UA125761C2 - Поліпептид, який перешкоджає передачі wnt-сигналів у пухлинних клітинах - Google Patents

Поліпептид, який перешкоджає передачі wnt-сигналів у пухлинних клітинах Download PDF

Info

Publication number
UA125761C2
UA125761C2 UAA201911920A UAA201911920A UA125761C2 UA 125761 C2 UA125761 C2 UA 125761C2 UA A201911920 A UAA201911920 A UA A201911920A UA A201911920 A UAA201911920 A UA A201911920A UA 125761 C2 UA125761 C2 UA 125761C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
izmo
binding
zeo
sequence
biu
Prior art date
Application number
UAA201911920A
Other languages
English (en)
Inventor
Вітторіа Цінцалла
Витториа Цинцалла
Клаус-Петер Кюнкеле
Марі-Анж Бьойсе
Мари-Анж Бьойсе
Карен Кромі
Карен Кроми
Стефані Сталенс
Стефани СТАЛЕНС
Беатрейс Стрюббе
Original Assignee
Бьорінгер Інгельхайм Інтернаціональ Гмбх
Бёрингер Ингельхайм Интернациональ Гмбх
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Бьорінгер Інгельхайм Інтернаціональ Гмбх, Бёрингер Ингельхайм Интернациональ Гмбх filed Critical Бьорінгер Інгельхайм Інтернаціональ Гмбх
Publication of UA125761C2 publication Critical patent/UA125761C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D519/00—Heterocyclic compounds containing more than one system of two or more relevant hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system not provided for in groups C07D453/00 or C07D455/00
    • C07D519/04—Dimeric indole alkaloids, e.g. vincaleucoblastine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Винахід стосується поліпептиду, який зв'язується з білком 5, спорідненим до білків сімейства рецептора ліпопротеїнів низької щільності (LRP5) та способу лікування злоякісних новоутворень. - 110 - - 100 - 12-0422-EP-1 - 1 -

Description

Винахід стосується поліпептиду, який зв'язується з білком 5, спорідненим до білків сімейства рецептора ліпопротеїнів низької щільності (ІКР5) та способу лікування злоякісних новоутворень.
ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ, ДО ЯКОЇ НАЛЕЖИТЬ ВИНАХІД
Даний винахід стосується нових поліпептидів, що зв'язують білок 5, споріднений до білків сімейства рецептора ліпопротеїнів низької щільності (КРБ). Винахід також стосується нуклеїнових кислот, що кодують такі поліпептиди; способів одержання таких поліпептидів; клітин-хазяїнів, що експресують або здатні експресувати такі поліпептиди; композицій, що містять такі поліпептиди; і застосувань таких поліпептидів або таких композицій, особливо для терапевтичних цілей в галузі онкологічних захворювань.
ПЕРЕДУМОВИ СТВОРЕННЯ ВИНАХОДУ
Активація сигнального шляху МУУпі вимагає зв'язування позаклітинних УУпі-лігандів з рецептором Нгіг27Ієй і корецептором І КРБ (номер доступу: ОпіРгоїєКкВ-075197Л КР5 НОМАМ). У клітинах ссавців існує 19 білків МуУпі і 10 рецепторів Ргі27/ей. За відсутності М/пі-ліганду цитоплазматичний бета-катенін фосфорилується білковим комплексом, що складається із каркасних білків Ахіп і АРС, а також кіназ 55К3-бета й СК1а. Наступне розпізнавання бета-
ТісР-убіквітин-лігазою приводить до Уубіквітин-опосередкованої деградації бета-катеніну. У присутності МУУпі-ліганду зв'язування МУУпі з Ргіллей і ГКР5 приводить до залучення цитоплазматичного ефекторного білка ЮОмі і фосфорилування цитоплазматичного хвоста І КРБ, що забезпечує сайт для приєднання Ахіп. Секвестрація Ахіп за допомогою І КР5 приводить до інактивації комплексу Ахіп-АРС-С245КЗ-бета, а отже, до стабілізації й нагромадження внутрішньоклітинного бета-катеніну. Таким чином, рівень бета-катеніну в цитоплазмі росте, і бета-катенін переміщається до ядра, утворюючи комплекси із членами сімейства факторів транскрипції Т-клітинного фактора (ТСЕ)/Фактора, що зв'язується з лімфоїдним енхансером (ЕР). Потім залучаються механізм базальної транскрипції й транскрипційні коактиватори, включаючи білок (СКЕВ-ріпаїпд ргоївіп, СВР), який зв'язується з білком, що зв'язуються із цамф- чутливим елементом (САМР гезропзе еІетепі-бріпаїпо ргоївіп, СРЕВ), або його гомолог р3о00, що приводить до експресії різних цільових генів, включаючи Ахіп2, циклін 01 і с Мус.
Додатковий рівень ліганд-залежної регуляції шляху М/пі опосередкований ЕЗ-лігазою ЕМЕ43 і її близькоспорідненим гомологом 2МКЕЗ, а також секретованими білками К-спондинами (де
І ам та ін. "Пе В-5ропаїп/І дг5/Апі43 тоацшіе: гедшайг ої М/пі відпа! вігтепдій". Сепев Овєм. 2014; 28 (4):305-16). КМЕ43 є посередником в убіквітинуванні рецепторного комплексу Егіг7Іеал КРБ на
Зо клітинній поверхні, приводячи до його деградації й у такий спосіб пригнічуючи ліганд-залежну активність шляху М/пі. Активності КМЕ43З протидіють члени сімейства К-спондинів (В-спондинові ліганди 1-4). При наявності К-спондинового ліганду він усуває КМЕ43 із клітинної поверхні, роблячи можливим нагромадження комплексу НЕгіг7Ієа/л КРБ і посилення МУпі-передачі сигналів в присутності М/пі-лігандів.
ЇКР5 діє як воротар ліганд-залежної активації сигнального шляху МУпі і, отже, можуть вважатися мішенями для досягнення повної блокади шляху, опосередковуваного всіма 19-ма лігандами МУпі і 10-ма рецепторами Егі277ей, а також посилюваного К-спондиновими лігандами.
Зокрема, УУпі-ліганди можна розділити на класи МУпи!ї і МУпіЗа, кожний з яких для передачі сигналу зв'язується з різними епітопами/ділянками І КР5. Позаклітинний домен І КРБ містить чотири повторювані бета-пропелерних елементи, зв'язані з ЕСЕ-подібним доменом, за якими ідуть три ОЇ К-повтори типу А. Комбінування структурного й функціонального аналізу ГЕРБ вказує на те, що МУпи (ліганд класу М/пі/1) зв'язується із фрагментом І КРб, який містить бета- пропелери 1 і 2, а М/піЗа зв'язується із фрагментом, який містить бета-пропелери З і 4.
КРБ і агенти, що перешкоджають активності КРБ, були описані в контексті різних показань, включаючи ураження кісток, ліпід-модульовані порушення, хворобу Альцгеймера, ревматоїдний артрит і інсулінозалежний діабет (див., наприклад, УМО 2002/092015, УМО 2006/102070, МО 2009/155055 ії ММО 1998/046743).
Гіперактивація сигнального шляху УМУпі додатково залучена в патогенез різних типів раку.
При деяких типах раку часті мутації в молекулах низхідних сигнальних шляхів сприяють конститутивній активації шляху М/пі (напр., мутації АРС при колоректальному раку; активуюча бета-катенін мутація при печінковоклітинній карциномі). Навпаки, при тричі негативному раку молочної залози (ТНРМ3З), недрібноклітинному раку легень (НДКРЛ), аденокарциномі підшлункової, а також підмножині колоректальних раків (КРР) і ендометріальних раків активація сигнального шляху МУпі приводиться в дію ліганд-залежним механізмом (тобто, аутокринною/паракринною активацією МУпО, що виявляються за внутрішньоклітинним нагромадженням бета-катеніну. При НДКРЛ, ТНРМ3З ії аденокарциномі підшлункової ліганд- залежна активація МУпі опосередкована безліччю механізмів, включаючи підвищену експресію
МУпі-лігандів та/або рецепторів І КР5, або ж сайленсинг негативного регулятора І КР5 - ОККІ1 (ТНРМ3У: Кпгатізом та ін. "М/п/реїа-саїепіп раїйпулау асіїмайоп іб5 епгіспей іп Базаї!-ІпКе Бгеаві 60 сапсеї5 апа ргедісіє роог ошісоте". Ат У Раїпої. 2010; 176 (6): 2911-20; НДКРЛ: Маказпіта та ін.
"Мп омегехргезвіоп аззосіаївд мйп їштог ргоїїїтегайноп апа а роог ргодповів іп поп-зтаї! сеї! їшпд сапсег раїепіб". Опсо! Вер. 2008; 19 (1)203-9; Рак підшлункової: 7папуд та ін. "Сапопісаї зідпаїїпу М/пі із гедцігей г рапсгеаїйс сагсіподепевів". Сапсег Вев5. 2013; 73 (15):4909-22). Було показано, що ліганд-залежна активація М/пі у пухлинах стимулює ріст пухлини і її резистентність до хіміотерапії або імунотерапії, а також зв'язана з рецидивами в доклінічних моделях.
З рівня техніки відомі деякі молекули, що зв'язують І КР5 і здатні модулювати сигнальний шлях М/пг:
ОБіскКорі-14 (ОККІ) представляє собою інгібітор ГКР5У. ОККІ! зв'язується з ІКР5 і трансмембранним білком Кгетеп, пригнічує передачу сигналів МУпі і приводить до швидкої інтерналізації ГКР. Було показано, що ОККІ1 пригнічує як Уупи1-, так і М/піЗа-опосередковану передачу сигналу.
Також було показано, що лікування ОКК'І іп мімо приводить до серйозних токсичних реакцій шлунково-кишкового тракту. Зокрема, було показано, що опосередкована аденовірусом експресія ОККІ у дорослих мишей помітно інгібувала проліферацію в тонкому й товстому кишечнику, що супроводжувалося прогресуючою дегенерацією його архітектури, великою втратою ваги тіла й смертністю від коліту й генералізованої інфекції. Зокрема, І КРБ експресується в проліферуючих епітеліальних клітинах тонкого кишечнику й необхідний для проліферації кишкового епітелію, що наводить на припущення, що інгібування І КР5 може бути токсичним для цієї й інших нормальних тканин (Попа та ін. "І "р5 апа І "рб ріау сотрепзаюгу гоЇїез5 іп тоиве іпіевіїпа! демеіортепі". ) Се! Віоспет. 2012; 113 (1):31-8). Тому виникають сумніви в тому, що інгібітори ГЕРБ або взагалі які-небудь інгібітори сигнального шляху МУпі (МУПИ і МуУпіЗа) можуть бути використані в терапевтичних цілях, напр., можуть піти в розробку як засоби проти раку.
В УМО 1998/046743 А1 описане антитіло, специфічне до І КРБ, і передбачаються декілька
І КР5 пептидів для підвищення такого антитіла. Проте, не було описано експериментальних результатів, що стосуються створення такого антитіла, також не було специфічно описано такого антитіла.
В 05 9175090 описані способи інгібування передачі сигналів МУпі у раковій клітині з дефектною експресією Арс шляхом введення моноклонального антитіла, специфічно дм антитіла, яке зв'язує І КРБ.
В УМО 2013/109819 описані анти-ЇКР5 антитіла, особливо антитіла, що потенціюють активність та/лїабо передачу сигналів Моггіп/Р7244, і їх застосування для лікування станів, зв'язаних з ангіогенезом.
Проте, жодна з описаних у рівні техніки ГКР5-зв'язувальних молекул поки що не була допущена органами охорони здоров'я до застосування як лікарський засіб для лікування якої- небудь хвороби. Говорячи конкретніше, подібне застосування вимагає дуже особливих зв'язувальних властивостей, правильної специфічності, щоб такі молекули не зв'язували, не активували або не інгібували інші мішені (напр., приводячи до небажаної активації або інгібування інших сигнальних шляхів, або ж недостатньої активації або інгібування стосовно цільових ізоформам), у випадку бі- або мультиспецифічних агентів - належної збалансованості двох або більше специфічностей зв'язування, належних фармакокінетичних (рі фармакодинамічних властивостей, прийнятного токсикологічного профілю й, звичайно ж, ефективності іп мімо.
Враховуючи вищевикладене, існує потреба в нових терапевтичних агентах, що дозволяють ефективно лікувати різні типи ракових захворювань і пухлин. Таким чином, задачею винаходу є надання подібних фармакологічно активних агентів, які можуть використовуватися в лікуванні багатьох ракових захворювань, включаючи НДКРЛ і ТНРМ3.
Зокрема, задачею винаходу є надання подібних фармакологічно активних агентів, композицій та/або способів лікування, які мають певні переваги в порівнянні з використовуваними та/або відомими з рівня техніки на даний момент агентами, композиціями та/або способами. Ці переваги включають ефективність іп мімо, поліпшені терапевтичні й фармакологічні властивості, менша кількість побічних ефектів, а також інші сприятливі властивості, такі як спрощене виготовлення або знижена вартість товарів, особливо в порівнянні із уже відомими потенційними лікарськими препаратами.
КОРОТКИЙ ВИКЛАД СУТІ ВИНАХОДУ
Відповідно до першого аспекту винаходу даний винахід забезпечує поліпептид, який зв'язується з білком 5, спорідненим до білків сімейства рецептора ліпопротеїнів низької щільності (І КРБ), де поліпептид містить одиночний варіабельний домен імуноглобуліну (ІЗМО), вибраний із групи, яка включає наступні І КР5-зв'язувальні ІЗМО (І) - (ІМ): бо (І) ІЗМО з наступними послідовностями ділянки, що визначає комплементарність (СОК):
СОоВІ: ТМУМа (5ЕО І МО 1)
СОоР2: АІМуУЗа,ЗТУМАОБУКа (5ЕО ІЮ МО 2)
СОовЗ: БВАТЗТРОВНАБОМЗАХОМ (5ЕО ІЮ МОЗ), (І) ІБМО з наступними СОК послідовностями:
СОВ1: ВУАМА (5ЕО ІЮ МО 4)
СОР2: АІТУЗ5авВІЮОМАОБУКа (5ЕО І МО:5)
СОовВЗ: ОВАРНЗТаНнЗатТавзРОТМОМ (5ЕО І МО:6), (ПІ) ІЗМО з наступними СОК послідовностями:
СОН: ІСАМОИ (5ЕО І МО:7)
СОоР2: АУЗЗО,аазТУУУЮБУКа (ЗЕО І МО:8)
СОКЗ: ЕТОРУСРРККОМ (ЗЕО ІО МО 9), і (ІМ) ІЗМО з наступними СОК послідовностями:
СОН: ІМАМа (5ЕО 10 МО:10)
СОоР2: АУЗЗаазТУУМУрБУКа (ЗЕО ІЮ МО:8)
СОВЗ: ЕТаРУСРРКАОЮМ (5ЕО І МО:9).
У цьому аспекті, поліпептид згідно із даним винаходом переважно містить перший ІЗМО (а), вибраний з ІЗМО (І) і (ІЇ), як визначено вище, і другий ІЗМО (б), вибраний з ІЗМО (І) ії (ІМ), як визначено вище. Ще більш переважно, один або декілька ІЗМО (І)-(ІМ) визначаються як такі, що містять наступні послідовності, відповідно: (І)
АМОЇ МЕЗО МОРОСБІ ВІ БСААЗИаВТЕЗТУУМОаМЕВОАРЕКЕНЕЕМААІЗМУЗаЗТУМАр
УКОаВЕТІЗВОМЗКМТУМІ ОММЗІ АРЕОТАУУУСААЗНатЗТРОВАЗОУЗАУрУМСЦО,ТІ МТУ (ЗЕО ІО МО:11), або
ЕМОЇ МЕЗО МОРОаБІІ ВІ БСМАБСОВТЕЗТУУМОМЕВОАРЕКЕНЕРЕМААІЗМУЗаЗТ УМА
УКОаВЕТІЗВОМЗКМТУМІ ОММЗІ АРЕОТАУУУСААЗНИатТЗТРОВАЗОУЗНУВЮУМУСОСТІ МТУ (ЗЕО ІО МО:23), (І) (ЗЕО ІО
МО:12), 251 ВІ ЗСААБаїЇ ТЕЗАМАМАМЕКОАРОКЕВЕЕМААІ ГТУЗЗавВІОМАрБУКСОаВЕТІЗАОМЗКМ
ТУМ ОММБІ АРЕОТАМУУУСААОВА!РАЗТа НИ ТаЗРОТ ОМ СОСТІ МТУ5БА (ЗЕО І МО 12),
Коо) (1)
АМОЇ МЕЗО! МОРОСБІ ВІ БСААЗОаЗІРВІСАМОУМУ УВОАРОКОВЕЇ МАДУЗЗ,аСсСЗзГУМУрзуУкан
ЕТІЗАОМЗКМ УМ ОММЗІАРЕОТАМУМСМАЕТаРМаРРКАОМУМ ОСТІ МТУ (5ЕО І МО:13), або
ЕМО МЕЗОСИЇ МОРОИБІ ВІ БСААЗОаЗІРВІСАМОУМУ УВОАРЕОКОВЕЇ МААУЗЗОИЗТ МОУ
КавеЕтІзВОМ5КМТУМ ОММЗІ АРЕОТАУУУСМАЕТаРУСРРКАСУМУСОСТІ МТА (5ЕО І
МО:22), і (М)
ЕМОЇ МЕЗО МОРОИБІ ВІ БСААБЗОаЗІЄВІМАМО М УВОАРОКОВЕЇ МААУЗЗССЗТУУУрзуУкан
ЕТІЗВОМЗКМТУМІ ОММЗІАРЕОТАМУМСМАЕТаРМаРРКАОМУМ ОСТІ МТУ55 (5ЕО ІЮ МО:14).
Терміни "перший" і "другий" по відношенню до таких ІЗМО або доменів у цілому, як використовується в даній заявці, призначені тільки для позначення того, що ці домени є двома різними доменами (тому що вони принаймні містять різні СОК-послідовності). Тому дані терміни не слід розуміти як такі, що позначають точний порядок або послідовність доменів у подібному поліпептидному ланцюзі. Інакше кажучи, вищевказані ІЗМО (а) і (б) можуть бути розташовані або в наступному порядку (а)-(б) або в наступному порядку (6)-(а) у межах поліпептидів, описаних у даній заявці.
У деяких варіантах здійснення, поліпептид, описаний у даній заявці, містить - перший ІЗМО (а), що містить наступні СОК послідовності:
СОоВІ: ТМУМа (5ЕО І МО 1)
СОоР2: АІМуУЗа,ЗТУМАОБУКа (5ЕО ІЮ МО 2)
СОЗ: ЗКОТ5ТРУКАБЗОМУЗЕМОМУ (5ЕО І МО:3), і - другий ІЗМО (б), що містить наступні СОК послідовності:
СОН: ІСАМОИ (5ЕО І МО:7)
СОоР2: АУЗЗСИазТУУМУрБУКа (ЗЕО ІЮ МО:8)
СОВЗ: ЕТаРУСРРКАОЮМ (5ЕО І МО:9).
У деяких варіантах здійснення, поліпептид, описаний у даній заявці, містить - перший ІЗМО (а), що містить наступні СОК послідовності:
СОоВІ: ТМУМа (5ЕО І МО 1)
СОоР2: АІМуУЗа,ЗТУМАОБУКа (5ЕО ІЮ МО:2) 60 СОЗ: ЗКОТ5ТРУКАБЗОМУЗЕМОМУ (5ЕО І МО:3), і
- другий ІЗМО (б), що містить наступні СОК послідовності:
СОВІ1: ІМАМа (5ЕО І МО:10)
СОоР2: АУЗЗаазТУУМУрБУКа (ЗЕО ІЮ МО:8)
СОВЗ: ЕТаРУСРРКАОЮМ (5ЕО І МО:9).
У деяких варіантах здійснення, поліпептид, описаний у даній заявці, містить - перший ІЗМО (а), що містить наступні СОК послідовності:
СОВ1: ВУАМА (5ЕО ІЮ МО 4)
СОР2: АІТУЗ5авВІЮОМАОБУКа (5ЕО І МО:5)
СсОКЗ3: ОКАРКЗТОКООТОЗРОТУЮМ (5ЕО ІЮ МО:6), і - другий ІЗМО (б), що містить наступні СОК послідовності:
СОВІ1: ІСАМОа (5ЕО ІЮ МО/7)
СОоР2: АУЗЗаазТУУМУрБУКа (ЗЕО ІЮ МО:8)
СОВЗ: ЕТаРУСРРКАОЮМ (5ЕО І МО:9).
У деяких варіантах здійснення, поліпептид, описаний у даній заявці, містить - перший І5МО (а), що містить наступні СОК послідовності:
СОВ1: ВУАМА (5ЕО ІЮ МО 4)
СОР2: АІТУЗЗаВІОМАЮЗУКа (5ЕО І МО:5)
СсОКЗ3: ОКАРКЗТОКООТОЗРОТУЮМ (5ЕО ІЮ МО:6), і - другий ІЗМО (б), що містить наступні СОК послідовності:
СОВІ1: ІМАМа (5ЕО І МО:10)
СОоР2: АУЗЗаазТУУМУрБУКа (ЗЕО ІЮ МО:8)
СОВЗ: ЕТаРУСРРКАОЮМ (5ЕО І МО:9).
Специфічно, ІЗМО з поліпептидів, описаних у даній заявці (наприклад, ІЗМО, що містять СОК послідовності, як визначено вище) представляють собою УНН домени, переважно гуманізовані
МНН домени.
У деяких варіантах здійснення, ІЗМО (І) з поліпептидів, описаних у даній заявці, містить послідовність 560 ІЮ МО:11 або послідовність 5ЕО ІЮ МО:23. У деяких варіантах здійснення,
ІЗМО (І) містить послідовність ЕО ІЮ МО:12. У деяких варіантах здійснення, ІЗМО (І) містить послідовність 5ЕО ІЮ МО:13 або послідовність 5ЕО ІЮ МО:22. У деяких варіантах здійснення,
Зо ІЗМО (ІМ) містить послідовність зХЕО ІЮ МО:14.
Специфічно, поліпептиди, описані в даній заявці, містять перший І5МО (а) і другий ІЗМО (б), де вказаний перший ІЗМО містить послідовність, вибрану із групи, яка включає 5ЕО ІЮ МО:11,
ЗЕО ІЮ МО:12 і ЗЕО ІЮ МО:23, і вказаний другий ІЗМО містить послідовність, вибрану із групи, яка включає 5ЕО ІЮ МО:13, 5ЕБЕО ІЮ МО:14 і 5ЕО ІЮ МО:22. У деяких варіантах здійснення, перший ІЗМО містить послідовність 5ЕО ІЮ МО:11 і другий ІЗМО містить послідовність ЗЕО ІЮ
МО:22. У деяких варіантах здійснення, перший ІЗМО містить послідовність 5Е2О ІЮ МО:12 і другий ІЗМО містить послідовність БЕО ІЮ МО:13. У деяких варіантах здійснення, перший ІЗМО містить послідовність ЗЕ ІЮ МО:23, і другий ІЗМО містить послідовність ЗЕО ІЮ МО:14. У деяких варіантах здійснення, перший ІЗМО містить послідовність ЗЕО ІЮО МО:11 ії другий ІЗМО містить послідовність ЕС ІЮО МО:14. У деяких варіантах здійснення, перший ІЗМО містить послідовність ЗЕО ІЮ МО:11 і другий ІБМО містить послідовність ЗЕО ІЮ МО:13. У деяких варіантах здійснення, перший ІЗМО містить послідовність ЗЕО ІЮ МО:12 і другий ІЗМО містить послідовність БЗЕО ІЮ МО:14. У деяких варіантах здійснення, перший ІЗМО містить послідовність
ЗБО ІЮ МО:12 і другий ІЗМО містить послідовність ЗЕБЕО ІО МО:22. У деяких варіантах здійснення, перший ІЗМО містить послідовність 5ЕО ІО МО:23 і другий ІЗМО містить послідовність БЗЕО ІЮ МО:22. У деяких варіантах здійснення, перший ІЗМО містить послідовність
ЗЕО ІЮ МО:23 і другий ІБМО містить послідовність ЗЕО ІО МО:13.
Відповідно до одного аспекту, перший ІЗМО і другий ІЗМО з поліпептидів, описаних у даній заявці, ковалентно зв'язані лінксерним пептидом, де вказаний лінкерний пептид необов'язково містить або складається із третього ІЗМО; наприклад, альбумінзв'язувального ІЗМО.
Відповідно до подальшого аспекту, поліпептиди, описані в даній заявці, додатково містять компонент, що збільшує період напівжиття, який ковалентно зв'язаний із вказаним поліпептидом і необов'язково, вибраний із групи, яка включає альбумінзв'язувальний компонент, такий як альбумінзв'язувальний пептид або альбумінзв'язувальний домен імуноглобуліну, трансферинзв'язувальний компонент, такий як анти-трансфериновий домен імуноглобуліну, молекула поліетиленгліколю, сироватковий альбумін людини, і фрагмент сироваткового альбуміну людини. Специфічно, компонент, що збільшує період напівжиття, представляє собою альбумінзв'язувальний компонент, переважно альбумінзв'язувальний ІЗМО, ще більш переважно АЇб11 домен, що містить наступну послідовність: бо ЕМОЇ МЕЗОСИЇ МОРОМ5БІ ВІ БСААЗИаЕТЕ55рГОМО5УУМАОАРИаКаТїЇ ЕМ М5БІЗОБОаБОТІ МАО
УКОавВЕТІЗВОМАКТТІ М ОММЗІ АРЕОТАМУУСТІСЯБВІ 5АЗБЗОСТІ МТУ55 (5ЕО ІЮ МО:21)
Відповідно до переважного аспекту, поліпептиди, описані в даній заявці, містять перший (а) і другий (б) І КР5-зв'язувальний ІЗМО і третій ІЗМО (в), наприклад, альбумінзв'язувальний ІЗМО (в); - вказаний перший ІЗМО, що зв'язує І ЕР5 (а), вибраний із групи, яка включає ІЗМО (І) і (10): (І) ІБМО, що містить наступні СОК послідовності:
СОоВІ: ТМУМа (5ЕО І МО 1)
СОоР2: АІМуУЗас,ЗТУМАОБУКа (5ЕО ІЮ МО:2)
СОЗ: ЗКОТ5ТРУКАБЗОМУЗЕМОМУ (5ЕО І МО:3), і (І) ІБМО, що містить наступні СОК послідовності:
СОВ1: ВУАМА (5ЕО ІЮ МО 4)
СОР2: АІТУЗ5авВІЮОМАОБУКа (5ЕО І МО:5)
СОовВЗ: ОВАРНЗТаНнЗатТавзРОТМОМ (5ЕО І МО:6), - вказаний другий ІЗМО (б), вибраний із групи, яка включає ІЗМО (ПП) ї (ІМ): (11) ІЗМО, що містить наступні СОК послідовності:
СОН: ІСАМОИ (5ЕО І МО:7)
СОоР2: АУЗЗаазТУУМУрБУКа (ЗЕО ІЮ МО:8)
СОКЗ: ЕТОРУСРРККОМ (ЗЕО ІО МО 9), і (ІМ) ІЗМО, що містить наступні СОК послідовності:
СОВІ1: ІМАМа (5ЕО І МО:10)
СОоР2: АУЗЗаазТУУМУрБУКа (ЗЕО ІЮ МО:8)
СОКЗ: ЕТОРУСРРККОМ (ЗЕО ІО МО 9), і - вказаний альбумінзв'язувальний ІЗМО (в) визначається як такий, що містить наступні СОК послідовності:
СОВ1: 5БРОаМ5 (ЗЕО ІЮ МО 15)
СОовРг: 5ІЗОВОЗОТІ МАОБУК,а (5ЕО І МО:16)
СовЗ: аа5І ЗА (5ЕО І МО:17).
Наприклад, поліпептид містить перший і другий ІЗМО, як визначено за допомогою СОК послідовностей вище, і третій ІЗМО, який представляє собою альбумінзв'язувальний ІЗМО, як визначено за допомогою СОК послідовностей вище, і який безпосередньо або опосередковано з'єднує перший і другий ІЗМО. У деяких варіантах здійснення, перший ІЗМО ковалентно зв'язаний з допомогою пептидного лінкера із третім ІЗМО, який ковалентно зв'язаний з о другим
ІЗМО за допомогою пептидного лінкера. Терміни "перший" і "другий", як вказано вище, не вказують їх положення в межах поліпептиду, отже, від М до С кінця ІЗМО послідовності в межах поліпептиду можуть бути розташовані або в наступному порядку ІЗМО (а)-(в)-(б6), (а)-І(лінкер|-(в)-
І(лінкеріІ-(6), (6)-(в)-(а). (6)- (лінкері-(в)-(лінкерІ-(а).
У деяких варіантах здійснення, поліпептид містить - перший ІЗМО, що містить наступні СОК послідовності:
СОоВІ: ТМУМа (5ЕО І МО 1)
СОоР2: АІМуУЗа,ЗТУМАОБУКа (5ЕО ІЮ МО 2)
СОовЗ: БВАТЗТРОВАБОМЗАМОМ (ЗЕО ІО МОЗ), - другий ІЗМО, що містить наступні СОК послідовності:
СОН: ІСАМОИ (5ЕО І МО:7)
СОоР2: АУЗЗаазТУУМУрБУКа (ЗЕО ІЮ МО:8)
СОКЗ: ЕТОРУСРРККОМ (ЗЕО ІО МО 9), і - альбумінзв'язувальний ІЗМО (третій ІЗМО) визначається як такий, що містить наступні СОК послідовності:
СОВА: 5РОМ5 (ЗЕО І МО:15)
СОовРг: 5ІЗОВОЗОТІ МАОБУК,а (5ЕО І МО:16)
СОовЗ: аа5І ЗА (5ЕО І МО:17).
У деяких варіантах здійснення, поліпептид містить - перший ІЗМО, що містить наступні СОК послідовності:
СОоВІ: ТМУМа (5ЕО І МО 1)
СОоР2: АІМуУЗа,ЗТУМАОБУКа (5ЕО ІЮ МО 2)
СОовЗ: БВаТЗТРОВАБОМЗАМОМ (ЗЕО ІО МОЗ), - другий ІЗМО, що містить наступні СОК послідовності:
СОН: ІМАМа (5ЕО 10 МО:10)
СОоР2: АУЗЗаазТУУМУрБУКа (ЗЕО ІЮ МО:8)
СОКЗ: ЕТОРУСРРККОМ (ЗЕО ІО МО 9), і бо - альбумінзв'язувальний ІЗМО визначається як такий, що містить наступні СОК послідовності:
СОВА: 5РОМ5 (ЗЕО І МО: 15)
СОовРг: 5ІЗОВОЗОТІ МАОБУК,а (5ЕО І МО:16)
СОовЗ: аа5І ЗА (5ЕО І МО:17).
У деяких варіантах здійснення, поліпептид містить - перший ІЗМО, що містить наступні СОК послідовності:
СОВ1: ВУАМА (5ЕО ІЮ МО 4)
СОР2: АІТУЗ5аВІЮОМАОБУКа (5ЕО І МО:5)
СОовВЗ: ОВАРНЗТаНнЗатТавзРОТМОМ (5ЕО І МО:6), - другий ІЗМО з наступними СОК послідовностями:
СОН: ІСАМОИ (5ЕО І МО:7)
СОоР2: АУЗЗаазТУУМУрБУКа (ЗЕО ІЮ МО:8)
СОКЗ: ЕТОРУСРРККОМ (ЗЕО ІО МО 9), і - альбумінзв'язувальний ІЗМО визначається як такий, що містить наступні СО послідовності:
СОВА: 5РОМ5 (ЗЕО І МО: 15)
СОовРг: 5ІЗОВОЗОТІ МАОБУК,а (5ЕО І МО:16)
СОовЗ: аа5І ЗА (5ЕО І МО:17).
У деяких варіантах здійснення, поліпептид містить - перший І5МО, що містить наступні СОК послідовності:
СОВА: ВУАМА (5ЕО ІЮ МО 4)
СОР2: АІТУЗ5авВІЮОМАОБУКа (5ЕО І МО:5)
СОовВЗ: ОВАРНЗТаНнЗатТавзРОТМОМ (5ЕО І МО:6), - другий ІЗМО, що містить наступні СОК послідовності:
СОВІ1: ІМАМа (5ЕО І МО:10)
СОоР2: АУЗЗаазТУУМУрБУКа (ЗЕО ІЮ МО:8)
СОКЗ: ЕТОРУСРРККОМ (ЗЕО ІО МО 9), і - альбумінзв'язувальний ІЗМО визначається як такий, що містить наступні СОК послідовності:
Зо СОВА: 5РОМ5 (ЗЕО І МО: 15)
СОовРг: 5ІЗОВОЗОТІ МАОБУК,а (5ЕО І МО:16)
СОовЗ: аа5І ЗА (5ЕО І МО:17).
У деяких варіантах здійснення, ІЗМО, як визначається відповідно до їх СОК послідовностей у вищеописаних поліпептидах, перегруповані таким чином, що альбумінзв'язувальний ІЗМО безпосередньо або опосередковано (наприклад, за допомогою лінкерного пептиду) з'єднує перший і другий ІЗМО.
У деяких варіантах здійснення, поліпептид, описаний у даній заявці, містить або складається з послідовності, вибраної з БЕО ІЮО МО: 18, 19 і 20.
У ще подальшому аспекті, даний винахід стосується поліпептиду, який зв'язується з І КРБ, що містить ІЗМО, який конкурує за зв'язування з І КР5 з еталонним ІЗМО, де еталонний ІЗМО має послідовність, ідентифіковану в ЗЕО ІЮ МО: 11, 12, 13, 14, 22 або 23.
В іншому аспекті, даний винахід стосується поліпептиду, який зв'язується з І КРБ, що містить перший ІЗМО (а), який конкурує за зв'язування з І! КР5 з першим еталонним ІЗМО, де перший еталонний ІЗМО має послідовність, ідентифіковану в ЗЕО ІЮ МО: 11, 23 або 12, і другий ІЗМО (б), який конкурує за зв'язування з І КРБ із другим еталонним ІЗМО, де другий еталонний ІЗМО має послідовність, ідентифіковану в 5ЕО ІЮ МО: 13, 22 або 14.
У ще одному аспекті, даний винахід стосується поліпептиду, який зв'язується з КРБ, що містить перший ГКР5-зв'язувальний домен, переважно ІЗМО, і другий І КР5-зв'язувальний домен, переважно ІЗМО, де перший домен зв'язує ділянку І КРБ, який відрізняється від І КР5 ділянки, з якою зв'язується другий домен. Відповідно до переважного варіанта здійснення, перший І КР5-зв'язувальний домен блокує МУ/піЗа зв'язувальний сайт в І КРБ, і переважно інгібує
МУпіЗа-опосередковану транскрипцію цільового гена, та/"або де другий ІКРб5-зв'язувальний домен блокує МУпії зв'язувальний сайт в І КР5, і переважно інгібує Уупи -опосередковану транскрипцію цільового гена.
Згідно з подальшими аспектами, винахід стосується молекул нуклеїнових кислот, векторів експресії, клітин-хазяїнів, а також способів виробництва, використовуваних для виготовлення винайденого поліпептиду. Молекули нуклеїнових кислот, що кодують поліпептиди згідно з винаходом, у виділеному вигляді можуть бути використані для конструювання відповідних векторів експресії, які потім можуть бути перенесені шляхом трансфекції в клітини-хазяїни, бо використовувані для біофармацевтичного виробництва поліпептидів згідно з винаходом. Подібні способи виготовлення, як правило, включають етапи культивування клітини-хазяїна в умовах, що роблять можливою експресію поліпептиду, виділення поліпептиду і його очищення відомими в галузі методами.
Подальші аспекти, варіанти здійснення, застосування й способи, у яких використовуються поліпептиди згідно з винаходом, будуть зрозумілі з нижченаведеного детального опису винаходу й доданої формули.
Винаходом надані нові молекули, які уложливлюють більш ефективне лікування різних типів раку, таких як ТНРМ3, КРР і НДКРЛ, з меншою кількістю побічних ефектів. Поліпептиди згідно з винаходом забезпечують несподіваний терапевтичний ефект (тобто, дієвість) при лікуванні хворих на рак пацієнтів, який полягає в тому, що вони здатні викликати регрес пухлини, що приводить до повної патоморфологічної відповіді (пППВ). Очікується, що це у свою чергу приведе до значного поліпшення виживаності без прогресування й загальної виживаності, особливо у випадку великої нереалізованої медичної потреби, такої, як, напр., при раку молочної залози.
Таким чином, поліпептиди згідно з винаходом забезпечують нові терапевтичні можливості для лікування ряду типів раку, особливо тих, де виявляють розрегульований сигнальний шлях М/пі і нагромадження бета-катеніну.
Більше того, поліпептиди згідно з винаходом легко виробляти, вони мають високу стабільність і низьку антигенність, а також відкривають ряд можливостей щодо шляхів введення, крім ін'єкцій і інфузій.
КОРОТКИЙ ОПИС ФІГУР
На Фігурі 1 показане схематичне зображення біпаратопних поліпептидів, що протидіють передачі сигналів М/пИи ї М/піЗа. Вони складаються із трьох доменів, два з яких зв'язуються з різними епітопами КР5 (блокатор МУпИ і МУпіЗза) і один домен для продовження періоду напіввиведення (домен, що зв'язується з людським сироватковим альбуміном).
На Фігурах 2А/28 показане зв'язування трьох біпаратопних І КР5-селективних УНН конструкцій із продовженим періодом напіввиведення, тобто, особливо переважних поліпептидів згідно із даним винаходом, з ГКР5 людини (Фігура 2А) і ГКРб людини (Фігура 2В), які понадекспресуються в клітинних лініях НЕК293, у порівнянні з негативним контролем, що складаються із ненаціленого зв'язувального компонента (МНН конструкція, яка зв'язується з
Зо бактеріальним білком, який не експресується в клітинах НЕК293) і в порівнянні з І КРБ/6- перехресно-реагуючим зв'язувальним компонентом, МОКО81681Ідс11І АГА 6475 5сім. Біпаратопні
ІГКР5 специфічні МНН конструкції із продовженим періодом напіввиведення згідно із даним винаходом зв'язуються тільки з ЇКР5 людини без зв'язування, що виявляється, з | КРб людини, на відміну від ГКР5Б/б-перехресно-реагуючого зв'язувального компонента.
На Фігурах ЗА/ЗВ показана повна ОККІ1 конкуренція трьох біпаратопних І КР5-селективних
МНН конструкцій із продовженим періодом напіввиведення, тобто, особливо переважних поліпептидів згідно із даним винаходом, за зв'язування як з І! КР5 людини (Фігура ЗА), так і мишиним ІКРБ (Фігура ЗВ), які понадекспресуються в клітинних лініях НЕК293, як було виявлено за допомогою аналізу ОКК1-конкуренції на основі ЕАС5.
На Фігурах 4А/4В показане повне інгібування шляху М/пИ (Фіг. 4А) і УУпіЗа (Фіг. 48) трьома біпаратопними І АРб-селективними МНН конструкціями із продовженим періодом напіввиведення, тобто, особливо переважними поліпептидами згідно із даним винаходом.
На Фігурі 5 показане інгібування передачі сигналів МУпі у ракових клітинах, як виявляється шляхом інгібування відносної експресії мРНК Ахіп2 (права панель), і проліферації клітин (ліва панель), оцінюваної за зниженням відсотка (90) життєздатних клітин, після лікування із застосуванням біпаратопної І ЕР5-селективної МНН конструкції із продовженим періодом напіввиведення, тобто, особливо переважного поліпептиду згідно із даним винаходом (у кінцевій концентрації 1 мкМ).
На Фігурах бА/6В показана ефективність іп мімо біпаратопних І КР5-селективних УНН конструкцій із продовженим періодом напіввиведення (Б012900082 на Фігурі бА ії Е012900141 на
Фігурі 6В), тобто, особливо переважних поліпептидів згідно із даним винаходом, на моделях пухлин, викликаних М/пі (ксенотрансплантатна модель ММТМ-М/пії).
На Фігурі 7 показане інгібування шляху передачі сигналів М/пі у пухлинах, лікованих із застосуванням біпаратопних ГКР5-селективних МНН конструкцій із продовженим періодом напіввиведення, тобто, особливо переважних поліпептидів згідно із даним винаходом, як виявляється шляхом зменшення експресії мРНК Ахіп2/ЯНМЕ4З/Моїшт у порівнянні з контрольною групою.
На Фігурі 8 показане, що ІКР5 експресується на більш високому рівні, ніж І КРб у дендритних клітинах моноцитарного походження людини (ліва панель). Крім того, супресивний бо вплив УУпіЗза на активацію Т-клітин, як визначено шляхом вивільнення гамма-інтерферону,
сильно пригнічується лікуванням із застосуванням біпаратопних І КР5-селективних УНН конструкціям із продовженим періодом напіввиведення (центральна й права панелі), тобто, переважних пептидів згідно із даним винаходом. Кожний символ позначає окремого донора дендритних клітин (ДК). Наведені дані нормалізовані до рівнів ФНІП-альфа в необробленому контролі й кожний символ позначає унікальну донорську пару для ОС і Т-клітин.
На Фігурі 9 показане селективне інгібування АМЕ43З мутантної СКС органоїдної проліферації (АМЕ43 тий ії АМЕ4З3 тиї2) у порівнянні з відсутністю істотного впливу на АМЕ43З дикого типу
СКС органоїдну проліферацію (КМЕ43 УТ), оцінювану за зниженням відсотка (95) життєздатних клітин, після лікування із застосуванням біпаратопної | КР5-селективної МНН конструкції із продовженим періодом напіввиведення, тобто, особливо переважного поліпептиду згідно із даним винаходом. Також описані ІСсо нМ значення інгібування НАМЕ43 мутантної СКС органоїдної проліферації.
На Фігурі 10 показане селективне інгібування передачі сигналів М/пі в ВМЕ43 мутантних СЕС органоїдах (АМЕ43 тий і АМЕ43 ти) у порівнянні з відсутністю істотного впливу в АМЕ4З3 дикого типу СКС органоїді (КМЕ43 М/Т), як виявляється шляхом інгібування відносної експресії
МРНК Ахіп2, після лікування із застосуванням біпаратопної І КР5-селективної УНН конструкції із продовженим періодом напіввиведення, тобто, особливо переважний поліпептид згідно із даним винаходом (у кінцевій концентрації 62 нМ).
ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
Визначення
Вищевикладені й інші аспекти й варіанти здійснення винаходу будуть зрозумілі з наведеного далі опису, у якому: а) Якщо не вказане або не визначене інше, усі використані терміни мають звичайне для даної галузі значення, яке очевидно фахівцеві. Приміром, даним посилаємося на стандартні посібники, такі як Затогоок та ін., "МоіІесціаг Сіопіпд: А І арогаїгу Мапиаї!" (2-е вид.), Т. 1-3, Соїа
Ургіпд Нагбог І арогаїогу Рге55 (1989); І ем/іп, "Зепе5 ІМ", Охіога Опімегейу Ргез5, Нью-Йорк, (1990), Воїїй та ін., ""І«ттипоіоду" (2-е вид.), Сожмег Меаіїсаї! Рибіїзпіпу, Лондон, Нью-Йорк (1989), а також на процитовані тут документи загального рівня техніки. Крім того, якщо не вказано інше, усі способи, етапи, методики й маніпуляції, конкретні деталі яких не описані, можуть бути
Зо виконані й виконувалися відомим рег зе способом, що буде зрозуміло фахівцеві. Для прикладу знову ж таки посилаємося на стандартні посібники, процитовані тут документи загального рівня техніки й подальші документи, що згадуються. б) Якщо не вказано інше, терміни "імуноглобулін" і "послідовність імуноглобуліну" - чи використовуються вони для позначення важкого ланцюга антитіла або ж звичайного 4- ланцюгового антитіла - використані як загальні терміни, що охоплюють повнорозмірні антитіла, їх окремі ланцюги, а також будь-які їх частини, домени або фрагменти (включаючи, але не обмежуючись ними, антигензв'язувальні домени або фрагменти, такі як МНН-домени або МНЛ/І- домени, відповідно). Крім того, використовуваний тут термін "послідовність" (наприклад, у складі таких термінів, як "послідовність імуноглобуліну", "послідовність антитіла", "послідовність (окремого) варіабельного домену", "МНН-послідовність" або "послідовність білка") потрібно в цілому розуміти, який такий, що охоплює й відповідну амінокислотну послідовність і послідовності нуклеїнової кислоти, які її кодують, або нуклеотидні послідовності, якщо тільки контекстом не мається на увазі більш обмежене тлумачення; в) Термін "домен" (поліпептиду або білка) тут і далі позначає складчасту білкову структуру, яка здатна утримувати свою третинну структуру незалежно від іншого білка. Як правило, домени відповідають за окремі функціональні властивості білків, і в багатьох випадках можуть бути додані, вилучені або перенесені на інший білок без втрати функції залишку білка та/або домену. г) Термін "імуноглобуліновий домен" тут і далі використаний для позначення глобулярної ділянки в ланцюзі антитіла (такої як, напр., ланцюг звичайного 4-ланцюгового антитіла або важкого ланцюга антитіла) або ж поліпептиду, який по суті складається з такої глобулярної ділянки. Імуноглобулінові домени відрізняються тим, що зберігають характерну для молекул антитіл імуноглобулінову укладку, що представляє собою 2-шаровий "сендвіч" із приблизно семи антипаралельних бета-ниток, покладених у два бета-листки, необов'язково стабілізовані консервативним дисульфідним зв'язком. д) Термін "варіабельний домен імуноглобуліну" тут і далі позначає імуноглобуліновий домен, що складається по суті із чотирьох "каркасних ділянок", які тут і в документах рівня техніки позначаються як "каркасну ділянку 1" або "ЕК1"; "каркасна ділянка 2" або "ЕК2"; "каркасна ділянка 3" або "РК3"; і "каркасна ділянка 4" або "ЕК4", відповідно; ці каркасні ділянки бо перемежовуються трьома "ділянками, що визначають комплементарність" або "СОК", які тут і в документах рівня техніки позначаються як "ділянка, що визначає комплементарність 1" або "СОК1"; "ділянка, що визначає комплементарність 2" або "СОК2"; і "ділянка, що визначає комплементарність 3" або "СОМКЗ3", відповідно. Таким чином, загальну структуру або послідовність імуноглобулінового варіабельного домену можна відобразити в наступному вигляді: ЕК1-СО81-ЕН2-СО08Н2-ЕВЗ3-СОВЗ3-ЕКЯ4. Саме імуноглобуліновий варіабельний домен(-и) надає антитілу специфічність за антигеном, оскільки на ньому знаходиться антигензв'язувальна ділянка. е) Термін "одиночний варіабельний домен імуноглобуліну" (або ІЗМО) тут і далі позначає імуноглобуліновий варіабельний домен, який здатний специфічно зв'язуватися з епітопом антигену, не будучи спареним з додатковим варіабельним імуноглобуліновим доменом. Одним із прикладів ІЗМО у контексті даного винаходу є "доменні антитіла", такі як ІЗМО МН і МІ. (МН- домени й Мі -домени). Іншим важливим прикладом ІЗМО є "МНН-домени" (або ж просто УНН) верблюдових, визначення яким дано нижче.
У контексті вищевикладеного визначення антигензв'язувальний домен звичайного 4- ланцюгового антитіла (такого, як молекула Ідс, ІМ, ІдЧА, дО або ІдЧЕ; відомі з рівня техніки) або
Еар-фрагменту, Е(ар)2-фрагменту, Ем-фрагменту, такого як дисульфідно зшитий Еу- або 5сЕм- фрагмент, або діатіла (усі відомі з рівня техніки), що походять від подібного звичайного 4- ланцюгового антитіла, як правило, не буде вважатися ІЗМО, тому що в цих випадках зв'язування з відповідним епітопом антигену звичайно не відбувається при участі тільки одного (окремого) імуноглобулінового домену, але вимагає пари (об'єднаних) імуноглобулінових доменів, таких як варіабельні домени легкого й важкого ланцюга, тобто, пари МН-МІ. імуноглобулінових доменів, які спільно зв'язуються з епітопом відповідного антигену. е1) "МНН-домени", відомі також як МНН, МнН-домени, МНН-фрагменти антитіл і МНнН- антитіла, спочатку були описані як антигензв'язувальні імуноглобулінові (варіабельні) домени "важколанцюгових антитіл" (тобто, "антитіл, що не мають легких ланцюгів"; Натегв5-савієттап С,
Агатоциси Т, Миуїдептапе 5, НКоБріпвоп сї, Натегв С, бопда ЕВ, Вепдаайтап М, Натегв В.: "Маїшигану оссигтіпу апіїродіє5 демоїй ої дні спаіп5"; Маїшге 363, 446-448 (1993)). Термін "УНН- домен" був вибраний, щоб відрізняти такі варіабельні домени від варіабельних доменів важкого ланцюга, наявних у звичайних 4-ланцюгових антитілах (які тут і далі позначені як "УМн-домени" або "МН-домени") і від варіабельних доменів легкого ланцюга, наявних у звичайних 4- ланцюгових антитілах (які тут і далі позначені як "Мі-домени" або "Мі -домени"). МНН-домени здатні специфічно зв'язуватися з епітопом без додаткового антигензв'язувального домену (на відміну від МН- або Мі -доменів звичайного 4-ланцюгового антитіла, у випадку якого Мі- і МН- домени розпізнають епітоп спільно) МНН-домени є малими, стійкими й ефективними антигенрозпізнавальними одиницями, утвореними окремим імуноглобуліновим доменом.
У контексті даного винаходу терміни МНН-домен, УНН, МнН-домен, МНН-фрагмент антитіла,
МНН-антитіло, а також "Мапородує" і "Мапободу?-домен" ("Мапободу" є торговельною маркою компанії Абіупх М.М.; Гент; Бельгія) застосовуються взаємозамінно й позначають представників
ІЗМО (що мають структуру ЕК1-СОВ1-ЕН2-СОВ2-ЕВ!З3-СОВ8З3-ЕК4У, й що специфічно зв'язуються з епітопом, не потребуючи для цього присутно другого імуноглобулінового варіабельного домену), які також можна відрізнити від МН-доменів за так званими "відрізняючими залишках" згідно з визначенням в, напр., УМО 2009/109635, Фіг. 1.
Амінокислотні залишки МНН-домену нумерують за загальною системою нумерації Мн- доменів, розробленою КарБбаї та ін. ("Зедиепсе ої ргоївїпв ої іттипоіодіса! іпіеге5і", О5 Рибіїс
Неакнй Зегмісе5, МІН Бетесда, Мериленд, Публікація Мо 91), згідно з її застосуванням для МНІН- доменів Верблюдових, показаному, напр., на Фігурі 2 з Кіесптапп і Миуїдептапв, 9. Іттипої.
Меїтоавз 231, 25-38 (1999). Згідно із цією системою нумерації - ЕК! складається з амінокислотних залишків у положеннях 1-30, - СОКІ1 складається з амінокислотних залишків у положеннях 31-35, - ЕК2 складається з амінокислотних залишків у положеннях 36-49, - СОК2 складається з амінокислотних залишків у положеннях 50-65, - ЕКЗ складається з амінокислотних залишків у положеннях 66-94, - СОКЗ складається з амінокислотних залишків у положеннях 95-102, - ЕК4 складається з амінокислотних залишків у положеннях 103-113.
Однак слід зазначити - і це добре відомо для Мн-доменів і для МНН-доменів - що загальна кількість амінокислотних залишків у кожному СОК може відрізнятися й може не відповідати загальній кількості амінокислотних залишків, передбаченому нумерацією за Кабаї (а саме, одне або більше положень згідно з нумерацією за Кабаї у реальній послідовності можуть не бути зайняті, або ж реальна послідовність може містити більше амінокислотних залишків, ніж бо передбачено системою Кава). Це значить, що в цілому нумерація за Караї може відповідати або не відповідати реальній нумерації амінокислотних залишків у реальній послідовності.
З рівня техніки відомі альтернативні методи нумерації амінокислотних залишків Мн-доменів, які можуть аналогічним чином застосовуватися й до МНН-доменів. Проте, якщо не вказано інше, у даному описі, формулі й на фігурах використовується нумерація за Кабаї, застосована до
УНН-доменам згідно з описом вище.
Загальна кількість амінокислотних залишків в МНН-домені, як правило, знаходиться в діапазоні від 110 до 120, часто між 112 і 115. Однак, слід відзначити, що для описаних тут цілей можуть підходити й більш короткі й довгі послідовності.
Подальші структурні характеристики й функціональні властивості МНН-доменів |і поліпептидів, що їх містять, можуть бути підсумовані в такий спосіб:
МНН-домени ("спроектовані" природою для функціонального зв'язування з антигеном без присутності варіабельного домену легкого ланцюга й без якої-небудь взаємодії з ним) здатні функціонувати як окрема, відносно невелика функціональна антигензв'язувальна структурна одиниця, домен або поліпептид. Це відрізняє МНН-домени від МН- і МІ -доменів звичайного 4- ланцюгового антитіла, які самі по собі, як правило, не придатні до практичного застосування як окремі антигензв'язувальні білки або ІЗМО, але потребують комбінування в тій чи іншій формі, щоб забезпечити функціональну антигензв'язувальну одиницю (як, наприклад, у звичайних фрагментах антитіл, таких як Рар-фрагменти; в 5СсЕм, що складаються із МН-домену, ковалентно зв'язаного з МІ -доменом).
Завдяки цим унікальним властивостям використання УНН-доменів - окремо або як частини більшого поліпептиду - має ряд значних переваг у порівнянні з використанням звичайних МН- і
МІ-доменів, 5сЕм або звичайних фрагментів антитіл (таких, як Гар- або Е(ар)2-фрагменти): - для високоафінного й високоселективного зв'язування антигену потрібен тільки один домен, так що відпадає необхідність мати в наявності два окремі домени, а також переконуватися в правильній просторовій конформації й конфігурації цих двох доменів (тобто, за допомогою спеціальних лінкерів, як у випадку 5сЕм). - МНН-домени можуть експресуватися з одного гена й не вимагають посттрансляціної укладки або модифікацій; - МНН-домени можна легко вбудувати в мультивалентні й мультиспецифічні формати (про що вказано далі); - МНН-домени добре розчинні й не мають схильність до агрегації (як мишині антигензв'язувальні домени, описані Умага та ін., Маїшге 341: 544-546 (1989)); - МНН-домени дуже стійкі до дії температури, рН, протеаз і інших денатуруючих агентів або умов, і тому можуть виготовлятися, зберігатися або транспортуватися без використання холодильного обладнання, тим самим заощаджуючи фінанси, час і запобігаючи наслідкам для навколишнього середовища; - МНН-домени відносно просто й дешево виготовити, навіть у виробничих масштабах.
Наприклад, МНН-домени й поліпептиди, що їх містять, можна виготовити мікробним культивуванням (напр., згідно з описом нижче), не використовуючи системи експресії ссавців, що потрібні, наприклад, для звичайних фрагментів антитіл; - МНН-домени в порівнянні зі звичайними 4-ланцюговими антитілами і їх антигензв'язувальними фрагментами відносно невеликі (приблизно 15 кДа, або в 10 раз менше, ніж звичайний Ідс), а тому - переважно проникають у тканині й - можуть бути введені в більш високих дозах ніж звичайні 4-ланцюгові антитіла і їх антигензв'язувальні фрагменти; - МНН-домени можуть проявляти так звані властивості порожнинного зв'язування (серед іншого завдяки подовженій у порівнянні зі звичайними МН-доменами петлі їх СОКЗ), і тому їм доступні також мішені й епітопи, недоступні для звичайних 4-ланцюгових антитіл і їх антигензв'язувальних Фрагментів.
Способи одержання МНН-доменів, що зв'язуються з конкретним антигеном або епітопом, були описані раніше, напр., в МЛО 2006/040153 і МО 2006/122786. Також у цьому документі детально описане, що МНН-домени Верблюдових можна "гуманізувати", замінивши один або більше амінокислотних залишків в амінокислотній послідовності оригінальної МНН-послідовності одним або більше амінокислотними залишками, що знаходяться у тих же положеннях УН- домену звичайного 4-ланцюгового антитіла людини. Гуманізований МНН-домен може містити одну або більше повністю людських послідовностей каркасних ділянок, а в ще більш конкретному варіанті здійснення може містити людські послідовності каркасних ділянок, отримані з ОР-29, ОР-47, ОР-51, або їх частини, необов'язково скомбіновані з послідовностями 60 УН, такими як УН5.
е2) "Доменні антитіла", також відомі як "Сар", "Сотаїп Апііродієв", ії "адАБбБе" (де терміни "Бботаїп Апііродіеє" і "ЯАре" використовуються як торговельні марки групою компаній
СпіахозтіййКіїпе), були описані, напр., в УМага Е.5. та ін.: "Віпаіпуд асіїмкіе5 ої а герегіоїге ої зіпдіе іттиподіобиїйп магіаріє дотаїп5 зесгеїва їот ЕзспПегісніа соїї"; Мате 341: 544-546 (1989); Ної
ГУ. та ін: "ботаїп апібродіев: ргоївіп5 Тог Шегару" ТКЕМО5З іп Віотїесппоїоду 21(11): 484-490 (2003); а також в УМО2003/002609.
Доменні антитіла по суті відповідають УН- або Мі -доменам ссавців, що не є Верблюдовими, зокрема, людських 4-ланцюгових антитіл. Щоб мати можливість зв'язувати епітоп як окремий антигензв'язувальний домен, тобто, не будучи в парі з відповідним Мі - або МН-доменом, необхідний спеціальний відбір за такими антигензв'язувальними властивостями, напр., за допомогою бібліотек послідовностей окремих людських МН- або МІ -доменів.
Доменні антитіла, як і МНН, мають молекулярну масу від приблизно 13 до приблизно 16 кДа, а якщо отримані з повністю людських послідовностей, то не потребують гуманізації для, напр., терапевтичного застосування на людях. Як і у випадку МНН-доменів, вони добре експресуються в прокаріотних системах експресії, що забезпечує значне зменшення загальних виробничих витрат.
Доменні антитіла, як і МНН-домени, можна піддавати афінному дозріванню, вводячи в амінокислотну послідовність одного або більше СОК зміни, які приводять до поліпшення афінності одержуваного ІЗМО до його відповідного до антигену в порівнянні з відповідною батьківською молекулою. Піддані афінному дозріванню молекули ІЗМО згідно з винаходом можна виготовити відомими з рівня техніки способами, наприклад, описаними в Магкз5 та ін., 1992, Віоїесппоіоду 10:779-783, або Вагбаз та ін., 1994, Ргос. Маї. Асай. Зсі, ОБА 91: 3809-3813.;
ЗПіег та ін., 1995, Сепе 169:147-155; Мецоп та ін., 1995, Іттипої. 155: 1994-2004; даск:хоп та ін., 1995, 9. Іттипої. 154 (7):3310-9; а також Намкіп5 та ін., 1992, 9. Мої. Віо!І. 226 (3): 889 896; К5
УдЧоппзоп апа ВЕ Наужкіпз, "Айіпйу таїйигаїйоп ої апіїродієв ивзіпа рпаде аїізріау", Охгога Опімегейу
Ргез5 1996. еЗ3) Крім того, фахівцеві в даній галузі також буде зрозуміло, що можна "пересадити" один або більше із вищезгаданих СОК на інші "каркаси", включаючи, але не обмежуючись ними, каркаси людського походження або неімуноглобулінові каркаси. Підходящі каркаси й методики для подібного пересадження СОР відомі з рівня техніки.
Ж) Терміни "епітоп" і "антигенна детермінанта", які можуть використовуватися взаємозамінно, позначають частину макромолекули, таку як поліпептид, розпізнавану антигензв'язувальними молекулами, такими як звичайні антитіла або поліпептиди згідно з винаходом, а більш конкретно - антигензв'язувальною ділянкою цих молекул. Епітопи визначають мінімальну ділянку зв'язування імуноглобуліну й тому є мішенню специфічності імуноглобуліну.
Частину антигензв'язувальної молекули (така, як звичайне антитіло або поліпептид згідно з винаходом), яка розпізнає епітоп, називають паратопом. з) Термін "біпаратопна" (антиген-)зв'язувальна молекула або "біпаратопний" поліпептид тут і далі позначає поліпептид, що містить перший ІЗМО і другий ІЗМО відповідно даному тут визначенню, причому ці два варіабельні домени здатні зв'язуватися із двома різними епітопами одного антигену, при цьому один моноспецифічний імуноглобулін, такий як, напр., звичайне антитіло або один ІЗМО, у нормальних умовах не зв'язується з обома цими епітопами одночасно. Біпаратопні поліпептиди згідно з винаходом складаються з варіабельних доменів з різними специфічностями за епітопами і не містять взаємно комплементарних пар варіабельних доменів, що зв'язуються з тим самим епітопом. Тому вони не конкурують один з одним за зв'язування з І КР5. и) Поліпептид (такий, як імуноглобулін, антитіло, ІЗМО, поліпептид згідно з винаходом або антигензв'язувальна молекула або її фрагмент у загальному розумінні), здатний "зв'язувати", "зв'язуватися з", "специфічно зв'язувати" або "специфічно зв'язуватися з", що має "афінність до" та/або "специфічністю за" певного епітопу, антигену або білку (або принаймні однієї його частини, фрагменту або епітопу), називають "поліпептидом до" або "поліпептидом, спрямованим проти" вказаного епітопу, антигену або білка, або ж він є "зв'язувальною" молекулою у відношенні такого епітопу, антигену або білка. кю) У цілому термін "специфічність стосується ряду різних типів антигенів або епітопів, з якими може зв'язуватися конкретна антигензв'язувальна молекула або антигензв'язувальний білок (такий, як імуноглобулін, антитіло, ІЗМО або поліпептид згідно з винаходом).
Специфічність антигензв'язувального білка можна визначити на підставі його афінності та/або авідності. Афінність, яка хараткеризується рівноважною константою дисоціації антигену й бо антигензв'язувального білка (КО), є критерієм сили зв'язування епітопу й антигензв'язувальної ділянки антигензв'язувального білка: чим менше значення КО, тим більша сила зв'язування епітопу й антигензв'язувальної молекули (альтернативно афінність можна виражати як константу афінності (КА), яка є 1/КО). Як буде зрозуміло фахівцеві (наприклад, на підставі подальшої інформації із цього документа), афінність можна визначити відомим рег хе способом, залежно від конкретного антигену, що представляє інтерес. Авідність - це показник сили зв'язування антигензв'язувальної молекули (такої, як імуноглобулін, антитіло, ІЗМО або поліпептид згідно з винаходом) з конкретним розглянутим антигеном. Авідність залежить як від афінності епітопу і його антигензв'язувальної ділянки на антигензв'язувальній молекулі, так і від кількості відповідних застосовних сайтів зв'язування на антигензв'язувальній молекулі.
Як правило, антигензв'язувальні білки (такі, як поліпептиди згідно з винаходом) мають при зв'язуванні константу дисоціації (КО) від 10Е-5 до 10Е-14 моль/літр (М) або менше, переважно від 1О0Е-7 до 10Е-14 моль/літр (М) або менше, більш переважно від 10Е-8 до 10Е-14 моль/літр, ще більш переважно від 10Е-11 до 10Е-13 (виміряну, напр., аналізом Кіпеха; відомий з рівня техніки), та/або константу асоціації (КА) принаймні 10Е7 МЕ-1, переважно принаймні 10Е8 МЕ-1, більш переважно принаймні 10Е9 МЕ-1, таку як принаймні 10Е11 МЕ-1. Будь-яке значення КО вище 10Е-4 М, як правило, вважають таким, що вказує на неспецифічне зв'язування. Переважно поліпептид згідно з винаходом зв'язується з бажаним антигеном з КО меншою, ніж 500 нМ, переважно меншою, ніж 200 нМ, більш переважно меншою, ніж 10 нМ, такою, як менше 500 пМ.
Специфічне зв'язування антигензв'язувального білка з антигеном або епітопом можна визначити будь-яким підходящим відомим рег зе методом, включаючи, наприклад, описані тут аналізи, аналіз Скетчарда та/або аналізи конкурентного зв'язування, такі, як радіоїмуноаналізи (РІА), імуноферментні аналізи (ІФА) і сендвіч-аналізи конкуренції, а також різні з варіанти, відомі рег зе з рівня техніки. л) Термін "перехреснореактивний" стосовно зв'язувальних молекул, здатних зв'язуватися й з
І КРБ, ї з СКРб ("перехреснореактивні за І КРБ/ КР") слід розуміти як те, що такі зв'язувальні молекули можуть специфічно зв'язуватися з епітопом, що міститься в молекулі ГКР, а також альтернативно можуть специфічно зв'язуватися з епітопом, що міститься в молекулі І КРб. м) Амінокислотні залишки позначені стандартними трибуквеними або однобуквеними кодами амінокислот, загальновідомими й загальноприйнятими в даній галузі. При порівнянні
Зо двох амінокислотних послідовностей термін "амінокислотна різниця" позначає інсерції, делеції або заміщення вказаного числа амінокислотних залишків у положенні еталонної послідовності в порівнянні із другою послідовністю. У випадку заміщення(-ь) воно(-и) переважно є консервативним(-и) амінокислотним(-и) заміщенням(-ями), тобто амінокислотний залишок замінений на інший амінокислотний залишок із подібною хімічною структурою, і це не впливає або не впливає суттєво на функцію, активність або інші біологічні властивості поліпептиду.
Подібні консервативні амінокислотні заміщення добре відомі в даній галузі, наприклад, з УМО 98/49185, де консервативні амінокислотні заміщення переважно є заміщеннями, при яких одна амінокислота з нижчеподаних груп (І) - (М) заміщена іншим амінокислотним залишком з тієї ж групи: (І) малі аліфатичні, неполярні або слабополярні залишки: Аа, бег, ТПг, Рго і СУ; (Ії) полярні, негативно заряджені залишки і їх (незаряджені) аміди: Азр, Азп, Сім їі Сп; (ПІ) полярні, позитивно заряджені залишки: Ні, Аг і Гуз; (ІМ) більші аліфатичні, неполярні залишки: Меї,
Ї ем, Пе, маї ї Сув; і (М) ароматичні залишки: Рпеє, Туг і Тгр. Особливо переважними є наступні консервативні амінокислотні заміщення:
Аа на Сіу або на 5ег;
Агд на Гуз;
Ап на Сіп або на Нів;
Авр на Си;
Суз на 5ег;
СіІп на А:п;
Сім на Ар;
Су на Аа або на Рго;
Ні на Азп або на сСіп;
Ме на Гей або на Маї;
Ї еи на Іе або на Маї;
Гуз на Аго, на Сіп або на Си;
Меї на ГІ еи, на Туг або на Пе;
Рпе на Меї, на Г ем або на Туг;
Зег на ТАг;
Тиг на 5ег; бо Тгр на Туг;
Туг на Тгр або на Ре;
Уа! на Іе або на І ем.
Н) Молекула нуклеїнової кислоти або поліпептиду вважається "(в) по суті виділеною (формі)" - наприклад, у порівнянні зі своїм природним біологічним джерелом та/або реакційним середовищем або культуральним середовищем, з якого(-й) її одержують - після відділення цієї молекули від принаймні одного іншого компонента, з яким вона звичайно зв'язана в вказаному джерелі або середовищі, такому, як інша нуклеїнова кислота, інший білок/поліпептид, інший біологічний компонент або макромолекула або принаймні один забруднювач, домішка або другорядний компонент. Зокрема, молекула нуклеїнової кислоти або поліпептиду вважається "по суті виділеною" після того, як її очистили принаймні 2-кратно, зокрема, принаймні 10-кратно, більш конкретно принаймні 100-кратно й до 1000-кратно або більше. Молекула нуклеїнової кислоти або поліпептиду, що знаходиться в "по суті виділеній формі", переважно по суті гомогенна, що визначено за допомогою підходящого методу, такого як підходящий хроматографічний метод, такий як електрофорез у поліакриламідному гелі; о) "Ідентичність послідовностей", напр., двох послідовностей ІЗМО, відображає процентну частку амінокислот, які в цих двох послідовностях збігаються. Її можна розрахувати або визначити за описом в абзаці Її на сторінках 49 і 50 МО 2008/020079. "Подібність послідовностей" відображає процентну частку амінокислот, які або ідентичні, або є консервативними амінокислотними заміщеннями.
Специфічність за мішенню
Поліпептиди згідно з винаходом мають специфічність до І КРБ, у тому розумінні, що вони типово містять ІЗМО, які специфічно зв'язуються з епітопами КРБ. Переважно, поліпептиди згідно з винаходом мають афінність та/або авідність до ЇКР5, особливо ЇКР5 людини, яка принаймні в 10 раз, переважно принаймні в 100 раз, більш переважно принаймні в 1000 раз, ще більш переважно принаймні в 10000 раз, навіть ще більш переважно принаймні в 100000 раз або принаймні 1000000 раз більш сильна, ніж їх афінність та/або авідність до І КРб, особливо
ІАРБб людини (Номер доступу: ОпіРгоїКВ-075581Л КРб НИОМАМ). Найбільш переважно, поліпептиди перехресно не реагують із Г КРб, особливо І КРб людини (див. Приклад 7,1).
Молекули згідно з винаходом будуть зв'язуватися з людськими формами І КРБ, і переважно також з опонентами в інших видів, що мають значення для розробки лікарських засобів, тобто,
І КР5 яванської макаки й миші.
Поліпептиди згідно з винаходом
У самому широкому розумінні, винахід забезпечує нові фармакологічно активні агенти для лікування ракових захворювань. Типові агенти відповідно до винаходу належать до нового класу зв'язувальних молекул, а саме біпаратопні поліпептиди, які містять два або більше ІЗМО, що зв'язуються з КРБ за різними епітопами. Термін "біпаратопний" пояснений вище, таким чином, що біпаратопні молекули можуть бути визначені як молекули, здатні зв'язуватися з | КР5 за двома різними епітопами, що містяться в білку І КРБ.
В одному аспекті, поліпептид згідно з винаходом містить перший І КР5-зв'язувальний домен, і другий І КР5-зв'язувальний домен, де перший домен зв'язує ділянку І КРБ, який відрізняється від ГКР5 ділянки, з якою зв'язується другий домен. Такий І КР5-зв'язувальний домен може представляти собою будь-який домен імуноглобуліну, наприклад, будь-який домен імуноглобуліну, описаного в даній заявці. Переважно, такий І КРо5-зв'язувальний домен представляє собою І5МО.
В одному варіанті здійснення, перший домен блокує УуУпіЗа зв'язувальний сайт в І КРБ, і переважно інгібує М/піЗа-опосередковану транскрипцію цільового гена, та/або де другий домен блокує М/п/1 зв'язувальний сайт в І КРБ, і переважно інгібує МУпиИ -опосередковану транскрипцію цільового гена.
Інакше кажучи, поліпептиди згідно з винаходом можуть включати: - перший ІЗМО, який здатний специфічно зв'язуватися з І КР5 за допомогою епітопу / таким чином, що приводить до інгібування сигнального шляху МУпіЗа, внаслідок цього інгібується
М/піЗа-опосередкована транскрипція цільового гена, і - другий ІЗМО, який здатний специфічно зв'язуватися з І! КР5 за допомогою епітопу / таким чином, що приводить до інгібування сигнального шляху М/пи, внаслідок цього інгібується М/пи - опосередкована транскрипція цільового гена.
Завдяки двом ІЗМО, присутнім у поліпептидах, описаних вище, де два домени зв'язуються з різними епітопами (що мають відношення до передачі сигналу МУпи / УУпіЗа), ці молекули є біпаратопними зв'язувальними молекулами. Цей режим біпаратопного зв'язування схематично показано на Фігурі 1. 60 У зв'язку із цим слід зазначити, що передбачається, що поліпептиди згідно з винаходом можуть зв'язуватися з однією окремою молекулою І КР5 за обома своїми І КР5-зв'язувальними доменами, як показано на Фіг. 1 (режим внутрішньомолекулярного зв'язування). Проте, можуть мати місце й інші режими зв'язування.
На завершення, передбачається, що поліпептиди згідно з винаходом здатні конкурувати з
ОККІ - природним лігандом ГКР5, і перешкоджати передачі сигналів УУпії і М/пІЗа - за зв'язування з КРБ, тим самим інгібуючи сигнальний шлях УМУпиї, а також сигнальний шлях
УупіЗа. Проте, цю теорію також не слід розуміти як таку, що обмежує обсяг винаходу.
Специфічно, даний винахід забезпечує поліпептид, який зв'язується з білком 5, спорідненим до білків сімейства рецептора ліпопротеїнів низької щільності (КРБ), де поліпептид містить
ІБМО, вибраний із групи, яка включає наступні І КР5-зв'язувальні ІЗМО: (І) ІБМО, що має наступні послідовності ділянки, що визначає комплементарність (СОК):
СОоВІ: ТМУМа (5ЕО І МО 1)
СОоР2: АІМуУЗа,ЗТУМАОБУКа (5ЕО ІЮ МО 2)
СОовЗ: БВАТЗТРОВАБОМЗАМОМ (ЗЕО ІО МОЗ), (1) ІБМО, що має наступні СОК послідовності:
СОВ1: ВУАМА (5ЕО ІЮ МО 4)
СОР2: АІТУЗ5авВІЮОМАОБУКа (5ЕО І МО:5)
СОовВЗ: ОВАРНЗТаНнЗатТавзРОТМОМ (5ЕО І МО:6), (ПІ) ІЗМО, що має наступні СОК послідовності:
СОВІ1: ІСАМа (ЗЕО ІЮ МО/7)
СОоР2: АУЗЗаазТУУМУрБУКа (ЗЕО ІЮ МО:8)
СОКЗ: ЕТОРУСРРККОМ (ЗЕО ІО МО 9), і (ІМ) ІЗМО, що має наступні СОК послідовності:
СОН: ІМАМа (5ЕО 10 МО:10)
СОоР2: АУЗЗаазТУУМУрБУКа (ЗЕО ІЮ МО:8)
СОВЗ: ЕТаРУСРРКАОЮМ (5ЕО І МО:9).
Поліпептид згідно із даним винаходом переважно містить перший І5МО (а), вибраний з ІЗМО (І) ї (І), як визначено вище, і другий ІЗМО (б), вибраний з ІЗМО (І) ї (ІМ), як визначено вище. В одному варіанті здійснення, перший ІЗМО представляє собою ІЗМО (І) і другий І5МО
Зо представляє собою ІЗМО (І). Надалі варіанті здійснення, перший ІЗМО представляє собою
ІБМО (І) і другий ІЗМО представляє собою ІЗМО (ІМ). В іншому подальшому варіанті здійснення, перший ІЗМО представляє собою ІЗМО (ІЇ) і другий ІЗМО представляє собою ІЗМО (І). В іншому варіанті здійснення, перший ІЗМО представляє собою ІЗМО (ІІ) і другий ІЗМО представляє собою
ІЗМО (ІМ). Переважно, ІЗМО (І) додатково визначається, що як має послідовність, ідентифіковану як ЗЕО ІЮ МО:11 або 5ЕО ІЮ МО:23, ІБМО, (ІЇ) додатково визначається, що як має послідовність, ідентифіковану як ЗЕО ІЮ МО:12, ІЗМО (Ії) додатково визначається, що як має послідовність, ідентифіковану як 5ЕО ІЮ МО:13 або 5ЕО ІЮ МО:22, та/або ІЗМО (ІМ) додатково визначається, що як має послідовність, ідентифіковану як ЗЕО ІЮ МО:14.
Використання термінів "перший" і "другий" по відношенню до таких ІЗМО призначене тільки для позначення того, що ці домени є різними доменами, тому що вони містить різні СОК послідовності й будуть зв'язуватися з різними епітопами. Однак дані терміни не слід розуміти як такі, що позначають точний порядок або послідовність доменів у такому поліпептидному ланцюзі. Інакше кажучи, вищевказані ІЗМО можуть бути розташовані або в наступному порядку (ОЛІЇ) - «ПОХІМ) або в наступному порядку (ПОЛІМ) - (ІІ) у межах такого поліпептиду згідно з винаходом.
ІЗМО типово складаються по суті із чотирьох каркасних ділянок (ЕК1-ЕКА, відповідно) і трьох ділянок, що визначають комплементарність (СОМК1-СОКЗ, відповідно). Щоб знаходитися в одному поліпептиді або поліпептидному ланцюзі, вказаний перший і вказаний другий ІЗМО повинні бути ковалентно зв'язані, або прямо або через лінкерний пептид (наприклад, лінкерну послідовність, що має походження із шарнірної ділянки важкого ланцюга антитіла, полі- аланінової лінкерної послідовності, сІу/5ег лінкерів різної довжини або подібні).
Таким чином, загальна структура молекул згідно з винаходом також може бути представлена в такий спосіб:
ЕВ(а)1-СОА(а)1-ЕК(а)2-СОВ(а)2-ЕВ(а)3-СОВ(а)3-ЕН(а)ї - (лінкерний пептид)! - ЕР(6)1-
СОР(6)1-ЕК(6)2-СОК(6)2-ЕК(6)3-СОК(6)3-ЕК(6)4 де
ЕК(а) позначає каркасну ділянку першого ІЗМО,
ЕК) позначає каркасну ділянку другого ІЗМО,
СОКкса) позначає СОК першого ІЗМО, 60 СОР(б) позначає СОЕК другого ІЗМО,
Ілінкерний пептиді позначає лінкерний пептид, який необов'язково може бути присутнім, переважно, де СОК мають послідовності, як вказано вище (тобто, СОК з (а) можуть представляти собою СОР з (І) або (Ії) ії СОК з (б) можуть представляти собою СОБК з (ІІ) або (М).
Також слід прийняти в увагу, що (а) і (б) можуть мінятися місцями, тобто, що молекули, що мають загальну структуру
ЕР(6)1-СОК(6)1-ЕК(6)2-СОК(6)2-ЕК(6)3-СОК(6)3-ЕК(6)4 - (лінкерний пептид)! - ЕВ(а)1-
СОА(а-ЕВ(а)2-СОНВ(а)2-ЕН(а)з3-СОВ(а)3-ЕВ(а)д також можуть охоплюватися даним винаходом.
Лінкерний пептид може містити амінокислотну послідовність, наприклад, що має довжину 9 або більше амінокислот, переважно принаймні 17 амінокислот, таку як приблизно 20-40 амінокислот. Лінкерна послідовність може представляти собою послідовність, що зустрічається у природі, або послідовність, що не зустрічається у природі. Типові лінкерні послідовності включають, але не обмежуючись тільки ними, лінкерні послідовності, що мають походження із шарнірної ділянки важких ланцюгів антитіл, полі-аланінові лінкерні послідовності, і (їу/зЗег лінкери різної довжини (наприклад, (діухбоегу)»; лінкери, такі як (діу«5ег)з, (діу«5ег)», (діу«5ег)», (діузвег)з, (аїуззег)5, (діузвег)?, (діузбег»)з, (діузвег»)», і (дІузвегг)?).
Переважно, поліпептид додатково містить альбумін-зв'язувальний ІЗМО (наприклад, третій
ІБМО), переважно й де альбумін-зв'язувальний ІЗМО ковалентно зв'язує сегмент поліпептиду, де сегмент містить або складається з першого ІЗМО (наприклад, ІЗМО (І) або (Ії), як визначено вище), до сегмента поліпептиду, де сегмент містить або складається із другий ІЗМО (наприклад,
ІБМО (І) або (ІМ), як визначено вище). Інакше кажучи, лінкерний пептид може ковалентно зв'язувати вказаний перший ІЗМО із вказаним другим ІЗМО, де вказаний лінкерний пептид переважно містить або складається з додаткового ІЗМО, більш переважно альбумін- зв'язувальний ІЗМО, особливо альбумін-зв'язувальний ІЗМО, як визначено в даній заявці.
У деяких варіантах здійснення лінкерний пептид містить або складається із третього домену, такого як, наприклад, альбумінзв'язувальний ІЗМО, такий як АЇБ11 домен, що містить наступні
Сов:
СОН(АЇІВ11)1: БРОаМ5 (- 5ЕО І МО:15)
Зо СОН(АЇІВ11)2: ІЗ БОаБОТІ МАОБУКа (- 5ЕО ІЮ МО:16)
СОН(АЇІВІ11)3: СИ5І ЗА (- 5ЕО ІЮ МО:17)
Це приводить до групи поліпептидів згідно з винаходом, що мають наступну загальну структуру:
ЕВ(а)1-СОНА(а)1-ЕК(а)2-СОВ(а)2-ЕВ(а)3-СОВ(а)3-ЕВ(а)4 - (лінкерний пептиді| - ЕВ(АЇІБ11)1-
СОН(АЇІВ11)1-ЕВ(АІЬ11)2-СОВ(АЇЬТ1)2-ЕВ(АІЬ11)3-СОВ(АЬТ1)3-ЕВ(АЇЬТ1)4 - (лінкерний пептиді -
ЕР(6)1-СОК(6)1-ЕК(6)2-СОК(6)2-ЕК(6)3-СОМК(6)3-ЕК(6)4, переважно, де СОК мають послідовності, як вказано вище (тобто, СОК з (а) можуть представляти собою СОК з (І) або (ІЇ) і
СОК з (б) можуть представляти собою СОК з (ІІІ) або (ІМ).
Знову ж таки, порядок трьох ІЗМО (а), (6) і АІБ11 не закріплений, навпаки, поліпептиди з наступним порядком вищевказаних доменів у наступному порядку: (6) - АІНТ1 - (а) теж охоплюються даним винаходом.
Крім того, поліпептиди, що мають АЇБ11 домен на М- або С-кінцевій ділянці поліпептиду (наприклад, АЇІБ11 - (а) - (6), АІБ11 - (б) - (а), (а) - (6) - АІБ11, або (б) - (а) - АІБ11) також будуть охоплюватися даним винаходом.
У трьох переважних варіантах здійснення, поліпептиди згідно з винаходом включають ІЗМО, визначені в такий спосіб:
Перший переважний варіант здійснення: Поліпептиди, що містять перший ІЗМО, що має наступні СОК послідовності:
СОоВІ: ТМУМа (5ЕО І МО 1)
СОоР2: АІЗМИЗСИазТУМАрБУКа (5ЕО ІЮ МО 2)
СОовЗ: БВАТЗТРОВАБОМЗАМОМ (ЗЕО ІО МОЗ), і другий ІЗМО, що має наступні СОК послідовності:
СОН: ІМАМа (5ЕО 10 МО:10)
СОоР2: АУЗЗаазТУУМУрБУКа (ЗЕО ІЮ МО:8)
СОВЗ: ЕТаРУСРРКАОЮМ (5ЕО І МО:9).
Другий переважний варіант здійснення: Поліпептиди, що містять перший ІЗМО, що має наступні СОК послідовності:
СОВ1: ВУАМА (5ЕО ІЮ МО 4) 60 СОР2: АІТУЗ5авВІЮОМАОБУКа (5ЕО І МО:5)
СоВяЗ: ОВАРАЗТОа нБИатавзРБЗТМОМ (5ЕО І МО:6). і другий ІЗМО, що має наступні СОК послідовності:
СОН: ІСАМОИ (5ЕО І МО:7)
СОоР2: АУЗЗаазТУУМУрБУКа (ЗЕО ІЮ МО:8)
СОВЗ: ЕТаРУСРРКАОЮМ (5ЕО І МО:9)
Третій переважний варіант здійснення: Поліпептиди, що містять перший ІЗМО, що має наступні СОК послідовності:
СОоВІ: ТМУМа (5ЕО І МО 1)
СОоР2: АІМуУЗа,ЗТУМАОБУКа (5ЕО ІЮ МО 2)
СОовЗ: БВаТЗТРОВАБОМ5АМОМ (ЗЕО ІЮ МОЗ) і другий ІЗМО, що має наступні СОК послідовності:
СОН: ІСАМОИ (5ЕО І МО:7)
СОоР2: АУЗЗаазТУУМУрБУКа (ЗЕО ІЮ МО:8)
СОВЗ: ЕТаРУСРРКАОЮМ (5ЕО І МО:9).
Зрозуміло, вищевикладені варіанти - тобто, що необов'язково включають лінкерні пептиди (наприклад, лінкерну послідовність, що має походження із шарнірної ділянки важких ланцюгів антитіл, полі-аланінові лінкерні послідовності, Сіу/Зег лінкери різної довжини або подібні) та/або інші домени, що особливо включають АЇБ11 домен, з різним порядком ІЗМО - також будуть застосовні до цих трьох переважних варіантів здійснення.
В особливо переважному варіанті здійснення, альбумінзв'язувальний ІЗМО (наприклад,
АІЬ11) розташовано між двома І КР5-зв'язувальними ІЗМО (ІЗМО (а) і (6)). Тому, такі переважні поліпептиди можуть мати структуру (а) - АЇБ11 - (б) або (6) - АІБІ1 - (а). Специфічно, альбумінзв'язувальний ІЗМО (наприклад, АЇБ11) може бути ковалентно зв'язаний з, або прямо або через лінкерний пептид (наприклад, лінкерну послідовність, що має походження із шарнірної ділянки важких ланцюгів антитіл, полі-аланінові лінкерні послідовності, сїу/зЗег лінкери різної довжини або подібні) І КР5-зв'язувальні ІЄМО домени (а) і (б) з них М- ї С- кінцевіми ділянками(наприклад, М-кінцева ділянка альбумінзв'язувального домену зв'язана з
ІБМО (а) і С-кінцева ділянка альбумінзв'язувального домену зв'язана з ІЗМО (б) або навпаки, переважно, де ІЗМО містять СОК або повнорозмірні ІЗМО послідовності, як вказано вище
Зо (тобто, СОМЛЗМО послідовності з (а) можуть представляти собою СОК/ЛЗМО послідовності з (І) або (І) ї СОК/Л5МО послідовності з (б) можуть представляти собою СОБ/Л5МО послідовності з (І) або (ІМ)).
Три особливо переважні варіанти здійснення можна представити в такий спосіб:
Перший особливо переважний варіант здійснення: Поліпептиди, що містять перший (І КР5Б- зв'язувальний) ІЗМО, що має наступні СОК послідовності:
СОоВІ: ТМУМа (5ЕО І МО 1)
СОоР2: АІМуУЗа,ЗТУМАОБУКа (5ЕО ІЮ МО 2)
СОовЗ: БВАТЗТРОВНАБОМЗАМОМ (ЗЕО ІЮ МОЗ) альбумінзв'язувальний ІЗМО, що має наступні СОРЕ. послідовності:
СОН: 5РОамМ5 (- 5ЕО ІЮ МО 15)
Сов: 5ІЗОБОЗОТІ МАОБУКа (- 5ЕО ІЮ МО:16)
СовВЗ: аавбІ ЗА (- 5ЕО ІЮ МО:17); і другий (ГКР5-зв'язувальний) ІЗМО, що має наступні СОК послідовності:
СОН: ІМАМа (5ЕО 10 МО:10)
СОоР2: АУЗЗаазТУУМУрБУКа (ЗЕО ІЮ МО:8)
СОВЗ: ЕТаОРУСРРКАОЮМ (5ЕО ІО МО:9); або у викладеному порядку, або зі зміненим порядком вищевказаних доменів.
Другий особливо переважний варіант здійснення: Поліпептиди, що містять перший (І КР5Б- зв'язувальний) ІЗМО, що має наступні СОК послідовності:
СОВ1: ВУАМА (5ЕО ІЮ МО 4)
СОР2: АІТУЗ5авВІЮОМАОБУКа (5ЕО І МО:5)
СояЗ: ОВАРАНЗТО нБИатавзРБЗМТМОМ (5ЕО І МО:6); альбумінзв'язувальний ІЗМО, що має наступні СОК послідовності:
СОН: 5РОамМ5 (- 5ЕО ІЮ МО 15)
Сов: 5ІЗОБОЗОТІ МАОБУКа (- 5ЕО ІЮ МО:16)
СовВЗ: аавбІ ЗА (- 5ЕО ІЮ МО:17); і другий (ГКР5-зв'язувальний) ІЗМО, що має наступні СОК послідовності:
СОН: ІСАМОИ (5ЕО І МО:7)
СОоР2: АУЗЗаазТУУМУрБУКа (ЗЕО ІЮ МО:8) (510) СОВЗ: ЕТаРУСРРКАОЮМ (5ЕО ІО МО:9);
або у викладеному порядку, або зі зміненим порядком вищевказаних доменів.
Третій особливо переважний варіант здійснення: Поліпептиди, що містять перший (І КР5Б- зв'язувальний) ІЗМО, що має наступні СОК послідовності:
СОоВІ: ТМУМа (5ЕО І МО 1)
СОоР2: АІМуУЗа,ЗТУМАОБУКа (5ЕО ІЮ МО 2)
СОовЗ: БВАТЗТРОВАБОМЗАМОМ (ЗЕО ІО МО:3); альбумінзв'язувальний ІЗМО, що має наступні СОРЕ. послідовності:
СОН: 5РОамМ5 (- 5ЕО ІЮ МО 15)
Сов: 5ІЗОБОЗОТІ МАОБУКа (- 5ЕО ІЮ МО:16)
СовВЗ: аавбІ ЗА (- 5ЕО ІЮ МО:17); і другий (ГКР5-зв'язувальний) ІЗМО, що має наступні СОК послідовності:
СОН: ІСАМОИ (5ЕО І МО:7)
СОоР2: АУЗЗаазТУУУЮрБУКа (5ЕО ІЮО МО:8)
СОВЗ: ЕТаРУСРРКАОЮМ (5ЕО ІО МО:9); або у викладеному порядку, або зі зміненим порядком вищевказаних доменів.
СОК послідовності, вказані вище, зведені в Таблицях ІА, ІВ, і ІС:
Таблиця ІА
СОК послідовності ІЗМО, що перешкоджають передачі сигналу М/піЗа ши ЕО129097А08 ЕО129093А02 , ВУАМА
Сов ТУУМа (5ЕО ІЮ МО) (5ЕО ІО МО) сово АІБМуБасеТУМАрУКа (5ЕБЕО Ір АІПУЗЗавВІЮМАОрБУКОа
МО:2) (ЗЕО І МО 5) сов зНато5ТРОВАБОУЗАМОУ рААРАЗТанЗатТтавРБТУрУ (ЗЕО ІЮ МОЗ) (ЗЕО ІЮ МО:б)
Таблиця ІВ
СОК послідовності ІЗМО, що перешкоджають передачі сигналу УУпИ г012904 г012904 6СТО(ЕТА, М32С) 6С10 о ІМАМО
Сов ІСАМа (5ЕО ІЮ МО:7) (5ЕО 10 МО-10) сово дуззаазтТУУУрзУкКа дуззаса!зтТУУУрзУКа (ЗЕО ІЮ МО:8) (ЗЕО ІО МО: 8) сов ЕТаРМаРРКАЮУ ЕТаРМаРРКАОУ (ЗЕО І МО:9) (ЗЕО ІЮ МОС9)
Таблиця ІС
СОК послідовності ІЗМО, що зв'язуються із сироватковим альбуміном (АЇБ11 домен) нн АВТ домен зЕамМ5
Сон! (5ЕО І МО-15) зіБаБавОТІ МАОБУКОа
Сонг (ВЕО1О МО 16) саві5вА
СсонЗ (6Е0 10 МО-17)
Додатково до послідовностей СОК, як вказано вище, ІЗМО, що містяться в поліпептидах згідно з винаходом, включають послідовності каркасних ділянок (ЕК) імуноглобуліну. Ці послідовності переважно не є імуногенними для людей, і, отже, переважно представляють собою людські або гуманізовані ЕК послідовності. Підходящі людські або гуманізовані ЕК послідовності відомі в даній галузі техніки. Специфічно переважні ЕК послідовності можна знайти в показані нижче варіантах здійснення, що описують повні ЗМО, а отже, і СОК послідовності, а також ЕЕ послідовності.
Відповідно до більш специфічного варіанта здійснення, поліпептиди згідно з винаходом містять ІЗМО (наприклад, ІЗМО, як визначено за допомогою СОК послідовностей, перерахованих у Таблицях ІА-ІС і утворюючих ІЗМО (а), (6), або (в), як вказано у варіантах здійснення, представлених вище), які представляють собою МНН домени, і переважно гуманізовані МНН домени. Специфічно, поліпептиди, описані в даній заявці, містять перший
ІБМО (а), який містить СОМ послідовності з (І) або (Ії) ії другий ІЗМО (б) який містить СОК послідовності з (ІІІ) або (ІМ), і третій ІЗМО, який представляє собою альбумінзв'язувальний ІЗМО (наприклад, АЇБ11), ІЗМО якого представляють собою УНН домени, і переважно гуманізовані
МНН домени.
Відповідно до ще більш специфічного варіанта здійснення, поліпептиди згідно з винаходом включають перший ІЗМО (а), вибраний із групи, яка включає ІЗМО (І) і (ІІ), які мають наступні послідовності: ()
АМОЇ МЕЗО МОРОСБІ ВІ БСААБаВТеЕЗТУУМОМ ЕВОАРОКЕВЕЕМААІВМУЗсСОТУМАО5
УКОаВЕТІЗАОМЗКМТУМ ОММ5І АРЕОТАМУУСААЗНатЗТРОЬВАЗОУЗАУЮМУМССОС,ТІ МТУ55 (ЗЕО ІО МО:11), або
ЕМОЇ МЕЗИОаСИОЇ МОРОСБІ ВІ БСМАБОВТЕЗТУУМОМЕВОАРОКЕВЕЕМААІЗМУ ОЗ УМА
УКаВЕТІЗАЮОМЗКМТУМІ ОММ5І АРЕОТАМУУСААВВНаИатоТРОВАБОУЗАУОММУСОСТІ МТУ55 (ЗЕО ІО МО:23), і (1)
ЕМОЇ МЕССІ МОРОСБІ ВІ БСААБаї ТЕЕЄЗВМАМАМЕВОАРОКЕНЕЕМААІТ М 55 ВІОМАОБУКИ
Зо ВЕТІБНОМЗКМТУМ ОММ5І АРЕОТАМУМСААВААРєРАЗТОНЗОаТа5РЗТУЮМУМаДОС,тТІ МТГМ55А (ЗЕО ІО МО: 12), і другий ІЗМО (б), вибраний із групи, яка включає ІЗМО (І) ї (ІМ), які мають наступні послідовності: (1)
АМОЇ МЕЗИОСИОЇ МОРОСБІ ВІ БСААБаБІЕВІСАМОМ УВОАРОКОВЕЇ МААУ5ЗОСЗТУУУроБУКО В
ЕТІЗАОМЗКМ УМ ОММЗІАРЕОТАМУМСМАЕТаРМаРРКАОМУМ ОСТІ МТУ (5ЕО І МО:13), або
ЕМОЇ МЕЗИОСИОЇ МОРОСБІ ВІ БСААБаБІРВІСАМОМ УВОАРОКОВЕ
МАДУЗООССаВТУУМОБУКОВЕТІЗНОМЗКМТММІ ОММ5І АВРЕОТАМУМУ
МКЕТОРУСРРККОМУУСОСТІ МТУ55А (5ЕО ІЮ МО:22), і (М)
ЕМОЇ МЕС, МОРОСБІ ВІ БСААЗОа5ІЕВІМАМЕО М МВОАРОКОВЕЇ МАДУЗЗ,ваЗзТтУУрзіУкав
ЕТІЗВОМЗКМТУМІ ОММЗІАРЕОТАМУМСМАЕТаРМаРРКАОМУМ ОСТІ МТУ55 (5ЕО ІЮ МО:14).
Переважними варіантами здійснення є поліпептиди, що містять - перший ІЗМО, що має амінокислотну послідовність, як показано в ЗЕО ІЮ МО:23 і другий
ІБМО, що має амінокислотну послідовність, як показано в ЗЕО ІЮ МО:14; або - перший ІЗМО, що має амінокислотну послідовність, як показано в ЗЕО ІЮ МО:12 і другий
ІБМО, що має амінокислотну послідовність, як показано в ЗЕО ІЮ МО:13; або - перший ІЗМО, що має амінокислотну послідовність, як показано в ЗЕО ІЮ МО:11 і другий
БО ІБМО, що має амінокислотну послідовність, як показано в ЗЕО ІЮО МО:22.
Таким чином, вищеописані варіанти здійснення можна схематично зобразити як івма(а) - (лінкерний пептиді - ізма(б), де "ізма" позначає відповідний ІЗМО, і де інші визначення й варіанти залишаються такими ж, як вказано вище, як вказано вище, особливо відносно наявності необов'язкових лінкерних пептидів та/або додаткових доменів, особливо АЇБ11 домену, а також відносно різних порядків
ІБМО.
Специфічно, альбумінзв'язувальний ІЗМО (наприклад, АЇБ11) може бути ковалентно зв'язаний з, або прямо або через лінкерний пептид (наприклад, лінкерну послідовність, що має походження із шарнірної ділянки важких ланцюгів антитіл, полі-аланінові лінкерні послідовності, 60 Сіу/Зег лінкери різної довжини або подібні) І КР5-зв'язувальні ІЗМО домени (а) і (6) з них М- і С-
кінцевими ділянками; наприклад, М-кінцева ділянка альбумінзв'язувального домену зв'язана через лінкерний пептид з ІЗМО (а) і С-кінцева ділянка альбумінзв'язувального домену зв'язана через лінкерний пептид з ІЗМО (б) або навпаки, переважно, де ІЗМО містять повнорозмірні ІЗМО послідовності, як вказано вище (тобто, ІЗМО послідовності з (а) можуть представляти собою
ІЗМО послідовності з (І) або (ІІ) і ІМО послідовності з (б) можуть представляти собою ІЗМО послідовності з (ІІІ) або (ІМ), як визначено вище).
У деяких варіантах здійснення, перший ІЗМО зв'язаний з альбумінзв'язувальним ІЗМО за допомогою лінкерного пептиду й другий ІЗМО зв'язаний прямо з альбумінзв'язувальним ІЗМО. У деяких варіантах здійснення, другий ІЗМО зв'язаний з альбумінзв'язувальним ІЗМО за допомогою лінкерного пептиду й перший ІЗМО зв'язаний прямо з альбумінзв'язувальним ІЗМО.
У деяких варіантах здійснення, обидва перший і другий ІЗМО зв'язані з альбумінзв'язувальним
ІЗМО за допомогою лінкерного пептиду, відповідно.
Відповідно до конкретних варіантів здійснення винаходу, вищевказані поліпептиди додатково можуть включати компонент, що збільшує період напівжиття, де вказаний компонент, що збільшує період напівжиття, ковалентно зв'язаний із вказаним поліпептидом і необов'язково, вибраний із групи, яка включає альбумінзв'язувальний компонент, такий як альбумінзв'язувальний пептид або альбумінзв'язувальний домен імуноглобуліну, переважно альбумінзв'язувальний ІЗМО, більш переважно АЇБ11 домен, трансферинзв'язувальний компонент, такий як анти-трансфериновий домен імуноглобуліну, молекула поліеєтиленгліколю, сироватковий альбумін, переважно сироватковий альбумін людини, і фрагмент (людського) сироваткового альбуміну.
Послідовність вищевказаного АЇБ11 ІЗБМО є наступною:
ЕМОЇ МЕЗО МОРОМ5БІ ВІ БСААЗИаЕТЕЗЗеИМОУМУАОАРОКаї ЕМ/УЗБІЗОВОБЗОТІ Ар
УКанвВЕтІЗАОМАКТТІ М ОММ5І АРЕОТАМУУСТІ саві знаЗО,ТІ УТУ55 (- АІЬ11 домен; - ЗЕО ІЮ МО: 21)
Подальші приклади ІЗМО, що зв'язуються із сироватковим альбуміном людини, відомі в даній галузі техніки, і описані більш докладно наприклад, у міжнародних патентних публікаціях
УМО 2006/122787 і УМО 2008/028977. Інші пептиди, що зв'язуються із сироватковим альбуміном
Зо людини, описані, наприклад, в УМО 2008/068280, УМО 2009/1127691, і УМО 2011/095545.
Таким чином, трьома переважними конкретними варіантами здійснення винаходу є:
Перший переважний конкретний варіант здійснення: Поліпептиди, що містять - перший (І КР5Б-зв'язувальний) ІЗМО, що має амінокислотну послідовність, як показано в
ЗЕО ІЮ МО:23; - альбумінзв'язувальний ІЗМО, що має амінокислотну послідовність, як показано в ЗЕО ІЮ
МО:21; - другий (ГКР5-зв'язувальний) ІЗМО, що має амінокислотну послідовність, як показано в хХЕО
ІО МО:14; або у викладеному порядку, або зі зміненим порядком вищевказаних трьох доменів.
Другий переважний конкретний варіант здійснення: Поліпептиди, що містять - перший (І КР5Б-зв'язувальний) ІЗМО, що має амінокислотну послідовність, як показано в
ЗЕО ІЮ МО:12; - альбумінзв'язувальний ІЗМО, що має амінокислотну послідовність, як показано в ЗЕО ІЮ
МО:21; - другий (ГКР5-зв'язувальний) ІЗМО, що має амінокислотну послідовність, як показано в ЗЕО
ІО МО:13; або у викладеному порядку, або зі зміненим порядком вищевказаних трьох доменів.
Третій переважний конкретний варіант здійснення: Поліпептиди, що містять - перший (І КР5Б-зв'язувальний) ІЗМО, що має амінокислотну послідовність, як показано в
ЗЕО ІЮ МО:11; - альбумінзв'язувальний ІЗМО, що має амінокислотну послідовність, як показано в 5ЕО ІЮ
МО:21; - другий (ГКР5-зв'язувальний) ІЗМО, що має амінокислотну послідовність, як показано в ЗЕО
ІО МО:22; або у викладеному порядку, або зі зміненим порядком вищевказаних трьох доменів.
У ще більш переважних конкретних варіантах здійснення, альбумінзв'язувальний. ІЗМО розташовано між двома І КР5-зв'язувальними ІЗМО.
Послідовності ІЗМО, вказаних вище, зведені в Таблицях ПА, ПІВ, і ПС:
Таблиця ПА
Послідовності ІЗМО, що перешкоджають передачі сигналу УУпіЗа
МНН
ВЕТІЗВ
АМОЇ МЕБОС МЕВОА АІБМУ5 МКМ знат5 Іжмсао
Е0129097А08| І МОРОСОЇ. ТУУМС /РСКЕВ ват УМО ТРБОВА ат (ЕТА, М2ЗА) |ВІ 5САдБаВ ФЕО ІО ЕЕМА УХА ММ5І А заУ5 УМ
ЗЕО ІОЇ ТЕ5 Мо) (5ЕО І зука РЕОТА ву 55
МО:11 (ЗЕО Тв в МО 25) (ЗЕО 0 МУУСАА | |(ЗЕОЮ |(5ЗЕОЮ
МО:24) ' МО:2) (ЗЕО ІЮ МО:3) МО:27)
МО:26
ВЕТІ5 вОоМ5
ЕМОЇ МЕБОС АІТМІ5 ОвАРА
ГО129093А02 | СІМОРССЗІ. МЕН всвро 0 |КМТУ тоне (боб
ВУАМА |АРОК М ОМ ТІ МТ
ЗЕО ІОЇ ВІ 5СААБОЇ рхАр атОаБР
Я (ЗЕО ІБ ЕВЕЕМА М5І ВР УВА
МО:12 ТЕ5 й зука ЗТУОУ
МО) |(ЗЕО (р ЕОТАМ (ЗЕО ІЮ (5ЕО ІО МО 25) (БО І УХУСАА (БЕ І МО:29)
МО:28) МО:5) (ВЕО1О МО:6)
МО:26
ВЕТІ5 вОоМ5
ЕМОЇ МЕЗО АІБМУ5 КМТМ знать
МЕВО жа,ора го129097до8| ССІМОРС | Туумо | АРОК паз пом ТРА |путу а51 815202 УХА М5І В захв (ЗЕО І (ЗЕО ІОЕВЕЕМА 55
МО" 23) МАБОВТЕ5 МОЯ) | 8ЕО СО зука РЕОТ урх (ОО і (ЗЕО Тв вн МО 25) (ЗЕО 0 АУХУ (ЗЕОІЮ МО 27)
МО:30) ' МО:2) САА МО:3) ' (5ЕО І
МО:26
Таблиця ІІВ
Послідовності ІБМО, що перешкоджають передачі сигналу М/пії
МНН
АМОГ У ВЕТІЗ
ЕВОС ОМ сі о МУВО фАУ85 0 КМТ ЕТОР МсОСс гОо12904 АРОК аа5тТ М ОМ раб ІХМАМА ХаРР ТІ МТ 6С10 ОВЕ айв) М5І ВР
ІНІ5 (ЗЕО ІО КАбУ У (ЕТА, МЗ3З2О) й ЇМА зуУука ЕОТА
САА5 МО:7) (ЗЕО 10 (5ЕОІЮ 5ЗЕО 9 сеІєВ (ЗЕОІЮ (ЗЕО!ІЮ |мУУс Мо) МО)
МОЗ МО:32) МО:8) МА і і (5ЕО І ЕОІЮ
МО: 31)
МО:ЗЗ3
Продовження таблиці ІВ
ЕМО. ВЕТІЗ
МЕЗО вом вам МмУвОо АУБ КМТ роїт2ео4 (ОРОС | дм (АРОК сот МОМ и не 6С10 ЗІ ВІ ОВЕЇ. дв) МО В 5ЕО юеСАА ОБО Од 5ука 0 |РЕОТ квоУу уУ55 ! МО:10) (ЗЕО 0 (ЗЕО І
МО:14 заві (ЗЕО Ір (ЗЕОІЮ |АМУУ МО") МО 27)
ЕВ МО:З2) МО:8) СсМА І І (ЗЕО І (ЗЕО ІЮ
МО:34 МО:ЗЗ3
ЕМО М ВЕТІ
ЕЗОС ЗзвОМ
Бої2904 |СІМО просо 0 |вКМт ЕТаР |МсОС 6С10 (М320) | РОС ІСАМО ОВЕН. УУУр дк) МОаРР |ТІМТ
ЗЕО ІФ ВІ 5 (5ЗЕО І МА 5УКС МБ. КВОМ |М5БА
МО:22 САдА5 МО:7) (5ЕО (БО о ВРЕО (ЗЕО І (ЗЕО І аІЕВ МО:32) МОВ) ТАМУ МО:9) МО:29) (ЗЕО І І УСМА
ІО МО :34 ЗЕО І МОЗ
Таблиця ПС
Послідовність ІЗМО, що зв'язуються із сироватковим альбуміном (АЇБ11 домен)
УНН
ЗЕО І ЕВ!І Сов ЕН2 сов2 ЕВНЗ СсовЗ ЕН4
МО:
ЕМОГМ ВЕТІЗ
ЕЗОС ЗІЗа ВОМА сі хо лрою 805 КпіМ
АІр11 РаМ5 зЕамМ5 рт ГОМ савб5і5А
ЕО (іВІеС (БО СОС 0 АОБМ ОО 5ІВРЕ (ЗО СО ЗБО1О МО 8)
МО:21 |ААбОа МО:15) (5ЕО І ка ОТАМУ МО:17) І
ЕТЕ5 МОЗ) (5БЕО ПО мсТтІ (ЗЕО ІО І МО:16) (ЗЕО ІЮ
МО:35 МО:37
В одному аспекті, даний винахід стосується поліпептиду, який зв'язується з КРБ, що містить ІЗМО, який конкурує за зв'язування з І КРБ з еталонним ІЗ5МО, де еталонний ІЗМО має послідовність, ідентифіковану в ЗЕО ІЮ МО: 11, 12, 13, 14, 22 або 23. Переважно ІЗМО блокує
М/ПИ або УуУпіЗа зв'язувальний сайт в ЕР. Особливо ІЗМО інгібує УУпи -опосередковану або
М/піЗа-опосередковану транскрипцію цільового гена
В іншому аспекті, даний винахід стосується поліпептиду, який зв'язується з І КРБ, що містить перший ІЗМО, який конкурує за зв'язування з |/КР5 з першим еталонним ІЗМО, де перший еталонний ІЗМО має послідовність, ідентифіковану в 5ХЕО ІЮО МО: 11, 23 або 12, і другий ІЗМО, який конкурує за зв'язування з І КР5 із другим еталонним ІЗМО, де другий еталонний ІЗМО має послідовність, ідентифіковану в ЗЕО ІЮ МО: 13, 22 або 14. Переважно перший ІЗМО блокує
МуУпіЗа зв'язувальний сайт в І КР5, особливо, інгібує УМУпіЗза опосередковану транскрипцію цільового гена. Альтернативно, або додатково до цього, другий ІЗМО може блокувати М/пи зв'язувальний сайт в І КР5, особливо інгібувати МУпи -опосередковану транскрипцію цільового гена.
У даній заявці, вираз "ІЗМО, який конкурує за зв'язування з антигеном з еталонним ІЗМО" (або подібні вирази) включає всі ІЗМО, які зв'язуються з тим же епітопом, що й еталонний ІЗМО або з епітопом, які перекривається з епітопом еталонного ІЗМО і інгібує зв'язування еталонного
ІБМО з антигеном (тобто, І КРБ) до певного ступеня. Переважно, такі ІЗМО зв'язуються з тим же епітопом, що й еталонний ІЗМО та/або по суті повністю інгібують зв'язування еталонного ІЗМО (таких як будь-який із вказаних вище) з антигеном (тобто, І КР5).Незалежно від того, чи буде певний ІЗМО представляти собою ІЗМО, який конкурує за зв'язування з еталонним ІЗМО, легко можна тестувати кваліфікованим фахівцем у даній галузі техніки, якщо він має знання в галузі еталонного ІЗМО і антигену, навіть без знань епітопу антигену, з яким зв'язується еталонний
ІБМО, шляхом здійснення будь-якого з аналізів конкурентного зв'язування, відомих у даній галузі техніки. Такі аналізи конкурентного зв'язування добре відомі в даній галузі техніки. Наприклад, кваліфікований фахівець у даній галузі техніки може інкубувати антиген з міченим еталонним
ІЗМО ї може порівнювати кількість антигензв'язаного міченого еталонного ІЗМО з кількістю міченого еталонного ІЗМО, який зв'язується з антигеном при попередньому інкубуванні з тестованим ІЗМО. Якщо ця остання кількість зменшена (тобто, оскільки попереднє інкубування надає можливість тестованому ІЗМО блокувати зв'язувальні сайти, які вони спільно використовують із еталонним ІЗМО), то можна зробити висновок про те, що тестований ІЗМО конкурує за зв'язування з антигеном з еталонним ІЗМО.
Як установлено вище, (принаймні два) ІЗМО, присутні в поліпептиді згідно з винаходом, можуть бути з'єднано один з одним прямо, без використання лінкера, або ж через лінкер. Лінкер переважно представляє собою лінкерний пептид і, відповідно до винаходу, може бути підібраний таким чином, щоб уможливити зв'язування принаймні двох різні ІЗМО з кожним з їх цільових епітопів.
Підходящі лінкери іпіег аа залежать від епітопів і, специфічно, від відстані між епітопами на цільових молекулах, з якими будуть зв'язуватися ІЗМО. Фахівцеві це буде зрозуміло на підставі даного опису, необов'язково - після деякого обмеженого кількості рутинних експериментів.
Таким чином, підходящі лінкери можуть містити амінокислотну послідовність, наприклад, що має довжину 9 або більше амінокислот, переважно принаймні 17 амінокислот, наприклад, приблизно 20-40 амінокислот. Лінкерна послідовність може представляти собою послідовність, що зустрічається у природі, або послідовність, що не зустрічається у природі. У випадку застосування для терапевтичних цілей, лінкер переважно не є імуногенним для суб'єкта, якому вводять поліпептид згідно з винаходом.
Однією із придатних груп лінкерних послідовностей є лінкери важких ланцюгів, що мають походження із шарнірної ділянки, антитіл, як описано в УМО 1996/34103 і УМО 1994/04678.
Іншими прикладами є полі-аланінові лінкерні послідовності, такі як АІа-Аа-Апа.
Зо Подальшими переважними прикладами лінкерних послідовностей є ОСіу/5ег лінкери різної довжини, такі як (діухбегу); лінкери, включаючи наприклад, (діу«5етг)з, (діуг«5ег)»5, (аіу«5ег);, (діузвег)з, (аІуззег)5, (діузвег)?, (діузбег»г)з, (діузвег»)», і (дІузвег»)».
Альтернативно, або додатково до поліпептидного лінкеру, принаймні два ІЗМО, присутні у поліпептиді згідно з винаходом, можуть бути з'єднані один з одним за допомогою іншого компонента, такого як інший поліпептид, який, у переважному, але необмежуючому варіанті здійснення, може представляти собою додатковий ІЗМО, як уже було описано вище. Такий компонент може бути або по суті неакстивним або може мати біологічний ефект, такий як поліпшення бажаних властивостей поліпептиду або може надавати поліпептиду одне або кілька бажаних властивостей. Як уже викладалося вище, переважний додатковий поліпептид домен буде продовжувати період напіввиведення поліпептиду, будучи таким, як домен, що зв'язується з (людським) сироватковим альбуміном, такий як АЇБ11 домен.
Таким чином, відповідно до подальшого варіанта здійснення, винахід специфічно включає поліпептиди, що містять будь-яку з нижченаведених послідовностей, при цьому точні амінокислотні послідовності можна взяти з Таблиці І нижче:
Е012900082, що має послідовність, ідентифіковану як ЗЕО ІЮО МО: 18,
Е012900135, що має послідовність, ідентифіковану як ЗЕО ІЮО МО: 19, їі
Е012900141, що має послідовність, ідентифіковану як ЗЕО ІЮ МО: 20.
Таблиця ЇЇ
Послідовності трьох конкретних варіантів здійснення поліпептидів згідно з винаходом
ЕМОЇ МЕЗОаСИЇ МОРОСБІ ВІ БСМАБОВТЕЗТУУМОМ ЕНОАРОКЕВЕРЕМААІВУУЗИСІ
ЗГУХАрБУКОаВЕТІЗНОМУКМТ УМ ОММ5І АРЕОТАУМУСААЗНаИТтоТРОЬВАЗОМ5А
Е0О12900082 хмрмхмсості мтизвассоаЗасавазСсСсоа5асхвавзасвссааЗавасвавиасеЕМО «ЕОЮ ГЇМЕБОаСОЇ МОРОМБІ ВІ БСААБаєТЕ55ЕОМБУУВОАРОаКаї ЕМ У5БІЗОБИБОТІ.
МО-18 ХАрБУКОаВЕТІЗНОМАКТТІ М ОММ5І АРЕОТАУМУСтТІССЯБІ 5Н5БОСТІ МТУ5БИаС
І сазассаа5асавсвасвасвавававВавсасвасвааоЕМОЇ МЕЗСаСИаЇ МОРОСБІ ВІ.
ЗСААБавІЕЄВІМАМСОМУВОАРЕИКОВЕЇ МАДУЗЗЬССЬЗГУМУроЗУКСОАВЕТІЗАОМЗКМТ
МУ ОММ5І АРЕОТАУУУСМАЕТаРМаРРКАЮ УМ СХОСТІ МТУ
АМОЇ МЕБОСОЇ МОРОСБІ ВІ БСААБаБІРВІСАМЕЕМУАВОАРОКОВЕЇ МАДУ5ЗБЗОСО тУкУрвБУКанвЕТтІЗАОМОЗКМТ УМ ОММ5І ВРЕОТАУМУСМАЕТаРМОаРРКАОМУУСО
Е012900135 сті мтуиз5ССсесзазасасвьсаасазасвсиасвзасвасЗаса,аоЗавайоЕмМОІ МЕЗО, «ЕОЮ ГМОРОМ5БІ ВІ БСААЗаєТЕ55ЕаМ5УМУУВОАРОаКаі ЕМ У5Б5ІЗОЗОЗОТІ МАОБУКОа
МО-19 ВЕТІБНОМАКТТІ М ОММ5І АВРЕОТАУУУСТІССВІ 5НОЗОСТІ МУТУБОЗСОСИИБИСО
І свасава5асаав5асааЗасасввасвоасеЕМОЇМЕБИСсИаИЇ МОРІ ВІ 5СААБИЇ.
ТЕЗВАМАМАМЕВОАРОКЕВЕЕМААІ ТУ ЗЗОаВІОМАОЗУКСОВЕТІЗАОМЗКМТ УМ ОММ
ЗІ АРЕОТАМУМСААОВАРАНЗТОНЗИаТа5РОТУОУМСОСТІ МТУ55А
АМОЇ МЕ2ЗОаСИЇ МОРОСБІ ВІ БСААБОВТЕЗТУУМОМ ЕКОАРОКЕВЕРЕМААІВУУЗИСІ
ЗГУХАрБУКОаВЕТІЗНОМУКМТ УМ ОММ5І АРЕОТАУМУСААЗНаИТтоТРОЬВАЗОМ5А
Е012900141 хмрмхмсості мтизвассоаЗасавазСсСсоа5асхвавзасвссааЗавасвавиасеЕМО «ЕОЮ ГЇМЕБОаСОЇ МОРОМБІ ВІ БСААБаєТЕ55ЕОМБУУВОАРОаКаї ЕМ У5БІЗОБИБОТІ.
МО? ХАрБУКОаВЕТІЗНОМАКТТІ М ОММ5І АРЕОТАУМУСтТІССЯБІ 5Н5БОСТІ МТУ5БИаС
І сазассаа5асасввасвасвавававВавсас!васвааоЕМОЇ МЕЗОСИСІ МОРИСОЇІ ВІ.
ЗСААБавІЕВІСАМОМ УВОАРОКОВЕЇ МАДУ5ЗС5ТУУУрауУкаввЕтіІзвОМоКМТ
МУ ОММ5І АРЕОТАУУУСМАЕТаРМаРРКАВЮ УМ СОСТІ МТ УА
Як пояснювалося раніше, якщо не вказано інше, то поліпептиди згідно з винаходом можуть містити подальші фрагменти та/або додаткові поліпептидні домени, якщо тільки такий додатковий фрагмент або домен не перешкоджає їх зв'язуванню з І КР5.
Поліпептиди згідно з винаходом можуть додатково містити модифікації, такі як глікозильні залишки або модифіковані амінокислотні бічні ланцюги, а також можуть Пегілуватися з метою продовження періоду напіввиведення й інших властивостей подібної молекули. Методи й реактиви для Пегілування біпаратопних конструкцій ІЗМО можна знайти, напр., в УМО 2011/107507.
Поліпептиди згідно з винаходом можуть мати модифіковану на М-кінці послідовність, напр., з видаленням однієї або більше М-кінцевих амінокислот, або ж із заміною напр., першої М- кінцевої амінокислоти (напр., глутамату на аланін), з метою оптимізації молекули для експресії в певних системах експресії (таких, як конкретні вектори або клітини-хазяїна), або ж для експресії як тілець включення або в розчинній формі, або ж для секретування в середовище або периплазматичний простір або для утримання в клітині, або ж для одержання більш гомогенного продукту. Поліпептиди згідно з винаходом можуть мати модифіковану на С-кінці послідовність, напр., з додатковим аланіном та/або з додатковими амінокислотними замінами в
С-кінцевій частині або в інших установлених положеннях будь-якої з каркасних ділянок, згідно з поясненнями, напр., в МО 2012/175741, МО 2011/075861 або УМО 2013/024059, з метою подальшого поліпшення стабільності або зниження імуногенності таких поліпептидів.
Крім того, період напіввиведення поліпептидів згідно з винаходом можна продовжити додаванням альбумінового домену, тобто, перетворивши їх в альбумінові злиті білки. Приклади підходящих альбумінових фрагментів і методи їх додавання до зв'язувальних молекул описані, напр., в МО 2001/079271 і МО 2003/059934.
Переважно поліпептиди згідно з винаходом мають значення зв'язування (ЕСбзо), виміряні аналізом зв'язування ЕАС5, описаним у Прикладі 7.1 нижче, у діапазоні 104 моль/літр або менше, більш переважно 107 моль/літр або менше, ще більш переважно в діапазоні від 1079 до 1073 моль/літр, або мають значення ІСзо, виміряне комбінованим аналізом за геном-репортером
Ко) МИ і М/піЗа, описаним у Прикладі 7.3 нижче, 109 моль/літр або менше, більш переважно в діапазоні від 5 х 1079 моль/літр до 10-72 моль/літр.
Поліпептиди згідно з винаходом уможливлюють більш ефективне лікування ряду типів раку, таких як ТНРМ3З, КРР і НДКРЛ. У них поліпшені іп міо характеристики (тобто, більш висока ефективність пригнічення шляхи МУпі), див., напр., Приклади 7 і 8 нижче, а також значні здатності пригнічувати ріст пухлини іп мімо, що веде до більш високої ефективності іп мімо у порівнянні з зв'язувальними І КРб молекулами, що показане, напр., у Прикладі 9. Додатково, поліпептиди згідно з винаходом мають значно більш низьку токсичність на шлунково-кишковий тракт у порівнянні з І КРб зв'язувальними молекулами, описаними в рівні техніки, як показано, наприклад, у Прикладі 9.
Зокрема, як показано іп мімо на моделі пухлини, викликаної МУпі, біпаратопні КРБ гуманізовані УНН конструкції із продовженим періодом напіввиведення були здатні пригнічувати передачу сигналів Му/пі і ріст пухлини іп мімо, забезпечуючи навіть значне зменшення пухлини (тобто, пригнічення росту пухлини більш ніж на 100 95). Зменшення пухлини (тобто, регрес пухлини) є бажаним терапевтичним ефектом (тобто, дієвістю) при лікуванні хворих раком пацієнтів. Більше того, регрес пухлини, що приводить до повної патоморфологічної відповіді (пПВ), є визнаною клінічною кінцевою точкою, що свідчить про значне поліпшення виживаності без прогресування й загальної виживаності.
У тих же експериментах іп мімо не спостерігали значимих змін ваги тіла (« 10 95), а результати гістопатологічних аналізів шлунково-кишкових тканин не показали якого-небудь токсичного впливу вищезгаданих поліпептидів згідно з винаходом. Це особливо дивно у контексті вищезгаданих досліджень експресії ОККІ1 іп мімо (тобто, що приводили до виразки слизової кишечнику й втраті ваги тіла).
Крім того, приклади, описані нижче, демонструють здатність біпаратопної І КРБ специфічної
МНН конструкції із продовженим періодом напіввиведення селективно інгібувати проліферацію ракових клітин, що несуть мутації в ЕМЕ43З гені, які залежать від активної передача сигналу МУпі.
Специфічно, це додатково показує, що біпаратопні ІКР5 специфічні МНН конструкції із продовженим періодом напіввиведення, описані в даній заявці, селективно інгібують передачу сигналу М/пі раковими клітинами, що несуть мутації в ВМЕ43З гені.
Таким чином, поліпептиди згідно з винаходом фактично забезпечують нові терапевтичні
Зо можливості для лікування ракових захворювань, і особливо у випадку великої нереалізованої медичної потреби, такої, як, наприклад, при (тричі негативному) раку молочної залози.
Вищеописані ефекти, що дають перевагу, додатково проілюстровані Прикладами нижче й наявними в них порівняльними даними.
Більше того, поліпептиди згідно з винаходом прості у виготовленні й краще розчиняються, що означає, що їх можна зберігати та/або вводити в більш високих в порівнянні зі звичайними антитілами концентраціях. Вони стабільні при кімнатній температурі й довше залишаються стабільними навіть при екстремальних значеннях рн, так що можуть виготовлятися, зберігатися та/або транспортуватися без використання холодильного обладнання, тим самим заощаджуючи фінанси, час і запобігаючи наслідкам для навколишнього середовища. Завдяки вищевикладеному, а також своїй низькій імуногенності, вони додатково відкривають ряд можливостей щодо шляхів введення, крім ін'єкцій і інфузій, а також щодо протоколів введення й використання конкретних обладнань.
Нуклеїнові кислоти, вектори, клітини-хазяїна
Згідно з подальшими аспектами винахід стосується молекул нуклеїнових кислот і векторів експресії, що кодують поліпептиди згідно з винаходом, а також клітин-хазяїв, які їх експресують.
Ці нуклеїнові кислоти, вектори й клітини-хазяїна корисні при виготовленні поліпептидів згідно з винаходом, і їх додаткові аспекти й варіанти здійснення будуть докладніше описані нижче у взаємозв'язку з викладенням способів виробництва поліпептидів згідно з винаходом.
Терапевтичне застосування
Завдяки своїм біологічним властивостям поліпептиди згідно з винаходом придатні для лікування захворювань, що характеризуються надлишковою або аномальною проліферацією клітин, таких як рак і ідіопатичний легеневий фіброз (ІЛФ).
Наприклад, поліпептидами згідно з винаходом можна лікувати наступні ракові захворювання, пухлини й інші проліферативні захворювання, не обмежуючись ними:
Рак голови й шиї; Рак легені, такий як, напр., недрібноклітинний рак легені (НДКРЛ) і дрібноклітинний рак легені (МКРЛ); Новоутворення середостіння, такі як, напр., нейрогенні пухлини й мезенхімальні пухлини; Рак шлунково-кишкового тракту (ШКТ), такий як, напр., рак стравоходу, шлунку, підшлункової залози, печінки й жовчних проток (включаючи, напр., печінковоклітинну карциному (ПКК)), а також тонкого й товстого кишечнику (включаючи, напр., бо колоректальний рак); Рак передміхурової залози; Рак яєчок; Гінекологічні види раку, такі як,
напр., рак яєчників; Рак молочної залози, такий як, напр., карцинома молочної залози, гормон- рецептор-позитивний рак молочної залози, Нег2-позитивний рак молочної залози й тричі негативний рак молочної залози; Рак ендокринної системи; Саркоми м'яких тканин, такі як, напр., фібросаркома, рабдоміосаркома, ангіосаркома, саркома Капоши; Саркоми кісток, такі як, напр., мієлома, остеосаркома, пухлина Юінга, фібросаркома, остеохондрома, остеобластома й хондробластома; Мезотеліоми;
Рак шкіри, такий як, напр., карцинома базальних клітин, плоскоклітинна карцинома, карцинома клітин Меркеля й меланома; Новоутворення центральної нервової системи й головного мозку, такі як, напр., астроцитома, гліобластома, гліома, нейробластома й ретинобластома; Лімфоми й лейкози, такі, як, напр., В-клітинні неходжкінські лімфоми (НХЛ), Т- клітинні неходжкінські лімфоми, хронічний В-клітинний лімфоцитарний лейкоз (В-ХЛЛ), хронічний Т-клітинний лімфоцитарний лейкоз (Т-ХЛЛ), хвороба Ходжкіна (БХ), лейкоз із великими гранулярними лімфоцитами (ВГЛ), хронічний мієлогенний лейкоз (ХМЛ), гострий мієлогенний/мієлоїдний лейкоз (ГМЛ), гострий лімфатичний/лімфобластний лейкоз (ГЛЛ), множинна мієлома (ММ), плазмацитома й мієлодиспластичні синдроми (МДС); а також пухлини невідомої первинної локалізації.
Мається на увазі, що всі вищезгадані ракові захворювання, пухлини, новоутворення і т. д., охарактеризовані конкретною локалізацією/місцем походження в тілі, включають як первинні пухлини, так і метастатичні пухлини, що походять від них.
Більш конкретно поліпептиди згідно з винаходом корисні при лікуванні таких захворювань, особливо ракових захворювань, при яких аномальна проліферація клітин викликана аномальним (активованим) шляхом передачі сигналу УМпі, або він приймає в ньому участь.
Тому поліпептиди згідно з винаходом особливо корисні для лікування солідних пухлин, більш конкретно для лікування раку легень, печінки, ободової кишки, головного мозку, щитовидної залози, підшлункової залози, молочної залози, яєчників і передміхурової залози, а ще більш конкретно для лікування недрібноклітинного раку легень (НДКРЛ), тричі негативного раку молочної залози (ТНРМ3З) і колоректального раку (КРР). Зокрема, поліпептиди згідно з винаходом можна використовувати для лікування пацієнтів з місцевопоширеним або метастатичним ТНРМУЗ, пацієнтів з метастатичним НДКРЛ або місцевопоширеним або метастатичним КРР, як одиночний агент або в комбінації, з метою продовжити виживаність без прогресування (ВБП) і загальну виживаність (3В). Крім того, поліпептиди згідно з винаходом можна використовувати як неоад'ювантну терапію для пацієнтів з раком молочної залози з метою досягнення повної патоморфологічної відповіді (ППО; визначається як відсутність залишкового інвазивного раку й раку іп 5йи при гістопатологічній оцінці повністю висіченого зразка молочної залози й проб із усіх регіонарних лімфовузлів після завершення неоад'ювантної системної терапії).
Поліпептиди згідно з винаходом можна використовувати в терапевтичних протоколах у контексті першої лінії, другої лінії або будь-якій подальшій лінії лікування.
Поліпептиди згідно з винаходом можна використовувати для профілактики, короткострокового або тривалого лікування вищезгаданих захворювань, необов'язково в комбінації із променевою терапією та/або хірургією.
Також поліпептиди згідно з винаходом особливо придатні для лікування інших захворювань, викликаних аномальною проліферацією клітин, у якій бере участь сигнальний шлях М/пї, таких як ідіопатичний легеневий фіброз (ІЛФ). (Копідзпоїй та ін. "Рипсііопа! М/пі зідпаїїпа і5 іпстєазеад іп ідіораїпіс ри!топагу Прговів". Ріо Опе 2008;3 (5):62142; І ат та ін. "М/пі согесеріог І гр5 ів а агімег ої ідіораїпіс риїтопагу їірговів". Ат .) Незріг Стії Саге Мед. 2014и190(2):185-95).
Крім того, поліпептиди згідно з винаходом особливо придатні для лікування ретинопатій, особливо для лікування діабетичної ретинопатії через аномальну активацію М/пі у клітинах внутрішньої сітківки, яка викликає посилений аномальне утворення кровоносних судин сітківки, що приводить до розвитку й прогресування діабетичної ретинопатії (Спеп У. та ін. "Асіїмайіоп ої
Ше М/пі раїнжмау ріау5 а раїйодепіс гоїє іп аіабеїййс геїйпораїну іп питапз апа апіта! тодеїв" Те
Ат У Раїної. 2009; 175 (6):2676-85., Сбао та ін. "ЕІємаїєд І АРб ІеємеїЇ5 соїтеїа(є м/йй мазсшіаг епаоїнеїа! дгоули Тасіюг іп Пе міїгеоиз ої ргоїГегайме аіабеїйс гейпорашу" Мої Міб5. 2015:21:665-72).
Ї нарешті, оскільки показано, що пригнічення сигнальних шляхів УУупиИ Л//піЗза може також впливати на дендритні клітини (ДК) і функціонування дендритних клітин, поліпептиди згідно з винаходом можуть бути корисні для лікування імунних і інфекційних захворювань, а також для впливу на мікрооточення пухлини при різних ракових захворюваннях із числа перерахованих вище. Пухлини активно пригнічують протипухлинний імунітет, а ДК відіграють важливу роль у механізмі відхилення раку від імунітету. Зокрема, дослідження показали, що УУпі-ліганди в бо мікрооточенні пухлини здатні також ініціювати паракринний сигналінг в імунних клітинах і регулювати протипухлинний імунітет хазяїна (Нопо та ін. "реїа-саїепіп рготоїе5 гедшіаїогу Т-сеї! гезропзе5 іп їШштогв Бу іпаисіпа міатіп А теїароїївєт іп депагййс сеїїв". Сапсег Вез. 2015;75 (4):656-65).
Вищеописане також охоплює застосування поліпептидів згідно з винаходом у різних способах лікування вищевказаних захворювань шляхом введення терапевтично ефективної дози пацієнтові, що потребує її, так само як і застосування цих поліпептидів для виготовлення лікарських засобів для лікування подібних захворювань, так само як і фармацевтичні композиції, що включають такі поліпептиди згідно з винаходом, так само як і складання та/або виготовлення лікарських засобів, що включають такі поліпептиди згідно з винаходом, іт. д. і т. п.
Комбінації з іншими активними речовинами
Поліпептиди згідно з винаходом можна використовувати поодинці або в комбінації з іншими фармакологічно активними речовинами, такими як речовини передового рівня або стандарти лікування, такі як, напр., цитостатичні або цитотоксичні речовини, інгібітори проліферації клітин, антиангіогенні речовини, стероїди, імуномодулятори/нгібітори контрольних точок і т. п.
Цитостатичні та/або цитотоксичні активні речовини, які можна вводити в комбінації із сполуками згідно з винаходом, включають, не обмежуючись ними, гормони, аналоги гормонів і антигормони, інгібітори ароматази, агоністи й антагоністи І НЕН, інгібітори факторів росту (такі фактори росту, як, наприклад, фактор росту тромбоцитів (РОСЕ), фактор росту фібробластів (ЕОР), фактор росту ендотелію судин (МЕС), епідермальний фактор росту (ЕСБЕ), інсуліноподібні фактори росту (СЕ), епідермальний фактор росту людини (НЕК, напр., НЕК,
НЕКЗ, НЕКЗ) і фактор росту гепатоцитів (НОБЕ)), де інгібітори представляють собою, наприклад, антитіла проти фактора росту, антитіла проти рецептора фактора росту й інгібітори тирозинкінази, такі як, наприклад, цетуксимаб, гефітиніб, афатиніб, нінтеданиб, іматиніб, лапатиніб, босутиніб і трастузумаб; антиметаболіти (напр., антифолати, такі як метотрексат, ралтитрексед, піримідинові аналоги, такі як 5-фторурацил (5-ФУ), капецитабін і гемцитабін, пуринові й аденозинові аналоги, такі як меркаптопурин, тіогуанін, кладрибін і пентостатин, цитарабін (ага С), флударабін); протипухлинні антибіотики (напр., антрацикліни); похідні платини (напр., цисплатин, оксаліплатин, карбоплатин); алкілуючі агенти (напр., естрамустин, мехлоретамін, мелфалан, хлорамбуцил, бусульфан, дакарбазин, циклофосфамід, іфосфамід, темозоломід, нітрозосечовини, такі як, наприклад, кармустин і ломустин, тіотепа); антимітотичні агенти (напр., алкалоїди Міпса, такі як, наприклад, вінбластин, віндезин, вінорелбін і вінкристин; а також таксани, такі як паклітаксел, доцетаксел); інгібітори ангіогенезу, інгібітори тубуліну; інгібітори синтезу ДНК, інгібітори РАКР, інгібітори топоіїзомерази (наприклад, епіподофілотоксини, такі як, наприклад, етопозид і етопофос, теніпозид, амсакрин, топотекан, іринотекан, мітоксантрон), інгібітори серин/греонінкінази (напр., інгібітори РОКІ, інгібітори Каї, інгібітори А-Каї, інгібітори В-Каї, інгібітори С-Каї, інгібітори тт, інгібітори ттТовс1/2, інгібітори РІЗК, інгібітори РІЗКа, подвійні інгібітори тТО/РІЗК, інгібітори ЗТКЗ3, інгібітори АКТ, інгібітори РІКІ (такі як воласертиб), інгібітори СОК, інгібітори кінази Аийгога), інгібітори тирозинкінази (напр., інгібітори РТК2/ЕАК), інгібітори білок-білкової взаємодії, інгібітори МЕК, інгібітори ЕКК, інгібітори РІ Т3, інгібітори ВКОЯ4, інгібітори ІСБ-1К, агоністи ТЕАЇІК2, інгібітори
Всі-хї., інгібітори Всі-2, інгібітори Всі-2г/Всі-хі, інгібітори рецептора ЕгбБВ, інгібітори ВСК-АВІ, інгібітори АВІ., інгібітори Згс, аналоги рапаміцину (наприклад, еверолімус, темзиролімус, ридафоролімус, сиролімус), інгібітори синтезу андрогенів, інгібітори рецепторів андрогенів, інгібітори ОММТ, інгібітори НОАС, інгібітори АМС1/2, інгібітори СУР17, радіофармацевтичні препарати, імунотерапевтичні агенти, такі як інгібітори імунних контрольних точок (напр., молекули/муноглобуліни, що зв'язують СТІ А4, РОТ, РО-І7, ГАСЗ і ТІМ3, такі як іпілімумаб, ніволумаб, пембролізумаб), протиракові вакцини, такі як традиційна протипухлинна вакцина (клітинні вакцини, напр., Зіршеисе!-ї для лікування раку передміхурової залози), персоналізовані неоантигенні вакцини й онколітичні віруси, а також різні хіміотерапевтичні агенти, такі як аміфостин, анагрелід, клодронат, філграстин, інтерферон, інтерферон-альфа, лейковорин, ритуксимаб, прокарбазин, левамізол, месна, мітотан, памідронат і порфімер.
Особливо переважними є способи лікування, що включають застосування поліпептидів згідно з винаходом у комбінації з лікарським засобом, вибраним із групи, що складається з: (І) антитіл проти МЕСЕ (бевацизумаб і інші антиангіогенні речовини), з або без комбінації з хіміотерапією (включаючи комбінацію доксорубіцин/циклофосфамід та/або комбінацію капецитабін/доцетаксел за неоад'ювантною схемою; протокол таксан/платина для першої й пізніших ліній лікування) для пацієнтів з раком молочної залози; (І) ІТК ЕСЕК для НДКРЛ, мутантного за ЕСЕК, або кризотинібу для НДКРЛ із перебудовою
АЛК, з або без комбінації з хіміотерапією (цитотоксична комбінована терапія препаратами бо платини, включаючи гемцитабін/цисплатин як терапію першої лінії; доцетаксел або пеметрексед як терапію другої лінії для пацієнтів з раком легень; (І) антитіл проти ЕСЕ (цетуксимаб і панітумумаб для пухлин з КВА5 дикого типу), з або без комбінації з хіміотерапією (включаючи іринотекан), комбінації з антитілами проти МЕСЕ (бевацизумаб і інші антиангіогенні речовини) або комбінації з регорафенібом, напр., для лікування пацієнтів із КРР. (ІМ) імунотерапевтичних агентів, включаючи агенти проти РО-1, такі як пембролізумаб і ніволумаб, агенти проти РО-11, агенти проти СТІ А4, агенти проти ВТГА, агенти проти ГАЗ і агенти проти ТІМ3, такі як антитіла проти РОІ 1 і т. д., напр., для лікування пацієнтів з раком молочної залози, легені й КРР. (М) хіміотерапевтичних агентів, таких як антинеопластичні препарати на основі платини, або ж у комбінації з хіміотерапевтичним протоколом РОЇРОХ, включаючи фолінову кислоту, 5'- фторурацил і оксаліплатин, або ж у комбінації з хіміотерапевтичним протоколом БОЇ ЕОХІКІ, включаючи фолінову кислоту, 5'-фторурацил, оксаліплатин і іринотекан, напр., для лікування пацієнтів з раком молочної залози й КРР.
Якщо дві або більше речовини або принципи дії використовують як частини комбінованого протоколу хіміотерапії, то їх можна вводити тим же шляхом або різними шляхами, по суті в той самий час (тобто, одночасно, паралельно) або в різний час (напр., послідовно, підряд, поперемінно, один по одному або в будь-якому іншому вигляду змінного режиму).
Якщо речовини або принципи вводять одночасно тим самим шляхом, то їх можна вводити у вигляді різних фармацевтичних препаратів або композицій або як частину комбінованого фармацевтичного препарату або композиції. Крім того, якщо дві або більше речовини або принципи використовують як частини комбінованого протоколу хіміотерапії, то кожну речовину або принцип можна вводити в тій же кількості й за тим же протоколом, які використовуються для одиночного застосування сполуки або принципу, і таке комбіноване застосування може мати синергічний ефект або не мати його. Однак якщо комбіноване застосування двох або більше активних речовин приводить до синергічного ефекту, то можна зменшити кількість однієї, декількох або всіх речовин, що вводяться, або принципів, зберігаючи при цьому бажану терапевтичну дію. Це може бути корисним для, наприклад, запобігання, обмеження або зменшення яких-небудь небажаних побічних ефектів, зв'язаних із застосуванням однієї або
Зо більше речовин або принципів у звичайних кількостях, зберігаючи при цьому бажаний фармакологічний або терапевтичний ефект.
Вищеописаним охоплені виготовлення й способи виготовлення поліпептидів згідно з винаходом для комбінованого застосування з вищевказаними комбінаційними партнерами.
Охоплені також виготовлення й способи виготовлення вищевказаних комбінаційних партнерів для комбінованого застосування з поліпептидами згідно з винаходом. Таким чином, винаходом забезпечені, напр., способи застосування або виготовлення для застосування імуномодулятора/інгібітора контрольних точок, такого як антитіла проти РОТ, такого як пембролізумаб або ніволумаб, для введення в комбінації з поліпептидом згідно з винаходом, а більш конкретно для введення в складі комбінованого терапевтичного протоколу з поліпептидом згідно з винаходом.
Більше того, винаходом також охоплені набори, у які входять принаймні один поліпептид згідно з винаходом і один або більше інших компонентів, вибраних із групи, що складається з інших лікарських засобів, застосовуваних для лікування захворювань і розладів згідно з описом вище, а також обладнань згідно з описом нижче.
Фармацевтичні композиції, способи введення, дозування
Фахівцеві буде зрозуміло, що вищеописані способи лікування захворювання мають на увазі виготовлення лікарського засобу для лікування вказаного захворювання. Таким чином, винахід також стосується фармацевтичних композицій для лікування вищезгаданих захворювань, причому подібні композиції містять принаймні один поліпептид згідно з винаходом.
Поліпептиди згідно з винаходом та/або композиції, які їх містять, можна вводити пацієнтові, який цього потребує, будь-яким підходящим способом, залежно від конкретного використовуваного фармацевтичного препарату або композиції. Таким чином, поліпептиди згідно з винаходом та/або композиції, які їх містять, можна вводити, наприклад, внутрішньовенно (в. в.), підшкірно (п. ш.), внутрішньом'язово (в. м.), внутрішньоочеревинно (в. о.), через шкіру, перорально, сублінгвально (напр., у вигляді сублінгвальної таблетки, спрею або крапель, що поміщають під язик і адсорбуються через слизові мембрани в під'язичну капілярну мережу), (внутрішньо-)назально (напр., у вигляді назального спрею та/або аерозолю), поверхово, за допомогою супозиторію, інгаляцією або будь-яким іншим підходящим способом в ефективній кількості або дозуванні. 60 Поліпептиди згідно з винаходом та/або композиції, які їх містять, вводять згідно із протоколом лікування, що підходить для лікування та/або полегшення захворювання, розладу або стану, що підлягає лікуванню або полегшенню. Лікар, як правило, може визначити підходящий протокол лікування залежно від таких факторів, як захворювання, розлад або стан, що підлягає лікуванню або полегшенню, ступінь важкості захворювання, ступінь важкості його симптомів, конкретний застосовуваний поліпептид згідно з винаходом, конкретний шлях введення й застосовуваний фармацевтичний препарат або композиція, вік, стать, вага, режим харчування, загальний стан пацієнта й тому подібні фактори, добре відомі лікареві. Як правило, протокол лікування включає введення одного або більше поліпептидів згідно з винаходом або однієї або більше композицій, які їх містять, у терапевтично ефективних кількостях або дозах.
Як правило, для лікування та/або полегшення згаданих тут захворювань, розладів і станів, залежно від конкретного підлягаючого лікуванню захворювання, розладу або стану, сили конкретного використовуваного поліпептиду згідно з винаходом, використовуваних конкретного шляху введення й конкретного фармацевтичного препарату або композиції поліпептиди згідно з винаходом у загальному вводять у кількості від 0,005 до 20,0 мг на кілограм маси тіла й дозу, переважно від 0,05 до 10,0 мг/кг/ дозу, ще більш переважно від 0,5 до 10 мг/кг/дозу, або безупинно (напр., інфузією), або, що більш переважно, у вигляді окремих доз (таких як, напр., прийняті двічі на тиждень, раз на тиждень, раз на місяць; див. нижче), але все це може відрізнятися, особливо залежно від вищезгаданих параметрів. Тому в деяких випадках достатньою може бути доза менше вказаної тут мінімальної дози, тоді як в інших випадках вона може перевищувати верхню границю. При введенні більших кількостей рекомендується розділяти їх на ряд менших доз, прийнятих протягом дня.
Залежно від конкретного поліпептиду згідно з винаходом, а також його конкретних фармакокінетичних і інших властивостей, його можна вводити раз у день, кожний другий, третій, четвертий, п'ятий або шостий день, раз на тиждень, раз на місяць і т. п. Протокол введення може мати на увазі довгострокове щотижневе лікування. Під "довгостроковим" мається на увазі тривалість принаймні два тижні, переважно місяці або роки.
Дієвість поліпептидів згідно з винаходом, а також композицій, які їх містять, можна перевірити за допомогою будь-якого підходящого відомого рег 56 аналізу іп мій, аналізу на клітинах, аналізу іп мімо та/або на тваринній моделі, або ж будь-якої їх комбінації, залежно від
Зо конкретної розглянутої хвороби. Підходящі аналізи й тваринні моделі будуть зрозумілі фахівцеві й для прикладу включають аналізи й тваринні моделі, використовувані в Прикладах нижче.
Переважно поліпептиди згідно з винаходом мають переважні характеристики, ніж звичайні відомі в даній галузі антитіла, принаймні в одному із цих аналізів або моделей, а переважно в одній або більше моделей іп мімо.
Препарати
Для фармацевтичного застосування поліпептиди згідно з винаходом можуть бути введені до складу фармацевтичного препарату, що включає (І) принаймні один поліпептид згідно з винаходом і (І) принаймні один фармацевтично прийнятний носій, розріджувач, допоміжна речовина, ад'ювант та/або стабілізатор, а також (Ії) необов'язково один або більше додаткових фармакологічно активних поліпептидів або сполук. Під "фармацевтично прийнятним" слід розуміти матеріал, що не проявляє яких-небудь біологічних або інших небажаних ефектів при введенні індивідуумові й не взаємодіє негативно з будь-яким з інших компонентів фармацевтичної композиції (таким як, напр., фармацевтично активний інгредієнт), яка містить відповідний матеріал. Конкретні приклади можна знайти в стандартних посібниках, таких як, напр., Кетіпдоп'є Рпаптасешіса! Зсіепсе5, 18-е вид., Маск Рибріїзпіпд Сотрапу, США (1990).
Наприклад, поліпептиди згідно з винаходом можна рецептувати і вводити будь-яким способом, відомим рег 56 для звичайних антитіл і фрагментів антитіл, а також інших фармацевтично активних білків. Таким чином, згідно з наступним варіантом здійснення винахід стосується фармацевтичної композиції або препарату, що містять принаймні один поліпептид згідно з винаходом і принаймні один фармацевтично прийнятний носій, розріджувач, допоміжну речовину, ад'ювант та/або стабілізатор, а також необов'язково одну або більше додаткових фармакологічно активних речовин.
Фармацевтичні препарати для парентерального введення, такого як внутрішньовенна, внутрішньом'язова, підшкірна ін'єкція або внутрішньовенна інфузія, можуть, наприклад, бути стерильними розчинами, суспензіями, дисперсіями, емульсіями або порошками, які містять діючу речовину й придатні, необов'язково після додаткового етапу розчинення або розведення, для ін'єкції або інфузії. Підходящі носії або розріджувачі для подібних препаратів включають, для прикладу й не для обмеження, стерильну воду й фармацевтично прийнятні водні буфери й розчини, такі як фізіологічний фосфатно-сольовий розчин, розчин Рінгера, розчин декстрози й 60 розчин Хенкса; масла з водою; гліцерин; етанол; гліколі, такі як пропіленгліколь, а також мінеральні масла, тваринні масла й рослинні олії, наприклад, арахісова олія, соєва олія й придатні їх суміші.
Розчини поліпептидів згідно з винаходом можуть також містити консервант для запобігання росту мікроорганізмів, такий, як антибактеріальні й протигрибкові речовини, наприклад, п- гідроксибензоати, парабени, хлорбутанол, фенол, сорбінова кислота, тіомерсал, етилендіамінтетраоцтова кислота (і її солі з лужними металами) і т. п. У багатьох випадках переважно включати ізотонічні агенти, наприклад, цукри, буфери або хлорид натрію.
Необов'язково можуть використовуватися емульгатори та/або диспергатори. Належну текучість можна підтримувати, наприклад, утворенням ліпосом, підтриманням потрібного розміру частинок у випадку дисперсій і застосуванням поверхнево-активних речовин. Можна також додавати інші речовини, що затримують абсорбцію, наприклад, алюмінію моностеарагт і желатин. Розчини можна розливати в ін'єкційні рлакони, ампули, пляшки для інфузій і т. п.
У будь-якому випадку кінцева лікарська форма повинна бути стерильною, рідкою й стабільною в умовах виробництва й зберігання. Стерильні ін'єкційні розчини виготовляють включенням діючої речовини в необхідну кількість належного розчинника, за необхідності з різними іншими інгредієнтами з перерахованих вище, з наступною стерилізуючою фільтрацією.
У випадку стерильних порошків для приготування стерильних ін'єкційних розчинів переважними способами виготовлення є методи вакуумного висушування й виморожування, що дозволяють одержати порошок діючої речовини й будь-якого бажаного додаткового інгредієнта з їх розчину, що попередньо пройшов стерилізуючу фільтрацію.
Звичайно віддають перевагу водним розчинам або суспензіям. Як правило, підходящими препаратами для терапевтичних білків, таких як поліпептиди згідно з винаходом, є забуферені розчини білків, такі як розчини, що містять білок у підходящій концентрації (такій, як від 0,001 до 400 мг/мл, переважно від 0,005 до 200 мг/мл, більш переважно від 0,01 до 200 мг/мл, більш переважно 1,0-100 мг/мл, такій, як 1,0 мг/мл (в. в. введення) або 100 мг/мл (п. ш. введення) і водний буфер, такий як: - фосфатно-сольовий розчин, рн 7,4, - інші фосфатні буфери, рН 6,2-8,2, - ацетатні буфери, рН 3,2-7,5, переважно рнН 4,8-5,5
Ко) - гістидинові буфери, рН 5,5-7,0, - сукцинатні буфери, рН 3,2-6,6, і - цитратні буфери, рН 2,1-6,2, і, необов'язково, солі (напр., Масі) та/або цукри (напр., сахароза й трегалоза) та/або інші поліоли (напр., маніт і гліцерин) для забезпечення ізотонічності розчину.
Переважними забуференими розчинами білків є розчини, що містять приблизно 0,05 мг/мл поліпептиду згідно з винаходом, розчиненого в 25 мМ фосфатного буфера, рН 6,5, з відрегульованої додаванням 220 мМ трегалози ізотонічністю. Додатково подібні розчини можуть містити інші агенти, такі як детергенти, напр., 0,02 95 Туееп-20 або Ту'ееп-80. Препарати для підшкірного застосування можуть містити більші концентрації поліпептиду згідно з винаходом, такі, як до 100 мг/мл або навіть вище 100 мг/мл. Однак фахівцеві в даній галузі буде зрозуміло, що вищевказані інгредієнти й кількості є тільки однією, переважною з можливостей. Фахівцеві будуть негайно очевидні, або ж легко виведені з вищевикладеного, їх альтернативи й варіанти.
Також у порівнянні зі звичайними антитілами або фрагментами антитіл одним з більших переваг застосування поліпептидів згідно з винаходом є те, що їх можна легко вводити шляхами, відмінними від парентерального введення, і легко скласти їх рецептуру для такого введення. Наприклад, як описано в міжнародній патентній заявці УМО 2004/041867, подібні поліпептиди можна рецептувати як препарати для перорального, інтраназального, внутрішньолегеневого й трансдермального введення.
Згідно 3 наступним аспектом винаходу поліпептид згідно з винаходом можна використовувати в комбінації з обладнанням, що використовуються для введення поліпептиду, таким як шприц, ручка-ін'єктор, мікронасос або інше обладнання.
Способи виробництва й очищення
Винаходом також надані способи виробництва поліпептиду згідно з винаходом, причому такі способи в цілому включають етапи: - культивування клітин-хазяїн, що містять нуклеїнову кислоту, що кодує поліпептид згідно з винаходом (тут і далі: "нуклеїнову кислоту згідно з винаходом") в умовах, що роблять можливою експресію поліпептиду згідно з винаходом; і - виділення або ізолювання поліпептиду, експресованого клітинами-хазяїнами, з культури; і - необов'язково подальшого очищення та/або модифікації та/або рецептування поліпептиду 60 згідно з винаходом.
Нуклеїнова кислота згідно з винаходом може, напр., бути молекулою ДНК, що містить кодуючі послідовності, а також регуляторні послідовності й необов'язково природні або штучні інтрони, або може бути молекулою кднк. Вона може мати свої первісні кодони або ж оптимізовані кодони, спеціально адаптовані для експресії в передбачуваній клітині-хазяїні або організмі-хазяїні. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу нуклеїнова кислота згідно з винаходом знаходиться в по суті виділеній формі згідно з визначенням вище.
Нуклеїнова кислота згідно з винаходом може також знаходитися у вигляді, бути в наявності у та/або бути частиною вектора, такого як, наприклад, плазміда, косміда або ХАС, який знову ж таки може знаходитися в по суті виділеній формі. Вектор може бути по суті вектором експресії, тобто, вектором, здатним забезпечити експресію поліпептиду іп міго та/або іп мімо (напр., у підходящій клітині-хазяїні, організмі-хазяїні та/або системі експресії). Подібний вектор експресії, як правило, містить хоча б одну нуклеїнову кислоту згідно з винаходом, функціонально зв'язану з одним або більше підходящими регуляторними елементами, такими як промотор(-и), енхансер(-и), термінаторс-и) і т. п. Конкретні приклади подібних регуляторних елементів і інших елементів, таких як фактори вбудовування, маркери відбору, сигнальні або лідерні послідовності, репортерні гени й т. п., корисні або необхідні для експресії поліпептидів згідно з винаходом, описані, напр., на стор. 131-133 МО 2006/040153.
Нуклеїнові кислоти згідно з винаходом можна виготовити або одержати відомим рег зе способом (напр., автоматизованим синтезом ДНК та/або технологією рекомбінантних ДНК) на підставі наведеної тут інформації про амінокислотні послідовності поліпептидів згідно з винаходом.
Згідно з іншим варіантом здійснення винахід стосується хазяїна або клітини-хазяїна, що експресує або здатен експресувати поліпептид згідно з винаходом; та/або який містить нуклеїнову кислоту, що кодує поліпептид згідно з винаходом. Згідно з особливо переважним варіантом здійснення вказані клітини-хазяїни є бактеріальними клітинами, дріжджовими клітинами, грибковими клітинами або клітинами ссавців.
Для виробництва в промислових масштабах переважні гетерологічні хазяї для (промислового) виробництва ІЗМО поліпептидів і білкових ліків, які їх містять, включають штами
Е. сої, Ріспіа рахіогів і 5. сегемівзіає, які підходять для великомасштабної експресії, виробництва
Зо й ферментації, і зокрема, для великомасштабної (біо-)фармацевтичної експресії, виробництва й ферментації.
Поліпептиди згідно з винаходом, вироблювані в клітині згідно з описом вище, можуть вироблятися або внутрішньоклітинно (напр., у цитозолі, периплазмі або в тільцях включення) з наступним виділенням із клітин-хазяїн і необов'язковим подальшим очищенням; або ж вони можуть вироблятися позаклітинно (секретуватися в середовище, де культивуються клітини- хазяїна) з наступним виділенням з культурального середовища й необов'язковим подальшим очищенням.
Додаткові способи й реактиви, використовувані для рекомбінантного виробництва поліпептидів, так вектори, що як підходять, експресії, методи трансформації або трансфекції, маркери відбору, методи індукування експресії білка, умови культивування й т. п. відомі з рівня техніки. Точно так само фахівцеві відомі техніки виділення й очищення білка, що підходять для способу виробництва поліпептиду згідно з винаходом.
Виробництво поліпептидів згідно з винаходом ферментацією в зручних рекомбінантних організмах-хазяїнах, таких як Е. соїї і дріжджі, є фінансово вигідним у порівнянні зі звичайними антитілами, яким, як правило, потрібно дороге обладнання для культивування клітин ссавців.
Більше того, досяжні високі рівні експресії, і вихід поліпептидів згідно з винаходом знаходиться в діапазоні 1-10 г/л (Е. соїї) і до 10 г/л (дріжджі) і більше.
ПРИКЛАДИ
Приклад 1: Імунізація лам за допомогою І КРБ для індукування гуморальної імунної відповіді
Для імунізації лам необхідно було розробити й впровадити декілька протоколів для ідентифікації МНН доменів, що зв'язують ГКР5: Спочатку лами імунізували за допомогою рекомбінантних позаклітинних доменів білка І КР5 (миші). Однак функціональна оцінка вищевказаного рекомбінантного білка ГКР5 показала, що рекомбінантний білок не був належним чином укладений. Отже, для розробки підходящих антигенів для імунізації потрібна була додаткова робота. Як обхідний шлях, лами імунізували клітинами НЕК293, стабільно трансфікованими ГКР5 людини або І КР5 яванської макаки (цино). Однак і тоді можна було досягти тільки дуже низької експресії ІКР5 людини або цино, як при тимчасовій, так і при стабільній трансфекції, а також із застосуванням різних клітинних ліній (НЕК293 ї СНО). Таким чином, необхідна ще додаткова робота для досягнення достатньої експресії КРБ. В бо остаточному підсумку, і після деякої кількості безуспішних проб і помилок, цього вдалося
Зо досягти шляхом розробки протоколу, що передбачає стабільну ко-трансфекцію НЕК293 клітин із застосуванням Ме50С-2, шаперону, який повинен підвищувати екзогенну експресію І КР5. Але навіть тоді, тобто, після ко-експресії Ме5О0С-2 протягом створення ІКР5 стабільно трансфікованої клітинної лінії, неодноразово спостерігалася експресія білка. На відміну від цього, суттєво більш високі й стабільні рівні експресії досягалися при спільній експресії | КРб людини з Ме50С-2 у клітинах НЕК293. Ці отримані результати узгоджуються з опублікованими даними, що показують властиву стимуляцію І КР5 людини як дуже погано експресованого білка (Ріешигу та ін., Ргоївіп Ехрг Ригії. 2010 Маг; 70 (1):39-47). Це привело до проблеми, що експресія
І КР5 може бути загублена під час імунізації й селекції. Щоб розв'язати цю додаткову проблему, кількість пасажів клітин, які експресують ГЕРБ, обмежили максимально можливо й виконували додаткове сортування клітин з метою збагачення клітин, які експресують І КРБ.
Лам додатково імунізували із застосуванням ДНК, що кодує І КРБ, з і без шаперона ПМе5ОсС- 2 на протилежних кінцях. Декільком ламам увели додаткові стимули в спробі підсилити міжвидову перехресно-реактивну імунну відповідь, з метою підвищити шанси ідентифікації анти- людських І КР5 УНН доменів, перекресно реагуючих з мишиним і цино ГКР.
Через регулярні проміжки часу відбирали зразки імунізованої крові (РВІ), визначали серологічну відповідь, і з виділених РВІ. готували загальну РНК. Після імунізації рекомбінантним білком спостерігали низьку серологічну відповідь на І КРБ; на відміну від цього, середню І КРБ імунну відповідь спостерігали для лам, імунізованих ДНК. Надзвичайно низьку імунну відповідь спостерігали для імунізації клітинами. Додатково, також досліджували синтетичні бібліотеки.
Проте, зрештою, вдалося досягти різноманітності репертуарів для продовження на наступних етапах, як викладено в Прикладі 2.
Приклад 2: Виділення моновалентних УНН доменів (УНН), що зв'язують І КР5
Створення бібліотеки:
Безпосередньо після відбору імунних тканин виділяли загальну РНК, підтверджували цілісність і концентрацію РНК. Із цих препаратів РНК робили зразки кДНК. Нуклеотидні послідовності, що кодують УНН, ампліфікували зі зразків КДНК одноетапної РЧ-ПЛР. Амплікони по 700 п. о., спеціально ампліфіковані із КДНК присутніх у зразку Ідса2 і ІдсЗ, виділяли з агарозного гелю й згодом використовували як шаблон для "гніздової" ПЛР. Потім продукти ПЛР
Зо розщеплювали 5ІЇїЇ і Ввівїї і вшивали у відповідні сайти рестрикції фагмідного вектора рАХ5О.
Зшиті суміші електропорацією вводили в ЕзсПегісніа соїї Т2-1. Отриманий пул трансформантів склав генетичну різноманітність бібліотеки фаг-дисплею. рАХ5ОО - це вектор експресії, отриманий з рОС119 ген, що містить, резистентності до ампіциліну й промотор Іас, за яким розташована кодуюча послідовність сигнального пептиду
РП-білка в одній рамці зчитування з розташованим далі сайтом вбудовування МНН-домену. У рамці зчитування з послідовністю, що кодує МНН-домен, вектор кодує С-кінцевий Мус, гексагістидинову мітку й рІП-білок коліфагу. Після зараження бібліотеки клонів Е. соїї Т(а-1 фагом-хелпером присутність рРАХ5О уможливлює вироблення частинок фага в цих клонах, виводячи індивідуальні МНН-домени у вигляді білка, злитого з ріП-білком.
Відбір
Для відбору створювали й використовували бібліотеки МНН-доменних фагмід. Беручи до уваги дуже високу міжвидову гомологічність білків (КРБ людини й лами), було незрозуміло, чи забезпечить викликана у лам імунна відповідь достатню різноманітність МНН-доменів. Тому під час відбору паралельно з імунними бібліотеками використовували дві синтетичні бібліотеки.
Під час відбору використовували наступні різні стратегії: - Зміна виду-джерела (тобто, інструменти, отримані від людського й мишиного І КРБ) для посилення шансів ідентифікації перехресно реагуючих УНН доменів ІГКР5 видів людини/миші, наприклад, відбір за бібліотеками з лам, імунізованих І КР5 людини, з НЕК293, які стабільно експресують мишиний І КРБ або застосування НЕК293 клітинні лінії, які експресують як КРБ миші, так ії людини, під час відбору на синтетичних бібліотеках (мишина перехресна реактивність такого І КРБ антагоніста надає можливість оцінки ефективності, тобто, інгібування росту пухлини, і профілі безпеки, необхідні для оцінки терапевтичного вікна, у тих же самих доклінічних моделях (тобто, у ксенотрансплантатних моделях пухлин на мишах)). - Відбори "у розчині" із застосуванням рекомбінантного білка І ЕР5 для утримання епітопів у них нативній конформації: Додаткова перешкода полягала в тому, що було виявлено, що рекомбінантний білок ЇЕР5 втрачає належну укладку при безпосередньому нанесенні на планшети ЕЇІ5А для зв'язування. Тому, рекомбінантний білок біотинілували й, після підтвердження належної укладки у функціональних аналізах, використовували для відбору "у розчині". 60 - Відбори з використанням клітин, які понадекспресують ГКР5, з метою забезпечити природну конформацію рецепторів. Це несподівано виявилося важливим прийомом, особливо необхідним для поліпшення відбору структур, що зв'язуються з доменом ЇКР5 класу М/піЗа, оскільки функціональні дані за рекомбінантним білком показали відсутність правильної укладки
М/піЗа-зв'язувального епітопу. - Негативний відбір з використанням клітин, які понадекспресують І КРб, для ідентифікації
І АРо-селективних структур.
Приклад 3: Скринінг моновалентних УНН
Після відбору клони вирощували в 96-лункових планшетах із глибокими лунками (об'ємом 1 мл) і індукували експресію УНН додаванням ІПТГ. Згідно зі стандартною методикою, описаною, напр., в УМО 2011/1107507, готували периплазматичні екстракти окремих клонів і проводили їх скринінг на зв'язування з людськими ГКР5. Спочатку скринінг периплазматичних екстрактів здійснювали аналізом зв'язування ЕГІЗА з рекомбінантними й КРБ, який є чутливим, завадостійким і високопродуктивним аналізом у порівнянні з аналізом зв'язування на основі
ЕАС5. Після очищення МНН, ідентифікованим аналізами ЕГІЗА, давали додаткову характеристику за допомогою аналізу зв'язування ЕБАС5, щоб підтвердити зв'язування очищених УНН з рецептором І КР5 у його природній конформації.
Звичайно очікується гарна кореляція аналізів зв'язування за методами ЕГІЗА і ЕАС5. Однак у цьому випадку МНН, що найкраще зв'язуються з І! КР5 в аналізі ЕГІЗА (тобто, з високою афінністю до рекомбінантного позаклітинного домену КРБ), не виявили зовсім ніякого або дуже слабке зв'язування з людським І КРБ в аналізі зв'язування ЕАС5. Використання різних буферів покриття (фосфатно-сольового буфера Дульбеко й бікарбонатного буфера) і блокувальних розчинів при постановці ЕГІЗА (Магує! і БСА) не усунула спостережувану розбіжність. Замість цього було виявлено, що дуже слабкі згідно ЕГІ5А зв'язувачі показали високу афінність до І КРБ в аналізах зв'язування ГАС5 при використанні клітин НЕК293, які експресують ГКР5. Ці додаткові дані й експерименти уможливили відбір високоафінних зв'язувальних речовин, що розпізнають природню конформацію двох рецепторів. Крім того, було підтверджено, що ці високоафінні зв'язувальні речовини розпізнають у білку КРБ залежний від конформації епітоп, а не лінійний епітоп. Ці додаткові нестандартні дані й експерименти уможливили відбір терапевтично важливих речовин, що зв'язують І КРБ, які
Зо повинні мати високу афінність до І КРБ, що експресується на плазматичній мембрані у своїй природній конформації.
Тому, незважаючи на (І) низьку продуктивність аналізів зв'язування ЕАС5, (Ії) менш завадостійку постановку аналізу й (ІП) вищеописані складності, що виникли через втрату експресії рекомбінантного білка при пасивуванні клітин, які понадекспресують І КРБ, ці аналізи все-таки використовували для наступного відбору й характеристики високоафінних УНН- зв'язувачів. Якщо коротко, клітини інкубували з розведеннями очищених УНН (серійні розведення 1:5 від 1 мкМ до 1 пМ у кінцевій концентрації) протягом 1,5 годин при 4 "С на планшетному шейкері. Після 5-кратного промивання клітин буфером РАС5, що складаються із 1Тх фосфатно-сольового буфера (ФСБ) -х 10 95 ембріональної бичачої сироватки (ЕБС) ж 0,05 95 азиду натрію, їх інкубували протягом від 30 хвилин до 1 години при 4 "С з поліклональним мишиним антитілом, що зв'язуються з каркасною ділянкою УНН, а отже, що зв'язуються з усіма зв'язувачами І КРБ, що перевіряються. Після трикратного промивання клітин буфером ЕАСЗ їх інкубували протягом від 30 хвилин до 1 години при 4 С з міченим вторинним антитілом (протимишине, ФЕ) з наступним трикратним промиванням буфером БАС5. Флюоресценцію вимірювали за допомогою ЕАСЗ Аітау (ВО).
На підставі даних про зв'язування ЕАСЗ5 і аналізу послідовностей в імунних бібліотеках і бібліотеках синтетичного походження ідентифікували в загальному близько п'ятдесяти селективних для І КР5 сімейств/кластерів УНН. Приклади їх представників показані й визначені своєю послідовністю нижче. МНН експресували в Ес.соїї і очищали. Якщо експресія в Е. соїї була недостатньою, МНН продукували в Ріспіа равіогізх. Короткий опис експресії й очищення УНН наведено нижче.
Загальна експресія УНН в Е. соїї
Кодуючі послідовності вбудовували у вектор експресії рАХ100 і експресували в Е. соїї у вигляді с-Мус білків з гексагістидиновою міткою. Клітини Е. соїї ТО-1, що містять потрібні УНН конструкції, вирощували (37 "С, 250 об./хв.) у колбах, що струшуються, на середовищі ТВ із додаванням каніміцину й індукували додаванням 1 мМ !ПТГ для експресії. Після центрифугування клітинних культур готували периплазматичні екстракти методом заморожування-відтавання осаду й ресуспендування його у ФОБД.
Загальна експресія УНН в Рісніа (Р.) разютгів бо Кодуючі послідовності вбудовували у вектор експресії рАХ159 і експресували в Р. равіогі5 у вигляді с-Мус білків з гексагістидиновою міткою. Клітини Р. разіогіз Х-33, що містять потрібні
МНН конструкції, вирощували (30 С, 250 об./хв.) на середовищі ВОСМ (Вийегей сСіусего!- сотрієх Медішт, комплексне середовище із забуференим гліцерином; Іпмігодеп). На третій день середовище замінювали на ВМОСМ (Вийегеайа МейШапо!-сотрієх Медішт, комплексне середовище із забуференим метанолом; Іпмігодеп) і вирощували культуру далі, регулярно індукуючи її додаванням 0,5 об. 95 метанолу (100 95). Після центрифугування клітинних культур відбирали супернатант (що містить секретовані УНН).
Очищення УНН
МНН з гексагістидиновою міткою очищали на Тесап ЕМО150 афінною хроматографією з імобілізованним металом (КобоСоїштп5 100и! МісКке! Зерпагозейт 6 ЕР, АіЇ), елюювали зі колонки 250 мМ імідазолом і потім знесолювали до ФСБД. Цілісність і чистоту. УНН підтверджували 505-РАСЕ та/або вестерн-блотингом з детекцією антитілами проти Мус і МНН.
Приклад 4: Іп міо характеристика очищених моновалентних УНН
Після скринінгу очищеним МНН з високою афінністю до клітин, що експресують І КРБ, давали характеристику за допомогою ряду функціональних і біофізичних аналізів, описаних нижче: 4.1 Ефективність селективного зв'язування з ІКР5, перехресна реактивність: Аналіз конкуренції з ОККІ1 на основі ЕАС5
Під час характеристики ГКР» селективних моновалентних УНН спостерігали, що отримані в аналізі зв'язування ЕАС5 дані не завжди корелювали із силою, спостережуваною в аналізах за геном-репортером УУпиИ і М/пІіЗа, швидше за все, через високу швидкість дисоціації деяких УНН.
Тому виникла необхідність у розробці цього додаткового аналізу (тобто, РАС5З для конкуренції З
РКК), який показав себе більш надійним у відношенні селективності й визначення сили зв'язування, включаючи зв'язування з І КРБ і відсутність зв'язування з І КР. Метою був відбір функціональних УНН, які селективно зв'язуються з І КР5 з відсутністю зв'язування з І КРб, що визначається при концентрації аж до 1 мкМ. Тому ідентифіковані функціональні МНН до УУ/пи і
УупіЗа характеризували ГАСЗ для конкуренції з ОКК1 у такий спосіб:
Для аналізу конкуренції з ЮОККІ! на основі ЕАС5 використовували клітини НЕК293 зі стабільною понадекспресією людського КРБ або людського І КРб. Людський рекомбінантний
Зо ОККт (тпОКкКкІТ-НаО Бузієт5, артикул 5439-0ОК/СЕ) додавали до клітин у постійній кінцевій концентрації 1 нМ. Клітини інкубували з розведеннями гпОККІ і І КР5-зв'язувача (серійні розведення очищених МНН 1:5) протягом 1,5 години при 4 "С на планшетному шейкері. Після трикратного промивання клітин буфером ЕБАС5 їх інкубували з біотиніллованим цапиним антитілом проти людського ОККІ1 (КО Зузіетв, кат. ВАЕ1096) протягом 30 хвилин при 4 "С на планшетному шейкері. Після трикратного промивання клітин буфером ЕАСЗ їх інкубували зі стрептавідином ФЕ (ВО Віозсіепсе5, кат. 554061) протягом від 30 хвилин до 1 години при 4 "С на планшетному шейкері в темряві. Клітини двічі промивали буфером ЕГАС5, вимірювали флюоресценцію за допомогою БАС5 Аітау (ВО) і відзначали значення середньої канальної флуоресценції (МСЕ).
Вважають, що І КР5 селективні УНН будуть конкурувати з людським ОККІ за зв'язування з
НЕК293 клітинами, що понадекспресують /КР5О5 людини, але не будуть конкурувати, або з надзвичайно низькою ефективністю (21 мкМ) за зв'язування з НЕК293 клітинами, що понадекспресують І КРб людини (і, навпаки, аналогічне буде застосовуватися до ІКРб специфічних МНН). На відміну від цього, ІКРОЛЕРб перехреснореактивні МНН будуть конкурувати з ОКК1 людини за зв'язування з НЕК293, що понадекспресують І КР5 людини, а також за зв'язування з НЕК293, що понадекспресують ГКРб людини. У результаті цього експерименту було продемонстровано, що присутні ЇКР5 селективні МНН конкурують із ОКК1 людини за зв'язування з НЕК293 клітинами, що понадекспресують ІКР5 людини (тобто, зниження значення МСЕ при підвищенні концентрації зв'язувача, де повному інгібуванню ОКК1- зв'язування відповідали значення х 60 МСЕ при найвищій тестованій концентрації). 4.2 Міжвидова перехресна реактивність: миша і яванська макака
Щоб визначити, чи здатна відібрана панель І КР5 селективних УНН зв'язуватися з І КР5 від миші і яванської макаки, виконували наступний ЕАС5 для конкуренції з ОКК1:
Серійні розведення МНН інкубували із клітинами НЕК293, які стабільно експресують І КРБ миші або І КР5 макаки в присутності 1 і 0,3 нм пОКК (концентрація нижче ЕСзо для миші й макаки відповідно). Зв'язування ЮОККІ із клітинами виявляли за допомогою біотинілованого антитіла проти ОККІ1 зі стрептавідином-фе як вторинний детектор, згідно з описом вище. У результаті змогли продемонструвати таку перехресну реактивність. 4.3 Епітоп-специфічне сортування бо Експерименти з сортування виконували для найсильніших блокувальних передачу сигналів
МупИи КРБ селективних МНН, щоб визначити різні епітопні групи. Зокрема, окремі УНН перевіряли на здатність конкурувати з іншими біотинілованими УНН (так званими еталонними
МНН) за зв'язування з рецепторами КРБ за допомогою аналізів на основі ЕАС5. Серійні розведення окремих УНН інкубували на клітинах НЕК293, які стабільно експресують людські
І АРБ, разом з 200 пм або 500 пм біотинілованих еталонних УНН (концентрації нижче значення
ЕСво). Зв'язування біотинілованих еталонних МНН із клітинами визначали за допомогою стрептавідину-фе. Конкуренція МНН з еталонними МНН за зв'язування з І! КР5 проявляється зниженням флюоресценції, що вимірюється ЕАСЗ Аітау.
У результаті цих дослідів блокатори М/пітї блокатори М/піЗ поділили на дві й шість груп відповідно. 4.4 Аналізи за геном-репортером УУпИ і УУпіЗа
Здатність І КР5О селективних МНН пригнічувати Му/Упі передачу сигналів перевіряли функціональним аналізом МУпіИї і МУпіЗза. Щодо цього неможливо було використовувати встановлений протокол, довелося зробити кілька спроб, щоб установити біохімічні функціональні аналізи, такі як аналізи блокування УУупи Л/УпіЗа - КРБ: До всіх складностей з рекомбінантними білками ГКР5 (див. Приклад 1), немає функціонального рекомбінантного
МУпи-ліганду, не кажучи вже про комерційно доступний. Білки УУпі містять багато консервативних цистеїнів і модифіковані мононенасиченою жирною // кислотою (пальмітинолеїновою кислотою), приєднаною до консервативного серину. Ці посттрансляційні модифікації необхідні для ефективної передачі сигналів і секретування Уупі. Структурні аналізи показали, що один з доменів, що містить ліпід пальмітинолеїнову кислоту, необхідний для зв'язування з рецептором Ргі27єд, приводячи до зміни конформації, що робить можливим взаємодію МУпі-лігандів з І КРБ рецептором на клітинній поверхні. Виявилося, що такі посттрансляційні модифікації необхідні для функціональних досліджень із цим білком, але в той же час подібні ліпідні посттрансляційні модифікації дуже сильно ускладнюють експресію й очищення цих білків (через погану розчинність). Тому це стало великою перешкодою для біохімічних аналізів.
Тому для характеристики очищених МНН був розроблений функціональний аналіз на клітинній основі: аналіз МУпі за геном-репортером бета-лактамази. Зокрема, для пригнічення
Зо шляху МУпії клітини СеїЙЗепзог ГЕР/ТСЕ-Біа РгеебБІує 293 (Іпмігодеп, кат. К1677) трансфікували людським МУпії і відбирали клони зі стабільною понадекспресією людського
МуУпи. Для перевірки пригнічення шляхи МУпіЗза створювали клітини СеїЇЗепзог ГЕБ/ТСЕ-Біа
Егеезіуїе 293Е із стабільною понадекспресією людського УУпіЗа, і за два дні до лікування із застосуванням ГКР5О селективних МНН, здійснювали тимчасове вимикання /КРб людини за допомогою мірнк (ЗМАВАВТроої, ОМ-ТАВСЕТтТріи5 5івВМА, ЮОНаптасоп, кат. 1-003845-0010) відповідно до інструкцій виробника.
Клітинна лінія СеїЇЗепбзог» | ЕР/ТСЕ-ріа ЕРгеебіуїетм 293 містить репортерний ген бета- лактамази під контролем індукованого М/пі промотору ГЕР/ТСЕ, який стабільно вбудований у клітини Егеебіуіетм 293 (Іпмігодеп). Таким чином, експресія МУпіИї або У/піза у цих клітинах приводить до конститутивної експресії, а отже, і до ферментативної активності бета-лактамази.
Тому лікування із застосуванням функціональних І КР5 селективних МНН повинна привести до пригнічення шляху МУпії або Мупіза, що приведе до пригнічення ферментативної активності бета-лактамази.
Для аналізу 1Е0б/мл клітин зі понадекспресієюууУпи! або Мупіза висівали на 384-лунковий планшет для тканинних культур і інкубували протягом ночі при 37 "С. Наступного дня готували серійні розведення різних ЇКР5О селективних УНН і додавали до клітин у присутності ГісіІ у кінцевій концентрації 10 нМ. Як позитивний контроль до клітин додавали ОККІ у фінальній концентрації 200 нМ. Обробка ОККІ1 приводила до повного пригнічення шляху МУпИ і УУпіЗа і тому до повного пригнічення ферментативної активності бета-лактамази. Клітини інкубували протягом ночі при 37 "С. Наступного дня ферментативну активність бета-лактамази вимірювали згідно з інструкціями виробника (Іпмйгодеп, кат. КТО085). Для флуоресцентної емісії одержували значення при 460 нм і 530 нм за допомогою стандартного флуоресцентного планшетного рідера, і співвідношення емісії при 460/530 нм наносили на графік відносно вказаної обробки.
Ефективність розраховували відносно позитивного контролю (ОККІ у кінцевій концентрації 200
НМ).
Було ідентифіковано два М/пі!ї блокатора. Усього вісім УУпіза блокаторів виявили хорошу активність (ІСво нижче 100 нМ) і повну ефективність. 4.5 Аналізи фосфорилування УУПИ і МУпіЗа
Найбільш потужні й ефективні зразки з кожної групи блокаторів МУПИ, а також найбільш бо потужні й ефективні блокатори УУпіЗа згодом перевіряли в аналізах фосфорилування ГЕРБ,
залежного від МУПИ і УупіЗа. В аналізах фосфорилування використовували клітини СеїбЗепзог
ГЕР/ГСЕ 293БЕ від Іпмігодеп (кат. К1677), ко-трансфіковані векторами експресії, що кодують або
УМУпИ, або Му/упіЗза Тому що утворення комплексу МУУпі-їі27Іеа-ЇКР5 приводить до фосфорилування І КРБ і наступній спадній передачі сигналу, для вимірювання такої передачі можна використовувати кількісне визначення фосфорилування. Щоб одержати специфічні за
ІЇКР5 показання, клітини піддавали лізису й виконували імунопреципітацію за допомогою антитіла, селективного по І КРБ (спрямованого проти внутрішньоклітинного домену рецептора).
Фосфориловані І КР5 виявляли вестерн-блотингом з використанням поліклонального антитіла проти фосфо-ЇКРб (Зег1490) (Се Зідпаїйпу Тесппоіоду), яке перехресно реагує з фосфорилованим білком І КР5. Відібрану панель очищених УНН, що блокують УМУпИ і М/піЗа, що містить принаймні один представник УНН з кожної групи, перевіряли у фінальних концентраціях від 10 до 100 нм. Зокрема, клітини інкубували протягом ночі в присутності блокувальних УНН перед лізисом клітин і імунопреципитацією І КР5. Ефективність МНН, що блокують МУпиИ або
УупіЗа, при блокуванні фосфорилування І КР5 розраховували кількісною оцінкою смуг вестерн- блотингу в порівнянні з позитивним контролем (ОКК'1, фінальна концентрація 1 мкМ). 4.6 Біофізична характеристика
ІГКР5 селективним МНН-доменам давали подальшу оцінку експресії й очищення в Е. сої і
Ріспіа равіогі5, як описано в Прикладі 3. Зокрема, вихід експресії моновалентних зразків панелі
МНН уважали прийнятним, якщо він був вище 0,1 мг/л. Відібрані І ЕР5 селективні МНН показали експресію в діапазоні 0,3-22,6 мг/л в Е.соїї і вище в Ріспіа равіюгів (» 1 мг/л). Експресію оцінювали аналізом ЗО5-РАСЕ.
Термостабільність моновалентних ЇКР5О селективних МНН визначали флуоресцентним аналізом теплового зсуву (АТС) за допомогою І ідпісусіег (Коспе). УНН інкубували при різних значеннях рН у присутності Зурго Огапде, застосовуючи градієнт температури. Після розгортання укладки, викликаного теплом, оголюються гідрофобні ділянки білків, з якими зв'язується Зурго Огапде, що приводить до підвищення інтенсивності флюоресценції (Зб/Ем - 465/580 нм). Точка перегину на першої похідній кривій інтенсивності флюоресценції служить критерієм температури плавлення (Тпл). У всіх МНН Тпл підвищувалася при підвищенні рн і вирівнювалася при рН б, що є типовою для МНН схемою Тпл. Для І КР5 селективних МНН-
Зо блокаторів УУпИ і МНН-блокаторів МУпіЗа одержали середнє значення більше 68 "С при рН 7.
Методом аналітичної ексклюзійної хроматографії досліджували потенційну можливість агрегації й мультимеризації ГКР5 селективних МНН. Із цією метою 8 мкг очищеного зразка УНН у концентрації 0,5 мг/мл інжектували за допомогою обладнання Ріопех ОШітаїе 3000 у колонку
Адіїеєпі БЕС-3. Як рухому фазу застосовували І -аргініновий буфер (10 мМ фосфату, 300 мМ Агао- псІ, рН 6,0) на швидкості потоку 1 мл/хв. Жоден з МНН селективних до І! КР5 не мав великих проблем з агрегацією під час Ех-аналізу: профілі вказували на більш ніж 95 95 мономерів у більшості зразків.
Приклад 5: Створення й характеристика біпаратопних конструкцій із продовженим періодом напіввиведення
І КРБ селективні УНН для УУпИ і МУпіЗа використовували як будівельні блоки для створення біпаратопної конструкції, зображеної на Фігурі 1. Як метод продовження періоду напіввиведення використовували генне злиття з МНН, що зв'язуються із сироватковим альбуміном. Три будівельні блоки (М/пи -блокатор, УупіЗа-блокатор і альбумінзв'язувальний) з'єднували гнучким лінкером. МНН виробляли в Р. равіогіз і очищали за описом в Прикладі 3. Отримані конструкції, тобто біпаратопні ГЕРБ селективні МНН конструкції вбудовували у вектор експресії рАХ159 для
Р. равіогіз у вигляді МНН-конструкцій з сМус-гексагістидиновою міткою на С-кінці, згідно зі стандартними процедурами, описаними, напр., в УМО 2012/131078. Досліджували різну орієнтацію будівельних блоків і різні лінкери, особливо (С5-лінкери. На підставі даних моделювання гомології, що відображають збільшену площу поверхні між потенційними сайтами зв'язування МУпиї і М/піЗа в КРБ, вибрали відносно довгий (5-лінкер. Найкращі результати відносно сили за комбінованим аналізом за геном-репортером Мп і МупіЗза одержали при вбудовуванні МНН, що зв'язує людський сироватковий альбумін/ЛСА, у середину.
Використовували 35-25-лінкер, а МНН-блокатори УУпИ і М/піЗа розташували в переважному порядку.
З метою відбору оптимальних УНН-зв'язувачі і комбінацій зв'язувачві створили бібліотеку, у якій УНН, що зв'язує людський, сироватковий альбумін/ЛСА, помістили між ГКР5 селективними
МУпи -М/піЗа-блокаторами. Зокрема, у бібліотеці використовували панель високоафінних зв'язувачів з великою силою й ефективністю згідно з аналізами М/пЛИ або У/піЗа (аналізи за геном-репортером й фосфорилуванням), щоб створити біпаратопні конструкції із продовженим бо періодом напіввиведення, спроектовані, як показано на Фігурі 1. Після експресії в Ріспіа равіогів
(як описано в Прикладі 3) і наступного очищення біпаратопні конструкції із продовженим періодом напіввиведення піддавали скринінгу за допомогою аналізів за геном-репортером УУпиИ і МупіЗа (описано в Прикладу 4) у присутності 30 мкМ ЛСА в трьох розведеннях (1/100, 1/1000, 1/7000), з метою оцінити ефективність і відносну силу. У цілому спостерігали хорошу кореляцію даних репортерних аналізів МУпи і УуУпіЗа, і для багатьох форматів зв'язувачів виміряли високу ефективність. Для подальшої оцінки відібрали всього десять біпаратопних ГКР5 селективних конструкцій із продовженим періодом напіввиведення, беручи до уваги ефективність в обох репортерних аналізах і різноманітність блокаторів МУпи ії УУпіЗа. Ці подальші оцінні аналізи описані нижче.
Аналізи за геном-репортером УУПИ і М/піЗа:
Аналізи за геном-репортером УУпи1 і МУпіЗа виконували згідно з описом у Прикладі 4.4, у присутності кінцевої концентрації ЛСА 30 мкМ. Очищені біпаратопні І КР5 селективні конструкції перевіряли в 12 розведеннях, починаючи з 2,5 мкМ.
Більшість конструкцій показала високу силу - зі значеннями ІСво нижче 1 нМ в УУпіЗа і нижче 5,7 НМ в Мп репортерних аналізах, відповідно- і повну ефективність в обох репортерних аналізах для І КР5 залежної М/пі передачі сигналів.
Приклад 6: Оптимізація послідовностей УНН і МНН-конструкцій
Оптимізація послідовностей - це процес, у якому батьківську послідовність піддають мутації, щоб зробити її більш подібною до людської зародкової консенсусної послідовності (ЗНМЗ-ІСНУ.
Приміром, конкретні амінокислоти каркасних ділянок (за винятком так званих відмітних залишків) заміняють їх людськими аналогами так, щоб зберегти структуру, активність і стабільність білка.
Ці мутації можна розділити на наступні категорії: 1. Стандартні: Оптимізація послідовностей у цих положеннях не повинна суттєво змінювати стабільність, активність або афінність МНН, тому їх усе змінюють одночасно, одержуючи базовий варіант. 2. Унікальні: Невідомо, як оптимізація послідовностей у цих положеннях вплине на стабільність, активність або афінність МНН, тому їх досліджують індивідуально на підставі базового варіанта.
Відомо, що відмітні залишки критично важливі для стабільності, активності й афінності МНН, тому їх не міняють.
Крім того, амінокислоти СОК, для яких є експериментальне підтвердження того, що вони чутливі до посттрансляційних модифікацій (ПТМ), змінювали так, щоб інактивувати сайт ПТМ, не задіюючи при цьому структуру, активність і стабільність білка. Посттрансляційні модифікації, що найбільш часто зустрічаються, описані для антитіл і МНН, перераховані в Таблиці ІМ нижче.
Чутливість МНН до ппосттрансляційних модифікацій аналізували за дослідженнями з форсованим навантаженням, застосовуючи ряд стандартних умов, включаючи обробку НгОг для оцінки окиснення метіоніну, високу температуру, високий рн і тривале зберігання для оцінки дезамідування аспарагіну й ізомеризації аспартату. Процентну частку окиснення, дезамідування й ізомеризації вимірювали згідно зі стандартними процедурами й порівнювали з еталонними зразками (МНН, що зберігалися при -207С). Для визначення потенційно чутливих залишків виконували аналіз цільних білків методом хроматографії з оберненою фазою (ОФХ) і картуванням пептидів методом мас-спектрометрії (МС). Якщо після стрес--есту в УНН спостерігалися посттрансляційні модифікації, то відповідну(-ії) амінокислоту(-и) піддавали мутації.
Таблиця ЇМ
Потенційні посттрансляційні модифікації і мотиви, які потенційно запускають їх
У результаті у вищеописані конструкції ввели кілька мутацій, одержавши серед іншого три конструкції, показані в Таблиці І вище, відібрані для подальшої характеристики іп міїго і іп мімо,
як показано в подальших Прикладах.
Приклад 7: Іп міго-характеристика трьох біпаратопних ГЕРБ специфічних УНН-конструкцій із продовженим періодом напіввиведення; Порівняння з зв'язувальними І КРбЄ молекулами
Після оптимізації послідовностей УНН три біпаратопних І КР5 селективних УНН-конструкцій (див. Таблицю І вище) із продовженим періодом напіввиведення рекомбінантно експресували й очищали, після чого характеризували за допомогою ряду функціональних і біофізичних аналізів, описаних нижче. 7.1 Аналіз зв'язування ЕАС5
Зв'язування з людськими І КРБ і | КРбЄ визначали на клітинах аналізом ЕАС5, як показано на
Фігурах 2А и 2В відповідно. Зокрема, зв'язування з людським І КР5 перевіряли на клітинах
НЕК293 із стабільною понадекспресією людського ЇКР5. Для зв'язування з людським ІКРб використовували клітини НЕК293 із стабільною понадекспресією людського І РЕРб. Клітини інкубували з розведеннями І КРБ5-зв'язувачів (серійні розведення зв'язувачів 1:5, що відповідають фінальним концентраціям, показаних на Фігурах 2А та 28) протягом 1,5 години при 4"С на планшетному шейкері. Після 5-кратного промивання клітин буфером ЕБАС5, що складаються із їх ФСБ (Іпмігодеп, арт. 141190-094) ї- 10 95 ЕБС (Зідта, арт. Е7524) ж 0,05 95 азиду натрію, їх інкубували протягом 1 години при 4 "С з поліклональним мишиним антитілом, що зв'язуються з каркасною ділянкою МНН. Після трикратного промивання клітин буфером
ЕАСЗ5Б їх інкубували протягом 1 години при 4 "С з міченим вторинним антитілом (протимишине,
ФЕ (115-116-071)) з наступним трикратним промиванням буфером ЕГАС5. Флюоресценцію вимірювали за допомогою ЕБАС5 Агау (ВО). Зв'язуванню з людськими КРБ і І КРб при найвищій перевіреній концентрації відповідали значення МСЕ 2 3000. Негативний контроль складався з ненаціленого зв'язувача (МНН-конструкція, що зв'язується з бактеріальним білком, який у клітинах НЕК29З не експресується). Як показано на Фігурі 2А, зв'язуванню з І КР5 людини відповідали значення 2 3000 МСЕ при найвищих тестованих концентраціях трьох біпаратопних І ЕР5 селективних УНН конструкцій із продовженим періодом напіввиведення. На відміну від цього, не було виявлено зв'язування з ЇКРбЄ людини (значення МСЕ х 300), як показано на Фігурі 28. Ці дані підтверджують, що відформатовані, біпаратопні зв'язувальні молекули з оптимізованою послідовністю селективно зв'язуються з рецепторами І КР5 людини
Зо в їх природній конформації в системі аналізу на клітинах. ЕСзо значення зв'язування з ПІ КР5 наведені в Таблиці М нижче.
Таблиця М
ЕСовхо значення зв'язування з І ЕР5 людини, визначені аналізами зв'язування ЕАС5
Специфічність | КР5 селективних форматованих, біпаратопних зв'язувальних молекул з оптимізованою послідовністю порівнювали з описаними раніше ІКРб зв'язувальними молекулами, розкритими в УМО 2011/138391:
В УМО 2011/138391 були описані мультивалентні антитіла, що зв'язуються з І КРб і інгібують взаємодію як з лігандом Мп, так і МУпіЗ3. Ці мультивалентні антитіла, що зв'язуються з І КРб, є біпаратопними молекулами, що зв'язують ЇКРб, що складаються із антитіла (30 як перший зв'язувальний рецептор домен й фрагменту 5сЕм як другий зв'язувальний рецептор домен, при цьому антитіло дос і фрагмент 5сЕм з'єднані лінкером. В УМО 2011/138391 повідомляється, що всі зв'язувальні І ЕРб молекули мають приблизно однакову силу за репортерним аналізом М/пи і М/піЗа (Фіг. 18 М/О 2011/138391). Тому для порівняльних дослідів можна вибрати будь-яку із цих мультивалентних молекул, що зв'язуються з І КРб. Тому як першу сполуку для порівняння було вирішено використовувати конструкт "901" (позначений МОКО8168ІДде1І АГА 6475 5см; також показаний на Фіг. 27 ММО 2011/138391).
В МО 2013/067355 показані похідні цієї конструкції "901". Більш конкретно описані сполуки 8011 ї 8021 (див. інформацію на стор. 132 опису), що мають два І КРб-зв'язувальні домени 5сЕм плюс фрагмент, що продовжує період напіввиведення. Оскільки, як видно, 801 і 8027 мають однакові силу й біофізичні характеристики іп міго, то для нижчеописаних експериментів брали тільки один з них - варіант 8027.
Афінності зв'язування біпаратопних ГКР5 специфічних МНН конструкцій із продовженим періодом напіввиведення порівнювали з МОМКО8168І9ДС1І АГА 6475 5сіїм біпаратопною ІКРб зв'язувальною молекулою, використовуючи аналізи зв'язування ЕАС5, описані в Прикладі 3. Як було виявлено при здійсненні даного винаходу й показано на Фігурі 2А і Фігурі 28,
МООВ8168ІДС1І АГА 6475 5сїм біпаратопна І КРб зв'язувальна молекула зв'язується з обома
ІГКР5 людини й І КРб людини, що відповідає значенням МСЕ 2 3000 при найвищій тестованій концентрації; на відміну від цього, біпаратопні І КР5 специфічні МНН конструкції із продовженим періодом напіввиведення згідно із даним винаходом зв'язуються тільки з ІКР5 людини без зв'язування, що виявляється, з І КРб людини (МСЕ значення х 300). Ці дані свідчать про те, що біпаратопні ГЕРБ специфічні МНН конструкції із продовженим періодом напіввиведення мають різну зв'язувальну специфічність (| КР5 селективні зв'язувачі) при порівнянні з описаними раніше ГКРб зв'язувальними молекулами, описаними в М/О 2011/138391, які виявилися
ІКРЗЛКРб перехресно-реагуючими зв'язувальними компонентами при тестуванні при здійсненні даного винаходу. 1.2 Аналіз конкуренції з ОКК1 на основі ГЕАС5
Силу й ефективність І КР5 селективних МНН конструкцій додатково аналізували із застосуванням аналізу ОКК1-конкуренції на основі ЕАС5, як описано в Прикладі 4,1. НЕК29З3 клітини зі стабільною понадекспресією ІКР5 людини або мишиного ІКР5 інкубували із серійними розведеннями І КР5 селективних МНН конструкцій (серійні розведення 1:5, що відповідають фінальним концентраціям, показаним на Фігурі ЗА і Фігурі ЗВ). І КР5 селективні
МНН конкурували з ОККІ людини за зв'язування з НЕК293 клітинами, що понадекспресують
ІГКР5 людини, а також за зв'язування з НЕК293 клітинами, що понадекспресують мишиний
КРБ, як показано на ФігурахзаА і ЗВ, відповідно. Повне інгібування зв'язування ОККІ1 досягали при найвищих тестованих концентраціях (2 1 мкМ) і це відповідало значенням МСЕ х 100. У результаті цього експерименту було продемонстровано, що присутність | КР5 селективних УНН конкурує з ОККІ людини за зв'язування з НЕК293 клітинами, що понадекспресують І КРБ людини, а також із клітинами, що понадекспресують мишиний І КРБ (тобто, зниження значення
МСЕ при підвищенні концентрації зв'язувача, де повне інгібування зв'язування ОККІ1 відповідало значенням МСЕ х 100 при найвищій тестованій концентрації). Отже, дані І КРБ
Зо селективні МНН є мишиними перехресно реактивними. Дані зміцнюють позицію, що відформатовані, біпаратопні зв'язувальні молекули з оптимізованою послідовністю у своїй природній конформації зв'язуються з людськими/мишиними І КРБ рецепторами. 7.3 Комбінований аналіз за геном-репортером УУпИ і УУпіЗа
Силу й ефективність відформатованих, біпаратопних ГКР5 зв'язувальних молекул з оптимізованою послідовністю аналізували за допомогою аналізу за геном-репортером УМПИ і
МуУпіЗа, як описано в Прикладу 4.4. На Фігурі 4А, значення співвідношення флюоресценції
І460/535 нмі, позначене як "УУпи", що відповідає активації шляху УУпи, визначене на підставі клітин, які понадекспресують М/пи!; повне інгібування шляху Мп! відповідає співвідношенню флюоресценції І(460/535 нм)| х 0,8. На Фігурі 48, значення співвідношення флюоресценції
І460/535 нм), позначене як "МУпіЗа", що відповідає активації шляху УУпіЗа, визначеному на підставі клітин, які понадекспресують М/піЗа; значення співвідношення флюоресценції (460/535 нмі|, позначене як "вихідна лінія" на Фігурі 4В8 відповідає повному інгібуванню шляхи УУпіЗа, визначеному шляхом обробки з позитивним контролем (ОКК'І; кінцева концентрація 200 нм). Як показано на Фігурі 4А і 4В, повне інгібування обох шляхів МУпиї і МУпіза досягають шляхом обробки трьома ІКР5 селективними, відформатованими, біпаратопними зв'язувальними молекулами з оптимізованою послідовністю. Крім того, відзначалася також значна сила, як показано в Таблиці МІ нижче на значеннях ІСбо.
Таблиця МІ
Значення ІСво інгібування шляхів УУпиИ і МУпіЗа
Аналіз за геном-репортером
ІСво (НМ) УУПИ 0,37 0,37 0,3
ІСво (НМ) УУпіЗа «01 «01 0,05
Приклад 8: Вплив трьох біпаратопних І КР5 селективних УНН конструкцій із продовженим періодом напіввиведення на передачу сигналу М/пі і життєздатність ракових клітинних ліній
Здатність біпаратопних ГКР5 селективних МНН конструкцій із продовженим періодом напіввиведення пригнічувати активну передачу сигналу М/пі додатково охарактеризували за допомогою клітинних ліній з активною передачею сигналу М/пі, описаних раніше (Ваїйсо та ін. "Ап ашостіпе тесНапівт ог сопвійціме М/пі райулау асіїмайоп іп питап сапсег сеїІв". Сапсег Сеї! 2004;6(5):497-506; ОваїІтеїада та ін. "Те зоЇшбіе мпії гесеріог Егіг7леавсво-нес іппіріїв те дтоуУли ої їегаосагсіпотав іп мімо". Сапсег Нев. 2007;67(11):5371-9); АКІіїгі та ін. "М/пі раїймжау абе!таїйоп5 іпсійцдіпуд ашостгіпе МУпі асіїмайоп оссиг аї підп тедиепсу іп питап поп-:таїЇІ-сеїЇ Ішпуд сагсіпота".
Опсодепе. 2009; 28(21):2163-72). Якщо коротко, лінію ракових клітин з активною передачею сигналу МУпі РА-ТО-89885, висівали на 12-лункові планшети й обробляли І КР5 селективними
МНН конструкціями в кінцевій концентрації 1 мкМ протягом ночі. Здатність пригнічувати передачу сигналу У/пі виявляли за інгібуванням експресії мрнк Ахіп2, ендогенного гена-мішені
Уупі. Аналіз експресії КПЛР виконували з використанням стандартних методик РНК: Виділення
РНК здійснювали за допомогою ОІАСЕМ Кпеазу Міпі Кії згідно із протоколом ОІАСЕМ; синтез кднк - за допомогою Зирегзогірі МІСО сСОМА 5Зупіпевзів Кії (Іпмігодеп, арт. 11754050) і кпЛр - за допомогою ТадМап Сепе Ехргез5зіоп Аззау із праймерами/зондами Ахіп2 Тадмап (Н5З00610344 ті АХІМ2 БАМ, І йе ТесппоїІодіеб5), а також з еукаріотичним 185 ендогенним контрольним МІС-МОаВ (4319413Е-1307061, Арріїєа Віозувзієтв).
Як показано на Фігурі 5 (права панель), РА-Ти89885 ракові клітини при обробці біпаратопної
І КРБ селективної МНН конструкцією із продовженим періодом напіввиведення показали значне зниження відносних рівнів мРНК Ахіп2 (тобто, нормалізованих за ендогенним контролем) у порівнянні з необробленими клітинами або клітинами, обробленими ненаціленою УНН конструкцією (негативний контроль). Ці дані демонструють здатність біпаратопної ГЕРБ селективної МНН конструкції із продовженим періодом напіввиведення інгібувати передачу сигналу МУпі у ракових клітинних лініях з активною передачею сигналів МУпі. Крім того, досліджували вплив блокади передачі сигналів МУпі на життєздатність клітин у раковій клітинній лінії РА-ТО89885, про яку раніше повідомлялося, що їх проліферація залежить від активної передачі сигналів УУпі (Чапуд еї аї. "Іпасіїмайпуд тшиайоп5 ої АМЕ43З сопієї М/пі дерепаепсу іп рапсгеаїйс дисіа! адепосагсіпота". Ргос Май Асай 5сі 0 5 А. 2013; 110(31):12649-54).
Зо Життєздатність клітин вимірювали за допомогою аналізу АІатаг Віце (Іпмігодеп, Мо кат. рАЇ 1100) після обробки протягом днів із застосуванням біпаратопної І КР5 специфічної УНН конструкції із продовженим періодом напіввиведення (кінцева концентрація 1 мкМ) або ненаціленої МНН конструкції (негативний контроль) або із застосуванням доксорубіцину (кінцева концентрація 1 мкМ; позитивний контроль). Як показано на Фігурі 5 (ліва панель), РА-ТО89885 ракові клітини, оброблені біпаратопної | КР5О селективної МНН конструкцією із продовженим періодом напіввиведення показали значне зниження відсоток життєздатних клітин (зниження на 2 75590) у порівнянні з необробленими клітинами або клітинами, обробленими негативним контролем, який не виявляв впливу на життєздатність клітин. Максимальне зменшення життєздатності клітин відповідало обробці із застосуванням хіміотерапевтичного засобу, такого як доксорубіцин (зменшення на 2 80 95). Ці дані демонструють здатність біпаратопних КРБ селективних МНН конструкцій із продовженим періодом напіввиведення інгібувати проліферацію ракових клітин, які залежать від активної передача сигналів М/пї.
Приклад 9: Ефективність іп мімо
ІЇКР5 селективні біпаратопні МНН конструкції/зв'язувальні молекули із продовженим періодом напіввиведення додатково охарактеризували іп мімо на моделі пухлини, викликаної
МуУпі. Здійснили досліди, покликані визначити, чи пригнічують ці зв'язувальні молекули ріст пухлини іп мімо. Трансгенна експресія УУпі-лігандів за допомогою І ТК-енхансера вірусу пухлини молочної залози мишей (промотору ММТУ) у мишей приводить до великої гіперплазії проток з наступною аденокарциномою молочної залози в трансгенних (ТГ) мишей до б6-місячного віку. Ці пухлини молочної залози викликаються індукованою глюкокортикоїдами понадекспресією УУпі- лігандів і за своїми характеристиками подібні до ТНРМЗ-пухлин, включаючи експресію епітеліальних і мезенхімальних маркерів (подібний до базального фенотип) і активну передачу сигналів МУпі, оцінювані за внутрішньоклітинній локалізації бета-катеніну. Зокрема, пухлині молочної залози в трансгенних мишей ММТМ-М/пі-ї залежать від Мп. Повідомлялося, що блокування активності МУпі за допомогою розчинного рецептора УУпі, що включає багатий на цистеїн домен (БЦД) Егі27/Леав, злитий з людським Ес-доменом (ЕВСКОПЕс) (Оеаїтеїйда та ін. "ТНе зоїЇшбіе млпі гесеріог Егі2г7лєавСАО-НЕс іппіріїв (йе дгоули ої (егаїосагсіпотав іп мімо". Сапсег
Ве. 200767 (11):5371-9), пригнічує ріст пухлини іп мімо. Тому виділені із трансгенних мишей
ММТУ-Ю/пИ пухлини підшкірно пасивували у вигляді шматочків пухлини безтимусним мишам у 60 кількості від 2 до 5 пасажів перед початком досліду з ефективності. Між 14 їі 21 днями після імплантації коли пухлини досягли середнього об'єму приблизно 150-300 мм3, мишей рандомізували по групах по 7 мишей і вводили їм в/в сполуку. І КР5 селективні біпаратопні МНН конструкції із продовженим періодом напіввиведення вводили мишам в/в три рази (Е012900082) або два рази на тиждень (Б012900141), у дозах, показаних на Фігурі бА для БО12900082 і на
Фігурі 68 для Г0О12900141. Під час досліду з ефективності відслідковували об'єм пухлини (ліві панелі) і вагу тіла (праві панелі) і медіанні об'єми пухлин показано на Фігурах 6А і 6В. Наприкінці досліду з ефективності визначали інгібування росту пухлини (ТОЇ). Особливо, ТОЇ визначали для кожної групи лікування в порівнянні з контрольною групою (обробка мишей гістидиновим буфером - буфером з 20 мМ гістидину й рН 6,5). Крім того, наприкінці досліду з ефективності виконували шлунково-кишковий (ШК) гістопатологічний аналіз (ГЗЕ-фарбування зрізів ШК- тракту від дванадцятипалої до прямої кишки) з метою оцінити потенційну токсичність антагоністів І КР. Інгібування росту пухлини (ТОЇ), результат ШкК-гістопатологічного аналізу наприкінці дослідження ефективності іп мімо, смертність, відповідна до кількості мишей, яких довелося вмертвити через значну втрату ваги тіла (х18 95 втрат ваги тіла в порівнянні з початком досліду з ефективності), а також кількість регресів пухлин (коли об'єм пухлини наприкінці досліду менше, ніж об'єм пухлини на початку лікування), для кожної групи лікування наведені в Таблицях МІІА і МІІВ, і, щодо експериментів і дані представлені також на Фігурах 6А і
ЄВ, відповідно.
Таблиця МІА
Ефективність Р012900082 іп мімо при в/в введенні три рази на тиждень.
Результати цього експерименту показані також на Фігурі бА о їй : Гістопатологічна
ШИ Доза (|мг/кгі та! (96) |Регресії (Х/7|| Смертність (х/7| оцінка ШКТ
Гістидиновий
Контроль буфер п А
Таблиця МІВ
Ефективність РО12900141 іп мімо при в/в введенні два рази на тиждень.
Результати цього експерименту показані також на Фігурі 6В
ЩІ Доза мг/кг! ТО 95) Регресії Гх/7)|Смертність (х/7) Потопатопогена оцінка
Гістидиновий
Контроль буфер пи ОО ПО 70817701 (беоютотю 51151710
Як можна зрозуміти за Фігурами б6А-6В і Таблицями МА і МІВ вище, лікування із застосуванням ЇКР5О селективних біпаратопних МНН конструкцій із продовженим періодом напіввиведення (Б012900082 у дозі 50 мг/кг за графіком З р/тиждень і Е012900141 у дозі 15 і 50 мг/кг за графіком 2 р/тиждень) приводило до регресії пухлини (тобто, інгібування росту пухлини (ТО) » 100 95, що відповідає зменшенню пухлини; зниження обсягу пухлини наприкінці досліду з ефективності в порівнянні з об'ємом пухлини на початку експерименту), при цьому не відзначалося значних змін ваги тіла («х 1095) ії на гістопатологічному аналізі ШКТ не відзначалося особливостей, що свідчить про хорошу переносимість лікування.
Зо Зменшення пухлини (тобто, регрес пухлини) є, поза всіляким сумнівом, бажаним терапевтичним ефектом (тобто, дієвістю) при лікуванні пацієнтів, хворих на рак. Насправді, у клінічних дослідженнях лікування, що викликають регрес пухлини, що приводить до повної патоморфологічної відповіді (пПВ), позитивно приводять до значного поліпшення виживаності без прогресування й загальної виживаності у випадку великої нереалізованої медичної потреби, такої, як при раку молочної залози.
Як порівняння, далі досліджували, може чи МОКО81681ІДдс11 АГА 6475 5сім біпаратопна І КРб зв'язувальна молекула забезпечити такий же позитивний ефект. Із цією метою виконали наступне дослідження переносимості іп мімо на мишах: Сполуку МОКО8168ІДдс1І АГА 6475 5сїм вводили в. в. у дозі З мг/кг двічі на тиждень (2дм/); це ті ж самі доза й протокол, для яких в МО 2011/138391 на ксенотрансплантатної моделі пухлини була виявлена ефективність іп мімо, згідно з описом на Фіг. 22 цього документа. Першу обробку МОКО8168Ідс1І АГА 6475 5сїУ здійснили в день 1, а починаючи із дня 6, у мишей відзначали значну втрату ваги тіла. На 10-й день деякі миші, оброблювані сполукою МОКОВ81681ІДдс11 АГА 6475 5сім, показали значну втрату ваги тіла (210 95). На 11-й день мишей умертвили, і гістопатологічний аналіз ШКТ показав запалення з ерозією ободової кишки й сліпої кишки мишей. Ці дані вказують на те, що
МОКОВІбвВІДСТІ АГА 6475 5сїм в ефективній дозі/протоколі непереносимий. Таким чином, біпаратопні І КЕР5 селективні УНН конструкції із продовженим періодом напіввиведення мають перевагу відносно терапевтичного вікна; тобто, вони викликають регрес пухлини без значних змін ваги тіла (« 10 95) і без особливостей, які б виявлялися гістопатологічним аналізом ШКТ.
Приклад 10: Інгібування шляху передачі сигналів М/пі іп мімо
Щоб додатково оцінити вплив ІГКР5 селективних біпаратопних УНН конструкцій/зв'язувальних молекул із продовженим періодом напіввиведення на передачу сигналу УУпі, наприкінці описаного в Прикладі У досліду з ефективності виділяли пухлини.
Особливо, пухлини виділяли через 24 години після останньої ін'єкції сполук (Г012900082 у дозі 50 мг/кг або Г012900141 у дозі 15 мг/кг) або контрольної обробки. Інгібування передачі сигналів
УМ/пі визначали за зниженням експресії мРНК Ахіп2, а також додаткових УМпї цільових генів:
ЕМЕ43 і Моїшт у пухлинах, лікованих із застосуванням БО12900082 і Р012900141, відповідно, аналізували, як описано в Прикладі 8. ТадмМап праймери/зонди використовували для аналізів
Моїшт і ЕМЕ43, (МіптО1253278 т! Моїцшт ЕАМ і МітО0552558 т! ЕМЕ43 ЕАМ ге Тесппо!одієв5).
Кратність зміни експресії мРНК Ахіп2, ЕМЕ43 або Моїшт у порівнянні з контрольною групою
Зо показано на Фігурі 7 (ліва частина) для ефективності іп мімо із застосуванням ГО12900082 (порівн. Фігура 6А) і на Фігурі 7 (права частина) для ефективності іп мімо із застосуванням
Е012900141 (порівн. Фігура 6).
Як видно з Фігурі 7, спостерігали істотне зменшення експресії мрнк Ахіп2, КЕМЕ43 і Моїшт мрнк у пухлинах, оброблених ЇКР5О селективними зв'язувальними молекули, у порівнянні з контрольною групою. Ці результати дозволяють припустити, що ГКР» селективні зв'язувальні молекули здатні інгібувати ріст пухлини шляхом пригнічення передачі сигналів М/пі у пухлинних клітинах.
Приклад 11: Спосіб промислового виробництва 11.1 Ферментація: Будь-який з поліпептидів, перерахованих у Таблиці Ш вище, може експресуватися в цитоплазмі різних штамів Е. соїї, таких як МУ3110, ТО1, ВІ 21, ВІ 21(ОЕЗ),
НМ5174, НМ5174(0ЕЗ), ММ294, під контролем індуцибельного промотору. Цей промотор може бути вибраний з Іасимб5, гас, 17, ігр, Т5, ага». Середовища культивування переважно повністю визначене по Умітв5 та ін., 2001 (УМітв5 В., НашскК А., Кеиз5 М., Зуїдаїк С., Мацез К., зіетапп М. і
АПпеприсппег у9.: Нідн-сеіІ-депзйу БРептпепіайоп ог Ргодисіоп ої І-п-сагбатоуїабзе Овіпд ап
Ехргезбвіоп БЗузієт Вазей оп Ше ЕвсПегіспіа соїї гтпарай Рготоїег. Віоїесппоіоду апа
Віоепдіпеетгіпд, 73:95-103 (2001)), Овіїза та ін., 1999 (Оеєїїза М. Р., Гі у. С., Као б., Ууеідапа УМ. А. і
Вепіієу МУ. Е.: Мопіогіпд Стр-орегоп Тивіоп ргоївєїп ехргезвіоп дигіпу Підп сеї! аєпзпйу сийімайоп ої
ЕвсНетісніа сої ивіпд ап оп-їїпе оріїса! зепзог. ВіоїесппоЇоду апа Віоєпдіпеегіпо, 65:54--64.(1999)) або еквівалентні до них. Проте, доповнення середовища такими амінокислотами, як ізолейцин, лейцин, лізин, метіонін, фенілаланін, треонін, триптофан і валін, або комплексними компонентами, такими як соєвий пептон або дріжджовий екстракт, може виявитися корисним.
Ферментаційний процес виконували напівбезперервним способом. Умови: Температура 30 - 40 С, рН 6 - 7,5, розчиненого кисню більше 20 95. Після споживання первинного джерела вуглецю культуру підживлюють вищевказаним (або еквівалентним) живильним середовищем.
При нагромадженні у ферментері 40-90 г/л сухої маси клітин культуру індукують належним індуктором, що відповідають використаній промоторній системі (напр., ІПТГ, лактозою, арабінозою). Індукцію можуть здійснювати як імпульсну повну індукцію або як часткову індукцію, подаючи відповідний індуктор у ферментер протягом тривалого часу. Фаза вироблення повинна тривати не менш 4 годин. Клітини відокремлюють центрифугуванням у роторних центрифугах, 60 трубчастих центрифугах або тарілчастих сепараторах, супернатант культури зливають.
11.2 Очищення: Клітинну масу Е. соїї ресуспендують в 6-8-кратній кількості лізисного буфера (фосфатний або трис-буфер, рН 7-8,5). Лізис клітин переважно здійснюють гомогенізацією під високим тиском з наступним видаленням уламків клітин шляхом центрифугування в роторних, трубчастих центрифугах або тарілчастих сепараторах. Супернатант, що містить цільовий білок, необов'язково фільтрують через фільтр на 0,22-10 мкМ і розділяють катіонообмінною хроматографією (напр., Тоуореагі МедасарФ І 5ЗР-550ЕС, Тоуореап! Сідасар 5-650М, 5Р бЗерпагохе ВВ, ЗР БЗерпагозе РЕ або 5 Нурегсеї!") при рН 7-8,р5. Елюювання здійснюють градієнтом Масі, що лінійно підвищується, при рН 7-8,5. Фракції, що містять цільовий білок, поєднують і потім інкубують з 5-10 мМ ДТТ із метою запобігти димеризації або агрегації, опосередковану вільними цистеїновими залишками. Після подальшого додавання 0,8-1 М сульфату амонію або 2-3 М Масі розчин розділяють гідрофільною хроматографією (напр., на
Ріпепу! Зерпагозе НР, Ріепу! Зерпагозе ЕЕ, Вшу! Зерпагозе НР, ВілЛуЇ Зерпгозе ЕЕ, Вшуї
Тоуорва!! 650 (5, М, С), Риепу! Тоуореагі 650 (5, М, С)) при рН 7-8,5. Елюювання здійснюють градієнтом сульфату амонію або Масі, що лінійно знижується, при рН 7-8,5 у присутності 5 ММ
ДТТ. Фракції, що містять цільовий білок з мінімальним ступенем чистоти 90 95, об'єднують і знесолюють діафільтрацією у присутності 5 мМ ДТ із наступним концентруванням до приблизно 5 мг/мл. Потім виконують рефолдинг, розводячи білковий розчин 1:5-1:20 50 мМ трис, 150 мМ Масі, 4 мМ цистаміну, 10 мМ СНАРЗ при рн 8,5 до фінальної концентрації білка 0,25-1 мг/мл. Рефолдинговий розчин інкубують, помішуючи, протягом 12-36 год. при кімнатній температурі й потім розділяють катіонообмінною хроматографією (напр., 5Р Зерпагозе ЕЕ, 5Р
Зерпагозе НР, Тоуореаг! 5Р-650 (5, М, С)) при рН 7-8,5. Елюювання здійснюють градієнтом
Масі, що лінійно підвищується, при рН 7-8,5. Фракції, що містять мономерний цільовий білок, об'єднують і вводять до складу 25 мМ фосфату натрію й 220 мМ очищеної від ендотоксинів трегалози при рН 7,5 шляхом діафільтрації. Розчин стерилізують фільтрацією й зберігають при 2-86.
Приклад 12: Фармацевтичний препарат для п/ш введення
Будь-який з вищеописаних біпаратопних поліпептидних конструкцій згідно з винаходом може бути відібраний для виробництва фармацевтичного препарату для підшкірного введення з наступним складом:
Зо Лікарська субстанція: 100 мг/мл (від 1 до З нмоль/мл)
Ацетатний буфер: 25 мМ
Трегалоза: 220 мМ
Тмееп-20: 0,02 95
Лікарську субстанцію вводять до складу розчину вищевказаної композиції, стерилізують і зберігають при 2-8 76.
Приклад 13: Фармацевтичне застосування на людях
Виготовлений у Прикладі 11.2 розчин вводять пацієнтові, який цього потребує, такому як людина, хвора на рак, чутливий до інгібіторів М/пі-сигналінгу, шляхом внутрішньовенної інфузії (у дозі від 100 до 200 мг) з інтервалом від двох до чотирьох тижнів.
Приклад 14: Вплив інгібування передачі сигналів МУпіЗза на вивільнення прозапальних цитокінів дендритними клітинами в аналізі ех-мімо
У здорових донорів з їх інформованої згоди брали РВМСО. Людські дендритні клітини моноцитарного походження (Мо-ДК) створювали в такий спосіб; РВМС культивували в середовищі Х-МІМО з додаванням 50 нг/мл ОМ-С5Е і 50 нг/мл 1ІІ/-4. Після культивування протягом 24 годин, супернатант обережно видаляли й заміняли середовищем Х-МІМО з додаванням тих же М-С5Е і ІІ -4. На четвертий день, аліквоту клітин відбирали для аналізу
ЕАС5 експресії І КР5 і І КРб, і супернатант клітин, що залишилися, обережно видаляли й заміняли на середовище Х-МІМО у присутності тільки І Р або в комбінації з М/піЗа людини або з
МупІЗа людини й 1 КР5 селективними зв'язувальними молекулами. Наступного дня, супернатанти збирали й піддавали аналізу ФНП-альфа за методом ЕЇГ ІЗА згідно з інструкціями виробника.
Здійснювали аналіз ЕАС5 диференційованих дендритних клітин (ДК), як описано в Прикладі 7.1 використовуючи наступні антитіла: - ГКР5 специфічне моноклональне антитіло: мишине ІДС1 анти-ЇКР5 людини - клон 1Е9 (Зідта Мо М/НО0О04041М/) при серійних розведеннях 1:100 від 1 мг/мл до 10 мкг/мл - ГКРб специфічне моноклональне антитіло: мишине Ідс2а анти-ЇКРб людини (КО Мо
Мабр1505); при серійних розведеннях 1:50 від 500 мкг/мл до 10 мкг/мл) - Контроль: мишиний ІдсСга ізотипний контроль (баКо Мо Х0943); при серійних розведеннях 170 бо - Вторинне мічене поліклональне антитіло: козяче анти-мишине ІдсС/Ес-РЕ (Оіапома Мо 115-
115-164); розведення 1:100.
Як показано на Фігурі 8 (ліва панель), за допомогою аналізу ЕАС5 диференційованих ДК виявили високу експресію І КРБ (високі значення РЕ-А) у порівнянні з контролем. Також була виявлена експресія І КРб, але менш виражена в порівнянні з І КРБ (РЕ-А значення І КРб « РЕ-А значення І КРБ).
Як повідомлялося раніше (Одегир та ін. "Сапопіса! апа попсапопіса! М/пі ргоїєїп5 ргодгат депанйіс сеї! гезропз5ев ог оІегапсе". ) Іттипо!. 2013190 (12): 6126-344), і як показано на Фігурі 8, М/піЗа безпосередньо інгібує секрецію прозапальних цитокінів (тобто, вивільнення. ФНП- альфа) диференційованими ДК. Викликане УупіЗа пригнічення вивільнення ФНІП-альфа із ДК відновлялося при доставлянні І КР5 селективних зв'язувальних молекул.
Ці дані свідчать про те, що відформатовані, біпаратопні зв'язувальні молекули з оптимізованою послідовністю здатні відновити секрецію ФНІП-альфа за допомогою УУпіЗа оброблених дендритних клітин, у такий спосіб пригнічуючи інгібуючий вплив УУпі на дендритні клітини.
Слід зазначити, що блокування шляху М/пі у дендритних клітинах мікрооточення пухлини представляє собою потенційний терапевтичний підхід до порушення пухлино-опосередкованого пригнічення імунітету й доповнення протипухлинного імунітету.
Щоб досліджувати вплив ДК на Т-клітини (ефекторні Т-клітини), попередньо оброблені
МуУпіЗза ДК, з або без молекул, що селективно зв'язують І КР5, культивували разом з Т- клітинами, виділеними з РВМС, як описувалося раніше (Одегир та ін. "Сапопіса! апа попсапопіса! М/пії ргоївїп5 ргодгат депаніїйс сеї! гезропз5ев ог (оЇІегапсе". У Іттипої. 2013;190 (12): 6126-34). Через З дня спільного культивування ДК/І-клітин збирали супернатанти й піддавали їхньому аналізу на ІФН-гамма за методом ЕГ І5А згідно з інструкціями виробника.
Секреція ІФН-гамма (є маркером активації Т-клітин. Як показано на Фігурі 8 (центральна й права панелі), М/піЗа-опосередковане пригнічення ДК приводить до зниженої секреції ІФН- гамма Т-клітинами (пригнічення функції Т-клітин), яка відновлюється обробкою молекулами, що селективно зв'язують І АР.
У підсумку ці дані показують, що молекули, що селективно зв'язують І КРБ, пригнічують інгібуючий вплив М/пі на дендритні клітини, приводячи до відновлення Функції Т-клітин.
Зо Відомо, що постійна активація/стимуляція Т-клітин викликає кінцеве диференціювання, що приводить до виснаженого фенотипу Т-клітин втраті, що прогресує, функції Т-клітинами. Тому передбачається, що вплив молекул, що селективно зв'язують ІКР5, на Т-клітини, опосередкований активацією ДК, може бути обмежений виснаженням Т-клітин. Тому очікується, що комбіноване лікування, у якому введення молекул, що селективно зв'язують І КРБ, об'єднане із введенням інгібітора імунних контрольних точок, що блокує виснаження Т-клітин, повинне допомогти активувати й підтримувати функцію Т-клітин, тим самим змінюючи мікрооточення пухлини й підтримуючи терапевтичний ефект молекул згідно з винаходом.
Приклад 15: Вплив трьох біпаратопних І КР5 селективних УНН конструкцій із продовженим періодом напіввиведення на передачу сигналу УМУпі і життєздатність в АМЕ43 мутантних СКС органоїдах
Була охарактеризована здатність біпаратопних ГКР5 селективних МНН конструкції із продовженим періодом напіввиведення селективно інгібувати проліферацію (обумовлену шляхом інгібування життєздатності клітин), і активної передачі сигналів М/пі (обумовлену шляхом зменшення рівня мРНК Ахіп2), використовуючи органоїди АМЕ43 мутантного раку ободової і прямої кишки (СКС). СКС органоїди одержували, як було описано раніше (мап де
МУеїегпд та ін. "Ргозресіїме дегімайоп ої а Іїміпд огдапоїй Біорапк ої соіогесіа! сапсег кишки раїепів. СеїЇ 2015;161(4):933-45). Коротко, для здійснення аналізу життєздатності клітин, кожний із трьох СКС органоїдів, отриманих від пацієнтів, (АМЕ43 тий, НМЕ43 ти і АМЕ43 М/Т) фільтрували через фільтр 40 мкМ і висівали в планшети на 384 лунок (покриті матриксом базальної мембрани -ВМЕ). Особливо, «500 органоїдів ресуспендували в загальному об'ємі 40 мкл середовища (з 595 ВМЕ) на лунку. Культуральне середовище не містило УУпі лігандів.
Сполуку розподіляли за допомогою Тесап 0300 бідна! Оізрепзег. Органоїди піддавали впливу 8- точкових серійних розведень ЇКР5О селективної МНН конструкції або контрольної сполуки й однієї фіксованої концентрації стауроспорину (2 мкМ). Свіжі сполуки додавали в день 0 і день З після висівання органоїдів. Через 5 дня, використовували аналіз життєздатності клітин СеїїТйег- біо 30 Сеїї Міарійу Авззау (Рготеда) для визначення життєздатності клітин органоїдів, отриманих від СКС пацієнтів. Се Тйег-СіІо ЗО СеїІ! Міарійу Аззау представляє собою гомогенний метод для визначення кількості життєздатних клітин в ЗО культурі на підставі кількісного визначення присутнього АТФ, який є маркером наявності метаболічно активних клітин. У 60 кожному експерименті, обробку із застосуванням біпаратопної /КР5 селективної УНН конструкції із продовженим періодом напіввиведення й контрольних сполук здійснювали в трьох повторах на органоїдну лінію. Як внутрішні контролі, три органоїди, отримані від СКС пацієнтів, також обробляли із застосуванням ДМСО й Стауроспорину й відповідні дані життєздатності клітин використовували як еталон: значення ДМСО як 10095 виживання й значення
Стауроспорину як 0 95 виживання. ДМСО додавали у всіх лунки для нормування до найбільш високої концентрації (0,1 95 для ДМСО в Стауроспорині).
Для аналізу рівнів мРНК Ахіп2 з використанням кількісної ПЛР із детекцією у реальному часі, кожних із трьох органоїдів, отриманих від пацієнтів з СКС (АМЕ43 тий, АМЕ43 ти? і АМЕ4З
МЛ), фільтрували через фільтр 40 мкМ і висівали в планшети на 384 лунок (покриті за допомогою ВМЕ). Особливо, «500 органоїдів ресупендували в загальному об'ємі 40 мкл середовища (з 5 95 ВМЕ) на лунку. Культуральне середовище не містило УУпі лігандів. Сполуки розподіляли з використанням Тесап 0300 Бідна! Оізрепзег. Органоїди піддавали впливу біпаратопної ЕР5 селективної МНН конструкції із продовженим періодом напіввиведення в кінцевій концентрації 62 нМ або 1 мкМ контрольна сполука). Сполуки додавали в день 0 і через 24 години після обробки органоїди збирали для здійснення аналізу кРУ-ПЛР і визначали рівні мрнк Ахіп2 як біомаркер інгібування активної передачі сигналів УУпі.
Як показано на Фігурі 9, АМЕ43 мутантні СКС органоїди (ЯМЕ43З тий, АМЕ43 ти), оброблені із застосуванням біпаратопної | КР5 селективної МНН конструкції із продовженим періодом напіввиведення, показали значне зниження відсотка життєздатних клітин (зменшення на 2 50 95) у порівнянні із клітинами, обробленими ненаціленою УНН конструкцією (контроль), яка не виявляла впливи на життєздатність клітин. КМЕ43 дикого типу СКС органоїд (АМЕ4З
МЛ), оброблені із застосуванням І КРБ селективної УНН конструкції із продовженим періодом напіввиведення, не проявляли впливи на життєздатність клітин у порівнянні із клітинами, обробленими контрольною сполукою. Ці дані демонструють здатність біпаратопних КРБ селективних УНН конструкцій із продовженим періодом напіввиведення селективно інгібувати проліферацію ракових клітин, що несуть мутації в АМЕ43 гені, які залежать від активної передачі сигналу МУ/пі.
Як показано на Фігурі 10, АМЕ43 мутантні СКС органоїди (ВМЕ43З тий, АМЕ43 ти), оброблені із застосуванням біпаратопної | КР5 селективної МНН конструкції із продовженим
Зо періодом напіввиведення (кінцева концентрація 62 НМ), показали значне зниження відносних рівнів МРНК Ахіп2 (тобто, нормалізованих за ендогенним контролем) у порівнянні із клітинами, обробленими із застосуванням контролю (кінцева концентрація 1 мкм). КМЕ43 дикого типу СЕС органоїд (ВМЕ43 МУ), оброблені із застосуванням біпаратопної КР5 селективної УНН конструкції із продовженим періодом напіввиведення (кінцева концентрація 62 нМ) не продемонстрували істотного впливу на рівні мРНК Ахіпг, у порівнянні із клітинами, обробленими контрольною сполукою (кінцева концентрація 1 мкМ). Ці дані демонструють здатність біпаратопної ЇКР5О селективної МНН конструкції із продовженим періодом напіввиведення селективно інгібувати передача сигналів М/пі раковими клітинами, що несуть мутації в ВМЕ4З3 гені.
Перелік послідовністей «110» Воейтіпчдех ІпчеїПйвіштш Іпрехспасіопаії ставн «1202 ПОНЛІПЕНТИДИ, ЯКІ ПЕРЕШКОДЖАЮТЬ ПЕРЕДАЧІ МЕТ СИГНАЛІВ В ПУХНИННИХ
КЛІТИНАХ
«І305 12-0492-щ0-Х «160 З8 «1ї7О0» БібБАр 1.3.5 «102 1 кВ1ї» 5 «2122 Білок «213» Штучна послідовність «30» «223 сові з 50129097д08 «4005 1
ТвВЕ Тук Уві Меб б5іу 1 5 «105 2 «ії» 17 «і» Білок «21ї3з Штучив послідовність «га» «223» СО з КО129097А08 «2002 2 діа ІТієе 5Зеї Тго бек біу біу Зек Тік Тух Тух Аїа АБр бБег Уаії Гу 1 Ко 10 15 5Біу «105 3 «чаеїї» 18 «17» Білок «7513» Штучна послідовність «20» «2835 СОВЗ з кО129097А08 «4005 3 ех Ака піу Так Веї Трх Рко Бек Аху Аза Чек зіу Уаї Бех Аку Тук і 5 10 15
Ар Тух к105 4 «211» 5 к212» Білок кз13» Штучна послідовність купах «223» сові з КО129093Дд02 «4505 4
Ага ТтТух Аїз Чаї Аїа 1 5 «102» 5 к»1і» 17 «ІЙ» Бідок «2132 Штучна послідовність «220 «232 СОВО з КО129053ДА02 «0» 5
А1а ї1їе Тк Тер бетг бех сіу Ах І1е Авр о Тух Аза Авр чех Уаї Був х а 16 15 агу «9105 6 к2іїз 20 «212» ББінож «віз» Штучна послідовніств «2» кг2з» СсОВЗ з К0О129093592 «4005 5
Авройга Ах Рго Ауту Бек ТВх б1у Ак бек біу Тв біу Зекс Рко зес 1 5 10 15
Тахо Тут Авротує 29 «ах 7 «115 5 «2105 Білок «2135 Штучна послідовньств «20» «2232 СОВі з КО12З0А6С1О(БІА, Мао) «00 7
Ії бі Аіз мес сіу 1 5 «210х В «211» 16 «2122» Білок 213» Штучна послідовність
«220х «232» СО? з КЕЗ129046С10(Е1А, 326) «00» 8
Аїа чаї бек бех біу біу Зек Тв Тух Туг Уаї Азвр бек Уаї Ппуз сіу 1 5 10 15 «2105 9 «8115 12 «122 Білок «2132 Штучна послідовність «250» «?иЗ3» СОЯ з БВІтОВвАаБсіІВ(іЕТА,М32ОІ «4002 9 із ТБІ сФ1іу Ро тТух щу Рго Рго ПЦув АкЧ Авр о Тук 1 5 10 кеій» 10 «115 5 «і2» Білок «213» Штучна послідовність «Ох «ге3» срві з К01250450210 «400» 10
Ті АхпоА1За мес сіу ї 5 «21025 11 «211» 127 «122 Білок «2135 Штучна послідовність «Вей» «723» КО123057А085 (БЕЇА, У23А) повна послідовність ЇМО «005 11
Аїаз чаї бів без Уаї біз бех біу біу сіу єм уві біп Ро біу Біу 1 5 10 т бек реч ДхЯ ївцч Бек Сув Аза Аіа БбБехг біу Ага ТЬх Рбе б5ек Тлх Тук во 25 зо
Чаї Мес біу Тхр Рпе Аку біп Аза Рхо сіу Був 01: АкФ біз Бе Уаї 30 45 вів А1їа ї1іе бЗех Тгробех б03у б01у Беж ТВх Тук Тух Аїа Авр бех Уа)
БО
Туз піу Ака Ре Тік о ї1е Бех Ахку АвроАяп о бек Буд Аво Тахо Ууаї ТУЮ 55 70 75 во їез сів Ме Авп о бех пен Аку Рхо біо Авр ТВх Аїа Уаі Тух Тух Су в 90 95
А1з Аїа бек Ах біу Тих бех Твх Рхо бех Ах Аза Бек сіу узі Бек
100 105 150
Аха Тух Авр Тук Ткробіу бів 5Біу ТИХ пей Уаїі ТпПї Мазі бек дех 115 120 125 «ій» їЗ к21ї» 130 «2125 Білок кеі3» Штучна послідовність «2» «ве» КО129093А02 повна посліщовніств ЇЩУВ «4005 12 зі аі бів Без Чаї біз ех біу сіу бі бец Уа)» біп вхо б0і1У 615 1 5 105 15
Зах Гей ку їспт Бех Сув Азїа Аїа бек біу Гей Тих рРпе бек Агу Тук
Аіа аз) Віз Тер РБе АкЯ біп о Аіа Рко б1у Був біб АкЯ су) РБе паї
Аів Аза т11е Тах Тер бек бЗеї піу Ака їЛ1е Ар оТук Аїа Авробек а
Зо 55 89
Був Сі Аж РБе Твг о тТ3)іе бЗех ВХ Авр Ав» Зак Бе Авп оТви Уві Тук ва то т5 во ем біп Мес Азп обех Бей Агу Ро сій Авр ТБу Аіа уаї Тух Тух Сув 85 зо 35
Кіа Аза Авр Ага Ака Рхо Агу Бех ТОркх біу Ахоа Зек йіу ТВх біу Бек 10о Щщо5 119
Ежо бек Так Тух Авр Тук Ткр 2іу біз а1їу Тпх без Чаї тТвВке Узі век 115 129 125 вет АТа 130 «105 13 «11 180 «12» Білок «гі3» Штучна послідовність ка2гй» «йиЗ» ЕкЕОТ?9ЗОо4бСЗО(ЕЇА,МЗоСЬ повна послідовність І5У «до» 13 діз таї біп би уаї біз Зек бі біу сіу дез уві біп Рго біу біу 1 В 10 15 йЗек Цей Аха йши Беб Суз Аза Аза бек б5іу Беж ЇТі8е Рі Аа І1іе сіу 20 25 за
Аіа Мес Бі Ткр о Тухк Ак сіп Аза Рко бБіу був 513 Аку сій Пе Уаї 35 40 45
Аіа Ага Уаї Бек ех су бі Вех ТВу Туш Туї Уа) Ар Бех Чаї Був що 5 во с3іу хо Ре Тк ї1е бех Ак Авр одвп о бех Був Ава тТржх Уа Тух ев 65 то 75 о 5125 Меб Авп обес їц Ах Вкго 510 Авр Тих Аза уаї Тук Туг Сув Ав 85 ЗО 55
Аге бій Твгобіу Ро Тух біу рРхо Рго Був Ах Авр о Тук Тур сту 510 100 105 110 с51уУ Тпх без Уаї ТП о Уаї беє бек 115 125
«210» 14 «211» 120 «122 Білок «213» Штучна послідовність «Едх «23» КО129045С210 повна послідовність І5У0 «43ах 14 біз уаї бів Бей Уаї бі) бЗех біу спіу бБіу Тез Уаї іп Рко біу Б1у 1 У 10 15
Бех цем Аха їі бек Сув Аза Аза Зах біу Бех їі Ре Аку Яіе Ап зо
Аіїа Мебє бі Тер Тух Ага бів Віа Рго сі був біп Ака бій пей Чаї
Аіїа Аза Узі бек бЗех біу йбіу Зех ТлЛх Тух Тук Уві Авробетх Уві Був 5О 35 во біу Ака Ре Твх Ї1іе беж Ак Авр Ап обек Був АБп Тих Уаї Тук пед 7 75 во біп Мебє АвпобЗех їв Дку Рта сів АвроТВк Аза Уаі Тух Тухк Сув Адд 55 за Зк
Ах бів Твпх біу Рсо Тук біу рго Рко Був Аку Азр тує Ткр сіу бів 150 1053 ВЗ
Сіу тк Бей уві трг о Уаї бек беж 115 120 «Ро» 15 «кі» 5 сві» Білок «213» Штучна послідовність к220» «пеЗ3» АТВІ1 сові «41005 15
Зех Рпе зіу Ме Бех 1 5 «210» 16 к2115 17 212» Білок «13з Штучна послідовність «вайх «2232 АІВв1І1 сок «390з 16 дах її Бек піу бек піу Бех Ав5р Тпх Бей Тук Аїа АБр Бек Чаї Гуз 1 5 о 15
Чу «105 17 «2115 5 «212» Білок
«2132 Штучна послідовність «ВО» «в2а» вові спа «005 17 піч біУу ех їз Бек Ак 1 о «2102 18 «211» 432 «2122» Білок «213» Штучна послідовність «го «223з ЕО12900082 повна послідовність «400» 18 віз Уаії біп Пеип уУаї сій Бех б0іу біу щу бєий Чаї біп Рко сіу 019у 1 5 10 15 бех їв Ах їєм Вех Сук Уаі Аїв Бех бі Ак Тпх Ва Бех ТВх ТУХ го 25 30
Чаї Мек біу Ткр Бе Ага біп Аза Ркро бі уз сій Ах б31й Ре Ууаї діа Аза Ізїіе Зек Ттр обех б)іу біу бек Три Тух Тух Аза Авзр Бех Маї зо 25 50 їув З1у Акад Ріе Ту Ії Зех Ас Авр Авпобйех Був Аза Тих Маії Тух 65 То 5 80
Без бів Мек Аза бек Те) Ак Рго бі Авр Тк Аза Уаї Тухк Тух Сув 85 Зо За
Віа діа Зек Аку біу Тих Бех Тих Рхо Зех Ахо А1з Бех бБіу Уві Бек їп00 195 119 вка Тук Авр Тут Ткр б1іу б іп біу Тпх пецй Уаї ТПУ уаї Бех Бех біу 115 120 125 сіу Біу 01іу бЗек бі1у біу бі біу бек біу біу бі1у б5іу Бех біу Щ1Уу 135 1535 145 сіу біу Зех біу 53іу біу піу Зех сіу бу б1у біу бех сіу біу с19У 145 150 ї155 160 сіу Зек бій уві біп о Без 81 біо Вес біу біу біу бем уаї сів РКО 165 179 175 с1іу Авп обет їев Ака Грей бек Сув Аза Аза Зех біу Рпе Ту Ре вехг їв 185 190
Зек Рпе піу Меб Бех Ткр Уаі Агя сіп Азія Ехо біу Бухя сіу пев бій 135 290 205 тТкЕр Чаї Зек Чет Іі бех біу Бех біу Бех Авр Тк Пец Тух Аїаз Авр 210 215 рам)
Зек чаї Був сСіу Аку Рпе Тож Їїє бех Аг йзр Авп оАіа Пув Так тах а 230 235 240
Пец Тух це) бів Меї Ак» Бек Бей дка Ро бій Авр о тТвх Аза хУа1ї Тук 245 25 255 тТук Сув Тах тів біу біу бек Пес Бех Аха бек Бек біо біу Тах цей 280 263 279 уаї Тах Уаї Бех Чек б5іу сіу б3іу сіу Бех сіу 51іу біу сіу Зек 1у 275 289 285 -іу бі біу бек біу біу піу біу бек біу сіу біу б1у Чех біу сїу 290 235 Зоо сСіу Біу бек сіу біу біу біу Бех бій Уаії біп без а) біо бек біуУ
305 зів 315 32560 пІіУу Бі їжу тУуаї бій рго бі біу Яек Бей Акод Бей Бех Су Аза дй1а
За з30 335 бек біу беж 11 Рпе Ага ІЗ Авп Аза Меї 01у Тжхр Ту Ахку біп Аза зай 345 зв
Рхо біу Був біп Ах біз Бей Узі Аза Аіз Заї бек Бех бі сіу бек 355 З6о0 365
Тих Тух Тук Уві Авр Зек Уві БПув піу вка Рпе Тк Їїє Зак 2г9у Авр 370 375 зво
Азп оЗек їмз Ак ТВх уаї Тух пей біп Мес Аво бек Їїей Ака Бго під 385 3560 за5 00
Акр Тих Аїа уві тТУук Тухк Суб Ап дкЯ біз Тпк о біу Вко Тук бБіу РКО 405 410 15
Рхо Пйуз Ака Авр о тТук ТЕр сіу сіп ї03у ТВк без уаї Тр Таї бек Бех 425 425 450 «2105 15 «211ї7 435 «12» Білок 2135 Штучна послідовність «2205 «газ РОї5800155 повна послідовність «4005 19 діа таї біп їєв Ууді блю беж сі1у бу піУ їз тУаї бій Рко бБіу п1у 1 З 16 ї8
Зех це» Ак йо) бЗежх Сув Аіа Аїз Бек пБіу дек їїе рРпе Ах Ті біу а 25 хо
А1їа Мес біу Ткр Тух Аку бій Аа Рко піу був бБіп Аа пів бєм Чаї 35 40 45 діа Аза Маі бек Бек сіу біу ЯЗеї Тр Тух Туїх Уаї Ар бек Уаії ГПув 5о 55 5О 5іу Аху Рре Тр отїіе Зех дга Азвр Аво Бех буз5 Аво ТЕ Хаї Тух гей 7 ТВ о іп Меб Авп одех ред дк Рхо бій Азр Те йіа Уаї Тук Тухк Сув Ав 85 зо 5 дха бі Твих біу Рхо Тук О1у Рко Рго був Ак Вар Тух Ткр біу віп 108 105 110 бі Тах Бей Уві Трх Уай бек Зах бі Шіу біу сбіу бек піу бі піу 115 120 125 б5іу Бех біу біу біу біу бБеб біу біу сіу біу Бех біу сіу Біу їу 138 135 140
Бех спіу біу біу біу Бех 0197 СтТу б1у Сіу Бек саіц уді сіп пес Уві 135 ї50 ї55 1650
Бі бек Бі спіу 51 Бец уаї бзіп Рхо 51у Авп о бех цей Ага Бей ек 155 170 175 був діа Аз15 бек б1іу Ра ТБк Рпе бек Бетг Рпе біу Меє бек Ткр Уві 159 185 190
Ахо сів вза вхо біу бух біу Без бій Тер Уві беїх Бек їі Бех 1У 195 280 205 бек б1іу Бех Акр Тк Без Тух Аізіз Авр ех Маї Був вБфу Ага рРре ТЕ 210 215 220
Ііе бек Ака йно Ваза Аза Був Твх ТАх пед Тух пев бір Мес бо бек
ТЗ 230 233 240 їв. Ак Рко біз Ахяр ТВх Аза таї Ту Тух Суз ТОх Ті біу сіу Бех
245 250 255 їез Бех Аха бек бек сій біу Три їв Маз) тах Уаії Бех дек 01 біу 259 268 270
Бі сіу Бек Біу сіу б1у сі Бек сіу зіу Біу біу Зек сіу біу 01Уу 2-75 280 285 піу Бех сіу біу б1у біу Бех біу б1іу піу Біу бек біу бБіу сіу біу 250 295 зоо
Зек 51» Уаї біп їею уаії бів Зек біу біу Бі Бе Мах бБію Рхо б3іу 305 з10 35 329 біу Век їецй Ака Бец Бех Суз Аза Аїа Бек б5Біу Бей ТУ Рпе бек АкКФ зи з30 335
Тух Аіїа аї Віа Тер рРіпе Аха біб Аза Ро бБіу Був бій Ах сів Ре заз 345 3585 уаї Аза Аїа їі Тр Тер Зех Бек бі АкЯ4 ІЗ Авр Тух Аза Взр Бас 355 зво 3655 таї Бу сіу Ага Бе Ту Іїе бек Ага Авр Авп о Ветх пуб дво Тдх Чаї
ЗО 375 зво
Тук цей сів Мех Авп бег Теой Ага рго пі) дер отак Аза Уа1ї Тук Тук за 390 395 409 був Аїа А183 Авр АкЗ АхЯ Рхо дге Бех Тк 51іу АкУ Бех б1іу Тих с1іу 425 410 4315
Бек Рхо бек Тих Тух Авр Тує ТЕр сім біп Сіу ТБк обем Маії ТВх Уаї 480 425 430
Зех Бех іа аз5 «2102 20 «211» 433 «2122» Білок «2135 Штучна послідовність 220» «8235 КБО12500141 повна послідовність к1005 20
Аїа уаї біп ївц баї бід бех сіу біу біх Пец Уаї біп Рко біу Біу 1 5 10 15 ех Гецз АкаЯа Пей ек Су Аза Аза Бек біу Ак Тих Рпе Зек ТВ Туг 2 аз 30 чаї Мек сіу Ткр Ре Аку сіп Аза Рхо йіу бу« Сі Ака бій Ре Уа) діа Аза їіїе Бек Тер Вех сі біу Бех ТБк Тук Ту Аза Ввр бек Уаї 5 во
Був с1у Ах Бпе ТПх ї1іє Бех Аку АДвр ово бех Був Ап о Так Хаї тує
У 70 75 89
Бей біп Меб дав хек Бей АтгЯ Рхо 010 Авр ТвВх Аіа Уві Тут Тух Сув 35 зо 95
Аза А1а бек Ах сп1іу Тих беє тах Рко Бех Аху Аіа бек біу Уаї зек 190 105 119
Ака Тут Двр оТух Тер о біу сів біу Трх Гем уаї ТВ о Уаі беж ех щ1у 115 179 125 біу біу с1іу Бех СьЬу 5іу біу біу бек біу 5і1у сБіу 615 Беж с1у Біу 130 135 140 біу пЩіу Зесг сіу біу біу бі Бех біу біу біу біу бек біу сху бІіу 145 1559 155 160 сіу бек сід таї біп бем Уві Сів Зек біу біу біу без уаї біп Рко 165 170 175 сіу Авпобех їй Агу Її бек був Аза Аза Зек біу Ре ТБу РвБе Зех їво і85 150
Вех Ре біу Меїб бек Тр ві Аха біп Аза Рхо сбу Пув БЕу цей 51) 135 200 205
Тер Уаї Бех бех ї1е бек біу бек біу Бех Авр Твх пеб Тук Аїа Вер 210 ів 22о
Бех чаї Був біу Ако вБле тожх 18 бех Ак дар Ав Аїа уз ТВх ТЕ 225 230 235 240 пев Тух гезі бір Меї Авп о бек Без Аа Рко сіб Авр Тк Азїа Маії тух 245 25 255
Тук Суя ТІ 115 сіу піу Бех їец Бех дка бек бек піп бі ТЕ Без ва 285 27а
Ммаії Твх Уві ВЗек бер сіу сїу сіу піу Зек 5іу 51у сіу сіу Бех 51у 250 285 зіУу піу БіуУу бЗехк біу біу біу біу Зек пі піу бі сіу Бех сту біу 290 235 300 сіу біу Бех біу біу біу біу Бек бій 7аї Сіп цев Уві бів бек сіу 305 зів 315 Зо сіу Біу Без Уді біп рго біу біу бБег ви Аку їеб Бек Сув Аїя Аїд з25 339 335 бЗех біу йежх Хі Ра Ак їіє 51У Аза Меб біу Тгр Туг Ага біп А1д з45 345 352
Рхо б1Уу Муз бів Аха бій пе; уві Аза Аїа Уді Бек беїх б1їу сіу Бех 355 355 365 тТвж Тух Тухк Уа1 Авр Зех Уаї Пув 51у Аку Ре ТНЖ Ізе Бех Ахоа Ар 379 375 ЗО
Авп бек Був Анни Тпх Узі Тух їм Сію Меї Авп обех Пе Аку Рго бід 385 90 355 400
АвротТйх діа уві ТУух Тук Сує Ва о Аха біо тах 01у Ро Ту біу Рхо 05 4319 415
РКО Був Ак АБр Тух Тер біу біп с01у Три без Уаії Тк Уаї Бех зек 420 425 430
Аів «2105 81 к2гїї» 115 «212» Білок «213» Штучна послідовність «Ох «ди» 81511 повна послідовність «-400з 21 сі Уві бів їз Уаї б)ібз Зек 51іу б51у піу їв баї біп ВБко фу АБп
І 5 10 15
Зеєж рей Ака обев беї Суз Аза Аза Чех б1іу Рре Тих Ре Бех Бех Рре сіу Мес Вех Тер Заї Ак сів Аза Вхо біу Був бі1у Без ФР Ткр Уаї
Бек Зежє ї1з: бех сіу беб йпіу Бех Ачзр Тс йез Тух Аіїа Авр Зех МУаї па 60 їув біу Аха Рва Тих їЇїє Бех Ак Авр ов Авіа уз Тс ТП о пев Тут о 73 й на їви біп Меї Аза бек Пец уд Ро біб Авр ТЕ Аза аі Тук Тут сук 85 Зо З5
Тиж Ії біу біу Бек цер бек Аху бек Бех сій сіу Твк Без баії Ту
То09 105 ІЖЩУ уаї бек век
«2105 92 «11» 121 «2122 Білок «213» Штучна послідовність «202 «гЕ3» кОТ2Зпчес10(М32) «4005 28 пів уУаї бів їец Заї біз 5Зех бі сіу біУу во Уаї бів Рхо 51іу бБ1у 1 5 18 15
Зек Пец АкЯ Без Зек Сув Азіа Азїа йех сіу Бек Тіє рРйе дк Ті б1у о 25 зо
Аїз Меб біу Ткр Тук АкЯ біп Аіїа Рко 51Уу Пув біп Вк Сів Твен Уді
Аїз Аіа Уаї бех Бех с1і1у біу Бек ТПЕ Тухк Тух Узі Авр Бек Уаї Був
Зо БІ 50
Сіу гу Рає ТК Іїе Бех Аго Авр Ав Бех Мув Авп тТВкЕ тУаї Тук Ббем 5-5 70 75 во біп Меї Ап бех Пей Ах Бкго бій Авр Тлх Аїа Маі Тух Тук Сув АвБп 85 зо 5 дка сія тТву бі Рко Тук біу Рко Рхо був Ахку АзротТух Ткр б1у біп ї0а 105 То с1у Тйх пе уаї Тв уаї Бек чех А1а 115 120 «2105 23 «2112 1957 «219» Білоє 213» Штучна послідоввість «га» «223» КО1929097АО8 «бо» 23 сій узі біб о їец уаї 61; бек щ1у біу біу пев баї бій Рхо сіу піу 1 5 10 15
Бек Ппей Акуч їви бВех Сув уві Аіа беж бі Аку ТЕ РБе бек ТЬх Тук за 25 30
Чаї Мек 51у Тхр Впе Ак біп Аіа Во біу був бій Ах бі: РБе Уві 35 40 45
Віз Аїа ї1іє6 бех Тхр бек 51у біу Бех Ту Ттук Тух АтТа Авр ех Уді зо 5 5 рув сіу ду Рре ТвВкг ті Бех Ахо Авр Ап обах пу Авп о Трх Узі Тує 85 70 75 во їц біп Меє двзп обех Ццез Ара Рто біб Ар Тйх Аза Уаї Тук Тух Сув я зо з5 діа Аіа бек дк3з сСіу ТВгобБех ТЬх Рхо бек Аку Аіїа бек біу Уаї вехг 109 105 110
Ака тТук Ар ТуУухк Ткр біуУу бій сіу ТВх без таї ТрЕ Уаї Бех чех 115 12 125 «2105 24 «2115 30 «2129 Білок
«132 Штучва послідовність ква ЕВі з КО1290З7АОВ (БІА, УА) «зп 24
Аіа туаї бій їй: Уаї 61 бЗеє бБіу 01у біу перо о Уді біп Рхо 61 Б1у 1 5 10 15
Чех Гей Аку ей Бех Сув Віа Аза Зах біу Аку Трек Рбе бех «ві1о0» 25 «3115 14 «8195 Білок «вії» Штучна послідовність «шу» «23» ЕВ2 з КО1238097ДдО8 «400х 75
Ттр Ре Акз сій Аїа Вко біу ув біс Ах Сів Рбе Уаї Аїа8 1 5 10 «210» 86 «ії 32 «212» Бідож «7135 Штучна послідовність «ве» «223» БЕВЗ з К01259097А08 «400» 26
Ах Бпе Тах 11є бек Аку Ар Ап обБекх Був Авп о Тпх Уві Тухк ви біб 1 5 10 15
Меє Авп обех Бей й Рко 51 Авр ТОх Аза Чаї Тук Тух Суз Аза Аіа 2О х5 30 «210х 277 «2115 11 «212» Білок «13» Штучна послідовність к2Ох «2235 ЕВЯ з БОЗ328097АОВ «00» 27 тв сіу біб Біу Тк Пе Уаї Тк оМаії Бех бек 1 5 130 «2105 28 «1їз 30 «1?» Білок «2137 Штучна послідовність
«вад» «223» ЕВі з КкО128093А02 «ОО» 28 піз Уаї біп без Уаї біб бЗех біу б1у б1іу Бей ма) піп Ро сі сіу ї З 10 15
Зек Беш Ак бйец бЗек Сув Аза Аїзїв бех йпіу Бей тах Ре бех
Зо «10» 29 «211» 12 «2122 Білок «213» Штучна послідовність «вай» «2232 ЕВ4А з ЕО129З093А0Х «800» 29
Тхр біу біп бБіу Тих йей Уві ТВх о Уді бБеї Бех Аза 1 5 10 «2102 30 «51їх 50 «іа» Білок. «2132 Штучна послідовні ст «Ей» «8523» ЕВ1 з КО1295097А08 «400» 30 піп тУаї бів їєцн Уаї бід бек бзіу біу біу Бей уаї біп рхо біу бБ1у 1 5 їо і15
Зех йео дк без бех Сув Узі Азіа Бек біу Ага Тс Бе Беж 20 25 30 «війх 31 «2115 39 «2122 Білок «213» Штузна послідовність квах «га» кВІ1 з КкОТ29046с10 (БЕТА, МЗС) «400» 31
Аіз Ууаї біп її Уа1ї бів бек біу б1у сіу Бей уаї сій Рко біу б1у 1 5 10 15 ек їва Аху їз Беж Суб Аїа Аза Бех сіу Зех ї1їе Ре Аго 20 23 За «2105 32 -2115 14 «212» Білок «213» Штучна послідовність
«ВР» кга3» ЕВ2 з КЕО129046С10 «400» 35
ТЕр Тух Ахч бїп Аза Рхо біу дує Сіп Зга бій Пе) Чаї діа 1 5 їв «2105 33 «2117 32 «212» Білок «2135 Штучна послідовність «г 223» ЕВЗ3 з БП123046с10 «450» 33
Ах Рпе тТВх їі Бех БтЧ Авр о Азп о бетх Пуз Аап Тс оУаії Тух ей бій 1 а 10 15
Меб Авпобех Бе) Ага Бгто бій Авротпг Аїа узі Туг Тухк Сув Ава Ака а 25 Зо «2105 34 каії» 30 «1й» Білок «13» Штучна послідовність «Ей» ка» ЕВЗ з БО129036Сс10 «400» 34 сім Уаї сій їцез ба1ї біо бек сіу біу біу є) уаї сів Рго 51у с1у 1 5 19 15
Бек Пец Ак їжи Бех Сув Аіа А)із Зек біу бег ї13е ре Акд «210» 35 «2115 ЗО «1 ВБідож «213» Штучна послідовність «220х «ги35 БЕК з АБв11 «4005 35 вій уаї бів єм Уві бій Бех бБіу Біу б1у Бей уві бів Рхо Б1у Авв 1 З 10 15 бек Пец Ах во бет Сув Аза діа Зек біу Ре Тих Рбе зЗех а 25 ЗО «ВТО» 35 «211» 14 «2122 Білок «2132 Штучна послідевнаістіх
«220х «ро23» ЕВ з АБВІ1 «00 35
ТЕр уаії Аку «іп АтТа Рхо піу Пузв біу Бей 5іц Тр чаї ет 1 5 10 «ВТах 37 «115 32 «РІ1Й» Білок «213» Штучна послідовність «ех «223» ЕВЗ з дЬВІ1Ї «4005 37
Вга впе Тег о їїє Вес АгаЯ Ар Авп діа пузв ТВх Тк ей Тух без біп 1 5 16 15
Мес Авп бек ес Ахо Рхо біз Аво ТОх діа Уаї Тук ТУуК Сув Тпх Ї12 2а 25 зо «2105 38 сії» 11 «212» Білок «213» Штучна послідовність «гг? «273» ЕВ4А з ВІВ1ТХ «айо0» 38
Зак бек піс б1іу ТВ пев» Узі тих Уві Бех вес
А З 10

Claims (22)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Поліпептид, який зв'язується з білком 5, спорідненим до білків сімейства рецептора ліпопротеїнів низької щільності (ІРЕР5), де поліпептид містить одиночний варіабельний домен імуноглобуліну (ІЗМО), вибраний із групи, яка включає ІЗМО (1)-(ІМ): (І) ІБМО, що містить наступні послідовності ділянки, що визначає комплементарність (СОК): СОВІ: ТМУМа (ЗЕО ІО МО), СОоР2: АІЗМУЗаазТУМАОБУКа (ЗЕО ІЮ МО 2), СОовЗ: БВаТЗТРОВАБОМЗАМОМ (ЗЕО ІО МОЗ), (ІІ) ІЗМО, що містить наступні СОК послідовності: СОВ1: ВУАМА (5ЕО ІЮО МО 4), СОР2: АІТУЗ5аВІЮОМАОБУКа (5ЕО І МО:5), СОовВЗ: ОВАРНЗТаНнЗатТавзРОТМОМ (5ЕО І МО:6), (ПІ) ІЗМО, що містить наступні СОК послідовності: СОН: ІСАМО (5ЕО І МО:7), СОоР2: АУЗЗаазТУУМУрБУКа (ЗЕО ІЮ МО:8), СОКЗ: ЕТОРУСРРККОМ (ЗЕО ІО МО 9), і (ІМ) ІЗМО, що містить наступні СОК послідовності: СОН: ІМАМа (ЗЕО 10 МО:10), СОоР2: АУЗЗаазТУУМУрБУКа (ЗЕО ІЮ МО:8), СОВЗ: ЕТаРУСРРКАОЮМ (5ЕО І МО:9).
2. Поліпептид за п. 1, що містить перший ІЗМО, вибраний з ІЗМО (І) і (Ії), ї другий ІЗМО, вибраний з ІЗМО (ПІ) ї (ІМ).
3. Поліпептид за п. 2,
- де перший ІЗМО являє собою І5МО (І) і другий ІЗМО являє собою ІЗМО (І); або - де перший ІЗМО являє собою ІБМО (І) і другий ІЗМО являє собою І5МО (ІМ); або - де перший ІЗМО являє собою ІБМО (ІІ) і другий ІЗМО являє собою ІЗМО (І); або - де перший ІЗМО являє собою ІБМО (ІІ) і другий ІЗМО являє собою ІЗМО (ІМ).
4. Поліпептид за будь-яким з пп. 1-3, де вказані ІЄМО являють собою МНН-домени, переважно гуманізовані МНН-домени.
5. Поліпептид за п. 1, де ІЗБМО (І) містить послідовність ЗЕО ІЮ МО:11 або послідовність ЗЕО ІЮ МО:23, ІБМО (Ії) містить послідовність ЗЕО ІЮ МО:12, ІБМО (ІІ) містить послідовність ЗЕО ІЮ МО:13 або послідовність ЗЕО ІЮ МО:22, та/або ІЗМО (ІМ) містить послідовність зХЕО ІЮ МО:14.
6. Поліпептид за п. 5, що містить перший ІЗМО і другий ІЗМО, де вказаний перший ІЗМО містить послідовність БЗЕО ІЮ МО:11, 5ЕО ІЮ МО:12 або 5ЕО ІЮ МО:23, і вказаний другий ІЗМО містить послідовність ФЕО ІЮ МО:13, 5ЕО ІЮ МО:14 або 5ЕО ІЮО МО:22.
7. Поліпептид за пп. 6, - де вказаний перший ІЗМО містить послідовність зХЕО ІЮ МО: 11 і вказаний другий ІЗМО містить послідовність ЗЕО ІЮ МО:22; - де вказаний перший ІЗМО містить послідовність ЗЕО ІЮ МО:12 і вказаний другий ІЗМО містить послідовність ФЕО ІЮ МО:13; або - де вказаний перший ІЗМО містить послідовність зЕО ІЮ МО:23 і вказаний другий ІЗМО містить послідовність ЗЕО ІЮ МО:14.
8. Поліпептид за будь-яким з пп. 2-7, де вказаний перший ІЗМО і вказаний другий ІЗМО ковалентно зв'язані лінкерним пептидом, де вказаний лінкерний пептид необов'язково містить або складається із третього ІЗМО.
9. Поліпептид за будь-яким з пп. 2-8, де вказаний поліпептид додатково містить компонент, що збільшує період напівжиття, де вказаний компонент, що збільшує період напівжиття, ковалентно зв'язаний із вказаним поліпептидом і, необов'язково, вибраний із групи, яка включає альбумінзв'язувальний компонент, такий як альбумінзв'язувальний пептид або альбумінзв'язувальний домен імуноглобуліну, трансферинзв'язувальний компонент, такий як Зо антитрансфериновий домен імуноглобуліну, молекула поліетиленгліколю, сироватковий альбумін людини і фрагмент сироваткового альбуміну людини; переважно де вказаний компонент, що збільшує період напівжиття, являє собою альбумінзв'язувальний компонент, переважно альбумінзв'язувальний ІЗМО, більш переважно АІр11-домен, що містить послідовність 5БЕО 1О МО:21.
10. Поліпептид, що містить перший і другий ІЗМО, що зв'язують ІКР5, і один альбумінзв'язувальний ІЗМО, - вказаний перший ІЗМО, що зв'язує І КРБ, вибраний із групи, яка включає ІЗМО (І) і (1): (І) ІБМО, що містить наступні СОК послідовності: СОВІ: ТМУМа (ЗЕО ІО МО), СОоР2: АІЗМУЗаазТУМАОБУКа (ЗЕО ІЮ МО 2), СОовЗ: БВаТЗТРОВАБОМЗАМОМ (ЗЕО ІО МОЗ), (ІІ) ІЗМО, що містить наступні СОК послідовності: СОВ1: ВУАМА (5ЕО ІЮО МО 4), СОР2: АІТУЗ5аВІЮОМАОБУКа (5ЕО І МО:5), СОовВЗ: ОВАРНЗТанЗатТавзРОТМОМ (5ЕО І МО:6), - вказаний другий ІЗМО, вибраний із групи, яка включає ІЗМО (ПП) ї (ІМ): (ПІ) ІЗМО, що містить наступні СОК послідовності: СОВІ1: ІСАМа (ЗЕО ІЮ МО 7), СОоР2: АУЗЗаазТУУМУрБУКа (ЗЕО ІЮ МО:8), СОКЗ: ЕТОРУСРРККОХУ (5ЕО ІО МО:9), і (ІМ) ІЗМО, що містить наступні СОК послідовності: СОВІ1: ІМАМа (5ЕО І МО':10), СОоР2: АУЗЗаазТУУМУрБУКа (ЗЕО ІЮ МО:8), СОВЗ: ЕТаРУСРРКАОЮМ (5ЕО ІО МО:9), - вказаний альбумінзв'язувальний ІЗМО визначається як такий, що містить наступні СОМ послідовності: СОВ1: 5БРОаМ5 (ЗЕО І МО 15), Сов: 5ІЗВОЗОТІ МАрБУК,а (5ЕО І МО:16), СОовЗ: аа5І ЗА (5ЕО І МО:17). 60 11. Поліпептид за п. 10,
- де перший ІЗМО являє собою ІБМО (І) і другий ІЗМО являє собою ІЗМО (І); або - де перший ІЗМО являє собою ІБМО (І) і другий ІЗМО являє собою І5МО (ІМ); або - де перший ІЗМО являє собою ІБМО (ІІ) і другий ІЗМО являє собою ІЗМО (І); або - де перший ІЗМО являє собою ІБМО (ІІ) і другий ІЗМО являє собою ІЗМО (ІМ).
12. Поліпептид, який зв'язується з І КРБ, що містить або складається з послідовності, вибраної з ЗЕО ІЮ МО:18, 19 і 20.
13. Молекула нуклеїнової кислоти, переважно у виділеній формі, що кодує поліпептид за будь- яким з пп. 1-12.
14. Експресійний вектор, що містить нуклеїнову кислоту за п. 13.
15. Клітина-хазяїн, що несе експресійний вектор за п. 14.
16. Спосіб одержання поліпептиду за будь-яким з пп. 1-12, який включає стадії: - культивування клітини-хазяїна за п. 15 в умовах, які надають можливість експресії поліпептиду за будь-яким з пп. 1-12; і - відновлення вказаного поліпептиду; і, за вибором, який додатково включає стадію - очищення вказаного поліпептиду.
17. Фармацевтична композиція, що містить: (І) як активний компонент поліпептид за будь-яким з пп. 1-12, і (І) фармацевтично прийнятний носій, і необов'язково (ІІ) розріджувач, наповнювач, ад'ювант та/або стабілізатор.
18. Поліпептид за будь-яким з пп. 1-12 для застосування як лікарського засобу в способі лікування, запобігання або ослаблення захворювання, порушення або стану в людини або тварини.
19. Поліпептид за будь-яким з пп. 1-12 для застосування при лікуванні злоякісного новоутворення, переважно раку молочної залози, раку легень, специфічно недрібноклітинної карциноми легень (МЗС С), раку підшлункової залози, раку ободової і прямої кишки, сарком, раку яєчників або гепатоклітинної карциноми, або для застосування для лікування ідіопатичного захворювання легень, або для застосування для лікування ретинопатії, викликаної аномальною передачею сигналів М/пі; переважно для застосування при лікуванні тричі негативного раку молочної залози (ТМВС).
20. Поліпептид за будь-яким з пп. 1-12 для застосування в комбінації з хіміотерапевтичним Зо засобом, терапевтично активною сполукою, яка інгібує ангіогенез, інгібітором шляху передачі сигналу, інгібітором ЕСЕЕК, імуномодулятором, інгібітором контрольної точки імунної відповіді або засобом для гормональної терапії.
21. Застосування поліпептиду за будь-яким з пп. 1-12 для модифікації мікрооточення пухлини шляхом інгібування УУпи- ії М/піЗа-опосередкованої транскрипції цільового гена в дендритних клітинах, де вказане застосування являє собою застосування в умовах іп міїго.
22. Поліпептид за будь-яким з пп. 1-12 для застосування для лікування злоякісного новоутворення в комбінації з інгібітором контрольної точки імунної відповіді, вибраним із групи, яка включає анти-РО1-антитіла, анти-РОЇ 1-антитіла, анти-СТІ А4-антитіла, анти-ВТІ А-антитіла, анти-І АСЗ-антитіла і анти-ТІМЗ-антитіла, або в комбінації із протираковою вакциною. бо ши: М інгібітор Мвза" ли за ооо шш паддпиаавиь
Фіг. 1 в1
2А БО а009 мой Я, -- МОКОВІВЕНН В А ВАТ ВУ Й ж о плекати - ЗО0О. ит - БЛОЮВОВ ве ДІ - ЕФООВОТІВ Ж з00о Же -е КОТЛІ "7 зі я- негативний хочтраль са 1 я я ян з о У дя М 28 восо- 4000 х « 3000 -у Ж -е- МОНО ВК АКА ВАТ шо В ; -- РОНОЕКИОВ Ж зов я «ве КОТИ Що - ЕОНЮПЮВІ 100 У шк негативною контроль д--я- кає інв Яр Не р фо ем ем зв жо ве жо м
Фіг. 2 зА- лпюдИиНИ БОЮ Й у мих «ж БОТУО0138 два» ж о БОТИ Шин - ВОЖКІ ц. 300. у о що -Е є Я 200 у 100 Ка. о из жа ЯЗ чо 00500105 М ЗБ- мигні БОЮ а ЕОТ2О00135 і. ЖИ -йо Ротавовта Ж -- пОБКІ : 300 о 200 ко х 5 100 ча З о пн НИ т М ГП ВЕ ГЕ: М
Фіг. З ад ч.8 че- РОТ с даттт жо ожа й -к- БОТОКС В сталі УТ Й Й - ВОЗІ ТВ ; ой і сж- АК її бо і т їх ше ч Ж. з 3 я і. рек шен 2 ої о п . чо че чо яд я в ав й -йе ЕПІДОПОТЗА Е 3 4 ї я ф лена Е; се ЩЕ -е БОТКЦТА Б ши з нн ния 5 Е ее ЩЕ й М х їх «В. початкових дівень її сан Міра
0.0. т ; чо о оз то яз 40 402 ло ча:
КЕ.
Фіг. 4
UAA201911920A 2017-05-31 2018-05-30 Поліпептид, який перешкоджає передачі wnt-сигналів у пухлинних клітинах UA125761C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP17173782 2017-05-31
PCT/EP2018/064295 WO2018220080A1 (en) 2017-05-31 2018-05-30 Polypeptides antagonizing wnt signaling in tumor cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA125761C2 true UA125761C2 (uk) 2022-06-01

Family

ID=59021278

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201911920A UA125761C2 (uk) 2017-05-31 2018-05-30 Поліпептид, який перешкоджає передачі wnt-сигналів у пухлинних клітинах

Country Status (22)

Country Link
US (2) US11033636B2 (uk)
EP (1) EP3630816B1 (uk)
JP (1) JP7216024B2 (uk)
CN (1) CN110637030B (uk)
AR (1) AR111840A1 (uk)
AU (1) AU2018276409A1 (uk)
BR (1) BR112019022729A2 (uk)
CA (1) CA3060401A1 (uk)
CL (1) CL2019003419A1 (uk)
CO (1) CO2019012329A2 (uk)
EA (1) EA201992808A1 (uk)
ES (1) ES2979194T3 (uk)
IL (1) IL270854B2 (uk)
MA (1) MA48760A (uk)
MX (1) MX2019014331A (uk)
MY (1) MY200744A (uk)
PE (1) PE20200610A1 (uk)
PH (1) PH12019502602A1 (uk)
PL (1) PL3630816T3 (uk)
TW (1) TW201906858A (uk)
UA (1) UA125761C2 (uk)
WO (1) WO2018220080A1 (uk)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2019014331A (es) * 2017-05-31 2020-01-27 Boehringer Ingelheim Int Polipeptidos que antagonizan la se?alizacion wnt en celulas tumorales.
CN111491655A (zh) 2017-08-07 2020-08-04 加利福尼亚大学董事会 用于生成安全细胞治疗剂的平台
WO2019126401A1 (en) 2017-12-19 2019-06-27 Surrozen, Inc. Anti-lrp5/6 antibodies and methods of use
CN118271444A (zh) 2017-12-19 2024-07-02 瑟罗泽恩奥普瑞汀公司 Wnt替代分子和其用途
JP7418332B2 (ja) 2017-12-19 2024-01-19 スロゼン オペレーティング， インコーポレイテッド 抗フリズルド抗体及び使用方法
WO2020080941A1 (en) * 2018-10-16 2020-04-23 Umc Utrecht Holding B.V. Anti- low-density lipoprotein receptor-related protein 5/6 antibodies
JP2022520084A (ja) * 2019-02-11 2022-03-28 スロゼン オペレーティング， インコーポレイテッド 眼障害におけるｗｎｔシグナル伝達の調節
TW202104258A (zh) 2019-03-29 2021-02-01 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 抗癌組合療法
JP2022544308A (ja) * 2019-08-14 2022-10-17 モッドマブ セラピューティクス インコーポレイテッド Ｌｒｐ５タンパク質に結合する抗体および使用方法
CA3228331A1 (en) * 2021-08-10 2023-02-16 Karla FRIETZE Generation and characterization of novel tim-4 binding agents
CN114702588B (zh) * 2022-04-27 2022-11-22 博际生物医药科技(杭州)有限公司 抗Nectin-4抗体和双特异性抗体
WO2023250402A2 (en) * 2022-06-22 2023-12-28 Antlera Therapeutics Inc. Tetravalent fzd and wnt co-receptor binding antibody molecules and uses thereof

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK0656946T4 (da) 1992-08-21 2010-07-26 Univ Bruxelles Immunoglobuliner uden lette kæder
EP0739981A1 (en) 1995-04-25 1996-10-30 Vrije Universiteit Brussel Variable fragments of immunoglobulins - use for therapeutic or veterinary purposes
EP0988379B1 (en) 1997-04-15 2007-04-11 The Wellcome Trust Limited as Trustee to the Wellcome Trust Ldl-receptor
US6329516B1 (en) 1997-04-28 2001-12-11 Fmc Corporation Lepidopteran GABA-gated chloride channels
CA2405525A1 (en) 2000-04-12 2001-10-25 Principia Pharmaceutical Corporation Albumin fusion proteins
AU2002342734B2 (en) 2001-05-17 2007-07-26 Oscient Pharmaceuticals Corporation Reagents and methods for modulating Dkk-mediated interactions
DK1399484T3 (da) 2001-06-28 2010-11-08 Domantis Ltd Dobbelt-specifik ligand og anvendelse af denne
EP1463752A4 (en) 2001-12-21 2005-07-13 Human Genome Sciences Inc ALBUMIN FUSION PROTEINS
SI1517921T1 (sl) * 2002-06-28 2006-10-31 Domantis Ltd Dvojno-specificni ligandi z zvisano serumsko razpolovno dobo
EP1558645B1 (en) 2002-11-08 2011-07-27 Ablynx N.V. Stabilized single domain antibodies in pharmaceutical composition adapted for inhalation
US8461155B2 (en) 2003-09-22 2013-06-11 University Of Connecticut Sclerostin and the inhibition of WNT signaling and bone formation
AU2005293752A1 (en) 2004-10-13 2006-04-20 Ablynx N.V. Single domain camelide anti-amyloid beta antibodies and polypeptides comprising the same for the treatment and diagnosis of degenarative neural diseases such as Alzheimer's disease
MX363423B (es) 2005-05-18 2019-03-22 Ablynx Nv Nanobodiestm (nanocuerpos) mejorados contra el factor alfa de necrosis del tumor.
WO2007027509A2 (en) * 2005-08-31 2007-03-08 Biogen Idec Ma Inc. Evaluating and treating scleroderma
EP2057191A1 (en) 2006-08-18 2009-05-13 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against il-6r and polypeptides comprising the same for the treatment of deseases and disorders associated with il-6-mediated signalling
US20100113339A1 (en) 2006-09-08 2010-05-06 Ablynx N. V. Serum albumin binding proteins with long half-lives
AU2007328900A1 (en) 2006-12-05 2008-06-12 Ablynx N.V. Peptides capable of binding to serum proteins
GB2470328A (en) 2008-03-05 2010-11-17 Ablynx Nv Novel antigen binding dimer complexes, methods of making and uses thereof
JP2011516603A (ja) 2008-04-17 2011-05-26 アブリンクス エン．ヴェー． 血清タンパク質と結合することが可能なペプチド、並びにこれを含む化合物、構築物及びポリペプチド
US8716243B2 (en) 2008-05-28 2014-05-06 St. Jude Childen's Research Hospital Methods of effecting Wnt signaling through Dkk structural analysis
KR20170084357A (ko) 2009-12-23 2017-07-19 에스바테크 - 어 노바티스 컴파니 엘엘씨 면역원성의 감소 방법
EP2531523A1 (en) 2010-02-05 2012-12-12 Ablynx N.V. Peptides capable of binding to serum albumin and compounds, constructs and polypeptides comprising the same
EP2542579A1 (en) 2010-03-03 2013-01-09 Boehringer Ingelheim International GmbH Biparatopic abeta binding polypeptides
RU2587625C2 (ru) * 2010-03-24 2016-06-20 Дженентек, Инк. Анти-lrp6 антитела
MA34287B1 (fr) 2010-05-06 2013-06-01 Novartis Ag Compositions et méthodes d'utilisation d'anticorps multivalents thérapeutiques de faible densité de la protéine apparentée à la lipoprotéine 6 (lrp6)
CN103038258B (zh) * 2010-05-06 2017-02-15 诺华股份有限公司 用于治疗低密度脂蛋白相关蛋白质6(lrp6)的抗体的组合物及使用方法
KR20140035337A (ko) * 2011-01-28 2014-03-21 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 Ｗｎｔ 조성물 및 이의 사용 방법
US9527925B2 (en) 2011-04-01 2016-12-27 Boehringer Ingelheim International Gmbh Bispecific binding molecules binding to VEGF and ANG2
US8790650B2 (en) 2011-04-28 2014-07-29 Vanderbilt University Methods of using an antibody to inhibit WNT-mediated cardiac remodeling
CN108653728B (zh) 2011-06-23 2022-11-18 埃博灵克斯股份有限公司 用于预测、检测和减少涉及免疫球蛋白单可变结构域的测定法中的非特异性蛋白干扰的技术
ES2813432T3 (es) 2011-08-17 2021-03-23 Glaxo Group Ltd Proteínas y péptidos modificados
KR20140091031A (ko) 2011-11-04 2014-07-18 노파르티스 아게 저밀도 지단백질-관련 단백질 6 (lrp6) - 반감기 연장제 구축물
BR112014017518A2 (pt) 2012-01-18 2018-09-04 Genentech Inc anticorpo e ácido nucleico isolados, célula hospedeira, métodos, imunoconjugado, formulação farmacêutica e uso do anticorpo
US11332519B2 (en) * 2015-11-18 2022-05-17 Ablynx N.V. Serum albumin binders
AU2016363787B2 (en) * 2015-12-04 2023-02-02 Boehringer Ingelheim International Gmbh Biparatopic polypeptides antagonizing Wnt signaling in tumor cells
MX2019014331A (es) * 2017-05-31 2020-01-27 Boehringer Ingelheim Int Polipeptidos que antagonizan la se?alizacion wnt en celulas tumorales.
TW202104258A (zh) * 2019-03-29 2021-02-01 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 抗癌組合療法

Also Published As

Publication number Publication date
EP3630816C0 (en) 2024-03-20
IL270854B (en) 2022-10-01
JP2020521478A (ja) 2020-07-27
CO2019012329A2 (es) 2020-01-17
US20180344868A1 (en) 2018-12-06
CN110637030B (zh) 2024-06-11
MA48760A (fr) 2020-04-08
PE20200610A1 (es) 2020-03-10
JP7216024B2 (ja) 2023-01-31
US11033636B2 (en) 2021-06-15
ES2979194T3 (es) 2024-09-24
US20220362393A1 (en) 2022-11-17
KR20200011933A (ko) 2020-02-04
AR111840A1 (es) 2019-08-21
TW201906858A (zh) 2019-02-16
PL3630816T3 (pl) 2024-08-05
EP3630816B1 (en) 2024-03-20
IL270854B2 (en) 2023-02-01
MX2019014331A (es) 2020-01-27
MY200744A (en) 2024-01-13
CN110637030A (zh) 2019-12-31
EA201992808A1 (ru) 2020-05-14
IL270854A (en) 2020-01-30
BR112019022729A2 (pt) 2020-05-19
CL2019003419A1 (es) 2020-03-27
EP3630816A1 (en) 2020-04-08
CA3060401A1 (en) 2018-12-06
WO2018220080A1 (en) 2018-12-06
PH12019502602A1 (en) 2020-06-08
AU2018276409A1 (en) 2019-10-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA125761C2 (uk) Поліпептид, який перешкоджає передачі wnt-сигналів у пухлинних клітинах
US11952418B2 (en) Biparatopic polypeptides antagonizing Wnt signaling in tumor cells
JP6714751B2 (ja) 単鎖ｔｒａｉｌ受容体アゴニストタンパク質
UA126854C2 (uk) Антитіло до тім-3
EA019595B1 (ru) СПЕЦИФИЧНЫЕ ИНГИБИТОРЫ PDGFRβ
KR102717656B1 (ko) 종양 세포에서 wnt 신호 전달을 길항하는 폴리펩티드
US20200024347A1 (en) Or10h1 antigen binding proteins and uses thereof
EA046752B1 (ru) Полипептиды, препятствующие передаче wnt сигналов в опухолевых клетках
EP4269437A1 (en) Pd-1 binding molecule and application thereof
EA040170B1 (ru) БИПАРАТОПНЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ-АНТАГОНИСТЫ ПЕРЕДАЧИ СИГНАЛА Wnt В ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ