KR20170084357A - 면역원성의 감소 방법 - Google Patents

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KR20170084357A
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레오나르도 보라스
티 군데
다비드 우레히
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에스바테크 - 어 노바티스 컴파니 엘엘씨
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Abstract

본 발명은 항체 가변 도메인의 면역원성을 감소시키는 방법에 관한 것이다.

Description

면역원성의 감소 방법{METHOD FOR DECREASING IMMUNOGENICITY}
관련 출원
본 원은 2009년 12월 23일자 미국 가특허출원 제61/289,446호에 대하여 미국 특허법 35 U.S.C. §119 하에서 우선권 주장하였으며, 그 내용은 참조를 위해 여기에 포함되었다.
발명의 분야
본 발명은 항체 가변 도메인, 특히 scFv의 면역원성을 변성하는 방법에 관한 것이다.
필요한 대상에게 투여된 치료적 항체는 대상의 면역 시스템에 의해 대개는 이물질로 인식된다. 투여된 항체가, 예를 들면 마우스 CDR을 마우스 성분을 최소화하기 위해 인간 면역글로불린 프레임워크에 그래프팅하여 인간화한 경우에 조차도 이들은 여전히 치료제의 효능 및/또는 안정성을 손상시키는 면역반응을 유도할 수 있다.
문헌에 따르면, 환자의 항체 반응은 B-세포 에피토프와 T-세포 에피토프의 존재에 달려있다. B-세포 리셉터가 투여된 치료적 항체 같은 항원을 인식하고 결합할 경우, 항원은 리셉터 매개 엔도사이토시스(endocytosis)에 의해 B-세포에 내면화(internalize)되어 단백질 가수분해 과정을 수행한다. 이어서 얻어진 펩티드는 MHC 클래스 II 분자에 의해 제공된다. T 헬퍼 세포가 T 세포 에피토프를 인식하면 T 헬퍼 세포는 상응하는 B 세포를 자극하여 증식하고 항체를 생산하는 플라스마 세포로 분화한다.
투여된 항체에 대한 환자 면역 시스템의 반응을 감소시키기 위해 종래기술에서는 여러가지 탈면역화(de-immunization) 기술을 제공하였다. 현재 기술들의 대부분은 T-세포 제거에 집중하고 있는 반면, B-세포 면역원성을 감소시키는 방법에 대해서는 제한된 예들이 있을 뿐이다.
국제 공개특허 WO 93/18792는 항체의 부분적 감소에 의한 항체의 변성방법을 기술하고 있다. 이것은 이들의 면역원성을 변성하여 항이소타입 반응(anti-isotypic response)을 유발하는 이들의 능력을 선택적으로 약화시키지만, 이들은 여전히 항이소타입 반응을 유도할 수 있다. 비록 이 방법이 백신에 적합할지라도 항이소타입 반응은 다른 치료적 적용에는 바람직하지 않다.
Molineux G (2003) Pharmacotherapy 23: 35-85에서는 단백질과 고분자량 폴리에틸렌 글리콜의 커플링을 기술하고 있다. 그러나, Onda, M. 등[PNAS Vol 105(32): 11311-11316 (2008)]은 박테리아 독소 또는 식물 독소에 결합된 가변성 단편으로 구성된 하이브리드 단백질을 사용하는 이 방법의 제한적 성공을 보고하였다. 이들의 하이드리드 단백질은 불활성화되었고; 또한 이들은 면역원성의 경미한 감소만을 확인하였다.
두 번째 방법은 항체 투여 전 화학요법으로 구성되며, 여기에서 환자는 사이클로포스파미드(cyclophosphamide) 또는 플루다라빈(fludarabine)으로 치료된다. 이러한 치료는 면역 시스템을 손상하기 때문에 환자에게 바람지하지 않다(Kusher, BH et al (2007), Pediatr Blood Cancer 48: 430-434; Leonard JP et al (2005), J Clin Oncol 23: 5696-5704).
Nataga, S. and Pastan, I. (2009), Adv Drug Deliv Rev, p. 977-985 및Onda, M. et al (2008), PNAS Vol 105(32): 11311-11316에서는 외래 단백질 표면 상의 "항원성 핫 스팟(hot spot)"에서의 포인트 돌연변이에 의한 B-세포 에피토프 제거를 제안하였다. 이들은 넓은 노출 범위를 가지는 거대 친수성 잔기를 작은 아미노산(알라닌, 글리신 및 세린)으로 치환하였다. 알라닌은 전형적으로 모든 2차 구조의 숨겨진 위치와 노출된 위치에 존재하며, 또한 새로운 수소 결합을 제공하지 않기 때문에 치환에 바람직하다. 알라닌은 항체와 반응할 수 있는 β-탄소 이후에 측쇄 원자가 없어서 항원의 형태를 유지한다. 그러나, Nataga와 Pastan이 기술한 상기 "핫 스팟"은 단백질 표면 상의 이산 클러스터에 위치한 형태적 에피토프이다. 컴퓨터 시뮬레이션으로 재현할 수 없는 에피토프의 위치를 결정하는데 엄청난 실험량이 필요하며, 따라서 이들의 방법은 통상적으로 적용할 수 있는 항체의 면역원성을 감소시키기 위한 일반적 방안이 되지 않는다. 게다가 이 방법의 원리적 가설은 주로 분자 표면상의 친수성 잔기가 숙주 항체와의 접촉에 연관되어 있다는 것이다. 대부분의 외래 단백질에 있어서 이것은 실제로 자연적으로 발생한 단백질의 일부(예: 단편, 도메인)만이 사용되는 경우에는 사실이지만, 다른 도메인에 접촉으로 이전에 차단된 소수성 아미노산이 용매에 노출되어 면역 시스템에 대한 에피토프로서 제공될 수 있을 것이다. 이것은 분명히 Fv 항체 단편에 대한 경우이며, 이 경우에 가변 도메인 상의 경계면 잔기는 Fab 단편에서 커버되지만 단리된 가변 도메인에서 노출된다. B-세포 에피토프를 예측하기 위한 현재 가능한 알고리즘은 입증하기 어렵고 전형적으로 낮은 성공률을 가진다.
따라서, 당업계에서는 항체 단편, 특히 가변 도메인에 대한 면역원성을 효과적으로 감소시키는 간단한 방법이 필요하다.
발명의 요약
그러므로, 본 발명의 일반적 목적은 대량의 분자 모델링 작업을 수행하지 않고 항체 가변 도메인의 면역원성을 감소시키는 방법을 제공하는 것이다. 특히, 본 발명의 목적은 항체 가변 도메인으로부터 B-세포 에피토프를 제거하는 방법을 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명은 가변 경쇄 및/또는 가변 중쇄의 하나 이상의 아미노산 잔기를 치환하는 단계를 포함하고, 상기 잔기는 상응하는 전장(full-length) 항체 또는 Fab의 가변 사슬과 불변(constant) 사슬간 경계에 존재하는, 가변 경쇄 및/또는 가변 중쇄를 포함하는 항체 가변 도메인의 면역원성을 감소하는 방법을 제공한다.
일 측면에서, 항체 가변 도메인은 scFv, Fv 단편 또는 단일 도메인 항체이고, 특히 scFv이다.
일 측면에서, 치환될 가변 경쇄 및/또는 가변 중쇄의 하나 이상의 아미노산 잔기는 각 서브타입의 컨센서스(consensus) 잔기이다.
다른 측면에서, 치환될 하나 이상의 아미노산 잔기는 루이신(L), 발린(V), 아스파르트산(D), 페닐알라닌(F), 아르기닌(R) 및/또는 글루탐산(E)이다.
임의의 측면에서, 가변 경쇄의 하나 이상의 아미노산 잔기는 99, 101 및/또는 148 위치(AHo 넘버링)에 있다. 다른 측면에서, 가변 중쇄의 하나 이상의 아미노산 잔기는 하나 이상의 12, 97, 98, 99, 103, 및/또는 144 위치(AHo 넘버링)에 있다.
또다른 측면에서, 가변 중쇄 내의 치환될 하나 이상의 아미노산 잔기는 (a) 중쇄 아미노산 12 위치의 루이신(L); (b) 중쇄 아미노산 103 위치의 발린(V); 및/또는 (c) 중쇄 아미노산 144 위치의 루이신(L)이다.
다른 측면에서, 본 발명은 여기에 기술된 방법으로 얻어질 수 있는 항체 가변 도메인과, 이 항체 가변 도메인을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
이하의 상세한 설명에 따라 본 발명이 보다 잘 이해될 수 있고 상기한 것 이외의 목적들이 분명해 질 수 있을 것이다. 이러한 설명은 첨부된 도면을 참조로 한다.
도 1a는 선재성(preexisting) 항scFv 항체를 검출하기 위해 사용된 브릿지 ELISA의 모식도를 나타낸다. 1: 플레이트 표면, 2: scFv903; 3: 항약물 항체 (ADA); 4: 비오틴화된(biotinylated) scFv903; 5: 스트렙타비딘(Streptavidin) Poly-HRP (호오스 래디쉬 퍼옥시다제).
도 1b는 약물과 비오틴화된 scFv903에 결합한 ADA가 과량의 scFv903, 34 max (791), scFv903_DHP (961) 및 scFvl05 (100 mcg/ml)와 경쟁하는 확인 평가의 원리를 나타낸다.
도 2는 항scFv 903 항체를 검출하기 위한 비색 에세이(브릿지 ELISA)에서 149개 개별 혈청의 시그널 강도를 나타낸 것이다. 에세이 커트 포인트 이상의 시그널은 각 혈청 샘플 내의 항scFv 903 항체(ADA)의 존재를 나타낸다. 대략 30%의 시험 혈청 샘플이 에세이에서 양성을 나타냈다.
도 3은 4개의 상이한 scFv의 용매 노출 위치의 가변 경쇄 서열 배열을 나타낸다. 상부 패널: scFv 903 내의 각각의 아미노산과 종류가 다른 각 scFv의 아미노산을 굵게 나타냈다. 하부 패널은 각각의 개별 위치가 연관된 에피토프 카테고리와, 각각의 에피토프 카테고리에 대한 결합을 보여주는 인간 혈청의 백분율을 나타낸다.
도 4는 4개의 상이한 scFv의 용매 노출 위치의 가변 중쇄 서열 배열을 나타낸다. 상부 패널: scFv 903 내의 각각의 아미노산과 종류가 다른 각 scFv의 아미노산을 굵게 나타냈다. 하부 패널은 각각의 개별 위치가 연관된 에피토프 카테고리와, 각각의 에피토프 카테고리에 대한 결합을 보여주는 인간 혈청의 백분율을 나타낸다.
도 5는 scFv 903의 분자구조 모델을 나타낸 것이다. 5a: 정면도; 5b: 180°회전도. 회색: 잠재적으로 에피토프 카테고리 β에 참여하는 잔기; 흑색: 잠재적으로 에피토프 카테고리 α에 참여하는 잔기.
본 발명을 보다 용이하게 설명하기 위하여 먼저 특정 용어들을 정의하였다. 달리 정의되지 않는 한, 여기에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야에 숙련된 사람들에게 통상적으로 이해되는 것과 같은 의미를 가진다. 여기에 기술된 것들과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있으나, 적합한 방법과 물질을 이하에 기술하였다. 여기에서 언급된 모든 공개물, 특허출원, 특허 및 기타 참고문헌들은 그 전체가 참조를 위해 통합되었다. 충돌이 있는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 조절하게 된다. 또한, 재료, 방법 및 실시예는 예시를 위한 것으로 제한을 의미하지는 않는다.
여기에서 사용된 "면역원성(immunogenicity)"이란 표현은 B-세포 또는 대상에게 투여된 단백질 상의 항체 에피토프의 발생을 의미하는 반면, 이러한 B-세포 또는 항체(또한 항약물 항체: ADA라고도 칭함)는 상기 단백질의 투여 전에 존재할 수 있다.
이러한 면역원성의 범위는 ELISA 에세이에 의해 측정될 수 있고 선재성 ADA의 측정가능한 양을 포함하는 인간 혈청의 백분율로 표시할 수 있다. 단백질과 그의 면역원성을 감소시키는 목적으로 조작된 상응하는 단백질 간의 면역원성 감소는 조작된 단백질에 대한 ADA를 함유하는 혈청 샘플의 백분율을 고유의 단백질에 대한 ADA를 함유하는 혈청 샘플의 백분율과 비교하여 측정할 수 있다. 조작된 단백질에 대한 양성 혈청 샘플의 더 낮은 수 또는 백분율은 조작된 단백질에 대한 면역원성의 감소를 나타낸다. 단일 혈청 샘플에 근거하여 적용될 수 있는 더 많은 민감한 측정에는 경쟁 ELISA 셋업을 사용한다. 이러한 경쟁 ELISA에서 조작된 단백질은 시험 혈청 중의 ADA의 결합에 대해 고유 단백질과 경쟁한다. 조작된 단백질의 고유 단백질과 경쟁하는 능력이 낮을수록 면역원성 감소가 더 성공적이다.
바람직하게, 면역원성 감소 범위는 조작된 단백질이 더이상 고유 단백질과 효과적으로 경쟁할 수 없는 혈청 샘플의 백분율로서 지칭된다. 효과적인 경쟁은 역치(threshold)(경쟁 ELISA에서의 상대적 시그널)로 정의되며, -100은 완벽한 경쟁자(면역원성 감소 없음)를 나타내고 0은 경쟁이 전혀 없는 것(ADA 에피토프의 완전 부재)을 나타낸다. 전형적으로 이러한 효과적인 경쟁에 대한 역치는 -90, -80, -70, -60, -50, -40, -30, -20, -10 또는 > -10일 수 있다.
여기에서 사용된 "경계면" 또는 "계면-계면"은 전장 항체의 가변 도메인과 불변 영역 1(CL1 또는 CH1) 사이 또는 Fab 부분과 Fc 도메인(CH2 및 CH3) 사이에 위치한 영역들을 지칭한다.
여기에서 사용된 "ADA"는 환자의 혈청 또는 혈청들 중의 선재 항체를 지칭하는 항약물 항체(anti-drug antibody)의 약자이다.
"항체 가변 도메인"(V-Domain)이란 용어는 항체의 항원 결합부위의 전체 또는 일부, 예를 들면 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인의 전체 또는 일부를 함유하는 분자를 지칭하며, 따라서 항체 가변 도메인은 특이적으로 표적 항원을 인식한다. 그러므로, 이 용어는 면역글로불린의 V-J-REGION 또는 V-D-J-REGION에 해당한다. 이러한 V-Domain을 VL (Ig-경쇄의 V-Domain) 또는 VH (Ig-중쇄의 V-Domain)로 지정하였다. 항체 가변 도메인의 비제한적 예는 다음과 같다:
(i) 항체 싱글암(single arm)의 VL 및 VH 도메인을 포함하는 Fv 단편,
(ii) 단일 사슬 Fv 단편 (scFv),
(iii) VH 또는 VL 도메인으로 구성되는 Dab 단편(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), 카멜리드(Camelid) (Hamers- Casterman, et al., Nature 363:446-448 (1993), and Dumoulin, et al., Protein Science 11:500-515 (2002) 참조) 또는 Shark 항체(예를 들면, Shark Ig-NARs Nano-bodies®)같은 단일 도메인 항체.
여기에서 사용된 "항체 프레임워크(framework)" 또는 "프레임워크"란 용어는 가변 도메인의 항원 결합 루프에 대한 스캐폴드로서 작용하는 가변 도메인, VL 또는 VH의 일부를 지칭한다(Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242).
여기에서 사용된 "항체 CDR" 또는 "CDR"이란 용어는 문헌[Kabat E.A. et al., (1991) Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242]에 의해 정의된 항원 결합 루프로 이루어진 항체의 상보성 결정영역을 지칭한다. 항체 Fv 단편의 2개 가변 도메인 각각은, 예를 들면 3개의 CDR이다.
"단일사슬 항체" 또는 "scFv"란 용어는 링커에 의해 연결된 항체 중쇄 가변영역(VH) 및 항체 경쇄 가변영역(VL)을 포함하는 분자를 지칭한다. 이러한 scFv 분자는 화학식: NH2-VL-링커-VH-COOH 또는 NH2-VH-링커-VL-COOH를 가질 수 있다.
"서브타입"이란 용어는 주어진 종 내에서 동일 그룹에 속하고 고비율의 동일성을 공유하는 V-DOMAIN의 세트를 지칭한다. "서브타입"이란 용어는 Knappik (2000)에서 정의된 바와 같은 각각의 컨센서스 서열에 의해 규정된 서브타입을 지칭한다. "서브패밀리" 또는 "서브클래스"는 "서브타입"과 동의어로 사용된다. 여기에서 사용된 "서브타입"이란 용어는 그들의 서브타입을 나타내는 각각의 컨센서스 서열과 매우 높은 정도의 동일성과 유사성을 공유하는 서열을 지칭한다. 특정한 가변 도메인이 속한 "서브타입"에 대해서는 모두 공지된 인간 생식세포계열 세그먼트 또는 각 서브타입의 정의된 컨센서스 서열로 각 서열을 정렬하고 가장 큰 상동성에 기초한 특정 서브타입에 대한 후속 결합에 의해서 결정된다. BLOSUM (Henikoff 1992) 같은 써치 매트릭스를 사용하여 상동성을 측정하고 서열을 그룹화하는 방법은 당업자들에게 공지되어 있다.
주어진 위치의 "컨센서스 잔기"는 주어진 서브타입의 아미노산 컨센서스 서열을 생산하여 결정할 수 있다. 여기에서 사용된 "아미노산 컨센서스 서열"이란 적어도 두 개, 바람직하게 그 이상의 정렬된 아미노산 서열의 매트릭스를 사용하고 배열 내에 갭을 허용하여 각각의 위치에서 가장 빈번한 아미노산 잔기가 측정될 수 있도록 생성될 수 있는 아미노산 서열을 지칭한다. 컨센서스 서열은 각각의 위치에서 가장 빈번하게 나타나는 아미노산을 포함하는 서열이다. 2개 이상의 아미노산이 단일 위치에서 동등하게 나타날 때, 컨센서스 서열은 이들 아미노산 둘 다 또는 모두를 포함한다. 단백질의 아미노산 서열을 다양한 수준으로 분석할 수 있다. 예를 들면, 보존성 또는 가변성은 단일 잔기 수준, 복수 잔기 수준, 갭 등을 가지는 복수 잔기에서 나타내어 질 수 있다. 잔기들은 동일한 잔기의 보존성을 나타내거나 클래스 수준에서 보존될 수 있다. 다른 클래스는 당업자들에게 알려져 있으며 구조 결정 또는 치환성(substitutability)을 평가하는 다른 데이터를 사용하여 정의될 수 있다. 이 경우, 치환 가능한 아미노산은 그 위치에서 치환될 수 있고 작용 보존성을 유지할 수 있는 아미노산을 지칭할 수 있다. 여기에서 사용된 바와 같이, 하나의 아미노산 서열(예를 들면, 제1 VH 또는 VL 서열)을 하나 이상의 추가 아미노산 서열(예를 들면, 데이터베이스 내의 하나 이상의 VH 또는 VL 서열)로 정렬시킬 경우, 하나의 서열(예를 들면, 제1 VH 또는 VL 서열) 내의 아미노산 위치는 하나 이상의 추가 아미노산 서열 내의 "상응하는 위치"와 비교될 수 있다. 여기에서 사용된, "상응하는 위치"란 서열이 최적으로 정렬되었을 때, 즉 서열이 정렬되어 가장 높은 동일성 또는 유사성 백분율을 얻었을 때 비교되는 서열 내에서의 동등한 위치를 나타낸다.
상세한 설명 전체에서 사용된 AHo 넘버링 체계는 A. Honegger and A. Pluckthun (2001), J.Mol.Biol. 309: 657-670에 기술되어 있다.
"환자"란 용어는 사람 또는 사람이 아닌 동물을 지칭한다.
"치료하다", "치료" 또는 "처치"란 용어는 질환 또는 재발한 질환의 하나 이상의 증상을 완화 또는, 그 중증도를 예방, 치유, 지연, 경감하는 것을 목적으로 하거나 이러한 치료의 부재로 예상되는 것 이상으로 대상의 생존율을 연장하기 위한 치료 및/또는 예방방법을 지칭한다.
"친수성" 아미노산이란 극성이고 전기적으로 하전된 아미노산, 예를 들면 Asp, Glu, Lys, Arg 및 His이다.
극성이며 하전되지 않은 아미노산은 Gly, Ser, Thr, Cys, Asp, Gln 및 Tyr이다.
"소수성" 아미노산은 전형적으로 비극성 아미노산으로, 예를 들면 Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp 및 Pro이다.
제1 측면에서, 항체 가변 도메인의 면역원성을 감소시키는 방법을 기술하였다. 항체 가변 도메인은 가변 경쇄 및/또는 가변 중쇄를 포함하고, 본 방법은 가변 경쇄 및/또는 가변 중쇄의 하나 이상의 아미노산 잔기를 치환하는 단계를 포함하고, 상기 잔기는 상응하는 전장 항체(또는 Fab, 즉 항체 또는, 불변 도메인 또는 그의 일부를 포함하는 항체 단편)의 가변 사슬 및 불변 사슬 사이의 경계면에 존재한다.
치환을 위해 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기는 바람직하게 상응하는 전장 항체(또는 Fab, 즉 항체 또는, 불변 도메인 또는 그의 일부를 포함하는 항체 단편)의 가변 사슬 및 불변 사슬 사이의 경계면에 존재하고, scFv 같은 항체 가변 도메인에서 용매 노출된 것들이다. 경계면은 또한 V/C 도메인 계면이라 불리운다.
항체 가변 도메인은, 예를 들면 scFv, Fv 단편 또는 단일 도메인 항체, 바람직하게 scFv이다.
특히, 비연속적, 즉 형태적 B-세포 에피토프를 형성하는 위치의 아미노산 잔기가 주목된다. 이러한 잔기는 다음 위치(AHo 넘버링)에서 발견되는 것들이다:
가변 경쇄 99, 101 및/또는 148 위치; 및
가변 중쇄 12, 97, 98, 99, 103, 및/또는 144 위치.
중쇄의 12, 98, 103, 및 144 잔기 위치(AHo 넘버링)뿐만 아니라 경쇄의 99, 101 및 148 잔기 위치(AHo 넘버링)는 단백질 조작에 의한 항체의 폴딩 작용을 개선하기 위한 문헌, Nieba et al. (1997) Protein Eng., Apr;10(4):435-44에서 알려졌다(또한 미국 특허 제6,815,540호에도 기재). Nieba는 수소성 아미노산을 표시된 위치에서 친수성 아미노산으로 치환하는 것을 제안하였으나, 이 문헌은 이러한 치환이 분자의 면역원성에 미치는 영향에 대해서는 언급하지 않았다. 또한, 저자들은 이러한 소수성 잔기의 전부가 동등하게 대체를 위한 양호한 후보가 아니라는 것을 강조하고 있다. 소수성 패치의 존재가 모든 항체에서 보존되지만 이들의 정확한 위치와 범위는 다르다.
당분야에서 알려진 바와 같이, 특히
(i) 2차 구조의 선회(turn) 영역에 존재하고,
(ii) 신축성 거대 측쇄 또는 벌키 측쇄를 가지며, 또는
(iii) 소수성인 아미노산은 용이하게 B-세포 에피토프의 일부가 될 수 있어서 면역원 반응을 유도한다. 면역원 아미노산을 제거하므로써 B-세포 에피토프를 방해하여 환자의 항체 가변 도메인에 대한 내성(tolerance)을 증강시킬 수 있다.
바람직하게, 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기는 선택된 아미노산보다 면역원성이 더 낮은, 즉 면역반응을 일으키지 않거나 약한 면역반응을 일으키는 아미노산으로 치환된다. 이러한 면역원성이 낮은 아미노산은 고유(즉, 치환되지 않은) 아미노산을 함유하는 항체 가변 도메인에 대한 ADA 반응성과 비교하여 ADA 반응성을 감소시킨 것들이다.
면역원성, 즉 환자의 체내에서 항체 반응을 유도하는 특성은, 예를 들면 그의 항원성, 즉 선재하는 항체와의 반응성에 의해 추정할 수 있다. 항원성은, 예를 들면 ADA 반응성으로 브릿지 ELISA(실시예 및 도 1 참조)에 의해 잠재적으로 선재하는 항체를 포함하는 공여체의 혈청을 사용하여 측정할 수 있다. 그러므로, 더 낮은 면역원성 아미노산의 평가에 있어서, 항체 가변 도메인은 표시된 위치에서 돌연변이될 수 있다. 면역원성에 대한 이러한 돌연변이 효과는 브릿지 ELISA에서 전구(progenitor) 항체의 시그널을 아마도 면역원성이 더 낮은 그의 조작된 유도체와 여기에 기술된 바와 같이 경쟁하여 평가할 수 있다. 항체에 대한 ADA의 결합은 또한 표면 플라스몬 공명, 형광 공명에너지 전이(FRET), 비색 에세이 등과 같은 라벨링이 없는 결합 에세이를 사용하여 평가할 수 있다.
일 구체예에서, 치환을 위해 선택된 아미노산은 가변 경쇄 잔기 99, 101 및 148과, 가변 중쇄 잔기 12, 97, 98, 99, 103 및 144로 구성되는 군에서 선택된 하나 이상의 위치에 있다.
치환을 위해 선택된 바람직한 아미노산은 표면 노출되지만 상응하는 전장 항체 또는 Fab 내의 불변 도메인에 의해 숨겨진다.
일 구체예에서, 치환될 가변 경쇄 및/또는 가변 중쇄의 하나 이상의 아미노산 잔기는 각 서브타입의 컨센서스 잔기이다. 예를 들면, 치환을 위해 선택된 바람직한 아미노산은 루이신(L), 발린(V), 아스파르트산(D), 페닐알라닌(F), 아르기닌(R), 및/또는 글루탐산(E)이다.
더욱 바람직하게, 치환되기 위해 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기는 가변 경쇄 잔기 D99, F101 및 L148과, 가변 중쇄 잔기 L12, R97, A98, E99, V103 및 L144로 구성되는 군에서 선택된다.
보다 더 바람직하게, 루이신(L), 발린(V), 페닐알라닌(F) 및/또는 알라닌(A)은 극성 아미노산, 바람직하게 세린(S) 및/또는 트레오닌(T)으로 치환된다.
특히, 국제 특허출원 PCT/CH2009/00022에 기술된 DHP 모티브는 예상외로 항체 가변 도메인의 열 안정성, 리폴딩, 발현 수율, 응집 및/또는 결합 활성에 대한 역효과 없이 항체 가변 도메인의 면역원성을 감소하는 것이 발견되었다. DHP 모티프는 다음의 아미노산이 존재하는 가변 중쇄 12, 103 및 144 (AHo 넘버링)의 아미노산 잔기를 포함한다:
(a) 중쇄 아미노산 12 위치의 세린(S);
(b) 중쇄 아미노산 103 위치의 세린(S) 또는 트레오닌(T); 및/또는
(c) 중쇄 아미노산 144 위치의 세린(S) 또는 트레오닌(T).
국제 특허출원 PCT/CH2009/00022에서는 개시된 변성이 항체 가변 도메인의 면역원성을 감소하는데 적합하다는 어떠한 단서도 제공하지 않았다.
DHP 모티브는 Fab 단편의 V/C 경계면에 위치하고 불변 도메인의 제거 시에 용매 노출된다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구체예에서 하나 이상의 아미노산 잔기는 가변 중쇄 12, 103 및 144 (AHo 넘버링)로 구성되는 군으로부터 치환을 위해 선택된다. 바람직하게,
(a) 루이신(L)은 중쇄 아미노산 12 위치에 존재하고;
(b) 발린(V)은 중쇄 아미노산 103 위치에 존재하고; 및/또는
(c) 루이신(L)은 중쇄 아미노산 144 위치에 존재한다.
이러한 잔기들은 인간 프레임워크에서 고도로 보존된다. 따라서, 하나 이상의 상기 잔기들을 치환하는 것은 분자의 생물물리학적 특성에 영향을 주지 않으면서 항체 가변 도메인을 탈면역화하는 일반적 방안을 제공하고, 여기에 기술된 방법은 항체 가변 도메인의 어떤 프레임워크에도 적용가능하다. 바람직하게 표시된 위치에 존재하는 잔기들은 다음 잔기에 의해 치환된다:
(a) 중쇄 아미노산 12 위치의 세린(S);
(b) 중쇄 아미노산 103 위치의 세린(S) 또는 트레오닌(T); 및/또는
(c) 중쇄 아미노산 144 위치의 세린(S) 또는 트레오닌(T).
더욱 더 바람직하게 다음과 같이 치환된다: L12S, V103T 및/또는 L144T.
항체 가변 도메인은 모든 표적에 대한 것일 수 있고, 특정하게 상기 표적과 결합한다. 예시적인 표적의 예는 다음과 같으며, 이에 한정되지는 않는다: 막투과 분자, 리셉터, 리간드, 성장인자, 성장 호르몬, 응혈인자, 항응혈인자, 플라스미노겐 활성제, 혈청 알부민, 호르몬 또는 성장인자의 리셉터, 신경영양인자, 신경성장인자, 섬유아세포 성장인자, 형질전환성장인자(TGF), CD 단백질, 인터페론, 콜로니자극인자(CSF), 인터루킨(IL), T-세포 리셉터, 표면막단백질, 바이러스 단백질, 종양관련항원, 인티그린(integrin) 또는 인터루킨, VEGF; 레닌(renin); 인간성장호르몬; 소성장호르몬; 성장호르몬 방출인자; 부갑상선호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 리포단백질; 알파-1-안티트립신; 인슐린 A-사슬; 인슐린 B-사슬; 프로인슐린; 여포자극호르몬; 칼시토닌; 황체형성호르몬; 글루카곤; 응혈인자 VIIIC; 응혈인자 IX; 조직인자 (TP); von Willebrands 인자; Protein C; 심방나트륨이뇨인자; 폐 계면활성제; 유로키나제; 인간 소변; 조직형 플라스미노겐 활성제 (t-PA); 봄베신(bombesin); 트롬빈(thrombin); 조혈성장인자; 종양괴사인자-알파 또는 -베타; 엔케팔리나제(enkephalinase); RANTES (Regulated on Activation Normally T-cell Expressed and Secreted); 인간 대식세포 염증성 단백질(MIP-1)-알파; 인간혈청알부민; Muellerian-저해물질; 릴락신(relaxin) A-사슬; 릴락신 B-사슬; 프로릴락신; 마우스 고나도트로핀(gonadotropin)-관련 펩티드; 미생물 단백질, 베타-락타마제; DNase; IgE; 세포독성 T-임파구관련항원 (CTLA); CTLA-4; 인히빈(inhibin); 액티빈; 혈관내피세포성장인자(VEGF); 프로테인 A 또는 D; 류마티스인자; 골유래 신경영양인자 (BDNF); 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6); NGF-베타; 혈소판유도 성장인자 (PDGF); aFGF; bFGF; 상피세포성장인자(EGF); TGF-알파; TGF-베타, 예를 들면 TGF-베타1, TGF-베타2, TGF-베타3, TGF-베타14, 또는 TGF-beta5; 인슐린유사성장인자-I 또는 -II (IGF-I 또는 IGF-II); des(l-3)-IGF-I (뇌 IGF-I), 인슐린유사성장인자 결합 단백질, 에리트로포이에틴; 골유도인자; 면역독소; 뼈형성단백질 (BMP); 인터페론-알파, -베타, 또는 -감마; M-CSF, GM-CSF 또는 G-CSF; IL-1 내지 IL-10; 슈퍼옥사이드 디스뮤타제; 붕괴촉진인자(decay accelerating factor); AIDS 인벨로프 단백질; 수송 단백질; 귀소 리셉터; 어드레신(addressin); 조절 단백질; CD3, CD4, CD8, CD11a, CD11b, CD11c, CD18, CD19, CD20, CD34, CD40, 또는 CD46, ICAM, VLA-4 또는 VCAM; 또는 HER2, HER3 또는 HER4 리셉터; ErbB 리셉터족의 구성성분; EGF 리셉터; HER2, HER3 또는 HER4 리셉터; 세포부착분자; LFA-1, Mac1, p150.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, 알파4/베타7 인티그린 또는 알파v/베타3 인티그린; 세포부착분자의 알파 또는 베타 서브유니트; 항체); 성장인자, VEGF; 조직인자 (TF); TGF-베타; 알파 인터페론(알파-IFN); IL-8; IgE; 혈액형 항원 Apo2, 사멸 리셉터; flk2/flt3 리셉터; 비만 (OB) 리셉터; mpl 리셉터; CTLA4 또는 프로테인 C.
다른 구체예에서, 본 발명은 여기에 기술된 방법으로 얻어질 수 있는 항원 결합 단편을 제공한다. 이 항원 결합 단편은, 예를 들면 치료 또는 진단 용도에 사용될 수 있다.
이하의 실시예에서 사용된 서열은 다음과 같다:
> 903 또는 578minmax (서열번호: 1)
Figure pat00001
> 791 또는 34max (서열번호: 2)
Figure pat00002
> scFvl 05 (서열번호: 3)
Figure pat00003
> 961 또는 578minmaxDHP (서열번호: 4)
Figure pat00004
실시예 1
항약물 항체 브릿지 ELISA(ADA-ELISA)
1.1. 배경
단일클론 항체에 대해 선재하는 항체는 불변 영역, 가변 도메인 프레임워크 위치 또는 항원 결합 루프, CDR에 대한 것일 수 있다. IgG가 아니라 Fv 단편에 특이적으로 결합하는 선재 항체는 이전에 IgG에서 차폐된 영역을 인식할 가능성이 있다. 이러한 영역은 주로 가변 도메인과 불변 영역 1(CL1 또는 CH1) 또는 Fab 부분과 Fc 도메인(CH2 및 CH3) 사이에 위치한 도메인 경계면이다. 이러한 경계면을 인식하는 항체는 모든 가능성에서 특이적인 포맷이다. scFv903의 프레임워크 서열은인간에서 고도로 보존되기 때문에 사람 혈청 내에서 scFv903에 대한 선재 항체는 CDR 또는 V/C-경계면 잔기에 결합할 것으로 보인다. 이러한 선재하는 항-scFv903 항체의 에피토프를 샌드위치 ELISA에서 항약물 항체(ADA)와 ESBA903의 결합과 경쟁하는 다양한 scFv의 포텐셜을 평가하여 특성화하였다. 시험된 scFv는 다음과 같다:
- scFv903과 동일한 프레임워크이나 상이한 CDR(34_max(791))을 함유하는 scFv,
- scFv903과는 상이한 프레임워크와 상이한 CDR(scFvl05)을 가지는 scFv, 및
- 이전의 V/C 경계면에 치환을 포함하는 scFv903 변이체 (scFv903 DHP (961))
항scFv903 항체의 스크리닝을 위해 개발된 ELISA는 준정량적 에세이이며 상이한 종으로부터 모든 항체 이소타입의 반응을 검출할 수 있는 브릿지 포맷으로 개발되었다(도 1 참조).
도 1을 참조하여 요약하면, 마이크로역가 플레이트를 항scFv 903 항체 3,6을 함유하는 샘플이 결합된 scFv 903 1, 2로 코팅하였다. 제1 검출시약으로, 비오틴화된 scFv 903 4를 사용하여 결합된 scFv 903/항scFv 903 복합체를 검출한 다음, 제2 검출시약 4, 스트렙타비딘 Poly-HRP 5로 검출하였다. 품질 대조용과 샘플 내에 존재하는 항scFv 903 항체의 양을 퍼옥시다제(POD) 기질 (3,3'-5,5'테트라메틸벤지딘 (TMB))을 사용하여 측정하였다.
AB903-3이라는 양성 대조용 항체로 ADA ELISA의 전개를 수행하였다. 래빗을 scFv 903으로 면역화한 다음, 혈청의 친화성 정제(Squarix Biotechnology)하여 항scFv 903 항체 스톡 (AB903-3으로 불리는 래빗 폴리클로날 항scFv 903 IgG)을 전개하였다. 도 1b에 나타낸 바와 같이, scFv 903 상의 선재 항체의 에피토프는 scFv 903에 결합한 ADA와 상기한 scFv의 경쟁으로 특성화되었다.
1.2 에세이 방법
마이크로역가 플레이트(Nunc Maxisorp)를 PBS (Dulbecco, Sigma) 중의 0.1 mcl/ml scFv 903으로 코팅하였다. 밀봉된 플레이트를 밤새 4 ℃에서 인큐베이션하였다.
플레이트를 웰당 300 mcl의 세척 완충액(TBST 0.005% Tween (20)/Atlantis Microplate Washer (ASYS))으로 3회 세척하였다. 비특이적 부위를 웰당 280 mcl의 블로킹 완충액(PBS, 10 mg/ml BSA 1% (w/v), 0.1 ml/50ml Tween 20 (0.2%, v/v)으로 블로킹하였다. 밀봉된 플레이트를 실온(25 ℃)에서 1.5시간 동안 진탕하면서 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 다시 위에서 나타낸 바와 같이 3회 세척하였다.
분석대상 대조군(AB903-3으로 불리는 친화성 정제된 래빗 폴리클론 항scFv 903 IgG 또는 인간 혈청)을 3개의 다른 농도로 첨가하였다:
HiQC: 2500 ng/ml AB903
MeQC: 500 ng/ml AB903
LoQC: 250 ng/ml AB903
QC를 각각의 NSB 혈청 모음에 혼합하였다(에세이 커트 포인트의 측정에 사용된 모든 혈청 모음, >30). 측정될 샘플을 1 대 10 비율로 희석하였다. 웰당 50 mcl의 샘플을 적가하고 밀봉된 플레이트를 실온(25 ℃)에서 2.0 시간 동안 인큐베이션하였다.
상기한 바와 같이, 플레이트를 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 제1 검출 시약으로서, 비오틴화된 scFv 903(Lightning-Link 키트 (protocol: Lightning-Link™ Biotin Conjugation Kit, Type A, # 704-0015, Innova Biosciences)로 비오틴화된 500 mcg 단백질)을 첨가하였다. 상기한 목적을 위하여 비오틴화된 scFv 903을 250 ng/ml 농도의 희석 완충액(PBS, 10 mg/mL BSA 1% (w/v), 0.1 ml/50 ml Tween 20 (0.2% v/v))으로 희석하였다. 웰당 50 mcl을 첨가하였다. 밀봉된 플레이트를 실온(대략 25 ℃)에서 1.0 시간 동안 진탕하면서 인큐베이션하였다.
플레이트를 다시 상기한 바와 같이 3회 세척하였다. 제2 검출 시약, 스트렙타비딘-Poly-HRP (Stereospecific Detection Technologies, 1 mg/ml)를 희석 완충액으로 1:5'000으로 희석하여 웰당 50 mcl을 첨가하였다. 밀봉된 플레이트를 실온(대략 25 ℃)에서 1.0 시간 동안 진탕하면서 인큐베이션하였다.
검출을 위하여, 플레이트를 상기한 바와 같이 웰당 300 mcl 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 이어서, 플레이트를 웰당 300 mcl의 ddH20로 2회 세척하였다. 이 후, 웰당 50 mcl POD (TMB) 기질을 실온에서 첨가하였다. 3-6분 동안 인큐베이션한 후(인큐베이션 시간은 최대 30분을 초과하지 않아야 한다), 50 mcl/웰 1M HCL을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 발색 반응이 너무 강하면, 더 빨리 50 mcl/웰 1M HCL을 첨가하여 반응을 중단한다.
Tecan Sunrise의 마이크로역가 플레이트 판독기를 사용하여 플레이트를 450 nm에서 판독하였다. 전형적으로, 반응은 각각의 품질 제어용, NSB 및 개별 혈청 샘플에 대해 3회 반복하였다. 판독을 평균화하였다.
1.3 에세이 커트 포인트 (ACP) 결정
양성(positive)의 결정을 위해 에세이 커트 포인트를 에세이 진행 동안 구축하였다. 에세이의 커트 포인트는 에세이 반응의 수준으로, 그 이상에서는 샘플이 양성인 것으로 규정되고 그 이하에서는 샘플이 음성인 것으로 규정된다. 리스크를 기반으로 한 접근방법을 사용하여 5% 위양성(false positive)을 가지는 것이 위음성 보다 적절하였다. 이것은 파라미터 접근방식으로 1.645의 표준편차를 더한 평균 흡광도를 사용하여 수행되었으며, 여기에서 1.645는 정규분포의 95번째 백분위수이다. OD ≥ 3* 표준편차를 가지는 모든 개인을 배제하고 새로운 에세이 커트 포인트를 계산하였다. 개인들의 최대 5%의 OD가 ACP 이상이면, 계산된 값은 ACP로서 사용될 수 있다. 반면, 남아있는 개인들에 대한 제외 기준을 다시 적용하여 최대 5%의 개인들이 ACP 이상의 OD를 가질 때까지 과정을 반복하였다.
149개의 개별 혈청 중 34개를 제외한 후, 에세이 커트 포인트를 0.110으로 교정하였다. 40 개 혈청(26.8%)이 에세이 커트 포인트 보다 더 높은 OD를 나타내었다(도 2 참조). LoQC, MeQC 및 HiQC 샘플을 에세이 수행의 모니터링에 포함시켰다. NSB의 제조를 위해 에세이 커트 포인트의 통계적 평가용으로 옮겨진 34개 혈청을 혈청 모음에서 제외시켰다. 평균 NSB 결과는 0.073이고, 정규화(normalisation) 인자는 1.50이었다.
1.4 정규화 인자와 플레이트 특이적 커트 포인트의 결정
ACP를 NSB로 결정한 다음, 정규화 인자를 적용하여 동일한 NSB로 차후 측정에 대한 플레이트 특이적 커트 포인트를 계산하였다. 정규화 인자를 결정하기 위하여 NSB의 OD값을 평가하였다. NSB의 3회 반복물(트리플리케이트)을 각각의 플레이트에서 분석하였다. 정규화 인자는 NSB의 평균 흡광도로 나눈 에세이 커트 포인트로 정의된다. 각 플레이트에 대한 플레이트 특이적 커트 포인트는 다음과 같이 계산되었다:
플레이트 특이적 커트 포인트 = NSB 흡광도 * 정규화 인자
1.5 확인 에세이
혈청 중의 검출된 ADA의 경우에, 확인 에세이는 ADA 브릿징 ELISA에서 양성인 것으로 밝혀진 항체가 scFv 903에 특이적임을 입증하고 있다. 확인 에세이는 양성 샘플을 혼합하여 분석 전에 scFv 903을 함유하는 에세이 완충액 또는 단지 에세이 완충액과 사전 인큐베이션하는 것을 제외하고 스크리닝 에세이와 유사하다. 이러한 목적을 위하여 대조물질을 LoQC, MeQC 및 HiQC 수준의 농도로 희석 완충액 또는 인간 혈청에 혼합하였다. 그런 다음, 샘플들을 완충액 또는 10 mcg/ml, 100 mcg/ml 또는 1 mcg/ml (인간 혈청에 대해) scFv 903을 함유하는 완충액으로 2분의 1로 희석하였다. 샘플들을 RT에서 약 60분 동안 인큐베이션하여 샘플 중에 존재하는 ADA에 scFv 903을 결합시켰다. 전체 매트릭스 희석을 최소로 하기 위하여 플레이트 상에 로딩하기 전에 샘플을 완충액에 추가로 희석하였다. scFv 903은 플레이트 상에 코팅된 scFv 903에 대한 ADA의 결합을 방해한다(도 1 참조). 그러므로, 완충액으로 2분의 1로 희석된 혈청과 scFv 903을 함유하는 완충액으로 2분의 1로 희석된 혈청 간의 > 30%의 OD값 변화는 특이적 항scFv 903 항체의 존재를 확인하는 최소 저해로 정의된다. 1 mcg/ml뿐만 아니라 10 mcg/ml, 100 mcg/ml의 scFv 903과의 사전 인큐베이션은 시험된 모든 3 QC 수준에 대하여 60% 내지 95%의 OD 변화를 일으켰다. 100 mcg/ml의 농도를 확인 에세이를 위해 선택하였다.
1.6 경쟁 에세이 결과
항scFv 903 항체의 결합부위를 맵핑하기 위하여, scFv 903의 IgG 포맷뿐만 아니라 기지의 아미노산 서열을 가지는 상이한 scFv의 세트를 과량의 scFv 903 대신에 상기한 확인 에세이 셋업에 사용하였다. 이러한 실험 셋업에서 ADA가 또한 시험 scFv 상에서 유사한 에피토프를 인식한다면, 주어진 시험 항체는 단지 항scFv 903 항체(ADA)에 대한 scFv 903의 결합에 대해서만 경쟁할 수 있다. 따라서, 에세이에서 시그널 감소는 scFv 903과 시험 scFv 사이에 공유된 적어도 하나의 에피토프 존재를 나타내게 된다. 다음 시험 항체를 실험에서 사용하였다: scFv105, Vk1-VH1b 타입의 인간 scFv 스캐폴드에 그래프트된 마우스 CDR을 포함하는 인간화된 TNF-저해 scFv 항체 단편; scFv 791, scFv 903 (Vkl-VH3)에서 사용된 바와 같은 동일한 scFv 스캐폴드에 그래프트된 래빗 CDR을 포함하는 인간화된 TNF-저해 항체 단편; scFv 961, 가변 및 불변 도메인 사이의 경계면에 위치한 영역 내에 3개의 포인트 돌연변이(DHP 모티브)를 포함하는 scFv 903의 유도체, 및 scFv903-IgG, scFv 903의 IgG 포맷.
ADA 결합 특성의 차이를 가지는 4개의 시험 분자 간 서열 변이의 상관관계를 사용하여 전체 scFv 스캐폴드 및, 보다 구체적으로 V-C 경계면에서의 ADA 에피토프를 동정하였다. 또한, scFv903 (IgG)의 전체 크기 버젼과의 경쟁을 사용하여 선재하는 ADA의 포맷 특이성을 추가로 확인하였다.
경쟁 실험으로부터의 데이터를 표 1에 요약하였다. 2개의 개별 인간 혈청을 제외한 모두의 결합을 과량의 scFv 903과 경쟁시켜서 이러한 ADA가 ESBA903에 특이적인 것을 확인하였다. scFv 903에 특이적인 32개 인간 혈청 중에서 단 2개만이 scFv791에 의해 경쟁되지 않아서, 이러한 인간 혈청(H53 및 H76)에 존재하는 항체가 scFv903 CDR에 결합하지만, 다른 모든 혈청은 분명히 CDR 특이적이지 않음을 나타내었다. 이러한 반응이 약간 더 낮지만, 약 48%의 ADA 또한 scFv105상에서 에피토프를 인식한다. 이것은 대부분의 항체가 명백하게 프레임워크 특이적이라기 보다는 상이한 scFv 스캐폴드에서 보존된 아미노산에 결합하는 것임을 나타낸다. 흥미롭게도 scFv 903의 IgG 포맷은 시험된 혈청에 대한 결합에서 scFv 903과 심각하게 경쟁하지 않았다. 이것은 대부분의 혈청이 가변 및 불변 영역 사이의 계면에 결합하여 scFv 903의 IgG 포맷에서가 아니라 scFv 903의 ADA에 접근가능하다는 것을 강력하게 시사한다. 또한, scFV903과 단지 3개 아미노산만이 다른 scFv 961은 단지 64% ADA의 결합을 경쟁하였다. 이러한 반응은 일반적으로 scFV903보다 더 낮은 것으로, 선재하는 ADA의 주 분획이 scFv 903의 V-C 경계면에서 소수성 표면 패치를 구성하는 3개 아미노산을 포함하는 에피토프에 결합하는 것을 나타낸다. scFV903과 비교하여 scFV105로 얻어진 결과들 간의 차이는 이러한 두 개 분자들에서 소수성 표면 패치의 상이한 패턴의 존재에 의해 설명될 수 있다. 요약하면, 이러한 결과는 인간 혈청 내의 선재하는 ADA의 최대 50%가 scFv 포맷 특이적 항체임을 나타낸다.
표 1:
인간 혈청 내의 선재하는 항체의 에피토프 특성화. 100 mcg/ml의 scFv903, 791 (34_max), scFv105 및 961 (scFv903_DHP) 및 scFv903의 IgG 포맷과의 경쟁시 OD의 감소율(%)은 선재하는 항scFv903 항체를 가지는 34개의 상이한 인간 혈청에 대해 제공.
Figure pat00005
ADA와 scFv 903 간의 상호작용 부위를 동정하기 위하여 scFv 903과 다른 scFv (791, 105 및 961) 간의 서열 변이를 다양한 인간 혈청 중의 ADA의 특이성과 연관시켰다. 제1 단계에서, 상이한 scFv의 서열을 정렬시키고 용매 노출 위치를 scFv 903과 다른 scFv간의 서열 차이(도 3 및 4)에 따라 그룹지었다. 여기에서, "α"는 scFv 961과 다른 모든 scFv 간에 다른 위치의 그룹을 나타내고, "β"는 scFv 105만이 다른 분자들로부터의 서열과 다른 위치를 나타내며, "γ"는 scFv 791이 다른 모든 것들과 상이한 위치를 나타낸다. 또한, αβ와 αγ는 scFv 961과 scFvl05 또는 scFv961과 scFv791 각각을 제외한 모든 scFv에서 보존되는 위치를 나타낸다. 마찬가지로, 항scFv903 항체를 함유하는 인간 혈청을 아미노산 위치에 대하여 위에서 사용된 동일한 분류 코드를 사용하여 경쟁 에세이에서 측정된 다른 scFv에 대한 이들의 특이성으로 분류하였다(표 2 참조). 혈청이 제공된 시험 scFv에 대한 결합으로 적합화하기 위해 경쟁 에세이에서 50%의 최소 시그널 감소를 역치로서 설정하였다. 이 시험에서 "α"는 scFv 961에 대해 결합 활성을 나타내지 않은 인간 항scFv 903 혈청을 나타낸다. "β"-혈청은 scFv105에 결합하지 않았고, "γ"-혈청은 scFv 791에 결합하지 않았다. 서열 분석과 시험관내 결합 시험의 상관관계로부터, 예를 들면 "α" 타입 인간 혈청의 항scFv 903 항체는 아미노산 그룹 "α"로부터의 적어도 하나의 아미노산과 상호작용한다고 결론지을 수 있다. 마찬가지로, 다른 타입의 혈청은 각각의 아미노산 그룹 내의 적어도 하나의 아미노산과 상호작용한다.
scFv 903의 구조 분석과 상동성 모델을 Discover Studio version 2.5.5를 사용하여 수행하였다. 모델링된 구조를 분석하여 어떤 아미노산 잔기가 용매에 노출되었는지와 어떤 아미노산 잔기가 묻혔는지를 측정하였다. 각 잔기들의 최대 가능한 용매가 접근가능한 표면적과 관련하여 각 잔기의 상대적 Solvent Accessible Surface (SAS)를 측정하여 계산하였다. 컷오프를 25%로 규정하였으므로 상대적 SAS가 25% 이상인 잔기는 용매 노출된 것으로 간주되었다.
Figure pat00006
94%의 혈청이 scFv 903 또는 scFv 791에 특이적으로 결합된 항체를 가져서 대부분의 선재 항체가 CDR 영역에 결합하지 않은 것으로 나타났다. 사람 혈청의 절반(50%)은 scFv 961에 결합하는 항체를 보이지 않거나 거의 가지지 않았다. 서열 분석에서는 scFv 961 및 scFv 903이 가변 중쇄의 12, 103 및 144 위치에서만 다른 것으로 나타났다. 따라서, scFv 903의 가변 중쇄 내의 L12, V103 및 L144는 ADA 결합에 연관되어 있다(표 2 및 도 4와 5). 이러한 발견은 또한 각각의 경계면 잔기가 이웃한 불변 영역과의 접촉으로 인하여 용매 접근할 수 없는 scFv 903의 IgG 포맷이 항scFv 903 혈청과 scFv 903의 결합과 경쟁하지 않는다는 사실에 의해 확인되었다.
12%의 시험된 인간 혈청은 모든 항원 영역(α,β,γ)에 대한 항체를 가졌다.
64%의 혈청은 scFv 961 (α)에 결합하는 항체를 포함하지 않거나 거의 가지지 않았다. 상기한 바와 같이, 이 scFv는 이전의 가변-불변 도메인 경계면에 위치한 3 잔기 위치(L12S, V103T, L103T)에서만 scFv 903과 상이하다. V/C 경계면에서 이러한 잔기 위치는 고도로 보존되므로 이 위치들을 돌연변이하는 것은 생체물리학적 특성에 영향을 미치지 않고 scFv를 탈면역화하는 일반적 방법을 이미 제공한다.
51%의 혈청은 scFvl05 (β) Vk1-VH1b 서브타입 (상이한 프레임워크)의 scFv에 대한 항체를 포함하지 않거나 거의 가지지 않았다. 가능한 항원 영역을 서열 정렬로 동정하였다(도 3, 4 및 5).
23%의 혈청은 scFv 903에 특이적이지만, scFv105 또는 scFv 961 (αβ)과 결합하지 않았다. scFv903과 비교하여 2개 scFv에서 상이한 하나의 잔기 위치만이 있다. 따라서, scF 903 (L12)의 가변 헤비 도메인 내의 각각의 아미노산은 ADA와 scFv 903 사이의 상호작용에서 중요한 역할을 한다.
요약하면, a) 대략 50%의 ADA가 가변 영역과 불변 영역(α) 사이의 경계면에서 에피토프에 결합하고, 가변 헤비 도메인 내의 12, 103 및 144 위치의 잔기를 포함하고, b) 이러한 3개의 고도로 보존된 잔기를 돌연변이시키는 것은 결합강도와 일반적으로 scFv에 대한 선재 항체의 빈도를 상당히 저하시키는 것으로 결론지을 수 있다. scFv의 면역원성을 감소시키는 DHP-모티브의 이러한 포괄적 적용가능성은 또한 인간 기원의 가변 중쇄 내 12 위치의 루이신, 103 위치의 발린 및 144 위치의 루이신의 높은 빈도로 뒷받침된다(도 6). 항scFv 903 혈청과 scFv105의 결합이 일반적으로 scFv 903과 비교하여 더 약하기 때문에 scFv105에서 각 아미노산에 대한 scFv 903 내에서 용매 노출된 잔기의 치환은 B-세포 에피토프를 잠재적으로 제거하거나 약화시킬 수 있다. 특히 가변 경쇄의 잔기번호 101과 148이 주목되며, 이러한 벌키 잔기가 이전의 불변-가변 도메인 경계면에 참여하기 때문이다(표 4)
Figure pat00007
Figure pat00008
이제까지 본 발명의 바람직한 구체예를 나타내고 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되지 않고 다른 한편으로 이하의 청구항 범위 내에서 다양하게 구현되고 실시될 수 있음을 명백히 알 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> ESBATech an Alcon Biomedical Research Unit Urech, David Gunde, Tea Borras, Leonardo <120> METHOD FOR DECREASING IMMUNOGENICITY <130> 3763 <160> 4 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 251 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> antibody fragment <400> 1 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ile Ile His Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Tyr Leu Ala Ser Thr 85 90 95 Asn Gly Ala Asn Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 130 135 140 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu 145 150 155 160 Thr Asp Tyr Tyr Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 165 170 175 Leu Glu Trp Val Gly Phe Ile Asp Pro Asp Asp Asp Pro Tyr Tyr Ala 180 185 190 Thr Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn 195 200 205 Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 210 215 220 Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Asp His Asn Ser Gly Trp Gly Leu Asp Ile 225 230 235 240 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 245 250 <210> 2 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> antibody fragment <400> 2 Met Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Leu 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Gly 20 25 30 Asn Ile Trp Met Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg 50 55 60 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser 65 70 75 80 Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Asn Phe Asn 85 90 95 Thr Gly Asp Arg Tyr Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu 130 135 140 Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe 145 150 155 160 Thr Ile Ser Arg Ser Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 165 170 175 Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Cys Ile Tyr Gly Asp Asn Asp Ile Thr 180 185 190 Pro Leu Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly Arg Phe Pro Val Ser Thr Asp 195 200 205 Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu 210 215 220 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Tyr Ala Asp Tyr Ala 225 230 235 240 Tyr Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 245 250 <210> 3 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> antibody fragment <400> 3 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 Val Val Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Phe Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Arg Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Ser Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 130 135 140 Ser Val Lys Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 145 150 155 160 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 165 170 175 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Lys Phe 180 185 190 Lys Asp Arg Phe Thr Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Val Tyr 195 200 205 Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 210 215 220 Ala Arg Glu Arg Gly Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 225 230 235 240 Val Thr Val Ser Ser 245 <210> 4 <211> 251 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> antibody fragment <400> 4 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ile Ile His Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Tyr Leu Ala Ser Thr 85 90 95 Asn Gly Ala Asn Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln 130 135 140 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu 145 150 155 160 Thr Asp Tyr Tyr Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 165 170 175 Leu Glu Trp Val Gly Phe Ile Asp Pro Asp Asp Asp Pro Tyr Tyr Ala 180 185 190 Thr Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn 195 200 205 Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr 210 215 220 Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Asp His Asn Ser Gly Trp Gly Leu Asp Ile 225 230 235 240 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 245 250

Claims (10)

  1. 가변 경쇄 아미노산 위치 99 (AHo 넘버링)를 세린(S)으로, 가변 중쇄 아미노산 위치 12 (AHo 넘버링)를 세린(S)으로, 가변 중쇄 아미노산 위치 103 (AHo 넘버링)을 세린(S) 또는 트레오닌(T)으로, 그리고 가변 중쇄 아미노산 위치 144 (AHo 넘버링)를 세린(S) 또는 트레오닌(T)으로 치환하는 단계를 포함하는, 가변 경쇄 및 가변 중쇄의 면역원성을 감소시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 가변 도메인들이 단일 사슬 항체 (scFv)의 일부인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 치환될 아미노산 잔기가 루이신(L), 발린(V), 아스파르트산(D), 페닐알라닌(F), 아르기닌(R) 및/또는 글루탐산(E)인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 가변 중쇄의 아미노산 잔기가
    (a) 중쇄 아미노산 위치 12에서 세린(S);
    (b) 중쇄 아미노산 위치 103에서 트레오닌(T); 및
    (c) 중쇄 아미노산 위치 144에서 트레오닌(T)으로 치환되는 방법.
  5. 제1항에 따른 방법에 의해 수득되는 항원 결합 단편.
  6. 제5항에 있어서, 치료 또는 진단 용도를 위한 항원 결합 단편.
  7. 제6항에 있어서, 부위적으로 및/또는 국소적으로 적용되는 항원 결합 단편.
  8. 제6항에 있어서, 서방성 제제 및/또는 장치로 적용되는 항원 결합 단편.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 사슬 항체(scFv)인 항원 결합 단편.
  10. 경쇄 아미노산 위치 99 (AHo 넘버링)의 세린(S)을 포함하는 가변 경쇄; 및
    중쇄 아미노산 위치 12 (AHo 넘버링)의 세린(S), 중쇄 아미노산 위치 103 (AHo 넘버링)의 세린(S) 또는 트레오닌(T), 및 중쇄 아미노산 위치 144 (AHo 넘버링)의 세린(S) 또는 트레오닌(T)을 포함하는 가변 중쇄;
    를 포함하는, 단일 사슬 항체 (scFv).
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