UA122079C2 - Поліпептид, що специфічно зв'язується з lrp5 і lrp6 - Google Patents

Поліпептид, що специфічно зв'язується з lrp5 і lrp6 Download PDF

Info

Publication number
UA122079C2
UA122079C2 UAA201807120A UAA201807120A UA122079C2 UA 122079 C2 UA122079 C2 UA 122079C2 UA A201807120 A UAA201807120 A UA A201807120A UA A201807120 A UAA201807120 A UA A201807120A UA 122079 C2 UA122079 C2 UA 122079C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
bek
aia
uai
tut
immunoglobulin
Prior art date
Application number
UAA201807120A
Other languages
English (en)
Inventor
Вітторія Зінзалла
Виттория Зинзалла
Клаус-Петер Кюнкеле
Марі-Анж Бьойсе
Мари-Анж Бьойсе
Карен Кромі
Карен Кроми
Стефані Сталенс
Стефани СТАЛЕНС
Беатрейс Штруббе
Original Assignee
Бьорінгер Інгельхайм Інтернаціональ Гмбх
Бёрингер Ингельхайм Интернациональ Гмбх
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Бьорінгер Інгельхайм Інтернаціональ Гмбх, Бёрингер Ингельхайм Интернациональ Гмбх filed Critical Бьорінгер Інгельхайм Інтернаціональ Гмбх
Publication of UA122079C2 publication Critical patent/UA122079C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Винахід стосується поліпептиду, що специфічно зв'язується з LRP5 і LRP6, що містить перший імуноглобуліновий окремий варіабельний домен та другий імуноглобуліновий окремий варіабельний домен. Також винахід стосується вектора експресії, клітини-хазяїна, способу виробництва поліпептиду, фармацевтичної композиції, що містить поліпептид і фармацевтично прийнятний носій, а також поліпептиду для застосування в лікуванні раку.

Description

Галузь техніки
Даний винахід стосується нових поліпептидів, які зв'язують подібний до рецептора ліпопротеїнів низької щільності білок 5 (І КРБ) і подібний до рецептора ліпопротеїнів низької щільності білок 6 (І КРб). Винахід також стосується нуклеїнових кислот, що кодують такі поліпептиди; способів виготовлення таких поліпептидів; клітин-хазяїв, які експресують або здатні експресувати такі поліпептиди; композицій, що містять такі поліпептиди; а також застосувань таких поліпептидів або таких композицій, зокрема, у терапевтичних цілях в галузі ракових захворювань.
Рівень техніки
Активація сигнального шляху МУУпі вимагає зв'язування позаклітинних МУУпі-лігандів з рецептором Етгіг7Іей і корецептором ГЕРБ (номер доступу: ОпіРгоїКкВ-0О75197 / І ВРЮ НОМАМ) або його близькоспорідненим гомологом ІГЕРб (номер доступу: ОпіРгоїКВ-О75581 /
ІКРб НОМАМ). У клітинах ссавців існує 19 білків УУпі і 10 рецепторів Егі27ейд. При відсутності
МУпі-ліганду цитоплазматичний бета-катенін фосфорилується білковим комплексом, який складається із каркасних білків Ахіп і АРС, а також кіназ з5КЗ-бета й СКта. Наступне розпізнавання бета-ТісР-убіквітин-лігазою приводить до убіквітин-опосередкованої деградації бета-катеніну. У присутності М/пі-ліганду зв'язування М/пі з Егіг7Іеа і ГЕРБ або І КРб приводить до залучення цитоплазматичного ефекторного білка ЮОмі і фосфорилування цитоплазматичного хвоста ІКР5 або І КРб, що забезпечує сайт для приєднання Ахіп. Секвестрація Ахіп за допомогою І КР5 або І КРб приводить до інактивації комплексу Ахіп-АРС-С5КЗ-бета, а отже, до стабілізації й нагромадження внутрішньоклітинного бета-катеніну. Таким чином, рівень бета- катеніну в цитоплазмі росте, і бета-катенін переміщається до ядра, утворюючи комплекси із членами сімейства факторів транскрипції Т-клітинного фактора (ТСЕ)/Фактора, що зв'язується з лімфоїдним енхансером (СЕР). Потім залучаються механізм базальної транскрипції й транскрипційні коактиватори, включаючи білок (СКЕВ-ріпаїпуд ргоїеіп, СВР), який зв'язується з білком, що зв'язується із цамф-чутливим елементом (сатр гезропзе еІетепі-біпаіпу ргоївіп,
СКЕВ), або його гомолог р30О0, що приводить до експресії різних цільових генів, включаючи
Ахіпг2, циклін 01 їі с-Мус.
Додатковий рівень ліганд-залежної регуляції шляху М/пі опосередкований ЕЗ-лігазою ЕМЕ43 і її близькоспорідненим гомологом 2МКЕЗ, а також секретованими білками К-спондинами (де
Іашм ї ін. "Те В-5ропаїп/І дг5/Апі43 тоашіе: гедшіатог ої МУпі відпа! вігепдаїй". Сепе5 ЮОем. 2014; 28(4):305-16). КЕМЕ43 є посередником в убіквітинуванні рецепторного комплексу Егі27еал КРБ або І КРб на клітинній поверхні, приводячи до його деградації й у такий спосіб пригнічуючи ліганд-залежну активність шляху МУУпі. Активності КМЕ43 протидіють члени сімейства К- спондинів (К-спондинові ліганди 1-4). При наявності К-спондинового ліганду він усуває КМЕ43 із клітинної поверхні, роблячи можливим нагромадження комплексу Егіг77леал КРБ або І РЕРб і посилення УУпі-сигналінгу в присутності М/пі-лігандів.
І КРБ ії ГКР діють як воротарі ліганд-залежної активації сигнального шляху МУпі і, отже, можуть вважатися мішенями для досягнення повної блокади шляху, опосередковуваного всіма 19-ма лігандами М/пі і 10-ма рецепторами Егі27Іє4й, а також посилюваного К-спондиновими лігандами. Зокрема, УУпі-ліганди можна підрозділити на класи М/пИ і УУпіЗа, кожний з яких для передачі сигналу зв'язується з різними епітопами/ділянками І КРБ і ГКРб. Позаклітинний домен
І КРБ і ГКРЄ містить чотири повторювані бета-пропелерних елемента, зв'язані з ЕСЕ-подібним доменом, за якими ідуть три ГОЇК-повтори типу А. Комбінування структурного й функціонального аналізу КРБ і ГКРб змушує припустити, що МУпії (ліганд класу УУпи) зв'язується із фрагментом І КРб, який містить бета-пропелери 1 і 2, а М/піЗа зв'язується із фрагментом, який містить бета-пропелери З і 4. У даний момент відомо тільки зображення позаклітинного домену І КРб, що містить бета-пропелерні ділянки 1-4, у низькому розділенні (АнНп і ін" Зігисішгаї! баві5 ої МУпі зідпаїйпд іпрібйіоп Бу ОісККорі Біпаїпд то І КРБ/6". ЮОем Сеї. 2011; 21(5):862-73). Однак неточності цих реконструкцій у низькому розділенні (40 А") ї відсутність даних про структуру позаклітинного домену І КРб у комплексі з МУпі-лігандами не дозволяють точно встановити епітопи, що приймають участь у зв'язуванні лігандів МУпПИ або УУпіза.
Гіперактивація сигнального шляху МУпі бере участь у патогенезі різних типів раку. При деяких типах раку часті мутації в молекулах низхідних сигнальних шляхів сприяють конститутивній активації шляху М/пі (напр., мутації АРС при колоректальному раку; активуюча бета-катенін мутація при печінковоклітинній карциномі). Навпаки, при тричі негативному раку молочної залози (ТНРМЗ), недрібноклітинному раку легень (НДКРЛ), аденокарциномі підшлункової, а також підмножині колоректальних раків (КРР) і ендометріальних раків активація сигнального шляху МУпі приводиться в дію ліганд-залежним механізмом (тобто, (610) аутокринною/паракринною активацією МУп)О, що виявляються за внутрішньоклітинним нагромадженням бета-катеніну. При НДКРЛ, ТНРМ3З ії аденокарциномі підшлункової ліганд- залежна активація УУпі опосередкована багатьма механізмів, включаючи підвищену експресію
МУпі-лігандів та/або рецепторів ГЕРБ і | КРб, або ж сайленсинг негативного регулятора І КРБ і
ГАРБб - ОККІ1 (ТНРМ3З: Гі ї ін." КРБ омегехргеззіоп деїпез а сіав55 ої рБгеавзі сапсег зибіуре апа ів аїагдеї ог Шегару". Ргос Маї! Асай 5сі ОО 5 А 2010; 107 (11):5136-41; Кнгатівом і ін. "МУпу/реїа- саїепіп раїймау асіїмайоп і5 епгісней іп Базаї!-ІїКе Бгєаві сапсег5 апа ргедісі5 роог ошісоте". Ат /
Раїпої. 2010; 176(6): 2911-20; НДКРЛ: Макавзпіта і ін. "М/П! омегехргезвіоп аззосіаїєд м/йй Штог ргооїїегайоп апа а роог ргодповів іп поп-5таї сеї ІШпа сапсег раїепів". Опсої! Вер. 2008; 19(1):203- 9; Рак підшлункової: Папа і ін. "Сапопіса! м/пі відпаїїпу ів гедцігей ог рапсгеаїйс сагсіподепезвів".
Сапсег Вев. 2013; 73(15):4909-22). Зокрема, опубліковані дані показують, що в здорових тканинах (напр., епітелії молочної залози й легені) бета-катенін локалізований строго в плазматичній мембрані. На відміну від цього, у більшості первинних клінічних зразків ТНРМ3З,
НДКРЛ ї аденокарциноми підшлункової виявлене внутрішньоклітинне нагромадження бета- катеніну (тобто, у цитоплазмі/ядрі; біомаркер активації М/пі-сигналінгу) через порушений УУпі- сигналінг. У недавніх публікаціях було показано, що ліганд-залежна активація сигнального шляху УУпї опосередкована мутуючим/інактивованим КМЕ43 (Сіаппакіз і ін. "ВМЕ43З і5 їтедоепіу тиїаїєа іп соїогесіаЇ апа епдотеїгіа! сапсегв". Маї Сепеї. 2014; 46(12)1264-6) або активацією К- спондинових злитих транскриптів (кодуючих білки К-спондин?2 або К-спондин3, керованих конститутивно активними сильними промоторами; Зезпадігі і ін. "Несштепі В-5ропаїп Тивіоп5 іп сооп сапсег!". Маїште 2012; 488(7413):660-4) Було показано, що інактивація як мутацій КМЕ43, так і К-спондинових злитих транскриптів підсилює ліганд-залежний МУпі-сигналінг іп міїко, підвищуючи відносний вміст Егі77Іє4й на поверхні клітини. Було показано, що ліганд-залежна активація МУпі у пухлинах стимулює ріст пухлини і її резистентність до хіміотерапії або імунотерапії, а також зв'язана з рецидивами в доклінічних моделях.
З рівня техніки відомі деякі молекули, що зв'язують І КР5 або І КРб і здатні модулювати сигнальний шлях М/пг:
БіскКорі-1 (ОККІ) - це інгібітор КРБ і ГЕРб. ОККІ зв'язується з обома корецепторами М/пі,
І КРБ ї 6, а також трансмембранним білком Кгетеп, пригнічує М/пі-сигналінг і приводить до швидкої інтерналізації ГКР і І КРб. Було показано, що ОККІ1 пригнічує як МУпи-, так і М/піЗа- опосередковану передачу сигналу. Дослідження зі структурного моделювання показали, що окрема молекула ОКК1 кооперативно зв'язується з витягнутою ділянкою позаклітинного домену
І КРБ (від 1-го до 3-го бета-пропелера). Структурні аналізи припускають взаємодію ОККІ і | КРБ за принципом кооперативного зв'язування, з первинним зв'язуванням з З-ьою бета- пропелерною ділянкою, яке сприяє взаємодії/зв'язуванню з 1-0ю і 2-ою бета-пропелерними ділянками, оскільки змінює конформацію позаклітинного домену ІКРб. Однак, як уже згадувалося, конкретні епітопи в доменах 1-го, 2-го й 3-го бета- пропелерів, що брав участь у зв'язуванні ОККІ і І КРБ, не з'ясовані через низьке розділення реконструкцій структури повного позаклітинного домену І КРб, зв'язаного з ОККТ1.
Було показано, що лікування ЮККІ іп мімо приводить до серйозних токсичних реакцій шлунково-кишкового тракту. Зокрема, було показано, що опосередкована аденовірусом експресія ОККІ у дорослих мишей помітно інгібувала проліферацію в тонкому й товстому кишечнику, що супроводжувалося прогресуючою дегенерацією його архітектури, великою втратою маси тіла й смертністю від коліту й генералізованої інфекції. Зокрема, І КРБ і І КРб експресуються в проліферуючих епітеліальних клітинах тонкого кишечнику й необхідні для проліферації кишкового епітелію, що наводить на припущення, що інгібування І КРБ і | КРб може бути токсичним для цієї й інших нормальних тканин (попу і ін. "тро апа І ?рб ріау сотрепзаїйогу гоїе5 іп тоивзе іпіевіїпа! демеюортепі". У Сеї! Віоспет. 2012; 113(1):31-8). Тому виникають сумніви в тому, що інгібітори ІКР5 і І ЕРб або взагалі які-небудь інгібітори сигнального шляху М/пі (М/пи і УМуУпіЗа) можуть бути використані в терапевтичних цілях, напр., можуть піти в розробку як засоби проти раку.
МО2009/056634 стосується молекул, що зв'язуються з І КРб, які можуть антагоністично або агоністично взаємодіяти із сигнальним шляхом М/пії або із сигнальним шляхом УУпізЗ/За, і які можуть бути використані з метою діагностики або ж для лікування "розладів, зв'язаних із сигнальним шляхом МУпі", таких як остеоартрит, полікістоз нирок або рак. У цьому документі не згадані які-небудь конкретні приклади подібних зв'язувальних молекул, визначені своїми амінокислотними послідовностями.
В УМО2011/138391 ії УМО2011/138392 описані мультивалентні антитіла, які зв'язують І КРб. В
МО2011/138391 заявлені антитіла, що блокують один із сигнальних шляхів М/пі (М/пи або
Мупі3), не підсилюючи при цьому інший шлях (відповідно МУпіЗ або УуУпи). В УМО2011/138392 10) серед іншого надані антитіла або фрагменти антитіл, що підсилюють сигнал М/пі шляхом утворення рецепторних кластерів І КРб.
В УМО2011/138391 пояснюється, що для досягнення бажаного ефекту молекули, що зв'язують І КРб, слід довести до формату повнорозмірних ІдсС-антитіл. Наведені приклади біпаратопних молекул І КРб, що включають молекулу дос з першою специфічністю зв'язування, з'єднану з одноланцюговою Ем-ділянкою із другою специфічністю зв'язування. Деякі формати описані як такі, що мають значно знижену термостабільність (Тпл від 50 до 52 "С). Ес-ділянка може додати молекулі дс ефекторні функції, такі як комплемент-залежна цитотоксичність (КЗЦ) або антитілозалежна клітинноопосередкована цитотоксичність (АЗКЦ).
В ММО2013/067355 описані зв'язувальні І КРб біпаратопні імуноглобулінові 5сЕм-конструкти із продовженим періодом напіввиведення, отримані з молекул до, описаних в УМО2011/138391.
В УМО2011/119661 описані антитіла, що зв'язуються з І КРб і пригнічують передачу сигналу через першу ізоформу Уупі, особливо через М/піЗ або М/піЗа, але посилюючі передачу сигналу через другу ізоформу Умпі, яка може бути ізоформою У/пИ, 2, 26, 4, 6, 7а, 7, ва, ба, 90, 10а або 10р. Описані біспецифічні молекули, що зв'язуються з Е1-Е2-ділянкою І КРб, а також з ЕЗ3-Е4- ділянкою І КРб. Для одержання біспецифічних антитіл використовували технологію "виступів-в- западини".
Епітопи зв'язування (певні амінокислотні залишки в границях позаклітинного домену/бета- пропелерних ділянок І КРб), що приймають участь у зв'язуванні | КРб з антитілами, не ідентифіковані ні в УУО2009/056634, ні в УМО2011/138391 або ММО2013/067355, і лише частково ідентифіковані в М/О2011/119661. Зокрема, антитіла, що зв'язують І КРб, здатні пригнічувати передачу сигналу М/пі за допомогою альтернативних механізмів, що відповідають зв'язуванню з різними ділянками І КРб, включаючи пряму конкуренцію з УУпі5 або інгібування утворення потрійних рецепторних комплексів (УМупі-ІАРб-Ргі27І64), тоді як інші підсилюють передачу сигналу, можливо, шляхом утворення рецепторних кластерів (Апйп і ін." 5ігисішга! бавзів ої М/пі відпаїїпо іппірйіоп Бу ОісккКорії ріпаїпа ю ГАРБ/б6". Оєм Сеїї. 2011; 21(5):862-73).
Проте, жодна з описаних у рівні техніки зв'язувальних молекул поки що не була допущена органами охорони здоров'я до застосування як лікарський засіб для лікування якої-небудь хвороби. Говорячи конкретніше, подібне застосування вимагає дуже особливих зв'язувальних властивостей, правильної специфічності, щоб такі молекули не зв'язували, не активували або не інгібували інші мішені (напр., приводячи до небажаної активації або інгібування інших сигнальних шляхів, або ж недостатньої активації або інгібування по відношенню до цільових ізоформ), у випадку бі- або мультиспецифічних агентів - належної збалансованості двох або більше специфічностей зв'язування, належних фармакокінетичних і фармакодинамічних властивостей, прийнятного токсикологічного профілю й, звичайно ж, ефективності іп мімо.
Враховуючи вищевикладене, існує потреба в нових терапевтичних агентах, що дозволяють ефективно лікувати різні типи ракових захворювань і пухлин. Таким чином, задачею винаходу є надання подібних фармакологічно активних агентів, які можуть використовуватися для лікування ряду ракових захворювань, включаючи НДКРЛ і ТНРМ3.
Зокрема, задачею винаходу є надання подібних фармакологічно активних агентів, композицій та/(або способів лікування, які мають певні переваги в порівнянні з використовуваними та/або відомими з рівня техніки на даний момент агентами, композиціями та/або способами. Ці переваги включають ефективність іп мімо, поліпшені терапевтичні й фармакологічні властивості, меншу кількість побокових ефектів, а також інші сприятливі властивості, такі як спрощене виготовлення або знижена вартість товарів, особливо в порівнянні із уже відомими потенційними лікарськими препаратами.
Короткий опис винаходу
Згідно з першим аспектом винаходу, даним винаходом забезпечені поліпептиди, які специфічно зв'язуються з І! КР5 або І КРб, причому подібний поліпептид згідно з винаходом містить перший імуноглобуліновий окремий варіабельний домен (а), вибраний із групи імуноглобулінових окремих варіабельних доменів від (І) до (ІІ), що визначаються наявністю наступних СОК-послідовностей: (І):
СОовІ: тУТМа (- ЗЕО І МО)
СОР2: АІВАНазвзтуУМАреУКа (- 5ЕО І МО:2)
СОВЗ: ОТАТМАГ ГГ ОМАМОМ (- 5ЕО ІЮ МОЗ) (у:
СОН: БМАМОа (- 5ЕО 1Ю МО:4)
СОов2: АІААЗаВАТУМАОБУКа (- 5ЕО І МО:5)
СОВЗ: АВАУАЗЗТАУМТа ГУМ/МЕМ (- ЗЕО І МО:6) бо (П):
СОовВІ: ВУТМа (- 5ЕО ІЮ МО:7)
СОоР2: АІМАЗаСОЗГУМАреУКа (- 5ЕО І МО:8)
СОовВЗ: ОВВОВСЕММИ І У5БаВУЕМ (- 5ЕО І МО:9), і другий імуноглобуліновий окремий варіабельний домен (б), вибраний із групи імуноглобулінових окремих варіабельних доменів (ІМ) ії (М), що визначаються наявністю наступних СОК-послідовностей: (ІМ):
СОВІ: 5БМАМОИ (- 5ЕО ІО МО:10)
СОоР2: АІМуЗа,ЗТУМАОБУКа (- 5ЕО ІЮ МО 711)
СОВЗ: БРІРМаБІ ЇЇ АААМММОМ (- 5БЕО ІО МО:12) (М):
СОВІ: 5БМАМОИ (- З5ЕО ІО МО 13)
СОР2: АІЗМунЗИаЗТУМАрБУКа (- 5ЕО ІЮ МО: 14)
СОВЗ: ОРВаУСМАММУБАМУЕМ (- 5ЕО ІЮ МО:15).
Терміни "перший" і "другий" по відношенню до цих імуноглобулінових окремих варіабельних доменів призначені тільки для позначення того, що ці домени є двома різними доменами (тому що вони принаймні містять різні СОК-послідовності). Тому дані терміни не слід розуміти як такі, що позначають точний порядок або послідовність доменів у подібному поліпептидному ланцюзі.
Поліпептиди згідно з винаходом необов'язково містять третій імуноглобуліновий окремий варіабельний домен, особливо такий, як альбумінзв'язувальний імуноглобуліновий окремий варіабельний домен, як домен АЇБ11, що містить наступні СОК:
СОНВІ(АЇІЬ11): БР М5 (- 5ЕО І МО:16)
СОР2(АЬТ1): ВІЗА ЗОаЗОТІ МАОБУКа (- ЗЕО ІЮ МО:17)
СОВЗ(АЇЬТ1): С5І ЗА (- 5ЕО ІЮ МО:18).
Згідно з більш конкретним варіантом здійснення поліпептиди згідно з винаходом включають імуноглобулінові окремі варіабельні домени, що є доменами УНН, переважно гуманізованими доменами УНН.
Відповідно до ще більш конкретного варіанту здійснення поліпептиди згідно з винаходом містять перший імуноглобуліновий окремий варіабельний домен (а), вибраний із групи імуноглобулінових окремих варіабельних доменів від (І) до (ІІ), які мають наступні послідовності: (І):
АМОЇ МЕЗО! МОРОСБІ ВІ БСААЗаВТЕЗТУ МОМ ЕВОАРЕОКЕРЕРМААІНННИЗЗТ УМА
УКОаВЕТІЗВОМЗКМТУМІ ОММЗІ АРЕОТАУУУСААОТАТМАП ОМА УМУСОСТІ МТУ (- ФЕО ІО МО:19) (у:
АМОЇ МЕЗО МОРОСБІ ВІ БСААБССТЕЗ5МАМОМЕВОАРОКЕВЕЕМААІН АЗИ ВАТУМАО
УКОавВЕТІЗВОМЗКМТУМІ ОММЗІ АРЕОТАУУУСАААВВУВОЗТАУМТаТпМММЕУМИОСТІ МТУ55 (- ФЕО ІЮ МО:20) (ПВ):
АМОЇ МЕЗО МОРОСБІ ВІ БСААБаї ТЕЗАУ ТМОМЕВОАРОКЕВЕЕМААХІУнЗСИЗТУМАБ
УКОавВЕТІЗВОМЗКМТУМІ ОММЗІ АРЕОТАУУУСААВА!ВавВаСЕММН І М5ЗаВМЕММ ПОСТІ МТУ (- ФЕО ІО МО:21), і другий імуноглобуліновий окремий варіабельний домен (б), вибраний із групи, що складається з імуноглобулінових окремих варіабельних доменів (ІМ) і (М), які мають наступні послідовності: (ІМ):
ЕМОЇ МЕЗО МОРОИБІ ВІ БСААЗаВТЕЗ5МАМОМЕВОАРЕКЕВЕЕМААІЗУМУЗазТУМАрБУК
САЕТІЗВОМЗКМТУМ ОММЗІАРЕОТАУМУУСААЗРІРУМаБИЇ ЕВАМММОММУСОС,ТІ МТУ (- ЗЕО ІО МО:22), і (М):
ЕМОЇ МЕЗО, МОРОИБІ ВІ БСААБССТЕЗ5МАМОМ ЕВОАРОКЕВЕЕМААЛІЗМ НЗИаЗТУМАрБ
УКОавВЕТІЗВОМЗКМТУМІ ОММЗІ АРЕОТАУУУСААОРВИУаМАМУВАМУЕУМСОСТІ МТУ55 (- ФЕО ІО МО:23).
Згідно з особливо кращим варіантом здійснення поліпептиди згідно з винаходом додатково містять фрагмент, що продовжує період напіввиведення, при цьому вказаний фрагмент, що продовжує період напіввиведення, ковалентно зв'язаний із вказаним ополіпептидом (і4 необов'язково вибраний із групи, що складається з альбумінзв'язувального фрагмента, такого як альбумінзв'язувальний пептид або альбумінзв'язувальний імуноглобуліновий домен, (610) переважно альбумінзв'язувальний імуноглобуліновий окремий варіабельний домен, більш переважно домен АЇБ11, трансферинзв'язувального фрагмента, такого як антитрансфериновий імуноглобуліновий домен, молекули поліетиленгліколю, людського сироваткового альбуміну, а також фрагмента людського сироваткового альбуміну.
Особливо кращими є поліпептиди, які додатково до двох імуноглобулінових окремих варіабельних доменів (а) і (б) згідно з описом вище містять домен АЇІБ11, що має наступну послідовність:
ЕМОЇ МЕЗО МОРОМ5БІ ВІ БСААЗИаЕТЕЗЗеИМОУМУАОАРОКаї ЕМ/УЗБІЗОВОБЗОТІ Ар
УКанвВЕтІЗАОМАКТТІ М ОММ5І АРЕОТАМУУСТІ саві знаЗО,ТІ УТУ55 (- БЕО ІЮ МО:24)
Згідно з наступним варіантом здійснення винахід охоплює конкретні поліпептиди, що містять або складаються із будь-якого з наступних трьох поліпептидних ланцюгів:
Е13500575 з послідовністю 5ЕО ІЮО МО:25,
Е13500571 з послідовністю 5ЗЕО ІО МО:26, і
Е13500720 з послідовністю ЗЕО ІЮ МО:27.
Згідно з подальшими аспектами, винахід стосується молекул нуклеїнових кислот, векторів експресії, клітин-хазяїв, а також способів виробництва, використовуваних для виготовлення винайденого поліпептиду. Молекули нуклеїнових кислот, що кодують поліпептиди згідно з винаходом, у виділеному вигляді можуть бути використані для конструювання відповідних векторів експресії, які потім можуть бути перенесені шляхом трансфекції в клітини-хазяї, використовувані для біофармацевтичного виробництва поліпептидів згідно з винаходом. Подібні способи виготовлення, як правило, включають етапи культивування клітини-хазяїна в умовах, що роблять можливою експресію поліпептиду, виділення поліпептиду і його очищення відомими в галузі методами.
Подальші аспекти, варіанти здійснення, застосування й способи, у яких використовуються поліпептиди згідно з винаходом, будуть зрозумілі з нижченаведеного детального опису винаходу й прикладеної формули.
Винаходом надані нові молекули, які уложливлюють більш ефективне лікування різних типів раку, таких як ТНРМ3, КРР і НДКРЛ, з меншою кількістю побічних ефектів. Поліпептиди згідно з винаходом забезпечують несподіваний терапевтичний ефект (тобто, дієвість) при лікуванні хворих раком пацієнтів, що полягає в тому, що вони здатні викликати регрес пухлини, що приводить до повної патоморфологічної відповіді (пППВ). Очікується, що це у свою чергу приведе до значного поліпшення виживаності без прогресування й загальної виживаності, особливо у випадку великої нереалізованої медичної потреби, такої, як, напр., при раку молочної залози.
Таким чином, поліпептиди згідно з винаходом забезпечують нові терапевтичні можливості для лікування ряду типів раку, особливо тих, де виявляють розрегульований сигнальний шлях Мп і нагромадження бета-катеніну.
Більше того, поліпептиди згідно з винаходом легко робити, вони мають високу стабільність і низьку антигенність, а також відкривають ряд можливостей щодо шляхів введення, крім ін'єкцій і інфузій.
Короткий опис графічних матеріалів
На Фігурі 1 показане схематичне зображення біпаратопних поліпептидів-антагоністів передачі сигналу МУпИ їі М/піЗа. Вони складаються із трьох доменів, два з яких зв'язуються з певними епітопами КРБ і ГКРб (блокатор МУпи і МУпіЗа) і один служить для продовження періоду напіввиведення (домен, що зв'язується з людським сироватковим альбуміном).
На Фігурі 2 показана відсутність кореляції між аналізами зв'язування за методами ЕАСЗ і
ЕПІЗА для репрезентативної кількості | КРб-зв'язувальних УНН, отриманих при імунізації лам.
Панель МНН під номером "1" характеризується високою афінністю до клітин, що експресують
КРб на плазматичній мембрані, виявленою за допомогою аналізу зв'язування ЕАСЗ (на осі у показані значення МСЕ). Панель МНН під номером "2" характеризується високою афінністю до рекомбінантного позаклітинного домену людського І КРб (гпКРб-Ес), виявленою за допомогою аналізу зв'язування ЕГІЗА (на осі х показані значення 00405).
На Фігурі З показане зв'язування трьох біпаратопних перехреснореактивних за І КРБ/Л КРб
УНН-конструктів із продовженим періодом напіввиведення з І КРБ (Фігура ЗА) і І КРб (Фігура
ЗВ), які понадекспресуються в клітинних лініях НЕК293, у порівнянні з негативним контролем, що складаються із ненаціленого зв'язувача (МНН-конструкт, що зв'язується з бактеріальним білком, який в клітинах НЕК293 не експресується).
На Фігурі 4 показана повна конкуренція трьох біпаратопних перехреснореактивних за
ГАРБ/Л АРб УНН-конструктів із продовженим періодом напіввиведення з ОКК/І за зв'язування як (610) з людським КРБ (Фігура 4А), так і людським ГКРб (Фігура 4В), які понадекспресуються в клітинних лініях НЕК293, виявлена аналізом ОКК1-конкуренції на основі ЕАС5.
На Фігурі 5 показане повне інгібування шляху М/пи і УУпіЗза трьома біпаратопними перехреснореактивними за ГКРБ5/ЛАРб МНН-конструктами із продовженим періодом напіввиведення (Фігура 5А) і порівняння з іншими молекулами, що зв'язують І КРб (Фігура 58:
Кпоб НС УМу210.09 і МОКО81681ІДд4с11І АГА 6475 5сїу; Фігура 5С: 802) у комбінованому аналізі за геном-репортером УУпИ і УуУпіЗа.
На Фігурі б показане інгібування МуУпі-сигналінгу в ракових клітинах, що виявляється інгібуванням відносної експресії мРНК Ахіпа2 (Фігура бА), а також проліферацією клітин (Фігура 68), оцінюваною за зниженням відсотка (95) життєздатних клітин, після обробки трьома біпаратопними перехреснореактивними за ІКРБЛЕКРб МНН-конструктами із продовженим періодом напіввиведення (у кінцевій концентрації 1 мМ) і після обробки 802Т, у порівнянні з
Е013500571 і необробленими (контрольними) клітинами (діаграми з лівої й правої сторін Фігури 68); для обробки одним біпаратопним ГКРЗЛКРб конструктом із продовженим періодом напіввиведення (Фігура 6С) і 8027 (Фігура 60) показані криві залежності відповіді від дози.
На Фігурі 7 показана ефективність біпаратопних перехреснореактивних за І КРБ/Л ЕРб УНН- конструктів із продовженим періодом напіввиведення іп мімо (Б013500571 на Фігурі 7А і
ЕО013500720 на Фігурі 78), а також Кпоб НС УУМу210.09 (Фігура 7С), на моделях пухлин, викликаних М/пі (ксенотрансплантатна модель ММТМ-М/пПИ).
На Фігурі 8 показане інгібування шляху УУпі у пухлинах, оброблюваних біпаратопними перехреснореактивними за ГГ КРБУЛКРб МНН-конструктами із продовженим періодом напіввиведення БО13500571 і Б013500720, що виявляється зниженням рівня експресії мРНК
Ахіп2 у порівнянні з контрольною групою.
На Фігурі 9 показаний вплив пригнічення У/піЗза-сигналінгу на вивільнення прозапального цитокіну ФНІП-альфа дендритними клітинами (Фігура 9А), а також вплив на активацію Т-клітин, що виявляється вивільненням інтерферону-гамма, після обробки біпаратопним перехреснореактивним за ГКРУЛКРб МНН-конструктом із продовженим періодом напіввиведення. Кожний символ позначає окремого донора дендритних клітин (ДК). Наведені дані нормалізовані до рівнів ФНП-альфа в необробленому контролі (Фігура 9А), і кожний символ позначає унікальну донорську пару для ДК і Т-клітин (Панель В).
Детальний опис винаходу
Визначення
Вищевикладені й інші аспекти й варіанти здійснення винаходи будуть зрозумілі з наведеного далі опису, у якому: а) Якщо не вказане або не визначене інше, усі використані терміни мають звичайне для даної галузі значення, яке очевидно фахівцеві. Приміром, даним посилаємося на стандартні посібники, такі як Затогоок і ін., "Моїесціаг СіІопіпд: А ІГабогаїогу Мапиаї" (2-е вид.), Т. 1-3, Соїа
Зрігіпуд Натог Іарогаїогу Рге55 (1989); І ем/іп, "Зепе5 ІМ", Охіога Опімегейу Ргез5, Нью-Йорк, (1990), Воїй і ін., ""пптипоіоду" (2-е вид.), Сомжмег Медіса! Рибіїзпіпд, Лондон, Нью-Йорк (1989), а також на процитовані тут документи загального рівня техніки. Крім того, якщо не вказане інше, усі способи, етапи, методики й маніпуляції, конкретні деталі яких не описані, можуть бути виконані й виконувалися відомим рег зе способом, що буде ясно фахівцеві. Для прикладу знову- таки посилаємося на стандартні посібники, процитовані тут документи загального рівня техніки й подальші документи, що згадуються. б) Якщо не вказане інше, терміни "імуноглобулін" і "послідовність імуноглобуліну" - чи використовуються вони для позначення важколанцюгового антитіла або ж звичайного 4- ланцюгового антитіла - використані як загальні терміни, що охоплюють повнорозмірні антитіла, їх окремі ланцюги, а також будь-які їх частини, домени або фрагменти (включаючи, але не обмежуючись ними, антигензв'язувальні домени або фрагменти, такі як МНН-домени або МНЛ/І- домени, відповідно). Крім того, використовуваний тут термін "послідовність" (наприклад, у складі таких термінів, як "послідовність імуноглобуліну", "послідовність антитіла", "послідовність (окремого) варіабельного домену", "МНН-послідовність" або "послідовність білка") слід в цілому розуміти як таку, що охоплює й відповідну амінокислотну послідовність, і послідовності нуклеїнової кислоти, які її кодують, або нуклеотидні послідовності, якщо тільки контекстом не мається на увазі більш обмежене тлумачення; в) Термін "домен" (поліпептиду або білка) тут і далі позначає складчасту білкову структуру, яка здатна втримувати свою третинну структуру незалежно від іншого білка. Як правило, домени відповідають за окремі функціональні властивості білків, і в багатьох випадках можуть бути додані, вилучені або перенесені на інший білок без втрати функції залишку білка та/або домену. (610) г) Термін "імуноглобуліновий домен" тут і далі використаний для позначення глобулярної ділянки в ланцюзі антитіла (такої як, напр., ланцюг звичайного 4-ланцюгового антитіла або важколанцюгового антитіла) або ж поліпептиду, який по суті складається з такої глобулярної ділянки. Імуноглобулінові домени відрізняються тим, що зберігають характерну для молекул антитіл імуноглобулінову укладку, що представляє собою 2-шаровий "сендвіч" із приблизно семи антипаралельних бета-ниток, покладених у два бета-листи, необов'язково стабілізовані консервативним дисульфідним зв'язком. д) Термін "імуноглобуліновий варіабельний домен" тут і далі позначає імуноглобуліновий домен, що складається по суті із чотирьох "каркасних ділянок", які тут і в документах рівня техніки позначаються як "каркасна ділянка 1" або "ЕК1"; "каркасна ділянка 2" або "ЕК2"; "каркасна ділянка 3" або "ЕКЗ"; і "каркасна ділянка 4" або "ЕКА4", відповідно; ці каркасні ділянки перемежовуються трьома "ділянками, що визначають комплементарність" або "СОК", які тут і в документах рівня техніки позначаються як "ділянка, яка визначає комплементарність 1" або "СОКІ1"; "ділянка, яка визначає комплементарність 2" або "СОК2"; і "ділянка, яка визначає комплементарність 3" або "СОМКЗ3", відповідно. Таким чином, загальну структуру або послідовність імуноглобулінового варіабельного домену можна відобразити в наступному виді:
ЕВ1-СОВ1-ЕН2-СОВ2-ЕА3-СО83-ЕК4. Саме імуноглобуліновий варіабельний домен(-и) надає антитілу специфічність за антигеном, оскільки на ньому знаходиться антигензв'язувальна ділянка. е) Термін "їмуноглобуліновий окремий варіабельний домен" тут і далі позначає імуноглобуліновий варіабельний домен, який здатний специфічно зв'язуватися з епітопом антигену, не будучи спареним з додатковим варіабельним імуноглобуліновим доменом. Одним із прикладів імуноглобулінових окремих варіабельних доменів у контексті даного винаходу є "доменні антитіла", такі як імуноглобулінові окремі варіабельні домени МН і МІ. (МН-домени й МІ - домени). Іншим важливим прикладом імуноглобулінових окремих варіабельних доменів є "УНН- домени" (або ж просто МНН) верблюдових, визначення яким дано нижче.
Враховуючи вищевикладене визначення антигензв'язувальний домен звичайного 4- ланцюгового антитіла (такого, як молекула Ідс, Ідт, Іда, да або Іде; відомі з рівня техніки) або
Еар-фрагмента, Е(аб)2-фрагмента, Ем-фрагмента, такого як дисульфідно зшитий Еу- або 5сЕм- фрагмент, або діатіла (усі відомі з рівня техніки), що походить від подібного звичайного 4- ланцюгового антитіла, як правило, не буде вважатися імуноглобуліновим окремим варіабельним доменом, тому що в цих випадках зв'язування з відповідним епітопом антигену звичайно не відбувається при участі тільки одного (окремого) імуноглобулінового домену, але вимагає пари (об'єднаних) імуноглобулінових доменів, таких як варіабельні домени легкого й важкого ланцюга, тобто, пари МН-МІ імуноглобулінових доменів, які спільно зв'язуються з епітопом відповідного антигену. е1) "МНН-домени", відомі також як МНН, МНН-домени, МНН-фрагменти антитіл ії МНнН- антитіла, спочатку були описані як антигензв'язувальні імуноглобулінові(варіабельні) домени "важколанцюгових антитіл" (тобто, "антитіл, що не мають легких ланцюгів"; Натег5-Савієттап
С, Аїатоисп Т, Миуїденптапе 5, Вобіпзоп Сі, Натег5 С, 5опда ЕВ, Вепдантап М, Натегїв В.: "Маїшигану оссигтіпу апіїродіє5 демоїй ої дні спаіп5"; Маїшге 363, 446-448 (1993)). Термін "УНН- домен" був вибраний, щоб відрізняти такі варіабельні домени від варіабельних доменів важкого ланцюга, наявних у звичайних 4-ланцюгових антитілах (які тут і далі позначені як "МН-домени" або "МН-домени") і від варіабельних доменів легкого ланцюга, наявних у звичайних 4- ланцюгових антитілах (які тут і далі позначені як "Мі -домени" або "Мі -домени"). МНН-домени здатні специфічно зв'язуватися з епітопом без додаткового антигензв'язувального домену (на відміну від МН- або Мі -доменів звичайного 4-ланцюгового антитіла, у випадку якого Мі- і МН- домени розпізнають епітоп спільної МНН-домени є малими, стійкими й ефективними антигенрозпізнавальними одиницями, утвореними окремим імуноглобуліновим доменом.
У контексті даного винаходу терміни МНН-домен, УНН, УНН-домен, МНН-фрагмент антитіла,
МНН-антитіло, а також "МапободуФф" і "МапородуФ-домен" ("Мапободу" є торгівельною маркою компанії Абіупх М.М.; Гент; Бельгія) застосовуються взаємозамінно й позначають представників імуноглобулінових окремих варіабельних доменів (що мають структуру ЕК1-СОВ81-ЕН2-СОН2-
ЕВЗ-СОВЗ3-ЕК4, що й специфічно зв'язуються з епітопом, не потребуючи для цього присутності другого імуноглобулінового варіабельного домену), які також можна відрізнити від МН-доменів за так званими "відрізняючими залишками" згідно з визначенням в, напр., УМО2009/109635, Фіг. 1.
Амінокислотні залишки МНН-домену нумерують за загальною системою нумерації МНн- доменів, розробленою КарБбаї і ін. ("бедиепсе ої ргоївїп5 ої іттипоіодіса! іпієгеві", О5 Рибіїс
Неакнй Зегмісе5, МІН Бетесда, Мериленд, Публікація Мо 91), згідно з її застосуванням для УНН- 10) доменів Верблюдових, показаному, напр., на Фігурі 2 з Кіесптапп і МиуЇдегтапв, 9. Іттипої.
Меїтоавз 231, 25-38 (1999). Згідно із цією системою нумерації - ЕК! складається з амінокислотних залишків у положеннях 1-30, - СОКІ1 складається з амінокислотних залишків у положеннях 31-35, - ЕК2 складається з амінокислотних залишків у положеннях 36-49, - СОК2 складається з амінокислотних залишків у положеннях 50-65, - ЕКЗ складається з амінокислотних залишків у положеннях 66-94, - СОКЗ складається з амінокислотних залишків у положеннях 95-102, - ЕК4 складається з амінокислотних залишків у положеннях 103-113.
Однак слід зазначити -- і це добре відомо для МН-доменів і для МНН-доменів - що загальна кількість амінокислотних залишків у кожному СОК може відрізнятися й може не відповідати загальній кількості амінокислотних залишків, передбаченому нумерацією за Кабаї (а саме, одне або більше положень згідно з нумерацією за Кабаї у реальній послідовності можуть не бути зайняті, або ж реальна послідовність може містити більше амінокислотних залишків, ніж передбачено системою Кабаї). Це значить, що в цілому нумерація за Кабаї може відповідати або не відповідати реальній нумерації амінокислотних залишків у реальній послідовності.
З рівня техніки відомі альтернативні методи нумерації амінокислотних залишків МН-доменів, які можуть аналогічним чином застосовуватися й до МНН-доменів. Проте, якщо не вказане інше, у даному описі, формулі й на фігурах використовується нумерація за Кабаї, застосована до
УНН-доменів згідно з описом вище.
Загальна кількість амінокислотних залишків в МНН-домені, як правило, знаходиться в діапазоні від 110 до 120, часто між 112 і 115. Слід, однак, відзначити, що для описаних тут цілей можуть підходити й більш короткі й довгі послідовності.
Подальші структурні характеристики й функціональні властивості МНН-доменів |і поліпептидів, що їх містять, можуть бути підсумовані в такий спосіб:
МНН-домени ("спроектовані" природою для функціонального зв'язування з антигеном без присутності варіабельного домену легкого ланцюга й без якої-небуть взаємодії з ним) здатні функціонувати як окрема, відносно невелика функціональна антигензв'язувальна структурна одиниця, домен або поліпептид. Це відрізняє МНН-домени від МН- і МІ -доменів звичайного 4- ланцюгового антитіла, які самі по собі, як правило, не придатні до практичного застосування як окремі антигензв'язувальні білки або окремі імуноглобулінові варіабельні домені, але потребують комбінування в тій або іншій формі, щоб забезпечити функціональну антигензв'язувальну одиницю (як, наприклад, у звичайних фрагментах антитіл, таких як ЕРар- фрагменти; в 5сЕм, що складаються із МН-домену, ковалентно зв'язаного з Мі -доменом).
Завдяки цим унікальним властивостям використання УНН-доменів - окремо або як частина більшого поліпептиду - має ряд значних переваг у порівнянні з використанням звичайних МН- і
МІ-доменів, 5сЕм або звичайних фрагментів антитіл (таких, як Рар- або Е(ар)2-фрагменти): - для високоафінного й високоселективного зв'язування антигену потрібно тільки один домен, так що відпадає необхідність мати в наявності два окремі домени, а також переконуватися в правильній просторовій конформації й конфігурації цих двох доменів (тобто, за допомогою спеціальних лінкерів, як у випадку зсгЕм). - МНН-домени можуть експресуватися з одного гена й не вимагають посттрансляційної укладки або модифікацій; - МНН-домени можна легко вбудувати в мультивалентні й мультиспецифічні формати (про що говориться далі); - МНН-домени добре розчинні й не мають схильність до агрегації (як мишині антигензв'язувальні домени, описані Умага і ін., Маїиге 341: 544-546 (1989)); - МНН-домени дуже стійкі до дії температури, рН, протеаз і інших денатуруючих агентів або умов, і тому можуть виготовлятися, зберігатися або транспортуватися без використання холодильного обладнання, тим самим заощаджуючи фінанси, час і запобігаючи наслідкам для навколишнього середовища; - МНН-домени відносно просто й дешево виготовити, навіть у виробничих масштабах.
Наприклад, МНН-домени й поліпептиди, які їх містять, можна виготовити мікробним культивуванням (напр., згідно з описом нижче), не використовуючи системи експресії ссавців, що потрібні, наприклад, для звичайних фрагментів антитіл; - МНН-домени в порівнянні зі звичайними 4-ланцюговими антитілами і жюиїх антигензв'язувальними фрагментами відносно невеликі (приблизно 15 кДа, або в 10 раз менше, ніж звичайний Ідс), а тому -- краще проникають у тканині й -- можуть бути введені в більш високих дозах (610) ніж звичайні 4-ланцюгові антитіла і їх антигензв'язувальні фрагменти;
- МНН-домени можуть проявляти так звані властивості порожнинного зв'язування (серед іншого завдяки подовженій у порівнянні зі звичайними МН-доменами петлі їх СОКЗ), і тому їм доступні також мішені й епітопи, недоступні для звичайних 4-ланцюгових антитіл і їх антигензв'язувальних фрагментів.
Способи одержання МНН-доменів, що зв'язуються з конкретним антигеном або епітопом, були описані раніше, напр., в УМО2006/040153 і М/О2006/122786. Також у цьому документі детально описане, що МНН-домени Верблюдових можна "гуманізувати", замінивши один або більше амінокислотних залишків в амінокислотній послідовності оригінальної МНН-послідовності одним або більше амінокислотними залишками, що знаходяться у тих же положеннях УН- домену звичайного 4-ланцюгового антитіла людини. Гуманізований МНН-домен може містити одну або більше повністю людських послідовностей каркасних ділянок, а в ще більш конкретному варіанті здійснення може містити людські послідовності каркасних ділянок, отримані з ОР-29, ОР-47, ОР-51, або їх частини, необов'язково скомбіновані з послідовностями
УН, такими як УН5. е2) "Доменні антитіла", також відомі як "Сар", "ОСотаїп Апііродіеєв", і "ЗАре" (де терміни "Бботаїп Апііродіеє" і "ЯАре" використовуються як торговельні марки групою компаній
СІахозтійНКіїпе), були описані, напр., в Умага Е.5. і ін.: "Віпаіпуд асіїмікев5 ої а герепоїге ої 5іпдіе іттиподіобиїйп магіаріє дотаїп5 5есгеїва їот ЕзсепПегіснпіа соїї"; Мате 341: 544-546 (1989); Ної
ГУ. її їнс "Оотаїп апіїродієв: ргоївеіп5 їог (пегару"; ТКЕМО5 іп Віоїесппоіоду 21(11): 484-490 (2003); а також в ММО2003/002609.
Доменні антитіла по суті відповідають УН- або Мі -доменам ссавців, що не є Верблюдовими, зокрема, людських 4-ланцюгових антитіл. Щоб мати можливість зв'язувати епітоп як окремий антигензв'язувальний домен, тобто, не будучи в парі з відповідним Мі - або МН-доменом, необхідний спеціальний відбір за такими антигензв'язувальними властивостями, напр., за допомогою бібліотек послідовностей окремих людських МН- або МІ -доменів.
Доменні антитіла, як і МНН, мають молекулярну масу від приблизно 13 до приблизно 16 кДа, а якщо отримані з повністю людських послідовностей, то не вимагають гуманізації для, напр., терапевтичного застосування на людях. Як і у випадку МНН-доменів, вони добре експресуються в прокаріотних системах експресії, що забезпечує значне зменшення загальних виробничих витрат.
Доменні антитіла, як і МНН-домени, можна піддавати афінному дозріванню, уводячи в амінокислотну послідовність одного або більше СОЖК змін, які приводять до поліпшення афінності одержуваного імуноглобулінового окремого варіабельного домену до його відповідного до антигену в порівнянні з відповідною батьківською молекулою. Піддані афінному дозріванню молекули імуноглобулінових окремих варіабельних доменів згідно з винаходом можна виготовити відомими з рівня техніки способами, наприклад, описаними в МагкКз і ін., 1992,
ВіоїесппоЇоду 10:779-783, або Вагбазв і ін., 1994, Ргос. Маї. Асай. Зсі, ОБА 91: 3809-3813.; ЗПпіег і ін., 1995, Сепе 169:147-155; Мецоп і ін., 1995, Іттипої. 155: 1994-2004; даск:хоп і ін., 1995, 4).
Іттипої. 154(7):3310-9; а також НамкКкіпз і ін., 1992, 9. Мої. Віої. 226(3): 889 896; К5 доппзоп апа
ВЕ Наужіпв, "Апіпйу таїйигаїйоп ої апіїродієз изіпу рпаде дізріау", Охіога Опімегзйу Ргезз 1996. еЗ3) Крім того, фахівцеві в даній галузі також буде ясно, що можна "пересадити" одну або більше із вищезгаданих СОК на інші "каркаси", включаючи, але не обмежуючись ними, каркаси людського походження або неімуноглобулінові каркаси. Підходящі каркаси й методики для подібного пересадження СОБК відомі з рівня техніки.
Ж) Терміни "епітоп" і "антигенна детермінанта", які можуть використовуватися взаємозамінно, позначають частину макромолекули, таку як поліпептид, розпізнавану антигензв'язувальними молекулами, такими як звичайні антитіла або поліпептиди згідно з винаходом, а більш конкретно - антигензв'язувальною ділянкою цих молекул. Епітопи визначають мінімальну ділянку зв'язування імуноглобуліну й тому є мішенню специфічності імуноглобуліну.
Частину антигензв'язувальної молекули (такої, як звичайне антитіло або поліпептид згідно з винаходом), яка розпізнає епітоп, називають паратопом. з) Термін "біпаратопна" (антиген-)зв'язувальна молекула або "біпаратопний" поліпептид тут і далі позначає поліпептид, що містить перший імуноглобуліновий окремий варіабельний домен і другий імуноглобуліновий окремий варіабельний домен відповідно до даного тут визначення, причому ці два варіабельні домени здатні зв'язуватися із двома різними епітопами одного антигену, при цьому один моноспецифічний імуноглобулін, такий як, напр., звичайне антитіло або один імуноглобуліновий окремий варіабельний домен, у нормальних умовах не зв'язується з обома цими епітопами одночасно. Біпаратопні поліпептиди згідно з винаходом складаються з (610) варіабельних доменів з різними специфічностями за епітопами і не містять взаємно комплементарних пар варіабельних доменів, що зв'язуються з тим самим епітопом. Тому вони не конкурують один з одним за зв'язування з І КР5 або І КРб. и) Поліпептид (такий, як імуноглобулін, антитіло, імуноглобуліновий окремий варіабельний домен, поліпептид згідно з винаходом або антигензв'язувальна молекула або її фрагмент у загальному розумінні), здатний "зв'язувати", "зв'язуватися з", "специфічно зв'язувати" або "специфічно зв'язуватися з", що має "афінність до" та/або "специфічність за" певним епітопом, антигеном або білком (або принаймні однієї його частини, фрагменту або епітопу), називають "поліпептидом до" або "поліпептидом, спрямованим проти" вказаного епітопу, антигену або білка, або ж він є "зв'язувальною" молекулою у відношенні такого епітопу, антигену або білка. кю) У цілому термін "специфічність стосується ряду різних типів антигенів або епітопів, з якими може зв'язуватися конкретна антигензв'язувальна молекула або антигензв'язувальний білок (такий, як імуноглобулін, антитіло, імуноглобуліновий окремий варіабельний домен або поліпептид згідно з винаходом). Специфічність антигензв'язувального білка можна визначити на основі його афінності та/або авідності. Афінність, яка відображається рівноважною константою дисоціації антигену й антигензв'язувального білка (КО), є мірою сили зв'язування епітопу й антигензв'язувальної ділянки антигензв'язувального білка: чим менше значення Ко, тим більша сила зв'язування епітопу й антигензв'язувальної молекули (альтернативно афінність можна виражати як константу афінності (Ка), яка є 1/Ко). Як буде зрозуміло фахівцеві (наприклад, на основі подальшої інформації із цього документа), афінність можна визначити відомим рег 5е способом, залежно від конкретного антигену, що представляє інтерес. Авідність - це міра сили зв'язування антигензв'язувальної молекули (такої, як імуноглобулін, антитіло, імуноглобуліновий окремий варіабельний домен або поліпептид згідно з винаходом) з конкретним розглянутим антигеном. Авідність залежить як від афінності епітопу і його антигензв'язувальної ділянки на антигензв'язувальній молекулі, так і від кількості відповідних застосовних сайтів зв'язування на антигензв'язувальній молекулі.
Як правило, антигензв'язувальні білки (такі, як поліпептиди згідно з винаходом) мають при зв'язуванні константу дисоціації (Ко) від 10Е-5 до 10Е-14 моль/літр (М) або менше, переважно від 1О0Е-7 до 10Е-14 моль/літр (М) або менше, більш переважно від 10Е-8 до 10Е-14 моль/літр, ще більш переважно від 10Е-11 до 10Е-13 (виміряну, напр., аналізом Кіпеха; відомим з рівня
З0 техніки), та/або константу асоціації (Ка) принаймні 10Е7 МЕ-1, переважно принаймні 10Е8 МЕ-1, більш переважно принаймні 1069 МЕ-1, таку як принаймні 10Е11 МЕ-1. Будь-яке значення КО вище 10Е-4 М, як правило, уважаються, що вказують на неспецифічне зв'язування. Переважно поліпептид згідно з винаходом зв'язується з бажаним антигеном з Ко меншою, ніж 500 нМ, переважно меншою, ніж 200 нМ, більш переважно меншою, ніж 10 нМ, такою, як менше 500 пМ.
Специфічне зв'язування антигензв'язувального білка з антигеном або епітопом можна визначити будь-яким підходящим відомим рег зе методом, включаючи, наприклад, описані тут аналізи, аналіз Скетчарда та/або аналізи конкурентного зв'язування, такі, як радіоїмуноаналізи (РІА), імуноферментні аналізи (ІФА) і сендвіч-аналізи конкуренції, а також різні з варіанти, відомі рег зе з рівня техніки. л) Термін "перехреснореактивний" по відношенню до зв'язувальних молекул, здатних зв'язуватися й з І КРБ, і з І КРб ("перехреснореактивні за І КРБ/Л КРБ") слід розуміти як те, що такі зв'язувальні молекули можуть специфічно зв'язуватися з епітопом, що міститься в молекулі
ІКР5, а також альтернативно можуть специфічно зв'язуватися з епітопом, що міститься в молекулі ГКРб. Звичайно така перехресна реактивність може виникнути у випадку, коли епітопи різних білків, з якими зв'язується така зв'язувальна молекула, мають схожу структуру та/або послідовність, напр., являють собою консервативні епітопи, напр., які є у білків, що належать до певного сімейства (напр., І КРБ і І КРб, які належать до сімейства білків І ЕР). м) Амінокислотні залишки позначені стандартними трибуквеними або однобуквеними кодами амінокислот, загальновідомими й загальноприйнятими в даній галузі. При порівнянні двох амінокислотних послідовностей термін "амінокислотна різниця" позначає інсерції, делеції або заміщення вказаного числа амінокислотних залишків у положенні еталонної послідовності в порівнянні із другою послідовністю. У випадку заміщення(-ь) воно(-и) переважно є консервативним(-и) амінокислотним(-и) заміщенням(-ями), тобто амінокислотний залишок замінений на інший амінокислотний залишок з схожою хімічною структурою, і це не впливає або не впливає суттєво на функцію, активність або інші біологічні властивості поліпептиду. Подібні консервативні амінокислотні заміщення добре відомі в даній галузі, наприклад, з УМО 98/49185, де консервативні амінокислотні заміщення переважно є заміщеннями, при яких одна амінокислота з нижчеподаних груп (І) - (М) заміщена іншим амінокислотним залишком з тієї ж групи: (І) малі аліфатичні, неполярні або слабополярні залишки: Аа, Зег, ТПг, Рго і Су; (Ії) (610) полярні, негативно заряджені залишки і їх (незаряджені) аміди: Азр, Азп, Сім і СІп; (ПІ) полярні,
позитивно заряджені залишки: Ні, Аг і Гуз; (ІМ) більші аліфатичні, неполярні залишки: Меї,
Ї ем, Пе, маї ї Суб; ї (М) ароматичні залишки: Ріє, Туг і Ттр. Особливо переважними є наступні консервативні амінокислотні заміщення:
Аа на Су або на 5ег;
Агд на Гуз;
Авхп на Сіп або на Ні;
Азр на Си;
Суз на зег;
Сіп на Авбп;
Сім на Азр;
Су на Аїа або на Рго;
Ні на Азп або на Сп;
Ме на Гей або на Маї;
Ї еи на Іе або на Маї;
Гуз на Аго, на Сіп або на Си;
Меї на ГІ еи, на Туг або на Пе;
Рпе на Меї, на Г ем або на Туг;
Зег на ТАг;
Тиг на 5ег;
Тгр на Туг;
Туг на Тгр або на Ре;
Уа! на Іе або на Г еи. н) Молекула нуклеїнової кислоти або поліпептиду вважається "(в) по суті виділеній (формі)" - наприклад, у порівнянні зі своїм природним біологічним джерелом та/або реакційним середовищем або культуральним середовищем, з якого(-ї) її одержують - після відділення цієї молекули від принаймні одного іншого компонента, з яким вона звичайно зв'язана в вказаному(- й) джерелі або середовищі, такого, як інша нуклеїнова кислота, інший білок/поліпептид, інший біологічний компонент або макромолекула або принаймні один забруднювач, домішка або другорядний компонент. Зокрема, молекула нуклеїнової кислоти або поліпептиду вважається " по суті виділеною" після того, як її очистили принаймні 2-кратно, зокрема, принаймні 10-кратно, більш конкретно принаймні 100-кратно й до 1000-кратно або більше. Молекула нуклеїнової кислоти або поліпептиду, що знаходиться в " по суті виділеній формі", переважно по суті гомогенна, що визначено за допомогою підходящого методу, такого як підходящий хроматографічний метод, такий як електрофорез у поліакриламідному гелі; о) "Ідентичність послідовностей", напр., двох послідовностей імуноглобулінових окремих варіабельних доменів, відображає процентну частку амінокислот, які в цих двох послідовностях збігаються. Її можна розрахувати або визначити за описом в абзаці ) на сторінках 49 і 50
УОо2008/020079. "Подібність послідовностей" відображає процентну частку амінокислот, які або ідентичні, або є консервативними амінокислотними заміщеннями.
Специфічність за мішенню
Поліпептиди згідно з винаходом специфічні за І КРБ і І КРб, у тому розумінні, що містять імуноглобулінові окремі варіабельні домени, що специфічно зв'язуються з епітопами, що є в обох цих молекулах (молекули, які перехреснореактивно зв'язють І КРБ/Л КРб).
Молекули згідно з винаходом зв'язуються з людськими формами І КРБ і І КРб, а переважно також і з їх аналогами в інших видів, що мають значення для розробки ліків, тобто, І КРБ і І КРб яванської макаки й миші.
Поліпептиди згідно з винаходом
У самому широкому розумінні винаходом забезпечені нові фармакологічно активні агенти для лікування ракових захворювань. Агенти згідно з винаходом належать до нового класу зв'язувальних молекул, а саме до біпаратопних перехреснореактивних за ГЕРБ/ЛКРб поліпептидів, які містять два або більше імуноглобулінових окремих варіабельних доменів, що зв'язуються з ІКР5 та/або /КРб за різними епітопами. Терміни "перехреснореактивний" і "біпаратопний" пояснені вище, так що біпаратопні перехреснореактивні за І ЕРБ/Л КРб молекули можна визначити як молекули, здатні зв'язуватися з /КР5 за двома різними епітопами, що містяться в білку І КРБ, а також здатні зв'язуватися з | КРб за двома відповідними епітопами, що містяться в білку І КРб.
Більш конкретно поліпептиди згідно з винаходом містять: - перший імуноглобуліновий окремий варіабельний домен, здатний специфічно зв'язуватися й з І КРБ, і з 'КРб (перехреснореактивний за І КРБО/Л КРб) за епітопом / таким чином, який (610) приводить до пригнічення сигнального шляху М/пИ, пригнічуючи активовану М/пИи транскрипцію гена-мішені, і - другий імуноглобуліновий окремий варіабельний домен, здатний специфічно зв'язуватися й з І КРБ, і з 'КРб (перехреснореактивний за І КРБО/Л КРб) за епітопом / таким чином, який приводить до пригнічення сигнального шляху УУпіЗза, пригнічуючи активовану МУМ/піЗа транскрипцію гена-мішені.
Завдяки двом імуноглобуліновим окремим варіабельним доменам у подібному поліпептиді, причому два домену зв'язуються з різними епітопами (що мають відношення до передачі сигналу МУПИ / М/піЗа), ці молекули є біпаратопними зв'язувальними молекулами. Цей режим біпаратопного зв'язування схематично показано на Фігурі 1.
У зв'язку із цим слід зазначити, що передбачається, що поліпептиди згідно з винаходом можуть зв'язуватися з однією окремою молекулою І КРБ або І КРб по обом своїм І КРБ/Л КРб- зв'язувальним доменам, як показано на Фіг. 1 (режим внутрішньомолекулярного зв'язування).
Проте, можуть мати місце й інші режими зв'язування.
Нарешті, передбачається, що поліпептиди згідно з винаходом здатні конкурувати з ОККІ1 - природним лігандом І КРБ і ГКРб, що перешкоджають УуУпи - і МупіЗа-сигналінгу - за зв'язування з І ЕР5 і КРБ, тим самим інгібуючи сигнальні шляхи М/пи і М/піЗа. Проте, цю теорію також не слід розуміти як обмежуючу обсяг винаходу.
Більш конкретно поліпептиди згідно з винаходом специфічно зв'язуються з І КР5 або І КРб, причому подібні поліпептиди містять перший імуноглобуліновий окремий варіабельний домен (а), вибраний із групи імуноглобулінових окремих варіабельних доменів від (І) до (ІІ), що визначаються наявністю наступних СОВ-послідовностей: (І):
СОовІ: тУТМа (- ЗЕО І МО)
СОР2: АІВАНазвзтуУМАреУКа (- 5ЕО І МО:2)
СОВЗ: ОТАТМАГ ГГ ОМАМОМ (- 5ЕО ІЮ МОЗ)
ГЕ СОК домену МУп"и-333ЕОбтоа (у:
СОН: БМАМОа (- 5ЕО 1Ю МО:4)
СОов2: АІААЗОаВАТУМАОБУКа (- 5ЕО ІЮ МО:5) зо СОВЗ: АВАУВЗЗТАУМТаТатУммМЕМ (- 5ЕО І МО:б)
ГЕ СОК домену Уупи1-333С06) (ПВ):
СОовВІ: ВУТМа (- 5ЕО ІЮ МО:7)
СОоР2: АІМАЗаСОЗГУМАреУКа (- 5ЕО І МО:8)
СОовВЗ: ОВВОВСЕММИ І У5БаВУЕМ (- 5ЕО І МО:9)
ГЕ СОК домену УУпи -33200Зтосді, і другий імуноглобуліновий окремий варіабельний домен (б), вибраний із групи імуноглобулінових окремих варіабельних доменів (ІМ) і (М), що визначаються наявністю наступних СОК-послідовностей: (ІМ):
СОВІ: 5БМАМОИ (- 5ЕО ІО МО:10)
СОоР2: АІМуЗа,ЗТУМАОБУКа (- 5ЕО ІЮ МО 711)
СОВЗ: БРІРМаБІ ЇЇ АААМММОМ (- 5БЕО 1О МО:12)
ГЕ СОК домену МпіЗа-093АО1) (М):
СОВІ: БМАМОИ (- З5ЕО ІО МО:13)
СОР2: АІЗМунЗИаЗТУМАрБУКа (- 5ЕО ІЮ МО: 14)
СОВЗ: ОРВаУСМАММУБАМУЕМ (- 5ЕО ІЮ МО:15)
ГЕ СОК домену М/піЗа-367В10).
Використання термінів "перший" і "другий" по відношенню до цих імуноглобулінових окремих варіабельних доменів призначене тільки для позначення того, що ці домени є різними доменами, тому що вони містять різні СОК-послідовності й зв'язуються з різними епітопами.
Однак дані терміни не слід розуміти як такі, що позначають точний порядок або послідовність доменів у подібному поліпептидному ланцюзі. Інакше кажучи, вищевказані імуноглобулінові окремі варіабельні домени (а) і (б) у поліпептиді згідно з винаходом можуть бути розташовані в порядку (а) - (б) або в порядку (б) - (а).
Термін "специфічно зв'язуються з І КРБ або І КРб" слід розуміти як те, що імуноглобулінові окремі варіабельні домени (а) і (б) є перехреснореактивними по відношенню до ІРР і | КРБ.
Само собою, зв'язувальні властивості таких молекул визначаються їх (СОК) послідовностями, (610) так що викладена вище й у формулі ознака "специфічно зв'язуються з /КР5 або І ЕРб"
призначена тільки для ілюстрування практичного застосування винаходу, але не для обмеження його обсягу.
Імуноглобулінові окремі варіабельні домени, як правило, складаються по суті із чотирьох каркасних ділянок (ЕК1-ЕК4, відповідно) і трьох ділянок, що визначають комплементарність (СОВ1-СОКЗ, відповідно). Щоб знаходитися в одному поліпептиді або поліпептидному ланцюзі, вказані перший і другий імуноглобулінові окремі варіабельні домени повинні бути ковалентно зв'язані, або прямо, або через пептид-лінкер.
Тому загальну структуру молекул згідно з винаходом можна також зобразити як:
ЕВ(а)1-СОНА(а)1-ЕК(а)2-СОВ(а)2-ЕВ(а)3-СОВ(а)3-ЕВ(а)4 - (пептид-лінкер) - ЕК(6)1-СОР(0)1-
ЕР(6)2-СО8(6)2-ЕК6)3-СОК(6)3-ЕК(6)4 де
ЕК(а) позначає каркасну ділянку першого імуноглобулінового окремого варіабельного домену,
ЕК(б) позначає каркасну ділянку другого імуноглобулінового окремого варіабельного домену,
СОка) позначає СОК першого імуноглобулінового окремого варіабельного домену,
СОК(б) позначає СОК другого імуноглобулінового окремого варіабельного домену,
Іпептид-лінкер)| позначає пептид, що необов'язково може бути присутній, -лінкер, при цьому СОК мають визначені вище послідовності.
Знову-таки слід розуміти, що (а) і (б) можуть мінятися місцями, тобто, молекули із загальною структурою
ЕР(6)1-СОК(6)1-ЕК(6)2-СОК(6)2-ЕК(6)3-СОК(6)3-ЕК(0)4 - |пептид-лінкері - ЕВ(а)1-СОВ(а)1-
ЕВ(а)2-СОН(а)2-ЕН(а)3-СОВ(а)3-ЕВ(а)д теж охоплюються даним винаходом.
Пептид-лінкер необов'язково містить третій домен або складається з нього, такий, як альбумінзв'язувальний імуноглобуліновий окремий варіабельний домен, як-те домен АЇБ11, що містить наступні СОК:
СОН(АЇІВ11)1: БРОаМ5 (- 5ЕО І МО:16)
СОН(АЇІВ11)2: ІЗ БОаБОТІ МАОБУКа (- ЗЕО ІЮ МО:17)
СОН(АЇІВ11)3: 51 5А (- 5ЕО ІЮ МО:18)
Звідси випливає група поліпептидів згідно з винаходом з наступною загальною структурою:
ЕВ(а)1-СОА(а)1-ЕК(а)2-СОВ(а)2-ЕВ(а)3-СОВ(а)3-ЕН(а)ї - (пептид-лінкер)| - ЕВ(АЇІБ11)1-
СОН(АЇІВ11)1-ЕВ(АІЬ11)2-СОВ(АЇЬТ1)2-ЕВ(АІЬ11)3-СОВ(АЬТ1)3-ЕА(АІЬ11)4 - (Іпептид-лінкер) -
ЕР(6)1-СОК(6)1-ЕК(6)2-СОК(6)2-ЕК(6)3-СОК(6)3-ЕК(06)4.
Знову-таки, порядок трьох імуноглобулінових окремих варіабельних доменів (а), (б) і АІБ11 не закріплений, навпаки, поліпептиди з наступним порядком вищевказаних доменів: (6) - АІБІ11 - (а) теж охоплюються.
Більше того, винаходом також охоплені поліпептиди, у яких домен АЇБ11 знаходиться на М- або С-кінці поліпептиду (напр., АЇІБ11 -- (а) - (6), АІБ11 - (6) - (а), (а) - (6) - АІБ11, або ж (6) - (а) -
А|Ь11).
У трьох кращих варіантах здійснення поліпептиди згідно з винаходом містять імуноглобулінові окремі варіабельні домени, визначені в такий спосіб:
Перший переважний варіант здійснення: Поліпептиди, що містять перший імуноглобуліновий окремий варіабельний домен з наступними послідовностями СОК:
СОовІ: тУТМа (- ЗЕО І МО)
СОР2: АІВАНазвзтуУМАреУКа (- 5ЕО І МО:2)
СОВЗ: ОТАТМАГ ГГ ОМАМОМ (- 5ЕО ІЮ МОЗ) і другий імуноглобуліновий окремий варіабельний домен з наступними послідовностями
Сов:
СОВІ: 5БМАМОИ (- 5ЕО ІО МО:10)
СОоР2: АІМуЗа,ЗТУМАОБУКа (- 5ЕО ІЮ МО 711)
СОВЗ: БРІРМаБІ І АА!ААМММОМ (- 5БЕО ІО МО:12).
Другий переважний варіант здійснення: Поліпептиди, що містять перший імуноглобуліновий окремий варіабельний домен з наступними послідовностями СО:
СОН: БМАМОа (- 5ЕО 1Ю МО:4)
СОов2: АІААЗОаВАТУМАОБУКа (- 5ЕО ІЮ МО:5)
СОВЗ: АВАУАЗЗТАУМТа ГУМ/МЕМ (- ЗЕО І МО:6) і другий імуноглобуліновий окремий варіабельний домен з наступними послідовностями бо Сов:
СОВІ: БМАМОИ (- З5ЕО ІО МО:13)
СОР2: АІЗМУнЗИаЗТУМАрБУКа (- 5ЕО 10 МО 14)
СОВЗ: ОРВаУСМАММУБАМУЕМ (- 5ЕО ІЮ МО:15).
Третій переважний варіант здійснення: Поліпептиди, що містять перший імуноглобуліновий окремий варіабельний домен з наступними послідовностями СО:
СОовВІ: ВУТМа (- 5ЕО ІЮ МО:7)
СОоР2: АІМАЗСаСЗГУМАрБУКа (- 5ЕО І МО: 8)
СОовВЗ: ОВВОВСЕММИ І У5БаВУЕМ (- 5ЕО І МО:9) і другий імуноглобуліновий окремий варіабельний домен з наступними послідовностями
Сов:
СОВІ: БМАМОИ (- З5ЕО ІО МО:13)
СОР2: АІЗМунЗИаЗТУМАрБУКа (- 5ЕО ІЮ МО: 14)
СОВЗ: ОРВаУСМАММУБАМУЕМ (- 5ЕО ІЮ МО:15).
Зрозуміло, вищевикладені варіанти - тобто пептиди, що необов'язково містять, -лінкери та/або додаткові домени, особливо домен АЇБ11, з різним порядком імуноглобулінових окремих варіабельних доменів - застосовні й до цих трьох переважних варіантів здійснення.
В особливо кращому варіанті здійснення альбумінзв'язувальний імуноглобуліновий окремий варіабельний домен розташовано між двома І КРБ/ КРб-зв'язувальними імуноглобуліновими окремими варіабельними доменами. Тому три особливо переважні варіанти здійснення можна представити в такий спосіб:
Перший особливо переважний варіант здійснення: Поліпептиди, що містять перший (ГАРБ/ АРб-зв'язувальний) імуноглобуліновий окремий варіабельний домен з наступними послідовностями СО:
СОовІ: тУТМа (- ЗЕО І МО)
СОов2: АІВАНазвзтУМАрБУка (- 5ЕО І МО:2)
СОВЗ: ОТАТМАГ ГГ ОМАМОМ (- 5ЕО ІЮ МОЗ) альбумінзв'язувальний імуноглобуліновий окремий варіабельний домен з наступними послідовностями СО:
СОН: 5РОамМ5 (- 5ЕО ІЮ МО 16) зо Сов: 5ІЗОБОЗОТІ МАОБУКа (- ЗЕО І МО:17)
СовВЗ: аавбІ ЗА (- 5ЕО І МО:18); і другий (ІКРБ/ КРб-зв'язувальний) імуноглобуліновий окремий варіабельний домен з наступними послідовностями СОК:
СОВІ: 5БМАМОИ (- 5ЕО ІО МО:10)
СОоР2: АІМуЗа,ЗТУМАОБУКа (- 5ЕО ІЮ МО 711)
СОВЗ: БРІРМаБІ ЇЇ АААМММОМ (- 5БЕО ІО МО:12); або у викладеному порядку, або зі зміненим порядком вищевказаних доменів.
Другий особливо переважний варіант здійснення: Поліпептиди, що містять перший (ГАРБ/ АРб-зв'язувальний) імуноглобуліновий окремий варіабельний домен з наступними послідовностями СОК:
СОВІ: БМАМОа (- 5ЕО І МО 4)
СОов2: АІААЗОаВАТУМАОБУКа (- 5ЕО ІЮ МО:5)
СОВЗ: АВАУВЗЗТАУМТа ГУМ/МЕМ (- ЗЕО ІЮ МО:6); альбумінзв'язувальний імуноглобуліновий окремий варіабельний домен з наступними послідовностями СОК:
СОН: 5РОамМ5 (- 5ЕО ІЮ МО 16)
СОовРг: 5ІЗОБОЗОТІ МАОБУКа (- ЗЕО ІЮ МО:17)
СовВЗ: аавбІ ЗА (- 5ЕО ІЮО МО:18); і другий (ІКРБ/ КРб-зв'язувальний) імуноглобуліновий окремий варіабельний домен з наступними послідовностями СОК:
СОВІ: БМАМОИ (- З5ЕО ІО МО:13)
СОР2: АІЗМунЗИаЗТУМАрБУКа (- 5ЕО ІЮ МО: 14)
СОВЗ: ОРВаУСМАММУБАМУЕМ (- 5ЕО ІЮО МО:15); або у викладеному порядку, або зі зміненим порядком вищевказаних доменів.
Третій особливо переважний варіант здійснення: Поліпептиди, що містять перший (ГАРБ/ АРб-зв'язувальний) імуноглобуліновий окремий варіабельний домен з наступними послідовностями СО:
СОовВІ: ВУТМа (- 5ЕО ІЮ МО:7)
СОоР2: АІМАЗаСОЗГУМАреУКа (- 5ЕО І МО:8) (610) СОовВЗ: ОВВОВСЕММИ І У5БаВУЕМ (- 5ЕО І МО:9);
альбумінзв'язувальний імуноглобуліновий окремий варіабельний домен з наступними послідовностями СО:
СОН: 5РОамМ5 (- 5ЕО ІЮ МО 16)
Сов: 5ІЗОБОЗОТІ МАОБУКа (- ЗЕО І МО:17)
СовВЗ: аавбІ ЗА (- 5ЕО ІЮО МО:18); і другий (ІКРБ/ КРб-зв'язувальний) імуноглобуліновий окремий варіабельний домен з наступними послідовностями СОК:
СОВІ: БМАМОИ (- З5ЕО ІО МО:13)
СОР2: АІЗМунЗИаЗТУМАрБУКа (- 5ЕО ІЮ МО: 14)
СОВЗ: ОРВаУСМАММУБАМУЕМ (- 5ЕО ІЮ МО:15); або у викладеному порядку, або зі зміненим порядком вищевказаних доменів.
Вищезгадані послідовності СОК зведені в Таблицях ІА, ІБ і ІВ:
Таблиця ІА
Послідовності СОР. імуноглобулінових окремих варіабельних доменів, що перешкоджають передачі сигналу М/пИ ши Мп -333ЕОбтоа МУпи -3330:06 Мп -33200Зтоа сов! тТУтУув ЗУАМО УМО
ЗЕО ІЮ МО ЗЕО І МОА ЗЕО ІО МО:7 сово АІвВАвазвзтУМАреУка |АввЗавАТУМАрУКа АмзааеГУМАрБУКОа
ЗЕО ІЮ МО ЗЕО І МО ЗЕО ІЮ МО:8 сов ОТАТМАПОУвУрУ АВВУВО5ЗТАУМТаТтМмУММЕМ | ВААВаВСОСЕММІ І У55аВМЕМ
ЗЕО І МОЗ ЗЕО ІЮ МО:6 ЗЕО ІЮ МО:9
Таблиця ІБ
Послідовності СОР. імуноглобулінових окремих варіабельних доменів, що перешкоджають передачі сигналу УУпіЗа ши М/піЗа-093А01 М/піЗа-367810 сов! ЗУАМа ЗУАМа
ЗЕО І МО:10 ЗЕО І МО: 13 сов2 АІБМУуЗИаЗТУМАрВУКО АІБУунЗзавтуУАрзУКа
ЗЕО ІЮ МО-11 ЗЕО ІО МО:14 сов ЗРІРУМаБІИ ЇЇ АВАМММОМ ОРАВаМамМАМУБАМУУЕУ
ЗЕО І МО2 ЗЕО І МО:15
Таблиця ІВ
Послідовності СОК імуноглобулінових окремих варіабельних доменів, що зв'язуються із сироватковим альбуміном (домен АЇБ11) ни АЇЬ11 домен зЕамМ5
Сон! ЗЕО 0 МО76 зіБаБавоті мМАрБУКО
Сонг ЗЕО ПО МО: 17 азів
Сон ЗЕОО МО78
Додатково до вищевстановлених послідовностей СОК імуноглобулінові окремі варіабельні домени, що містяться в поліпептидах згідно 3 винаходом, містять послідовності імуноглобулінових каркасних ділянок (ЕК). Ці послідовності переважно не є імуногенними для людей, і тому переважно є людськими або гуманізованими ЕК-послідовностями. Прийнятні людські або гуманізовані ЕК-послідовності відомі з рівня техніки. Особливо кращі послідовності
ЕК можна знайти в показані нижче варіантах здійснення, що описують повні імуноглобулінові окремі варіабельні домени, а отже, і послідовності СОРЕ. і ЕВ.
Згідно з більш конкретним варіантом здійснення поліпептиди згідно з винаходом включають імуноглобулінові окремі варіабельні домени, що є доменами УНН, переважно гуманізованими доменами УНН.
Відповідно до ще більш конкретного варіанту здійснення поліпептиди згідно з винаходом містять перший імуноглобуліновий окремий варіабельний домен (а), вибраний із групи імуноглобулінових окремих варіабельних доменів від (І) до (ІІ), які мають наступні послідовності: ее:
АУОБУВЯОООСТ ОВО ВІ СсАЗВОВТЕВТУТУЄСУВВОАРОКЕВВЕУА ав сяхтУУАВУКОСВЕТВОМчЕМТУ У ОМАРА СА
ІКАО ХК ОХОТУ ТУєх
Ге домен УЗ Обин я ББО ПО ОО
АОС УКВБКНИ У ОРЕ КІ ВСААВСОССТЕВВ У АМОКККОАРОБЕКЕКУ А
АТВЕСВВТУХАЮУКОВЕТІНОМЕКМТУ ХУ ОМ ЕРЕОТАЖУСАА зЕКУКО СЛ ОТ КАИКТ У КОСТУТУЄУ
Її: домен Ж ЗЗ3О06: я КО ТО МСБО, ( аа УЧНІ КО АЗОТ У ТУ У ККОАРОКЕКЕУ А ау ТУУАЮВУКОВРТІЧКОМЕКМТУ У ОММВ ВРЕОТАУ Ж УСАА
ВК ЦЕ ра мо Ото У гУхе іїе домен У ЗО НКнНваой є БЕН МОЦІ, і другий імуноглобуліновий окремий варіабельний домен (б), вибраний із групи, що складається з імуноглобулінових окремих варіабельних доменів (ІМ) і (М), які мають наступні послідовності: пт
ВИСНОВКИ У СРО КТ СА АВС КАМИ КВАС А
АБО Оо т тТАБУКОКЕ ПКМУ Самим
Мо ВЕК хаос Ух і домен ЖАН: ее ВКО ОО МОЗ
УВУ БНО ОВО КЕКС ААВОУ ТЕБЕ АМОКЕКОАРОКЕКЕКУ А
АВ ОБТУУАОЯУКОВЕТІЯВОМВКМТУУСОММНСВРЕПТАУТУСАХ пвекотОоУ АХА КК ООСТСУгУхх ре домен Жайа Ниви є КО ОКХ,
Переважними варіантами здійснення є поліпептиди, що містять - перший імуноглобуліновий окремий варіабельний домен з амінокислотною послідовністю згідно із 5ЕО ОО МО:19 і другий імуноглобуліновий окремий варіабельний домен з амінокислотною послідовністю згідно із ЗЕО ІЮ МО:22; або - перший імуноглобуліновий окремий варіабельний домен з амінокислотною послідовністю згідно із 5ЕО ОО МО:20 і другий імуноглобуліновий окремий варіабельний домен з амінокислотною послідовністю згідно із ЗЕО ІЮ МО:23; або - перший імуноглобуліновий окремий варіабельний домен з амінокислотною послідовністю згідно із 5ЕО ОО МО:21 і другий імуноглобуліновий окремий варіабельний домен з амінокислотною послідовністю згідно із ЗЕО ІЮ МО:23.
Таким чином, вищеописані варіанти здійснення можна схематично зобразити як іовд(а) - (пептид-лінкері - іовд(б), де "іовд" позначає відповідний імуноглобуліновий окремий варіабельний домен, а інші визначення й варіанти залишаються такими ж, як й вище, особливо відносно наявності необов'язкових пептидів-лінкерів та/"або додаткових доменів, особливо домену АЇБ11, а також відносно різних порядків імуноглобулінових окремих варіабельних доменів.
Згідно з конкретними варіантами здійснення вищевказані поліпептиди можуть додатково містити фрагмент, що продовжує період напіввиведення, при цьому вказаний фрагмент, що продовжує період напіввиведення, ковалентно зв'язаний із вказаним поліпептидом (« необов'язково вибраний із групи, що складається з альбумінзв'язувального фрагмента, такого як альбумінзв'язувальний пептид або альбумінзв'язувальний імуноглобуліновий домен, переважно альбумінзв'язувальний імуноглобуліновий окремий варіабельний домен, більш переважно домен АЇБ11, трансферинзв'язувального фрагмента, такого як антитрансфериновий імуноглобуліновий домен, молекули поліетиленгліколю, сироваткового альбуміну, переважно людського сироваткового альбуміну, а також фрагмента (людського) сироваткового альбуміну.
Послідовність вищезгаданого імуноглобулінового окремого варіабельного домену АЇр11 наступна: веОоСБуУКВОосОоУсРОМмН ВіЕСлаАвСсвТваВкаМмаеУКОАвКЕМУВ що рі уАСЗУКОКТІЗКОМактт. УТ ОоММмеВРЕОТАУ ХУСТ сома кЗОТУТУХЯ
Се домен МІВ є БО ЦО МОЯ
Подальші приклади імуноглобулінових окремих варіабельних доменів, що зв'язуються з людським сироватковим альбуміном, відомі з рівня техніки й детально описані в, напр., міжнародних патентних публікаціях УМО2006/122787 і М/О2008/028977. Інші пептиди, що зв'язуються з людським сироватковим альбуміном, описані, напр., в УМО2008/068280,
УМО2009/127691 ії ММО2011/095545.
Таким чином, трьома кращими конкретними варіантами здійснення винаходи є:
Перший переважний конкретний варіант здійснення: Поліпептиди, що містять - перший (ГЕР5Б//КРБб-зв'язувальний) імуноглобуліновий окремий варіабельний домен з амінокислотною послідовністю згідно із ЗЕО ІЮ МО:19; - альбумінзв'язувальний імуноглобуліновий окремий варіабельний домен з амінокислотною послідовністю згідно із ЗЕО ІЮ МО:24; - другий (КРБ/Л КРб-зв'язувальний) імуноглобуліновий окремий варіабельний домен з амінокислотною послідовністю згідно із «ЕО ІЮ МО:22; або у викладеному порядку, або зі зміненим порядком вищевказаних трьох доменів.
Другий переважний конкретний варіант здійснення: Поліпептиди, що містять - перший (ГЕР5Б//КРБб-зв'язувальний) імуноглобуліновий окремий варіабельний домен з амінокислотною послідовністю згідно із ЗЕО ІЮ МО:20; - альбумінзв'язувальний імуноглобуліновий окремий варіабельний домен з амінокислотною послідовністю згідно із ЗЕО ІЮ МО:24; - другий (І КРБ/ КРб-зв'язувальний) імуноглобуліновий окремий варіабельний домен з амінокислотною послідовністю згідно із ЗЕО ІЮ МО:23; або у викладеному порядку, або зі зміненим порядком вищевказаних трьох доменів.
Третій переважний конкретний варіант здійснення: Поліпептиди, що містять - перший (ГЕР5Б//КРБб-зв'язувальний) імуноглобуліновий окремий варіабельний домен з амінокислотною послідовністю згідно із ЗЕО ІЮ МО:21; - альбумінзв'язувальний імуноглобуліновий окремий варіабельний домен з амінокислотною послідовністю згідно із ЗЕО ІЮ МО:24; - другий (КРБ/Л КРб-зв'язувальний) імуноглобуліновий окремий варіабельний домен з амінокислотною послідовністю згідно із ЗЕО ІЮ МО:23; або у викладеному порядку, або зі зміненим порядком вищевказаних трьох доменів.
У ще більш кращих конкретних варіантах здійснення альбумінзв'язувальний імуноглобуліновий окремий варіабельний домен розташовано між двома ІКРБ/ЛЕКРб- зв'язувальними імуноглобуліновими окремими варіабельними доменами.
Послідовності вищезгаданих імуноглобулінових окремих варіабельних доменів зведені в
Таблицях ПА, ПІБ і ІВ:
Таблиця ПА
Послідовності імуноглобулінових окремих варіабельних доменів, що перешкоджають передачі сигналу УУПИ
МНН Ір
Мп - АМОІЇМЕ5 ВЕТІЗВОМ
ЗЗЗЕОбто | ЧСС МОР МЕВОАРС АІвАвазвзі5КМТУМ О ОТВТУАН МСОСсТтІі М а аавбівВІБЗ | ТУТУС КЕВЕЕМА ТУМАОБУКІ ММ5І АРЕ ОУвУру тусе
ЗЕО ІОЇ СААЗа ВТ (Є. ртАМУУС
МО:19 Е5 АА мпи- АМОІЇМЕ5 ВЕТІЗВОМ сааі мор АввБавВв|5КМТУМІ ОЇ АВАУВНЗ5 зе до 5ІВІ5 |8УАМЕ ПЕОМ ТУУАОБУК ММБІАРЕ | ТВУМТет |У ! СААБОССТ (Є. ОТАМУМО | МЛМ/М/ЕУ
МО:20
Е5 АА
Мп - АМОІЇМЕ5 ВЕТІЗВОМ 33200Зто | СИС МОР АмнЗзасеї ЗКМТУмМ ОО рАваває а СОБІВІ5 |ВУТМО МИЛО ТУУАОБУК ММБІАРЕ |У а
ЗЕО ІОЇ СААБаЇ ТЕ (Є. рТАМУМО | ФАМЕУ
МО:21 З АА
Таблиця ІБ
Послідовності імуноглобулінових окремих варіабельних доменів, що перешкоджають передачі сигналу УУпіЗа
МНН Ір
Мупіза- ЕМОІ МЕ5 ВЕТІЗВОМ сааі мор АІБМУБаСі | КМТМУМІ ОЇ 5РІРМОаБІ.
ОБО р Зб8ІНІ5 |ЗУАМО АКА | ЗТУУАОБМ ММБІАРЕ АААММУ | МТУ
МО: 22 СААбОаВТ ка ртТАМУМО | СОУ
І Е5 АА
Мупіза- ЕМОІ МЕ5 ВЕТІЗВОМ сааі мор АІБМУвнБа | 5КМТУМ ОЇ ОРАДаМИаМ
ЗО ресвІВІВ 5УАМО ТАКТУ |ЗТУУАОЗМ ММВІ АРЕ | АУУБАУУЄ ГАВОТМ
МО: 23 СААБОССТ ка РТАМУМС |У
І Е5 АА
Таблиця ІІВ
Послідовності імуноглобулінових окремих варіабельних доменів, що зв'язуються із сироватковим альбуміном (домен АЇБ11)
МНН Ір
ЕМОІ МЕ5 ВЕТІЗВОМ
АІЬ11 сааі мор зіБавзазріАКТІМ о
ЕО ромеівія |зРоме | МОНОМРО піуАОБУК|ММБІАРЕ |совіяя |ОБОЯТУТ
МО:24 СААБИЕТЕ (Є. рТАМУУСТ
З
Як установлено вище, (принаймні два) імуноглобулінові окремих варіабельні домени в поліпептиді згідно з винаходом можуть бути з'єднано один з одним прямо, без використання лінкера, або ж через лінкер. Лінкер переважно є пептидним лінкером і, згідно з винаходом, підібраний так, щоб уможливити зв'язування принаймні двох імуноглобулінових окремих варіабельних доменів з кожної з них епітопних мішеней.
Підходящі лінкери іпіег айа залежать від епітопів і особливо від відстані між епітопами, з якими зв'язуються імуноглобулінові окремі варіабельні домени, на молекулах-мішенях.
Фахівцеві це буде зрозуміло на основі даного опису, необов'язково - після деякої обмеженої кількості рутинних експериментів.
Таким чином, підходящі лінкери можуть містити амінокислотну послідовність, напр., довжиною в 9 або більше амінокислот, переважно принаймні 17 амінокислот, наприклад, приблизно 20-40 амінокислот. Послідовність лінкера може бути такою, що зустрічається в природі або що не зустрічається в природі. У випадку застосування в терапевтичних цілях лінкер переважно не є імуногенним для суб'єкта, якому вводять поліпептид згідно з винаходом.
Однією із придатних груп лінкерних послідовностей є лінкери, отримані із шарнірної ділянки важколанцюгових антитіл, згідно з описом в УМО1996/34103 ії УМО1994/04678. Іншим прикладом є поліаланінові лінкерні послідовності, такі, як Аіа-Аїа-Аїпа.
Подальшими кращими прикладами лінкерних послідовностей є лінкери сСіу/Зег різної довжини, такі, як лінкери (діухзегу)», включаючи, напр., (діу«5ег)з, (діу«5ег)», (діу«5ег)?, (а1узвег)з, (діузвег)», (аІузвег)?, (дІузвегг)з, (діузвегг)» і (діуз5ег2)7.
Альтернативно або додатково до поліпептидного лінкеру принаймні два імуноглобулінових окремих варіабельні домени в поліпептиді згідно з винаходом можуть бути з'єднано один з одним за допомогою іншого фрагмента, такого як інший поліпептид, який у кращому, але не єдиному варіанті здійснення може бути додатковим імуноглобуліновим окремим варіабельним доменом, згідно з вже даним вище визначенням. Такий фрагмент може бути по суті неактивним або може виявляти біологічний ефект, такий як поліпшення бажаних властивостей поліпептиду, або ж може надавати поліпептиду одну або більше додаткових бажаних властивостей. Як уже викладалося вище, кращий додатковий поліпептидний домен продовжує період напіввиведення поліпептиду, будучи таким, як домен, що зв'язується з (людським) сироватковим альбуміном, такий як домен АЇБ11.
Тому згідно з наступним варіантом здійснення винахід особливо охоплює поліпептиди, що містять будь-яку з нижченаведених послідовностей, при цьому точні амінокислотні послідовності можна взяти з Таблиці ІЇЇ нижче:
ЗЕО ІЮ МО:25 (- послідовність поліпептиду ЕО13500575),
ЗЕО ІЮ МО:26 (- послідовність поліпептиду ЕО13500571), і
ЗЕО ІЮ МО:27 (х послідовність поліпептиду ЕО13500720).
Відповідно до ще більш конкретного варіанту здійснення поліпептиди згідно з винаходом вибрані з наступної групи молекул:
Поліпептид РО13500575 з послідовністю 5ЕО ІЮ МО:25,
Поліпептид ЕО13500571 з послідовністю 5ЕО ІЮ МО:26, і
Поліпептид РО13500720 з послідовністю 5ЕО ІЮ МО:27.
Таблиця ЇЇ
Послідовності трьох конкретних варіантів здійснення поліпептидів згідно з винаходом
Я мінакнелотна вослічовніть воолідовнают СО мінндеєлені 0000 кое мо; А нвавиенукна поси азаніз с повліва вч СО вілевеслеві :
ВО УХАПОУКЦКРТЕНОМеКМТУ ОМВО АУУУСААВТВК
ОБО ТО МО а ВО ЗО У ТУ ВИК КН О КН ВОЛО ВН ВО ! | сиве У ВВ ОВ ААЖОЗЕТЕ АЕС УВОАРОКОВЕ : ! ОХОЛОВ КОКЕПЗКОМАКТТЬУСОММАВЕОТАУ У УСТ : і ПлЬЗКІВОИТ КУ ГУК НИНІ КВН ИН НН ВС НХ : ОБОВ АВЕУКОКРЕТВОМЕКМТУУ ОМА УСВА ! КВІТ : А в о МУ КВ що чо Р що. щ. КО АЖ ї ТЕБЕ аАМО ЖЕ кох Р З БЖ КРУ. алі і
ІОВ УАЮЗУКЦВР ВОМУ ОММ ВЕК ААУ ААКНУЮ
ЕОМ Мете БТ ЖК ЖК У ТУЯ ВОСВЗО ЦО ВОВИ СНО у
ЕНН ВЕ ОМ УКОСИ УСНІ ВСАА ЕТ КІРОВА МУВОАР, ! КОС ВУУЗВІКО МОЗ АХ КОИИ ТВО МАКТТ БОМ АРТ і ж в и НА В В З М и Ж в ЦЕ ЦК КТ ВЕ,
КН ВУЄМУЮВОСО СУС ВО ВБІСААВООСТЕЗ ВУ Ам ХЕВОАВОКЕВК ОО
І БУЛА ЖжВЗОкТУАОІЖБОВРТВнИМЕКМТУУ ТОМА АА кни ЗаютоВ ТАКЕ ЖЕКСОМУ ННІ КЕЕСААКНС БА ЖТ МОЖЕ КО АРО КНЕУ ААУ : ОО УАВЗУКОКИТІКрМКМТУ УТ НМ ВРЕОТАУТУСААВВВОВ жЕОпБмОвІ 0 Цю мову УсОоОотУТУВВОССНИНКСЮЗВООВОЗО ОСОБ
ЕНН УМ НИКИ УС ВСАА ИЕТЕВЕО МАКИ В
! п У УКВ ОТ КА УКОВЕ КОМА КтТ т ОМС А У Е
І Іх ето Ват УТ УНК ОВЕН ВО ОО БОКИ ОКО ООВ
В НЕННЯ ОР ОВК САаМІ ва АМС УКВОАРОКЕВЕтуда ОТУХАВЯУКОВИТІВИМЕКМТе Уч ОМ ВВА ЖУСАВ
Як пояснювалося раніше, якщо не вказане інше, то поліпептиди згідно з винаходом можуть містити подальші фрагменти та/або додаткові поліпептидні домени, якщо тільки такий додатковий фрагмент або домен не перешкоджає їх зв'язуванню з І ЕРБ/ КРб.
Поліпептиди згідно з винаходом можуть додатково містити модифікації, такі як глікозильні залишки або модифіковані амінокислотні бокові ланцюги, а також можуть Пегілуватися з метою продовження періоду напіввиведення й інших властивостей подібної молекули. Методи й реактиви для Пегілування біпаратопних конструкцій імуноглобулінових окремих варіабельних доменів можна знайти, напр., в М/О2011/107507.
Поліпептиди згідно з винаходом можуть мати модифіковану на М-кінці послідовність, напр., з видаленням однієї або більше М-кінцевих амінокислот, або ж із заміною напр., першої М- кінцевої амінокислоти (напр., глутамату на аланін), з метою оптимізації молекули для експресії в певних системах експресії (таких, як конкретні вектори або клітини-хазяї), або ж для експресії як тілець включення або в розчинній формі, або ж для секретування в середовище або периплазматичний простір або для втримання в клітині або ж для одержання більш гомогенного продукту. Поліпептиди згідно з винаходом можуть мати модифіковану на С-кінці послідовність, напр., з додатковим аланіном (як показано для трьох варіантів здійснення в
Таблиці ІІЇ вище) та/"або з додатковими амінокислотними замінами в С- кінцевій частині або в інших установлених положеннях будь-якої з каркасних ділянок, згідно з поясненнями, напр., в
МО2012/175741, УМО2011/075861 або УУО2013/024059, з метою подальшого поліпшення стабільності або зниження імуногенності таких поліпептидів.
Крім того, період напіввиведення поліпептидів згідно з винаходом можна продовжити додаванням альбумінового домену, тобто, перетворивши їх в альбумінові злиті білки. Приклади підходящих альбумінових фрагментів і методи їх додавання до зв'язувальних молекул описані, напр., в МО2001/079271 і УМО2003/059934.
Переважно поліпептиди згідно з винаходом мають значення зв'язування (ЕС50О), виміряні аналізом зв'язування ЕАС5, описаним у Прикладі 7.1 нижче, у діапазоні 104 моль/літр або менше, більш переважно 107 моль/літр або менше, ще більш переважно в діапазоні від 1079 до 1073 моль/літр, або мають значення ІС5О0, виміряне комбінованим аналізом за геном-
репортером М/пИ і М/піЗа, описаним у Прикладі 7.3 нижче, 109 моль/літр або менше, більш переважно в діапазоні від 5х10-79 моль/літр до 1072 моль/літр.
Поліпептиди згідно з винаходом уможливлюють більш ефективне лікування ряду типів раку, таких як ТНРМ3З, КРР і НДКРЛ. У них поліпшені іп міо характеристики (тобто, більш висока ефективність пригнічення шляху УУпО), див., напр., Приклади 7 і 8 нижче, а також значні здатності пригнічувати ріст пухлини іп мімо, що веде до більш високої ефективності іп мімо у порівнянні з іншими зв'язувальними І КРб молекулами, що показано, напр., Прикладами 29 і 10 нижче.
Зокрема, як показано іп омімо на моделі пухлини, викликаної МуУпі, біпаратопні перехреснореактивні за ГКРБЗ/ЛКРб гуманізовані МНН-конструкти із продовженим періодом напіввиведення були здатні пригнічувати МУпі-сигналінг і ріст пухлини іп мімо, забезпечуючи навіть значне зменшення пухлини (тобто, пригнічення росту пухлини більше ніж на 100 95), чого в тих же експериментальних умовах не можна було досягти за допомогою відомої зв'язувальної
ІКРб речовини. Зменшення пухлини (тобто, регрес пухлини) є, поза всіляким сумнівом, бажаним терапевтичним ефектом (тобто, дієвістю) при лікуванні хворих на рак пацієнтів. Більше того, регрес пухлини, що приводить до повної патоморфологічної відповіді (пПВ), є визнаною клінічною кінцевою точкою, що свідчить про значне поліпшення виживаності без прогресування й загальної виживаності.
У тих же експериментах іп мімо не спостерігали значимих змін маси тіла (« 1095), а результати гістопатологічних аналізів шлунково-кишкових тканин не показали якого-небудь токсичного впливу вищезгаданих поліпептидів згідно з винаходом. Це особливо дивно з урахуванням вищезгаданих досліджень експресії ОККІ іп мімо (тобто, що приводили до виразки слизової кишечнику й втрати маси тіла).
Таким чином, поліпептиди згідно з винаходом фактично забезпечують нові терапевтичні можливості для лікування ракових захворювань, особливо у випадку великої нереалізованої медичної потреби, такої, як, напр., при (тричі негативному) раку молочної залози.
Як не дивно, винахідники прийшли до такого розв'язку не за традиційним шляхом, тобто, намагаючись розробити інгібітори або зв'язувальні молекули З високою специфічністю/селективністю за однією певною мішенню, такою як ЇКРб (що згадується як мішень для лікування "захворювань, опосередкованих передачею сигналу УУпі", напр., в
ММО2009/056634). Навпаки, винахідники розробили молекули, націлені одночасно на два родинні білки - І КРб і КРБ - і в такий спосіб досягли вищеописаних значно поліпшених ефектів іп міїко і іп мімо, які не можна було припустити за відомій з рівня техніки інформації.
Молекулярний механізм, що лежить в основі такої переваги, ясний не повністю, однак можна припустити - не маючи наміру обмежуватися конкретною теорією - що подібні перехреснореактивні молекули можуть мати додатковий, а тому більш сильний вплив на досить заплутаний сигнальний каскад сигнального шляху Мп.
Вищеописані ефекти, що дають перевагу, додатково проілюстровані Прикладами нижче й наявними в них порівняльними даними.
Більше того, поліпептиди згідно з винаходом прості у виготовленні й краще розчиняються, що означає, що їх можна зберігати та/або вводити в більш високих в порівнянні зі звичайними антитілами концентраціях. Вони стабільні при кімнатній температурі й довше залишаються стабільними навіть при екстремальних значеннях рн, так що можуть виготовлятися, зберігатися та/або транспортуватися без використання холодильного обладнання, тим самим заощаджуючи фінанси, час і запобігаючи наслідкам для навколишнього середовища. Завдяки вищевикладеному, а також своїй низькій імуногенності, вони додатково відкривають ряд можливостей щодо шляхів введення, крім ін'єкцій і інфузій, а також щодо протоколів введення й використання конкретних обладнань.
Нуклеїнові кислоти, вектори, клітини-хазяї
Згідно з подальшими аспектами винахід стосується молекул нуклеїнових кислот і векторів експресії, що кодують поліпептиди згідно з винаходом, а також клітин-хазяїв, які їх експресують.
Ці нуклеїнові кислоти, вектори й клітини-хазяї корисні при виготовленні поліпептидів згідно з винаходом, і їх додаткові аспекти й варіанти здійснення будуть докладніше описані нижче у взаємозв'язку з викладом способів виробництва поліпептидів згідно з винаходом.
Терапевтичне застосування
Завдяки своїм біологічним властивостям поліпептиди згідно з винаходом придатні для лікування захворювань, що характеризуються надлишковою або аномальною проліферацією клітин, таких як рак і ідіопатичний легеневий фіброз (ІЛФ).
Наприклад, поліпептидами згідно з винаходом можна лікувати наступні ракові (610) захворювання, пухлини й інші проліферативні захворювання, не обмежуючись ними:
Рак голови й шиї; Рак легені, такий як, напр., недрібноклітинний рак легені (НДКРЛ) і дрібноклітинний рак легені (МКРЛ); Новоутворення середостіння, такі як, напр., нейрогенні пухлини й мезенхімальні пухлини; Рак шлунково-кишкового тракту (ШКТ), такий як, напр., рак стравоходу, шлунка, підшлункової залози, печінки й жовчних проток (включаючи, напр., печінковоклітинну карциному (ПКК)), а також тонкого й товстого кишечнику (включаючи, напр., колоректальний рак); Рак передміхурової залози; Рак яєчок; Гінекологічні види раку, такі як, напр., рак яєчників; Рак молочної залози, такий як, напр., карцинома молочної залози, гормон- рецептор-позитивний рак молочної залози, Нег2-позитивний рак молочної залози й тричі негативний рак молочної залози; Рак ендокринної системи; Саркоми м'яких тканин, такі як, напр., фібросаркома, рабдоміосаркома, ангіосаркома, саркома Капоши; Саркоми кісток, такі як, напр., мієлома, остеосаркома, пухлина Юінга, фібросаркома, остеохондрома, остеобластома й хондробластома; Мезотеліоми;
Рак шкіри, такий як, напр., карцинома базальних клітин, плоскоклітинна карцинома, карцинома клітин Меркеля й меланома; Новоутворення центральної нервової системи й головного мозку, такі як, напр., астроцитома, гліобластома, гліома, нейробластома й ретинобластома; Лімфоми й лейкози, такі, як, напр., В-клітинні неходжкінські лімфоми (НХЛ), Т- клітинні неходжкінські лімфоми, хронічний В-клітинний лімфоцитарний лейкоз (В-ХЛЛ), хронічний Т-клітинний лімфоцитарний лейкоз (Т-ХЛЛ), хвороба Ходжкіна (БХ), лейкоз із великими гранулярними лімфоцитами (ВГЛ), хронічний мієлогенний лейкоз (ХМЛ), гострий мієлогенний/мієлоїдний лейкоз (ОМЛ), гострий лімфатичний/лімфобластний лейкоз (ОЛЛ), множинна мієлома (ММ), плазмацитома й мієлодиспластичні синдроми (МДС); а також пухлини невідомої первинної локалізації.
Мається на увазі, що всі вищезгадані ракові захворювання, пухлини, новотвори і т.д., охарактеризовані конкретною локалізацією/місцем походження в тілі, включають як первинні пухлини, так і метастатичні пухлини, які походять від них.
Більш конкретно поліпептиди згідно з винаходом корисні при лікуванні таких захворювань, особливо ракових захворювань, при яких аномальна проліферація клітин викликана аномальним (активованим) УУпі-сигналінгом, або він приймає в ній участь.
Тому поліпептиди згідно з винаходом особливо корисні для лікування солідних пухлин, більш конкретно для лікування раку легень, печінки, ободової кишки, головного мозку, щитовидної залози, підшлункової залози, молочної залози, яєчників і передміхурової залози, а ще більш конкретно для лікування недрібноклітинного раку легень (НДКРЛ), тричі негативного раку молочної залози (ТНРМ3З) і колоректального раку (КРР). Зокрема, поліпептиди згідно з винаходом можна використовувати для лікування пацієнтів з місцевопоширеним або метастатичним ТНРМЗ, пацієнтів з метастатичним НДКРЛ або місцевопоширеним або метастатичним КРР, як один агент або в комбінації, з метою продовжити виживаність без прогресування (ВБП) і загальну виживаність (3В). Крім того, поліпептиди згідно з винаходом можна використовувати як неоад'ювантна терапія для пацієнтів з раком молочної залози з метою досягнення повної патоморфологічної відповіді (пПВ; визначається як відсутність залишкового інвазивного раку й раку іп 5йи при гістопатологічній оцінці повністю висіченого зразка молочної залози й проб із усіх регіонарних лімфовузлів після завершення неоад'ювантної системної терапії).
Поліпептиди згідно з винаходом можна використовувати в терапевтичних протоколах у контексті першої лінії, другої лінії або будь-якій подальшій лінії лікування.
Поліпептиди згідно з винаходом можна використовувати для профілактики, короткострокового або тривалого лікування вищезгаданих захворювань, необов'язково в комбінації із променевою терапією та/або хірургією.
Також поліпептиди згідно з винаходом особливо придатні для лікування інших захворювань, викликаних аномальною проліферацією клітин, у якій бере участь сигнальний шлях М/пї, таких 5о0 як ідіопатичний легеневий фіброз (ІЛФ). (Копідзпой і ін. "Рипсійопа! МУпі зідпаїїпу і5 іпстеазеад іп ідіоратіс ритопагу Прговів". Ріоз Опе 2008;3(5):62142; І ат і ін. "М/пі согесеріог І тр5 із а апмег ої ідіораїпіс ри!топагу їібго5ів". Ат У Незріг Стїї Саге Мед. 2014:190(2):185-95).
Крім того, поліпептиди згідно з винаходом особливо придатні для лікування ретинопатій, особливо для лікування діабетичної ретинопатії через аномальну активацію М/пі у клітинах внутрішньої сітківки, яка викликає посилене аномальне утворення кровоносних судин сітківки, що приводить до розвитку й прогресування діабетичної ретинопатії (Спеп У. і ін. "Асіїмайоп ої
Ше М/пі раїпжмау ріау5 а раїподепіс гоїє іп аіабеїййс гейпорашу іп питапз5 апа апіта! тодеї!в" Те
Ат У Раїйої. 2009; 175(6):2676-85., (зао і ін. "ЕЄІемаїєд ГАРб Іємеїб5 соїтеїа(є м/йй мазсшціаг епаоїнеїа! дгоули Тасіюг іп Пе міїгеоиз ої ргоїГегайме аіабеїйс гейпорашу" Мої Міб5. 2015:21:665-72). (610) Ї нарешті, оскільки показано, що пригнічення сигнальних шляхів Мп! Л/Л/піЗза може також впливати на дендритні клітини (ДК) ії функціонування дендритних клітин, поліпептиди згідно з винаходом можуть бути корисні для лікування імунних і інфекційних захворювань, а також для впливу на мікрооточення пухлини при різних ракових захворюваннях із числа перерахованих вище. Пухлини активно пригнічують протипухлинний імунітет, а ДК відіграють важливу роль у механізмі відхилення раку від імунітету. Зокрема, дослідження показали, що М/пі-ліганди в мікрооточенні пухлини здатні також ініціювати паракринний сигналінг в імунних клітинах і регулювати протипухлинний імунітет хазяїна (Нопа і ін. "беїа-саїепіп рготоїев5 гедшіаюгу Т-сеї! гезропзеб5 іп їштог5 Бу іпдисіпа мйатіп А теїароїїбєт іп адепагйіс сеї". Сапсег Вев. 2015:;75(4):656-65).
Зрозуміло, вищеописане також охоплює застосування поліпептидів згідно з винаходом у різних способах лікування вищевказаних захворювань шляхом введення терапевтично ефективної дози пацієнтові, що потребує такої, так само як і застосування цих поліпептидів для виготовлення лікарських засобів для лікування подібних захворювань, так само як і фармацевтичні композиції, що включають такі поліпептиди згідно з винаходом, так само як і складання та/або виготовлення лікарських засобів, що включають такі поліпептиди згідно з винаходом, і т.д. і т.п.
Комбінації з іншими активними речовинами
Поліпептиди згідно з винаходом можна використовувати окремо або в комбінації з іншими фармакологічно активними речовинами, такими як речовини передового рівня або стандарту лікування, такі як, напр., цитостатичні або цитотоксичні речовини, інгібітори проліферації клітин, антиангіогенні речовини, стероїди, імуномодулятори / інгібітори контрольних точок і т.п.
Цитостатичні та/або цитотоксичні активні речовини, які можна вводити в комбінації зі сполуками згідно з винаходом, включають, не обмежуючись ними, гормони, аналоги гормонів і антигормони, інгібітори ароматази, агоністи й антагоністи І НЕН, інгібітори факторів росту (такі фактори росту, як, наприклад, фактор росту тромбоцитів (РОСЕ), фактор росту фібробластів (ЕОР), фактор росту ендотелію судин (МЕСЕ), епідермальний фактор росту (ЕСРБЕ), інсуліноподібні фактори росту (СЕ), епідермальний фактор росту людину (НЕК, напр., НЕК2,
НЕКЗ, НЕКЯ) і фактор росту гепатоцитів (НСЕ)), де інгібітори являють собою, наприклад, антитіла проти фактора росту, антитіла проти рецептора фактора росту й інгібітори тирозинкінази, такі як, наприклад, цетуксимаб, гефітиніб, афатиніб, нінтеданіб, іматиніб, лапатиніб, босутиніб і трастузумаб; антиметаболіти (напр., антифолати, такі як метотрексат, ралтитрексед, піримідинові аналоги, такі як 5-фторурацил (5-ФУ), капецитабін і гемцитабін, пуринові й аденозинові аналоги, такі як меркаптопурин, тіогуанін, кладрибін і пентостатин, цитарабін (ага С), флударабін); протипухлинні антибіотики (напр., антрацикліни); похідні платини (напр., цисплатин, оксаліплатин, карбоплатин); алкілуючі агенти (напр., естрамустин, мехлоретамін, мелфалан, хлорамбуцил, бусульфан, дакарбазин, циклофосфамід, іфосфамід, темозоломід, нітрозосечовини, такі як, наприклад, кармустин і ломустин, тіотепа); антимітотичні агенти (напр., алкалоїди Міпса, такі як, наприклад, вінбластин, віндезин, вінорелбін і вінкристин; а також таксани, такі як паклітаксел, доцетаксел); інгібітори ангіогенезу, інгібітори тубуліну; інгібітори синтезу ДНК, інгібітори РАКР, інгібітори топоїзомерази (наприклад, епіподофілотоксини, такі як, наприклад, етопозид і етопофос, теніпозид, амсакрин, топотекан, іринотекан, мітоксантрон), інгібітори серин/греонінкінази (напр., інгібітори РОКІ, інгібітори Каї, інгібітори А-Каї, інгібітори В-Каї, інгібітори С-Каї, інгібітори тіог, інгібітори тіогс1/2, інгібітори
РІЗК, інгібітори РІЗКа, подвійні інгібітори тіог/РІЗК, інгібітори 5ТКЗ3, інгібітори АКТ, інгібітори
РІГКІ (такі як воласертиб), інгібітори СОК, інгібітори кінази Аийгога), інгібітори тирозинкінази (напр., інгібітори РТК2/ЕАК), інгібітори білок-білкової взаємодії, інгібітори МЕК, інгібітори ЕРК, інгібітори Р/'Т3, інгібітори ВКОЯ4, інгібітори ІСЕ-1КЕ, агоністи ТЕАЇ-К2, інгібітори Всі-хі, інгібітори
Всі-2, інгібітори Всі-2/Всі-хіІ, інгібітори рецептора ЕгрБЬ, інгібітори ВСЕ-АВІ, інгібітори АВІ, інгібітори 5гс, аналоги рапаміцину (наприклад, еверолімус, темзиролімус, ридафоролімус, сиролімус), інгібітори синтезу андрогенів, інгібітори рецепторів андрогенів, інгібітори ОММТ, інгібітори НОАС, інгібітори АМС1/2, інгібітори СУРІ17, радіофармацевтичні препарати, імунотерапевтичні агенти, такі як інгібітори імунних контрольних точок (напр., молекули/муноглобуліни, що зв'язують СТІ А4, РО, РО-11, ГАСЗ і ТІМ3, такі як іпілимумаб, ніволумаб, пембролізумаб), протиракові вакцини, такі як традиційна протипухлинна вакцина (клітинні вакцини, напр., ЗіршеисеІ-- для лікування раку передміхурової залози), персоналізовані неоантигенні вакцини й онколітичні віруси, а також різні хіміотерапевтичні агенти, такі як аміфостин, анагрелід, клодронат, філграстин, інтерферон, інтерферон-альфа, лейковорин, ритуксимаб, прокарбазин, левамізол, месна, мітотан, памідронат і порфімер.
Особливо кращими є способи лікування, що включають застосування поліпептидів згідно з (610) винаходом у комбінації з лікарським засобом, вибраним із групи, що складається 3:
(І) антитіл проти МЕСЕ (бевацизумаб і інші антиангіогенні речовини), з або без комбінації з хіміотерапією (включаючи комбінацію доксорубіцин/циклофосфамід та/або комбінацію капецитабін/доцетаксел за неоад'ювантною схемою; протокол таксан/платина для першої й пізніших ліній лікування) для пацієнтів з раком молочної залози; (І) ІТК ЕСЕК для НДКРЛ, мутантного за ЕСЕЕК, або кризотинібу для НДКРЛ із перебудовою
АЛК, з або без комбінації з хіміотерапією (цитотоксична комбінована терапія препаратами платини, включаючи гемцитабін/цисплатин як терапію першої лінії; доцетаксел або пеметрексед як терапію другої лінії для пацієнтів з раком легень; (І) антитіл проти ЕСЕРЕ (цетуксимаб і панітумумаб для пухлин з КВА5 дикого типу), з або без комбінації з хіміотерапією (включаючи іринотекан), комбінації з антитілами проти МЕСЕ (бевацизумаб і інші антиангіогенні речовини) або комбінації з регорафенібом, напр., для лікування пацієнтів із КРР. (ІМ) імунотерапевтичних агентів, включаючи агенти проти РО-1, такі як пембролізумаб і ніволумаб, агенти проти РО-11, агенти проти СТІ А4, агенти проти ВТІА, агенти проти І АСЗ і агенти проти ТІМ3, такі як антитіла проти РОГ і т.д., напр., для лікування пацієнтів з раком молочної залози, легені й КРР. (М) хіміотерапевтичних агентів, таких як антинеопластичні препарати на основі платини, або ж у комбінації з хіміотерапевтичним протоколом РОЇРОХ, включаючи фолінову кислоту, 5'- фторурацил і оксаліплатин, або ж у комбінації з хіміотерапевтичним протоколом БОЇ РОХІКІ, включаючи фолінову кислоту, 5'-фторурацил, оксаліплатин і іринотекан, напр., для лікування пацієнтів з раком молочної залози й КРР.
Якщо дві або більше речовини або принципи дії використовують як частини комбінованого протоколу хіміотерапії, то їх можна вводити тим же шляхом або різними шляхами, по суті в той самий час (тобто, одночасно, паралельно) або в різний час (напр., послідовно, підряд, поперемінно, одна за одною або в будь-якому іншому виду змінного режиму).
Якщо речовини або принципи вводять одночасно тим самим шляхом, то їх можна вводити у вигляді різних фармацевтичних препаратів або композицій або як частину комбінованого фармацевтичного препарату або композиції. Крім того, якщо дві або більше речовини або принципи використовують як частини комбінованого протоколу хіміотерапії, то кожну речовину або принцип можна вводити в тій же кількості й за тим же протоколом, які використовуються для одиночного застосування сполуки або принципу, і таке комбіноване застосування може мати синергічний ефект або не мати його. Однак якщо комбіноване застосування двох або більше активних речовин приводить до синергічному ефекту, то можна зменшити кількість однієї, декількох або всіх речовин, що вводяться, або принципів, зберігаючи при цьому бажану терапевтичну дію. Це може бути корисним для, наприклад, запобігання, обмеження або зменшення яких-небудь небажаних побічних ефектів, зв'язаних із застосуванням однієї або більше речовин або принципів у звичайних кількостях, зберігаючи при цьому бажаний фармакологічний або терапевтичний ефект.
Зрозуміло, вищеописаним охоплені виготовлення й способи виготовлення поліпептидів згідно з винаходом для комбінованого застосування з вищевказаними комбінаційними партнерами. Охоплені також виготовлення й способи виготовлення вищевказаних комбінаційних партнерів для комбінованого застосування з поліпептидами згідно з винаходом.
Таким чином, винаходом забезпечені, напр., способи застосування або виготовлення для застосування імуномодулятора/інгібітора контрольних точок, такого як антитіла проти РОЇ, такого як пембролізумаб або ніволумаб, для введення в комбінації з поліпептидом згідно з винаходом, а більш конкретно для введення в складі комбінованого терапевтичного протоколу з поліпептидом згідно з винаходом.
Більше того, винаходом також охоплені набори, у які входять принаймні один поліпептид згідно з винаходом і один або більше інших компонентів, вибраних із групи, що складається з інших лікарських засобів, застосовуваних для лікування захворювань і розладів згідно з описом вище, а також обладнань згідно з описом нижче.
Фармацевтичні композиції, способи введення, дозування
Фахівцеві буде зрозуміло, що вищеописані способи лікування захворювання мають на увазі виготовлення лікарського засобу для лікування вказаного захворювання. Таким чином, винахід також стосується фармацевтичних композицій для лікування вищезгаданих захворювань, причому подібні композиції містять принаймні один поліпептид згідно з винаходом.
Поліпептиди згідно з винаходом та/або композиції, які їх містять, можна вводити пацієнтові, який цього потребує, будь-яким підходящим способом, залежно від конкретного використовуваного фармацевтичного препарату або композиції. Таким чином, поліпептиди 10) згідно з винаходом та/або композиції, які їх містять, можна вводити, наприклад,
внутрішньовенно (в.в.), підшкірно (п.ш.), внутрішньом'язово (в.м.), внутрішньоочеревинно (в.о.), через шкіру, перорально, сублінгвально (напр., у вигляді сублінгвальної таблетки, спрею або краплі, що поміщають під язик і адсорбуються через слизові мембрани в під'язикову капілярну мережу), (внутрішньо-зуназально (напр., у вигляді назального спрею та/або аерозолю), поверхово, за допомогою супозиторію, інгаляцією або будь-яким іншим підходящим способом в ефективній кількості або дозуванні.
Поліпептиди згідно з винаходом та/або композиції, які їх містять, вводять згідно із протоколом лікування, що підходить для лікування та/(або полегшення захворювання, розладу або стану, що підлягає лікуванню або полегшенню. Лікар, як правило, може визначити підходящий протокол лікування залежно від таких факторів, як захворювання, розлад або стан, що підлягає лікуванню або полегшенню, ступінь важкості захворювання, ступінь важкості його симптомів, конкретний застосовуваний поліпептид згідно з винаходом, конкретний шлях введення й застосовуваний фармацевтичний препарат або композиція, вік, стать, вагу, режим харчування, загальний стан пацієнта й тому подібні фактори, добре відомі лікареві. Як правило, протокол лікування включає введення одного або більше поліпептидів згідно з винаходом або однієї або більше композицій, які їх містять, у терапевтично ефективних кількостях або дозах.
Як правило, для лікування та/або полегшення згаданих тут захворювань, розладів і станів, залежно від конкретного захворювання, розладу або стану, що підлягають лікуванню, сили конкретного використовуваного поліпептиду згідно з винаходом, використовуваних конкретного шляху введення й конкретного фармацевтичного препарату або композиції поліпептиди згідно з винаходом у загальному вводять у кількості від 0,005 до 20,0 мг на кілограм маси тіла й дозу, переважно від 0,05 до 10,0 мг/кг/дозу, ще більш переважно від 0,5 до 10 мг/кг/дозу, або безперервно (напр., інфузією), або, що більш переважно, у вигляді окремих доз (таких як, напр., прийняті двічі на тиждень, раз на тиждень, раз на місяць; див. нижче), але все це може суттєво відрізнятися, особливо залежно від вищезгаданих параметрів. Тому в деяких випадках достатньою може бути доза менше вказаної тут мінімальної дози, тоді як в інших випадках вона може перевищувати верхню межу. При введенні більших кількостей рекомендується розділяти їх на ряд менших доз, прийнятих протягом дня.
Залежно від конкретного поліпептиду згідно з винаходом, а також його конкретних фармакокінетичних і інших властивостей, його можна вводити раз на день, кожний другий, третій, четвертий, п'ятий або шостий день, раз на тиждень, раз на місяць і т.п. Протокол введення може мати на увазі довгострокове щотижневе лікування. Під "довгостроковим" мається на увазі тривалість принаймні два тижні, переважно місяці або роки.
Дієвість поліпептидів згідно з винаходом, а також композицій, які їх містять, можна перевірити за допомогою будь-якого підходящого відомого рег 56 аналізу іп мій, аналізу на клітинах, аналізу іп мімо та/або на тваринній моделі, або ж будь-якої їх комбінації, залежно від конкретної розглянутої хвороби. Підходящі аналізи й тваринні моделі будуть зрозумілі фахівцеві й для прикладу включають аналізи й тваринні моделі, використовувані в Прикладах нижче.
Переважно поліпептиди згідно з винаходом мають кращі характеристики, ніж звичайні відомі в даній галузі антитіла (так, які ті, що зв'язують І КРб, описані в розділі "Рівень техніки" вище), принаймні в одному із цих аналізів або моделей, а переважно в одній або більше моделей іп мімо.
Препарати
Для фармацевтичного застосування поліпептиди згідно з винаходом можуть бути введені до складу фармацевтичного препарату, що включає (І) принаймні один поліпептид згідно з винаходом і (ІІ) принаймні один фармацевтични прийнятний носій, розріджувач, допоміжну речовину, ад'ювант та/або стабілізатор, а також (ІІІ) необов'язково один або більше додаткових фармакологічно активних поліпептидів або сполук. Під "фармацевтично прийнятним" слід розуміти матеріал, що не проявляє яких-небудь біологічних або інших небажаних ефектів при введенні індивідуумові й не взаємодіє згубно з будь-яким з інших компонентів фармацевтичної композиції (таким як, напр., фармацевтично активний інгредієнт), яка містить відповідний матеріал. Конкретні приклади можна знайти в стандартних посібниках, таких як, напр.,
Ветіпдіоп'є РНаптасешіса! бсіепсез5, 18-е вид., Маск РиБбіїзпіпд Сотрапу, США (1990).
Наприклад, поліпептиди згідно з винаходом можна рецептувати і вводити будь-яким способом, відомим рег 56 для звичайних антитіл і фрагментів антитіл, а також інших фармацевтично активних білків. Таким чином, згідно з наступним варіантом здійснення винахід стосується фармацевтичної композиції або препарату, що містять принаймні один поліпептид згідно з винаходом і принаймні один фармацевтично прийнятний носій, розріджувач, допоміжна речовина, ад'ювант та/або стабілізатор, а також необов'язково одне або більше додаткових (610) фармакологічно активних речовин.
Фармацевтичні препарати для парентерального введення, такого як внутрішньовенна, внутрішньом'язова, підшкірна ін'єкція або внутрішньовенна інфузія, можуть, наприклад, бути стерильними розчинами, суспензіями, дисперсіями, емульсіями або порошками, які містять діючу речовину й придатні, необов'язково після додаткового етапу розчинення або розведення, для ін'єкції або інфузії. Підходящі носії або розріджувачі для подібних препаратів включають, для прикладу й не для обмеження, стерильну воду й фармацевтично прийнятні водні буфери й розчини, такі як фізіологічний фосфатно-сольовий розчин, розчин Рінгера, розчин декстрози й розчин Хенка; масла з водою; гліцерин; етанол; гліколі, такі як пропіленгліколь, а також мінеральні масла, тваринні масла й рослинні олії, наприклад, арахісова олія, соєва олія й придатні їх суміші.
Розчини поліпептидів згідно з винаходом можуть також містити консервант для запобігання росту мікроорганізмів, такий, як антибактеріальні й протигрибкові речовини, наприклад, п- гідроксибензоати, парабени, хлорбутанол, фенол, сорбінова кислота, тіомерсал, етилендіамінтетраоцтова кислота (і її солі з лужними металами) і т.п. У багатьох випадках переважно включати ізотонічні агенти, наприклад, цукри, буфери або хлорид натрію.
Необов'язково можуть використовуватися емульгатори та/або диспергатори. Належну плинність можна підтримувати, наприклад, утворенням ліпосом, підтримкою потрібного розміру частинок у випадку дисперсій і застосуванням поверхово-активних речовин. Можна також додавати інші речовини, що затримують абсорбцію, наприклад, алюмінію моностеарат і желатин. Розчини можна розливати в ін'єкційні флакони, ампули, пляшки для інфузій і т.п.
У кожному разі кінцева лікарська форма повинна бути стерильною, рідкою й стабільною в умовах виробництва й зберігання. Стерильні ін'єкційні розчини виготовляють включенням діючої речовини в необхідну кількість належного розчинника, за необхідності з різними іншими інгредієнтами з перерахованих вище, з наступною стерилізуючою фільтрацією. У випадку стерильних порошків для приготування стерильних ін'єкційних розчинів кращими способами виготовлення є методи вакуумного висушування й виморожування, що дозволяють одержати порошок діючої речовини й будь-якого бажаного додаткового інгредієнта з їх розчину, що попередньо пройшов стерилізуючу фільтрацію.
Звичайно віддають перевагу водним розчинам або суспензіям. Як правило, підходящі препаратами для терапевтичних білків, таких як поліпептиди згідно з винаходом, є забуферені розчини білків, такі як розчини, що містять білок у підходящій концентрації (такій, як від 0,001 до 400 мг/мл, переважно від 0,005 до 200 мг/мл, більш переважно від 0,01 до 200 мг/мл, більш переважно 1,0-100 мг/мл, такий, як 1,0 мг/мл (в.в. введення) або 100 мг/мл (п.ш. введення) і водний буфер, такий як: - фосфатно-сольовий розчин, рн 7,4, - інші фосфатні буфери, рН 6,2-8,2, - ацетатні буфери, рН 3,2-7,5, переважно рнН 4,8-5,5 - гістидинові буфери, рН 5,5-7,0, - сукцинатні буфери, рН 3,2-6,6, і - цитратні буфери, рН 2,1-6,2, і, необов'язково, солі (напр., Масі) та/або цукри (напр., сахароза й трегалоза) та/або інші поліоли (напр., маніт і гліцерин) для забезпечення ізотонічності розчину.
Кращими забуференими розчинами білків є розчини, що містять приблизно 0,05 мг/мл поліпептиду згідно з винаходом, розчиненого в 25 мм фосфатного буфера, рН 6,5, з відрегульованою додаванням 220 мм трегалози ізотонічністю. Додатково подібні розчини можуть містити інші агенти, такі як детергенти, напр., 0,02 95 Тмееп-20 або Тмееп-80.
Препарати для підшкірного застосування можуть містити значно більші концентрації поліпептиду згідно з винаходом, такі, як до 100 мг/мл або навіть вище 100 мг/мл. Однак фахівцеві в даній галузі буде зрозуміло, що вищевказані інгредієнти й кількості є тільки однією, переважною з можливостей. Фахівцеві будуть негайно очевидні, або ж легко виведені з вищевикладеного, їх альтернативи й варіанти.
Також у порівнянні зі звичайними антитілами або фрагментами антитіл однією з великих переваг застосування поліпептидів згідно з винаходом є те, що їх можна легко вводити шляхами, відмінними від парентерального введення, і легко скласти їх рецептуру для такого введення. Наприклад, як описано в міжнародній патентній заявці М/О2004/041867, подібні поліпептиди можна рецептувати як препарати для перорального, інтраназального, внутрішньолегеневого й трансдермального введення.
Згідно 3 наступним аспектом винаходу поліпептид згідно з винаходом можна використовувати в комбінації з обладнанням, що використовуються для введення поліпептиду, (610) таким як шприц, ручка-ін'єктор, мікропомпа або інше обладнання.
Способи виробництва й очищення
Винаходом також надані способи виробництва поліпептиду згідно з винаходом, причому такі способи в цілому включають етапи: - культивування клітин-хазяїв, що містять нуклеїнову кислоту, яка кодує поліпептид згідно з винаходом (тут і далі: "нуклеїнову кислоту згідно з винаходом") в умовах, що роблять можливою експресію поліпептиду згідно з винаходом; і - виділення або ізолювання поліпептиду, експресованого клітинами-хазяями, з культури; і - необов'язково подальшого очищення та/або модифікації та/або рецептування поліпептиду згідно з винаходом.
Нуклеїнова кислота згідно з винаходом може, напр., бути молекулою ДНК, що містить кодуючі послідовності, а також регуляторні послідовності й необов'язково природні або штучні інтрони, або може бути молекулою кднк. Вона може мати свої первинні кодони або ж оптимізовані кодони, спеціально адаптовані для експресії в передбачуваній клітині-хазяїні або організмі-хазяїні. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу нуклеїнова кислота згідно з винаходом знаходиться в по суті виділеній формі згідно з визначенням вище.
Нуклеїнова кислота згідно з винаходом може також знаходитися у вигляді, бути присутня у та/або бути частиною вектора, такого як, наприклад, плазміда, косміда або МАС, який знову ж таки може знаходитися в по суті виділеній формі. Вектор може бути по суті вектором експресії, тобто, вектором, здатним забезпечити експресію поліпептиду іп міго та/або іп мімо (напр., у підходящій клітині-хазяїні, організмі-хазяїні та/або системі експресії). Подібний вектор експресії, як правило, містить хоча б одну нуклеїнову кислоту згідно з винаходом, функціонально зв'язану з одним або більше підходящими регуляторними елементами, такими як промотор(-и), енхансер(-и), термінатор(-и) і т.п. Конкретні приклади подібних регуляторних елементів і інших елементів, таких як фактори вбудовування, маркери відбору, сигнальні або лідерні послідовності, репортерні гени й т.п., корисні або необхідні для експресії поліпептидів згідно з винаходом, описані, напр., на стор. 131-133 М/О2006/040153.
Нуклеїнові кислоти згідно з винаходом можна виготовити або одержати відомим рег зе способом (напр., автоматизованим синтезом ДНК та/або технологією рекомбінантних ДНК) на основі наведеної тут інформації про амінокислотні послідовності поліпептидів згідно з винаходом.
Згідно з іншим варіантом здійснення винахід стосується хазяїна або клітини-хазяїна, що експресує або здатний експресувати поліпептид згідно з винаходом; та/або який містить нуклеїнову кислоту, що кодує поліпептид згідно з винаходом. Згідно з особливо кращим варіантом здійснення вказані клітини-хазяї є бактеріальними клітинами, дріжджовими клітинами, грибковими клітинами або клітинами ссавців.
Для виробництва в промислових масштабах кращі гетерологічні хазяї для (промислового) виробництва імуноглобулінових окремих варіабельних доменів-поліпептидів і білкових ліків, що їх містять, включають штами БЕ. соїї, Ріспіа равбіогіз і З. сегемізіає, які підходять для великомасштабної експресії, виробництва й ферментації, і зокрема, для великомасштабної (біо--фармацевтичної експресії, виробництва й ферментації.
Поліпептиди згідно з винаходом, які виробляються в клітині згідно з описом вище, можуть вироблятися або внутрішньоклітинно (напр., у цитозолі, периплазмі або в тільцях включення) з наступним виділенням із клітин-хазяїв і необов'язковим подальшим очищенням; або ж вони можуть вироблятися позаклітинно (секретуватися в середовище, де культивуються клітини- хазяї) з наступним виділенням з культурального середовища й необов'язковим подальшим очищенням.
Додаткові способи й реактиви, використовувані для рекомбінантного виробництва поліпептидів, такі які підходящі вектори експресії, методи трансформації або трансфекції, маркери відбору, методи індукування експресії білка, умови культивування й т.п. відомі з рівня техніки. Точно так само фахівцеві відомі техніки виділення й очищення білка, що підходять для способу виробництва поліпептиду згідно з винаходом.
Виробництво поліпептидів згідно з винаходом ферментацією в зручних рекомбінантних організмах-хазяїнах, таких як Е. соїї і дріжджі, є фінансово вигідним у порівнянні зі звичайними антитілами, яким, як правило, потрібно дороге обладнання для культивування клітин ссавців.
Більше того, можуть бути досягнуті високі рівні експресії, і вихід поліпептидів згідно з винаходом знаходиться в діапазоні 1-10 г/л (Е. соїї) і до 10 г/л (дріжджі) і більше.
Приклади
Приклад 1: Імунізація лам І КРБ і І КРб з метою індукування гуморальної імунної відповіді (610) Для ідентифікації перехреснореактивних за І КРБ/Л КРб УНН-доменів зв'язування необхідно було розробити й втілити ряд протоколів імунізації лам: Спочатку лам |імунізували рекомбінантними позаклітинними доменами білків ГЕРб і ГКР5 (від людини й миші). Однак функціональна оцінка вищезгаданого рекомбінантного білка | ЕР5 показала, що тільки епітоп зв'язування класу М/пії був покладений належним чином. | навпаки, ніщо не вказувало на належне укладання домену зв'язування класу ГКР5-М/піЗа. Тому для розробки підходящих для імунізації антигенів потрібна була додаткова робота. Як обхідний шлях лам імунізували клітинами НЕК293, стабільно трансфікованими людським ГКР5 або людським І КРб. Однак і тоді можна було досягти лише дуже слабкої експресії людського І КРБ, як при тимчасовій, так і при стабільній трансфекції, а також із застосуванням різних клітинних ліній (клітини НЕК293,
СНО ії МІН-3Т3). Тому для досягнення достатньої експресії ЕР5 потрібна була ще додаткова робота. Зрештою, після деякої кількості безуспішних проб і помилок, цього вдалося досягти розробленим протоколом, що включає стабільну ко-трансфекцію клітин НЕК293 МезОс-2, шапероном, який повинен підвищувати екзогенну експресію І КР5. Але навіть тоді, тобто, після ко-експресії Ме50С-2 протягом створення стабільно трансфікованої І БР5 клітинної лінії, неодноразово спостерігалася нестабільність експресії білка. Це привело до проблеми: експресія І КРБ під час імунізації й відбору могла бути втрачена. Щоб розв'язати цю додаткову проблему, кількість пасажів клітин, які експресують ГКР5, обмежили наскільки можливо й виконували додаткове сортування клітин з метою збагачення за клітинами, що експресують
ІГ АР.
Лам додатково імунізували ДНК, що кодує І КРБ, і ДНК, що кодує І ЕРб, з і без шаперону пМез0о-2 на протилежних кінцях. Декільком ламам ввели додаткові стимули в спробі підсилити перехреснореактивну імунну відповідь, з метою підвищити шанси ідентифікації перехреснореактивних за І КРБ/ КРб6 УНН-доменів.
Через регулярні проміжки часу брали зразки імунізованої крові (ЛІК), визначали серологічну відповідь і готували з виділених ЛІК загальну РНК. Після імунізації рекомбінантним білком спостерігали середню серологічну відповідь на І КРб, на відміну від слабкої серологічної відповіді на І КР. Середня імунна відповідь на І КР5 спостерігали в лам, імунізованих ДНК. І навпаки, для імунізацій клітинами спостерігали дуже слабку імунну відповідь. Додатково досліджували синтетичні бібліотеки. Тем не менше, зрештою вдалося досягти достатньої різноманітності репертуару для просування на наступний етап, викладений у Прикладі 2.
Приклад 2: Виділення моновалентних МНН-доменів (УНН), що зв'язують І КРБ і | КРб
Створення бібліотеки:
Безпосередньо після відбору імунних тканин виділяли загальну РНК, підтверджували цілісність і концентрацію РНК. Із цих препаратів РНК робили зразки кДНК. Нуклеотидні послідовності, що кодують УНН, ампліфікували зі зразків КДНК одноетапної РВ-ПЛР. Амплікони по 700 п.о., спеціально ампліфіковані із кДНК присутніх у зразку Ідс2 і ІдсЗ, виділяли з агарозного гелю й згодом використовували як шаблон для "гніздової" ПЛР. Потім продукти ПЛР розщеплювали б5іїї і Ввівїї і вшивали у відповідні сайти рестрикції фагмідного вектора рАХ5О.
Зшиті суміші електропорацією вводили в ЕзсПегісніа соїї Т2-1. Отриманий пул трансформантів склав генетичну різноманітність бібліотеки фаг-дисплея. рАХ5бБО - це вектор експресії, отриманий з рОС119 ген, що містить, резистентності до ампіциліну й промотор Іас, за яким розташована кодувальна послідовність сигнального пептиду рП-білка в одній рамці зчитування з розташованим далі сайтом вбудовування МНН-домену. У рамці зчитування з послідовністю, що кодує МНН-домен, вектор кодує С-кінцевий Мус, гексагістидинову мітку й рІП-білок коліфагу. Після зараження бібліотеки клонів Е. соїї Т(а-1 фагом-хелпером присутність рАХ5О уможливлює вироблення часточок фага в цих клонах, виводячи індивідуальні МНН-домени у вигляді білка, злитого з ріП-білком.
Відбір:
Для відбору створювали й використовували бібліотеки МНН-доменних фагмід. Беручи до уваги дуже високу міжвидову гомологічність білків (КРБ і | КРбЄ людину й лами), було неясно, чи забезпечить викликана у лам імунна відповідь достатню різноманітність МНН-доменів. Тому під час відбору паралельно з імунними бібліотеками використовували дві синтетичні бібліотеки.
Під час відбору використовували наступні різні стратегії: - Зміна отриманих від ІКР5 і І КРБ інструментів, щоб збільшити шанс виявити перехреснореактивні за ГКРБ/Л ЕРб УНН-домени, напр., відбір по бібліотеках від імунізованих
І КРБ лам за допомогою отриманих з І КРб білків, або ж використання й І КРБ, і І ЕРб під час відбору по синтетичних бібліотеках. - Зміна виду-джерела для відбору людських/умишачих перехреснореактивних за І КРБ/Л КРб (610) МНН-доменів (перехресна з мишами реактивність таких антагоністів КРБ і ЇКРб дозволяє оцінити ефективність, тобто, пригнічення росту пухлини, і профіль безпеки, необхідні для оцінки терапевтичного вікна в тих же доклінічних моделях (тобто, у ксенотрансплантатних моделях пухлин на мишах)). - Відбір "у розчині" за допомогою рекомбінантних білків, щоб утримувати епітопи в природній конформації: Додаткова перешкода полягала в тому, що рекомбінантні білки ГЕРБ і І КРб при безпосередньому нанесенні на планшети ЕГІЗА для зв'язування втрачали належне укладання.
Тому рекомбінантні білки біотинілували й, підтвердивши належне укладання функціональними аналізами, використовували для відбору "у розчині". - Відбір за допомогою клітин, які понадекспресують І КРБ або І КРб, з метою забезпечити природну конформацію рецепторів. Дивно, але це виявилося важливим прийманням, особливо необхідним для поліпшення відбору доменів, що зв'язуються з доменом ЇКР5 класу УУпіЗа, оскільки функціональні дані за рекомбінантним білком показали недостатньо правильне укладання УУпіЗа-зв'язувального епітопу.
Приклад 3: Скринінг моновалентних УНН
Після відбору клони вирощували в 96-лункових планшетах із глибокими лунками (об'ємом 1 мл) і індукували експресію УНН додаванням ІПТГ. Згідно зі стандартною методикою, описаною, напр., в УМО2011/107507, готували периплазматичні екстракти окремих клонів і проводили їх скринінг на зв'язування з людськими ІКРб і І КРБ. Спочатку скринінг периплазматичних екстрактів здійснювали аналізом зв'язування ЕГІЗА з рекомбінантними ІКРб і І КРБ, який є чутливим, завадостійким і високопродуктивним аналізом у порівнянні з аналізом зв'язування на основі ЕАС5. Після очищення МНН, ідентифікованим аналізами ЕГІ5ЗА, давали додаткову характеристику за допомогою аналізу зв'язування ЕБАС5, щоб підтвердити зв'язування очищених УНН з рецепторами ГІ КРб і І КРБ у їх природній конформації.
Звичайно очікується гарна кореляція аналізів зв'язування за методами ЕГІЗА і ЕАС5. Однак у цьому випадку УНН, що найкраще зв'язуються з І КРб і І КР5 в аналізі ЕГ ІЗА (тобто, з високою афінністю до рекомбінантного позаклітинного домену ЇКРб або І КРБ), не виявили зовсім ніякого або дуже слабке зв'язування з людськими І КРб і І КРБ в аналізі зв'язування ЕАС5, що показано на Фігурі 2 на панелі зв'язувальних речовин "2". Використання різних буферів покриття (фосфатно-сольового буфера Дульбекко й бікарбонатного буфера) і блокувальних розчинів при постановці ЕГІЗА (Магме! і БСА) не усунула спостережувана розбіжність. Замість цього було виявлено, що дуже слабкі згідно ЕГІЗА зв'язувачі показали високу афінність до І КРБ і І ЕРб в аналізах зв'язування ЕАС5 при використанні клітин, які експресують І КРБ і І КРб, як показано на Фігурі 2 на панелі зв'язувальних речовин "2". Ці додаткові дані й експерименти уможливили відбір високоафінних зв'язувальних речовин, що розпізнають природню конформацію двох рецепторів. Крім того, було підтверджено, що ці високоафінні зв'язувальні речовини розпізнають у білках КРБ і І КРб залежний від конформації епітоп, а не лінійний епітоп. Ці додаткові нестандартні дані й експерименти уможливили відбір терапевтично важливих речовин, що зв'язують І КРБ і ГКР, які повинні мати високу афінністю до І КРБ і І КРб, що експресуються на плазматичній мембрані у своїй природній конформації.
Тому, незважаючи на (І) низьку продуктивність аналізів зв'язування ЕАС5, (Ії) менш завадостійку постановку аналізу й (І) вищеописані складності, що виникли через втрати експресії рекомбінантного білка при пасируванні клітин, які понадекспресують І КРБ, ці аналізи все-таки використовували для наступного відбору й характеристики високоафінних УНН- зв'язувачів. Якщо коротко, клітини інкубували з розведеннями очищених УНН (серійні розведення 1:5 від 1 мкМ до 1 пМ у кінцевій концентрації) протягом 1,5 годин при 4 "С на планшетному шейкері. Після 5- кратного промивання клітин буфером ГАС5, що складаються із 1Тх фосфатно-сольового буфера (ФСБ) -х 10 95 ембріональної бичачої сироватки (ЕБС) ж 0,05 95 азиду натрію, їх інкубували протягом від 30 хвилин до 1 години при 4 "С з поліклональним мишиним антитілом, що зв'язуються з каркасною ділянкою МНН, а отже, зв'язуються з усіма зв'язувачами ГКР5 та/"або ІКРб, що перевіряються. Після трикратного промивання клітин буфером ЕАСЗ їх інкубували протягом від 30 хвилин до 1 години при 4 "С з міченим вторинним антитілом (протимишине, ФЕ) з наступним трикратним промиванням буфером ЕАСЗ5.
Флюоресценцію вимірювали за допомогою ЕАС5 Аїітау (ВО).
На основі даних про зв'язування ЕАС5 і аналізу послідовностей в імунних бібліотеках і бібліотеках синтетичного походження ідентифікували в загальному сто перехреснореактивних за І КРБ/ КРб сімейств/кластерів МНН. Приклади їх представників показані й визначені своєю послідовністю нижче. МНН експресували в Е.соїї і очищали. Якщо експресія в Е.соїї була недостатньою, МНН продукували в Ріспіа равіогізх. Короткий опис експресії й очищення УНН наведено нижче. (610) Загальна експресія УНН в ЕЄ.соїї:
Кодувальні послідовності вбудовували у вектор експресії рАХ100 і експресували в БЕ.сої у вигляді с-Мус білків з гексагістидиновою міткою. Клітини Е.соїї ТО-1, що містять потрібні МНН- конструкти, вирощували (37 С, 250 об./хв) у струшуваних колбах на середовищі ТВ із додаванням канаміцину й індукували додаванням 1 мМ ІПТГ для експресії. Після центрифугування клітинних культур готували периплазматичні екстракти методом заморожування-відтавання осаду й ресуспендування його у ФОБД.
Загальна експресія УНН в Рісніа (Р.) равзютів:
Кодуючі послідовності вбудовували у вектор експресії рАХ159 і експресували в Р. рабвіогіб5 у вигляді с-Мус білків з гексагістидиновою міткою. Клітини Р. разіогіз Х-33, що містять потрібні
МНН-конструкти, вирощували (30 С, 250 об./хв) на середовищі ВОСМ (Вийегей сСіусего|-
Сотріех Медійт, комплексне середовище із забуференим гліцерином; Іпмігодеп). На третій день середовище замінювали на ВМОСМ (Вийегеайа МеїПпапоІ-Сотрієх Меадішт, комплексне середовище із забуференим метанолом; Іпмігодеп) і вирощували культуру далі, регулярно індукуючи її додаванням 0,5 об. 95 метанолу (100 95). Після центрифугування клітинних культур відбирали супернатант (що містить секретовані МНН).
Очищення УНН:
МНН з гексагістидиновою міткою очищали на Тесап ЕМО150 афінною хроматографією з імобілізованим металом (Кобосоїштп5 100и! МіскеІ Зерпагозейт 6 ЕЕ, АЇОЇїЇ), елюювали зі колонки 250 мМ-імідазолом і потім знесолювали до ФСБД. Цілісність і чистоту. МНН підтверджували 5О5-РАСЕ та/або вестерн-блотингом з детекцією антитілами проти Мус і МНН.
Приклад 4: Іп міто-характеристика очищених моновалентних УНН
Після скринінгу очищеним МНН з високою афінністю до клітин, що експресують І КРБ і | КРб, давали характеристику за допомогою ряду функціональних і біофізичних аналізів, описаних нижче: 4.1 Сила зв'язування з І КРБ і І КРб, перехресна реактивність: Аналіз конкуренції з ОКК1 на основі ЕАС5
Під час характеристики перехреснореактивних за ІКРБОЗ/ЛКРБб моновалентних УНН спостерігали, що отримані в аналізі зв'язування ЕАС5 дані не завжди корелювали із силою, спостережуваною в аналізах за геном-репортером УУпиИ і М/піЗа, швидше за все, через високу швидкість дисоціації деяких МНН. Тому виникла необхідність у розробці цього додаткового аналізу (тобто, ЕАС5 для конкуренції з ОККІ), який показав себе більш надійним у відношенні селективності й визначення сили зв'язування, а також порівняння зв'язування з І КРБ і І КРб.
Метою був відбір функціональних УНН, що зв'язуються з І КРБ і І КРб з однаковою силою, щоб однією й тою же концентрацією досягти блокади обох рецепторів. Тому ідентифіковані функціональні МНН до УУпи і УУпіЗа характеризували ГАС5 для конкуренції з ОККІ у такий спосіб:
Для аналізу конкуренції з ЮОККІ! на основі ЕАС5 використовували клітини НЕК293 зі стабільною понадекспресією людського КРБ або людського І КРб. Людський рекомбінантний
ОККт (тпОКкКкІТ-НаО Бузієт5, артикул 5439-0ОК/СЕ) додавали до клітин у постійній кінцевій концентрації 1 нМ. Клітини інкубували з гтпОККІ і ГКР5- та/або І КРб-зв'язувачами (серійні розведення очищених МНН 1:5) протягом 1,5 години при 4 "С на планшетному шейкері. Після трикратного промивання клітин буфером ЕБАС5 їх інкубували з біотиніллованим цапиним антитілом проти людського ОККІ1 (КО 5Зузіетв, арт. ВАЕ1096) протягом 30 хвилин при 4 "С на планшетному шейкері. Після трикратного промивання клітин буфером ЕАСЗ їх інкубували зі стрептавідином ФЕ (ВО Віозсієпсев, арт. 554061) протягом від 30 хвилин до 1 години при 4 "С на планшетному шейкері в темряві. Клітини двічі промивали буфером ЕГАС5, вимірювали флюоресценцію за допомогою ЕАСЗ Аїттау (ВО) і відзначали значення МСЕ.
Очікується, що перехреснореактивні за ('КРБЛ КР УНН будуть конкурувати з людським
ОККІ за зв'язування з НЕК293, понадекспресуючими людський ІКР5, так само як і за зв'язування з НЕК293, понадекспресуючими людський І КРб. Навпаки, специфічний за І КРБ
МНН конкурував би з людським ОККІ за зв'язування з НЕК293, понадекспресуючими людський
КРБ, але не за зв'язування з НЕК293, понадекспресуючими людський І КРб (або конкурував би, але дуже слабко (»200нм) (і навпаки, те ж саме стосується специфічних за І КРб МНН). У результаті цього експерименту було продемонстровано, що присутні перехреснореактивні за
ГАКРБ/Л.КРб УНН конкурували з людським ОККІ за зв'язування з НЕК293, понадекспресуючими людський І КРБ, так само як і з НЕК293, понадекспресуючими людський І КРб (тобто, зниження значення МСЕ при підвищенні концентрації зв'язувача, де повному пригніченню ОККІ1- зв'язування при найвищій перевіреній концентрації відповідали значення МСЕ х 60). 4.2 Міжвидова перехресна реактивність: миша і яванська макака (610) Щоб визначити, чи здатна відібрана панель перехреснореактивних за І ЕРБЛ КРб. УНН
Зо зв'язуватися з КРБ і ГКРб від миші і яванської макаки, виконували наступний ЕАС5 для конкуренції з ОКК1:
Серійні розведення УНН інкубували із клітинами НЕК293, стабільно експресуючими І КРБ миші, КРБ макаки, І КРб миші або І КРб макаки в присутності 1 і 0,3 нт пОККІ (концентрація нижче ЕС5О для миші й макаки відповідно). Зв'язування ЮОККІ із клітинами виявляли за допомогою біотинілованого антитіла проти ОККІ1 зі стрептавідином-ФЕ як вторинним детектором, згідно з описом вище. У результаті змогли продемонструвати таку перехресну реактивність. 4.3 Епітоп-специфічне сортування
Експерименти із сортування виконували для найбільш сильних блокувальних УУпи -сигналінг перехреснореактивних за І ЕРБ/ КРб УНН, щоб визначити різні епітопні групи. Зокрема, окремі
МНН перевіряли на здатність конкурувати з іншими біотинілованими УНН (т.зв. еталонними
МНН) за зв'язування з рецепторами ГІ КРБ і І КРб за допомогою аналізів на основі ЕАС5. Серійні розведення окремих УНН інкубували на клітинах НЕК293, стабільно які експресують людські
І КРБ або ГЕРб, разом з 200 пм або 500 пм біотинілованих еталонних УНН (концентрації нижче значення ЄС50). Зв'язування біотинілованих еталонних МНН із клітинами визначали за допомогою стрептавідину-ФЕ. Конкуренція МНН з еталонними МНН за зв'язування з І КРБ і І КРб проявляється зниженням флюоресценції, виміряної РАС Аїітау.
У результаті цих дослідів блокатори М/пИ підрозділили на три групи. Більш низька афінність
МНН не дозволила провести експерименти з епітоп-специфічного сортування для блокаторів
М/піЗа. 4.4 Аналізи за геном-репортером УУпИ і УУпіЗа
Здатність перехреснореактивних за І КРБ/ КРб МНН пригнічувати УУпі-сигналінг перевіряли функціональним аналізом МУпії і УУпіЗа. Щодо цього неможливо було використовувати встановлений протокол, довелося зробити декілька спроб, щоб установити біохімічні функціональні аналізи, такі як аналізи блокування Му/пі!/ЛЛпіЗза - ІРО / ІКРб: До всіх складностей з рекомбінантними білками І КРБ і КРБ (див. Приклад 1), немає функціонального рекомбінантного М/пи-ліганду (включаючи доступні в продажі). Білки М/пі містять багато консервативних цистеїнів і модифіковані мононенасиченою жирною // кислотою (пальмітинолеїновою кислотою), приєднаною до консервативного серину. Ці посттрансляційні модифікації необхідні для ефективного сигналінгу й секретування УУпі. Структурні аналізи показали, що один з доменів, що містить ліпід пальмітинолеїнову кислоту, необхідний для зв'язування з рецептором Ргі27єд, приводячи до зміни конформації, що робить можливим взаємодію МУУпі-лігандів з І1КРБ5 і І КРбБ она клітинній поверхні. Виявилося, що такі посттрансляційні модифікації необхідні для функціональних досліджень із цим білком, але в той же час подібні ліпідні посттрансляційні модифікації дуже сильно ускладнюють експресію й очищення цих білків (через погану розчинність). Тому це стало великою перешкодою для біохімічних аналізів.
Тому для характеристики очищених МНН був розроблений функціональний аналіз на клітинній основі: аналіз МУпі за геном-репортером бета-лактамази. Зокрема, для пригнічення шляху МУпії клітини СеїЇЗепзог ГЕР/ТСЕ-рБіа Ргеебіуе 293 (Іпмігодеп, арт. К1677) трансфікували людським МУпії і відбирали клони зі стабільною понадекспресією людського
Уупи. Для перевірки пригнічення шляху УУпіЗза створювали клітини СеїЇЗепзог ГЕР/ТСЕ-Біа
Егеезіуїе 293Е зі стабільною понадекспресією людського УУпіЗа. Клітинна лінія СеїЇЗепзогто
ІГЕР/ТСЕ-ріа Ргеевзіуетм 293 містить репортерний (ген бета-лактамази під контролем індукованого МУпі промотору ГЕР/ТСЕ, який стабільно вбудований у клітини Егеевзіуе"мМ 293 (Іпмігодеп). Таким чином, експресія МУпИ або УУпіЗа у цих клітинах приводить до конститутивної експресії а отже, і до ферментативної активності бета-лактамази. Тому обробка функціональними перехреснореактивними за ГКРБ/Л КРб УНН повинна привести до пригнічення шляху М/пИ і М/піЗа, що приведе до пригнічення ферментативної активності бета-лактамази.
Для аналізу 1ЕОб/мл клітин зі понадекспресією М/П! або М/піЗа висівали на 384-лунковий планшет для тканинних культур і інкубували протягом ночі при 37 "С. Наступного дня готували серійні розведення різних перехреснореактивних за ГКРБ/Л КРб МНН і додавали до клітин у присутності Г іс у кінцевій концентрації 10 нМ. Як позитивний контроль до клітин додавали ОКК1 у фінальній концентрації 200 нМ. Обробка ОККІ1 приводила до повного пригнічення шляху М/пИ і М/піЗа і, отже, до повного пригнічення ферментативної активності бета-лактамази. Клітини інкубували протягом ночі при 37 "С. Наступного дня ферментативну активність бета-лактамази вимірювали згідно з інструкціями виробника (Іпмігодеп, арт. КТ1085). Для флюоресцентної емісії (610) одержували значення при 460 нм і 530 нм за допомогою стандартного флюоресцентного планшетного рідера, і співвідношення емісії при 460/530 нм наносили на графік відносно вказаної обробки. Ефективність розраховували відносно позитивного контролю (ОККІ1 у фінальній концентрації 200 нм).
Усього відібрали дванадцять перехреснореактивних за І КР5Б/ КРб блокаторів МУпПИ, повна ефективність і сила яких була більшою, ніж 50 НМ. Ідентифікували чотирнадцять перехреснореактивних блокаторів МУпіЗза, в основному слабких. Тільки один блокатор М/піЗа показав хорошу силу (нижче 5 нм). 4.5 Аналізи фосфорилування УУПИ і МУпіЗа
Найбільш потужні й ефективні зразки з кожної групи блокаторів МУПИ, а також найбільш потужні й ефективні блокатори М/піЗа згодом перевіряли в аналізах фосфорилування І КРБ і
ІГКРб, залежного від МуУпії і УУпіЗза. В аналізах фосфорилування використовували клітини
СеПЗепзог ГЕРЕ/ТСЕ 293БЕ від Іпмігодеп (арт. К1677), ко-трансфіковані векторами експресії, що кодують або МУпії, або МУ/піЗа. Оскільки утворення комплексу Умпі-Егі27Івєа-ЇКР5 або -І А Рб приводить до фосфорилування І КР5 або ГЕРБ і наступній низхідній передачі сигналу, для вимірювання такої передачі можна використовувати кількісне визначення фосфорилування.
Щоб одержати специфічні за І КРБ і | КРб показання, клітини піддавали лізису й виконували імунопреципітацію за допомогою антитіла, селективного за І КРБ або І КРб (спрямованого проти внутрішньоклітинного домену двох рецепторів). Фосфориловані /КР5О або І!КРб виявляли вестерн-блотингом з використанням поліклонального антитіла проти фосфо-Ї ВРб (5ег1490) (Сеї! Зідпаїйпуд Тесппоіоду), що виявляє фосфориловані білки й ГЕРБ, і І КРб. Відібрану панель очищених МНН, що блокують М/пі!ї і МУпіЗа, що містить принаймні один представник УНН з кожної групи, перевіряли у фінальних концентраціях від 10 до 100 нм. Зокрема, клітини інкубували протягом ночі в присутності блокувальних МНН перед лізисом клітин і імунопреципитацією І КРБ і І КРб. Ефективність УНН, що блокують М/пИ і МУпіЗа, при блокуванні фосфорилування ГКРБ5 і ГЕРБ розраховували кількісною оцінкою смуг вестерн-блотингу в порівнянні з позитивним контролем (ОКК/1, фінальна концентрація 1 мкм). 4.6 Біофізична характеристика
Перехреснореактивним за І КРБ/Л КРб МНН-доменами давали подальшу оцінку експресії й очищення в Е. соїї і Ріспіа равіогіх, як описано в Прикладі 3. Зокрема, вихід експресії моновалентних зразків панелі МНН вважали прийнятним, якщо він був вище 0,1 мг/л. Відібрані перехреснореактивні за ГКРБ/Л КРб УНН показали експресію в діапазоні 0,1-8,2 мг/л в Е.соїї і вище в Рісніа равіогів (» 1 мг/л). Експресію оцінювали аналізом 505-РРАСЕ.
Термостабільність моновалентних перехреснореактивних за /КРУЛКРб УНН визначали флюоресцентним аналізом теплового зсуву (АТС) за допомогою ГГідпісусіег (Коспе).. УНН інкубували при різних значеннях рН у присутності Зурго Огапде, застосовуючи градієнт температури. Після розгортання укладання, викликаного теплом, оголюються гідрофобні ділянки білків, з якими зв'язується 5урго Огапде, що приводить до підвищення інтенсивності флюоресценції (Возб/Ем - 465/580 нм). Точка перегину на першій похідній кривої інтенсивності флюоресценції служить заходом температури плавлення (Тпл). У всіх МНН Тпл підвищувалася при підвищенні рН і вирівнювалася при рН б, що є типовою для МНН схемою Тпл. Для перехреснореактивних за І КРБЗ/Л КРб УМНН-блокаторів М/пПИ ії МНН-блокаторів МУпіЗа одержали середнє значення 82 "С при рН 7.
Методом аналітичної ексклюзійної хроматографії досліджували потенційну можливість агрегації й мультимеризації УНН до І КРБ і ГГ КРБб. Із цією метою 8 мкг очищеного зразка МНН у концентрації 0,5 мг/мл інжектували за допомогою встаткування біопех ОШітаїе 3000 у колонку
Адіїеєпі БЕС-3. Як рухому фазу застосовували І -аргініновий буфер (10 мм фосфату, 300 мм Агд-
Неї, рН 6,0) на швидкості потоку 1 мл/хв. НІ один з МНН до І КР5 і І КРб не мав великих проблем з агрегацією під час ЕХ-аналізу: профілі вказували на більш ніж 95 95 мономерів у більшості зразків.
Приклад 5: Створення й характеристика біпаратопних конструктів із продовженим періодом напіввиведення
Перехреснореактивні за І ЕРБ/Л КРб УНН для УУпИ і М/піЗа використовували як будівельні блоки для створення біпаратопного конструкта, зображеного на Фігурі 1. Як метод продовження періоду напіввиведення використовували генне злиття з УНН, що зв'язується із сироватковим альбуміном. Три будівельні блоки (М/пи -блокатор, УУпіЗа-блокатор і альбумінзв'язувальний) з'єднували гнучким лінкером. МНН виробляли в Р. разіюогі5 і очищали за описом в Прикладі 3.
Отримані конструкти, тобто біпаратопні перехреснореактивні за (КРУЛ КР МНН-конструкти вбудовували у вектор експресії рАХ159 для Р. равіогіє у вигляді МНН-конструктів з сМус- гексагістидиновою міткою на С-кінці, згідно зі стандартними процедурами, описаними, напр., в 60 0/0 УМО2012/131078. Досліджували різну орієнтацію будівельних блоків і різні лінкери, особливо 55-
лінкери. На основі даних моделювання, що відбивають збільшену площу поверхні між потенційними сайтами зв'язування МУпи і УупіЗа в І КРб (тобто, те, що бета-пропелери 1 і 2 не знаходяться у безпосередній близькості від бета-пропелера 3), вибрали відносно довгий 55- лінкер. Найкращі результати відносно сили за комбінованим аналізом за геном-репортером
УМпИ ї М/піЗа одержали при вбудовуванні МНН, що зв'язує людський, сироватковий альбумін /ЛСА, у середину. Використовували 35-45-лінкер, а МНН-блокатори УУпИ і УупіЗа розташували в переважному порядку.
З метою відбору оптимальних УНН-зв'язувачів і комбінацій зв'язувачів створили бібліотеку, у якій МНН сироватковий альбумін, що зв'язує людський, /ЛСА, помістили між І АРБ/ АРб М/пи -
МУпіЗа-блокаторами. Зокрема, у бібліотеці використовували панель високоафінних зв'язувачів з великою силою й ефективністю згідно з аналізами УУпи або УУпіза (аналізи за геном- репортером й фосфорилування), щоб створити біпаратопні конструкти із продовженим періодом напіввиведення, спроектовані, як показано на Фігурі 1. Після експресії в Ріспіа равіогів (як описано в Прикладі 3) і наступного очищення біпаратопні конструкти із продовженим періодом напіввиведення піддавали скринінгу за допомогою аналізів за геном-репортером УУпИ їі УУпіЗа (описано в Прикладі 4) у присутності 30 мкМ ЛСА в трьох розведеннях (1/100, 1/1000, 1/7000), з метою оцінити ефективність і відносну силу. У цілому спостерігали хорошу кореляцію даних репортерних аналізів МУПИ і УупіЗа, і для багатьох форматів вимірювали високу ефективність.
Для подальшої оцінки відібрали всього 11 біпаратопних за КРБ і ІКРб конструктів із продовженим періодом напіввиведення, беручи до уваги ефективність в обох репортерних аналізах і різноманітність блокаторів М/ПИ і М/піЗа. Ці подальші оцінні аналізи описані нижче.
Аналізи за геном-репортером УУпИ і УУпіЗа:
Аналізи за геном-репортером УУпи1 і МУпіЗа виконували згідно з описом у Прикладі 4.4, у присутності кінцевої концентрації ЛСА 30 мкм. Очищені біпаратопні за І КР5Б/Л ЕРб конструкти перевіряли в 12 розведеннях, починаючи з 2,5 мкм.
Більшість конструктів показала високу силу - від 1,7 нм до 0,16 нм - і повну ефективність в обох репортерних аналізах, що відображено в Таблиці ІМ нижче. Послідовності встановлених там індивідуальних МНН-доменів, що інігбують УУпИ і УУпіЗа, наведені в Таблиці М нижче: зо
Таблиця ЇМ
Сила й ефективність відібраних біпаратопних перехреснореактивних за І КРБ/Л КРб УНН- конструктів із продовженим періодом напіввиведення в аналізах за геном-репортером в присутності ЛСА - . Репортерний аналіз 000001 фДепортернийаналомюн Реюгди гої13500046 |РО130332003 |РОї29093А01 | ЛЕО | 102 | бОєЛО | 96 гої3з500016 |РО130332003 |РО130367810 | ЗЛЕ-ЛО | 102 | 27е310 | 99 гоїЗз500018 |РО130332003 |РО130378805 | 7,4Е-ї0 | 102 | 1309 | 98 (гоїз500030 |го130378805 |Р0130372008 | 1,4Е-09 | 102 | 1309 | 96
Таблиця М
Послідовності МНН-доменів, наведених у Таблиці ІМ
ЖННЮ і лоннакностутна пестюовнІть ОО. о КецнВІчняь шин шин нн т тн ШК
ОБО АЄ ОО БУСЕУКМОООССУЮРОСВЕКЕЯСАЧОКТКАМОЖЕКОАВІ ВО
Каре. Ї псхухзстусют кі а зкан крики гаку ки ик Н
Сука | ОКЕКЕРУЛАБВ УВО ТАС УКОК ПІКОМВЕМІУ У
МКК ОТАУУУСААВМРУОН КЕКВ УУ КОС. Е ! знан зно ново в п о в о о поро ана
ОБМОЗЯННЕ БУС УВО ОСІ УОРОС ВІВСА АВТО АМИУВВА ОВ
Ж і ВаКЕНЕКУЛАВИВОВЕТУ ТАЛУ КОВЕПеВИМКВГУ У. ! МмМВЕАРЕОТАУУУСААЗВА УВУ УВО : : ЧТ УТУВАААВОКОЗВВО С ЗОЛАННВОНИ | !
ОБ ичюаАІ БУКВ ИНИЛОМОС КЕ чСААВОКТЕЖ УВО ОЮ.
ОУноа СОВОК ЕКУААТЧКЧИКА ТУ АДЧТУКОКИТЕВОМУКМТУ М
ООМе ЕТ АУУ СААЧКОУАОВТУ УВО ВУ ТОВ У : ту АЛАКОКИ МК МО АЦИНЦЩВ і
Овни роЄ БУС УВО УСС КЕЗСААСОКТЕВ ТУТ УС ЖЕВОКР | Бо у Жн ОВК У А ААВВИЕСВКТ УКВ ТКОВИ ОКОМ У ЦО
ОМАР ОТАУ У УСААТЕТ УА ОВУ ВТ ЦОЄСТЬУТУ ' с БвадАкОК сок ОоААНИНОВО
БаІзозаНМе 0 БУСОБУВІЦОЄСТУОВОО ІН ЗСААВСОСТЕЗКУ ГУСУРВОАЕ | се
Сн " СЕВЕКЕКУ АВТОР ТУ ОВУ ТЕ ТВО
МН АРКОТАУЄУСААВКАСКОВМ УМ УЧОМЕ УКУС '
ТАТ УЄАКАСОКОВЕОСОСЛАННИННИ :
ОВО ТВІН ОО БУСІУВЗООЦЬТ ОВОЧ В САЛЮТ ЧУКАМОЖЕНОХМ ши жа ОВК УААБКВОТ У ТАВУКОККПяНОМІКМТУ Ж
ОМ КРЕНТАУЖУСААПРНОЖОУ АТ УХА У УВУ КСО, ши о в
ОРОТОЗТЯНОЄ 0 ЕУОГБУБВОСВОС ОВО ВІВ ЗСУ АЗОКТЕВЕТАМИЖЕНОХЕ | в:
ОЖва О БКЕКЕРУААЇБВНОСКТУ АПК ПОВОМУКМ ОЇ . МКМР ТАВЖ У ТСААЮКВКУ ТР ТЗКУ МУ КУ | Е
ТтУФВАААРОК МИТО МО ЛАННИННЯ
БОБОВІ БУЄ УЮВЧИКИ УОМИВ О ЗСсА АВК У АМС УВО Мо ува ОЗКЕККЕУААПТЕТОКАТУ УА УКОКУПЕВОМаКМТУ УВО Е ї ОМУМАРЕОТАУТУСААЮВНВСОУУТ ОЕМ К ! о УнвдалкОоки ВО ма ААННИОЦИ
ОКО сСюВ ЕКО СУв НН КЕ СААВОКТЕВО СМС КТКОХ | Но.
Май ОВОКЕВЕКУААРЕЖНООВ ТУ У АВЯУЮТКЕПЕКОМІКМТУХЬ ! ОД КРЕВТАУ ЄС ААКВВСОВСМА ЦИМ МС С :
С БУтУква дао КОС хСАаницВОИ
ОБОТІОБЄ 0 БУОГБЖКеОСС УСИК ВЕЕСЛАВСЇТЕЧВУТМОХТВОАВ 3,
ОсКЕВКЕМАЛІМА НВ ТУХКОВУКОВР ВТМ МТУ
ММ ДРЕИТАУ У УСЛАВВВОВОКМУЧ І УМ ЕИЮЮ : пахтою твою с : ГОББС УЮЧОЄКИ УСРР ВІ ЯСААВСВТ ТВО МОЖУКО
АК ОБЕЖУЗИЧОВОЗО ТТ АОЗУКОВЕТВОКАКЛТЬМ
Ома аРЕОТАУ ХУСТ яВІМОСТЬУТУ ОВО СС : : г ссБаОСОВО са ос ОС ОВУ У КОС : ! ОРОС ВІ ЗСААХОЦТ КТ АМОКЕКОАРОКЕВЕВУААМ У : ОВТ УАНЗУКОВЕ ПЕВ У ОМА УХ ! ! УСААОВИОУОУАУ УА ВО ОСИ ТУ ААВОКИВ : ше Кене ее | :
ОБОТЗБОВННЯ БУС УКЗОСОЇ УОРОЮСВІ ВО ВСАА ТИВИ ТО ТВОА ЗВ
: | ОКЕКЕЕУААІМНОСОВТУ УВУ КОСВР ПКМУ УО ! "о МмиБАРЕрТАУУУСААВКВОЦО МУ Уч ОМВК УСЮ , тУТУЄЧОВООБОООСВО ОО ИЮОСВОСОСЯНЮОВООЮ 0
ООЧЕУЄИ УКОСУ СВ С ААЗИКТКЕУВЕОМОКУКО
: :АРОКОСАУ ВВЕ АЮ КОМАКТЕЬМ
ОоМминдАРОУТАУ ХУСТ ВОСТІ УТУВВОСОЮВОЮ | !
ОБКНККИЮЮБОСОЧ КюЮВИаюОВЕУО УВОСУ !
ОРОС СУ АЗОКТЕЯВУ АМС УБЕСАРОКТЕВЕУААМВВ : ! БОСВТУУАЮЧУКОВЕТІЗВНМКМТУ У ОМ АРЕОТАХХ | :
ОУСААОВВУУЄТ ВТ УМУ ЦО ТУ ААКОКИ !
ВЕрОхОоЛанННиНИ
ОВщЩНазвюі 00 БУС УВЕОСОСІ УЮ ЛІ САКВООТЕУАМОВВКОА ОЗ ! ОВОКЕВУКУААТНАОВВ ТТ УАОВУКОКР ПМК У : ; Ми аВЕрТАУУУСАААВКУНОВТК У А ВЕУ !
ДТ УТУВООСОСХОЦЮОЮОСОСІИОВИСОМИЦЮВИВОС
ОсБВУЄУЕВО ОСС УЮРИМОСНЬЕСААБОКТРЕБРОМЕЖУВ
С ОАВОКОБЕ ЧУ ЧО ПУ АОСУКОВРТВКОМАКТИ ХУ У
ПОМ ЕРЕОТАУТУЄТЕНЧ КОСТІ УТУЧВООООВО ! ! дО ц ОО ОБОВ ЕК ! ; ОР ВСАА ТУ АМОЖЕКОАРОККВЕКУ АХ і
Ока УТАОЗУКОВР КОМ КМТУ У ОМ ИРЕОТАМ і
ОУСААПРНИУОУАТУВАТТЕУ ОЦТУ ААКОКИ
ЕКО ААННиННИ | ! нн и п а КК нн
ОББІЮЮЄ 00 БУСОУБУООСТ ОВО СААЖОКІКТ УКУС КО : | ОКЕКЕРУААНВНОХВТ У УОКУКОВРТВОМЗКМІМУВО С : | ММе РЕА УУСААОТВ ТУ АОС : Бала ОО Кн ОО ОБО
УБВОЦС ОРОМУ ВІ ЯСЛАВОКТ ЕВРО МУЖУВОАРОКО У
Е ПКУ т АВУКОКЕТВОМАКТ ТО ОМ і і ВРЕОТАУЖУСТЮНВІ ЗВЕОСТЬ У ТУНІС ОВО НН : ОПО ОО ОО ОО ОО У АОС і : ГЕ УСЛАВНІТКОВУАМОУВНОАРОКККЕРУ АНЯ МИВОВ . : ОУХАВЗУКОВЕТ ВОМУ МИ ВР АВУ СА
ОБР УОУА УВА КОСТІ У ТУ НА АВОКИЕЕН, і нн т п о п п
БОЮ 00 БУЄСБУКВОСОЇ ОРОС ВІ ЗСУ АВОВТКІУАМОУВВОАВ ОО НО
ПОКЕВЕРУААІВВООСВТУУАЮВУКОВЕТІЗВОМУККТУ УМ
ОМВО гАУтЖУСААНВННУ УЧИ ВРТТВИМУ ОЮСТЬМ : тен КО ОО ОО ОК ОС ВООО :
С УСАЛЕВОСО УСДРОМИ ВІ ЗСААВИЕТРУВТО МО ХУВОАРО І
Кажу ОВ АСУ КОВРТІКОМАКТИ ОМ ї МВ ЕРЕОЮТАУ ХУСТКИ КОС ПУ ГУК ОВ ' пови овОонииювОо сову Тв
О ОББКБОСААЯИВ ТР УСМОЖКВОАРОКЕАТ КУ АМНУНИ ; : о КТУУАПЗУКОКРНПУВОММТУ КОМУ КРЕВТАУ Ж ЖСА і і АКЕВОКОЗУЗРМЯВУ МУ ТУ ВО ААКОКИВЕЕ
ОМНЗМНЮЗІ 00 БУОБУБВОСОБ УВО ЯСААЖСВІВЯЯКАМОЖЕВОАВ Я
ООКрВЕКУуАНВТСпетУУАВКУКИВР ВОМ МУ У
МУР ТАУТУСААВВУ У ВЕ СТЬ
! УООИЦО ОПОВ ОО ОБО ОовОопОопес юю !
НАВ ОСИ УОВРОМВ КЕ ЗСААЗОКТРЯЗКОМОЮУКОАРОК у
ПЕ УВО ОВО ТАЗ УКОВЕПОКОМАКТПЛОММВ
ОБЕРЕОТАЖ УСТ ЗВО У ТУ НИКІВ ОСЛО часова ОоОочЕ УВІ ОВОЮ о ВЕВГ яса АВОСТЕКУАМОЖКОАРОКННККУААННЯСКА
ОКУ УКОКЕ ЧЕМ УТ ОМ ВВЕ УС
ААВВУКяЕТВУМТОТ УВЕСТИ ААКОКВ
ЕВ САВНЦНННИ і
ОБОаЧННМЯ 0 БУС УБЧООСІ УОРОСВЕВІЯСУАВОВТРЕЯТАМИЖРВОАК Я
ОЕБВКРУЛАВАОЛЕТ УТ АВУКОКИ ХВО ЕМТУ УМО і Ме ев АУТУСААОВЕУ УТ ЕРТІВУМУжНЮТЬУ ! ТУ ооворвОоваеютОови вв нюе ! і МС МЕВВОСІ ХОРОМ ВІ ХОЛАЗОГТЕЗЗКОСМО ЖУКОВ
КОТУ УВО ВТ АВВУКОВЕПЗВОМАЮТТЬМ ОМ | '
ОМЕГА РЕОТАУУ СТЕ ВЕСТ УТ УСС і швом ню во расою ЕВ УВО,
ОО ЯСААБОСТРВВУАМОЖУКВОАРОКСВЕРУААВКОВ | ! ' КТУУАТУКСВР ТКУ ММК ВРЕОТАУЖУСА
ААКЕУВУЯТВ УМО ТВ КОСИ ТУ АВКОКИ
Евромоланннинн
Дутунюююнюнкннкнжтттюнннх некжкфетсттеннння ки ще а м в вНвВ В авта НВ Н а а а а а а а а В м ВО В о о А ння хх
ОБІЗОВОТО БУС УВЧОССЬУС ВИНИ ВІЖСААБОВТЕХТУУМОЖРВОА ОВО, і | ВаКЕКЕК ААУ УАЮЄУЮСНЕТІКОМяКМ ЄВ і
ТОМАТУ т САВА У АОКТ УВУ КМОЮТЬМ ! і ТУЮ С ОО ООПОНОККВК
МОУ ВВОСС УСТИМ ВСАА ТРЕКУ ВО
БОРУ ОВ У АОУУКОКРТВОМАКТТЬ ОМ
! МОВО ТАУ УСТ ВИТ ГУЗНООЦО НК ! : иа ОопЦ ципи БОМО ОВУ У БО
І ОБ ЗСААКОВТЕ ТТ ТУ ЖРЕОАРОКЕВВКУААТВНВСВЯ :
ОТУУ У КОВЕТАМЕКТОММВвЕОТАХ ЕС А
Е о ТТ жАОУ ВУ СКТУТ УВО АВОКИ ВЕС
КА КК В В В ВВ В ВВ ВВ В ИН
ОКОМ; 0 БУОСУБЕОСОБУСРООЗЬ В СААЧТЕВВУТМСЕВОАВ Я ! | ПКБВЕРУДАТВЕХООТУ ВИЗ УКОВЕПУВОМОККТУ ГО !
МИЛО ОТА У У СААНВКОВОКУУВЬВХАУВ ВО !
І ЕСУТУЗВООВОСВСЦСКИ КОЗАК ОСИ ОСНСТО ! і
ОБУ ЕКОН УР МО В СА АМІИТЕВВ РИМА УКО : : С АРОКССОЮУ ЗНОВ ІН КАСЖУКОКЕМКОМАКЮТТЬ ЗОСОММОу РЕНТА УЖУЄТЮВТ ЗВО УКВОСЄЮВОЮ і ' ! кана МО ВЕК ОО ОО ОВУ УНК і і ОРОС ВІ ЗСААЗСЕТРЕВУАМО ЖЕН АРОКЕВЕКУАМУ і ЗО ТУУАСЯУЮОВЕ НВО КМТУ КАМ ВРЕТАМУ : ' ї УА РУСВ НВ МУрУ МЮУ ТУ ВАКвЕрСМОААННННИН рон нн нн нн о ння
ЩНІНюЮв 00 БУГУ УСРОС І ВІ ЗСААЗОВТЕВТУТУЄУТВОАВ Я. ! ОЗЕЕВЕЕТААТЕКНСКУ УВО УКИЦВИ ТВО КМРУТ '
МеВ ААУ САНИК А ОКУ КК УТУ. ! ! : ше ее ЕЕ КЕ КЕ КЕ ЕК : ; БУВ ТОВОМО ВЕ ЖСЛАЗОЕ ТЕО МО я УКОАРОКО
ОЕУУАКО НОТ У АПК У КОВТКАМИ.ОРЕ АУ ХУСТКИ ВОСТІ УТУВВОСКК КК ! і Кене ев я в и ЕН ВО Я | І
ОК СААЗЕТЕУАМОЦМЕВО АВК ККУ ААУ ЧО
: | УУАВУКОКИПКОМКМТ У ОМ ЕРЕОТАУ СА ! ОМЕУОМ АК УВ У КОТУ ГУМА КЕ нн нн нн нн п В ОК
КОБІЗНННУ | пом и УВО КЗ ААЖВІТ КВУ ЯКО : : СКВЕРУ АМКУ ВНК ЖАВ КОВКИ М УЖ : ! МУ КРЕОТАУКТСААМНЕКОВСВЕВУМ КРИ УВОСТЬУТУ рсОовОн нн Воно ОО і ! | ТОД ТО РОМ В СА ВОСКОМ У ВАР і ' | КОН ЖУКОВ У АОУУКОВЕ ПЕОМ АКТТ ОМ :
ОМВО тТА МУ УСТ ВКА ОС ТС УТУ ВИННИК : анна ооо Кн Оу ! ПОВЕ ЯСДАЗОСТЕВЕХ АВТ РКО АРОК ЕВ УААТННЯСТВ ' | КТЗ АПОУКСОККИПЯКОМКМТ УМ ОМУЧ КОТА УА ; : | ААННУВВЕТЕМИТ РИМИ КУ УТУИАКОКИ : (Примітка: Описані в Таблиці М молекули містять тус-гексагістидинову мітку (підкреслена), щоб полегшити очищення рекомбінантно експресованих поліпептидів; ця мітка не потрібна для - і, як правило, не приймає участі в - зв'язування молекул з їх мішенями.
Приклад 6: Оптимізація послідовностей УНН і МНН-конструктів
Оптимізація послідовностей - це процес, у якому батьківську послідовність піддають мутації, щоб зробити її більш схожою з людською зародковою консенсусною послідовністю КЗНМЗ-ІСНУ.
Приміром, конкретні амінокислоти каркасних ділянок (за винятком так званих відмітних залишків) заміняють їх людськими аналогами так, щоб зберегти структуру, активність і стабільність білка.
Ці мутації можна розділити на наступні категорії: 1. Стандартні: Оптимізація послідовностей у цих положеннях не повинна суттєво змінювати стабільність, активність або афінність УНН, тому їх усі змінюють одночасно, одержуючи базовий варіант. 2. Унікальні: Невідомо, як оптимізація послідовностей у цих положеннях вплине на стабільність, активність або афінність МНН, тому їх досліджують індивідуально на основі базового варіанта.
Відомо, що відмітні залишки критично важливі для стабільності, активності й афінності МНН, тому їх не міняють.
Крім того, амінокислоти СОК, для яких є експериментальне підтвердження того, що вони чутливі до посттрансляційних модифікацій (ПТМ), змінювали так, щоб інактивувати сайт ПТМ, не торкаючи при цьому структуру, активність і стабільність білка. Посттрансляційні модифікації, які найбільш часто зустрічаються, описані для антитіл і МНН, перераховані в Таблиці МІ нижче.
Чутливість МНН до ппосттрансляційних модифікацій аналізували за дослідженнями з форсованим навантаженням, застосовуючи ряд стандартних умов, включаючи обробку НгОг для оцінки окиснення метіоніну, високу температуру, високий рн і тривале зберігання для оцінки дезамідування аспарагіну й ізомеризації аспартату. Процентну частку окиснення, дезамідування й ізомеризації вимірювали згідно зі стандартними процедурами й порівнювали з еталонними зразками (МНН, що зберігалися при -207С). Для визначення потенційно чутливих залишків виконували аналіз цільних білків методом фазової хроматографії з оберненою фазою (ОФХ) і картування пептидів методом мас-спектрометрії (МС). Якщо після стрес-тесту в УНН спостерігалися посттрансляційні модифікації, відповідну (-ї) амінокислоту(-и) піддавали мутації.
Таблиця МІ
Потенційні посттрансляційні модифікації і мотиви, які їх потенційно запускають
У результаті у вищеописані конструкти ввели декілька мутацій, одержавши серед іншого три конструкти, показані в Таблиці ІІЇ вище, відібрані для подальшої характеристики іп міїко і іп мімо, як показано в подальших Прикладах.
Приклад 7: Іп міго-характеристика трьох біпаратопних перехреснореактивних за І КРБ/Л КРб
МНН-конструктів із продовженим періодом напіввиведення; Порівняння з іншими зв'язувальними
І КРб молекулами
Після оптимізації послідовностей МНН три біпаратопних перехреснореактивних за
ІГАРБЛАРб МНН-конструкта із продовженим періодом напіввиведення рекомбінантно експресували й очищали, після чого характеризували за допомогою ряду функціональних і біофізичних аналізів, описаних нижче. 7.1 Аналіз зв'язування ЕАС5
Зв'язування з людськими І КРБ і І КРб визначали на клітинах аналізом ЕАС5Б, як показано на
Фігурах ЗА і ЗВ. Зокрема, зв'язування з людським ЇКР5 перевіряли на клітинах НЕК293 зі стабільною понадекспресією людського ЇКР5. Для зв'язування з людським І КРб використовували клітини НЕК293 зі стабільною понадекспресією людського І КРб. Клітини інкубували з розведеннями ІКР5Б- і | КРб-зв'язувачів (серійні розведення зв'язувачів 1:5, відповідні до фінальних концентрацій, показаних на Фігурах ЗА їі ЗВ) протягом 1,5 години при 4"С на планшетному шейкері. Після 5- кратного промивання клітин буфером ГАС5, що складаються із їх ФСБ (Іпмігодеп, арт. 141190-094) ї- 10 95 ЕБС (Зідта, арт. Е7524) ж 0,05 95 азиду натрію, їх інкубували протягом 1 години при 4 "С з поліклональним мишиним антитілом, що зв'язуються з каркасною ділянкою МНН. Після трикратного промивання клітин буфером
ЕАСЗ5Б їх інкубували протягом 1 години при 4 "С з міченим вторинним антитілом (протимишине,
ФЕ (115-116-071)) з наступним трикратним промиванням буфером ЕАС5. Флюоресценцію вимірювали за допомогою ЕБАС5 Агтау (ВО). Зв'язуванню з людськими ІКР5 і І КРб при найвищій перевіреній концентрації відповідали значення МСЕ 2 600. Негативний контроль складався з ненаціленого зв'язувача (МНН-конструкт, що зв'язується з бактеріальним білком, який у клітинах НЕК293 не експресується). Як показано відповідно на Фігурі ЗА і Фігурі ЗВ, зв'язуванню з людськими І КРБ і ГКРб відповідали значення МСЕ 2 600 і 2 1600, при найвищій перевіреній концентрації трьох біпаратопних перехреснореактивних за ГКРБЗЛКРб УНнН- конструктів із продовженим періодом напіввиведення. Ці дані підтверджують, що відформатовані біпаратопні зв'язувальні молекули з оптимізованою послідовністю у своїй природній конформації в системі аналізу на клітинах зв'язуються як з людським І КРБ, так і з людським І КРб. Значення ЕС50О зв'язування з ПІ РЕ і ПІ РЕЄ наведені в Таблиці МІ! нижче.
Таблиця МІЇ
Значення ЕСво зв'язування з людськими І КРБ і І КРб, визначені аналізом зв'язування ЕАС5
ПСРАб, ЕСво (НМ) 0,02 0,01 0,02 7.2 Аналіз конкуренції з ОКК1 на основі ЕАС5
Силу й ефективність трьох біпаратопних перехреснореактивних за ГКРБУЛКРб УНнН- конструктів додатково аналізували аналізом конкуренції з ОККІ на основі ЕАС5, описаним у
Прикладі 4.1. Клітини НЕК293 зі стабільною понадекспресією людського І КР5 або людського
ІКРб інкубували із серійними розведеннями перехреснореактивних за ГКРБЗЛКРб УНнН- конструктів (серійні розведення 1:5, що відповідають фінальним концентраціям, показаним на
Фігурах 4А і 48). Перехреснореактивні за І КРБ/Л КРб МНН конкурували з людським ОККІ1 за зв'язування із клітинами НЕК293, понадекспресуючими людський ІКР5, так само як ії за зв'язування із клітинами НЕК293, понадекспресуючими людський І КРб, як показано відповідно на Фігурах 4А і 48. Повного пригнічення зв'язування ОКК1 досягли при найвищих перевірених концентраціях (2 10 нМ), що відповідало значенням МСЕ «х 60. Навпаки, специфічний за І КРБ
МНН конкурував би з людським ОККІ за зв'язування з НЕК293, понадекспресуючими людський
І КРБ, але не за зв'язування з НЕК293, понадекспресуючими людський І КРб (або конкурував би, але дуже слабко (» 200 нМ) (і навпаки, те ж саме стосується специфічних за ГКРб МНН). У результаті цього експерименту було продемонстровано, що присутні перехреснореактивні за
ГАРБ/Л.КРб МНН конкурували з людським ОККІ за зв'язування з НЕК293, понадекспресуючими людський І КРБ, так само як і з НЕК293, понадекспресуючими людський І КРб (тобто, зниження значення МСЕ при підвищенні концентрації зв'язувача, де повному пригніченню ОККІ1- зв'язування при найвищій перевіреній концентрації відповідали значення МСЕ «х 60). Значення
ІС50О для конкуренції ОККІ за зв'язування з ПІ РЕ і ПІ РЕ із трьома перехреснореактивними за
ІГАРБ/Л АРб УНН-конструктами наведені в Таблиці МІ! нижче. Ці дані підтверджують зв'язування трьох перехреснореактивних за ГКРБ/Л КРб МНН-конструктів з людським ГКР5 і з людським
І КРб, а також показують досить подібну афінність (тут обумовлену як значення сили ІСво в аналізі конкуренції з ОККІ) двох рецепторів. Більше того, дані зміцнюють позицію, що відформатовані біпаратопні зв'язувальні молекули з оптимізованою послідовністю у своїй природній конформації зв'язуються як з людським І КРБ, так і з людським І КРб.
Таблиця МІ
Значення ІСво конкуренції з ОКК1 за зв'язування з людськими І КРБ і І КРб, визначені аналізом зв'язування ЕАС5
ПСРАб, ІСво (нМ) 0,01 0,1 0,2 зо 7.3 Комбінований аналіз за геном-репортером УУпИ і УУпіЗа
Силу й ефективність відформатованих біпаратопних зв'язувальних молекул з оптимізованою послідовністю аналізували за комбінованим аналізом за геном-репортером М/пи і М/піЗа, щоб забезпечити функціональну перевірку блокаторів МУпиИ і МУпіЗа в одному аналізі.
Комбінований аналіз за геном-репортером МпИ і М/піЗа засновано на описаному в Прикладі 4.4 аналізі, з наступними змінами протоколу. 1ЕОб/мл клітин зі понадекспресією МУпи висівали на 384-лунковий планшет для тканинних культур і обробляли рекомбінантним людським УУпіЗза (рек.чіл. МупіЗа: НО 25036-МУМ/СЕ), після чого клітини інкубували протягом ночі при 37 "С.
Наступного дня готували серійні розведення різних біпаратопних перехреснореактивних за
ІГКРБУЛКРб УНН і додавали до клітин у присутності ГісІ у кінцевій концентрації 10 нМ. Як позитивний контроль до клітин додавали ОККІ у фінальній концентрації 200 нМ. Обробка ОКК1 приводила до повного пригнічення комбінованого шляху МУпії і УУпіЗа і, отже, до повного пригнічення ферментативної активності бета-лактамази. Клітини інкубували протягом ночі при 37 "С. Наступного дня вимірювали ферментативну активність бета-лактамази згідно з інструкціями виробника. Як вказано в Прикладі 4.4, для флюоресцентної емісії одержували значення при 460 нм і 530 нм за допомогою стандартного флюоресцентного планшетного рідера, і співвідношення емісії при 460/530 нм наносили на графік щодо вказаної обробки.
Значення співвідношення флюоресценції (460/535нмі, позначене на Фігурі 5А як "базова лінія", відповідає повному інгібуванню шляхи МУпії і МуУпіЗза певному обробкою з позитивним контролем (ОККІ1 у фінальній концентрації 200 нм). Значення співвідношення флюоресценції
І460/535нм)|, позначене як "МУпи", відповідає активації тільки шляху УУпи, визначеної за клітинами, що понадекспресують МУУпії (тобто, не обробленим рекомбінантним людським
УупіЗа). Значення співвідношення флюоресценції І460/535нм|, позначене як "УМпиИ -/піЗа", відповідає комбінованій активації шляхів МУпіИї і УУпіза, визначеній обробкою клітин, які понадекспресують МУпи, рекомбінантним людським УУпіЗза. Як показано на Фігурі 5А, повне пригнічення (тобто, співвідношення флюоресценції І460/535нмі|, відповідне до базової лінії) досягалося обробкою трьома перехреснореактивними за ІКРБ5ЛРЕРб відформатованими біпаратопними зв'язувальними молекулами з оптимізованою послідовністю. Крім того, відзначалася також значна сила, як показано в Таблиці ЇХ нижче на значеннях ІС50.
Таблиця ЇХ
Значення ІСво пригнічення шляхів УУпи і УУпіЗа у комбінованому аналізі УУПИ і УУпіЗа за геном- репортером
ПСю(нМ)У 77777111 11171005 | 02 | 006
Далі силу й ефективність перехреснореактивних за ІКРБ5ЛКРб відформатованих біпаратопних зв'язувальних молекул з оптимізованою послідовністю порівнювали з відомими раніше молекулами, що зв'язують І КРб, згаданими в М/О2011/138391 і УМО2011/119661:
В УМО2011/138391 були описані мультивалентні антитіла, що зв'язуються з І КРб і інгібують взаємодію з лігандом як пропелера 1 (напр., М/пії), так і пропелера З (напр., УУпіЗ). Ці мультивалентні антитіла, що зв'язуються з І КРб, є біпаратопними молекулами, що зв'язують
І КРб, що складаються із антитіла дос як перший зв'язувальний рецептор домену й фрагмента 5сЕм як другий зв'язувальний рецептор домену, при цьому антитіло ідо і фрагмент 5сЕм з'єднані лінкером. В УМО2011/138391 повідомляється, що всі зв'язувальні |/КРб молекули мають приблизно однакову силу за репортерним аналізом УУпи і М/піЗа (Фіг. 18 УМО2011/138391). Тому для порівняльних дослідів можна вибрати будь-яку із цих мультивалентних молекул, що зв'язуються з /КРб. Тому як першу сполуку для порівняння було вирішено використовувати конструкт "901" (позначений МОКО8168Ідс11 АГА 6475 5сїм; також показаний на Фіг. 27 0 МмО2011/138391).
В УМО2013/067355 показані похідні цього конструкта "901". Більш конкретно описані сполукт 8011 їі 80271 (див. інформацію на стор. 132 опису), що мають два І КРб-зв'язувальні домени 5сЕм плюс фрагмент, що продовжує період напіввиведення. Оскільки, як видно, 801 і 8027 мають однакові силу й біофізичні характеристики іп міго, то для нижчеописаних експериментів брали тільки один з них - варіант 802Т.
В УМО2011/119661 описані біспецифічні антитіла, що зв'язуються з І! КРб і пригнічують передачу сигналу за багатьма ізоформами УУпі Ці біспецифічні антитіла проти ІКРб зв'язуються із двома різними ділянками ГКРб і пригнічують передачу сигналу, індуковану ізоформами МуУпі, серед них МУпИи і М/піЗза. Для одержання цих біспецифічних антитіл проти
І КРб використовували конструювання за принципом "виступи-в-западини" (Аймеї! ії ін. "Маріє
Пеїегодітет5 тот гетоавеїїпд Пе дотаїп іпіенасе ої а потоаіїтег ивіпу а рпаде аїзріау Ібгагу". у
Мо! ВіоІї. 1997; 270(1)26-353. У прикладі 11 УМО2011/119661 описаний гібрид Ідс з гетеродимерами важкого ланцюга УУу211.31.62 і МУУ210.09. Тому з метою порівняння згенерували два біспецифічних гібридних антитіла (дО з гетеродимерами важкого ланцюга
УМІ211.31.62 її МуМ210.09, користуючись технікою "виступів-в-западини", тобто, з амінокислотними змінами, спроектованими для створення виступу на СНЗ важкого ланцюга
УМІ210.09 і западини на СНЗ важкого ланцюга УУУ211.31.62 або навпаки, і позначили їх як Кпор
НС МУм210.09 ї Кпобб НС УУу211.31.62, відповідно. Ці два конструкти охарактеризували за допомогою репортерних аналізів МУпи і УУпіЗа згідно із Прикладом 4.4. Як і очікувалося, два біспецифічних гібриди С з гетеродимерами важкого ланцюга УУу211.31.62 і МУу210.09 в аналізах М/пИ ї МупіЗа показали однакову силу, що відзначено в Таблиці Х нижче. Тому для показаних далі порівняльних прикладів як другу порівняльну сполуку вибрали Кпоб НС
УМ210.09.
Таблиця Х
Значення ІСво пригнічення шляхів М/пИ і УуУпіЗа в аналізах М/пИ їі УупіЗа за геном-репортером (Мупіза,ІСвю(нМІ 777771111111Ї7111117111007111111111111111111108
Силу й ефективність біпаратопних перехреснореактивних за ГКРБ/Л КЕРб УНН-конструктів із продовженим періодом напіввиведення порівнювали З біпаратопноюмолекулою
МОО8168І9О11 АГА 6475 5сїм, що зв'язує ІКРб, з біспецифічною молекулою Кпор НС
УММІ210.09 проти ІКРб і з біспецифічною молекулою 8027 проти ІКРб, використовуючи комбінований аналіз за геном-репортером Му/пії і Мупіза. Як показано на Фігурі 5В, повне пригнічення (тобто, співвідношення флюоресценції (460/535нмі, що відповідає базовій лінії на
Фігурі 58) досягалося обробкою Кпоб НС УУу210.09 (біспецифічним гібридним антитілом дО з гетеродимерами важкого ланцюга УМ/211.31.62 їі ММ/210.09) так само, як і перехреснореактивною за І БЕРБЗЛКРб відформатованою біпаратопною зв'язувальною молекулою з оптимізованою послідовністю БО13500571. Однак БО13500571 показав більшу силу, як відзначено в Таблиці ХІ нижче. У той же час біпаратопні молекули МОКО8168ІДдстІ АГА 6475 5сїм і 802Т, що зв'язують І КРб, показали недостатньо повне пригнічення УУпи і МпіЗа (тобто, співвідношення флюоресценції (460/535нм| значно вище за базову лінію на Фігурі 5В і на
Фігурі 5С, відповідно). Ці дані вказують на те, що обидві біпаратопні молекули
МОКО8168ІДС1І АГА 6475 5сіїм і 802Т, що зв'язують І КРб, мають значно меншу ефективність при пригніченні УУпИ і УУпіЗа у порівнянні з Е013500571. Тому для описаних далі експериментів іп мімо як порівняльна сполука була вибрана Кпоб НС УМу210.09 (Приклад 9; ефективність іп мімо).
Таблиця ХІ
Значення ІСво пригнічення шляхів УУпи і УУпіЗа у комбінованому аналізі УУПИ і УУпіЗа за геном- репортером
Комбінований аналіз МУПИ і УУпіЗа за Кпор НС МОНОВ8168ІДСНІ АГА
Приклад 8: Вплив трьох біпаратопних перехреснореактивних за І КРБ/ КРб УНН-конструктів із продовженим періодом напіввиведення на передачу сигналу М/пі і життєздатність ракових клітинних ліній
Здатність біпаратопних перехреснореактивних за ІКРБОЗЛКРб МНН-конструктів (із продовженим періодом напіввиведення пригнічувати активний М/пі-сигналінг додатково охарактеризували за допомогою клітинних ліній з активним М/пі-сигналінгом, описаних раніше (Ваїїсо і ін. "Ап ашосііпе теспапізт ог сопбійшіме М/пі раїпугау асіїмайоп іп питап сапсег сеїЇв".
Сапсег Сеї! 2004;6(5):497-506; ЮОєаІтвеїада і ін. "Тне зоЇШшріє млпї гесеріог Егі27Леавсво-ніс іпніріїв
Ше дгоуй ої іегасагсіпотав іп мімо". Сапсег Нев5. 2007;67(11):5371-9); АКіїі і ін. "Мпі раїййжау абетайопз5 іпсішаіпд ашостіпе МУпі асіїмайоп оссиг аї підп птедиепсу іп питап поп-5таїїІ-сеї! їШпд сагсіпота". Опсодепе. 2009; 28(21):2163-72). Якщо коротенько, лінії ракових клітин з активним
МУпі-сигналінгом, РА-1 і РА-ТИ-89885, висівали на 12-лункові планшети й обробляли перехреснореактивними за ГКРБ/ЛКРб МНН-конструктами в кінцевій концентрації 1 мкм протягом двох днів. Здатність пригнічувати МУпі-сигналінг виявляли за інгібуванням експресії мрнк Ахіп2, ендогенного гена-мішені УУпі. Аналіз експресії кпЛр виконували з використанням стандартних методик РНК: Виділення РНК здійснювали за допомогою ОІАСЕМ Кпеабзу Міпі Кії згідно із протоколом ОІАСЕМ; синтез кднк - за допомогою Зирегзосгірі МІСО сапа Зупіпевіз КИ (Іпмігодеп, арт. 11754050) і кпЛр - за допомогою Тадтап Сепе Ехргеззіоп Авзау із праймерами/зондами Ахіп2 Тадтап (Н500610344 т! АХІМ2 ЕАМ, Ге Тесппоїодіє5) а також з еукаріотичним 185 ендогенним контрольним МІС-МОаВ (4319413Е-1307061, Арріїєа Віозузієтв).
Як показано на Фігурі бА, і ракові клітини РА-ТО89885, і РА-1 при обробці трьома біпаратопними перехреснореактивними за ГКРБУЛЕРб МНН-конструктами із продовженим періодом напіввиведення показали значне зниження відносних рівнів мРНК Ахіп2 (тобто, нормалізованих за ендогенним контролем) у порівнянні з необробленими (контрольними) клітинами. Ці дані демонструють здатність біпаратопних перехреснореактивних за І КРБ/Л КРб
МНН-конструктів із продовженим періодом напіввиведення пригнічувати МуУ/пі-сигналінг у клітинних лініях з активним УУпі-сигналінгом. Крім того, досліджували вплив блокади УУпі- сигналінгу на життєздатність клітин ракових клітинних ліній РА-ТО89885 і МАРС, про яких раніше повідомлялося, що їх проліферація залежить від активного М/пі-сигналінгу (діапд і ін. "Іпасіїмайпд тшиїайоп5 ої ВМЕ4З сопіег М/пі аерепаепсу іп рапсгеаїйс дисіа! адепосагсіпота". Ргос
Маї! Асад 5сі ОО 5 А. 2013; 110(31):12649-54). Життєздатність клітин вимірювали аналізом Аіатаг
Віне (Іпмйгодеп, арт. ЮАЇ1100) через десять днів після обробки біпаратопними перехреснореактивними за ЇКРБЗЛКРб МНН-конструктами із продовженим періодом напіввиведення (фінальна концентрація 1 мкМ) або порівняльною сполукою 8027 (фінальна концентрація 1 мкМ). Як показано на Фігурі 6В, ракові клітини РА-ТО89885 при обробці трьома біпаратопними перехреснореактивними за ГКРБУЛЕРб МНН-конструктами із продовженим періодом напіввиведення показали значне зниження відсотка життєздатних клітин (зниження на 2 75 9о) у порівнянні з необробленими (контрольними) клітинами. Після обробки 8027 впливу на життєздатність клітин не виявили (Фігура 68, діаграма із правої сторони). Ці дані демонструють здатність біпаратопних перехреснореактивних за ГЕРБ/Л КРб УНН-конструктів із продовженим періодом напіввиведення пригнічувати проліферацію клітинних ліній, залежних від активного
М/пі-сигналінгу, а також перевагу цих конструктів над 8027.
Крім того, для ЕО13500571 у порівнянні з 8027 на лініях ракових клітин РА-ТО89885 (Фігура 6С) і МАРС (Фігура 60) оцінили залежність життєздатності клітин від дози. При обробці
Е013500571 виявили дозозалежне зниження життєздатності клітин. На відміну від цього, при обробці порівняльною сполукою 802Т впливу на життєздатність клітин не виявили в жодній з ліній ракових клітин РА-ТО89885 і МАРС. Ці дані демонструють, що біпаратопні перехреснореактивні за І КРБ/Л КРб МНН-конструкти із продовженим періодом напіввиведення мають кращий ефект у порівнянні з 802.
Приклад 9: Ефективність іп мімо
Перехреснореактивні за І ЕРБ/Л КРБ біпаратопні МНН-конструкти/зв'язувальні молекули із продовженим періодом напіввиведення додатково охарактеризували іп мімо на моделі пухлини, викликаної МуУпі. Здійснили досліди, покликані визначити, чи пригнічують ці зв'язувальні молекули ріст пухлини іп мімо. На цій же моделі пухлини, викликаної УУпі, визначали ефективність порівняльної сполуки Кпоб НС УУу210.09. Трансгенна експресія УУпі-лігандів за допомогою І ТК-енхансера вірусу пухлини молочної залози мишей (промотору ММТУ) у мишей приводить до великої гіперплазії проток з наступною аденокарциномою молочної залози в трансгенних (ТТГ) мишей до б-місячного віку. Ці пухлини молочної залози викликаються індукованою глюкокортикоїдами понадекспресією УУпі-лігандів і за своїми характеристиками подібні до ТНРМЗ-пухлин, включаючи експресію епітеліальних і мезенхімальних маркерів (подібний базальному фенотип) і активний УУпі-сигналінг, оцінюваний за внутрішньоклітинною локалізацією бета-катеніну. Зокрема, пухлині молочної залози в трансгенних мишей ММІТМ-М/пі- 1 залежать від М/пи1. Насправді, повідомлялося, що блокування активності М/пі за допомогою розчинного рецептора М/пі, що включає багатий цистеїном домен (БЦД) Егіг27Іей8, злитий з людським Ес-доменом (ЕВСЕОПЕс) (Оеаїтеїйда і ін. "Те 5зоЇШбіє мпі гесеріог Егіг27Леавстор-ніс іппіріїє Ше доли ої іегаосагсіпотав5 іп мімо". бапсег Рез. 2007;:67(11):5371-9), пригнічує ріст пухлини іп мімо. Тому виділені із трансгенних мишей ММТМ-МУпиИ пухлини підшкірно пасирували у вигляді шматочків пухлини безтимусним мишам у кількості від 2 до 5 пасажів перед початком досліду з ефективності. Між 14 і 21 днями після імплантації, коли пухлини досягли середнього об'єму приблизно 150-250 мму, мишей рандомізували за групами по 7 мишей і вводили їм в.в. сполуки. Перехреснореактивні за ГКРБ//КРб біпаратопні МНН-конструкти із продовженим періодом напіввиведення вводили мишам в.в. двічі на тиждень, у дозах, показаних на Фігурі 7А для ЕО13500571 і на Фігурі 7В для Б013500720. Порівняльну сполуку Кпоб НС УМ/210.09 також вводили в.в. двічі на тиждень, але в більш високих дозах, тобто, 30 і 45 мг/кг (Фігура 7С), з- за даних, отриманих для цієї сполуки у вищеописаних експериментах іп міо. Під час досліду з ефективності відслідковували об'єм пухлини й масу тіла, і медіанні об'єми пухлин показано на
Фігурах 7А-7С. Наприкінці досліду з ефективності визначали пригнічення росту пухлини (ПРП).
Зокрема, ПРП визначали для кожної групи лікування в порівнянні з контрольною групою (обробка мишей гістидиновим буфером -буфером з 20 мМ гістидину й рН 6,5 - у досліді на (610) Фігурах 7А і 7В, або ж цитратним буфером у досліді на Фігурі 7С). Крім того, наприкінці досвіду по ефективності виконували шлунково-кишковий (ШК) гістопатологічний аналіз (ГеЕ- фарбуванням зрізів ЖК-тракту від дванадцятипалої до прямої кишки) з метою оцінити потенційну токсичність антагоністів КРБ і І КРб. Пригнічення росту пухлини (ПРП), результат
РКЕ-гістопатологічного аналізу наприкінці дослідження ефективності іп мімо, смертність, відповідна до кількості мишей, яких довелося вмертвити через значну втрату маси тіла (218 95 втрат маси тіла в порівнянні з початком досліду з ефективності), а також кількість регресів пухлин (коли об'єм пухлини наприкінці досліду менше, ніж об'єм пухлини на початку лікування), для кожної групи лікування наведені в Таблицях ХІІА, ХІПІБ і ХІІВ, а дані експериментів показані також на Фігурах 7А, 7В і 7С, відповідно.
Таблиця ХПА
Ефективність ЕО13500571 іп мімо при в.в. введенні двічі на тиждень. Результати цього експерименту показані також на Фігурі 7А
ПРП Регресів . Гістопатологічна оцінка
Гістидиновий
Контроль буфер п І ПО 71281 0701151| Беоооолеоття 71817111
Таблиця ХІБ
Ефективність Р013500720 іп мімо при в.в. введенні двічі на тиждень. Результати цього експерименту показані також на Фігурі 7В
ПРП Регресів . Гістопатологічна оцінка
Гістидиновий
Контроль буфер нд ПО ПО в 07011191 веоолиютю ни Ес НС ПО СУ
Таблиця ХІІВ
Ефективність Кпоб НС УУМ210.09 іп мімо при в.в. введенні двічі на тиждень. Результати цього експерименту показані також на Фігурі 7С
В.В Доза (мг/кг) ПРП Регресів Смертність Гістопатологічна оцінка що ІОе) Іх/7 Іх/7 ЖК
Цитратний
Контроль
Р буфер
Таблиця ХІІВ (продовження)
В.В Доза (мг/кг) ПРП Регресів Смертність Гістопатологічна оцінка що ІОе) Іх/7 Іх/7 ЖК конс 01301061 тез ГО» 18519195 | 5 Бееооюлюютя
Як можна зрозуміти за Фігурами 7А-7С і Таблицями ХІІА-ХІІВ, лікування біпаратопними перехреснореактивними за ЇКРБЗЛКРб МНН-конструктами із продовженим періодом напіввиведення (Б013500571 у дозі 4 і 10 мг/кг ії Б0О13500720 у дозі 1 мг/кг за графіком 2 р/тиждень) дійсно приводило до регресу пухлини (тобто, пригніченню росту пухлини (ПРП) » 100 95, що відповідає зменшенню пухлини; зменшення об'єму пухлини наприкінці досліду з ефективності в порівнянні з об'ємом пухлини на початку досліду), при цьому не відзначалося значних змін маси тіла (« 1090) і на гістопатологічному аналізі ЖКТ не відзначалося особливостей. Важливо, що на відміну від цього, при лікуванні | КРб-специфічним зв'язувачем
Кпор НС УУу210.09 не спостерігали ніякого регресу пухлин, навіть у максимальній дозі в.в, яку вводили мишам за графіком., яка відповідала 90 мг/кг за графіком Зр/тиждень.
Щоб додатково досліджувати спостережувані у вищеописаному експерименті відмінності ефективності іп мімо, поставили ще один дослід, що дозволяє більш часте введення мишам (тричі на тиждень) ще більшої дози порівняльної сполуки. Коротко, щоб досягти такого посиленого впливу, порівняльну сполуку вводили в.о., як вказано в нижченаведеній Таблиці
ХО:
Таблиця ХІІ
Ефективність Кпоб НС УМ/210.09 іп мімо при в.о. введенні двічі або тричі на тиждень, як вказано итратний .
Контроль Ц Тричі на тиждень буфер Й В 50 дають | 5010106
Улетосе | 0090000 двмінатидеь | 85 100
Ууу210.09 Двічі на тиждень 85 ово (Тоиаінатжкденььо | 87 | 00
Як видне за даними, наведеним у Таблиці ХІІ, у цій постановці також не досягли значного посилення ефекту в плані ПРП. Іншими словами, ці експерименти, дані й результати чітко вказують на більш високу ефективність біпаратопних МНН-конструктів із продовженим періодом напіввиведення в порівнянні з Кпоб НС о мМ/210.09, а також безпрецедентну здатність поліпептидів згідно з винаходом не тільки послабляти ріст пухлини, але навіть викликати її зменшення. Зменшення пухлини (тобто, регрес пухлини) є, поза всіляким сумнівом, бажаним терапевтичним ефектом (тобто, дієвістю) при лікуванні хворих раком пацієнтів. Насправді, у клінічних дослідженнях ліків пухлини, що викликають регрес, що приводить до повної патоморфологічної відповіді (пПВ), позитивно приводять до значного поліпшення виживаності без прогресування й загальної виживаності у випадку великої нереалізованої медичної потреби, такої, як при раку молочної залози.
Вищеописані порівняльні приклади також демонструють, що перехреснореактивні за
ІГКРБЛ КРБ біпаратопні МНН-конструкти із продовженим періодом напіввиведення не тільки є кращими за своїми характеристиками зв'язування, таким як афінність або значення Ко, але вони також мають більші переваги й кращі характеристики в умовах іп мімо.
Далі вивчили, чи може сполука МОКО8168ІдДС1| АГА 6475 всім забезпечити такий же позитивний ефект. Із цією метою виконали наступне дослідження переносимості іп мімо на мишах: Сполуку МОКО81681Д4С11І АГА 6475 5сім уводили в.в. у дозі З мг/кг двічі на тиждень (2дам); це ті ж самі доза й протокол, для яких в М/О2011/138391 на ксенотрансплантатній моделі пухлини була виявлена ефективність іп мімо, згідно з описом на фіг. 22 цього документа. Першу обробку МОКО8168ІдС1І АГА 6475 5сїм здійснили в день 1, а починаючи із дня 6, у мишей відзначали значну втрату маси тіла. На 10-й день деякі миші, оброблювані сполукою
МОКО8168ІДС1І АГА 6475 5сім, показали значну втрату маси тіла (210 95). На 11-й день мишей умертвили, і гістопатологічний аналіз ЖКТ показав запалення з ерозією ободової кишки й сліпої кишки мишей. Ці дані вказують на те, що МОКО8168ІдДс1|( АГА 6475 5сїм в ефективній дозі/протоколі непереносимий. Таким чином, біпаратопні перехреснореактивні за І КРБ/Л КРб
МНН-конструкти із продовженим періодом напіввиведення мають перевагу відносно терапевтичного вікна; тобто, вони викликають регрес пухлини без значних змін маси тіла (« 10 95) і без особливостей, які б виявлялися гістопатологічним аналізом ЖКТ.
Приклад 10: Пригнічення шляху МУпії іп мімо
Щоб додатково оцінити вплив перехреснореактивних за І ЕРБЛКРб біпаратопних УНН- конструктів/зв'язувальних молекул із продовженим періодом напіввиведення на М/пі-сигналінг, наприкінці описаного в Прикладі 9 досліду з ефективності виділяли пухлини. Зокрема, пухлині виділяли через 16 годин після останньої ін'єкції сполук або контрольної обробки. Пригнічення
М/пі-сигналінгу визначали за зниженням експресії мРНК Ахіп2 у пухлинах, аналізованої згідно з описом у Прикладі 8. Кратність зміни експресії мРНК Ахіп2 відносно контрольної групи показано на Фігурі ВА для ефективності БО13500571 іп мімо і на Фігурі 88 для ефективності Е013500720 іп мімо. Кількісне визначення зниження експресії мрнк Ахіп2 у кожній групі лікування наведене в
Таблицях ХПА і ХІЇБ нижче.
Таблиця ХША
Зниження експресії МРНК Ахіпа2 у пухлинах при лікуванні РО13500571. Дані стосуються Фігур7А і 8А п Доза |мг/кгі| ПРП (Обі Зниження Ахіпа2 (95)
Таблиця ХПБ
Зниження експресії МРНК Ахіп2 у пухлинах при лікуванні Е013500720. Дані стосуються Фігур7У і 8в
І Доза (мг/кгі ПРП (бої Зниження Ахіпа (95)
Як видно за Фігурами 8А і 8В, а також Таблицями ХІПА ії ХІПБ, у пухлинах, оброблених молекулами, перехреснореактивно зв'язувальними ІКР5/ЛКРб, спостерігалися значне зниження й дозозалежне зменшення (зокрема, для обробки РО13500571) експресії мрнк Ахіп2 у порівнянні з контрольною групою. Ці результати змушують припустити, що молекули,
перехреснореактивно зв'язувальні ГКРБ5ЛКРб, дійсно здатні пригнічувати ріст пухлини, пригнічуючи УУпі-сигналінг у пухлинних клітинах.
Приклад 11: Спосіб промислового виробництва 11.1 Ферментація: Будь-який з поліпептидів, перерахованих у Таблицях І ї М вище, може експресуватися в цитоплазмі різних штамів Е. соїї, таких як М/У3110, ТО1, ВІ21, ВІ 21(ОЕЗ),
НМ5174, НМ5174(0ЕЗ), ММ294, під контролем індуцибельного промотору. Цей промотор може бути вибраний з Іасимб5, гас, 17, ігр, Т5, ага». Середовища культивування переважно повністю визначене за Уміптз5 і ін., 2001 (М/Птв5 В., Нашиск А., Кеиз5 М., Зуїдаїк С., Мацез К., зіетапп М. і
АМПеприсппег у).: Нідп-СеП-Оеп5зйу Рептепіайоп їТог Ргодисіюп ої І -М-Сагратоуїазе Овіпд ап
Ехргезбвіоп БЗузієт Вазей оп Ше ЕвсПегіспіа соїї гтпарай Рготоїег. Віоїесппоіоду апа
Віоепдіпеегіпд, 73:95-103 (2001)), Оєїїва і ін., 1999 (Оеєїїза М. Р., Гі 9. С., Као б., Ууеідапа УМ. А. і
Вепіієу МУ. Е.: Мопіютгіпд СЕР-орегоп Тизіоп ргоїєїп ехргеззіоп адигіпу підн сеї! деп5йу сийімайоп ої
ЕвсНетісніа сої ивіпд ап оп-їїпе оріїса! зепзог. ВіоїесппоЇоду апа Віоепдіпеегіпо, 65:54-64.(1999)) або еквівалентні до них. Проте, доповнення середовища такими амінокислотами, як ізолейцин, лейцин, лізин, метіонін, фенілаланін, треонін, триптофан і валін, або комплексними компонентами, такими як соєвий пептон або дріжджовий екстракт, може виявитися корисним.
Ферментаційний процес виконували напівбезперервним способом. Умови: Температура 30 - 40"С, ри 6 - 7,5, розчиненого кисню більше 20 95. Після споживання первісного джерела вуглецю культуру підживлюють вищевказаним (або еквівалентним) живильним середовищем.
При нагромадженні у ферментері 40-90 г/л сухої маси клітин культуру індукують належним індуктором, що відповідають використаній промоторній системі (напр., ІПТГ, лактозою, арабінозою). Індукцію можуть здійснювати як імпульсну повну індукцію або як часткову індукцію, подаючи відповідний індуктор у ферментер протягом тривалого часу. Фаза вироблення повинна тривати не менше 4 годин. Клітини відокремлюють центрифугуванням у роторних центрифугах, трубчастих центрифугах або тарілчастих сепараторах, супернатант культури зливають. 11.2 Очищення: Клітинну масу Е. соїї ресуспендують в 6-8-кратній кількості лізисного буфера (фосфатний або трис-буфер, рН 7-8,5). Лізис клітин переважно здійснюють гомогенізацією під високим тиском з наступним видаленням уламків клітин шляхом центрифугування в роторних, трубчастих центрифугах або тарілчастих сепараторах. Супернатант, що містить цільовий білок, необов'язково фільтрують через фільтр на 0,22-10 мкм і розділяють катіонообмінною хроматографією (напр., Тоуореагі! МедасарФ І 5ЗР-550ЕС, Тоуореап! Сідасар 5-650М, 5Р бЗерпагохе ВВ, ЗР БЗерпагозе РЕ або 5 Нурегсеї") при рН 7-8,р5. Елюювання здійснюють градієнтом Масі, що лінійно підвищується, при рН 7-8,5. Фракції, що містять цільовий білок, об'єднують і потім інкубують з 5-10 мМ ДТТ із метою запобігти димеризації або агрегації, опосередкованій вільними цистеїновими залишками. Після подальшого додавання 0,8-1 М сульфату амонію або 2-3 М Масі розчин розділяють гідрофільною хроматографією (напр., на
Ріпепу! Зерпагозе НР, Ріепу! Зерпагозе ЕЕ, Вшу! Зерпагозе НР, ВіЛуЇ Зерпгозе ЕЕ, Вшуї
Тоуореаг! 650 (5, М,С), Рпепу! Тоуореагі 650 (5, М,С)) при рН 7-8,5. Елюювання здійснюють градієнтом, що лінійно знижується, сульфату амонію або Масі при рН 7-8,5 у присутності 5 мм
ДТТ. Фракції, що містять цільовий білок з мінімальним ступенем чистоти 90 95, поєднують і знесолюють діафильтрацією у присутності 5 мМ ДТТ із наступним концентруванням до приблизно 5 мг/мл. Потім виконують рефолдинг, розводячи білковий розчин 1:5-1:20 50 мМ трис, 150 мМ Масі, 4 мм цистаміну, 10 мМ СНАРЗ при рН 8,5 до фінальної концентрації білка 0,25-1 мг/мл. Рефолдинговий розчин інкубують, помішуючи, протягом 12-36 год. при кімнатній температурі й потім розділяють катіонообмінною хроматографією (напр., ЗР Зерпагозе ЕЕ, ЗР
Зерпагозе НР, Тоуореаг! 5Р-650 (5, М, С)) при рН 7-8,5. Елюювання здійснюють градієнтом масі, що лінійно підвищується, при рН 7-8,5. Фракції, що містять мономерний цільовий білок, об'єднують і вводять до складу 25 мМ фосфату натрію-і 220 мМ очищеної від ендотоксинів трегалози при рН 7,5 шляхом діафільтрації. Розчин стерилізують фільтрацією й зберігають при 002-876.
Приклад 12: Фармацевтичний препарат для п.ш. введення
Будь-який з вищеописаних біпаратопних поліпептидних конструктів згідно з винаходом може бути відібраний для виробництва фармацевтичного препарату для підшкірного введення з наступним складом:
Лікарська субстанція: 100 мг/мл (від 1 до З нмоль/мл)
Ацетатний буфер: 25 мМ
Трегалоза: 220 мМ
Тмееп-20: 0,02 95
Лікарську субстанцію вводять до складу розчину вищевказаної композиції, стерилізують і бО зберігають при 2-8 276.
Приклад 13: Фармацевтичне застосування на людях
Виготовлений у Прикладі 11.2 розчин вводять пацієнтові, який цього потребує, такому як людина, хворому на рак, чутливий до інгібіторів М/пі-сигналінгу, шляхом внутрішньовенної інфузії (у дозі від 100 до 200 мг) з інтервалом від двох до чотирьох тижнів.
Приклад 14: Вплив пригнічення УУпіза-сигналінгу на вивільнення прозапальних цитокінов дендритними клітинами в аналізі ех-мімо
У здорових донорів з їх інформованої згоди брали МКПК. Людські дендритні клітини моноцитарного походження (Мо-ДК) створювали в такий спосіб. МКПК культивували на середовищі Х-МІМО з додаванням 50 нг/мл ЗМ-С5Е і 50 нг/мл 1-4. Після 24 год. культивування супернатант обережно відбирали й заміняли середовищем Х-МІМО з додаванням тих же зМ-
С5Е і 1-4. На четвертий день супернатант обережно відбирали й заміняли середовищем Х-
МІМО у присутності тільки ЛПС або в комбінації з людським М/піЗза або з людським М/піЗа і молекулами, перехреснореактивно зв'язувальними ГКРБ/Л КРб. Наступного дня супернатанти збирали й піддавали аналізу ФНП-альфа по методу ЕГІЗА згідно з інструкціями виробника. Як повідомлялося раніше (Одегир і ін" Сапопісаї! апа попсапопісаї! МУпі ргоївіп5 ргодгат депанйіс сеї! гезропзев Тог оЇегапсе". ) Іттипої. 2013;190(12): 6126-34), і як показано на Фігурі 9А, УупіЗа безпосередньо пригнічує секрецію прозапальних цитокінів (тобто вивільнення ФНП-альфа) диференційованими дендритними клітинами (ДК). Викликане УУпіза пригнічення вивільнення
ФНІП-альфа із ДК відновлялося при додаванні молекул, що перехреснореактивно зв'язують
ГАРБ/Л АРб.
Ці дані демонструють, що відформатовані біпаратопні зв'язувальні молекули з оптимізованою послідовністю здатні відновити секрецію ФНІП-альфа в оброблених М/піЗа дендритних клітинах, тим самим пригнічуючи інгібіторний вплив М/пії на дендритні клітини.
Слід зазначити, що блокування шляху М/пі у дендритних клітинах мікрооточення пухлини може представляти потенційний терапевтичний підхід до порушення пухлиноопосередкованого пригнічення імунітету й доповнення протипухлинного імунітету.
Щоб досліджувати вплив ДК на Т-клітини (ефекторні Т-клітини), попередньо оброблені
УуУпіЗа ДК, з або без молекул, що перехреснореактивно зв'язують І! КРБ/ КРб, культивували разом з Т-клітинами, виділеними із МКПК, як описувалося раніше (Одегир і ін. "Сапопіса!Ї апа попсапопіса! М/пі ргоївіпо ргодгат депаніїс сеї! "езропзевз ог юоІегапсе". У Іттипої. 20137190(12): 6126-34). Через З дня спільного культивування ДК/Т-клітин збирали супернатанти й піддавали їх аналізу на ІФН-гамма за методом ЕГІЗА згідно з інструкціями виробника.
Секреція ІФН-гамма є маркером активації Т-клітин. Як показано на Фігурі 9В, УупіЗа- опосередковане пригнічення ДК приводить до зниженої секреції ІФН-гамма Т-клітинами (пригнічення функції Т-клітин), яка повністю відновлюється обробкою молекулами, перехреснореактивно зв'язувальними І КР5Б/ КРб.
У підсумку ці дані показують, що молекули, перехреснореактивно зв'язувальні ГКРБ/Л КРб, пригнічують інгібіторний вплив М/пі на дендритні клітини, приводячи до відновлення функції Т- клітин.
Відомо, що постійна активація/стимуляція Т-клітин викликає кінцеве диференціювання, що приводить до виснаженого фенотипу Т-клітин, прогресуючої втрати функції Т-клітинами. Тому передбачається, що вплив молекул, що перехреснореактивно зв'язують І КРБЗ/ЛКРб, на Т- клітини, опосередковане активацією ДК, може бути обмежений виснаженням Т-клітин. Тому очікується, що комбіноване лікування, у якому введення молекул, що перехреснореактивно зв'язують І! КРБ/ КРБ, об'єднане із введенням інгібітора імунних контрольних точок, що блокує виснаження Т-клітин, повинно допомогти активувати й підтримувати функцію Т-клітин, тим самим змінюючи мікрооточення пухлини й підтримуючи терапевтичний ефект молекул згідно з винаходом.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1105 ВОЕНВІМСЕВ ІМСВЕІНЕІМ ІМТЕВМАТІОМАТ, СМВН «1205 БІПАРАТОПНі ПОЛІПЕПТИДИ - АНТАГОНІСТИ ПЕРЕДАЧІ СИГНАЛУ ММТ В
ПОХЛИННИХ КЛІТИНАХ
«1305 РІ2-0401/0/1 «1605 47 бо
«1705 ВвіББАР 1.2 «2105 1 «2115 5 «212» Білок «213» Штучна послідовність «2205 «223» сСрв1 Мпе1-333Е0 бод «4005 1
ТПЕ Тут ТПт Уа1ї «(1У 1 5 «2105 2 «2115 17 «212» Білок «213» Штучна послідовність «2205 «223» СсСрВ2 Мпе1-3330 бод «4005 2
Аза чІ1е Агу Агу Акуд сіу бек бек ТПІ Тут Тут Аїа Авр бБет Уаї1ї Гуз 1 5 10 15 ов1у «2105 З «2115 14 «212» Білок «213» Штучна послідовність «2205 «223» СРВЕЗ3 УМпе1-333Е0О бод «4005 З
Авр ТПІ Атгуд ТПт Уаії Аїа теп їГец сіп Тухт Агуд Тут Авр Туг 1 5 10 «2105 4 «2115 5 «212» Білок «213» Штучна послідовність «2205 «223» сСрв1 Упе1-333606 «4005 4 бек Тух Аї1а Меє С1У 1 5 «2105 5 «2115 17 «212» Білок «213» Штучна послідовність «2205
«223» СрВ2 МпеЕ1-3330с06 «4005 5
Аза ІчІ1е Агу Агуд бБет с1у Агкгд Агкуд ТБї Тух Тут Аза Авр бБет Уаї1ї Гуз 1 5 10 15 ов1у «2105 6 «2115 19 «212» Білок «213» Штучна послідовність «2205 «223» СРВЗ Мпес1-3330с06 «4005 6
Аза Ату Атуд Уаі Агуд бет бет ТПтІ Агуд Тут Авп о ТПг с1іу ТПт Тгр Тгр 1 5 10 15
Тер сСіи Туг «2105 7 «2115 5 «212» Білок «213» Штучна послідовність «2205 «223» СрВ1 Мпеє1-332р0Зтой зо «4005 7
Атуд Тут ТПх Меє с1У 1 5 «2105 8 «2115 17 «212» Білок «213» Штучна послідовність «2205 «223» СрВ2 МпеЕ1-3320р0Зтой «4005 8
А1їа Іїе Маі Агд бБет сіу сіу бБет ТПї Тухк Тут Аза Авр бБет Уаї1ї Гуз 1 5 10 15 ов1у «2105 9 «2115» 20 «212» Білок «213» Штучна послідовність «2205 «223» СРВЗ3 Мпеє1-3320р0Зтой «4005 9
Авр Ат Атуд сб1у Агд с1іу сі Авзп Тут І1е Гей Ггец Тут бет бет 01Уу
1 5 10 15
Атуд Тут ої Тукг 20 «2105 10 «2115 5 «212» Білок «213» Штучна послідовність «2205 «223» СРВ1 йпеЕЗа-093АО1 «4005 10 бек Тут Аї1а Меє ШУ 1 5 «2105 11 «2115 17 «212» Білок «213» Штучна послідовність «2205 «223» СрРВ2 МпЕЗа-093АО01 «4005 11
А1їа Іїе бБегт Тгр бБет сіу сіу бБет ТПї Тухк Тут Аза Авр бБет Уаї1ї Гуз 1 5 10 15 ов1у зо «2105 12 «2115 17 «212» Білок «213» Штучна послідовність «2205 «223» СРВЗ МпеЕЗа-093АО1 «4005 12 ек Рко І1е Рго Тук с1іу бБег Гец Гец Агуд Агд Агд Авп Авп Тут Авр 1 5 10 15
ТУГ
«2105 13 «2115 5 «212» Білок «213» Штучна послідовність «2205 «223» СРВ1 йпеЕЗа-367В810 «4005 13 бек Тут Аї1а Меє ШУ 1 5 «2105 14 «2115 17
«212» Білок «213» Штучна послідовність «2205 «223» СсрВ2 МпеЕЗа-367В810 «4005 14
А1їа Іїе бБег ТІгр Акд бБет сіу бБет ТПї Тухк Тут Аза Авр бБет Уаї1ї Гуз 1 5 10 15 е1у «2105 15 «2115 16 «212» Білок «213» Штучна послідовність «2205 «223» СсСрРЕ3 МпеЗа-367В810 «4005 15
Авр Ргто Атуд сіу Тут сіу Уаії А1їа Тут Уаії бБегт Аза Тут Тут сіцЧ Туг 1 5 10 15 «2105 16 «2115 5 «212» Білок
Зо «213» Штучна послідовність «2205 «223» СсСрРВ1 А1511 «4005 16
Зек Рпе біу Ме бек 1 5 «2105 17 «2115 17 «212» Білок «213» Штучна послідовність «2205 «223» СсрРВ2 А16511 «4005 17
Ззек І1е Бек біу бек біу бек Авр ТПтІ Гей Тут Аїа Авр бек Уаі1ї Гуз 1 5 10 15 с1Уу «2105 18 «2115 6 «212» Білок «213» Штучна послідовність «2205
«223» СРВЗ А1Б511 «4005 18 сіу б1у бек Гей бБег Аг4д 1 5 «2105 19 «2115 123 «212» Білок «213» Штучна послідовність «2205 «223» УНН-домен МпЕ1-333БЕ0О бтосй «4005 19
А1їа уаії сіп Гец Уаі сіц бехт сі1у сі1у с1у гей Уаі сбіп Рго с1іу 01Уу 1 5 10 15
Ззек Гей Агд Гецп бек Сув Аїа Аїа бек С1у Агуд ТПтї РПпе бек ТПк Тук 20 ТБт Уаї с1у Тгр Рпбе Агуд сіп Аїа Рго сС1у Пув сС1цп Акд сі Робе Уаї
Аза Аїа чІ1е Агуду Агуд Акуд сіу бет бек ТПх Тут Тут Аза Авр бБет Уаї бо
Туз с1у Акд РпПе ТПї Іїе бек Агуд Авр Авп о бет Гув Авп ТПт Уаі1ї Тук 25 65 70 75 80 теп сіп Меє Авзп бет Гей Агд Рго бі Авр ТПтІ Аїа Уаї Тут Тут Сув 85 Зо 95
Аза Аза Авр ТПтІ Акуд ТПт Уаї А1їа еп Гей біп Туг Агуд Тут Авр Туг 100 105 110 30 Тер сСі1у сіп сСіу ТБк Іеец Уа1! ТртІ Уаї бек 5ег 115 120 «2105 20 «2115 128 35 «212» Білок «213» Штучна послідовність «2205 «223» УНН-домен ШпЕ1-333006 40 «4005 20
А1їа уаії сіп Гец Уаі сіц бет сі1у сі1у с1у гей Уаі сіп Рго сіу с1УуУ 1 5 10 15
Ззек Гей Агд Гецп бек Сув Аїа Аїа бек с1у с1у ТПтї РПпе бек бек Тук 45 20 25 30
А1їа Месє с1у Тгр Рпе Акд сіп Аїа Рго біу ув сбіц Акд сі Робе Уаї 35 40 45
Аза Аїа чІ1е Агуд Акд бет с1у Агуд Агуд ТБх Тут Тут Аза Авр бБет Уаї 50 55 бо 50 пув с1у Акд РпПе ТПтї Іїе Бек Агд Авр Авп о бетг Гув Авп ТПт Уа1ї Туг 65 70 75 80 теп сіп Меє Авзп бет Гей Агд Рго бі Авр ТПтІ Аїа Уаї Тут Тут Сув 85 Зо 95
А1їіа Аїа Аза Агу Акуд Уаі Акуд бет бет ТПІ Агуд Тут Авп о ТпПт б1у ТОПг 55 1600 105 110
ТЕр Тер Тктр сі Тут Тгр б1у біп б1іу ТПг теп Уа1і ТПІ Уаї бек бек 115 120 125
«2105 21 «2115 129 «212» Білок «213» Штучна послідовність «2205 «223» УНН-домен МпЕ1-332р0Зтой «4005 21
А1їа уаії сіп Гец Уаі сіц бехт сі1у сі1у с1у гей Уаі сбіп Рго с1іу 01Уу 1 5 10 15
Ззек Гей Агд Гецп бек Сув Аїа Аїа бек с1у Ге ТПтї Рібе бек Агд Тук
ТПх Меє с1у Ткр Рпе Агд біп Аза Рго сб1і1у Ппув бі Агкд сі Ропе Уаї1ї
Аза Аїа І1е Уаі Акд бБет сіу сСіу бек ТПх Тут Тут Аїа Авр бет Уаї бо 20 пув с1у Акд РпПе ТПтї Іїе Бек Агд Авр Авп бетг Гув Авп ТПт Уаї Туг 65 70 75 80 теп сіп Меє Авзп бет Гей Агд Рго бі Авр ТПт Аїа Уаї Тут Тук Сув 85 Зо 95
Аза Аїа Авр Агуд Агуд с1іу Акуд с1у бі Авп Тут Іїе їец Гец Тут 5Бег 25 1600 105 110 бек б1у Агд Тух бі Тухк Тгр с1і1у сбіп сб1у ТПї Ге Уа1і ТПх Уаї1ї бек 115 120 125 зекг
Зо «2105 22 «2115 126 «212» Білок «213» Штучна послідовність 35 «2205 «223» УНН-домен ШпЕЗа-093А01 «4005 22 40 сі Ма1! сі1іп Пец Уа1ї сі бек с1у сС1у с1у їец Уа1і с1іп Рго сС1у С1Уу 1 5 10 15
Ззек Гей Агд Гецп бек Сув Аїа Аїа бек С1у Агуд ТПтї РпПе бек бек Тук 20 25 30
А1їа Месє с1у Тгр Рпе Акд сіп Аїа Рго біу Ппув сбіц Акд сі Рое Уаї 45 35 40 45
Аза Аїа І1їе бБет Тгр бБет сіу сСіу бек ТПх Тут Тут Аїа Авр бБет Уаї 50 55 бо
Туз с1у Акд РпПе ТПї Іїе бек Агуд Авр Авп бет Гпув Авп ТПх Уа1ї Тук 65 70 75 80 50 теп сіп Месб Авзп о бет Гей Агуд Рго сій Авр ТПт Аїа Уаї Тут Тук Сув 85 Зо 95
Аза Аїа бБет Рго Іїе Рко Тут сСіу бек Гей Гей Агд Агд Агд Авп Авп 100 105 110
Тукх Авр Тут Ткр с1у Сіп с1у ТПх Ггецп Уа1 ТПт Уаї бБет 5бег 55 115 120 125 «2105 23 «2115 125
«212» Білок «213» Штучна послідовність «2205 «223» УНН-домен МпЕЗа-367810 «4005 23 сі Маї сб1іп Гец Маі сіц бехт сіу с1у с1у Гей Уаі біп Рго сС1у 1У 1 5 10 15 зет Гей Агд Пец бек Сув Аїа Аїа бБет Ссіу сіу ТПт РПпе бБектк бек Туг 20 25 30
А1їа Месє с1у Тгр Рпе Акд сіп Аїа Рго біу ув біц Акд бі Рпе Уаї 35 40 45
Аза Аїа І1їе бБет Тгр Акд бет Сіу бек ТПх Тут Тут Аїа Авр бБет Уаї 50 55 бо
Туз с1у Акд РпПе ТПї Іїе бек Агуд Авр Авп о бет Гув Авп ТПт Уаі1ї Тук 65 70 75 80 теп сіп Меє Авзп бет Гей Агд Рго бі Авр ТПтІ Аїа Уаї Тут Тук Сув 85 Зо 95
А1а А1ї1а Авр Рго Агуд с1у Тук с1у Уаї1ї Аїа Тук Уа1 бБег Аїа Туг Туг 100 105 110
Сбіц Ту Тер с1у сіп сіу ТПт Ггец Уа1! ТПї Уаі1ї бек бБекг 115 120 125 «2105 24 «2115 115 «212» Білок «213» Штучна послідовність
З0 0«2205 «223» УНН-домен А1Б611 «4005 24 сі Маї сб1іп Гец Уаі сіц бехт сіу с1у с1у гей Уаі біп Рго С1Уу Авп 1 5 10 15
Ззек Гей Агд Гецп бек Сув Аїа Аїа бек с1у Рпе ТПтї РпПе бек бек РІГе 20 25 30 сіу Меєсє бБег Ттр Уаі Агду сіп Аїа Рко сі1у пув с1у гей бій Тгр Уаї 35 40 45 зетк бБет І1е бек сіу Бек сіу Бек Авр ТПтї Гей Тут Аїа Авр бек Уаї1ї 50 55 бо
Туз с1у Акд РпПе ТПї Іїе бек Агуд Авр Авп Аїа Гуз ТПтї ТПКг Гец Тук 65 70 75 80 теп сіп Меє Авзп бет Гей Агд Рго бі Авр ТПтІ Аїа Уаї Тут Тут Сув 85 Зо 95
ТпПї Іїе сі1у сі1у бек Гецп бек Агуд бек бек біп с1у ТПтї Ге Уа1 ТЕПкК 100 105 110
Уа1ї Бек 5екг 115 «2105 25 «2115 435 «212» Білок «213» Штучна послідовність «2205 «223» УННн-конструкт ЕО13500575
«4005 25
А1їа уаії сіп Гец Уаі сіц бехт сі1у сі1у с1у гей Уаі сбіп Рго с1іу 01Уу 1 5 10 15
Ззек Гей Агд Гецп бек Сув Аїа Аїа бек С1у Агуд ТПтї РПпе бек ТПк Тук 20 25 30
ТПх Уаї с1у Ткр Рпбе Агд біп Аза Рго сб1і1у Ппув бі Агкд сі Ропе Уаї1ї 35 40 45
Аза Аїа чІ1е Агуду Агуд Акуд сіу бет бек ТПх Тут Тут Аза Авр бБет Уаї 50 55 бо пув с1у Акд РпПе ТПтї Іїе Бек Агд Авр Авп бетг Гув Авп ТПт Уаї Туг 65 70 75 80 теп сіп Меє Авзп бет Гей Агд Рго бі Авр ТПтІ Аїа Уаї Тут Тут Сув 85 Зо 95
Аза Аза Авр ТПтІ Акуд ТПт Уаї А1їа еп Гей біп Туг Агуд Тут Авр Туг 1600 105 110
ТЕр сі1у сіп с1у ТПї Гей Уа1і ТПкх Уа1і бек бет о1у с1у сі1у с1у бек 115 120 125 сіу б1у сб1у с1у Бек сіу сіу сіу сі1у бек біу б1у біу біу бБех 01У 130 135 140 сі1іу сб1у сС1у Бек с1у с1у сС1у с1у бек сі1у сС1у с1у с1у бек сі Уаї 145 150 155 160 сіп Гей Маії біц бек сіу сіу с1у Гец Уаі Сбіп Рго біу Авп бБет ТІец 165 170 175
Ат9д Гей бБет Сув Аїа Аїа бет сіу Рпе ТПї Рібе бет бБет Рпе сС1іу Меє 180 185 190
Ззект Тгтр Уаі Агд біп Аза Рго сіу їГув с1у Гец сі Ткгр Уаї бек бек 195 200 205
І1е Бек сіу бБет сіу бБет Авр ТПхїх Ггецп Тут Аїа Авр бБет Уаі Гуз щу 210 215 220
Акту Робе ТПІ І1е бег Агуд Авр Авп А1ї1а їув ТПг ТПІ Ієц Тут Ієц Сс1іп 225 230 235 240
Меє Авп обБет Гец Акуд Ркго с1іц Авр ТПї Аза Уаї Тут Тут Сув ТПт І1е 245 250 255 сіу сб1у бБет Гец бБет Акуд бБет бет біп б1у ТПт Ггец Уаі! ТПт Уаї 5ег 260 265 270 бек сі1у сбі1у б1у бі1у бек біу сі1у сі1у с1у Бех с1у с1у сіу с1у бек 275 280 285 сіу б1у сб1у с1у Бек сіу сіу сіу сі1у бек біу б1у с1у сіу Бех «(1У 290 295 300 сі1іу сб1у сС1у Бек сіц Уа1! сС1іп теецш Уаї1ї Сі бек сі1у сС1у с1у Іви Уаї 305 310 315 320 біп Ргто сбі1у с1у Бек Гец Акд Гец бехт Сув Аза Аїа бБет с1у Акд ТПг 325 330 335
Рпе бек бек Тухк Аїа Меєсє с1і1у Ттр Рпе Агд сіп Аїа Рко сС1у гув б1ц 340 345 350
Атуд бі Рпе Уаі Аїа Аїа І1е бет Тгр бек с1у с1і1у Бек ТПт Тук Туг 355 360 365
Аза Авр бБет Уаі Гпув сі1у Акд Ропе ТПї Іїе бБегт Агд Авр Авп бБет Гувг 370 375 380
Авп оТпт Уа1ї Тут Ггец біп Меє Авп бег Гец Агуд Рго сій Авр ТПт Аїа 385 390 395 400 уаї Тут Тук Сув Аїа Аїа бет Ркго І1е Рго Тут Сбіу бБет Іец ІТец Акгд 405 410 415
Ат Ат Авп о Авп Тут Авр Тут Тгр сіу біп с1у ТПт Гец Уаї ТПт Уаї 420 425 430 зет бБет А1а 435
«2105 26 «2115 439 «212» Білок «213» Штучна послідовність «2205 «223» УННн-конструкт ЕО13500571 «4005 26
А1а Уа1 сіп їеецш Уа1 сі бек с1у сС1у с1у Пец Уа1 сСі1іп Рго сС1у С1Уу 1 5 10 15
Ззек Гей Агд Гецп бек Сув Аїа Аїа бек с1у с1у ТПтї РПпе бек бек Тук 20 25 30
А1їа Месє с1у Тгр Рпе Агд сіп Аїа Рго Сб1і1у Ппув біц Акд бі Рпе Уаї 35 40 45
Аза Аїа чІ1е Агуд Акд бет с1у Агуд Агуд ТБх Тут Тут Аза Авр бБет Уаї 50 55 бо
Туз с1у Акд РпПе ТПтї Іїе бБег Агуд Авр Авп бет Гув Авп ТПт Уаі1ї Тук 65 70 75 80 теп сіп Месб Авзп о бет Гей Агуд Рго сій Авр ТПт Аїа Уаї Тут Тук Сув 85 Зо 95
Аза Аїа Аза Агу Акуд Уа1і Акуд бет бет ТПї Агуд Тут Авп о ТПт со1у Ток 100 105 110
ТЕр Тер Тктр сі Тут Тгр б1у біп б1іу ТПг теп Уа1і ТПІ Уаї бек бек 115 120 125 сіу б1у сб1у с1у Бек сіу сіу сіу сі1у бек біу б1у біу біу бБех 01У 130 135 140 сіу б1у сб1у Бек сіу сіу сіу сіу бБехт сіу сбі1у б1у біу Бех б1у 1У 145 150 155 160 сі1іу сб1у бек сі Уа1 с1іп тТец Уа1! СсСіц бек сС1у с1у сС1у тІец Уа1 сіп 165 170 175
Ркто сб1у Авп бек Ггец Агд Гей бехт Сув Аїа Аїа Бек с1у Рпе ТПк РіГе 180 185 190
Зек бек РПе біу Меєс бБехт Ттр Уаі Агу сіп Аїа Рко с1у пув С1УуУу Гей 195 200 205 біц Тер УМаї бБет бБет І1їіе бБет сіу бБет Сбіу бБет Авр ТПтІ Іец Тут А1а 210 215 220
Авр бБет Уаії Ггув сіу Акд РпПе ТПїІ І1е бек Агуд Авр АвБп Аїа Гув ТПг 225 230 235 240
ТІ гейш Тук Гец сСіп Меє Авп бет Гец Агд Рго С1іц Авр ТПг А1а Уаї 245 250 255
Тук Тут Сув ТПїІ І1е сіу сі1у Бек Пец бБегхт Агуд бБет Бех сіп с1у ТЕПк 260 265 270 теп Уаії ТПтІ Уаї бек бек бі1у біу бі1у с1у бБехт о1у с1у сі1у с1у бек 275 280 285 сіу б1у сб1у с1у Бек сіу сіу сіу сі1у бек біу б1у біу біу бБех 01У 290 295 300 сіу б1у сб1у Бек сіу сіу сіу сі1у бБехт бі Уаії біп Гец Уаї січ бБег 305 310 315 320 сі1у сбі1у б1у Гец Уаії Сбіп Рго сіу сіу бБег Гей Агд Іїецй бек Сув Аїа 325 330 335
Аза бБет с1у сіу ТПт РПе бет бет Тут Аїа Мес Сіу Тгр Рпе Агд сіп 340 345 350
Аза Ргто с1у Гув сіц Акд сі Рое Уаі Аза Аза Іїе бБет Тгр Аг9д 5ег 355 З6о0 365 сіу бек ТПІ Тут Тут Аїа Авр бБет Уаі пуз б1іу Агд Рпе ТПтІ Іїее 5ег 370 375 380
Ат Авр Авп обБет Гув Авп ТПт Уаї! Тут Гей біп Меєс Авп бет Іец Агд
385 390 395 400
Рго б1п Авр ТПх Аїа Уаі1 Тухк Тухт Сув Азїа Аза Авр Рго Акд с1уУу Тук 405 410 415 сіу Маі Аїа Тут МУМаії бБет Аїа Тут Тут бій Тухг Тгр С1у біп с1у ТПг 420 425 430 теп Ма1! ТПг Уаї бек 5ек Аїа 435 «2105 27 «2115 440 «212» Білок «213» Штучна послідовність «2205 «223» УНН-конструкт ЕО13500720 «4005 27
А1їа уаії сіп Гец Уаі сіц бехт сі1у сі1у с1у гей Уаі сбіп Рго с1іу 01Уу 1 5 10 15 зет Гей Агд Пец бек Сув Аїа Аїа бБет сСіу Гей ТПт Рпе бБег Агд Туг 20 25 30
ТПх Меє с1у Ткр Рпе Агд біп Аза Рго сб1і1у Ппув бі Агкд сі Ропе Уаї1ї 35 40 45
Аза Аїа І1е Уаі Акд бБет сіу сСіу бек ТПх Тут Тут Аза Авр бБет Уаї 50 зо бо
Туз с1у Акд РпПе ТПї Іїе бек Агуд Авр Авп о бет Гув Авп ТПт Уаі1ї Тук 65 70 75 80 теп сіп Меє Авзп бет Гей Агд Рго бі Авр ТПтІ Аїа Уаї Тут Тук Сув 85 Зо 95
Аза Аза Авр Агд Акуд б1іу Агуд б1у бі Авп Тут Іїе Гей Гец Тут бБег 100 105 110 бек б1у Агд Тух бі Тухк Тгр сі1у сбіп с1у ТПтї Ге Уа1і ТПх Уаї1ї бек 115 120 125 бек сі1у сбі1у б1у бі1у бек біу сі1у сі1у с1у Бех с1у с1у сіу с1у бек 130 135 140 сіу б1у сб1у с1у Бек сіу сіу сіу сі1у бек сбіу с1у с1у сіу Бех «(1У 145 150 155 160 сіу сб1у сб1у Бех біц Маі сіп Гец Уаі сі бек с1у с1у с1у Гец Уаї 165 170 175 сСіп Ркго сС1у Авп бет Іец Агд Іїец бек Сув Аїа А1ї1а бек СсС1у Рое ТПг 180 185 190
РпПе бек бек РіПе біу Меєс бБегт Ттр Уаі Агду сіп Аїа Ркго с1у ув ШУ 195 200 205 теп січ Ткр Уаї бек бек Іїе бек біу бБет сіу бБет Авр ТПхїх Гец Тук 210 215 220
Аза Авр бБет Уаі Гпув с1у Акд Ропе ТПї Іїе бБег Агд Авр Авп Аїа Гуз 225 230 235 240
ТПх ТпПт Ггец Тут Гей біп Меєс Авп бБет Гец Акд Рго с1п Авр Тіт Аїа 245 250 255
Ууа1ї Тук Тук Сув ТПг І1ї1е сіу сіу Бек Гей Бех Агд Бех Бех сіп ШУ 260 265 270
ТПх Гец Уаїії ТПтІ Уаї бек Бех б1іу біу біу сіу бехт б1у с1у сш1у ЗЩУу 275 280 285 бек сі1у сбі1у б1у бі1у бек біу сі1у сі1у с1у Бех с1у с1у сіу с1у бек 290 295 300 сіу б1у сб1у с1у Бек сіу сіу сіу сіу бек біц Уаі біп Гец Уаї с1ц 305 310 315 320 бек бі1у б1у б1у пгецп Уаі1і біп Рго сіу с1у Бек Гецп Акд Гец бек Сув
325 330 335
Аза Аїа бек сіу сіу ТПх Рібе бек бБегт Тут Аїа Меєсє сСі1іу Тгр Рпе Агд 340 345 350 біп Аїа Рго с1у Гув сіц Акд сі Рпбе Уаі Аза Аза Іїе бБет Тгр Агд 355 360 365
Зек біу бек ТПх Тухк Тут Аза Авр бБегхт Уаії Гпув с1у Акд Рпе ТПк Ше 370 375 380 зек Агд Авр Авп о бет пув Авп оТПтІ Уаі! Тут Гецп сіп Меєс Авзп бетг Гей 385 390 395 400
Акуд Рго СсСіц Авр ТПт АТїа Уа1ї! Туг Тугк Сув Аї1а Аза Авр Рго Агд сС1Уу 405 410 415
Тук сіу Уаі А1їа Тут Уаії бек Аза Тух Тухк сбіц Тут ТЕр с1у сіп щу 420 425 430
ТПг Гец Уаї ТПт Уаї бек 5ек Аїа 435 440 «2105 28 «2115 149 «212» Білок «213» Штучна послідовність «2205 «223» УНН-домен КЕО129093А01 «4005 28 сі Маї сб1іп Гец Маі сіц бехт сіу с1у с1у Гей Уаі біп Рго сС1у 1У 1 5 10 15
Ззек Гей Агд Гецп бек Сув Аїа Аїа бек С1у Агуд ТПтї РпПе бек бек Тук 20 25 30
А1а Мес сС1у Тгр Рпе Агд сСіп Аза Рго сі1у ув сб1ц Акд сі Робе Уаї
Аза Аїа І1їе бБет Тгр бБет сіу сСіу бек ТПх Тут Тут Аїа Авр бБет Уаї бо
Туз с1у Акд РпПе ТПї Іїе бек Агуд Авр Авп о бет Гув Авп ТПт Уаі1ї Тук 35 65 7о 75 80 теп сіп Меє Авзп бет Гей Агд Рго бі Авр ТПтІ Аїа Уаї Тут Тут Сув 85 Зо 95
Аза Аїа бБет Рго Іїе Рко Тут сСіу бБет Гей Гей Агуд Агд Агд Авп Авп 100 105 110 40 Тут Авр Тут Тгр с1у сСіп с1у ТПт Гец Уа1 ТПг Уаї бБег бек А1їа А1а 115 120 125
Аї1а сбіц с1іп ув їец І1е бек б1іц С1п Авр Ге Авп сС1у Аїа АїТа Ніз 130 135 140
Нів Нів Нів Нів Нів 45 145 «2105 29 «2115 151 «212» Білок 50 «213» Штучна послідовність «2205 «223» УНН-домен КО130333006 55 «4005 29 сі Маї сб1іп Гец Маії сіц бехт сіу с1у с1у Гей Уаі біп Рго сі1у «1У 1 5 10 15
Ззек Гей Агд Гецп бек Сув Аїа Аїа бек с1у с1у ТПтї РПпе бек бек Тук
20 25 30
А1їа Месє с1у Тгр Рпе Акд сіп Аїа Рго біу ув біц Акд сі Робе Уаї 35 40 45
Аза Аїа чІ1е Агуд Акд бет с1у Агуд Агуд ТБх Тут Тут Аза Авр бБет Уаї 50 55 бо
Туз с1у Акд РпПе ТПї Іїе бек Агуд Авр Авп о бет Гув Авп ТПх Уа1ї Тук 65 70 75 80 теп сіп Меє Авзп бет Гей Агд Рго бі Авр ТПтІ Аїа Уаї Тут Тут Сув 85 Зо 95
А1а А1ї1а А1а Агд Агуд Уа1і! Агуд бБетг бек ТПт Агуд Тут Авп ТПг с1у ТБг 100 105 110
ТЕр Тер Тктр сі Тут Тгр б1у біп б1іу ТПг теп Уа1і ТПІ Уаї бек бек 115 120 125
Азї1а Аїа Аїа сіц сіп пув Гец І1е бек бій бій Авр Гец Авп с1у А1а 130 135 140
А1а Нів Нів Нів Нів Нів Нів 145 150 «2105 30 «2115 148 «212» Білок «213» Штучна послідовність «2205 «223» УНН-домен КЕО129093А03 «4005 30 сі Маї сб1іп Гец Маі сіц бехт сіу с1у с1у Гей Уаі біп Рго сС1у 1У 1 5 10 15 зет Гей Агд Пец бек Сув Аїа Аїа бБет Сіу Агд ТПт Рпе бБет ТПк Туг 20 25 30 уаї Месє с1у ТЕр Рпе Акд сіп Аїа Рго біу ув біц Акд бі Рпе Уаї
Аза Аїа І1ї1е Авп Тгр бет сіу бБет Агд ТПх Тут Тут Аїа Авр бБет Уаї 35 50 55 бо
Туз с1у Акд РпПе ТПї Іїе бек Агуд Авр Авп о бет Гув Авп ТПт Уаі1ї Тук 65 70 75 80 теп сіп Меє Авзп бет Гей Агд Рго бі Авр ТПтІ Аїа Уаї Тут Тут Сув 85 Зо 95 40 Аза Аза Бек Агуд бБет бБет Тут Аїа с1у Акд ТПт Тут Туг сіц Гецч Туг 100 105 110
Авр Тут Ттр с1і1у сіп сіу ТПтї Ггец Уа1і ТПїх Уаї бБегт б5Бет Аїа Аїа А1а 115 120 125
Сі б1п пувз Гец І1е Бех Сі б1ц Авр Гїец Авп с1у Аїа Аїа Нів Нівз 45 130 135 140
Нів Нів Нів Нів 145 «2105 31 «2115 146 «212» Білок «213» Штучна послідовність «2205 «223» УННн-домен КО130333ЕО06 «4005 31 сі Маї сб1іп Гец Маі сіц бехт сіу с1у с1у Гей Уаі біп Рго сС1у 1У
1 5 10 15
Ззек Гей Агд Гецп бек Сув Аїа Аїа бек С1у Агуд ТПтї РПпе бек ТПк Тук 20 25 30
ТПх Уаї с1у Ткр Рпбе Агд біп Аза Рго сб1і1у Ппув бі Агкд сі Ропе Уаї1ї 35 40 45
Аза Аїа чІ1е Агу Агуд Акуд сіу бет бек ТПх Тут Тут бБет Авр бБет Уаї 50 55 бо
Туз с1у Акд РпПе ТПї Іїе бек Агуд Авр Авп о бет Гув Авп ТПт Уаі1ї Тук 65 70 75 80 теп сіп Месб Авзп о бет Гей Агуд Рго сій Авр ТПт Аїа Уаї Тут Тук Сув 85 90 95
Аза Аза Авр ТПтІ Акуд ТПт Уаї А1їа еп Гей біп Туг Агуд Тут Авр Туг 100 105 110
ТЕр сі1у сіп с1у ТПї Гей Уа1і ТПх Уа1і! бБех бБехт Аїа Аїа Аїа сі сіп 115 120 125 ув теп Іїе бБег Сі Сі Авр Тїец Авзп сС1у Аза Аїа Нівз Нів Нів Ніз 130 135 140
Нів Нів 145 «2105 32 «2115 152 «212» Білок «213» Штучна послідовність «2205 «223» УНН-домен КО1303320р03 «4005 32 сі Ма1! сі1іп Пец Уа1 сі бек с1у сС1у с1у їец Уа1 сСіп Рго сС1у С1Уу 1 5 10 15
Ззек Гей Агд Гецп бек Сув Аїа Аїа бек с1у Гей ТПтї РПпе 5ех Агкд Тук 20 25 30
ТПх Меє с1у Ткр Рпе Агд біп Аза Рго сб1і1у Ппув бі Агкд сі Ропе Уаї1ї 35 40 45
Аза Аїа І1е Авп Акуд бет сіу сСіу бек ТПх Тут Тут бБет Авр бБет Уаї 50 55 бо
Туз с1у Акд РпПе ТПї Іїе бек Агуд Авр Авп о бет Гув Авп ТПт Уаі1ї Тук 65 70 75 80 теп сіп Месб Авзп о бет Гей Агуд Рго сій Авр ТПт Аїа Уаї Тут Тук Сув 85 Зо 95
Аза Аїа Авр Агуд Агуд с1іу Акуд с1у бі Авп Тут бет їГец Гец Тут 5бег 100 105 110 ект Авп Агд Тут бі Тух Тгр сбі1у сбіп с1у ТПтї Ге Уа1і ТПхКх Уаї1ї бек 115 120 125 зехт Аї1а Аїа Аза біш сбіп ув Гей Іїе Бек сій сб1п Авр Гей Ап 01У 130 135 140
А1а А1ї1а Нівз Нів Нів Нів Нів Нів 145 150 «2105 33 «2115 148 «212» Білок «213» Штучна послідовність «2205 «223» УНН-домен КО130367810
«4005 33 сі Маї сб1іп Гец Маі сіц бехт сіу с1у с1у Гей Уаі біп Рго сС1у 1У 1 5 10 15
Ззек Гей Агд Гецп бек Сув Аїа Аїа бет бі1у с1у ТПї Рібе бек бек Тук 20 25 30
А1їа Месє с1у Тгр Рпе Акд сіп Аїа Рго біу ув біц Акд бі Рпе Уаї 35 40 45
Аза Аїа І1їе бБегт Тгр Агуд бек сСіу бек ТПІ Тут Тут Аїа Авр бБет Уаї 50 55 бо пув с1у Акд РпПе ТПтї Іїе Бек Агд Авр Авп бетг Гув Авп ТПт Уаї Туг 65 70 75 80 теп сіп Меє Азп бек Гей Агуд Рго біц біу ТПтІ Аїа Уаї Тут Тук Сув 85 Зо 95
Аза Аза Авр Рго Акд сіу Тут сіу Уаі Аїа Тут Уаї бБет Аїа Тут Туг 1600 105 110 біц Тук Тер с1у сіп сіу ТПх Гец Уа1і ТПї Уаї бБегт бБет б1у Аїа А1а 115 120 125
Сі б1п пувз Гец І1е Бех Сі б1ц Авр Гїец Авп с1у Аїа Аїа Нів Нівз 130 135 140
Нів Нів Нів Нів 145 «2105 34 «2115 149 «212» Білок «213» Штучна послідовність «2205 «223» УНН-домен КО130378805
Зо «4005 34 сі Маї сб1іп Гец Маі сіц бехт сіу с1у с1у Гей Уаі біп Рго сС1у 1У 1 5 10 15
Ззек Гей Агд Гецп бек Сув Уа1 Аїа бек С1у Агуд ТПтї РпПе бек бек Тук 20 25 30
А1їа Месє с1у Тгр Рпе Акд сіп Аїа Рго біу ув біц Акд бі Рпе Уаї 35 40 45
Аза Аза І1ї1е бБегт Акд бБет сіу с1у Агкд ТПх Тут Тут Аїа Авр бБет Уаї 50 55 бо пув с1у Акд РпПе ТПтї Іїе Бек Агд Авр Авп бетг Гув Авп ТПт Уаї Туг 65 70 75 80 теп сіп Меє Авзп бет Гей Агд Рго бі Авр ТПтІ Аїа Уаї Тут Тут Сув 85 Зо 95
Аза Аза Авр Агуд Акуд Уаї Тут бет ТПтї Гей Рго Рго ТПтІ ТПт 5бет Агд 1600 105 110
Тук Авп Тут Тктр сі1у біп б1у ТПх Гец Уа! ТПтІ Уаії Бех 5ехт Аїа Аїа 115 120 125
Аї1а сбіц с1іп ув їец І1е бек б1іц С1п Авр Ге Авп сС1у Аїа АїТа Ніз 130 135 140
Нів Нів Нів Нів Нів 145 «2105 35 «2115 147 «212» Білок «213» Штучна послідовність «2205
«223» УНН-домен КЕО130378А04 «4005 35 сі Маї сб1іп Гец Маі сіц бехт сіу с1у с1у Гей Уаі біп Рго сС1у 1У 1 5 10 15
Ззек Гей Агд Гецп бек Сув Аїа Аїа бек С1у Агуд ТПтї РпПе бек бек Тук 20 25 30
А1їа Месє с1у Тгр Рпе Акд сіп Аїа Рго біу ув біц Акд бі Рпе Уаї 35 40 45
А1а А1ї1а І1е ТБг Агу ТБг о сС1у Агуд Агуд ТБт Туг Тут А1їа Авр бет Уаї1 50 55 бо
Туз с1у Акд РпПе ТПї Іїе бек Агуд Авр Авп о бет Гув Авп ТПт Уаі1ї Тук 65 70 75 80 теп сіп Меє Авзп бет Гей Агд Рго бі Авр ТПтІ Аїа Уаї Тут Тут Сув 85 Зо 95
Аза Аза Авр Агуд Агкуд сіу Тут Тут Тут Тухк Авр бБет бБет РПе Тут Авр 100 105 110
Тут Тер сі1у сіп с1у ТПїх Ггецп Уа1 ТПх Уа1і бБехт бБехт Аїа Аїа Аїа с1ц 115 120 125 сСіп пув теп І1е бек сі сС1ц Авр Тец Авп сС1у Аза АТа Нів Нів Нів 130 135 140
Нів Нів Нів 145 «2105 36 «2115 150 «212» Білок «213» Штучна послідовність
З0 0«2205 «223» УНН-домен КО130372С08 «4005 36 сі Маї сб1іп Гец Маі сіц бехт сіу с1у с1у Гей Уаі біп Рго сС1у 1У 1 5 10 15
Ззек Гей Агд Гецп бек Сув Аїа Аїа бек С1у Агуд ТПтї РПпе 5еїг Авр Тукг 20 25 30 сіу Меє с1у Тер Рпе Агду сіп Аїа Ркго с1і1у пув б114 Агд бі Робе Уаї 35 40 45
А1а А1ї1а І1е Бек Тгр бек сС1іу с1у Агуд ТПтї Тугк Тут А1їа Авр бет Уаї1 50 55 бо
Туз с1у Акд РпПе ТПї Іїе бек Агуд Авр Авп о бет Гув Авп ТПт Уаї1ї Тук 65 70 75 80 теп сіп Меє Авзп бет Гей Агд Рго бі Авр ТПтІ Аїа Уаї Тут Тут Сув 85 Зо 95
Аза Аїа ув Агуд Акуд с1іу Акуд сСіу бБет Уаі1ії бет Рго Авп бет бет 5бег 100 105 110
Атуд Тут Авп о Тут Тгр сіу сіп с1у ТПїх Гей Уа1ї ТПт Уаії бБет бБет А1а 115 120 125
Аза Аїа сбіц сіп гув їец Іїе Бек сіц сій Авр Гец Авп с1іу Аза Аїа 130 135 140
Нів Нів Нів Нів Нів Нів 145 150 «2105 37 «2115 462 «212» Білок «213» Штучна послідовність
«223» УННн-конструкт ЕО13500016 «4005 37 сі Маії сб1іп Гец УМаі сі бек сіу сіу с1у Гей Уаі біп Рго сС1у 1У 1 5 10 15
Ззек Гей Агд Гецп бек Сув Аїа Аїа бек с1у Гей ТПтї РПпе 5ех Агкд Тук 20 25 30
ТБІ Месє с1у Тер Рпбе Агуд сі1п Аїа Рго сС1у Пув С1цп Акд Сі Робе Уаї 35 40 45
Аза Аїа І1е Авп Акуд бет сіу сСіу бек ТПх Тут Тут бБет Авр бБет Уаї 50 55 бо
Туз с1у Акд РпПе ТПї Іїе бек Агуд Авр Авп о бет Гув Авп ТПт Уаі1ї Тук 65 70 75 80 теп сіп Меє Авзп бет Гей Агд Рго бі Авр ТПтІ Аїа Уаї Тут Тут Сув 85 Зо 95
Аза Аїа Авр Агуд Агуд с1іу Акуд с1у бі Авп Тут бет їГец Гец Тут 5бег 100 105 110 бек Авп Агуд Тухкх біш Тухк Тгр сС1у СсС1іп с1у ТрПї Кей Уа1! ТПг Уаї 5ег 115 120 125 бек сі1у сбі1у б1у бі1у бек біу сі1у сі1у с1у Бех с1у с1у сіу с1у бек 130 135 140 сіу б1у сб1у с1у Бек сіу сіу сіу сі1у бек біу б1у біу біу бБех 01У 145 150 155 160 сіу сб1у сб1у Бех біц Маі сіп Гец Уаі сі бек с1у с1у с1у Гец Уаї 165 170 175 біп Рго б1у Авп бБет Гец Акд Гец бехт Сув Аза Аза бет біу Рпе ТПг 180 185 190
Рпе бекг бБет Ріпе Сіу Меє бег Тгр Уаї Акд СсСіп Аїа Рго сС1у Ггув С1У 195 200 205 теп січ Ткр Уаї бек бек Іїе бек біу бек біу бБет Авр ТПхїх Іец Тук 210 215 220
Аза Авр бБет Уаі Гпув с1у Акд Ропе ТПї Іїе бБег Агд Авр Авп Аїа Гуз 225 230 235 240
ТПх ТпПт Ггец Тут Гей біп Меєс Авп бек Гей Агуд Рго б1цп Авр ТПх Аїа 245 250 255 маї Тут Тук Сув ТПтІ Іїе сіу сі1іу бБет Гец бегт Агуд бБет бБет біп 01Уу 260 265 270
ТІ гейш Уаї ТртІ Уаї бБег бек сСіу с1у сС1у с1у бек сі1у С1у сС1у С1Уу 275 280 285 бек сі1у сбі1у б1у бі1у бек біу сі1у сі1у с1у Бех с1у с1у сіу с1у бек 290 295 300 сіу сб1у сб1у с1у Бек сіу сіу сі1у с1у бек бі Уаі біп їец Уаї с1ц 305 310 315 320 бек бі1у б1у б1у пгецп Уаі1і біп Рго сіу с1у Бек Гецп Акд Гец бек Сув 325 330 335
Аза Аза бек сіу сіу ТПт РПе бет бБеїт Тут Аза Меєсє сіу Тгр Рпе Агд 340 345 350 біп Аза Ркго сі1у пув біц Агуд бі Рпе Уаі Аїа Аза Іїе бБег Тгр Агд 355 360 365
Зек біу бек ТПх Тухк Тухк Аїа Авр бБегхт Уаії Гпув с1у Акд Рпе ТПк Ше 370 375 380 зек Агд Авр Авп о бет пув Авп оТПтІ Уаі! Тут Гецп сіп Меєс Авзп бетг Гей 385 390 395 400
Атуд Ргто біц с1у ТПтІ Аїа Уаї Тут Тут Сув Аза Аза Авр Рго Агд 01Уу 405 410 415
Тук сіу Уаі А1їа Тут Уаії бек Аза Тух Тухк сбіц Тут ТЕр с1у сіп щу
420 425 430
ТПх Гец Уаїії ТПїІ Уаії бек бек б1у Аїа Аїа сбіц сбіп Гуз Гей І1е бек 435 440 445
Сі бі Авр Гїец Авп сС1у Аїа АїТа Ніз Нів Ніз Нів Нів Ніз 450 455 460 «2105 38 «2115 463 «212» Білок «213» Штучна послідовність «2205 «223» УННн-конструкт ЕО13500018 «4005 38 сі Маї сб1іп Гец Маі сіц бехт сіу с1у с1у Гей Уаі біп Рго сС1у 1У 1 5 10 15
Ззек Гей Агд Гецп бек Сув Аїа Аїа бек с1у Гей ТПтї РПпе 5ех Агкд Тук 20 ТБт Месє с1у Тер Рпе Агуд сіп Аїа Рго сС1у Пув сС1цп Акд сі Робе Уаї
Аза Аїа І1е Авп Акуд бет сіу сСіу бек ТПх Тут Тут бБет Авр бБет Уаї бо
Туз с1у Акд РпПе ТПї Іїе бек Агуд Авр Авп о бет Гув Авп ТПт Уаі1ї Тук 25 65 70 75 80 теп сіп Меє Авзп бет Гей Агд Рго бі Авр ТПтІ Аїа Уаї Тут Тут Сув 85 Зо 95
Аза Аїа Авр Агуд Агуд с1іу Акуд с1у бі Авп Тут бет їГец Гец Тут 5бег 100 105 110 30 бек Авп Агуд Тухкх біш Тухк Тгр сС1у СсС1іп с1у ТрПї Кей Уа1! ТПг Уаї 5ег 115 120 125 бек сі1у сбі1у б1у бі1у бек біу сі1у сі1у с1у Бех с1у с1у сіу с1у бек 130 135 140 сіу б1у сб1у с1у Бек сіу сіу сіу сі1у бек біу б1у біу біу бБех 01У 35 145 150 155 160 сіу сб1у сб1у Бех біц Маі сіп Гец Уаі сі бек с1у с1у с1у Гец Уаї 165 170 175 біп Рго б1у Авп бБет Гец Акд Гец бехт Сув Аза Аза бет біу Рпе ТПг 180 185 190 40 Рпе бекг бБет Ріпе Сіу Меє бег Тгр Уаї Акд СсСіп Аїа Рго сС1у Ггув С1У 195 200 205 теп січ Ткр Уаї бек бек Іїе бек біу бек біу бБет Авр ТПхїх Іец Тук 210 215 220
Аза Авр бБет Уаі Гпув с1у Акд Ропе ТПї Іїе бБег Агд Авр Авп Аїа Гуз 45 225 230 235 240
ТПх ТпПт Ггец Тут Гей біп Меєс Авп бек Гей Агуд Рго б1цп Авр ТПх Аїа 245 250 255 маї Тут Тук Сув ТПтІ Іїе сіу сі1іу бБет Гец бегт Агуд бБет бБет біп 01Уу 260 265 270 50 ТПт Гец Уаї ТПт Уаї бек бек сіу Сі1у сбі1у сіу Бек с1у сі1у С1у щу 275 280 285 бек сі1у сбі1у б1у бі1у бек біу сі1у сі1у с1у Бех с1у с1у сіу с1у бек 290 295 300 сіу сб1у сб1у с1у Бек сіу сіу сі1у с1у бек бі Уаі біп їец Уаї с1ц 55 305 310 315 320 бек бі1у б1у б1у пгецп Уаі1і біп Рго сіу с1у Бек Гецп Акд Гец бек Сув 325 330 335 уа1ї Аїа бек с1і1у Акуд ТПт РПе бет бБеїт Тут Аза Меєсє сіу Тгр Рпе Агд
340 345 350 біп Аїа Рго с1у Гув сіц Акд сі Рпбе Уаі Аза Аза Іїе бБет Аг9д 5Бег 355 360 365 сіу б1у Агуд ТПтг Тут Тут Аїа Авр бБет Уаії Гпув Сс1у Агд Ропе ТПгІ Іїє 370 375 380 зек Агд Авр Авп о бет пув Авп оТПтІ Уаі! Тут Гецп сіп Меєс Авзп бетг Гей 385 390 395 400
Атуд Ргто біц Авр ТПтІ Аїа Уаї Тут Тут Сув Азїа Азїа Авр Агуд Агд Уаї 405 410 415
Тут Бек ТПг Ггец Рго Рго ТПт ТПтг бБет Агу Тут Авп Тут Тгтр С1у сіп 420 425 430 сіу ТпПг тей Маії ТПтІ УМаії бБехт бБехт сі1у Аїа Аїа сі сбіп гув ей Ії1є 435 440 445 бек біЧ бі1ц Авр Гец Авп с1у АТїа АїТа Ніз Нів Ніз Нів Нів Ніз 450 455 460 «2105 39 «2115 461 «212» Білок «213» Штучна послідовність «2205 «223» УННн-конструкт ЕО13500021 «4005 39 сі Маї сб1іп Гец Маі сіц бехт сіу с1у с1у Гей Уаі біп Рго сС1у 1У 1 5 10 15
Ззек Гей Агд Гецп бек Сув Аїа Аїа бек с1у с1у ТПтї РПпе бек бек Тук 20 25 30
А1а Мес сС1у Тгр Рпе Агд сСіп Аза Рго сі1у ув сб1ц Акд сі Робе Уаї
Аза Аїа чІ1е Агуд Акд бет с1у Агуд Агуд ТБх Тут Тут Аза Авр бБет Уаї бо
Туз с1у Акд РпПе ТПї Іїе бек Агуд Авр Авп о бет Гув Авп ТПт Уаі1ї Тук 35 65 70 75 80 теп сіп Меє Авзп бет Гей Агд Рго бі Авр ТПтІ Аїа Уаї Тут Тут Сув 85 90 95
Аза Аїа Аза Агу Акуд Уаі Акуд бет бет ТПї Агуд Тут Авп о ТПт со1у Ток 100 105 110 40 ТЕр Тгр Тетр Сі Тук Тгр с1у сіп с1у ТПї Гец Уа1! ТПтг Уа1ї! Бек бек 115 120 125 сіу б1у сб1у с1у Бек сіу сіу сіу сі1у бек біу б1у біу біу бБех 01У 130 135 140 сіу б1у сб1у Бек сіу сіу сіу сіу бБехт сіу сбі1у б1у біу Бех б1у 1У 45 145 150 155 160 сіу сб1у бек біц Маі сіп Гец Уаі сі бек біу бі1у біу Гец Уаї сіп 165 170 175
Ркто сб1у Авп бек Ггец Агд Гей бехт Сув Аїа Аїа Бек с1у Рпе ТПк РіГе 180 185 190 50 зетк Бек РПе сіу Мес бБег Тгтр Уаі Агуд сбіп Аза Рго Сс1у Пув с1У Гец 195 200 205 біц Тер УМаї бБет бБет І1їіе бБет сіу бБет Сбіу бБет Авр ТПтІ Іец Тут А1а 210 215 220
Авр бБет Уаії Ггув сіу Акд РпПе ТПїІ І1е бек Агуд Авр АвБп Аїа Гув ТПг 55 225 230 235 240
ТпПх Гец Тут Ггец біп Меєс Авп бек Гей Агуд Рго б1ц Авр ТПх Аїа Уаї1ї 245 250 255
Тук Тут Сув ТПїІ І1е сіу сі1у Бек Пец бБегхт Агуд бБет Бех сіп с1у ТЕПк
260 265 270 теп Уаії ТПтІ Уаї бек бек бі1у біу бі1у с1у бБехт о1у с1у сі1у с1у бек 275 280 285 сіу б1у сб1у с1у Бек сіу сіу сіу сі1у бек біу б1у біу біу бБех 01У 290 295 300 сіу б1у сб1у Бек сіу сіу сіу сі1у бБехт бі Уаії біп Гец Уаї січ бег 305 310 315 320 сіу б1у сб1у Гец Маі сіп Рко сіу сіу Бек Гей Агд Гец бБет Сув А1а 325 330 335
А1а бек сСі1іу с1у ТПг Ріе бетг бБетг Тут Аїа Мес с1у Тер Рпе Агд сіп 340 345 350
Аза Ргто с1у Гув сіц Акд сі Рое Уаі Аза Аза Іїе бБет Тгр Аг9д 5ег 355 360 365 сіу бек ТПІ Тут Тут Аїа Авр бБет Уаі пуз б1іу Агд РПпПе ТПтІ І1е 5ег 370 375 380
Ат Авр Авп обБет Гув Авп ТПт Уаї! Тут Гей біп Меєс Авп бет Іец Агд 385 390 395 400
Рго бі сб1у ТПх Аїа Уаі1 Тухк Тухт Сув Азїа Аза Авр Рго Агд С1Уу Тук 405 410 415 сі1іу Ма1 А1ї1а Тук Уа1 Бек А1ї1а Туг Тук Сі Туг Тгр С1у сі1іп сС1у ТЕГ 420 425 430 теп Уаії ТПтІ Уаї бек бек б1у Аїа Аїа біп сіп пув Гецп І1е бек б1ц 435 440 445
Сіш Авр Тїец Авзп сС1у Аїа АТїа Нів Ніз Нів Ніз Нів Нівз 450 455 460 «2105 40 «2115» 456 «212» Білок
Зо «213» Штучна послідовність «2205 «223» УННн-конструкт ЕО13500026
З5 «4005 40 сі Маї сб1іп Гец Маі сіц бехт сіу с1у с1у Гей Уаі біп Рго сС1у 1У 1 5 10 15
Ззек Гей Агд Гецп бек Сув Аїа Аїа бек С1у Агуд ТПтї РПпе бек ТПк Тук 20 25 30 40 ТБт Уаї с1у Тгр Рпбе Агуд сіп Аїа Рго сС1у Пув сС1цп Акд сі Робе Уаї
Аза Аїа чІ1е Агу Агуд Акуд сіу бет бек ТПх Тут Тут бБет Авр бБет Уаї бо
Туз с1у Акд РпПе ТПї Іїе бек Агуд Авр Авп о бет Гув Авп ТПт Уаі1ї Тук 45 65 70 75 80 теп сіп Меє Авзп бет Гей Агд Рго бі Авр ТПтІ Аїа Уаї Тут Тут Сув 85 Зо 95
Аза Аза Авр ТПтІ Акуд ТПт Уаї А1їа еп Гей біп Туг Агуд Тут Авр Туг 100 105 110 50 Тер с1у сіп сбі1іу ТПї Теп Уа1! ТПг Уаії бБет бБехт сіу сіу с1і1у с1у 5Бег 115 120 125 сіу б1у сб1у с1у Бек сіу сіу сіу сі1у бек біу б1у біу біу бБех 01У 130 135 140 сіу сб1у сб1у бек с1у сіу сіу сіу бБехт сіу с1у с1у сб1у Бех біц Уаї 55 145 150 155 160 сіп Гей Маії біц бек сіу сіу с1у Гец Уаі Сбіп Рго біу Авп бБет ТІец 165 170 175
Ат9д Гей бБет Сув Аїа Аїа бет сіу Рпе ТПї Рібе бет бБет Рпе с1іу Меє
180 185 190
Ззект Тгтр Уаі Агд біп Аза Рго сіу їув с1у Гец сі Тгр Уаї бек бек 195 200 205
І1е Бек сіу бБет сіу бБет Авр ТПїх Ггецп Тут Аїа Авр бБет Уаі Гуз ЩУ 210 215 220
Атуд Рпе ТПІ Іїе 5егт Акд Авр Авп Аїа Гуз ТПтІ ТПт їец Тут Іецч сі1іп 225 230 235 240
Меє Авп обБет Гец Акуд Ркго с1іц Авр ТПї Аза Уаї Тут Тут Сув ТПт І1е 245 250 255 сі1іу сб1у бет Пец бет Агд бет бБехт біп с1у ТПг Іеец Уа1 ТПхг Уа1ї! 5ег 260 265 270 бек сі1у сбі1у б1у бі1у бек біу сі1у сі1у с1у Бех с1у сб1у сС1у 1у бек 275 280 285 сіу б1у сб1у с1у Бек сіу сіу сіу сі1у бек біу б1у біу біу бБех 01У 290 295 300 сіу сб1у сб1у Бех біц Маі сіп Гец Уаії сі бек сб1і1у с1і1у с1у Гец Уаї 305 310 315 320 біп Ргто сбі1у с1у Бек Гец Акд Гец бехт Сув Аза Аза бет сбіу с1у ТПг 325 330 335
Рпе бек бБет Тут Аїа Меє сі1у Тер Рбе Агд сСіп Аїа Ркго с1у Кув СсС1ц 340 345 350
Атуд бі Рпе Уаі Аїа Аїа І1е бБетї Тгр Агд бет біу бБет ТПтІ Тут Туг 355 360 365
Аза Авр бБет Уаі Гпув сі1у Акд РоПе ТПтІ Іїе 5бБег Агд Авр Авп бБет Гуз 370 375 380
Авп оТПт Уаї Тут Гец сіп Меє Азп беїт Гей Агуд Рго біц сіу ТПт А1а 385 390 395 400 уаї Тут Тук Сув Аїа Аза Авр Рго Агтуд Сіу Тут сіу Уаі Аїа Тут Уаї 405 410 415 бек А1ї1а Тут Тук Сіцш Тук Тгр сС1у сС1іп с1у ТрПї Кїевц Уа1! ТПг Уаї 5ег 420 425 430 бек б1у Аїа Аза біш біп Ггув Гецп І1ї1е Бек бі бі Авр Гей Авп 01У 435 440 445
А1а А1ї1а Нівз Нів Нів Нів Нів Нів 450 455 «2105 41 «2115 461 «212» Білок «213» Штучна послідовність «2205 «223» УННн-конструкт ЕО13500030 «4005 41 сі Маї сб1іп Гец Маі сіц бехт сіу с1у с1у Гей Уаі біп Рго сС1у 1У 1 5 10 15
Ззек Гей Агд Гецп бек Сув Уа1 Аїа бек С1у Агуд ТПтї РпПе бек бек Тук 20 25 30
Аїа Меє о1у Тер Рпе Агуд Ссбіп Аза Рго сіу ув біцш Агкд сіц РПпе Уаї 35 40 45
Аза Аза І1ї1е бБегт Акд бБет сіу с1у Агкд ТПх Тут Тут Аїа Авр бБет Уаї 50 55 бо
Туз с1у Акд РпПе ТПї Іїе бек Агуд Авр Авп о бет Гув Авп ТПт Уаі1ї Тук 65 70 75 80 теп сіп Меє Авзп бет Гей Агд Рго бі Авр ТПтІ Аїа Уаї Тут Тут Сув 85 90 95
Аза Аза Авр Агуд Акуд Уаї Тут бет ТПтї Гей Рго Рго ТПтІ ТПт 5бет Агд
100 105 110
Тук Авп Тут Ткр с1у біп б1у ТПх Ггец Уа1! ТПпПтІ Уаї бБехт Бех с01у щу 115 120 125 сіу сб1у бек с1у сі1у сіу сіу бБехт сіу сі1у сі1у сС1у бек бі1у б1у 1У 130 135 140 сіу бек б1у сб1у сі1у сіу бБехт сіу сі1у сі1у сСі1у Бех бі1у б1іу сб1у 1У 145 150 155 160
Ззек бі Уаі біп ге Уа1і! сій бек с1у сіу сі1у Ге Уаі с1п Рго ШУ 165 170 175
Авп бек Гец Агд Гей бБехт Сув Аїа Аїа бегт Сбіу Рпе ТПтІ РПе бетг 5бег 180 185 190
Рпе сСі1іу Ме бек Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго с1у Гув с1у Ге сі Тгр 195 200 205
Уаї бБет бБет Іїе бБет сіу бБет Сіу бБегт Авр ТПтІ Ггец Тут Аїа Авр 5ег 210 215 220 уаї пув б1у Акд РПпе ТПтІ І1е бет Агд Авр Авп Аза пувз ТПт ТПт ТІец 225 230 235 240
Тут Гец сіп Меє Азп бек Ггец Агуд Рго бій Авр ТПтІ Аїа Уа1ї Тук Тук 245 250 255
Сув ТртІ І1їе сСіу с1у бБет КГец бет Агд бет бек Сіп с1у ТПкг Іеєц Уаї1ї 260 265 270
ТПх Уаї бБет бет сіу сбі1у сб1у бі1у бек бі1у сіу с1у с1у Бех с1у щу 275 280 285 сіу сб1у бек с1у сі1у сіу сіу бБехт сіу сі1у сі1у сС1у бек бі1у б1у 1У 290 295 300 сіу бек б1у сб1у сі1у сіу бБехт сіц Уаі сСіп Гей Уаі біц бех б1у 1У 305 310 315 320 с1у їец Маії сбіп Рго сіу сіу бБет Ггец Агд Гей бегт Сув Аїа Аїа 5ег 325 330 335 сС1у Акд ТПт Робе бет Авр Тут сі1у Меє с1у Тер Рпе Агд сСіп Аї1а Рго 340 345 350 сі1у ув бій Атд сі Рпе Уаі Аїа А1їа І1е бегт Тгр бБет біу С1у Акгд 355 360 365
ТПх Тут Тут А1ї1а Авзр бек Уа1і пув б1у Агкуд Рпе ТПІ Іїе 5ег Агд Авр 370 375 380
Авпобет Гув Авп ТПтІ Уаії Тут Ггец біп Меєс Авп бетг їец Агд Рго с1ц 385 390 395 400
Авр ТПІ Аїа Уаї Тут Тут Сув Аї1а Аїа Гуз Агу Агуд б1іу Агд с1у бег 405 410 415
Уа1ї Бек Рго Авп бБет бБет бет Агуд Тут Авп Тут Тгр б1іу сіп сіу ТЕГ 420 425 430 теп Уаії ТПтІ Уаї бек бек б1у Аїа Аїа сі сіп пув їецп І1е бек б1ц 435 440 445
Сіш Авр Тїец Авзп сС1у Аїа АТїа Нів Ніз Нів Ніз Нів Нівз 450 455 460 «2105 42 «2115» 460 «212» Білок «213» Штучна послідовність «2205 «223» УНН-конструкт ЕКЕО13500032 «4005 42 сі Маї сб1іп Гец Маі сіц бехт сіу с1у с1у Гей Уаі біп Рго сС1у 1У 1 5 10 15
Ззек Гей Агд Гецп бек Сув Аїа Аїа бек С1у Агуд ТПтї РпПе бек бек Тук
20 25 30
А1їа Месє с1у Тгр Рпе Акд сіп Аїа Рго біу ув біц Акд бі Рпе Уаї 35 40 45
Аза Аза І1е ТПтІ Акуд ТБПт с1у Агуд Агуд ТБх Тут Тут Аза Авр бБет Уаї 50 55 бо
Туз с1у Акд РпПе ТПї Іїе бек Агуд Авр Авп о бет Гув Авп ТПт Уаі1ї Тук 65 70 75 80 теп сіп Меє Авзп бет Гей Агд Рго бі Авр ТПтІ Аїа Уаї Тут Тут Сув 85 Зо 95
Аза Аза Авр Агд Акуд біу Тут Тук Тук Тут Авр бек бБет РПпе Тут Авр 100 105 110
Тут Тер сі1у сіп с1у ТПїх Ггецп Уа1 ТПх Уа1і! бет Бех о1у с1у с1у щу 115 120 125 бек сі1у сбі1у б1у бі1у бек біу сі1у сі1у с1у Бех с1у с1у сіу с1у бек 130 135 140 сіу б1у сб1у с1у Бек сіу сіу сіу сі1у бек біу б1у біу біу бек б1ц 145 150 155 160 уаї б1п Гец Уаі сіц бет сіу с1у с1у Ге Уаі біп Рго б1іу Авп 5бег 165 170 175 їецп Агд їец бБег Сув Аїа Аїа бет с1у Рпе ТПтг РіПе бБетг бек Рое СсС1У 180 185 190
Меє бБег Ттр Уаі Акд сіп Аїа Ркго сСі1у гузв біу гец біц Ткгр Уаї 5ег 195 200 205
Ззек І1е Бек біу бек біу бек Авр ТПтІ Гей Тут Аїа Авр бек Уаі1ї Гуз 210 215 220 с1у Акуд Рпе ТПІ Іїе 5Бегт Акуд Авр Авп Аїа Гуз ТПтІ ТПт їец Тут ТГец 225 230 235 240 біп Месє Авп о бБет Гец Акуд Рго сі Авр ТПхї Аза Уаї Тут Тут Сув ТПг 245 250 255
І1е сі1у сС1у бБет їГец бБег Акд бБет бек Сіп с1у ТПкх Іец Уа1 ТПкг Уаї 260 265 270 бек бек біу бі1у біу біу бек б1у с1у сіу сіу бек с1у сС1у с1у -Щ1У 275 280 285 бек сі1у сбі1у б1у бі1у бек біу сі1у сі1у с1у Бех с1у с1у сіу с1у бек 290 295 300 сіу б1у сб1у с1у Бек сіц Уаі сіп Гец Уаі бій бек біу біу с1У Гец 305 310 315 320 уаї біп Рго сіу сіу бБет Ггец Акд Гец бек Сув Аїа Аїа бет с1і1у 01Уу 325 330 335
ТБІ Рре бек бБет Тук Аї1а Меє сСі1іу Тер Рпе Агд СсСіп А1ї1а Рко сС1у Гув 340 345 350 бі Агд бі Рпе Уаі Аїа Аїа І1е Агуд Агд бет Сб1у Агд Агуд ТпПхг Туг 355 360 365
Тут Аїа Авр бБет Уаі гуз б1у Агд Рпе ТПтІ Іїе 5Бет Агд Авр Авп бек 370 375 380
Туз Авп ТПт Уаї Тут Гей біп Меєс Авп бегхт Тец Агуд Рго сб1п1 Авр Ток 385 390 395 400
А1їа уаї Тут Тут Сув Аї1а Аї1а А1ї1а Агуд Агд Уаії Агуд бБет бБет ТПт Агд 405 410 415
Тут Авп ТПг Сіу ТПтї Тгр Тгр Тгр Сіц Тут Тгр б1у сіп с1у ТПк Гец 420 425 430 уаї ТПІ УМаї Бек Бех сі1у Аїа Аїа сій Сбіп Гпув Гец Іїе Бех сіц с1ц 435 440 445
Авр теп Авп сС1у Аза АТа Нів Нів Ніз Нів Ніз Нівз 450 455 460 «2105 43 «2115 462
«212» Білок «213» Штучна послідовність «2205 «223» УНН-конструкт ЕО13500033 «4005 43 сі Маї сб1іп Гец Маі сіц бехт сіу с1у с1у Гей Уаі біп Рго сС1у 1У 1 5 10 15 зет Гей Агд Пец бек Сув Уаі Аїа бБет С1іу Агд ТПт РпПе бБетг бек Туг 20 25 30
А1їа Месє с1у Тгр Рпе Акд сіп Аїа Рго біу ув біц Акд бі Рпе Уаї 35 40 45
Аза Аза І1ї1е бБегт Акд бБет сіу с1у Агкд ТПх Тут Тут Аїа Авр бБет Уаї 50 55 бо
Туз с1у Акд РпПе ТПї Іїе бек Агуд Авр Авп о бет Гув Авп ТПт Уаі1ї Тук 65 70 75 80 теп сіп Меє Авзп бет Гей Агд Рго бі Авр ТПтІ Аїа Уаї Тут Тут Сув 85 Зо 95
Аза Аза Авр Агд Акуд Уа1ї Тут бек ТПг Гей Рго Рго ТПІ ТПтг бег Агд 100 105 110
Тук Авп Тут Ткр с1у біп б1у ТПх Ггец Уа1! ТПпПтІ Уаї бБехт Бех с01у щу 115 120 125 сіу сб1у бек с1у сі1у сіу сіу бБехт сіу сі1у сі1у сС1у бек бі1у б1у 1У 130 135 140 сіу бек б1у сб1у сі1у сіу бБехт сіу сі1у сі1у сСі1у Бех бі1у б1іу сб1у 1У 145 150 155 160
Ззек бі Уаі біп ге Уа1і! сій бек с1у сіу сі1у Ге Уаі с1п Рго ШУ 165 170 175
Авп бек Гец Агд Гей бБехт Сув Аїа Аїа бегт Сбіу Рпе ТПтІ РПе бетг 5бег 180 185 190
Рпе сСі1іу Ме бек Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго с1у Гув с1у Ге сі Тгр 195 200 205
Уаї бБет бБет Іїе бБет сіу бБет Сіу бБегт Авр ТПтІ Ггец Тут Аїа Авр 5ег 210 215 220 уаї пув б1у Акд РПпе ТПтІ І1е бет Агд Авр Авп Аза пувз ТПт ТПт ТІец 225 230 235 240
Тут Гец сіп Меє Азп бек Ггец Агуд Рго бій Авр ТПтІ Аїа Уаї Тук Тук 245 250 255
Сув ТртІ І1їе сСіу с1у бБет КГец бет Агд бет бек Сіп с1у ТПкг Іеєц Уаї1ї 260 265 270
ТПх Уаї бБет бет сіу сбі1у б1у бі1у бек бі1у сіу с1у с1у Бех б1у У 275 280 285 сіу сб1у бек с1у сі1у сіу сіу бБехт сіу сі1у сі1у сС1у бек бі1у б1у 1У 290 295 300 сіу бек б1і1у сб1у сі1у сіу бБет сіц Уаі сСіп Гей Уаі сіц Бех с1у «1У 305 310 315 320 с1у їец Маії сбіп Рго сіу сіу бБет Ггец Агд Гей бегт Сув Аїа Аїа 5ег 325 330 335 сі1у бі1у ТПк РПе бег бБет Тут Аїа Меєс сіу Тгр Рпе Агд Сіп Аза Рго 340 345 350 сі1у ув бій Атд сі Рпе Уаі Аїа Аїа І1е Агу Агуд бБет Сб1у Агд Агд 355 360 365
ТПх Тут Тут Аї1а Авзр бек Уа1і пув б1у Акуд РпПе ТПІ І1е бек Агд Авр 370 375 380
Авпобет Гув Авп ТПтІ Уаії Тут Ггец біп Меєс Авп бетг їец Агд Рго с1ц 385 390 395 400
Авр ТПІ Аїа Уаї Тут Тут Сув Аї1а Аії1а Аїа Агу Агтуд Уаі Акд бет 5бег
405 410 415
ТПЕ Акуд Тут Авп ТПт біу ТБ Тгр Тгр Тгр сі Тут Ттр с1у сіп щу 420 425 430
ТПх Гец Уаїії ТПїІ Уаї бек бек бі1у Аїа Аїа сіц сіп пувз Гей Ії1е бек 435 440 445
Сі бі Авр Гїец Авп сС1у Аїа АїТа Ніз Нів Ніз Нів Нів Ніз 450 455 460 «2105 44 «2115» 456 «212» Білок «213» Штучна послідовність «2205 «223» УНН-конструкт ЕО13500039 «4005» 44 сі Маї сб1іп Гец Маі сіц бехт сіу с1у с1у Гей Уаі біп Рго сС1у 1У 1 5 10 15 зет Гей Агд Пец бек Сув Аїа Аїа бБет Сіу Агд ТПт Рпе бБет ТПк Туг 20 25 30 уаї Месє с1у ТЕр Рпе Акд сіп Аїа Рго біу ув біц Акд бі Рпе Уаї 35 40 45
Аза Аїа І1ї1е Авп Тгр бет сіу бБет Агд ТПх Тут Тут Аїа Авр бБет Уаї 50 зо бо
Туз с1у Акд РпПе ТПї Іїе бек Агуд Авр Авп о бет Гув Авп ТПт Уаі1ї Тук 65 70 75 80 теп сіп Меє Авзп бет Гей Агд Рго бі Авр ТПтІ Аїа Уаї Тут Тук Сув 85 Зо 95
Аза Аза Бек Агуд бБет бБет Тут Аїа с1у Акд ТПт Тут Туг сіц Гецч Туг 100 105 110
Авр Тут Ттр с1і1у сіп сіу ТПтї Ггец Уа1і ТПї Уаї бБегт бек сі1у сі1у с1У 115 120 125 сіу бек б1у сб1у сі1у сіу бБехт сіу сі1у сі1у сСі1у Бех бі1у б1іу сб1у 1У 130 135 140 бек сі1у сбі1у б1у бі1у бек біу сі1у сі1у с1у Бех с1у сб1у сС1у 1у бек 145 150 155 160 сі Маї сб1іп Гец Уаі сіц бехт сіу с1у с1у гей Уаі біп Рго С1Уу Авп 165 170 175 бек теп Агд Тїец бегт Сув А1їа А1їа бек сС1у Рпе ТПтї Ріе бег бек Рре 180 185 190 сіу Меєсє бБег Ттр Уаі Агду сіп Аїа Рко сі1у пув с1у гей бій Тгр Уаї 195 200 205
Зек бБет І1їе бек біу бек біу бБет Авр ТПтІ Гецп Тут Аїа Авр бек Уаї1ї 210 215 220
Туз с1у Акд РпПе ТПї Іїе бек Агуд Авр Авп Аїа Гуз ТПтї ТПКг Гец Тук 225 230 235 240 теп сіп Меє Авзп бет Гей Агд Рго біц Авр ТПтІ Аїа Уаї Тут Тук Сув 245 250 255
ТПІ І1їе сіу Сіу бек Гей Бек Агд бБет бБет біп с1іу ТПтї Гецп Уаї ТПг 260 265 270
Ууаї бБет Бех сіу сіу сіу сіу бек сіу сі1у с1у с1у Бек бі1у с1у «1У 275 280 285 сіу бек б1у сб1у сі1у сіу бБехт сіу сі1у сі1у сСі1у Бех бі1у б1іу сб1у 1У 290 295 300 бек бі1у бі1у бі1у біу бек біц Маї сбіп Ге Уаі бі бек с1у С1у щу 305 310 315 320 теп Уаії сіп Рко сіу Сіу Бек Ггец Агд Гей бет Сув Аїа Аїа Бех щу
325 330 335
Атуд ТПг Рбпе бБетг ТПтІ Тухк ТПх Уа1 сС1у Тгр Рпе Агду Ссіп Аза Рго 01Уу 340 345 350 туз січ Акд сі Рбе Уаі Аза Аза Іїе Агуд Агуд Атуд с1іу Бек бек ТПкК 355 З6о0 365
Тук Тут бБет Авр бБет Уаї гпув б1у Агд Рпе ТПтІ І1е 5еї Агд Авр Авп 370 375 380
Ззек Гуз Авп ТПх Уаі1 Тухк пе біп Месб Авп бБет Гей Агд Рго с1ц Авр 385 390 395 400
ТВІ Атїа Уаї Тухк Тук Сув Аїа А1їа Авр ТПІ Агуд ТПг Уаї А1а Іец Ієц 405 410 415 біп Тут Агуд Тут Авр Тут Тктр сі1у сіп с1у ТБПт Ггец Уаі! ТПт Уаї 5ег 420 425 430 бек б1у Аїа Аїа бі біп Гув Гей Іїе Бек сій сб1п Авр Гей Ап 01У 435 440 445
А1а А1ї1а Нівз Нів Нів Нів Нів Нів 450 455 «2105 45 «2115 463 «212» Білок «213» Штучна послідовність «2205 «223» УНН-конструкт ЕО13500046 «4005 45 сі Маї сб1іп Гец Маі сіц бехт сіу с1у с1у Гей Уаі біп Рго сС1у 1У 1 5 10 15 зет Гей Агд Пец бек Сув Аїа Аїа бБет Ссіу Гей ТПт Рпе бБег Агд Туг 20 25 30
ТПх Меє с1у Ткр Рпе Агд біп Аза Рго сб1і1у Ппув бі Агкд сі Ропе Уаї1ї
Аза Аїа І1е Авп Акуд бет сіу сСіу бек ТПх Тут Тут бБет Авр бБет Уаї 35 50 55 бо
Туз с1у Акд РпПе ТПї Іїе бек Агуд Авр Авп о бет Гув Авп ТПт Уаі1ї Тук 65 70 75 80 теп сіп Меє Авзп бет Гей Агд Рго бі Авр ТПтІ Аїа Уаї Тут Тут Сув 85 Зо 95 40 Аза Аза Авр Агд Акуд б1іу Агуд б1у бі Авп Тут бек Гей Гец Тут бБег 100 105 110 ект Авп Агд Тут бі Тух Тгр сбі1у сбіп с1у ТПтї Ге Уа1і ТПхКх Уаї1ї бек 115 120 125 бек сі1у сбі1у б1у бі1у бек біу сі1у сі1у с1у Бех с1у с1у сіу с1у бек 45 130 135 140 сіу б1у сб1у с1у Бек сіу сіу сіу сі1у бек біу б1у біу біу бБех 01У 145 150 155 160 сіу сб1у сб1у Бех біц Маі сіп Гец Уаі сі бек с1у с1у с1у Гец Уаї 165 170 175 біп Рго б1у Авп бБетг Гец Агуд Гей бек Сув Аїа Аза бБег с1у Рпе ТЕГ 180 185 190
РпПе бек бек РіПе біу Меєс бБегт Ттр Уаі Агду сіп Аїа Ркго с1у ув ШУ 195 200 205 теп січ Ткр Уаї бек бек Іїе бек біу бек біу бБет Авр ТПхїх Іец Тук 210 215 220
Аза Авр бБет Уаі Гпув с1у Акд Ропе ТПї Іїе бБег Агд Авр Авп Аїа Гуз 225 230 235 240
ТПх ТпПт Ггец Тут Гей біп Меєс Авп бек Гей Агуд Рго бій Авр ТПх Аїа
245 250 255 маї Тут Тук Сув ТПтІ Іїе сіу сі1іу бБет Гец бегт Агуд бБет бБет біп 01Уу 260 265 270
ТПх Гец Уаїії ТПтІ Уаії бек бек біу біу б1і1у сі1у Бех с01у с1у СШ1у ЩУ 275 280 285 бек сі1у сбі1у б1у бі1у бек біу сі1у сі1у с1у Бех с1у с1у сіу с1у бек 290 295 300 сіу б1у сб1у с1у Бек сіу сіу сі1у с1у бек біц Уаії біп Гец Уаї с1іц 305 310 315 320 бек с1у с1у с1у їец Уаї с1іп Рко СсСіу сС1у бек Гей Агд Гей бек Сув 325 330 335
Аза Аза бек с1і1у Акуд ТПт РПе бет бБеїт Тут Аза Меєсє сіу Тгр Рпе Агд 340 345 350 біп Аїа Рго с1у Гув сіц Акд сі Рпбе Уаі Аза Аза Іїе бет Тгр 5ег 355 360 365 сіу с1у бек ТПІ Тут Тут Аїа Авр бБет Уаії пув С1у Агд Рпе ТПг Іїє 370 375 380 зек Агд Авр Авп о бет пув Авп оТПтІ Уаі! Тут Гецп сіп Меєс Авзп бетг Гей 385 390 395 400
Агкуд Рго СсСіц Авр ТПт Аза Уаї Тут Тук Сув Аїа А1ї1а бек Рго І1е Рго 405 410 415
Тук сіу бБет Ггец Гей Агд Агуд Агуд Авп о Авп Тут Авр Тут Тгр с1у сіп 420 425 430 сіу ТпПг тей Маії ТПтІ Уаії бБехг Бех с1у Аїа Аїа сі сіп Гув Гей Ії1є 435 440 445 бек біЧ бі1ц Авр Гец Авп с1у АТїа АїТа Ніз Нів Ніз Нів Нів Ніз 450 455 460 «2105 46 зо «2115 457 «212» Білок «213» Штучна послідовність «2205 «223» УНН-конструкт Е0О13500047 «4005» 46 сі Маї сб1іп Гец Маі сіц бехт сіу с1у с1у Гей Уаі біп Рго сС1у 1У 1 5 10 15 зет Гей Агд Пец бек Сув Аїа Аїа бБет Сіу Агд ТПт Рпе бБет ТПк Туг 20 25 30
ТПх Уаї с1у Ткр Рпбе Агд біп Аза Рго сб1і1у Ппув бі Агкд сі Ропе Уаї1ї 35 40 45
Аза Аїа чІ1е Агу Агуд Акуд сіу бет бек ТПх Тут Тут бБет Авр бБет Уаї бо
Туз с1у Акд РпПе ТПї Іїе бек Агуд Авр Авп о бет Гув Авп ТПт Уаі1ї Тук 65 70 75 80 теп сіп Меє Авзп бет Гей Агд Рго бі Авр ТПтІ Аїа Уаї Тут Тук Сув 85 Зо 95 50 Аза Аза Авр ТПІ Акуд ТПт Уаї Аїа Гецп Гей біп Тугт Агд Тут Авр Туг 100 105 110
ТЕр сі1у сіп с1у ТПї Гей Уа1 ТПкх Уа1і бек бет со1у сі1у сбі1у С1уУу бек 115 120 125 сіу б1у сб1у с1у Бек сіу сіу сіу сі1у бек біу б1у біу біу бБех 01У 55 130 135 140 сіу сб1у сб1у бек с1у сіу сіу сіу бБехт сіу с1у сб1у с1у Бех сіц Уаї 145 150 155 160 сіп Гей Маії біц бек сіу сіу с1у Гец Уаі Сбіп Рго біу Авп бБет ТІец
165 170 175
Ат9д Гей бБет Сув Аїа Аїа бет сіу РПе ТПтІ РпПе бБег бБет Рпе сіу Меє 180 185 190
Ззект Тгтр Уаі Агд біп Аза Рго сіу їув с1у Гец сі Тгр Уаї бек бек 195 200 205
І1е Бек сіу бБет сіу бБет Авр ТПх Ггец Тут Аїа Авр бБет Уаі Гуз ЩУ 210 215 220
Атуд Рпе ТПІ Іїе 5егт Акд Авр Авп Аїа Гуз ТПтІ ТПт їец Тут Іецч сі1іп 225 230 235 240
Ме Авп о бет теп Агуд Рго С1ц Авр ТБг Аїа Уа1! Туг Тугк Сув ТіПг І1е 245 250 255 сіу сб1у бБет Гец бБет Акуд бБет бет біп б1у ТПт Ггец Уаі! ТПт Уаї 5ег 260 265 270 бек сі1у сбі1у б1у бі1у бек біу сбіу сі1у б1у бБехт сі1у сі1у сі1у с1у бек 275 280 285 сіу б1у сб1у с1у Бек сіу сіу сіу сі1у бек біу б1у біу біу бБех 01У 290 295 300 сіу сб1у б1у Бех біц Маі сіп Ге Уаі1і сі бек сі1у с1і1у с1у Ггец Уаї 305 310 315 320 сСіп Ркго сСі1у с1у бет Іец Агд Іїец бек Сув А1їа Аїа бек сС1у Агд ТПг 325 330 335
Рпе бек бек Тух Аїа Меє сі1у Тктр Рпе Агд біп Аза Рго сС1у гув б1ц 340 345 350
Атуд бі Рпе Уаі Аїа Аїа І1е бет Тгр бек біу біу бБет ТПт Тут Туг 355 360 365
Аза Авр бБет Уаії пув с1іу Акд Ропе ТПї Іїе бБегт Агд Авр Авп бБет Гувг 370 375 380
Авп оТПт Уаї Тут Гец сіп Меє Азп беїт Гей Агуд Рго біц Авр ТПт А1а 385 390 395 400
Ууа1ї Тук Тук Сув Аїа Аїа бет Рго І1їе Ркго Тухкх сіу Бег Гец Гец Агд 405 410 415
Ат Ат Авп о Авп Тут Авр Тут Тгр сі1у біп біу ТПт Гец Уаії ТПт Уаї 420 425 430 бек бБехт б1у Аїа Аїа сбіш сбіп Гпув Гец Іїе бек с1п с1п Авр Гей Авп 435 440 445 сС1у Азї1а АТа Нів Нів Нівз Нів Нів Ніз 450 455 «2105 47 «2115 462 «212» Білок «213» Штучна послідовність «2205 «223» УНН-конструкт ЕГЕО13500053 «4005 47 сі Маї сб1іп Гец Маі сіц бехт сіу с1у с1у Гей Уаі біп Рго сС1у 1У 1 5 10 15 зет Гей Агд Пец бек Сув Аїа Аїа бБет Сіу Агд ТПт РпПе бБетг бек Туг 20 25 30
А1їа Месє с1у Тгр Рпе Акд сіп Аїа Рго біу ув біц Акд бі Рпе Уаї 35 40 45
Аза Аїа І1їе бБет Тгр бБет сіу сСіу бек ТПх Тут Тут Аїа Авр бБет Уаї 50 55 бо
Туз с1у Акд РпПе ТПї Іїе бек Агуд Авр Авп о бет Гув Авп ТПт Уаі1ї Тук 65 70 75 80 теп сіп Меє Авзп бет Гей Агд Рго бі Авр ТПтІ Аїа Уаї Тут Тут Сув
85 Зо 95
Аза Аїа бБет Рго Іїе Рко Тут сСіу бБет Гей Гей Агуд Агд Агд Авп Авп 100 105 110
Тукх Авр Тут Тктр сі1у біп б1у ТПх Ггец Уа1! ТПптІ Уаї бБехт Бех с01у щу 115 120 125 сіу сб1у бек с1у сі1у сіу сіу бБехт сіу сі1у сі1у сС1у бек бі1у б1у 1У 130 135 140 сіу бек б1у сб1у сі1у сіу бБехт сіу сі1у сі1у сСі1у Бех бі1у б1іу б1у «1У 145 150 155 160 бек бі Уаї сСіп тец Уаї Сіц бек сіу с1у СсС1у їеец Уа1 с1п Рго с1Уу 165 170 175
Авп обет теп Агд Гец бет Сув Аї1а Аїа бек біу Рпе ТПтІ РпПе бет 5ег 180 185 190
Рпе сСі1іу Ме бек Тгр Уаі Агуд сіп Аза Рго с1у Гув с1у Ге сі Тгр 195 200 205
Уаї бБет бБет Іїе бБет сіу бБет Сіу бБегт Авр ТПтІ Ггец Тут Аїа Авр 5ег 210 215 220 уаї пув б1у Акд РПпе ТПтІ І1е бет Агд Авр Авп Аза пувз ТПт ТПт ТІец 225 230 235 240
Тут Гец сіп Меє Авп бек Гец Агд Рго біц Авр ТПтІ Аза Уа1ї Тук Туг 245 250 255
Сузв ТПїІ І1е с1у сСі1у Бек Ге бек Агуд бБет бБет біп с1і1у ТПх Гей Уаї 260 265 270
ТПх Уаї бБет бет сіу сбіу б1у біу бек біу сбіу с1у с1у Бех С1у У 275 280 285 сіу сб1у бек с1у сі1у сіу сіу бБехт сіу сі1у сі1у сС1у бек бі1у б1у 1У 290 295 300 сіу бек б1і1у сб1у сі1у сіу бБет сіц Уаі сіп Те Уаі сіц Бех с1у «1У 305 310 315 320 сС1у пе Уа1ї сіп Рго с1у сС1у бБег ІТец Агд Іїец Бех Сув Аї1а А1а 5ег 325 330 335 сіу сб1у ТПтІ РПе бБет бБет Тут Аїа Меє сС1у Тгтр Рпе Агд сіп Аїа Ркго 340 345 350 сі1у ув бій Атд сі Рпе Уаі Аїа Аїа І1е Агу Агуд бБет Сб1у Агд Агд 355 360 365
ТПх Тут Тут А1ї1а Авзр бек Уа1і пув біу Акд Рпе ТПтІ І1е 5ег Агд Авр 370 375 380
Авпобет Гув Авп ТПтІ Уаії Тут Ггец біп Меєс Авп бетг їец Агд Рго с1ц 385 390 395 400
Авр ТБПг А1їа Уа1 Туг Туг Сув Аї1а Аї1а А1ї1а Агд Агуд Уа1 Агд бБекг бег 405 410 415
ТПЕ Акуд Тут Авп ТПт біу ТБ Тгр Тгр Тгр сі Тут Ттр с1у сіп щу 420 425 430
ТПх Гец Уа1ії ТПїІ Уаї бек Бех б1іу Аїа Аїа сіц сб1іп Гуз Гей Ії1е бек 435 440 445
Сі бі Авр Гїец Авп сС1у Аїа АїТа Ніз Нів Ніз Нів Нів Ніз

Claims (17)

450 455 460 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Поліпептид, що специфічно зв'язується з І КР5 і І КРб, що містить перший імуноглобуліновий окремий варіабельний домен, вибраний із групи імуноглобулінових окремих варіабельних доменів (1)-(ІІІ), що визначаються наявністю наступних СОК-послідовностей: (І): СОовІ: титМа (- ЗЕО ІЮ МО), СОР2: АІВАНазоОТуУМАрУКа (- 5ЕО ІЮ МО г), СОВЗ: ОТАТМАП ОМАМОМ (- 5ЕО ІО МОЗ),
(у: СОВІ: БМАМО (- 5ЕО ІО МО:4), СОов2: АІВАЗаВАТУМАОБУКа (- ЗЕО ІЮО МО:5), СОВЗ: АВВУВЗЗТАУМТОа ГУМ/МЕМ (- ЗЕО ІЮ МО:6), (ПВ: СОоВІ: ВУТМа (- 5ЕО ІЮ МО:7), СОоР2: АІМАЗаСОЗГУМАрБУКа (- 5ЕО ІЮ МО 8), СОовВЗ: ОВВОВСЕММИ І У5БаВУЕМ (- ЗЕО І МО:9), їі другий імуноглобуліновий окремий варіабельний домен, вибраний із групи імуноглобулінових окремих варіабельних доменів (ІМ) ії (М) що визначаються наявністю наступних СОК- послідовностей: (ІМ): СОВІ: 5БМАМОИ (- ЗЕО ІО МО:10), СОоР2: АІЗМУЗавзТУМАОБУКа (- 5ЕО ІЮ МО: 11), СОВЗ: БРІРМаБІ І АВААМММОМ (- 5БЕО ІО МО 12), (М): СОВІ: 5БМАМОИ (- ЗЕО ІО МО:13), СОР2: АІЗМУнЗаЗТУМАрБУКа (- 5ЕО ІЮ МО: 14), СОВЗ: ОРВаМОаМАММУБАМУЕМ (- 5ЕО ІЮ МО:15).
2. Поліпептид за п. 1, який відрізняється тим, що вказаний перший імуноглобуліновий окремий варіабельний домен містить наступні послідовності СОЕБ: СОовВІ: Тита (- 5ЕО ІЮО МО), СОР2: АІВАНазоОтуУМАреУКа (- ЗЕО ІО МО:г), СОВЗ: ОТАТМАГП ОМАМОМ (- 5ЕО ІЮ МОЗ), і де вказаний другий імуноглобуліновий окремий варіабельний домен містить наступні послідовності Сов: СОВІ: 5БМАМОИ (- ЗЕО ІО МО:10), СОоР2: АІЗМУЗаазТУМАОБУКа (- 5ЕО ІЮ МО 11), СОВЗ: БРІРМаБІ І АААМММОМ (- 5БЕО 1О МО 12).
3. Поліпептид за п. 1, який відрізняється тим, що вказаний перший імуноглобуліновий окремий варіабельний домен містить наступні послідовності СОЕБ: СОВІ1: БМАМО (- 5ЕО ІО МО:4), СОв2: АІВАЗаВАТУМАрБУКа (- 5ЕО ІО МО:5), СОВЗ: АВВУВЗЗТАУМТОа ГУМ/МЕМ (- ЗЕО ІЮ МО), і де вказаний другий імуноглобуліновий окремий варіабельний домен містить наступні послідовності Сов: СОВ1: 5БМАМа (- 5ЕО ІЮО МО:13), СОР2: АІЗМУнЗаЗТУМАрБУКа (- 5ЕО ІЮ МО: 14), СОВЗ: ОРВаМОаМАММУБАМУЕМ (- 5ЕО ІЮ МО:15).
4. Поліпептид за п. 1, який відрізняється тим, що вказаний перший імуноглобуліновий окремий варіабельний домен містить наступні послідовності СОК: Сов: ВУТМа (- 5ЕО І МО:7), СОоР2: АІМАЗаСОЗГУМАреУКа (- 5ЕО ІЮ МО:8), СОЗ: ОККОСКОСЕММІ І У5ЗОКУЕМ (- ЗЕО ІЮ МО:9), і де вказаний другий імуноглобуліновий окремий варіабельний домен містить наступні послідовності Сов: СОВІ: 5БМАМОИ (- ЗЕО ІО МО:13), СОР2: АІЗМУнЗаЗТУМАрБУКа (- 5ЕО ІЮ МО: 14), СОВЗ: ОРВаМОаМАММУБАМУЕМ (- 5ЕО ІЮ МО:15).
5. Поліпептид за будь-яким з пп. 1-4, який відрізняється тим, що вказані імуноглобулінові окремі варіабельні домени є доменами МНН, переважно гуманізованими доменами УНН.
6. Поліпептид за п. 1 або п. 2, який відрізняється тим, що вказаний перший імуноглобуліновий окремий варіабельний домен має амінокислотну послідовність згідно із ЗЕО ІЮ МО:19, ї вказаний другий імуноглобуліновий окремий варіабельний домен має амінокислотну 10) послідовність згідно із ЗЕО ІЮ МО:22.
7. Поліпептид за п. 1 або п. 3, який відрізняється тим, що вказаний перший імуноглобуліновий окремий варіабельний домен має амінокислотну послідовність згідно із ЗЕО ІЮ МО:20, і вказаний другий імуноглобуліновий окремий варіабельний домен має амінокислотну послідовність згідно із ЗЕО ІЮ МО:23.
8. Поліпептид за п. 1 або п. 4, який відрізняється тим, що вказаний перший імуноглобуліновий окремий варіабельний домен має амінокислотну послідовність згідно із ЗЕО ІЮ МО:21, і вказаний другий імуноглобуліновий окремий варіабельний домен має амінокислотну послідовність згідно із ЗЕО ІЮ МО:23.
9. Поліпептид за будь-яким з пп. 1-8, який відрізняється тим, що вказані перший і другий імуноглобулінові окремі варіабельні домени ковалентно зв'язані пептидом-лінкером, де вказаний пептид-лінкер необов'язково містить третій імуноглобуліновий окремий варіабельний домен або складається з нього.
10. Поліпептид за п. 9, який відрізняється тим, що вказаний третій імуноглобуліновий окремий варіабельний домен є альбумінзв'язувальним імуноглобуліновим окремим варіабельним доменом, переважно доменом А1р11, що визначається 5ЕО ІЮО МО:24.
11. Поліпептид, вибраний із групи поліпептидів, що містять або складаються із БЗЕО ІЮ МО:25, ЗЕОІЮО МО:26 і ЗЕО ІОЮ МО:27.
12. Вектор експресії, який містить нуклеїнову кислоту, яка кодує поліпептид за будь-яким з пп. 1-
11.
13. Клітина-хазяїн, що несе вектор експресії за п. 12.
14. Спосіб виробництва поліпептиду за будь-яким з пп. 1-11, який включає етапи: культивування клітини-хазяїна за п. 13 в умовах, що роблять можливою експресію поліпептиду за будь-яким з пп. 1-11; і виділення і необов'язково очищення вказаного поліпептиду.
15. Фармацевтична композиція, що містить (І) як діючу речовину поліпептид за будь-яким з пп. 1-11 ї (1) фармацевтично прийнятний носій, а також необов'язково (Ії) розріджувач, допоміжну речовину, ад'ювант і/або стабілізатор.
16. Поліпептид за будь-яким з пп. 1-11 для застосування як лікарського засобу в способі лікування, профілактики або полегшення захворювання, розладу або стану в людини або тварини, переважно для застосування у способі (а) лікування раку, такого як рак молочної залози, рак легені, рак підшлункової залози, колоректальний рак, саркоми, рак яєчників або печінковоклітинна карцинома, або (б) лікування ідіопатичного легеневого захворювання, або (в) лікування ретинопатії, викликаної аномальною передачею сигналу УУпі.
17. Поліпептид за будь-яким з пп. 1-11 для застосування в лікуванні раку в комбінації з інгібітором імунних контрольних точок, вибраним із групи, що складається з антитіл проти РО-1, антитіл проти РО-І11, антитіл проти СТІ А4, антитіл проти ВТ А, антитіл проти | АСЗ і антитіл проти ТІМ3, або ж у комбінації із протираковою вакциною. ії з АК блокатор САМЕ 0 АННА «блокатор меж 00 АлЬбУМНО оду 0003 Альбумін тя. 0 МАНЗа блокатор ста. 000 ММЗ «блокатор ще: : Ель МНС дез: . ОН КОЛОТ ж ГУ ІНР5 г ІВРБ
Фіг.
З їх : і КАН х Е Кореляція ЕОВАРАЄВ . Н Й ї Е Кат -наосдну поМму ; СУ з Сак К КАК щ н ї 1 Ве а | поши ШЕ і їж | оо пзма не ! Н Ї Н ї кох Я ОЖ: З хх Мак З Н КОЖ: 5 Ж МАСУ ї Н й у в Н у сдх З ший г о Ваюз Я і і : В я К ще ї Ї в ік зма КО ; і | їй і а ж Лама ; ІЗ щ ї Ж ї Н ТТ жк, ї зт: : в ї Н ей : - Ї Н : Ку ОК к Ї М КУ ї Х ї ї ї 5 і Б ІЗ З і ЖЕ зо. и : ШК НИЗ ЗЕ ! ож і і Н щи Е . М іш ЕН НН Н ТЗ С; З З 1 - і Її і І ТОЖ дк 1 ж : ІЗ ши ж і е ше ще : Н і г Ї Н Н їх і ї ї т КУ їх ! ж : ще щі ж : ВЖК і У, п : і КО Я К : : як ак вка ОО жо ж я яко й і ї 5 нн Анни нн нн нн нн Мн ЗИ ї : за В ЕЗ В. Я пекжжжлуют ду ЗК В КЗ 3 В Б З. денчннкх ще іонна че І кни лижних о В хх : : ЕИХА УМ ні) В Гу
Фіг. 2 і ее КОТИК со йнй оо уд жк «ов о Я КОТУ я 5 и ТУЮ й ее КОБЮ ТОЙ вок й й з ке з щ ЗД Ж негативним 2 400» ДЕ, контроль й 200 й, а Ж зла 5-43 «вв з аж 19 іве 38 це Не попопоовоододолкпннопотвано ко дводоододвонодол топові че водо двовоооол ео по ато в оди долота капот днопогвоо дво кн нннтьнн й
Фіг. ЗА а РОТЗ5О0Б7 25005 ; «о БОз3500575 що ЩІ ЛЕ й негативний о 18005 Гуе кантроль 310004 М що ж й як я з» КІН че че за за та й М о і Щ
ФГ. З воо щи ! «а ЕОТЗБООКИ ци чи Ж ЕС ЗБООБУ5 вва С ос а Я ; Й ка див те: фа -- КОЗЗ0ОШТ2О м і ЩА е КК е 400. хв зов. че В, Яні В - й -ш-я Пен 155 1 чо ча М
Фіг. АД ща ! яко ЕФ ЗБОЮ БНЯ бен у с ка ому й сс БЯ Ж «Й ВК ЕО КИ щі х. а КК! що о. у зво» хх с. ! мая Ж Яр 1 їаме ча я м
Фіг. 45
Ор оже ВОрЄОВЕМ КН Во тк хз икеорц ех їз 5, яко РОТЗБООБУЮ ой 5 Б Б 5 ку у
Я. 5 5 зак БЕЮТТЯВ ох 3 5 ЧЕ ве то вв й «ве ЗДЕВТ ж ДВЗ р Не Вк З буки ди нок г т шк НН У НЯ с Ся щі їх в 5 у ві ша я з АН Бк 5 В ві дадтив ни ї М вд» У - в Ж й «в: Базова пнів й З фр ютюфеюю фе я ОО о нн НЕ З ші сш: ВИ І І: ВИЗ і КЗ З ВМ
Фіг. ЗА ї | й в адже ж -- Куб НЕ жАКНО В Яни ОМ Ж сур, сукідкк хо ШІ КІ Кк схіже ЯК: ї ов «ве МОВИ ВЕ БАСА БЮ Ще | їі Ух, Я й ОО ек ке ве Я Щех зх хуй тд хан тео ХХ й І ВЕ і ж хан БЕН в ДАНУ ОВУ у фо З | фо схем оф од Краяни» ах чита хо в: ЗааОва пін я дув іони нн нн: зи з зи М КЕ: й З КЗ З М Фіг, з я КЗ ї ши а КОТОВ І Ж Кк ни м аа вн ин ся ОК ге З не У меж кадвнчих її в -ае У чАНОВ КошА в ще: жов щеня Ж ех у еф ох і СВ фо а . Ж - а з «яке Базова лін г: рост фе югежіф кою сне ях я НУ Й це й В ке то: 1 ще ЩЕ Ехо НЕ М фіг. 5 що РА-ТО-Вов85 РА Фо шин ВН : В Б ш ЗЕ : В ї В звінях Х В ха і С щ пух в 5 К ху УК стук йкУ ших в ку А ВОНО кА ее а КІНО щу - й с ше є ШИ у ее я ооо М МНЕ
Фіг. БА ВА-ТЮ-ВОВЯ5 КЕ ЗО в пк ; м хи ' о осн : Ж Б й т шк : кавтВеть це су к ши ку жду ок і пз ах контроль ОЖІБОО571 0 ОХ «кн лк оо Ком ноооо ооо оооооооооооюююоооооооооосоооооооооосссссооооооооососо осо оооооооооооооооооооосооссссе:
Фіг. 5
РА-тТОВВАВ5 З т М не ш те по ь І -е КЕ Б е й в Е ЕІ З г. з ее Ко х ее КОТУ с ЩО у | ще ї у З 80 Е - е контроль Кеш за зо чо 1 концентрація МІ
Фіг. С тА зош "| оч пд. т ч є КО13Б500573 ще Е з ) Кі х. с во Я ша ВОЗ Я Ке г КОНТроль в 105 105 концентрація (М
Фіг. 60 пнеінен Комтропь вжи ТО МОЖЕ сф Пон й ВІ я ладу ше а Й й се нин В вн у й х : 4 З ї й ЕК; а ЧУ - в З ; помнннвннннннн песен итттттетаттупттт тних й шня У : шк и Кк Я ше й КЗ суб : шк Я Сай те З ня ше сн нні пхнтянжхчтюючтх тенти ха : Е й т ОнККухухх Й й й БЕК нн, п В Н Й Ше сей, сх Ши чи фс» «Й. Й і шо о а й День Б В ЕЕ їх
Фон. ТА Гоа КОНТРОЛЬ шля 00оейрах 1 МЕЖ Шк. ше А Я м : мух ; ві Е УМ жен ЩО ВИК й Е о ЖЖ і. | а я : ях ок Ж дя Ж
БЮ. шщ- й: шин - : ово ЗИ і «ее Гу : в. шини р НЯ з | й - Ше ЩО сур ка ще (о; : ких : Й Ше т З. о рин свй - пн о шо, ЩІ о 2 а ДЦень б й 16 12
Фіг. 7 що он КОНТОМЬ : Я пк -- 1000 фен фон ння М, : З ШИ Й й з 400 зей т 0 в 18 15 20 Лень
Фіг. 76 8 144 ЕО13500571 а 145 ше Ше мех ява ж іже ЕЕ Ж жа ВИН пн КЕ: в я я 3 ППИЛИИИИИМИКИМИО й Я пли ан ЕЕ 1 В 1 скщрене на й хх ВЕ -е її ши: щ щ щ Е с Х ї
Фіг. ЗА е 14 ЕО13500720 шщ - ЕТ лк не ще К ! Б й й ЕЕ не Е: вв. ; | с о і й її т З я ПОДИВ ИвН ПИШИ, й в аа в (щі оо ЩЕ с аз. ВИМ ше : Ж ов--МИНН...МИНИЙ. лиш... МИШИМИ... - - « о
Фіг. 8 т . хе ше г ев й тах ва» - т | Я і и щИ а б и ян Кок 08 ЕЕ Фо ВЗ Е ; дна - я. ж Інбування « - 18
Фіг. ЗАД з хв» КЕ же З Й и ЩО Ї й ж шо СК. ве 08 . зи З во Ве ж Г КЗ: Я УУ ї Мо Ж що щ Шов ж 03 ; в Мпа - Ж Я інгібування - - | КВе/В нг. ЗВ
UAA201807120A 2015-12-04 2016-12-02 Поліпептид, що специфічно зв'язується з lrp5 і lrp6 UA122079C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP15197999 2015-12-04
PCT/EP2016/079575 WO2017093478A1 (en) 2015-12-04 2016-12-02 Biparatopic polypeptides antagonizing wnt signaling in tumor cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA122079C2 true UA122079C2 (uk) 2020-09-10

Family

ID=54782606

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201807120A UA122079C2 (uk) 2015-12-04 2016-12-02 Поліпептид, що специфічно зв'язується з lrp5 і lrp6

Country Status (34)

Country Link
US (2) US10597449B2 (uk)
EP (2) EP3797790A1 (uk)
JP (2) JP6728355B2 (uk)
KR (1) KR20180081825A (uk)
CN (1) CN108289943B (uk)
AR (1) AR106949A1 (uk)
AU (1) AU2016363787B2 (uk)
BR (1) BR112018010537A2 (uk)
CA (1) CA3006235A1 (uk)
CL (1) CL2018001384A1 (uk)
CO (1) CO2018005680A2 (uk)
CY (1) CY1123454T1 (uk)
DK (1) DK3383425T3 (uk)
EA (1) EA201891331A1 (uk)
ES (1) ES2821099T3 (uk)
HK (1) HK1255725A1 (uk)
HR (1) HRP20201528T1 (uk)
HU (1) HUE051777T2 (uk)
IL (1) IL259119B (uk)
LT (1) LT3383425T (uk)
MA (2) MA54648A (uk)
MX (1) MX2018006760A (uk)
MY (1) MY200933A (uk)
PE (1) PE20181515A1 (uk)
PH (1) PH12018501155A1 (uk)
PL (1) PL3383425T3 (uk)
PT (1) PT3383425T (uk)
RS (1) RS60823B1 (uk)
SA (1) SA518391728B1 (uk)
SG (1) SG11201804510PA (uk)
SI (1) SI3383425T1 (uk)
TW (1) TWI734719B (uk)
UA (1) UA122079C2 (uk)
WO (1) WO2017093478A1 (uk)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104302782A (zh) 2012-02-28 2015-01-21 诺华股份有限公司 利用rnf43突变状态选择wnt信号转导抑制剂给药的癌症患者
KR102317574B1 (ko) 2015-11-18 2021-10-26 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 Pd1 및/또는 lag3 결합제
SI3383425T1 (sl) * 2015-12-04 2020-11-30 Boehringer Ingelheim International Gmbh Biparatopični polipeptidi, ki antagonizirajo WNT-signaliziranje v tumorskih celicah
TWI794171B (zh) 2016-05-11 2023-03-01 美商滬亞生物國際有限公司 Ｈｄａｃ抑制劑與ｐｄ-ｌ１抑制劑之組合治療
TWI808055B (zh) 2016-05-11 2023-07-11 美商滬亞生物國際有限公司 Hdac 抑制劑與 pd-1 抑制劑之組合治療
MY200744A (en) * 2017-05-31 2024-01-13 Boehringer Ingelheim Int Gmbh Polypeptides antagonizing wnt signaling in tumor cells
WO2019032628A1 (en) 2017-08-07 2019-02-14 The Regents Of The University Of California GENERATING PLATFORM FOR SAFE CELLULAR THERAPEUTIC AGENTS
WO2019108806A1 (en) * 2017-11-29 2019-06-06 Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions and methods for cancer therapy
WO2020080941A1 (en) * 2018-10-16 2020-04-23 Umc Utrecht Holding B.V. Anti- low-density lipoprotein receptor-related protein 5/6 antibodies
WO2020200998A1 (en) 2019-03-29 2020-10-08 Boehringer Ingelheim International Gmbh Anticancer combination therapy
JP2022527097A (ja) 2019-03-29 2022-05-30 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 抗ガン併用療法
WO2020227071A1 (en) 2019-05-04 2020-11-12 Inhibrx, Inc. Cd123-binding polypeptides and uses thereof
AU2020267559A1 (en) * 2019-05-08 2022-01-06 2Seventy Bio, Inc. CD123 targeted immunotherapies
CA3147827A1 (en) * 2019-08-14 2021-02-18 Modmab Therapeutics Inc. Antibodies that bind to lrp5 proteins and methods of use
US20220281969A1 (en) * 2019-08-14 2022-09-08 Modmab Therapeutics Inc. Antibodies that bind to lrp6 proteins and methods of use
CN112794914B (zh) * 2019-11-14 2022-09-16 深圳华大生命科学研究院 一种基于噬菌体展示技术开发的alk纳米抗体及其应用
WO2021163490A1 (en) * 2020-02-14 2021-08-19 University Of Washington Targeted depletion of bacteria from mixed populations through programmable cell-cell adhesion
EP4314075A2 (en) * 2021-03-24 2024-02-07 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for cd3
WO2023286854A1 (ja) * 2021-07-16 2023-01-19 ブライトパス・バイオ株式会社 抗Ｔｉｍ－３抗原抗体または抗体誘導体およびその用途
CN116375851B (zh) * 2023-03-03 2024-03-22 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种抗禽流感病毒np蛋白的纳米抗体及其制备方法与应用

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK1087013T3 (da) 1992-08-21 2009-05-11 Univ Bruxelles Immunoglobuliner uden lette kæder
EP0739981A1 (en) 1995-04-25 1996-10-30 Vrije Universiteit Brussel Variable fragments of immunoglobulins - use for therapeutic or veterinary purposes
US6329516B1 (en) 1997-04-28 2001-12-11 Fmc Corporation Lepidopteran GABA-gated chloride channels
US6528054B1 (en) 1998-12-28 2003-03-04 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of breast cancer
CA2405709A1 (en) 2000-04-12 2001-10-25 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
EP1399484B1 (en) 2001-06-28 2010-08-11 Domantis Limited Dual-specific ligand and its use
AU2002364587A1 (en) 2001-12-21 2003-07-30 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
EP2267032A3 (en) 2002-11-08 2011-11-09 Ablynx N.V. Method of administering therapeutic polypeptides, and polypeptides therefor
AU2005293752A1 (en) 2004-10-13 2006-04-20 Ablynx N.V. Single domain camelide anti-amyloid beta antibodies and polypeptides comprising the same for the treatment and diagnosis of degenarative neural diseases such as Alzheimer's disease
EP1888640B1 (en) 2005-05-18 2012-03-14 Ablynx N.V. Improved nanobodies against tumor necrosis factor-alpha
WO2007140410A2 (en) * 2006-05-30 2007-12-06 Van Andel Research Institute Low-density lipoprotein receptor 6 (lrp6) as a mammary stem cell marker and related methods
EP2022995B1 (en) 2006-06-08 2013-02-20 NSK Ltd. Shell needle bearing with seal ring and its manufacturing method
WO2008020079A1 (en) 2006-08-18 2008-02-21 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against il-6r and polypeptides comprising the same for the treatment of deseases and disorders associated with il-6-mediated signalling
CN100428934C (zh) 2006-09-07 2008-10-29 中国人民解放军第二军医大学 香豆素类化合物在制备诱导神经干细胞定向分化药物中的应用
JP2010502208A (ja) 2006-09-08 2010-01-28 アブリンクス エン．ヴェー． 半減期の長い血清アルブミン結合タンパク質
JP2010511397A (ja) 2006-12-05 2010-04-15 アブリンクス エン．ヴェー． 血清タンパク質と結合可能なペプチド
EP2209491B1 (en) 2007-11-02 2015-10-28 Novartis AG Molecules and methods for modulating low-density-lipoprotein receptor-related protein 6 (lrp6)
US20110091462A1 (en) 2008-03-05 2011-04-21 Ablynx N.V. Novel antigen binding dimer-complexes, methods of making and uses thereof
AU2009237662A1 (en) 2008-04-17 2009-10-22 Ablynx N.V. Peptides capable of binding to serum proteins and compounds, constructs and polypeptides comprising the same
WO2010127216A2 (en) 2009-05-01 2010-11-04 Telcodia Technologies, Inc. Automated determination of quasi-identifiers using program analysis
US8276148B2 (en) 2009-12-04 2012-09-25 International Business Machines Corporation Continuous optimization of archive management scheduling by use of integrated content-resource analytic model
KR101721187B1 (ko) 2009-12-23 2017-03-29 에스바테크 - 어 노바티스 컴파니 엘엘씨 면역원성의 감소 방법
JP2013518853A (ja) 2010-02-05 2013-05-23 アブリンクス エン．ヴェー． 血清アルブミンと結合することが可能なペプチド並びにこれを含む化合物、構築物及びポリペプチド
PE20130527A1 (es) 2010-03-03 2013-05-09 Boehringer Ingelheim Int Polipeptidos de union a a-beta biparatopicos
BR112012022044A2 (pt) * 2010-03-24 2020-08-25 Genentech Inc ''anticorpo,imunoconjugado,formulação farmacêutica,uso do anticorpo,método de tratamento,anticorpo biespecifico isolado e célula hospedeira''.
EP4234698A3 (en) 2010-05-06 2023-11-08 Novartis AG Compositions and methods of use for therapeutic low density lipoprotein-related protein 6 (lrp6) antibodies
BR112012028326A2 (pt) * 2010-05-06 2017-03-21 Novartis Ag anticorpo multivalente isolado, anticorpos biparatópicos isolados, ácido nucleico, vetor, composição farmacêutica, método de obtenção dos referidos anticorpos, bem como uso do dos mesmos
US9527925B2 (en) 2011-04-01 2016-12-27 Boehringer Ingelheim International Gmbh Bispecific binding molecules binding to VEGF and ANG2
US8790650B2 (en) * 2011-04-28 2014-07-29 Vanderbilt University Methods of using an antibody to inhibit WNT-mediated cardiac remodeling
US20180009888A9 (en) 2011-06-23 2018-01-11 Ablynx N.V. Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains
TW201321405A (zh) 2011-08-17 2013-06-01 Glaxo Group Ltd 經修飾之蛋白質及肽
EP3252075A1 (en) 2011-11-04 2017-12-06 Novartis AG Low density lipoprotein-related protein 6 (lrp6) - half life extender constructs
JP5949270B2 (ja) 2012-07-24 2016-07-06 富士通株式会社 オーディオ復号装置、オーディオ復号方法、オーディオ復号用コンピュータプログラム
WO2014029752A1 (en) * 2012-08-22 2014-02-27 Glaxo Group Limited Anti lrp6 antibodies
SI3383425T1 (sl) * 2015-12-04 2020-11-30 Boehringer Ingelheim International Gmbh Biparatopični polipeptidi, ki antagonizirajo WNT-signaliziranje v tumorskih celicah

Also Published As

Publication number Publication date
US11952418B2 (en) 2024-04-09
PH12018501155A1 (en) 2019-01-28
MA43368A (fr) 2018-10-10
CN108289943A (zh) 2018-07-17
EP3797790A1 (en) 2021-03-31
EP3383425B1 (en) 2020-07-15
DK3383425T3 (da) 2020-09-28
EP3383425A1 (en) 2018-10-10
KR20180081825A (ko) 2018-07-17
PT3383425T (pt) 2020-10-07
CN108289943B (zh) 2023-06-20
US20170174762A1 (en) 2017-06-22
US20200199222A1 (en) 2020-06-25
SI3383425T1 (sl) 2020-11-30
CA3006235A1 (en) 2017-06-08
TWI734719B (zh) 2021-08-01
RS60823B1 (sr) 2020-10-30
PE20181515A1 (es) 2018-09-21
AU2016363787A1 (en) 2018-05-17
MX2018006760A (es) 2018-08-01
CY1123454T1 (el) 2022-03-24
PL3383425T3 (pl) 2021-01-11
JP6728355B2 (ja) 2020-07-22
CO2018005680A2 (es) 2018-06-12
CL2018001384A1 (es) 2018-09-14
HK1255725A1 (zh) 2019-08-23
IL259119B (en) 2022-04-01
MY200933A (en) 2024-01-24
MA54648A (fr) 2021-11-10
US10597449B2 (en) 2020-03-24
HRP20201528T1 (hr) 2020-12-11
IL259119A (en) 2018-06-28
LT3383425T (lt) 2020-10-12
SA518391728B1 (ar) 2022-03-28
HUE051777T2 (hu) 2021-03-29
SG11201804510PA (en) 2018-06-28
TW201731868A (zh) 2017-09-16
WO2017093478A1 (en) 2017-06-08
JP2020178701A (ja) 2020-11-05
EA201891331A1 (ru) 2018-12-28
MA43368B1 (fr) 2020-09-30
BR112018010537A2 (pt) 2018-11-13
AU2016363787B2 (en) 2023-02-02
JP2019506841A (ja) 2019-03-14
ES2821099T3 (es) 2021-04-23
AR106949A1 (es) 2018-03-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA122079C2 (uk) Поліпептид, що специфічно зв'язується з lrp5 і lrp6
UA125761C2 (uk) Поліпептид, який перешкоджає передачі wnt-сигналів у пухлинних клітинах
UA124631C2 (uk) Антитіло до pd-1
UA127200C2 (uk) Молекула антитіла до pd1
EP3027204A1 (en) Multipartite signaling proteins and uses thereof
EA019595B1 (ru) СПЕЦИФИЧНЫЕ ИНГИБИТОРЫ PDGFRβ
UA112050C2 (uk) Терапевтична композиція, що містить моноклональне антитіло проти інгібітора шляху тканинного фактора (tfpi)
CN112384527B (zh) Wnt信号传递激动剂分子
KR20210122274A (ko) Ccl21을 인코딩하는 재조합 랍도바이러스
CN112041336A (zh) 针对mospd2和t细胞或nk细胞特异性分子的双特异性抗体
EA040170B1 (ru) БИПАРАТОПНЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ-АНТАГОНИСТЫ ПЕРЕДАЧИ СИГНАЛА Wnt В ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ
EP3904383A1 (en) Anti-ox40 monoclonal antibody and application thereof
KR20240040068A (ko) 메조텔린을 특이적으로 표적화하는 조작된 면역 세포 및 이의 용도