TWI633184B - 用於降低免疫抗原性的方法 - Google Patents

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Abstract

揭露一種用於降低抗體變異區之免疫刺激性的方法。

Description

用於降低免疫抗原性的方法 相關申請案的交互參考
本申請案基於U.S.C. §119請求2009年12月23日申請之美國臨時專利申請案No. 61/289,446，其之完整內容係併於此以作為參考。
發明領域
本發明有關於一個改變抗體變異區(特別是scFvs)的免疫刺激性的方法。
 發明背景
施打於有需求的受試者之治療用抗體通常會被受試者的免疫系統辨識為外來物。即使將施打的抗體擬人化，例如透過將鼠源互補決定區(CDRs)嫁接到人類免疫球蛋白架構區使鼠源分子減少到最低，施打的抗體仍可能引發免疫反應而減損治療的有效性及/或安全性。
依據文獻，病患的抗體反應係取決於B細胞的抗原決定區和T細胞的抗原決定區二者的存在。當一B細胞受器辨識並結合抗原(例如一施打的治療用抗體)時，抗原藉由受器引導的細胞內吞作用被納入B細胞內並進行蛋白酶分解作用。產出的胜肽接著被第二類組織相容性複合體(MHC class II)分子表現出來。在輔助型T細胞辨識出T細胞抗原決定區後，輔助型T細胞刺激對應的B細胞進行增殖並分化成可產生抗體的漿細胞。
為了降低病患免疫系統對所施打抗體的反應，先前技術已提供了數種去免疫的技術。多數現行的方法著眼於T細胞抗原決定區的去除，然而降低B細胞免疫刺激性的方法卻只有有限的案例。
WO 93/18792描述一種藉抗體的部分去除以改良抗體的製程。這個製程改變了抗體的免疫刺激性，以使得抗體誘發之抗同型(anti-isotypic)反應的能力被選擇性地降低，但仍有能力引起抗遺傳型(anti-idiotypic)反應。雖然這個方法適用於疫苗，但抗遺傳型反應卻非其他治療性應用所希望的。
Molineux G(2003) Pharmacotherapy 23: 35-85敘述了蛋白質對高分子量的聚乙二醇的偶合。然而Onda,M. et al(2008),PNAS Vol 105(32): 11311-11316已報導此方法與雜交蛋白的有限性成功，該雜交蛋白係由多種附接至細菌或植物毒素之片段所構成。該等雜交蛋白係非活性化的；此外，他們發現於免疫刺激性僅係一少量的降低。
第二種方法存在於抗體施打前之化學療法，其中病患係被施以環磷醯胺(cyclophosphamide)或福達樂(fludarabine)。因為此治療會損傷免疫系統，這個方法對病患是不滿意的(Kusher,BH et al(2007),Pediatr Blood Cancer 48: 430-434;Leonard JP et al(2005),J Clin Oncol 23: 5696-5704)。
Nataga,S. and Pastan,I.(2009),Adv Drug Deliv Rev,p.977-985 and Onda,M. et al(2008),PNAS Vol 105(32): 11311-11316提出在外來蛋白表面上之「抗原熱點處」的點突變，藉此去除B細胞的抗原決定區。他們以小胺基酸(丙胺酸、甘胺酸和絲胺酸)取代帶有大裸露區域的龐大親水性殘基。丙胺酸係適合用於取代，因為丙胺酸係典型地出現在所有二級結構的埋藏和裸露部分，且亦不會賦加新的氫鍵結。丙胺酸缺少能與抗體反應的β-碳後的側鏈原子，且會保持抗原的構形。然而，被Nataga和Pastan所描述的該「熱點」係構形上的抗原決定區，其等係位於蛋白質表面上之分離的叢群中。確定抗原決定區的位置需要大量實驗工作，且不能用電腦模擬重現，因此該方法無法成為慣用於降低抗體免疫刺激性的通常方法。此外，此方法的基本假設在於分子表面上的主要親水性殘基涉及與宿主抗體的接觸。對多數外來蛋白而言這個假設事實上為真，然而在只有自然產生蛋白質的部分(如片段、區域)被使用的例子中，很有可能先前因與其他區域連接而被遮蓋的疏水性胺基酸也變成裸露至溶劑中且對免疫系統而言為抗原決定區。Fv抗體片斷即為一個明確的案例，其中在變異區上的界面殘基(interface residues)在Fab片段中是被覆蓋的，但在獨立的變異區則是裸露的。現今可得之用於預測B細胞抗原決定區的演算法極難被證實有效，且通常成功率很低。
因此，技術上對於提供有效降低抗體片斷且特別是針對變異區的免疫刺激性的直接方法存有一需求。
 發明概要
因此，本發明的一般目標是提供一種降低任何抗體變異區之免疫刺激性的方法，而不需執行大規模的分子模型作業。特別的是，本發明的目標是提供一種自抗體變異區去除B細胞抗原決定區的方法。
於是，本發明提供用於降低抗體變異區之免疫刺激性的方法，該抗體變異區包括一變異輕鏈及/或一變異重鏈，其中，該方法包括取代變異輕鏈及/或變異重鏈上之一或多個胺基酸殘基的步驟，該殘基係存在於對應的全長抗體或Fab的變異鏈和固定鏈之間的界面。
於一態樣，抗體變異區是一scFv、一Fv片段或一單區抗體，特別是一scFv。
於一態樣，變異輕鏈及/或變異重鏈之一或多個欲被取代的胺基酸殘基是各自亞型(subtype)的一致性殘基。
於另一態樣，欲被取代的一或多個胺基酸殘基是白胺酸(L)、纈胺酸(V)、天門冬胺酸(D)、苯丙胺酸(F)、精胺酸(R)及/或麩胺酸(E)。
在某些態樣中，變異輕鏈的一或多個胺基酸殘基是在位置99、101及/或148(AHo編號)。在其他態樣中，變異重鏈的一或多個胺基酸殘基則是在位置12、97、98、99、103及/或144(AHo編號)。
於另一態樣，變異重鏈的一或多個胺基酸殘基被取代為：(a)在重鏈胺基酸位置12的絲胺酸(S)；(b)在重鏈胺基酸位置103的絲胺酸(S)或蘇胺酸(T)；及/或(c)在重鏈胺基酸位置144上的絲胺酸(S)或蘇胺酸(T)。
於又一態樣，變異重鏈上之一或多個欲被取代的胺基酸殘基係為(a)在重鏈胺基酸位置12的白胺酸(L)；(b)在重鏈胺基酸位置103的纈胺酸(V)；及/或(c)在重鏈胺基酸位置144的白胺酸(L)。
於再一態樣，本發明提供由於此所揭露之方法所取得的抗體變異區，以及包含該抗體變異區的藥學組成物。
圖式簡單說明
當思考被放在接下來的關於本發明的詳細描述，本發明將更好被理解，且上面已說明之外的態樣將更清楚。這些描述係參照所附加之圖示。
第1a圖顯示一個用於偵測早期出現的抗-scFv抗體的橋接(bridging)ELISA示意圖。1：培養皿表面；2: scFv903；3：抗藥抗體(ADA)；4：生物素化scFv903；5：卵白素Poly-HRP(辣根過氧化氫酶)。
第1b圖顯示確認分析的原理，其為結合至藥品和生物素化之scFv903的ADA與一過量的scFv903、34 max(791)、scFv903_DHP(961)和scFv105(100 mcg/ml)競爭。
第2圖顯示149個單獨的血清於比色檢定(ELISA橋接)中的訊號強度，以偵測抗-scFv 903抗體。超過檢定分界點的訊號表示在相對之血清樣本中抗-scFv 903抗體(ADA)的存在。大約30%的受測血清樣本在檢測中為陽性。
第3圖顯示四種不同scFv之溶劑曝露位置的變異輕鏈的序列組合。上層表格：與scFv903中胺基酸種類相異的各scFv中的胺基酸用粗體表示。下層表格指出與個別位置相關的抗原決定區類別，及對各抗原決定區類別呈現結合作用的人類血清百分比。
第4圖顯示四種不同scFv之溶劑曝露區域的變異重鏈的序列組合。上層表格：與scFv903中胺基酸種類相異的各scFv中的胺基酸用粗體表示。下層表格指出與個別位置相關的抗原決定位類別，及呈現出結合在各抗原決定區類別的人類血清百分比。
第5圖顯示模擬的scFv903分子結構。5a：前側觀察圖。5b：旋轉180度的視圖。灰色：可能參與抗原決定區β類別的殘基；黑色：可能參與抗原決定區α類別的殘基。
 本發明之詳細說明
為了讓本發明較易於理解，對某些名詞先進行定義。除非不同的定義，於此所使用的所有技術和科學名詞和本發明所屬領域中之熟於此技者一般所了解者具有相同的意義。雖然於此所述相似或相同的方法和物質亦可用於本發明之實施或測試，但適合的方法和物質被記載於下面。於此所提及的所有出版物、專利申請案、專利和其他參考文獻整體被併入以作為參考。有所衝突時，本說明書(包括定義)將支配。另外，該等物質、方法和範例僅用於說明而非有意用於限制。
此處使用的「免疫刺激性」名詞意謂B細胞或某施打在受試者之蛋白質上抗體抗原決定區的出現，然而該等B細胞或抗體(亦稱為抗藥抗體，ADA)可能於該蛋白質施打之前已經存在。
該免疫刺激性的程度可由ELISA分析決定，並以含有可計數量之既存ADA之人類血清百分比來表達。蛋白質和被設計用以降低其免疫刺激性之目的的對應蛋白質間之免疫刺激性的降低，可藉由比較含有對抗經設計蛋白質的ADAs的血清樣本百分比與含有對抗原始蛋白質的ADAs的血清樣本百分比而被測量。對於經設計蛋白質之陽性反應的血清樣本的低數量或低百分比表示經設計的蛋白質之免疫刺激性的降低。可被施行在單一血清樣本基礎上之更高敏感度的測量方式係使用競爭性ELISA機構。在這個競爭性ELISA中，經設計的蛋白質與原始蛋白質為了與測試用血清中ADAs結合而進行競爭。經設計的蛋白質與原始蛋白質競爭的能力愈低，代表被降低的免疫刺激性愈成功。
免疫刺激性降低的程度較佳係稱為血清樣本百分比，其中經設計的蛋白質不再有能力與原始蛋白質進行有效地競爭。有效的競爭被定義為一個閾值(源自競爭性ELISA之相對性訊號)，而-100意謂完全競爭者(無免疫刺激性的降低)且0意謂完全沒有競爭性(完全沒有ADA抗原決定區)。通常有效競爭的閾值會是-90、-80、-70、-60、-50、-40、-30、-20、-10或>-10。
使用於此的「界面」或「界面-界面」係指那些位於全長抗體變異區和第一恒定區(CL1或CH1)之間或位於Fab部分和Fc區域(CH2和CH3)之間的區域。
使用於此的「ADA」是抗藥抗體的縮寫簡稱，意指於血清或病患血清中的既存抗體。
名詞「抗體變異區(V-Domain)」意指一含有抗體之所有或一部分抗原結合區的分子，例如所有或部分的重鏈及/或輕鏈變異區，如此則該抗體變異區專一地辨識出目標抗原。該名詞因此相當於免疫球蛋白的V-J-REGION或V-D-J-REGION。這些抗體變異區被稱為：VL(免疫球蛋白輕鏈的抗體變異區)或VH(免疫球蛋白重鏈的抗體變異區)。抗體變異區非限制的範例包括：
(i) Fv片段，包括一個抗體單臂上的VL和VH區，
(ii)　單鏈Fv片段(scFvs),
(iii)　單區抗體例如Dab片段(Ward et al.,(1989) Nature 341:544-546)，該片段由一個VH或一個VL區所組成，Camelid(見Hamers-Casterman,et al.,Nature 363:446-448(1993)，和Dumoulin,et al.,Protein Science 11:500-515(2002))或鯊魚抗體(例如shark Ig-NARs Nanobodies).
使用於此的名詞「抗體架構區」或「架構區」意指變異區的某部分(可能是VL或VH)，該部分係作為該變異區的抗原結合環(antigen binding loops)的支架(Kabat,E.A. et al.,(1991) Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242)。
使用於此的名詞「抗體CDR」或「CDR」意指由抗原結合環組成的抗體互補決定區，如同Kabat E.A. et al.,(1991) Sequences of proteins of immunological interest.. NIH Publication 91-3242)所定義。抗體Fv片段的兩個變異區域各含有例如三個CDR。
使用於此的名詞「單鏈抗體」或「scFv」意指一個分子，該分子包括透過連接子(linker)相連的一抗體重鏈變異區(VH)和一抗體輕鏈變異區(VL)。該scFv分子具有的通常結構為：NH2-VL-連接子-VH-COOH或NH2-VH-連接子-VL-COOH。
名詞「亞型(subtype)」意指一組在某特定物種中屬於同族群且共享高百分比一致性的抗體變異區。名詞「亞型」意指由各別的一致序列(consensus sequence)所界定之亞型，該一致序列係如同Knappik(2000)所定義。名詞”亞族(subfamily)”或”亞類(subclass)”被用於作為亞型的同義字。使用於此的名詞「亞型」意指一組序列，與代表其亞型的各別的一致序列共享最高程度的一致性和相似性。某特定變異區屬於何種亞型係透過以下方式決定，即將各自的序列與所有已知的人類生殖片段或已定義的各亞型的一致序列排列，接著基於最高同源性而連結到一特定亞型。決定同源性和藉著利用搜尋矩陣(search matrices)將序列分群的方法，例如BLOSUM(Henikoff 1992)，已經為熟習此藝者所熟知。
在特定位置上的「一致殘基」可藉在特定亞型產生胺基酸的一致序列而決定。使用於此的「胺基酸一致序列」係指一胺基酸序列，該序列可由最少二個(最好多個)排列的胺基酸序列的陣列(matrix)所產生，且允許排列中有缺口，故可能用於決定各位置上最常出現的胺基酸殘基。一致序列即為包含各位置上最常出現之胺基酸的序列。在二個或多個胺基酸被平等地表現在單一位置上的情況下，一致序列包括該二個或所有該等胺基酸。蛋白質的胺基酸序列可在多種層級中被分析。舉例來說，保留性或變化性可在單殘基層級、多殘基層級、多殘基伴隨缺口等等被顯示。殘基可表現同一殘基的保留性或可被保留於分類層級。其他類別已為熟習此藝者所知且使用結構性測定或其他資料而被定義，以評估其可代替性。在該概念下，一可取代的胺基酸係指任何在該位置處可被取代並維持原本功能的胺基酸。如同此處所示，當一個胺基酸序列(例如一第一VH或VL序列)與一個或多個其他的胺基酸序列(例如在資料庫中的一個或多個VH或VL序列)被排列在一起，一序列(例如第一VH或VL序列)上的一胺基酸位置可與一個或多個其他胺基酸序列中的”對應位置”進行比較。如同此處所示，當序列被最佳的排列在一起時，即，當序列排列以達到最高百分比一致性或百分比相等性時，該”對應位置”係表示被比照序列上的同等位置。
說明書中全文所使用的AHo編號架構被記載於A. Honegger and A. Plckthun(2001),J.Mol.Biol. 309: 657-670.
名詞”病患”係指一人類或一非人類之動物。
名詞處理(treat)、處置(treating)或治療(treatment)係指治療性及/或預防性方法，其目的為預防、治療、延緩、減輕疾病或復發性疾病的嚴重性或改善其一或多種症狀，或為延長受試者之生存期以令其超出未進行該處理所預期之生存期。
“親水性”胺基酸係為極性且帶電的胺基酸，如Asp、Glu、Lys、Arg和His。
胺基酸中有極性而無帶電者為Gly、Ser、Thr、Cys、Asp、Gln和Tyr。
“疏水性”的胺基酸通常為不具極性的胺基酸，如Ala、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Trp和Pro。
於第一態樣，一用以降低抗體變異區之免疫刺激性的方法被揭露。該抗體變異區包括一個變異輕鏈及/或一個變異重鏈，且該方法包括取代變異輕鏈及/或變異重鏈上一或多個胺基酸殘基的步驟，所稱殘基係表現在對應的全長抗體之變異鏈和恒定鏈間的界面(或Fab，即，任何包括一恒定區或其之一部分的抗體或抗體片段)。
該被選擇用於取代的一或多個胺基酸殘基係較佳地為該等表現在對應的全長抗體之變異鏈和恒定鏈間之界面者(或Fab，即任何包括恒定區或恒定區之一部分的抗體或抗體片段)，且係在抗體變異區中為溶劑曝露的，例如scFv。所稱界面亦可以V/C區域界面稱之。
抗體變異區係為例如，scFv、一Fv片段或一單區抗體，較佳是scFv。
特別值得注意的是，胺基酸殘基在位置上形成不連續的，即構形的，B細胞抗原決定區。該等殘基包括那些在以下位置被發現者(AHo編號)：變異輕鏈位置99、101及/或148；和變異重鏈位置12、97、98、99、103及/或144。
輕鏈上的殘基位置99、101和148(AHo編號)以及重鏈上的殘基位置12、98、103和144(AHo編號)係由Nieba et al.(1997)Protein Eng.,Apr;10(4):435-44(亦揭示於US 6,815,540)得知可藉蛋白質工程而促進抗體的折疊行為。Nieba建議在指定的位置以親水性胺基酸取代疏水性胺基酸；然而，文件中未提及這些取代物可能會對分子的免疫刺激性有影響。再者，該等作者們特別指出這些疏水性殘基並非全部皆可於取代時作為同等優良候選者。雖然疏水性團塊(patches)的存在在所有抗體中皆被維持著，他們的確切位置和程度係有變化。
如同此技術所知，以下特定胺基酸
(i)　表現在二級結構的扭轉區域，
(ii)　具大型的、彈性的側鏈或體積大的側鏈，或
(iii)　疏水性的
係傾向於成為B細胞抗原決定區的一部分從而引發免疫刺激性的反應。藉去除免疫刺激性的胺基酸，B細胞抗原決定區被阻斷且病患對抗體變異區的耐受度會被增強。
較佳的，選定的一或多個胺基酸殘基被一較選定的胺基酸具較低免疫刺激性之胺基酸所取代，即，不會引發免疫反應或引發弱的免疫反應。該等具較低免疫刺激性的胺基酸係相較於對含原始(即未取代)胺基酸之抗體變異區的ADA反應性為可降低ADA反應性的胺基酸。
免疫刺激性(即引發病患體內抗體反應的性質)可例如藉其抗原性(即與既存抗體的反應性)來預測。抗原性可例如經由橋接ELISA(見第1例和第1圖)，以ADA反應性加以決定，該橋接ELISA係利用來自供給者的血清，該血清可能含有既存抗體。因此，為了評估較低免疫刺激性的胺基酸，抗體變異區可能在被指定之位置被突變。該等突變對免疫刺激性的效果可藉由將在橋接ELISA中之前驅抗體的訊號與如於此所述之推定的低免疫刺激性的、經設計的衍生物的訊號間之競爭而被評估。ADA與抗體之結合亦可經由使用無標記結合檢定進行測量，例如表面電漿子共振、螢光共振能量轉移(FRET)、量熱分析法等。
在一具體實施例中，選定將用於被取代的胺基酸是在一或多個位置，該位置係選自由變異輕鏈殘基99、101和148，和變異重鏈殘基12、97、98、99、103和144所構成的組群中。
選用於取代的較佳胺基酸係表面露出但可被對應全長抗體或Fab中的恒定區所隱藏。舉例來說，選用於取代的較佳胺基酸為白胺酸(L)、纈胺酸(V)、天門冬胺酸(D)、苯丙胺酸(F)、精胺酸(R)及/或麩胺酸(E)。
更佳地，該選定將用於被取代的一或多個胺基酸殘基係選自由變異輕鏈殘基D99、F101和L148和變異重鏈殘基L12、R97、A98、E99、V103和L144所構成的組群中。
更佳地，白胺酸(L)、纈胺酸(V)、苯丙胺酸(F)及/或丙胺酸(A)係被極性的胺基酸所取代，較佳係由絲胺酸(S)及/或蘇胺酸(T)所取代。
尤其，如於PCT/CH2009/00022所述之DHP基序(motif)已被意外地發現可降低抗體變異區之免疫刺激性，卻不會對抗體變異區的熱穩定性、再摺疊、表現產量、聚集及/或結合活性有不利的結果。該DHP基序(motif)包括變異重鏈12、103和144(AHo編號)的胺基酸殘基，在此等位置存在有下列胺基酸：
(a)　絲胺酸(S)在重鏈胺基酸的位置12；
(b)　絲胺酸(S)或蘇胺酸(T)在重鏈胺基酸的位置103；及/或
(c)　絲胺酸(S)或蘇胺酸(T)在重鏈胺基酸的位置144。
PCT/CH2009/00022並未提供任何下列暗示，即所教示的修改適合用於降低抗體變異區的免疫刺激性。
DHP基序係位於Fab片段的V/C界面且在去除恒定區時變成溶劑曝露。因此在本發明的較佳具體實施例中，一或多個用於取代之胺基酸殘基係選自於由變異重鏈12、103和144(AHO編號)所構成的組群中。較佳地，
(a)　白胺酸(L)表現於重鏈胺基酸位置12；
(b)　纈胺酸(V)表現於重鏈胺基酸位置103；及/或
(c)　白胺酸(L)表現於重鏈胺基酸位置144。
該等殘基在人類架構區中被高度保留。因此，取代一或多個前稱殘基提供了一將抗體變異區去免疫卻不影響分子生物物理性質的通常解決方法，且於此揭露的方法係可適用於一抗體變異區的任何架構區。較佳者，該等表現於指定位置之殘基係被以下取代：
(a)絲胺酸(S)在重鏈胺基酸位置12；
(b)絲胺酸(S)或蘇胺酸(T)在重鏈胺基酸的位置103；及/或
(c)絲胺酸(S)或蘇胺酸(T)在重鏈胺基酸的位置144。
更佳者，下述取代係被進行：L12S、V103T及/或L144T。
抗體變異區可能被指示針對任何目標，且專一地結合該目標。目標的範例包括但不限於：一穿膜分子、一受器、一配體、一生長因子、一生長激素、一凝血因子、一抗凝血因子、一纖維蛋白溶酶原活化物、一血清白蛋白、一激素或一生長因子的受器、一神經營養因子、一神經生長因子、一纖維母細胞生長因子、轉形生長因子(TGF)、一CD蛋白、一干擾素、一細胞群落刺激因子(CSF)、一白血球介素(IL)、一T細胞受器、一表面膜蛋白、一病毒蛋白、一腫瘤相關抗原、一細胞黏合素或一白血球介素、VEGF；一腎素；一人類生長激素；一牛生長激素；一生長激素釋放因子；副甲狀腺激素；甲狀腺刺激素；一脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰島素A鏈；胰島素B鏈；前胰導素；促濾泡素；降血鈣素；黃體成長激素；升糖素；凝血因子VIIIC；凝血因子IX；組織因子(TP)；血管性假性血友病因子(von Willebrands factor)；蛋白質C；心房利尿鈉因子；肺界面活性劑；尿激酶；人類尿液；組織型纖維蛋白溶酶原活化物(t-PA)；鈴蟾素；凝血酶原；造血生長因子；腫瘤壞死因子-α或-β；腦啡肽酶；RANTES(調節活化正常T細胞表現並分泌)；人類巨噬細胞炎性蛋白(MIP-1)-α；人類血清白蛋白；穆樂抑制物質(Muellerian-inhibiting substance)；鬆弛素A鏈；鬆弛素B鏈；前鬆弛素(prorelaxin)；小鼠性促素關連胜肽；一微生物蛋白質，β-內醯胺酶；DNase；IgE；一細胞毒性T-淋巴細胞關聯性抗原(CTLA)；CTLA-4；抑制素；活化素；血管內皮生長因子(VEGF)；蛋白質A或D；一風濕性因子；骨衍生性神經滋養因子(BDNF)；神經營養因子-3，-4，-5，或-6(NT-3，NT-4，NT-5，或NT-6)；NGF-β；血小板衍生生長因子(PDGF)；aFGF；bFGF；表皮生長因子(EGF)；TGF-α；TGF-β(包括TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3，TGF-β14，或TGF-β5)；似胰島素生長因子-I或-II(IGF-I或IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(腦IGF-I)，一似胰島素生長因子結合蛋白，紅血球生成素；骨誘導因子；一免疫毒素；一骨形態演發蛋白(BMP)；干擾素-α，-β，或-γ；M-CSF，GM-CSF或G-CSF；IL-1到IL-10；超氧化歧化酶；衰減加速因子；一AIDS套膜蛋白；一穿膜蛋白；一回歸受體；一位址素(addressin)；一調控蛋白；CD3，CD4，CD8，CD11a，CD11b，CD11c，CD18，CD19，CD20，CD34，CD40，orCD46，一ICAM，VLA-4或VCAM；或HER2，HER3或HER4受體；ErbB受體群之一；一EGF受體；HER2，HER3或HER4受體；一細胞黏附分子；LFA-1，Mac1，p150.95，VLA-4，ICAM-1，VCAM，α4/β7細胞黏合素或αv/β3細胞黏合素；一細胞黏附分子之α或β次單元；抗體)；一生長因子，VEGF；組織因子(TF)；TGF-β；α干擾素(alpha-IFN)；IL-8；IgE；血型抗原Apo2，死亡受體；flk2/flt3受體；肥胖(OB)受體；mp1受體；CTLA4或蛋白質C。
在另一具體實施例中，本發明提供一抗原結合片段，其可由此所揭露之方法獲得。該抗原結合片段可例如被使用作為治療或診斷的用途。
於此實施例中所使用的序列包括：
實施例1：抗藥抗體橋接ELISA(ADA-ELISA)
1.1　背景
抗單株抗體的既存抗體可能被指為恒定區、變異區架構位置或抗原結合圈(即CDR)。專一結合至Fv片段而非IgG的既存抗體很可能去辨識先前被IgG所遮蓋的區域。該等區域主要為定位在變異區和第一恒定區(CL1或CH1)之間或在Fab部分和Fc區(CH2及CH3)之間的區域界面。辨識該等界面的抗體極有可能於形式為特別的。既然scFv903架構區序列在人類中為高度保留，這可能顯示對於人類血清中的scFv903的既存抗體會結合至CDR或V/C界面殘基。此既存抗-scFv903抗體的抗原決定區係在三明治ELISA中透過評估各種scFv與ESBA 903對抗藥抗體(ADA)之結合為競爭的潛力而被特徵化。該等被測試之scFv為：
-含與scFv903相同之架構區但不同CDR的scFvs(34_max(791))，
-具一與scFv903不同架構區且不同CDR的scFv(scFv105)，及
-一含有在先前V/C界面中之取代物的scFv903變異物(scFv903 DHP(961))。
為抗-scFv903抗體之篩選所發展的ELISA是一種準定量檢驗法且以一橋接形式(見第1圖)被發展，其允許來自不同物種之所有抗體同型體(isotype)反應的偵測。
簡言之並對照第1圖，微皿盤被覆以scFv 903(1、2)，含有抗-scFv 903抗體(3、6)之樣本係與scFv 903(1、2)結合。作為第一檢測劑，生物素化之scFv903(4)被使用為檢測任何已結合的scFv 903/抗-scFv 903複合物，該複合物則以第二檢測劑(4)，即卵白素Poly-HRP(5)，來檢測。抗-scFv 903抗體在品質控制組和樣本中表現的數量係使用過氧化酶(POD)受質(3,3’-5,5’四甲基聯苯胺(TMB))加以決定。
ADA ELISA的發展係用一陽性對照組抗體來進行，該抗體名為AB903-3。抗-scFv 903抗體庫(兔多株抗-scFv 903 IgG，名為AB903-3)係藉以scFv 903之免疫兔子及而後之血清的親和性純化(Squarix Biotechnology)而發展。如第1b圖所描寫，scFv 903上之既存抗體的抗原決定區係藉結合至scFv 903之ADA與前述之scFvs競爭而特徵化。
1.2　分析流程
一微皿盤(Nunc Maxisorp)係以溶於PBS(Dulbecco,Sigma)中之0.1 mcl/ml scFv 903塗佈。該密封的微皿盤被置於4℃中隔夜培養。
在Atlantis Microplate Washer(ASYS)中，以300 mcl/井清洗緩衝液(TBST 0.005% Tween(20)清洗該微皿盤三次。非專一性結合係以280 mcl/井之阻隔緩衝液(PBS,10 mg/ml BSA 1%(w/v),0.1 ml/50ml Tween 20(0.2%,v/v)阻隔。該密封的微皿盤被置於室溫(25℃)中搖晃培養1.5小時。接著，該微皿盤再以前述方法清洗三次。
分析物對照組(親和性純化之兔多株抗-scFv 903 IgG，名為AB903-3，或人類血清)以三種不同濃度加入：
HiQC: 2500 ng/ml AB903
MeQC: 500 ng/ml AB903
LoQC: 250 ng/ml AB903
品質控制組被注入在各NSB血清池(使用於決定分析分界點之所有血清的池，>30)。待測樣本被製備成1到10倍的稀釋物。50mcl的樣本被加入每個井中；密封的微皿盤被培養於室溫(25℃)2個小時。
如前面所示，微皿盤以清洗緩衝液清洗三次。加入作為第一偵側試劑之生物素化的scFv 903(500 mcg蛋白以Lightning-Link kit(protocol: Lightning-LinkTM Biotin Conjugation Kit,Type A,# 704-0015,Innova Bioscience進行生物素化)。為達所述目的，生物素化之scFv 903被以稀釋緩衝液稀釋為濃度250 ng/ml(PBS,10 mg/mL BSA 1%(w/v),0.1ml/50ml Tween 20(0.2% v/v))。50 mcl/井被加入。密封的微皿盤置於室溫(名義上為25℃)在搖晃下培養1小時。
該微皿盤再次依前所述清洗三次。第二偵測試劑卵白素-聚-HRP(Stereospecific Detection Technologies,1 mg/ml)以稀釋緩衝液稀釋1:5,000且50 mcl被加入每個井。密封的微皿盤置於室溫(名義上為25℃)在搖晃下培養1小時。
為了進行檢測，該微皿盤係以前述之300 mcl/井之清洗緩衝液清洗三次。接著，該微皿盤以300 mcL/井之ddH2O清洗二次。然後，在室溫下加入50 mcl/井之POD(TMB)受質。在培養3至6分鐘後(最長培養時間為30分鐘不可超過)，藉加入50 mcl/井之1M HCl以停止反應。若顏色反應非常強烈，以50 mcl/井之1M HCl提早停止反應。
使用Tecan Sunrise的微皿盤讀取器，微皿盤在450nm下被讀取。典型地，於各品質控制組、NSB和個別血清樣本中，反應係進行三次。讀取值係被平均。
1.3　分析分界點(ACP)的決定
為了判斷陽性反應者，一分析分界點在分析進行中被確立。一分析的分界點即分析反應的程度位在或超過一所被定義為陽性之樣本程度，且低於該定義為陰性之樣本程度。使用風險基礎流程，其適當地具有5%偽陽性而不是任何偽陰性。該分析利用參數方法做成，其使用平均吸光度加上1.645標準偏差，而1.645係常態分佈之第95百分位數。所有OD3*標準偏差的個體皆被排除，且一新分析分界點係被計算。若個體中最高的5%的OD值超過ACP，計算而得的數值會被當作ACP使用。相反地，剩餘個體的排除標準被再次實施，該流程重覆進行直到最高的5%的個體具有高於ACP的OD值。
在排除149個血清中的34個後，分析分界點被校正為0.110。40個血清(26.8%)的顯示高於分析分界點的OD值(見第2圖)。LoQC、MeQC和HiQC樣本亦被包括用於監測分析的表現。為準備NSB，因分析分界點的統計計算而被移除的34個血清由該血清池中被排除。平均NSB值結果是0.073，而致標準化因子為1.50。
1.4　決定標準化因子和微皿盤特別分界點
一旦ACP被以NSB決定，標準化因子被用於計算微皿盤特別分界點，以與相同的NSB用於後續測量。為決定標準化因子，一NSB的OD值被評估。於每一微皿盤上，三個NSB複製組(三重複)被進行分析。標準化因子被定義為特別分界點除以NSB平均吸光度值。每一微皿盤特別分界點被計算如下：
微皿盤特別分界點=NSB吸光度乘以標準化因子
1.5　確認分析(confirmatory assay)
在檢驗血清中ADAs時，一確認檢驗證實在ADA橋接ELISA中被發現之陽性的抗體係對scFv 903專一。確認分析與篩選檢驗相似，除了陽性樣本在分析前與含有scFv 903之分析緩衝液或只與分析緩衝液一起混和並預先培養。為達此目的，參考物質(reference material)被注入至稀釋緩衝液或人類血清中，至一LoQC、MeQC和HiQC等級的濃度。這些樣本接著以一比二的比例，以緩衝液或含10 mcg/ml、100 mcg/ml或1 mcg/ml(用於人類血清)之scFv 903的緩衝液進行稀釋。樣本被培養在室溫大約60分鐘，以使scFv 903結合至存在於樣本中之ADA。樣本於加入微皿盤前再被稀釋於緩衝液中，係為了使總基質稀釋(matrix dilution)為最低程度。scFv 903阻止了ADA和塗佈在微皿盤上的scFv 903之結合(亦見第1圖)。因此，在以一比二比例以緩衝液稀釋的血清和以一比二比例以含scFv 903緩衝液稀釋的血清之間的OD值大於30%的變化被定義為最小抑制性，以確認專一的抗-scFv 903抗體的存在。與10 mcg/ml、100 mcg/ml及1 mcg/ml的scFv 903的預先培養造成所有3個測試的QC等級在60%和95%之間的OD變化。100 mcg/ml濃度係被選定進行確認分析。
1.6競爭分析的結果
為了繪製出抗-scFv 903抗體的結合位置，一組具有已知胺基酸序列的不同scFvs及scFv 903的IgG形式係被用以取代前述建立的確認分析中過量的scFv 903。於此實驗架構中，若ADA辨識出一也位於測試的scFv上的相似抗原決定區，被給予的測試抗體只能為了與scFv 903結合而和抗-scFv 903抗體(ADA)進行競爭。因此，分析中的訊號減弱可能表示至少有一抗原決定區存在，且該抗原決定區由scFv 903和測試的scFv所共有。下面的測試抗體被用於本實驗中：scFv 105，一擬人化TNF-抑制性scFv抗體片段(其含有嫁接於Vk1-VH1b類型之人類scFv支架(scaffold)上之小鼠CDR；scFv 791，一TNF-抑制scFv抗體片段(其含有嫁接於與用於scFv 903(Vk1-VH3)相同之scFv支架(scaffold)之兔子CDR；scFv 961，一含有三個點突變(DHP-基序(motif))的scFv 903之衍生物，該點突變位在參與變異及恒定區間之界面中的區域，scFv 903-IgG，即scFv 903的IgG形式。
四個具不同ADA結合特性的測試分子間之序列變化的關聯被用於識別位於整個scFv支架中，更特別的是在V-C界面中之ADA抗原決定區。另外，與全長形式scFv 903(IgG)的競爭被用於進一步確認既存ADA的形式專一性。
來自競爭實驗的資料摘要顯示在表1。除了兩個單獨的人類血清外，所有的結合性係與過量scFv 903被競爭，此確認了這些ADAs對於ESBA 903的專一性。32個對scFv 903專一之人類血清中只有2個不被scFv 791競爭，意即該等存在於人類血清(H53和H76)中之抗體會結合到scFv 903 CDRs，而所有其他血清都係明顯地非對CDR為專一。約48%ADAs會辨識scFv 105上的抗原決定區，雖然這些反應稍弱。這暗示大多數抗體並不明顯的對架構區專一，但會結合至不同scFv架構中被保留的胺基酸。有趣的是，對於與任何測試血清之結合，scFv 903的IgG形式並非顯著地與scFv 903競爭。這強烈暗示大部份血清結合至變異和恒定區之間的界面，該界面易受ScFv 903中之ADAs影響，但不受scFv 903之IgG形式影響。再者，與scFv 903僅3個胺基酸不同的scFv 961與ADA之僅64%的結合性競爭。這些反應係普遍地較低於與scFv 903的反應，其暗示既存ADAs的優勢片段結合在含該3個胺基酸的抗原決定區，該3個胺基酸在scFv 903的V-C界面中組成一疏水性表面團塊。由scFV105和scFV903相比較所取得結果間的差異可被解釋為係在該二個分子中不同型態的疏水性表面團塊的存在。簡短來說，這些結果顯示人類血清中至高50%之既存ADAs表現對scFv形式專一的抗體。
表一
人類血清中既存抗體之抗原決定區的特性。當scFv903的IgG形式與100 mcg/ml的scFv903,791(34_max)、scFv105和961(scFv903_DHP)競爭時，34個包括既存抗-scFv903抗體的不同人類血清的OD降低%係被提供。
為確認ADAs和scFv 903間的反應位置，scFv 903和其他scFvs(791、105和961)間的序列變化被關聯至多種人類血清ADAs的專一性。於第一步驟，不同scFvs的序列被排列且溶劑曝露位置係依據scFv 903和其他scFvs間的序列差異被分組(第3和第4圖)。於此，“α”表示scFv 961和所有其他scFvs間不同之位置的組群，“β”表示僅scFv 105與其他分子在序列上相異的位置，而“γ”表示scFv 791與所有其他者不同的位置。此外，αβ和αγ描述除了scFv 961和scFv105或scFv961和scFv791外，在所有scFvs中被保留的位置。相同地，藉由使用與前面用於胺基酸位置相同的分類編碼，將含抗-scFv903抗體的人類血清以其對其他scFvs的專一性被分類(見表二)，該專一性係於競爭分析中被決定。為了令一血清符合結合至一被給予之測試scFv的條件，競爭分析中50%之最小的訊號降低被設為閾值。在此研究中，“α”代表不會對scFv961顯示結合活性之人類抗-scFv903血清。“β”-血清不會結合至scFv105，且“γ”-血清不會結合至scFv791。由序列分析和體外結合性研究的關聯性，其可推論為例如抗-scFv 903抗體於“α”型人類血清中與至少一來自胺基酸“α”組群的胺基酸進行反應。同樣地，任何其他型血清與至少一來自所對應之胺基酸組群的胺基酸進行反應。
scFv 903的結構分析和同源模式藉使用Discover Studio version 2.5.5而完成。模擬的結構被分析以決定何種胺基酸殘基被曝露於溶劑，及何種胺基酸殘基被埋藏。計算藉由決定關於各殘基之最大可能溶劑可親表面積的相對溶液接觸表面(SAS)而完成。截點被定義為25%，因此，具有一等於或多於25%之相對SAS的殘基即被認為是溶劑曝露的。
表二
34個血清樣本中，scFv 903、791、scFv105和961與scFv903競爭對於抗體之結合的ELISA結果。
94%血清具有專一地結合至scFcv 903或scFv 791的抗體，其顯示多數既存抗體並未結合至CDRs區。半數(50%)的人類血清並未顯示或具有較少之結合至scFv 961的抗體。序列分析顯示scFv 961和scFv 903僅於變異重鏈的位置12、103和144相異。因此scFv 903的變異重鏈L12、V103和L144係與ADA結合有關(第2表和第4及第5圖)。該發現進一步藉由scFv 903的IgG形式並未與抗-scFv 903血清結合競爭至scFv 903之事實而證實，在scFv 903的IgG形式中，對應的界面殘基為非溶劑可接觸的，其乃因為與鄰接恒定區的接觸。
12%的測試人類血清具有抗所有抗原決定區(α,β,γ)的抗體。
64%的血清不含或具有顯著較少之結合至scFv 961(α)的抗體。如前述，該scFv與scFv 903僅3個殘基位置相異(L12S、V103T、L130T)，該等位置位於之前變異-恒定區的界面。由於這些位在V/C界面的殘基位置是高度保留的，突變這些位置是去免疫scFvs的一般方法而不會影響生物物理性質。
51%的血清不含或具有較少抗scFv105(β)的抗體，scFv105(β)即Vk1-VH1b亞型的scFv(不同架構)。可能的抗原決定區藉序列排列而辨識(第3、4和5圖)。
23%的血清係對scFv 903專一，卻不會結合至scFv105或scFv961(αβ)。當與scFv 903比較時，在二個scFvs中只有一殘基位置相異。因此，scF 903(L12)變異重鏈區的各胺基酸於ADAs和scFv 903間的反應扮演重要角色。總結來說，結論是a)大約50%ADAs結合至變異區和恒定區(α)間界面的抗原決定區，包括變異重鏈區之位置12、103和144的殘基，且b)一般說來，突變三個高度保留的殘基顯著降低既存抗體對scFvs的結合強度和頻率。DHP-基序(motif)對於降低scFvs免疫刺激性的通用適用性可藉由人類來源的變異重鏈之位置12的白胺酸、位置103的纈胺酸和位置144的白胺酸的高頻率而進一步支持(第6圖)。由於當與scFv903相比較時抗-scFv 903血清與scFv105之結合普遍地較弱，將scFv 903中任何溶劑曝露殘基取代成scFv105中的對應胺基酸可能減少或弱化一B細胞的抗原決定區。當這些體積龐大的殘基參與在之前恒定-變異區界面中，特別值得注意的是變異輕鏈中之殘基號碼101和148(表4)。
表三
含有針對不同抗原區之抗體的經測試的人類血清簡表
表四
人類變異區在特定位置之胺基酸的頻率
雖然本發明的較佳實施例現在被顯示和描述，欲被清楚認知的是，本發明並不被限制於該實施例，可能在以下申請專利範圍之範圍內，以不同方式被實施和實踐。
<110>　ESBA科技，愛爾康生物醫學研究單位有限責任公司
尤奇　大衛
剛德　提
波雷斯　里歐納度J.
<120>　降低免疫刺激性的方法
<213>　人工合成
<223>　抗體片段
<400>　1
<213>　人工合成
<223>　抗體片段
<400>　2
<213>　人工合成
<223>　抗體片段
<400>　3
<213>　人工合成
<223>　抗體片段
<400>　4
1．．．培養皿表面
2．．．scFv903
3．．．抗藥抗體(ADA)
4．．．生物素化scFv903
5．．．卵白素Poly-HRP(辣根過氧化氫酶)
第1a圖顯示一個用於偵測早期出現的抗-scFv抗體的橋接(bridging)ELISA示意圖。1：培養皿表面；2:scFv903；3：抗藥抗體(ADA)；4：生物素化scFv903；5：卵白素Poly-HRP(辣根過氧化氫酶)。
第1b圖顯示確定評估的原理，其中結合至藥品的ADA與生物素化scFv903係與過量的scFv903、34 max(791)、scFv903_DHP(961)和scFv105(100 mcg/ml)相競爭。
第2圖顯示149個單獨的血清於比色檢定(與ELISA橋接)中的訊號強度，以偵測抗-scFv 903抗體。超過檢定分界點的訊號表示在相對之血清樣本中抗-scFv 903抗體(ADA)的存在。大約30%的受測血清樣本在檢測中為陽性。
第3圖顯示四種不同scFv之溶劑曝露區域的變異輕鏈的序列組合。上層表格：與scFv903中胺基酸種類相異的各scFv中的胺基酸用粗體表示。下層表格指出與個別位置相關的抗原決定區類別，及呈現出結合在各抗原決定區類別的人類血清百分比。
第4圖顯示四種不同scFv之溶劑曝露區域的變異重鏈的序列組合。上層表格：與scFv 903中胺基酸種類相異的各scFv中的胺基酸用粗體表示。下層表格指出與個別位置相關的抗原決定位類別，及呈現出結合在各抗原決定區類別的人類血清百分比。
第5圖顯示模擬的scFv903分子結構。5a：前側觀察圖。5b：旋轉180度的視圖。灰色部分：可能參與抗原決定位β類別的殘基；黑色：可能參與抗原決定位α類別的殘基。

Claims (12)

  1. 一種用以降低一抗體片段之免疫刺激性(immunogenicity)的方法，該抗體片段包括一變異輕鏈(variable light chain)及/或一變異重鏈(variable heavy chain)，該方法包括以下步驟：取代該變異輕鏈的一或多個胺基酸殘基，其是在位置99、101及/或148(AHo編號)；及/或取代該變異重鏈的一或多個胺基酸殘基，其是在位置12、103及/或144(AHo編號)；其中該抗體片段是一scFv、一Fv片段或一單區抗體(single domain antibody)。
  2. 如請求項1之方法，其中該抗體片段是一scFv。
  3. 如請求項1之方法，其中欲被取代的該一或多個胺基酸殘基是白胺酸(L)、纈胺酸(V)、天門冬胺酸(D)、苯丙胺酸(F)、精胺酸(R)及/或麩胺酸(E)。
  4. 如請求項1之方法，其中該一或多個胺基酸殘基被低免疫反應的胺基酸(less immunoreactive amino acid)所取代。
  5. 如請求項4之方法，其中白胺酸(L)、纈胺酸(V)及/或苯丙胺酸(F)被一更具極性的胺基酸所取代。
  6. 如請求項5之方法，其中該等更具極性的胺基酸是絲胺酸(S)及/或蘇胺酸(T)。
  7. 如請求項2之方法，其中該變異輕鏈的該一或多個胺基酸殘基是在位置101(AHo編號)。
  8. 如請求項7之方法，其中該變異重鏈的該一或多個胺基酸殘基是在一或多個以下位置：12及144(AHo編號)。
  9. 如請求項2之方法，其中該變異重鏈的該一或多個胺基酸殘基被挑選自由12、103和144(AHo編號)組成之群體。
  10. 如請求項9之方法，其中該一或多個胺基酸殘基為(a)在重鏈胺基酸位置12之白胺酸(L)；(b)在重鏈胺基酸位置103之纈胺酸(V)；及/或(c)在重鏈胺基酸位置144之白胺酸(L)。
  11. 如請求項9或10之方法，其中該變異重鏈的一或多個胺基酸殘基被取代為(a)在重鏈胺基酸位置12之絲胺酸(S)；(b)在重鏈胺基酸位置103之絲胺酸(S)或蘇胺酸(T)；及/或(c)在重鏈胺基酸位置144之絲胺酸(S)或蘇胺酸(T)。
  12. 如請求項1至4中任一項之方法，其中欲被取代之該一或多個胺基酸殘基為各亞型之一致殘基(consensus residues)。
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