磷酸盐缓冲生理盐水、林格氏溶液(Ringer'ssolution)、右旋糖溶液及汉克氏溶液(Hank's solution)；水油(water oils)；甘油；乙醇；二醇，诸如丙二醇，以及矿物油、动物油及植物油，例如花生油、大豆油，以及其适合的混合物。
本发明多肽的溶液亦可含有防腐剂以防止微生物生长，诸如抗细菌剂及抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯(p-hydroxybenzoates/parabens)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞(thiomersal)、乙二胺四乙酸(的碱金属盐)及其类似物。在许多情况下，将优选包括等张剂，例如糖、缓冲剂或氯化钠。任选地可使用乳化剂和/或分散剂。适当流动性可例如藉由形成脂质体、在分散液情况下藉由维持所需粒度或藉由使用界面活性剂来维持。亦可添加延迟吸收的其他试剂，例如单硬脂酸铝及明胶。可将溶液填充至注射小瓶、安瓿、输注瓶及其类似瓶中。
在所有情况下，最终剂型在制造及储存条件下均必须为无菌、流体且稳定。无菌可注射溶液如下制备：将所需量的活性化合物视需要与上文列举的各种其他成分一起并入适当溶剂中，随后过滤灭菌。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法为真空干燥及冷冻干燥技术，其产生存在于预先无菌过滤溶液中的活性成分加任何另外所需成分的粉末。
通常，水溶液或悬浮液将为优选的。一般而言，适合的治疗蛋白，诸如本发明多肽的配制剂为缓冲蛋白质溶液，诸如包括以下的溶液：呈适合浓度(诸如0.001mg/ml至400mg/ml、优选0.005mg/ml至200mg/ml、更优选0.01mg/ml至200mg/ml、更优选1.0mg/ml至100mg/ml，诸如1.0mg/ml(i.v.施用)或100mg/ml(s.c.施用))的蛋白质及诸如以下的缓冲剂水溶液：
-磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4，
-其他磷酸盐缓冲液，pH 6.2至pH 8.2，
-乙酸盐缓冲液，pH 3.2至pH 7.5，优选pH 4.8至pH 5.5，
-组氨酸缓冲液，pH 5.5至pH 7.0，
-丁二酸盐缓冲液，pH 3.2至pH 6.6，及
-柠檬酸盐缓冲液，pH 2.1至pH 6.2，
及任选地选用的提供溶液的等张性的盐(例如NaCl)和/或糖(诸如蔗糖及海藻糖)和/或其他多元醇(诸如甘露醇及甘油)。
优选缓冲蛋白质溶液为包括溶解于25mM磷酸盐缓冲液，pH 6.5中的约0.05mg/ml本发明的多肽的溶液，其藉由添加220mM海藻糖调整等张性。此外，其他试剂，诸如洗涤剂，例如0.02％Tween-20或Tween-80可包括于所述溶液中。皮下施用的配制剂可包括显著较高浓度，诸如高达100mg/ml或甚至大于100mg/ml的本发明的多肽。然而，本领域技术人员将清楚，如上所给出的成分及其量仅表示一种优选选择。其替代方案及变形对本领域技术人员将直接显而易知，或可易于从以上揭示内容出发进行构想。
此外，相较于常规抗体或抗体片段，使用本发明的多肽的一个主要优点在于其亦可易于经由除非经肠施用以外的途径施用且可容易针对该施用进行配制。举例而言，如国际专利申请WO2004/041867中所述，所述多肽可经配制以用于经口、鼻内、肺内及经皮施用。
根据本发明的另一方面，本发明的多肽可用于与适用于施用该多肽的装置，诸如注射器、注射笔、微型泵或其他装置进行组合。
制造及纯化方法
本发明进一步提供制造本发明的多肽的方法，所述方法通常包含以下步骤：
-在允许表达本发明的多肽的条件下培养包含编码本发明的多肽的核酸(以下称作：”本发明的核酸”)的宿主细胞；且
-自培养物回收或分离由宿主细胞表达的多肽；且
-任选地进一步纯化和/或修饰和/或配制本发明的多肽。
本发明的核酸可例如为包含编码序列以及调节序列及任选地选用的天然或人工内含子的DNA分子或可为cDNA分子。其可具有其初始密码子或可具有最佳化密码子使用，其特别适用于表达于所需宿主细胞或宿主生物体中。根据本发明的一个实施方案，如上文所定义，本发明的核酸呈基本上分离的形式。
本发明的核酸亦可呈以下形式：存在于载体中和/或作为载体的一部分，例如质粒、粘粒或YAC，其同样可呈基本上分离的形式。载体可特别为表达载体，亦即可提供多肽的体外和/或体内(例如在适合的宿主细胞、宿主生物体和/或表达系统中)表达的载体。该表达载体通常包含至少一种可操作地连接至一种或多种适合的调节元件，诸如启动子、增强子、终止子及其类似者的本发明的核酸。适用于表达本发明的多肽或表达本发明的多肽所需的所述调节元件及其他元件，诸如整合因子、选择标记、信号或前导序列、报导基因及其类似者的特定实施例揭示于例如WO2006/040153的第131页至第133页上。
可以本身已知的方式(例如藉由自动DNA合成和/或重组DNA技术)，基于本文中所给出的本发明的多肽的氨基酸序列的信息来制备或获得本发明的核酸。
根据另一实施方案，本发明涉及一种表达或能够表达本发明的多肽；和/或含有编码本发明的多肽的核酸的宿主或宿主细胞。根据特别优选实施方案，所述宿主细胞为细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。
对于工业规模的制造而言，用于免疫球蛋白单一可变域多肽及含有其的蛋白质治疗剂的(工业)制造的优选异源宿主包括大肠杆菌、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)及酿酒酵母的菌株，其适合于大规模表达、制造及发酵，且特别适合于大规模(生物)药物表达、制造及发酵。
如上文所述的产生于细胞中的本发明的多肽可以胞内方式(例如在细胞溶胶中、在外周胞质中或在包涵体中)产生且可随后自宿主细胞分离且任选地进一步加以纯化；或其可以胞外方式(分泌至宿主细胞在其中进行培养的培养基中)产生，且随后自培养基分离且任选地进一步加以纯化。
用于重组制造多肽的其他方法及试剂，诸如适合的表达载体、转化或转染方法、选择标记、蛋白质表达的诱导方法、培养条件及其类似者为本领域中已知的。类似地，适用于本发明的多肽的制造方法中的蛋白质分离及纯化技术已为本领域技术人员所熟知。
相比于通常需要昂贵哺乳动物细胞培养物设施的常规抗体，在常规重组宿主生物体，诸如大肠杆菌及酵母中经由发酵制造本发明的多肽具有成本效益。此外，可达成的表达水平较高且本发明的多肽的产量在1g/l至10g/l范围内(大肠杆菌)且高达10g/l(酵母)且高于10g/l。
实施例
实施例1：用LRP5及LRP6免疫接种美洲驼以诱导体液性免疫反应
针对LRP5/LRP6交叉反应性结合VHH域的鉴别所需要设计且实施的美洲驼的免疫接种的若干方案：用LRP6及LRP5蛋白(人类及小鼠)的重组胞外域对美洲驼进行初始免疫接种。然而，上述LRP5重组蛋白的功能性特征显示，仅Wnt1类结合表位得到恰当折叠。对比而言，并未指示LRP5-Wnt3a类结合域的恰当折叠。因此，需要进行进一步研究以产生适合免疫接种的抗原。作为解决方案，用经人类LRP5或人类LRP6稳定转染的HEK293细胞免疫接种美洲驼。然而，随后，藉由短暂转染或藉由稳定转染且使用不同细胞株(HEK293、CHO及NIH-3T3细胞)，也仅可达成人类LRP5的极低表达。因此，需要进行甚至进一步研究以达成LRP5的足够表达。最后，且在一些失败的试验和错误之后，可藉由制定涉及HEK293细胞与MesDC-2的稳定共转染的方案来达成此，该MesDC-2为意欲增加外源性LRP5表达的伴侣蛋白。即便如此，即在产生经LRP5稳定转染的细胞株期间共表达MesDC-2后，仍反复地观测到蛋白质表达的不稳定性。这导致LRP5表达可能会在免疫接种及选择期间丢失的问题。为解决这个进一步的问题，尽可能限制表达LRP5的细胞的传代且进行另外细胞分选以富集表达LRP5的细胞。
在存在及不存在hMesDC-2伴侣蛋白的情况下另外用LRP5编码DNA及LRP6编码DNA在相对侧腹中对美洲驼进行免疫接种。以增加鉴别LRP5/LRP6交叉反应性VHH域的机会为目标，向若干美洲驼递送另外增强免疫(boost)以试图增强交叉反应性免疫反应。
以规律时间间隔获取免疫血液(PBL)样本，测定血清反应，且由分离的PBL制备全部RNA。用重组蛋白免疫接种后，相比于对LRP5的低血清反应，观测到对LRP6的中等血清反应。观测到用DNA免疫接种的美洲驼的中等LRP5免疫反应。对比而言，观测到针对细胞免疫的极低免疫反应。此外，还探索了合成文库。然而，继续进行如实施例2中所概述的随后步骤，可最终达成文库的足够多样性。
实施例2：LRP5及LRP6结合单价VHH域(VHH)的分离
文库构建：
紧随免疫组织的收集提取全部RNA，且检验RNA完整性及浓度。cDNA样本由这些RNA制剂制得。在单步RT-PCR反应中自cDNA样本扩增编码VHH的核苷酸序列。自样本中的IgG2及IgG3cDNA特异性扩增的700bp扩增子自琼脂糖凝胶分离且随后用作巢式PCR反应中的模板。随后用SfiI及BstEII消化PCR产物且将所述产物接合至噬菌粒载体pAX50的相应限制位点。将接合混合物电穿孔至大肠杆菌TG-1中。所得转化体文库构成噬菌体展示文库的基因多样性。
pAX50为衍生自pUC119的表达载体，其含有氨苄西林(ampicillin)抗性基因及lac启动子，之后为框内pIII蛋白信号肽的编码序列，其具有下游VHH域克隆位点。在具有VHH域编码序列的框内，载体编码C末端Myc及六组氨酸标记及大肠杆菌噬菌体pIII蛋白。在用辅助噬菌体感染大肠杆菌TG-1文库克隆感染之后，pAX50的存在使得可由这些克隆产生噬菌体粒子，使个别VHH域显示为具有pIII蛋白的融合蛋白质。
选择：
构建VHH域-噬菌粒库且用于选择。鉴于跨越物种之间(在美洲驼与人类LRP5及LRP6之间)的物种同源性极高，因而不确定美洲驼中提高的免疫反应是否将提高VHH域的足够多样性。因此，在选择期间平行于免疫文库使用两个合成文库。
在选择期间使用如下不同策略：
-交替LRP5及LRP6衍生工具以增强鉴别LRP5/LRP6交叉反应性VHH域的机会，例如，用LRP6衍生蛋白对来自经LRP5免疫接种的美洲驼的文库进行选择或在对合成库的选择期间使用LRP5及LRP6蛋白。
-交替物种来源以选择人类/小鼠LRP5/LRP6交叉反应性VHH域(在相同临床前模型中(亦即异种移植肿瘤小鼠模型)中，允许评估治疗窗扣评定所需的功效，亦即肿瘤生长抑制及安全性概况的该LRP5及LRP6拮抗剂的小鼠交叉反应性)。
-用重组蛋白”在溶液中(in solution)”选择以使表位保持其天然构形：作为另外阻碍，发现若直接涂布于ELISA结合平板上，则LRP5及LRP6重组蛋白会失去其恰当折叠。因此，生物素标记重组蛋白，且在功能性分析中确定恰当折叠之后，将其用于”在溶液中”选择。
-使用过表达LRP5或LRP6的细胞进行选择，以具有受体的天然构形。出人意料地表明此为重要策略，特别为改善对LRP5的Wnt3a类结合域的结合物选择所需要的，因为重组蛋白的功能性数据显示缺少Wnt3a结合表位的恰当折叠。
实施例3：单价VHH的筛选
选择之后，使克隆在96深孔平板(1mL体积)中生长，且藉由添加IPTG诱导VHH表达。如例如WO2011/107507中所报导，根据标准方法制备单一克隆的周质提取物，且针对结合至人类LRP6及LRP5进行筛选。首先，在结合ELISA分析中使用重组LRP5及LRP6筛选周质提取物，当与基于FACS的结合分析相比时，所述分析呈现灵敏、稳健及高通量分析。纯化之后，使用结合FACS分析进一步表征ELISA分析中所鉴别的VHH以确认纯化VHH结合至呈其天然构形的LRP5及LRP6受体。
通常，期望ELISA与FACS结合分析之间的良好相关性。然而，在当前情况中，ELISA分析中的最佳LRP5及LRP6结合VHH(亦即具有与重组LRP5或LRP6胞外域的高亲和力)并未在FACS结合分析中显示与人类LRP5及LRP6的任何结合或与人类LRP5及LRP6的结合极弱，如图2中的小图”2”结合物所示。不同涂布缓冲液(dPBS与碳酸氢盐缓冲液)及ELISA设定中的阻断溶液(Marvel与BSA)的使用并未解决所观测到的差异。实际上，已发现ELISA中的极弱结合物在使用LRP5及LRP6表达细胞的结合FACS分析中显示出对LRP5及LRP6的高亲和力，如图2的小图”1”结合物中所示。因此，这些其他数据及实验使得可进行识别两种受体的天然构形的高亲和力结合物的选择。此外，这些高亲和力结合物识别构形依赖性表位而非LRP5及LRP6蛋白质中的线性表位由此得到确认。因此，这些其他非常规数据及实验使得可进行治疗相关性LRP5及LRP6结合物的选择，其应具有对质膜上所表达的呈其天然构形的LRP5及LRP6的高亲和力。
因此，尽管(i)FACS结合分析通量低，(ii)分析设定较不稳健，及(iii)归因于过表达LRP5的细胞传代后重组蛋白表达缺失而遇到上述困难，仍随后将这些分析用于高亲和力VHH结合物的其他选择及表征中。简言之，在4℃下在平板震荡器上用纯化VHH稀释液培育细胞(1μM至1pM最终浓度的1:5连续稀释液最终浓度)1.5小时。用由1×磷酸盐缓冲盐水(PBS)+10％胎牛血清(FBS)+0.05％叠氮化钠组成的FACS缓冲液洗涤细胞5次之后，在4℃下用结合至VHH的框架区且因此结合至所测试的所有LRP5和/或LRP6结合物的多克隆小鼠抗体培育30分钟至1小时。用FACS缓冲液洗涤细胞3次之后，在4℃下用标记二抗(抗小鼠PE)培育细胞持续30分钟至1小时，之后进行用FACS缓冲液洗涤3次的步骤。使用FACS阵列(BD)测定荧光。
基于结合FACS数据及序列分析，自免疫库及合成源鉴别总共一百种LRP5/LRP6交叉反应性VHH家族/群集(cluster)。其代表性实例藉由其序列进一步显示且限定于下文中。在大肠杆菌中表达VHH且加以纯化。以防大肠杆菌中的表达被证明不足，VHH产生于毕赤酵母中。VHH的表达及纯化的简要说明进一步报导于下文中。
VHH在大肠杆菌中的一般表达：
将编码序列克隆于pAX100表达载体中且在大肠杆菌中表达为c-Myc六组氨酸标记的蛋白质。使含有相关VHH构建体的大肠杆菌TG-1细胞在摇瓶中在补充有卡那霉素且藉由添加1mM IPTG以诱导表达的TB培养基中生长(37℃，250rpm)。旋转细胞培养物之后，藉由冷冻-解冻粒状沉淀且再悬浮于dPBS中来制备周质提取物。
VHH在甲醇(P.)酵母中的一般表达：
将编码序列克隆于pAX159表达载体中且在毕赤酵母中表达为c-Myc六组氨酸标记的蛋白质。使含有相关VHH构建体的毕赤酵母X-33细胞在BGCM(缓冲甘油复合培养基；Invitrogen)中生长(30℃，250rpm)。在第三天，将培养基切换为BMCM(缓冲甲醇复合培养基；Invitrogen)且使培养物进一步生长且藉由添加0.5vol％甲醇(100％)对培养物进行定期诱导。旋转细胞培养物之后，收集上清液(含有经分泌的VHH)。
VHH纯化：
在Tecan EVO150上藉由固定金属亲和性层析(RoboColumns 100ul NickelSepharoseTM 6FF,Atoll)纯化六组氨酸标记的VHH，自具有250mM咪唑的柱洗脱且随后经dPBS去盐。藉由SDS-PAGE和/或蛋白质印迹使用抗Myc及抗VHH检测检验VHH的纯度及完整性。
实施例4：纯化单价VHH的体外表征
VHH筛选之后，藉由使用如下文所述的若干功能性及生物物理学分析来表征对表达LRP5及LRP6的细胞具有高亲和力的纯化VHH：
4.1 LRP5及LRP6结合效能及交叉反应性：基于FACS的DKK1竞争分析
在LRP5/LRP6交叉反应性单价VHH的表征期间，观测到结合FACS分析中所获得的数据未必总是与Wnt1及Wnt3a报导分析中所观测到的效能相关，其最可能归因于VHH中的一些的快速解离速率。因此，需要确立此另外分析(亦即DKK1竞争FACS)，经证明，其对于选择性及结合效能测定及LRP5与LRP6结合之间的对比为较可信赖的。目标在于选择以相似效能结合至LRP5及LRP6的功能性VHH，以便在同一浓度下达成对两种受体的阻断。因此，在DKK-1竞争FACS中，经鉴别的Wnt1及Wnt3a功能性VHH的特征如下：
对于基于FACS的DKK1竞争分析而言，使用具有人类LRP5或人类LRP6的稳定过表达的HEK293细胞。以1nM的恒定最终浓度将人类重组DKK1(rhDKK1-R&D Systems，Cat 5439-DK/CF)添加至细胞中。在4℃下在平板震荡器上用rhDKK1及LRP5和/或LRP6结合物稀释液(纯化VHH的1:5连续稀释液)培育细胞1.5小时。用FACS缓冲液洗涤细胞3次之后，在4℃下在平板震荡器上用经生物素标记的山羊抗人类DKK1(R&D Systems，Cat BAF1096)对其培育30分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞3次之后，在4℃下在平板震荡器上于暗处用Streptavidin PE(BD Biosciences，Cat 554061)对其培育30分钟至1小时。用FACS缓冲液洗涤细胞两次，且使用FACS阵列(BD)测定荧光且报导MCF值。
LRP5/LRP6交叉反应性VHH预期与人类DKK1竞争结合至过表达人类LRP5的HEK293，且竞争结合至过表达人类LRP6的HEK293。对比而言，LRP5特异性VHH将与人类DKK1竞争结合至过表达人类LRP5的HEK293细胞，但不会或会以极低效能(>200nM)竞争结合至过表达人类LRP6的HEK293细胞(且反过来，其将适用于LRP6特异性VHH)。作为此实验的结果，可显示，本发明LRP5/LRP6交叉反应性VHH会与人类DKK1竞争结合至过表达人类LRP5的HEK293细胞以及过表达人类LRP6的HEK293细胞(亦即，在所测试的最高浓度下，伴随对应于≤60MCF值的DKK1结合的完全抑制，结合物的浓度增加，MCF值降低)。
4.2物种交叉反应性：小鼠及食蟹猴
为测定LRP5/LRP6交叉反应性VHH的选择组是否能够结合至小鼠来源的LRP5及LRP6及食蟹猴来源的LRP5及LRP6，DKK1竞争FACS进行如下：
在1nM及0.3nM hDKK1(浓度分别低于小鼠及食蟹猴的EC50值)的存在下与稳定表达小鼠LRP5、食蟹猴LRP5、小鼠LRP6或食蟹猴LRP6的HEK293细胞一起培育VHH的连续稀释液。如上所述，使用具有Streptavidin-PE的经生物素标记的抗DKK1抗体检测DKK1与细胞的结合作为第二检测。其结果是，可显示该交叉反应性。
4.3表位分组
对阻断LRP5/LRP6交叉反应性VHH的最强效Wnt1信号传递进行分组实验以鉴别不同表位组。具体而言，使用基于FACS的分析，分析个别VHH与其他经生物素标记的VHH(称为参照VHH)竞争结合LRP5及LRP6受体的能力。在稳定表达人类LRP5或LRP6的HEK293上培育个别VHH以及200pM或500pM经生物素标记的参照VHH的连续稀释液(浓度小于EC50值)。使用streptavidin-PE检测经生物素标记的参照VHH与细胞的结合。与参照VHH竞争结合至LRP5及LRP6的VHH显示使用FACS阵列所测定的荧光降低。
作为这些实验的结果，Wnt1阻断物可分类为三组。对于Wnt3a阻断物而言，VHH的较低亲和力不允许进行表位分组实验。
4.4Wnt1及Wnt3a报导分析
在功能性Wnt1及Wnt3a分析中测试LRP5/LRP6交叉反应性VHH抑制Wnt信号传递的能力。就此而言，也没有确立的方案可用，而是需要尝试若干尝试以确立生物化学功能性分析，诸如Wnt1/Wnt3a-LRP5/LRP6阻断分析：除了重组LRP5及LRP6蛋白质所碰到的困难(参见实施例1)以外，功能性重组Wnt1配体(包括市售)亦不可用。Wnt蛋白质含有诸多保守半胱氨酸且经单不饱和脂肪酸(棕榈油酸)修饰，附接至保守丝氨酸。这些翻译后修饰需要高效信号传递及Wnt分泌。结构性分析显示，含有棕榈油酸脂质的域中的一者需要结合至Frizzled受体，其引起使得Wnt配体与细胞表面上的LRP5及LRP6相互作用的构形变化。因此，结果表明该翻译后修饰需要进行涉及此蛋白质的功能性研究，但同时，该基于脂质的翻译后修饰使得这些蛋白质非常难以表达及纯化(低可溶性)。因此，这变成生物化学分析的主要障碍。
因此，研发出一种基于细胞的功能性分析以表征纯化VHH：Wntβ-内酰胺酶报导基因分析。具体而言，对于Wnt1路径抑制而言，用人类Wnt1转染CellSensor LEF/TCF-blaFreeStyle 293F细胞(Invitrogen,Cat.K1677)，且选择具有人类Wnt1的稳定过表达的克隆。为了测试Wnt3a路径抑制，生成具有人类Wnt3a的稳定过表达的CellSensor LEF/TCF-bla FreeStyle 293F细胞。在Wnt诱导性LEF/TCF启动子的控制下，LEF/TCF-bla FreeStyleTM293细胞株含有β-内酰胺酶报导基因，其稳定地整合于FreeStyleTM293细胞(Invitrogen)中。这些细胞中的Wnt1或Wnt3a的表达因此产生组成性表达，且因此，产生β-内酰胺酶的酶活性。使用LRP5/LRP6交叉反应性功能性VHH的处理因此预期引起对Wnt1及Wnt3a路径的抑制，其引起对β-内酰胺酶酶活性的抑制。
对于该分析而言，将具有Wnt1或Wnt3a的过表达的1E06/ml细胞接种至384孔组织培养物平板中且在37℃下培育过夜。第二天，制备不同LRP5/LRP6交叉反应性VHH溶液的连续稀释液且在LiCl存在下以10nM的最终浓度添加至细胞中。以200nM的最终浓度将DKK1作为阳性对照添加至细胞中。DKK1处理引起对Wnt1及Wnt3a路径的完全抑制，且因此完全抑制β-内酰胺酶酶活性。在37℃下培育细胞过夜。第二天，根据制造商的说明书(Invitrogen,Cat K1085)测定β-内酰胺酶酶活性。对于荧光发射而言，使用标准荧光盘读取器及针对所指示的处理绘制的460/530nm发射率获得460nm及530nm处的值。相对于阳性对照(DKK1；200nM最终浓度)计算功效。
选择具有完全功效及比50nM更优选的效能的总共12个LRP5/LRP6交叉反应性Wnt1阻断物。鉴别出14个大部分具有低效能的交叉反应性Wnt3a阻断物。仅一个Wnt3a阻断物显示良好效能(小于5nM)。
4.5Wnt1及Wnt3a磷酸化分析
随后在Wnt1及Wnt3a依赖性LRP5及LRP6磷酸化分析中测试由Wnt1阻断物的各组引起的最强效及有效性及最强效及有效Wnt3a阻断物。将经编码Wnt1或Wnt3a的表达载体共转染的来自Invitrogen的Cellsensor LEF/TCF293F细胞(cat K1677)用于磷酸化分析中。由于Wnt-Frizzled-LRP5或Wnt-Frizzled-LRP6复合体形成引起LRP5或LRP6磷酸化及后续下游信号传递，因而磷酸化的量化可用于测定该信号传递。为获得LRP5及LRP6特定读出结果，溶解细胞且用(针对两种受体的胞内域的)LRP6或LRP5选择性抗体进行免疫沉淀。在蛋白质印迹中，使用多克隆抗磷酸LRP6(Ser1490)抗体(细胞信号传递技术)检测经磷酸化的LRP6或LRP5，该抗体检测LRP6及LRP5磷酸化蛋白质。以10nM至100nM的最终浓度测试纯化Wnt1及Wnt3a阻断VHH的选择组，其含有来自各组的至少一个代表性VHH。具体而言，在细胞溶解及LRP5及LRP6免疫沉淀前在阻断VHH存在下培育细胞过夜。相对于阳性对照(DKK1，最终浓度为1μM)，经由量化蛋白质印迹带来计算阻断LRP5及LRP6磷酸化中Wnt1及Wnt3a阻断VHH的功效。
4.6生物物理学表征
如实施例3中所报导，针对在大肠杆菌中及在毕赤酵母中的表达及纯化进一步表征LRP5/LRP6交叉反应性VHH。具体而言，若单价主组(lead panel)VHH的表达产量超过0.1mg/L，则其视为可接受的。所选LRP5/LRP6交叉反应性VHH在大肠杆菌中显示介于0.1mg/L与8.2mg/L之间的表达量且在毕赤酵母中较高(>1mg/L)。藉由SDS-PPAGE分析评估表达。
在基于荧光的热位移分析(TSA)中使用Lightcycler(Roche)测定单价LRP5/LRP6交叉反应性VHH的热稳定性。在Sypro橙(Sypro Orange)存在下在不同pH值下培育VHH且施用温度梯度。热诱导的去折叠后，Sypro橙所结合的蛋白质的疏水片(hydrophobic patch)暴露，引起荧光强度增加(Ex/Em＝465/580nm)。荧光强度曲线的第一导数的反曲点充当熔融温度(Tm)的量度。对于所有VHH而言，Tm随pH增加而增加且在pH 6下稳定，其为针对VHH所发现的典型Tm型样。针对LRP5/LRP6交叉反应性Wnt1阻断物VHH及Wnt3a阻断物VHH，在pH 7下获得82℃的平均值。
藉由分析性尺寸排阻层析法(SEC)研究可能出现的LRP5及LRP6VHH的聚集及多聚化。为此目的，经由Dionex Ultimate 3000装置在Agilent SEC-3柱上注入呈0.5mg/mL的8μg纯化VHH样本。将L-精氨酸缓冲液(10mM磷酸盐、300mM Arg-HCl，pH 6.0)用作移动相且施加1mL/min的流动速率。LRP5/LRP6VHH中无一者在SEC分析期间显示严重的聚集问题：曲线指示大部分样本的超过95％的单体。
实施例5：半衰期延长的双互补位构建体的产生及表征
LRP5/LRP6交叉反应性Wnt1及Wnt3a VHH用作构筑嵌段以产生如图1中所描绘的双互补位构建体。与血清白蛋白结合VHH的基因融合用作半衰期延长方法。三个构筑嵌段(Wnt1阻断物、Wnt3a阻断物及白蛋白结合物)经由柔性接头连接。如实施例3中所述，在毕赤酵母中产生VHH且加以纯化。根据如例如WO2012/131078中所报导的标准程序，在毕赤酵母表达载体pAX159中克隆所得构建体，亦即双互补位、半衰期延长的LRP5/LRP6交叉反应性VHH构建体，其呈C末端cMyc六组氨酸标记的VHH构建体形式。探索构筑嵌段的不同定向及不同接头，特别GS接头。基于反映LRP6中潜在Wnt1与Wnt3a结合位点之间的延长的表面积的模型化数据(亦即，并非非常接近于β-螺旋桨3的β-螺旋桨1及β-螺旋桨2)选择相对较长GS接头。藉由将人类血清白蛋白/HSA结合VHH置放于中间，在组合Wnt1及Wnt3a报导分析中获得关于效能的最佳结果。使用35个GS接头，且以优选次序排列Wnt1及Wnt3a VHH阻断物。
为了选择最佳VHH结合物及结合物组合，生成文库，其中人类血清白蛋白(HSA)结合VHH置放于LRP5/LRP6Wnt1-Wnt3a阻断物之间。具体而言，将在Wnt1或Wnt3a分析(报导分析及磷酸化分析)中具有高效能及功效的高亲和力结合物的组用于库中以产生如图1中所描绘的经设计的半衰期延长的双互补位构建体。在毕赤酵母中表达(如实施例3中所报导)接着纯化之后，随后在Wnt1及Wnt3a报导分析(描述于实施例4中)中在30μM HSA存在下以三个稀释度(1/100、1/1000、1/7000)筛选半衰期延长的双互补位构建体，以评定功效及相对效能。一般而言，在Wnt1及Wnt3a报导分析中的数据之间观测到良好相关性且诸多格式测定到高功效。考虑报导分析中的功效及Wnt1及Wnt3a阻断物的多样性，选择总共11个半衰期延长的双互补位LRP5及LRP6构建体以进行进一步表征。此进一步表征分析描述于下文中。
Wnt1/Wnt3a报导分析：
在30μM HSA最终浓度的存在下，如实施例4.4中所述进行Wnt1及Wnt3a报导分析。以12个稀释度，自2.5μM开始测试纯化双互补位LRP5/LRP6构建体。
如下表IV中所示，在报导分析中，大多数构建体显示介于1.7nM与0.16nM之间的高效能及完全功效。其中所述的个别Wnt1及Wnt3a抑制VHH域的序列提供于下表V中：
表IV：在HSA存在下在报导分析中所选半衰期延长的双互补位LRP5/LRP6交叉反应性VHH构建体的效能及功效
表V：表IV中所述VHH域的序列
(附注：此表V中所述的分子包括myc-六组氨酸标记(带下划线)，使得可较易于进行经重组表达的多肽的纯化；此标记无需且通常不会干扰分子与其靶向物的结合)
实施例6：VHH及VHH构建体的序列最佳化
序列最佳化为其中使亲本序列突变以使其与人类IGHV3-IGHJ种系共有序列一致的方法。举例而言，以应保留蛋白质结构、活性及稳定性的方式将框架区中的特异性氨基酸(除所谓标志(hallmark)残基之外)换为其人类对应物。
这些突变可分类如下：
1.标准：预期这些位置的序列最佳化不会显著改变VHH的稳定性或活性或亲和力，且其由此均同时改变，产生基本变体。
2.特有：并不知晓这些位置的序列最佳化是否影响VHH的稳定性或活性或亲和力，且因此在基本变体基础上单独对其进行研究。
已知标志残基对于VHH的稳定性、活性及亲和力至关重要且因此不进行突变。
此外，以使得PTM位点失活同时蛋白质结构、活性及稳定性应保持完好的方式，改变实验证明对翻译后修饰(PTM)敏感的CDR中所存在的氨基酸。针对抗体所描述的最常见翻译后修饰及VHH列于下表VI中。在加速应激研究中分析翻译后修饰的VHH的敏感度，其应用若干标准条件，包括用以分析甲硫氨酸氧化反应的H2O2处理、高温、高pH及研究天冬酰胺脱酰胺及天冬氨酸异构化的长时间储存。根据标准程序测定氧化反应、脱酰胺及异构化的百分比且与参考样本(在-20℃下储存的VHH)进行比较。进行逆相层析(RPC)中的整个蛋白质分析及使用质谱(MS)的肽映射以鉴别潜在敏感的残基。在应激测试之后在VHH中观测到翻译后修饰的情况下，相应氨基酸发生突变。
表VI：可能存在的翻译后修饰及可能触发其的基序
基序 修饰
M Met氧化
N-S/G/H/N/A Asn脱酰胺
D-S/G/H Asp异构化
N-X-S/T-X(X≠P) Asn糖基化
Q/E 焦谷氨酸盐
因此，将若干突变引入以上所述的构建体中，产生包括上表III中所示的三个构建体，其经选择以进行进一步体外及体内表征，如下文实施例中进一步阐述。
实施例7：三个半衰期延长的双互补位LRP5/LRP6交叉反应性VHH构建体的体外表征；与其他LRP6结合分子的对比
在VHH序列最佳化之后，重组表达且纯化三个半衰期延长的双互补位LRP5/LRP6交叉反应性VHH构建体，且藉由使用如下文所述的若干功能性及生物物理学分析对其进行表征。
7.1FACS结合分析
如图3A及图3B中所报导，藉由FACS分析在细胞上测定与人类LRP5及LRP6的结合。具体而言，在具有人类LRP5的稳定过表达的HEK293细胞上测试与人类LRP5的结合。对于人类LRP6结合而言，使用具有人类LRP6的稳定过表达的HEK293细胞。在4℃下在平板震荡器上用LRP5及LRP6结合物稀释液(与图3A及图3B中所指示的最终浓度相对应的结合物的1:5连续稀释液)培养细胞1.5小时。在用FACS缓冲液(1×PBS(Invitrogen目录号141190-094)+10％FBS(Sigma目录号F7524)+0.05％叠氮化钠)洗涤细胞5次之后，在4℃下用结合至VHH的框架区的多克隆小鼠抗体培育所述细胞1小时。在用FACS缓冲液洗涤细胞3次之后，在4℃下用经标记的二抗(抗小鼠PE(115-116-071)培育细胞1小时，随后进行用FACS缓冲液洗涤3次的步骤。使用FACS阵列(BD)测定荧光。在所测试的最高浓度下，与人类LRP5及LRP6的结合与≥600MCF值相对应。阴性对照由非靶向结合物(结合至HEK293细胞中并未表达的细菌性蛋白质的VHH构建体)组成。如图3A及图3B中所示，分别在三个半衰期延长的双互补位LRP5/LRP6交叉反应性VHH构建体的最高测试浓度下，与人类LRP5及LRP6的结合分别与≥600MCF值及≥1600MCF值相对应。这些数据证实，经格式化的、双互补位且经序列最佳化的结合分子在细胞分析系统中结合至呈其天然构形的人类LRP5及人类LRP6两者。结合至hLRP5及hLRP6的EC50值报导于下表VII中。
表VII：藉由FACS结合分析测定的结合至人类LRP5及LRP6的EC50值
7.2FACS-DKK1竞争分析
使用如实施例4.1中所述的基于FACS的DKK1竞争分析进一步分析三个LRP5/LRP6交叉反应性VHH构建体的效能及功效。用LRP5/LRP6交叉反应性VHH构建体的连续稀释液(与图4A及图4B中所指示的最终浓度相对应的1:5连续稀释液)培育具有人类LRP5或人类LRP6的稳定过表达的HEK293细胞。如图4A及图4B中所示，LRP5/LRP6交叉反应性VHH分别与人类DKK1竞争结合至过表达人类LRP5的HEK293细胞以及过表达人类LRP6的HEK293细胞。在最高测试浓度(≥10nM)下达成DKK1结合的完全抑制且与≤60的MCF值相对应。对比而言，LRP5特异性VHH将与人类DKK1竞争结合至过表达人类LRP5的HEK293细胞，但不会或会以极低效能(>200nM)结合至过表达人类LRP6的HEK293细胞(且反过来，其将适用于LRP6特异性VHH)。作为此实验的结果，可显示，本发明LRP5/LRP6交叉反应性VHH会与人类DKK1竞争结合至过表达人类LRP5的HEK293细胞以及过表达人类LRP6的HEK293细胞(亦即，在所测试的最高浓度下，伴随对应于≤60MCF值的DKK1结合的完全抑制，结合物的浓度增加，MCF值降低)。针对三个LRP5/LRP6交叉反应性VHH构建体的与hLRP5及hLRP6的结合的DKK1竞争的IC50值报导于下表VIII中。这些数据证实三个LRP5/LRP6交叉反应性VHH构建体与人类LRP5及人类LRP6的结合且显示两种受体之间的极相似亲和力(藉由DKK1竞争分析中的IC50效能值限定)。此外，该数据强化了经格式化、双互补位且经序列最佳化的结合分子结合至呈其天然构形的人类LRP5以及人类LRP6的观点。
表VIII：藉由FACS结合分析测定的结合至人类LEP5及LRP6的DKK1竞争的IC50值
7.3组合Wnt1及Wnt3a报导分析
使用组合Wnt1及Wnt3a报导分析来分析经格式化、双互补位且经序列最佳化的结合分子的效能及功效以允许在同一分析中对Wnt1及Wnt3a阻断物进行功能性测试。组合Wnt1及Wnt3a报导分析基于实施例4.4中所述的分析，并伴随方案中的以下变化。在500ng/ml的最终浓度下用重组人类Wnt3a(重组人类Wnt3a：R&D#5036-WN/CF)处理接种至384孔组织培养物平板中的具有Wnt1的过表达的1E06/ml细胞，且随后在37℃下培育细胞过夜。第二天，制备不同LRP5/LRP6双互补位交叉反应VHH溶液的连续稀释液且在LiCl存在下以10nM的最终浓度添加至细胞中。以200nM的最终浓度将DKK1作为阳性对照添加至细胞中。DKK1处理引起对组合Wnt1及Wnt3a路径的完全抑制，且因此完全抑制β-内酰胺酶酶活性。在37℃下培育细胞过夜。第二天，根据制造商的说明书测定β-内酰胺酶酶活性。如实施例4.4.中所报导，对于荧光发射而言，使用标准荧光盘读取器及针对所指示的处理绘制的460/530nm发射率获得460nm及530nm处的值。藉由用阳性对照(DKK1；200nM最终浓度)的处理测定，图5A中报导为”基线”的荧光比[460/535nm]的值与Wnt1及Wnt3a路径的完全抑制相对应。由Wnt1过表达细胞(亦即，不经重组人类Wnt3a处理)测定，报导为”Wnt1”的荧光比[460/535nm]的值仅与Wnt1路径的活化相对应。藉由用重组人类Wnt3a对Wnt1过表达细胞进行的处理测定，报导为”Wnt1+Wnt3a”的荧光比[460/535nm]的值与Wnt1及Wnt3a路径的组合活化相对应。如图5A中所示，藉由用三个LRP5/LRP6交叉反应性、经格式化、双互补位且经序列最佳化的结合分子处理，完全抑制得以达成(亦即，与基线相对应的荧光比[460/535nm])。此外，如下表IX中所示亦藉由IC50值报导高效能。
表IX：组合Wnt1及Wnt3a报导分析中Wnt1及Wnt3a路径抑制的IC50值
随后，将LRP5/LRP6交叉反应性、经格式化、双互补位且经序列最佳化的结合分子的效能及功效与先前揭示的WO2011/138391及WO2011/119661中所报导的LRP6结合分子进行比较：
在WO2011/138391中，揭示了结合至LRP6且抑制螺旋桨1(例如，Wnt1)及螺旋桨3(例如，Wnt 3)的多价抗体。这些多价LRP6结合抗体为由作为第一受体结合域的IgG抗体及作为第二受体结合域的scFv片段组成的双互补位LRP6结合分子，其中IgG抗体与scFv片段藉由接头连接在一起。在WO2011/138391中，据报导，所有LRP6结合分子在Wnt1及Wnt3a报导分析(WO2011/138391的图18)中均具有大致相同的效能。因此，可选择那些多价LRP6结合分子中的任一者用于比较实验。因此，决定使用”901”构建体(称为MOR08168IgG1LALA6475scfv；也展示于WO2011/138391的图27中)作为第一比较化合物。
此”901”构建体的衍生物展示于WO2013/067355中。具体而言，揭示了命名为801T及802T的化合物(参见该说明书的第132页上的揭示内容)，所述化合物具有两个LRP6结合scFv域，加上一个半衰期延长部分。由于801T及802T呈现具有相同体外效能及生物物理学特征，因此下文中所述的实验中仅包括其中的一者——变体802T。
在WO2011/119661中，揭示了结合至LRP6且藉由多种Wnt同种型抑制信号传递的双特异性抗体。这些双特异性抗LRP6抗体结合至LRP6的两个不同区域且抑制藉由Wnt同种型，特别Wnt1及Wnt3a诱导的信号传递。杵臼结构工程改造(Atwell等人“Stable heterodimersfrom remodeling the domain interface of a homodimer using a phage displaylibrary”.J Mol Biol.1997；270(1):26-35)用于构建这些双特异性抗LRP6抗体。WO2011/119661的实施例11揭示一种具有YW211.31.62及YW210.09重链异二聚体的IgG杂交体。因此，出于比较目的，使用杵臼结构工程改造技术，亦即用经工程改造的氨基酸变化在YW210.09的重链的CH3上形成杵，且在YW211.31.62的重链的CH3上形成臼或反之亦然而产生具有YW211.31.62及YW210.09重链异二聚体的两个双特异性IgG杂交抗体，且所述抗体在本文中分别称为Knob HC YW210.09及Knob HC YW211.31.62。在根据实施例4.4的Wnt1及Wnt3a报导分析中表征这些两个构建体。如所预期，具有YW211.31.62及YW210.09重链异二聚体的两个双特异性IgG杂交体在Wnt1及Wnt3a分析中显示相似效能，如下表X中所报导。因此，针对下文进一步展示的比较实施例，选择Knob HC YW210.09作为第二比较化合物。
表X：Wnt1及Wnt3a报导分析中Wnt1及Wnt3a路径抑制的IC50值
使用组合Wnt1及Wnt3a报导分析，将半衰期延长的双互补位LRP5/LRP6交叉反应性VHH构建体的效能及功效与MOR08168IgG1LALA 6475scfv双互补位LRP6结合分子、Knob HCYW210.09双特异性抗LRP6分子及802T双特异性抗LRP6分子进行比较。如图5B中所示，与LRP5/LRP6交叉反应性、经格式化、双互补位且经序列最佳化的结合分子F013500571类似，藉由用Knob HC YW210.09(具有YW211.31.62及YW210.09重链异二聚体的双特异性IgG杂交抗体)处理会达成完全抑制(亦即，与图5B中的基线相对应的荧光比[460/535nm])。然而，如下表XI中所报导，F013500571显示较高效能。取而代之，MOR08168IgG1LALA 6475scfv及802T双互补位LRP6结合分子显示缺乏对Wnt1及Wnt3a的完全抑制(亦即分别在图5B及图5C中，荧光比[460/535nm]显著高于基线)。这些数据指示，当相较于F013500571时，MOR08168IgG1LALA 6475scfv及802T双互补位LRP6结合分子在Wnt1及Wnt3a路径抑制中具有显著较低功效。因此，选择Knob HC YW210.09作为如下文进一步描述的体内实验(实施例9；体内功效)的比较化合物。
表XI：组合Wnt1及Wnt3a报导分析中Wnt1及Wnt3a路径抑制的IC50值
实施例8：三个半衰期延长的双互补位LRP5/LRP6交叉反应性VHH构建体对癌细胞株中的Wnt信号传递及存活率的作用
如先前所述，使用具有活性Wnt信号传递的癌细胞株进一步表征半衰期延长的双互补位LRP5/LRP6交叉反应性VHH构建体抑制活性Wnt信号传递的能力(Bafico等人“Anautocrine mechanism for constitutive Wnt pathway activation in human cancercells”.Cancer Cell 2004；6(5):497-506；DeAlmeida等人“可溶性wnt受体Frizzled8CRD-hFc抑制体内畸胎瘤的生长”.Cancer Res.2007；67(11):5371-9)；Akiri等人“包括自分泌Wnt活化的Wnt路径畸变以高频率出现在人类非小细胞肺癌中”.Oncogene.2009；28(21):2163-72)。简言之，将具有活性Wnt信号传递的癌细胞株PA-1及PA-TU-8988S接种于12孔平板中且以1μM的最终浓度用LRP5/LRP6交叉反应性VHH构建体处理两天。藉由抑制轴蛋白2，内源Wnt靶基因的mRNA表达来检测抑制Wnt信号传递的能力。使用标准RNA技术进行qPCR表达分析：根据由QIAGEN提供的方案使用QIAGEN RNeasy Mini Kit进行RNA分离；使用SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit(Invitrogen,目录号11754050)进行cDNA合成；且使用具有轴蛋白2TaqMan引子/探针(Hs00610344_m1AXIN2FAM，Life Technologies)及真核18s内源对照VIC-MGB(4319413E-1307061，Applied Biosystems)的TaqMan基因表达分析进行qPCR。
如图6A中所示，当与未经处理(对照)细胞相比时，用三个半衰期延长的双互补位LRP5/LRP6交叉反应性VHH构建体处理的PA-TU8988S及PA-1癌细胞显示显著降低的轴蛋白2相对mRNA水平(亦即标准化为内源对照)。这些数据显示半衰期延长的双互补位LRP5/LRP6交叉反应性VHH构建体抑制具有活性Wnt信号传递的癌细胞株中的Wnt信号传递的能力。此外，在PA-TU8988S及YAPC癌细胞株中研究Wnt信号传递阻断对细胞存活率的影响，先前已报导所述癌细胞株的增殖视活性Wnt信号传递而定(Jiang等人“RNF43的失活突变赋予胰管腺癌中的Wnt依赖性”.Proc Natl Acad Sci U S A.2013；110(31):12649-54)。在用半衰期延长的双互补位LRP5/LRP6交叉反应性VHH构建体(最终浓度为1μM)或用比较化合物802T(最终浓度为1μM)处理十天后，藉由进行Alamar Blue分析(Invitrogen,目录号DAL1100)测定细胞存活率。如图6B中所示，当与未经处理(对照)细胞比较时，用三个半衰期延长的双互补位LRP5/LRP6交叉反应性VHH构建体处理的PA-TU8988S癌细胞显示显著降低的活细胞百分比(降低≥75％)。用802T处理后，未检测到对细胞存活率的影响(图6B，右小图)。这些数据证明半衰期延长的双互补位LRP5/LRP6交叉反应性VHH构建体抑制视活性Wnt信号传递而定的癌细胞的细胞增殖的能力，且当与802T比较时，其亦显示这些构建体的优良作用。
此外，如上所述，在PA-TU8988S(图6C)及YAPC(图6D)癌细胞株中，与802T相比较来评定F013500571的细胞存活率的剂量依赖性。在用F013500571处理后检测细胞存活率的剂量依赖性降低。对比而言，在用比较化合物802T处理后，未在PA-TU8988S及YAPC癌细胞株中显示对细胞存活率的影响。这些数据显示，当与802T比较时，半衰期延长的双互补位LRP5/LRP6交叉反应性VHH构建体具有优良作用。
实施例9：体内功效
在经Wnt驱动的肿瘤模型中体内进一步表征LRP5/LRP6交叉反应性双互补位半衰期延长的VHH构建体/结合分子。进行实验以测定这些结合分子是否抑制体内肿瘤生长。亦使用同一经Wnt驱动的肿瘤模型来测定比较化合物Knob HC YW210.09的功效。使用小鼠乳腺肿瘤病毒LTR增强子(MMTV启动子)的Wnt配体的转基因表达在小鼠中引起大面积的乳腺管增生，之后在6个月大的转基因(TG)小鼠中引起乳腺癌。这些乳腺肿瘤藉由Wnt配体的糖皮质激素诱导性过表达驱动且具有与TNBC肿瘤类似的特征，包括上皮及间叶细胞标记的表达(基底样表型)及如藉由细胞内β-联蛋白定位评定的活性Wnt信号传递。具体而言，衍生自MMTV-Wnt-1转基因小鼠的乳腺肿瘤为Wnt1依赖性的。实际上，使用包含融合至人类Fc域(F8CRDhFc)的Frizzled8富含半胱氨酸的域(CRD)的可溶性Wnt受体阻断Wnt活性(DeAlmeida等人“可溶性wnt受体Frizzled8CRD-hFc抑制体内畸胎瘤的生长”.CancerRes.2007；67(11):5371-9)据报导会抑制体内肿瘤生长。因此，在功效实验开始的前，在裸小鼠中将自MMTV-Wnt1转基因小鼠分离的肿瘤以肿瘤块形式皮下传代持续2代至5代。在植入后14天至21天之间，当肿瘤达至大约150mm3至250mm3的平均体积时，将小鼠随机分入组(每组7只小鼠)中且静脉内施用化合物。每周两次向小鼠静脉内施用LRP5/LRP6交叉反应性双互补位半衰期延长的VHH构建体，其中F013500571的剂量展示于图7A中且F013500720的剂量展示于图7B中。还每周两次静脉内施用比较化合物Knob HC YW210.09，但归因于上文所解释的体外实验中经此化合物获得的数据，要在较高剂量，亦即30mg/kg及45mg/kg(图7C)下施用。在功效实验期间监测肿瘤体积及体重，且中值肿瘤体积报导于图7A至图7C中。在功效实验结束时测定肿瘤生长抑制(TGI)。具体而言，与对照组(在图7A及图7B中所展示的实验中，用组氨酸缓冲液——20mM组氨酸pH6.5缓冲液处理小鼠；或针对图7C中所示的实验用柠檬酸盐缓冲液处理小鼠)相比较测定各处理组的TGI。此外，在功效实验结束时进行胃肠道(GI)组织病理学分析(经由对十二指肠至直肠的部分进行H&E染色)以评估LRP5及LRP6拮抗剂的潜在毒性。在表XIIA、表XIIB及表XIIC中，报导各处理组的肿瘤生长抑制(TGI)、体内功效研究结束时的GI组织病理学分析的结果、对应于归因于显著体重减轻(相较于功效实验的起始体重，体重减轻>18％)而需要处死的小鼠数目的死亡率及肿瘤消退数目(实验结束时的肿瘤体积小于在处理开始时测定的肿瘤体积)，其分别与也显示于图7A、图7B及图7C中的实验及数据有关。
表XIIA：每周两次静脉内施用的F013500571的体内功效。此实验结果亦展示于图7A中
表XIIB：每周两次静脉内施用的F013500720的体内功效。此实验结果亦展示于图7B中
表XIIC：每周两次静脉内施用的杵HC YW210.09的体内功效。此实验结果亦展示于图7C中
如根据图7A至图7C及上表XIIA至表XIIC可得出，使用LRP5/LRP6交叉反应性半衰期延长的双互补位VHH构建体(在2×/周日程中，F013500571以4mg/kg及10mg/kg且F013500720以1mg/kg)的处理实际上引起肿瘤消退(亦即与肿瘤缩小相对应的肿瘤生长抑制(TGI)>100％；功效实验结束时的肿瘤体积相较于实验开始时的肿瘤体积降低)，而在GI组织病理学分析之后未报导显著体重变化(<10％)且并无发现。重要的是，与此相反，在用LRP6特异性结合物Knob HC YW210.09处理后，即使在最大可施用的静脉内剂量/日程下在小鼠中仍未可观测到肿瘤消退，该最大可施用的静脉内剂量/日程与90mg/kg及3×/周日程相对应。
为了进一步研究如以上所解释的实验中观测到的体内功效的差异，设定允许向小鼠进行甚至更高剂量的比较化合物的较频繁施用(3次/周)的另一实验。简言之，为了达成该较高暴露，如下表XIID中所指示，腹膜内施用比较化合物：
表XIID：如所指示，每周两次或3次腹膜内施用的Knob HC YW210.09的体内功效
如根据表XIID中所示的数据可见，在此设定中，就TGI而言，也未获得显著较强作用。换言之，这些实验、数据及结果清楚地指示当与Knob HC YW210.09比较时半衰期延长的双互补位VHH构建体的较高功效，及本发明的多肽不仅减慢肿瘤生长，还甚至诱导肿瘤缩小的前所未有的能力。当然，肿瘤缩小(亦即肿瘤消退)为癌症患者的治疗的所需治疗性作用(亦即功效)。实际上，诱导引起病理性完全反应(pCR)的肿瘤消退的临床研究治疗在高度未被满足医疗需求的适应症中(诸如在乳腺癌中)积极地导致无进展存活期及总存活期的显著改善。
以上比较实施例还显示LRP5/LRP6交叉反应性双互补位半衰期延长的VHH构建体不仅就其结合特征，诸如亲和力或KD值而言为卓越的，且其在体内环境中也具有高度有利及卓越特性。
随后，研究化合物MOR08168IgG1LALA 6475scfv是否可提供相似的有利作用。出于此目的，在小鼠中如下进行体内耐受性研究：以3mg/kg，每周两次(2qw)(与WO2011/138391中的异种移植肿瘤模型中，如其中图22中所述，检测体内功效的剂量/疗程相同)静脉内施用MOR08168IgG1LALA 6475scfv化合物。在第1天使用MOR08168IgG1LALA 6475scfv进行首次处理，且自第6天开始，在小鼠中检测到显著体重减轻。在第10天，用MOR08168IgG1LALA6475scfv化合物处理的小鼠中的一些显示显著体重减轻(>10％)。在第11天处死小鼠，且胃肠道(GI)组织病理学分析显示在小鼠的结肠及盲肠中具有腐蚀作用的炎症。这些数据表明MOR08168IgG1LALA6475scfv在有效剂量/疗程下并不具有耐受性。因此，LRP5/LRP6交叉反应性双互补位半衰期延长的VHH构建体在治疗窗方面为卓越的；亦即其诱导肿瘤消退而在GI组织病理学分析之后未报导显著体重变化(<10％)且并无发现。
实施例10：体内Wnt路径抑制
为进一步表征LRP5/LRP6交叉反应性双互补位半衰期延长的VHH构建体/结合分子对Wnt信号传递的作用，在实施例9中所述的功效实验结束时分离肿瘤。具体而言，在最后一次注射化合物或对照治疗之后16小时分离肿瘤。如实施例8中所述分析，藉由降低肿瘤中轴蛋白2的mRNA表达测定Wnt信号传递抑制。针对F013500571的体内功效，轴蛋白2mRNA表达相对于对照组的倍数变化报导于图8A中，针对F013500720的体内功效，其报导于图8B中。各处理组的轴蛋白2mRNA降低的量化报导于下表XIIIA及表XIIIB中。
表XIIIA：藉由用F013500571处理的肿瘤中的轴蛋白2mRNA表达的降低率。数据参考图7A及图8A。
表XIIIB：藉由用F013500720处理的肿瘤中的轴蛋白2mRNA表达的降低率。数据参考图7B及图8B。
如根据图8A及图8B及表XIIIA及表XIIIB可见，相较于对照组，在用LRP5/LRP6交叉反应性结合分子处理的肿瘤中观测到轴蛋白2mRNA表达的显著降低及剂量依赖性降低(特别针对用F013500571的处理)。这些结果表明，LRP5/LRP6交叉反应性结合分子的确能够藉由抑制肿瘤细胞中的Wnt信号传递来抑制肿瘤生长。
实施例11：工业制造方法
11.1发酵：可诱导型启动子的控制下，使上表III及表V中所述的多肽中的任一者表达于不同大肠杆菌菌株，如W3110、TG1、BL21、BL21(DE3)、HMS174、HMS174(DE3)、MM294的细胞质中。此启动子可选自lacUV5、tac、T7、trp、T5、araB。培养基优选根据以下来限定Wilms等人,2001(Wilms,B.,Hauck,A.,Reuss,M.,Syldatk,C.,Mattes,R.,Siemann,M.及Altenbuchner,J.:High-Cell-Density Fermentation for Production of L-N-Carbamoylase Using an Expression System Based on the Escherichia coli rhaBADPromoter.Biotechnology and Bioengineering,73:95-103(2001))；DeLisa等人,1999(DeLisa,M.P.,Li,J.C.,Rao,G.,Weigand,W.A.及Bentley,W.E.:MonitoringGFP-operonfusion protein expression during high cell density cultivation of Escherichiacoli using an on-line optical sensor.Biotechnology and Bioengineering,65:54-64.(1999))或同等者。然而，用如异白氨酸、白氨酸、离氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸及缬氨酸的氨基酸或复合培养基组分，诸如大豆蛋白胨或酵母提取物补充培养基可为有益的。以分批进料模式进行发酵方法。条件：温度30℃至40℃，pH6至7.5，溶解氧保持高于20％。初始C源耗尽之后，用以上所规定的进料培养基(或等效者)补料至培养物中。当发酵罐中的细胞干重达至40g/L至90g/L时，用与所用启动子系统相对应的合适诱导剂(例如IPTG、乳糖、阿拉伯糖)诱导培养物。诱导可以脉冲式完全诱导形式或部分诱导形式藉由历时较长时间将相应诱导剂馈入至发酵罐中来进行。制造阶段应至少持续4小时。藉由碗式离心机、管碗式离心机或盘式堆叠离心机中的离心作用回收细胞，舍弃培养物上清液。
11.2纯化：将大肠杆菌细胞块再悬浮于6倍至8倍量的溶解缓冲液(磷酸盐或Tris缓冲液，pH7至8.5)中。细胞溶解优选藉由高压均质化，随后在碗式、管碗式或盘式堆叠离心机中藉由离心移除细胞碎片来进行。任选地使用0.22μm至10μm滤纸过滤且经由阳离子交换层析(例如Toyopearl II SP-550EC、Toyopearl GigaCap S-650M、SP琼脂糖BB、SP琼脂糖FF或S HyperCelTM)在pH7至8.5下分离含有靶蛋白的上清液。藉由线性增加的NaCl梯度在pH7至8.5下进行洗脱。汇集含有靶蛋白的级分且随后用5mM至10mM DTT培育，以防止藉由游离半胱氨酸残基介导的二聚或聚集。进一步添加0.8M至1M硫酸铵或2M至3MNaCl之后，经由亲水作用层析(例如苯基琼脂糖HP、苯基琼脂糖FF、丁基琼脂糖HP、丁基琼脂糖FF、丁基Toyopearl650(S,M,C)、苯基Toyopearl 650(S,M,C))在pH7至8.5下分离溶液。在5mM DTT存在下在pH7至8.5下藉由线性降低硫酸铵或NaCl梯度进行洗脱。将纯度水平为最小90％的含有靶蛋白的级分汇集且在5mM DTT存在下藉由透滤作用脱盐，随后浓缩至大约5mg/ml。藉由在pH 8.5下用50mM Tris、150mM NaCl、4mM乌洛托品(Cystamin)、10mM CHAPS以1:5至1:20将蛋白质溶液稀释至0.25mg/ml至1mg/ml的最终蛋白质浓度来进行后续再折叠。在室温下在搅拌下培育再折叠溶液12小时至36小时，且随后在pH7至8.5下藉由阳离子交换层析(例如SP琼脂糖FF、SP琼脂糖HP、Toyopearl SP-650(S,M,C))分离。藉由在pH7至8.5下线性增加NaCl梯度进行洗脱。汇集含有单体靶蛋白的级分且经由透滤作用配制于25mM磷酸钠、220mM不含内毒素的海藻糖(pH 7.5)中。藉由过滤对溶液进行灭菌且储存在2℃至8℃下。
实施例12：用于皮下施用的药物配制剂
可选择以上本发明的双互补位多肽构建体中的任一者用于制造针对皮下应用的药物配制剂，其具有如下组成：
原料药：100mg/ml(1至3nmol/ml)
乙酸盐缓冲液：25mM
海藻糖：220mM
Tween-20:0.02％
将原料药配制于具有以上组成的溶液中，进行灭菌且储存在2℃至8℃下。
实施例13：人类中的医药用途
每两周至每四周藉由静脉内输注(剂量为100mg至200mg)将如以上实施例11.2中所制备的溶液施用于有需要的患者，诸如罹患对Wnt信号传递抑制剂敏感的癌症的人类。
实施例14：体外分析中Wnt3a信号传递抑制对藉由树突状细胞释放的促炎性细胞介素的作用
由知情同意的健康供体获得PBMC。人类单核细胞衍生树突状细胞(Mo-DC)如下产生：在补充有50ng/mL GM-CSF及50ng/mL IL-4的X-VIVO培养基中培养PBMC。培养24小时之后，小心地移除上清液且用补充有相同GM-CSF及IL-4的X-VIVO培养基替代。在第四天，小心地移除上清液且仅在LPS存在下或与人类Wnt3a或人类Wnt3a及LRP5/LRP6交叉反应性结合分子组合的X-VIVO培养基替代。在第二天，收集上清液且根据制造商的说明书经由ELISA进行TNF-α的分析。如先前报导(Oderup等人“Canonical and noncanonical Wnt proteinsprogram dendritic cell responses for tolerance”.J Immunol.2013；190(12):6126-34)，且如图9A中所示，Wnt3a直接抑制分化树突状细胞(DC)的促炎性细胞介素分泌(亦即TNF-α释放)。藉由添加LRP5/LRP6交叉反应性结合分子恢复经Wnt3a驱动的对来自DC的TNF-α释放的遏制。
这些数据显示经格式化、双互补位且经序列最佳化的结合分子能够恢复经Wnt3a处理的树突状细胞的TNFα分泌，由此抑制对树突状细胞的Wnt抑制作用。
重要的是要注意，在肿瘤微环境中阻断树突状细胞中的Wnt路径可代表针对破坏肿瘤介导的免疫抑制且加强抗肿瘤免疫性的潜在治疗性方法。
为了研究DC对T细胞(效应子T细胞)的作用，在存在或不存在LRP5/LRP6交叉反应性结合分子的情况下共培养经Wnt3a预处理的DC与T细胞，自PBMC分离，如先前所述(Oderup等人“Canonical and noncanonical Wnt proteins program dendritic cell responsesfor tolerance”.J Immunol.2013；190(12):6126-34)。DC/T细胞共培养3天之后，收集上清液且根据制造商的说明书经由ELISA进行IFNγ的分析。
IFNγ分泌为T细胞活化的标记。如图9B中所示，Wnt3a介导的DC抑制引起T细胞的IFNγ分泌减少(抑制T细胞功能)，藉由用LRP5/LRP6交叉反应性结合分子处理，该分泌得到完全恢复。
总体而言，这些数据显示LRP5/LRP6交叉反应性结合分子遏制对树突状细胞的Wnt抑制作用，使得T细胞功能得到恢复。
已知T细胞的连续活化/刺激会诱导最后分化，产生耗竭的T细胞表型，使得T细胞功能进行性丧失。因此，设想到LRP5/LRP6交叉反应性结合分子对藉由DC的活化介导的T细胞的作用可能会藉由T细胞耗竭受到限制。因此，将LRP5/LRP6交叉反应性结合分子的施用与阻断T细胞耗竭的免疫检查点抑制剂的施用组合的组合治疗预期有助于活化且维持T细胞功能，由此改变肿瘤微环境，且由此证实本发明的分子的治疗性作用。
序列表
<110> 勃林格殷格翰国际有限公司
<120> 在肿瘤细胞中拮抗WNT信号传递的双互补位多肽
<130> P12-0401/WO/1
<160> 47
<170> BiSSAP 1.2
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR1，属于Wnt1-333E06mod
<400> 1
Thr Tyr Thr Val Gly
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2，属于Wnt1-333E06mod
<400> 2
Ala Ile Arg Arg Arg Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3，属于Wnt1-333E06mod
<400> 3
Asp Thr Arg Thr Val Ala Leu Leu Gln Tyr Arg Tyr Asp Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR1，属于Wnt1-333G06
<400> 4
Ser Tyr Ala Met Gly
1 5
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2，属于Wnt1-333G06
<400> 5
Ala Ile Arg Arg Ser Gly Arg Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 6
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3，属于Wnt1-333G06
<400> 6
Ala Arg Arg Val Arg Ser Ser Thr Arg Tyr Asn Thr Gly Thr Trp Trp
1 5 10 15
Trp Glu Tyr
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR1，属于Wnt1-332D03mod
<400> 7
Arg Tyr Thr Met Gly
1 5
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2，属于Wnt1-332D03mod
<400> 8
Ala Ile Val Arg Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 9
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3，属于Wnt1-332D03mod
<400> 9
Asp Arg Arg Gly Arg Gly Glu Asn Tyr Ile Leu Leu Tyr Ser Ser Gly
1 5 10 15
Arg Tyr Glu Tyr
20
<210> 10
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR1，属于Wnt3a-093A01
<400> 10
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1 5
<210> 11
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2，属于Wnt3a-093A01
<400> 11
Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3，属于Wnt3a-093A01
<400> 12
Ser Pro Ile Pro Tyr Gly Ser Leu Leu Arg Arg Arg Asn Asn Tyr Asp
1 5 10 15
Tyr
<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR1，属于Wnt3a-367B10
<400> 13
Ser Tyr Ala Met Gly
1 5
<210> 14
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2，属于Wnt3a-367B10
<400> 14
Ala Ile Ser Trp Arg Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 15
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3，属于Wnt3a-367B10
<400> 15
Asp Pro Arg Gly Tyr Gly Val Ala Tyr Val Ser Ala Tyr Tyr Glu Tyr
1 5 10 15
<210> 16
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR1，属于Alb11
<400> 16
Ser Phe Gly Met Ser
1 5
<210> 17
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2，属于Alb11
<400> 17
Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 18
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3，属于Alb11
<400> 18
Gly Gly Ser Leu Ser Arg
1 5
<210> 19
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH域Wnt1-333E06mod
<400> 19
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Thr Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Arg Arg Arg Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Thr Arg Thr Val Ala Leu Leu Gln Tyr Arg Tyr Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 20
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH域Wnt1-333G06
<400> 20
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Arg Arg Ser Gly Arg Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Arg Arg Val Arg Ser Ser Thr Arg Tyr Asn Thr Gly Thr
100 105 110
Trp Trp Trp Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 21
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH域Wnt1-332D03mod
<400> 21
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Val Arg Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Arg Arg Gly Arg Gly Glu Asn Tyr Ile Leu Leu Tyr Ser
100 105 110
Ser Gly Arg Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 22
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH域Wnt3a-093A01
<400> 22
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Pro Ile Pro Tyr Gly Ser Leu Leu Arg Arg Arg Asn Asn
100 105 110
Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 23
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH域Wnt3a-367B10
<400> 23
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Trp Arg Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Pro Arg Gly Tyr Gly Val Ala Tyr Val Ser Ala Tyr Tyr
100 105 110
Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 24
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH域Alb11
<400> 24
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 25
<211> 435
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH构建体F013500575
<400> 25
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Thr Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Arg Arg Arg Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Thr Arg Thr Val Ala Leu Leu Gln Tyr Arg Tyr Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
145 150 155 160
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu
165 170 175
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met
180 185 190
Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser
195 200 205
Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
210 215 220
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln
225 230 235 240
Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile
245 250 255
Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
260 265 270
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
275 280 285
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
290 295 300
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
305 310 315 320
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr
325 330 335
Phe Ser Ser Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu
340 345 350
Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr
355 360 365
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys
370 375 380
Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala
385 390 395 400
Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Pro Ile Pro Tyr Gly Ser Leu Leu Arg
405 410 415
Arg Arg Asn Asn Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
420 425 430
Ser Ser Ala
435
<210> 26
<211> 439
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH构建体F013500571
<400> 26
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Arg Arg Ser Gly Arg Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Arg Arg Val Arg Ser Ser Thr Arg Tyr Asn Thr Gly Thr
100 105 110
Trp Trp Trp Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
165 170 175
Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
180 185 190
Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
195 200 205
Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala
210 215 220
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr
225 230 235 240
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val
245 250 255
Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr
260 265 270
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
275 280 285
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
290 295 300
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
305 310 315 320
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
325 330 335
Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln
340 345 350
Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Ser Trp Arg Ser
355 360 365
Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
370 375 380
Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
385 390 395 400
Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Pro Arg Gly Tyr
405 410 415
Gly Val Ala Tyr Val Ser Ala Tyr Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
420 425 430
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
435
<210> 27
<211> 440
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH构建体F013500720
<400> 27
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Val Arg Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Arg Arg Gly Arg Gly Glu Asn Tyr Ile Leu Leu Tyr Ser
100 105 110
Ser Gly Arg Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
165 170 175
Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
180 185 190
Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
195 200 205
Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr
210 215 220
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys
225 230 235 240
Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala
245 250 255
Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly
260 265 270
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
275 280 285
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
290 295 300
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
305 310 315 320
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
325 330 335
Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg
340 345 350
Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Ser Trp Arg
355 360 365
Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
370 375 380
Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
385 390 395 400
Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Pro Arg Gly
405 410 415
Tyr Gly Val Ala Tyr Val Ser Ala Tyr Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly
420 425 430
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
435 440
<210> 28
<211> 149
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH域F0129093A01
<400> 28
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Pro Ile Pro Tyr Gly Ser Leu Leu Arg Arg Arg Asn Asn
100 105 110
Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala
115 120 125
Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His
130 135 140
His His His His His
145
<210> 29
<211> 151
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH域F0130333G06
<400> 29
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Arg Arg Ser Gly Arg Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Arg Arg Val Arg Ser Ser Thr Arg Tyr Asn Thr Gly Thr
100 105 110
Trp Trp Trp Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala
130 135 140
Ala His His His His His His
145 150
<210> 30
<211> 148
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH域F0129093A03
<400> 30
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Trp Ser Gly Ser Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Arg Ser Ser Tyr Ala Gly Arg Thr Tyr Tyr Glu Leu Tyr
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala
115 120 125
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His
130 135 140
His His His His
145
<210> 31
<211> 146
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH域F0130333E06
<400> 31
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Thr Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Arg Arg Arg Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Thr Arg Thr Val Ala Leu Leu Gln Tyr Arg Tyr Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Glu Gln
115 120 125
Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His His
130 135 140
His His
145
<210> 32
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH域F0130332D03
<400> 32
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Arg Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Arg Arg Gly Arg Gly Glu Asn Tyr Ser Leu Leu Tyr Ser
100 105 110
Ser Asn Arg Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly
130 135 140
Ala Ala His His His His His His
145 150
<210> 33
<211> 148
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH域F0130367B10
<400> 33
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Trp Arg Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Gly Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Pro Arg Gly Tyr Gly Val Ala Tyr Val Ser Ala Tyr Tyr
100 105 110
Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ala Ala
115 120 125
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His
130 135 140
His His His His
145
<210> 34
<211> 149
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH域F0130378B05
<400> 34
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Arg Arg Val Tyr Ser Thr Leu Pro Pro Thr Thr Ser Arg
100 105 110
Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala
115 120 125
Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His
130 135 140
His His His His His
145
<210> 35
<211> 147
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH域F0130378A04
<400> 35
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Arg Thr Gly Arg Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Arg Arg Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Phe Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Glu
115 120 125
Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His
130 135 140
His His His
145
<210> 36
<211> 150
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH域F0130372C08
<400> 36
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Lys Arg Arg Gly Arg Gly Ser Val Ser Pro Asn Ser Ser Ser
100 105 110
Arg Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120 125
Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala
130 135 140
His His His His His His
145 150
<210> 37
<211> 462
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH构建体F013500016
<400> 37
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Arg Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Arg Arg Gly Arg Gly Glu Asn Tyr Ser Leu Leu Tyr Ser
100 105 110
Ser Asn Arg Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
165 170 175
Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
180 185 190
Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
195 200 205
Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr
210 215 220
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys
225 230 235 240
Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala
245 250 255
Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly
260 265 270
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
275 280 285
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
290 295 300
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
305 310 315 320
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
325 330 335
Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg
340 345 350
Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Ser Trp Arg
355 360 365
Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
370 375 380
Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
385 390 395 400
Arg Pro Glu Gly Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Pro Arg Gly
405 410 415
Tyr Gly Val Ala Tyr Val Ser Ala Tyr Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly
420 425 430
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser
435 440 445
Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His His His His
450 455 460
<210> 38
<211> 463
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH构建体F013500018
<400> 38
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Arg Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Arg Arg Gly Arg Gly Glu Asn Tyr Ser Leu Leu Tyr Ser
100 105 110
Ser Asn Arg Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
165 170 175
Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
180 185 190
Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
195 200 205
Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr
210 215 220
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys
225 230 235 240
Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala
245 250 255
Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly
260 265 270
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
275 280 285
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
290 295 300
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
305 310 315 320
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
325 330 335
Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg
340 345 350
Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Ser Arg Ser
355 360 365
Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
370 375 380
Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
385 390 395 400
Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Arg Arg Val
405 410 415
Tyr Ser Thr Leu Pro Pro Thr Thr Ser Arg Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln
420 425 430
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile
435 440 445
Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His His His His
450 455 460
<210> 39
<211> 461
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH构建体F013500021
<400> 39
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Arg Arg Ser Gly Arg Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Arg Arg Val Arg Ser Ser Thr Arg Tyr Asn Thr Gly Thr
100 105 110
Trp Trp Trp Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
165 170 175
Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
180 185 190
Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
195 200 205
Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala
210 215 220
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr
225 230 235 240
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val
245 250 255
Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr
260 265 270
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
275 280 285
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
290 295 300
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
305 310 315 320
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
325 330 335
Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln
340 345 350
Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Ser Trp Arg Ser
355 360 365
Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
370 375 380
Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
385 390 395 400
Pro Glu Gly Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Pro Arg Gly Tyr
405 410 415
Gly Val Ala Tyr Val Ser Ala Tyr Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
420 425 430
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu
435 440 445
Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His His His His
450 455 460
<210> 40
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH构建体F013500026
<400> 40
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Thr Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Arg Arg Arg Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Thr Arg Thr Val Ala Leu Leu Gln Tyr Arg Tyr Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
145 150 155 160
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu
165 170 175
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met
180 185 190
Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser
195 200 205
Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
210 215 220
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln
225 230 235 240
Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile
245 250 255
Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
260 265 270
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
275 280 285
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
290 295 300
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
305 310 315 320
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr
325 330 335
Phe Ser Ser Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu
340 345 350
Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Ser Trp Arg Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr
355 360 365
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys
370 375 380
Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Gly Thr Ala
385 390 395 400
Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Pro Arg Gly Tyr Gly Val Ala Tyr Val
405 410 415
Ser Ala Tyr Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
420 425 430
Ser Gly Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly
435 440 445
Ala Ala His His His His His His
450 455
<210> 41
<211> 461
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH构建体F013500030
<400> 41
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Arg Arg Val Tyr Ser Thr Leu Pro Pro Thr Thr Ser Arg
100 105 110
Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
165 170 175
Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser
180 185 190
Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
195 200 205
Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser
210 215 220
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu
225 230 235 240
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
245 250 255
Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val
260 265 270
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
275 280 285
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
290 295 300
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
305 310 315 320
Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
325 330 335
Gly Arg Thr Phe Ser Asp Tyr Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro
340 345 350
Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Arg
355 360 365
Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
370 375 380
Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu
385 390 395 400
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Lys Arg Arg Gly Arg Gly Ser
405 410 415
Val Ser Pro Asn Ser Ser Ser Arg Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
420 425 430
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu
435 440 445
Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His His His His
450 455 460
<210> 42
<211> 460
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH构建体F013500032
<400> 42
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Arg Thr Gly Arg Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Arg Arg Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Phe Tyr Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
145 150 155 160
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser
165 170 175
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly
180 185 190
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
195 200 205
Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys
210 215 220
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu
225 230 235 240
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
245 250 255
Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
260 265 270
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
275 280 285
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
290 295 300
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
305 310 315 320
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly
325 330 335
Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
340 345 350
Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Arg Arg Ser Gly Arg Arg Thr Tyr
355 360 365
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
370 375 380
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr
385 390 395 400
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Arg Arg Val Arg Ser Ser Thr Arg
405 410 415
Tyr Asn Thr Gly Thr Trp Trp Trp Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
420 425 430
Val Thr Val Ser Ser Gly Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu
435 440 445
Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His His His His
450 455 460
<210> 43
<211> 462
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH构建体F013500033
<400> 43
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Arg Arg Val Tyr Ser Thr Leu Pro Pro Thr Thr Ser Arg
100 105 110
Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
165 170 175
Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser
180 185 190
Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
195 200 205
Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser
210 215 220
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu
225 230 235 240
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
245 250 255
Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val
260 265 270
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
275 280 285
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
290 295 300
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
305 310 315 320
Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
325 330 335
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro
340 345 350
Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Arg Arg Ser Gly Arg Arg
355 360 365
Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
370 375 380
Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu
385 390 395 400
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Arg Arg Val Arg Ser Ser
405 410 415
Thr Arg Tyr Asn Thr Gly Thr Trp Trp Trp Glu Tyr Trp Gly Gln Gly
420 425 430
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser
435 440 445
Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His His His His
450 455 460
<210> 44
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH构建体F013500039
<400> 44
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Trp Ser Gly Ser Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Arg Ser Ser Tyr Ala Gly Arg Thr Tyr Tyr Glu Leu Tyr
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145 150 155 160
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn
165 170 175
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
180 185 190
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
195 200 205
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val
210 215 220
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr
225 230 235 240
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
245 250 255
Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr
260 265 270
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
275 280 285
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
290 295 300
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
305 310 315 320
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
325 330 335
Arg Thr Phe Ser Thr Tyr Thr Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly
340 345 350
Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Arg Arg Arg Gly Ser Ser Thr
355 360 365
Tyr Tyr Ser Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
370 375 380
Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp
385 390 395 400
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Thr Arg Thr Val Ala Leu Leu
405 410 415
Gln Tyr Arg Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
420 425 430
Ser Gly Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly
435 440 445
Ala Ala His His His His His His
450 455
<210> 45
<211> 463
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH构建体F013500046
<400> 45
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Arg Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Arg Arg Gly Arg Gly Glu Asn Tyr Ser Leu Leu Tyr Ser
100 105 110
Ser Asn Arg Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
165 170 175
Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
180 185 190
Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
195 200 205
Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr
210 215 220
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys
225 230 235 240
Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala
245 250 255
Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly
260 265 270
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
275 280 285
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
290 295 300
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
305 310 315 320
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
325 330 335
Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg
340 345 350
Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Ser Trp Ser
355 360 365
Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
370 375 380
Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
385 390 395 400
Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Pro Ile Pro
405 410 415
Tyr Gly Ser Leu Leu Arg Arg Arg Asn Asn Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
420 425 430
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile
435 440 445
Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His His His His
450 455 460
<210> 46
<211> 457
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH构建体F013500047
<400> 46
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Thr Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Arg Arg Arg Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Thr Arg Thr Val Ala Leu Leu Gln Tyr Arg Tyr Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
145 150 155 160
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu
165 170 175
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met
180 185 190
Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser
195 200 205
Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
210 215 220
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln
225 230 235 240
Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile
245 250 255
Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
260 265 270
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
275 280 285
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
290 295 300
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
305 310 315 320
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr
325 330 335
Phe Ser Ser Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu
340 345 350
Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr
355 360 365
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys
370 375 380
Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala
385 390 395 400
Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Pro Ile Pro Tyr Gly Ser Leu Leu Arg
405 410 415
Arg Arg Asn Asn Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
420 425 430
Ser Ser Gly Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn
435 440 445
Gly Ala Ala His His His His His His
450 455
<210> 47
<211> 462
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH构建体F013500053
<400> 47
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Pro Ile Pro Tyr Gly Ser Leu Leu Arg Arg Arg Asn Asn
100 105 110
Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
165 170 175
Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser
180 185 190
Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
195 200 205
Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser
210 215 220
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu
225 230 235 240
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
245 250 255
Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val
260 265 270
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
275 280 285
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
290 295 300
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
305 310 315 320
Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
325 330 335
Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro
340 345 350
Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Arg Arg Ser Gly Arg Arg
355 360 365
Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
370 375 380
Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu
385 390 395 400
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Arg Arg Val Arg Ser Ser
405 410 415
Thr Arg Tyr Asn Thr Gly Thr Trp Trp Trp Glu Tyr Trp Gly Gln Gly
420 425 430
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser
435 440 445
Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His His His His
450 455 460

Claims (30)

1.一种多肽，其特异性结合至LRP5或LRP6，其包含
-第一免疫球蛋白单一可变域，其选自由包含以下CDR序列而限定的免疫球蛋白单一可变域(i)至(iii)的组：
(i)：
CDR1：TYTVG(＝SEQ ID NO：1)
CDR2：AIRRRGSSTYYADSVKG(＝SEQ ID NO：2)
CDR3：DTRTVALLQYRYDY(＝SEQ ID NO：3)
(ii)：
CDR1：SYAMG(＝SEQ 1D NO：4)
CDR2：AIRRSGRRTYYADSVKG(＝SEQ ID NO：5)
CDR3：ARRVRSSTRYNTGTWWWEY(＝SEQ ID NO：6)
(iii)：
CDR1：RYTMG(＝SEQ ID NO：7)
CDR2：AIVRSGGSTYYADSVKG(＝SEQ ID NO：8)
CDR3：DRRGRGENYILLYSSGRYEY(＝SEQ ID NO：9)
及
-第二免疫球蛋白单一可变域，其选自由包含以下CDR序列而限定的免疫球蛋白单一可变域(iv)及(v)的组：
(iv)：
CDR1：SYAMG(＝SEQ ID NO：10)
CDR2：AISWSGGSTYYADSVKG(＝SEQ ID NO：11)
CDR3：SPIPYGSLLRRRNNYDY(＝SEQ ID NO：12)
(v)：
CDR1：SYAMG(＝SEQ ID NO：13)
CDF2：AISWRSGSTYYADSVKG(＝SEQ 1D NO：14)
CDR3：DPRGYGVAYVSAYYEY(＝SEQ ID NO：15)。
2.权利要求1的多肽，其中
-所述第一免疫球蛋白单一可变域包含以下CDR序列：
CDR1：TYTVG(＝SEQ ID NO：1)
CDR2：AIRRRGSSTYYADSVKG(＝SEQ ID NO：2)
CDR3：DTRTVALLQYRYDY(＝SEQ ID NO：3)
且其中
-所述第二免疫球蛋白单一可变域包含以下CDR序列：
CDR1：SYAMG(＝SEQ ID NO：10)
CDR2：AISWSGGSTYYADSVKG(＝SEQ ID NO：11)
CDR3：SPIPYGSLLRRRNNYDY(＝SEQ ID NO：12)。
3.权利要求1的多肽，其中
-所述第一免疫球蛋白单一可变域包含以下CDR序列：
CDR1：SYAMG(＝SEQ ID NO：4)
CDR2：AIRRSGRRTYYADSVKG(＝SEQ ID NO：5)
CDR3：ARRVRSSTRYNTGTWWWEY(＝SEQ ID NO：6)
且其中
-所述第二免疫球蛋白单一可变域包含以下CDR序列：
CDR1：SYAMG(＝SEQ ID NO：13)
CDR2：AISWRSGSTYYADSVKG(＝SEQ ID NO：14)
CDR3：DPRGYGVAYVSAYYEY(＝SEQ ID NO：15)。
4.权利要求1的多肽，其中
-所述第一免疫球蛋白单一可变域包含以下CDR序列：
CDR1：RYTMG(＝SEQ ID NO：7)
CDR2：AIVRSGGSTYYADSVKG(＝SEQ ID NO：8)
CDR3：DRRGRGENYILLYSSGRYEY(＝SEQ ID NO：9)
且其中
-所述第二免疫球蛋白单一可变域包含以下CDR序列：
CDR1：SYAMG(＝SEQ ID NO：13)
CDR2：AISWRSGSTYYADSVKG(＝SEQ ID NO：14)
CDR3：DPRGYGVAYVSAYYEY(＝SEQ ID NO：15)。
5.权利要求1至4中任一项的多肽，其中所述免疫球蛋白单一可变域为VHH域，且优选为人源化VHH域。
6.权利要求1的多肽，其中
-所述第一免疫球蛋白单一可变域选自具有以下序列的免疫球蛋白单一可变域(i)至(iii)的组：
(i)：
AVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSTYTVGWFRQAPGKEREF
VAAIRRRGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYY
CAADTRTVALLQYRYDYWGQGTLVTVSS
(＝SEQ ID NO：19)，
(ii)：
AVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGTFSSYAMGWFRQAPGKERE
FVAAIRRSGRRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYY
CAAARRVRSSTRYNTGTWWWEYWGQGTLVTVSS
(＝SEQ ID NO：20)，
(iii)：
AVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLTFSRYTMGWFRQAPGKEREF
VAAIVRSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYY
CAADRRGRGENYILL.YSSGRYEYWGQGTLVTVSS
(＝SEQ ID NO：21)，
且其中
-所述第二免疫球蛋白单一可变域选自由具有以下序列的免疫球蛋白单一可变域(iv)及(v)组成的组：
(iv)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKERE
FVAAISWSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVY
YCAASPIPYGSLLRRRNNYDYWGQGTLVTVSS
(＝SEQ ID NO：22)，
(v)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGTFSSYAMGWFRQAPGKERE
FVAAISWRSGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVY
YCAADPRGYGVAYVSAYYEYWGQGTLVTVSS
(＝SEQ ID NO：23)。
7.权利要求1或权利要求2的多肽，其中
-所述第一免疫球蛋白单一可变域具有如SEQ ID NO：19中所示的氨基酸序列，且
-所述第二免疫球蛋白单一可变域具有如SEQ ID NO：22中所示的氨基酸序列。
8.权利要求1或权利要求3的多肽，其中
-所述第一免疫球蛋白单一可变域具有如SEQ ID NO：20中所示的氨基酸序列，及
-所述第二免疫球蛋白单一可变域具有如SEQ ID NO：23中所示的氨基酸序列。
9.权利要求1或权利要求4的多肽，其中
-所述第一免疫球蛋白单一可变域具有如SEQ ID NO：21中所示的氨基酸序列，及
-所述第二免疫球蛋白单一可变域具有如SEQ ID NO：23中所示的氨基酸序列。
10.权利要求1至9中任一项的多肽，其中所述第一免疫球蛋白单一可变域及所述第二免疫球蛋白单一可变域藉由接头肽共价连接，其中所述接头肽任选地包含第三免疫球蛋白单一可变域或由第三免疫球蛋白单一可变域组成。
11.权利要求1至9中任一项的多肽，其中该多肽另外包括半衰期延长部分，其中该半衰期延长部分共价连接至所述多肽且任选地选自由以下组成的组：白蛋白结合部分，诸如白蛋白结合肽或白蛋白结合免疫球蛋白域；转铁蛋白结合部分，诸如抗转铁蛋白免疫球蛋白域；聚乙二醇分子；人类血清白蛋白及人类血清白蛋白的片段。
12.权利要求11的多肽，其中所述半衰期延长部分为白蛋白结合免疫球蛋白单一可变域，且优选为A1b11域，其由SEQ ID NO：24限定。
13.一种多肽，其选自包含或由SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26及SEQ ID NO：27组成的多肽的组。
14.一种核酸分子，其优选呈分离形式，其编码权利要求1至13中任一项的多肽。
15.一种表达载体，其包含权利要求14的核酸。
16.一种宿主细胞，其携带权利要求15的表达载体。
17.一种制造权利要求1至13中任一项的多肽的方法，该方法包含以下步骤
-将权利要求16的宿主细胞在允许表达权利要求1至13中任一项的多肽的条件下培养；及
-回收所述多肽。
18.权利要求17的方法，该方法另外包含以下步骤
-纯化所述多肽。
19.一种药物组合物，其包含(i)权利要求1至13中任一项的多肽作为活性成分，及(ii)药学上可接受的载体，及任选地(iii)稀释剂、赋形剂、佐剂和/或稳定剂。
20.权利要求1至13中任一项的多肽在制备药物中的，其用作治疗、预防或缓解人类或动物的疾病、病症或病状的方法中的药剂。
21.权利要求1至13中任一项的多肽，其用于癌症，优选乳腺癌、肺癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肉瘤、卵巢癌或肝细胞癌的治疗，或用于特发性肺病的治疗，或用于由异常Wnt信号传递引起的视网膜病变的治疗。
22.权利要求1至13中任一项的多肽，其用于三阴性乳腺癌(TNBC)的治疗。
23.权利要求1至13中任一项的多肽，其用于与化学治疗剂、抑制血管生成的治疗活性化合物、信号转导路径抑制剂、EGFR抑制剂、免疫调节剂、免疫检查点抑制剂或激素治疗剂组合。
24.一种治疗剂，该治疗剂选自由以下组成的组：化学治疗剂、抑制血管生成的治疗活性化合物、信号转导路径抑制剂、EGFR抑制剂、免疫调节剂、免疫检查点抑制剂及激素治疗剂，其用于与权利要求1至13中任一项的多肽组合。
25.一种在有需要的患者中治疗癌症或特发性肺病或视网膜病变的方法，包括向所述患者施用有效量的权利要求1至13中任一项的多肽，或权利要求19的药物组合物。
26.一种多肽，其包含
-第一免疫球蛋白结合蛋白，其能够特异性结合至LRP5以及LRP6(LRP5/LRP6交叉反应性)且抑制经Wnt1驱动的靶基因转录，及
-第二免疫球蛋白结合蛋白，其能够特异性结合至LRP5以及LRP6(LRP5/LRP6交叉反应性)且抑制经Wnt3a驱动的靶基因转录。
27.权利要求26的多肽，其中所述第一及所述第二免疫球蛋白结合蛋白为免疫球蛋白单一可变域。
28.一种权利要求1至13、26或27中任一项的多肽的用途，其用于藉由抑制树突状细胞中Wnt1驱动及Wnt3a驱动的靶基因转录而调节肿瘤微环境。
29.一种权利要求1至13、26或27中任一项的多肽，其用于治疗癌症。
30.一种权利要求1至13、26或27中任一项的多肽，其用于与选自由以下组成的组的免疫检查点抑制剂组合：抗PD1抗体、抗PDL1抗体、抗CTLA4抗体、抗BTLA抗体、抗LAG3抗体及抗TIM3抗体，或与癌症疫苗组合来治疗癌症。
CN201680071043.6A 2015-12-04 2016-12-02 在肿瘤细胞中拮抗wnt信号传递的双互补位多肽 Active CN108289943B (zh)

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