JP2020521478A - 腫瘍細胞におけるWntシグナル伝達と拮抗するポリペプチド - Google Patents
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Abstract
Description
Wntシグナル伝達経路の活性化には、細胞外WntリガンドがFrizzled受容体及び共役受容体LRP5(アクセッション番号:UniProtKB -O75197/LRP5_HUMAN)に結合することが必要である。哺乳類細胞には19種のWntタンパク質及び10種のFrizzled受容体が存在する。Wntリガンドの非存在下では、足場材料タンパク質Axin及びAPC、並びにキナーゼGSK3ベータ及びCK1aからなるタンパク質複合体によって、細胞質ベータ−カテニンがリン酸化される。続いて、ユビキチンリガーゼベータ−TrcPによって認識されることによって、ユビキチンが媒介するベータ−カテニンの分解が生じる。Wntリガンドの存在下では、WntがFrizzled及びLRP5に結合することによって、細胞質エフェクタタンパク質Dvlが動員され、そして、LRP5の細胞質尾部がリン酸化されて、Axinのドッキング部位が生じる。LRP5によってAxinが隔離されることによって、Axin-APC-GSK3ベータ複合体が不活化されるので、細胞内ベータ−カテニンが安定化し、そして、蓄積される。したがって、ベータ−カテニンの細胞質濃度が上昇し、そして、ベータ−カテニンは核に移動し、そして、転写因子のT細胞因子(TCF)/リンパ球エンハンサ結合因子(LEF)ファミリーのメンバーと複合体を形成する。次いで、cAMP応答エレメント結合タンパク質(CREB)結合タンパク質(CBP)又はそのホモログp300を含む基本転写機構及び翻訳共活性化因子が動員されて、Axin2、サイクリンD1、及びc-Mycを含む様々な標的遺伝子を発現させる。
本発明の第1の態様によれば、本発明は、低密度リポタンパク質受容体様タンパク質5(LRP5)に結合するポリペプチドであって、以下のLRP5結合免疫グロブリン単一可変ドメイン(ISVD)(i)〜(iv):
(i)以下の相補性決定領域(CDR)配列:
CDR1:TYVMG(配列番号1)
CDR2:AISWSGGSTYYADSVKG(配列番号2)
CDR3:SRGTSTPSRASGVSRYDY(配列番号3)
を有するISVD、
(ii)以下のCDR配列:
CDR1:RYAVA(配列番号4)
CDR2:AITWSSGRIDYADSVKG(配列番号5)
CDR3:DRRPRSTGRSGTGSPSTYDY(配列番号6)
を有するISVD、
(iii)以下のCDR配列:
CDR1:IGAMG(配列番号7)
CDR2:AVSSGGSTYYVDSVKG(配列番号8)
CDR3:ETGPYGPPKRDY(配列番号9)
を有するISVD、及び
(iv)以下のCDR配列:
CDR1:INAMG(配列番号10)
CDR2:AVSSGGSTYYVDSVKG(配列番号8)
CDR3:ETGPYGPPKRDY(配列番号9)
を有するISVD
からなる群から選択されるISVDを含むポリペプチドを提供する。
− 以下のCDR配列:
CDR1:TYVMG(配列番号1)
CDR2:AISWSGGSTYYADSVKG(配列番号2)
CDR3:SRGTSTPSRASGVSRYDY(配列番号3)
を含む第1のISVD(a)と、
− 以下のCDR配列:
CDR1:IGAMG(配列番号7)
CDR2:AVSSGGSTYYVDSVKG(配列番号8)
CDR3:ETGPYGPPKRDY(配列番号9)
を含む第2のISVD(b)と
を含む。
− 以下のCDR配列:
CDR1:TYVMG(配列番号1)
CDR2:AISWSGGSTYYADSVKG(配列番号2)
CDR3:SRGTSTPSRASGVSRYDY(配列番号3)
を含む第1のISVD(a)と、
− 以下のCDR配列:
CDR1:INAMG(配列番号10)
CDR2:AVSSGGSTYYVDSVKG(配列番号8)
CDR3:ETGPYGPPKRDY(配列番号9)
を含む第2のISVD(b)と
を含む。
− 以下のCDR配列:
CDR1:RYAVA(配列番号4)
CDR2:AITWSSGRIDYADSVKG(配列番号5)
CDR3:DRRPRSTGRSGTGSPSTYDY(配列番号6)
を含む第1のISVD(a)と、
− 以下のCDR配列:
CDR1:IGAMG(配列番号7)
CDR2:AVSSGGSTYYVDSVKG(配列番号8)
CDR3:ETGPYGPPKRDY(配列番号9)
を含む第2のISVD(b)と
を含む。
− 以下のCDR配列:
CDR1:RYAVA(配列番号4)
CDR2:AITWSSGRIDYADSVKG(配列番号5)
CDR3:DRRPRSTGRSGTGSPSTYDY(配列番号6)
を含む第1のISVD(a)と、
− 以下のCDR配列:
CDR1:INAMG(配列番号10)
CDR2:AVSSGGSTYYVDSVKG(配列番号8)
CDR3:ETGPYGPPKRDY(配列番号9)
を含む第2のISVD(b)と
を含む。
を含むアルブミン結合部分、好ましくは、アルブミン結合ISVD、更により好ましくは、Alb11ドメインである。
− 該第1のLRP5結合ISVD(a)は、ISVD(i)及び(ii):
(i)以下のCDR配列:
CDR1:TYVMG(配列番号1)
CDR2:AISWSGGSTYYADSVKG(配列番号2)
CDR3:SRGTSTPSRASGVSRYDY(配列番号3)
を含むISVD、及び
(ii)以下のCDR配列:
CDR1:RYAVA(配列番号4)
CDR2:AITWSSGRIDYADSVKG(配列番号5)
CDR3:DRRPRSTGRSGTGSPSTYDY(配列番号6)
を含むISVD
からなる群から選択され、
− 該第2のISVD(b)は、ISVD(iii)及び(iv):
(iii)以下のCDR配列:
CDR1:IGAMG(配列番号7)
CDR2:AVSSGGSTYYVDSVKG(配列番号8)
CDR3:ETGPYGPPKRDY(配列番号9)
を含むISVD、及び
(iv)以下のCDR配列:
CDR1:INAMG(配列番号10)
CDR2:AVSSGGSTYYVDSVKG(配列番号8)
CDR3:ETGPYGPPKRDY(配列番号9)
を含むISVD
からなる群から選択され、そして、
− 該アルブミン結合ISVD(c)は、以下のCDR配列:
CDR1:SFGMS(配列番号15)
CDR2:SISGSGSDTLYADSVKG(配列番号16)
CDR3:GGSLSR(配列番号17)
を含むことによって定義される。
− 以下のCDR配列:
CDR1:TYVMG(配列番号1)
CDR2:AISWSGGSTYYADSVKG(配列番号2)
CDR3:SRGTSTPSRASGVSRYDY(配列番号3)
を含む第1のISVDと、
− 以下のCDR配列:
CDR1:IGAMG(配列番号7)
CDR2:AVSSGGSTYYVDSVKG(配列番号8)
CDR3:ETGPYGPPKRDY(配列番号9)
を含む第2のISVDと、
− 以下のCDR配列:
CDR1:SFGMS(配列番号15)
CDR2:SISGSGSDTLYADSVKG(配列番号16)
CDR3:GGSLSR(配列番号17)
を含むことによって定義されるアルブミン結合ISVD(第3のISVD)と
を含む。
− 以下のCDR配列:
CDR1:TYVMG(配列番号1)
CDR2:AISWSGGSTYYADSVKG(配列番号2)
CDR3:SRGTSTPSRASGVSRYDY(配列番号3)
を含む第1のISVDと、
− 以下のCDR配列:
CDR1:INAMG(配列番号10)
CDR2:AVSSGGSTYYVDSVKG(配列番号8)
CDR3:ETGPYGPPKRDY(配列番号9)
を含む第2のISVDと、
− 以下のCDR配列:
CDR1:SFGMS(配列番号15)
CDR2:SISGSGSDTLYADSVKG(配列番号16)
CDR3:GGSLSR(配列番号17)
を含むことによって定義される該アルブミン結合ISVDと
を含む。
− 以下のCDR配列:
CDR1:RYAVA(配列番号4)
CDR2:AITWSSGRIDYADSVKG(配列番号5)
CDR3:DRRPRSTGRSGTGSPSTYDY(配列番号6)
を含む第1のISVDと、
− 以下のCDR配列:
CDR1:IGAMG(配列番号7)
CDR2:AVSSGGSTYYVDSVKG(配列番号8)
CDR3:ETGPYGPPKRDY(配列番号9)
を有する第2のISVDと、
− 以下のCDR配列:
CDR1:SFGMS(配列番号15)
CDR2:SISGSGSDTLYADSVKG(配列番号16)
CDR3:GGSLSR(配列番号17)
を含むことによって定義される該アルブミン結合ISVDと
を含む。
− 以下のCDR配列:
CDR1:RYAVA(配列番号4)
CDR2:AITWSSGRIDYADSVKG(配列番号5)
CDR3:DRRPRSTGRSGTGSPSTYDY(配列番号6)
を含む第1のISVDと、
− 以下のCDR配列:
CDR1:INAMG(配列番号10)
CDR2:AVSSGGSTYYVDSVKG(配列番号8)
CDR3:ETGPYGPPKRDY(配列番号9)
を含む第2のISVDと、
− 以下のCDR配列:
CDR1:SFGMS(配列番号15)
CDR2:SISGSGSDTLYADSVKG(配列番号16)
CDR3:GGSLSR(配列番号17)
を含むことによって定義される該アルブミン結合ISVDと
を含む。
定義
本発明の上記及び他の態様及び実施態様は、本明細書における更なる記載から明らかになるであろう:
− FR1は、1〜30位のアミノ酸残基を含み、
− CDR1は、31〜35位のアミノ酸残基を含み、
− FR2は、36〜49位のアミノ酸を含み、
− CDR2は、50〜65位のアミノ酸残基を含み、
− FR3は、66〜94位のアミノ酸残基を含み、
− CDR3は、95〜102位のアミノ酸残基を含み、そして、
− FR4は、103〜113位のアミノ酸残基を含む。
− 高親和性及び高選択性で抗原に結合するのに必要なのが単一ドメインのみであるので、2つの別々のドメインが存在する必要もなく、これら2つのドメインが正確な空間構造及び配置で存在することを保証する必要もない(すなわち、scFvのように、特別に設計されたリンカーの使用を通して);
− VHHドメインは、単一の遺伝子から発現させることができ、そして、翻訳後のフォールディングも修飾も必要としない;
− VHHドメインは、容易に操作して多価及び多重特異性のフォーマット(本明細書で更に論じられる)にすることができる;
− VHHドメインは、可溶性が高く、そして、凝集する傾向を有しない(Ward et al., Nature 341: 544-546 (1989)に記載されているマウス由来の抗原結合ドメインと同様に);
− VHHドメインは、熱、pH、プロテアーゼ、及び他の変性剤又は変性条件に対する安定性が高いので、冷蔵設備を使用せずに調製、保存、又は輸送することができ、搬送コスト、時間、及び環境的に節約になる;
− VHHドメインは、生産に必要な規模でさえも、調製が容易かつ比較的安価である。例えば、VHHドメイン及びそれを含有するポリペプチドは、(例えば、以下に更に記載する通り)微生物発酵を使用して生成することができ、そして、例えば従来の抗体断片のように、哺乳類発現系の使用を必要としない;
− VHHドメインは、従来の4本鎖抗体及びその抗原結合断片と比べて比較的小さい(約15kDa、又は従来のIgGよりも10倍小さい)ので、
このような従来の4本鎖抗体及びその抗原結合断片よりも
− (より)高い組織への浸透性を示し、そして、
− 高用量で投与することができる;
− VHHドメインは、いわゆるキャビティ結合特性を示すことができ(特に、従来のVHドメインと比べて、CDR3ループが延長されているため)、したがって、従来の4本鎖抗体及びその抗原結合断片にはアクセスできない標的及びエピトープにもアクセスすることができる。
AlaをGly又はSerに;
ArgをLysに;
AsnをGln又はHisに;
AspをGluに;
CysをSerに;
GlnをAsnに;
GluをAspに;
GlyをAla又はProに;
HisをAsn又はGlnに;
IleをLeu又はValに;
LeuをIle又はValに;
LysをArg、Gln、又はGluに;
MetをLeu、Tyr、又はIleに;
PheをMet、Leu、又はTyrに;
SerをThrに;
ThrをSerに;
TrpをTyrに;
TyrをTrp又はPheに;
ValをIle又はLeuに。
本発明のポリペプチドは、典型的にはLRP5のエピトープに特異的に結合するISVDを含む点で、LRP5に対する特異性を有する。好ましくは、本発明のポリペプチドは、LRP6、具体的にはヒトLRP6(アクセッション番号:UniProtKB - O75581/LRP6_HUMAN)に対する親和性及び/又は結合活性よりも少なくとも10倍、好ましくは少なくとも100倍、より好ましくは少なくとも1000倍、更により好ましくは少なくとも10000倍、更により好ましくは少なくとも100000倍、又は少なくとも1000000倍強い、LRP5、特にヒトLRP5に対する親和性及び/又は結合活性を有する。最も好ましくは、該ポリペプチドは、LRP6、具体的にはヒトLRP6との交差反応性がない(実施例7.1を参照)。
その最も広義では、本発明は、癌疾患を処置するための新規薬理学的活性剤を提供する。本発明に係る典型的な剤は、結合分子の新規クラス、すなわち、異なるエピトープにおいてLRP5に結合する2つ以上のISVDを含む二重パラトープポリペプチドに属する。用語「二重パラトープ」は、上に説明されているので、二重パラトープ分子は、LRP5タンパク質に含まれる2つの異なるエピトープにおいてLRP5に結合することができる分子として定義することができる。
− エピトープを介して/Wnt3aシグナル伝達経路を阻害する方法でLRP5に特異的に結合することができ、その結果、Wnt3aによって駆動される標的遺伝子の転写が阻害される第1のISVDと、
− エピトープを介して/Wnt1シグナル伝達経路を阻害する方法でLRP5に特異的に結合することができ、その結果、Wnt1によって駆動される標的遺伝子の転写が阻害される第2のISVDと
を含んでいてよい。
(i)以下の相補性決定領域(CDR)配列:
CDR1:TYVMG(配列番号1)
CDR2:AISWSGGSTYYADSVKG(配列番号2)
CDR3:SRGTSTPSRASGVSRYDY(配列番号3)
を有するISVD、
(ii)以下のCDR配列:
CDR1:RYAVA(配列番号4)
CDR2:AITWSSGRIDYADSVKG(配列番号5)
CDR3:DRRPRSTGRSGTGSPSTYDY(配列番号6)
を有するISVD、
(iii)以下のCDR配列:
CDR1:IGAMG(配列番号7)
CDR2:AVSSGGSTYYVDSVKG(配列番号8)
CDR3:ETGPYGPPKRDY(配列番号9)
を有するISVD、及び
(iv)以下のCDR配列:
CDR1:INAMG(配列番号10)
CDR2:AVSSGGSTYYVDSVKG(配列番号8)
CDR3:ETGPYGPPKRDY(配列番号9)
を有するISVD
から選択されるISVDを含むポリペプチドを提供する。
FR(a)1−CDR(a)1−FR(a)2−CDR(a)2−FR(a)3−CDR(a)3−FR(a)4−[リンカーペプチド]−FR(b)1−CDR(b)1−FR(b)2−CDR(b)2−FR(b)3−CDR(b)3−FR(b)4
(式中、
FR(a)は、第1のISVDのフレームワーク領域を意味し、
FR(b)は、第2のISVDのフレームワーク領域を意味し、
CDR(a)は、第1のISVDのCDRを意味し、
CDR(b)は、第2のISVDのCDRを意味し、
[リンカーペプチド]は、場合により存在していてもよいリンカーペプチドを意味し、
好ましくは、該CDRは、上記配列を有している(すなわち、(a)のCDRは、(i)又は(ii)のCDRであってよく、そして、(b)のCDRは、(iii)又は(iv)のCDRであってよい)。
FR(b)1−CDR(b)1−FR(b)2−CDR(b)2−FR(b)3−CDR(b)3−FR(b)4−[リンカーペプチド]−FR(a)1−CDR(a)1−FR(a)2−CDR(a)2−FR(a)3−CDR(a)3−FR(a)4
を有する分子も本発明に包含されるものとすると理解されるものとする。
CDR(Alb11)1:SFGMS(=配列番号15)
CDR(Alb11)2:SISGSGSDTLYADSVKG(=配列番号16)
CDR(Alb11)3:GGSLSR(=配列番号17)
を含むAlb11ドメインを含むか又はからなる。
FR(a)1−CDR(a)1−FR(a)2−CDR(a)2−FR(a)3−CDR(a)3−FR(a)4−[リンカーペプチド]−FR(Alb11)1−CDR(Alb11)1−FR(Alb11)2−CDR(Alb11)2−FR(Alb11)3−CDR(Alb11)3−FR(Alb11)4−[リンカーペプチド]−FR(b)1−CDR(b)1−FR(b)2−CDR(b)2−FR(b)3−CDR(b)3−FR(b)4、好ましくは、該CDRは、上記の配列を有している(すなわち、(a)のCDRは、(i)又は(ii)のCDRであってよく、そして、(b)のCDRは、(iii)又は(iv)のCDRであってよい)を有する本発明のポリペプチドの群が得られる。
(b)−Alb11−(a)
の順序で配置されているポリペプチドも同様に包含されるものとする。
CDR1:TYVMG(配列番号1)
CDR2:AISWSGGSTYYADSVKG(配列番号2)
CDR3:SRGTSTPSRASGVSRYDY(配列番号3)
を有する第1のISVDと、
以下のCDR配列:
CDR1:INAMG(配列番号10)
CDR2:AVSSGGSTYYVDSVKG(配列番号8)
CDR3:ETGPYGPPKRDY(配列番号9)
を有する第2のISVDと
を含むポリペプチド。
CDR1:RYAVA(配列番号4)
CDR2:AITWSSGRIDYADSVKG(配列番号5)
CDR3:DRRPRSTGRSGTGSPSTYDY(配列番号6)
を有する第1のISVDと、
以下のCDR配列:
CDR1:IGAMG(配列番号7)
CDR2:AVSSGGSTYYVDSVKG(配列番号8)
CDR3:ETGPYGPPKRDY(配列番号9)
を有する第2のISVDと
を含むポリペプチド。
CDR1:TYVMG(配列番号1)
CDR2:AISWSGGSTYYADSVKG(配列番号2)
CDR3:SRGTSTPSRASGVSRYDY(配列番号3)
を有する第1のISVDと、
以下のCDR配列:
CDR1:IGAMG(配列番号7)
CDR2:AVSSGGSTYYVDSVKG(配列番号8)
CDR3:ETGPYGPPKRDY(配列番号9)
を有する第2のISVDと
を含むポリペプチド。
CDR1:TYVMG(配列番号1)
CDR2:AISWSGGSTYYADSVKG(配列番号2)
CDR3:SRGTSTPSRASGVSRYDY(配列番号3)
を有する第1の(LRP5結合)ISVDと、
以下のCDR配列:
CDR1:SFGMS(=配列番号15)
CDR2:SISGSGSDTLYADSVKG(=配列番号16)
CDR3:GGSLSR(=配列番号17)
を有するアルブミン結合ISVDと、
以下のCDR配列:
CDR1:INAMG(配列番号10)
CDR2:AVSSGGSTYYVDSVKG(配列番号8)
CDR3:ETGPYGPPKRDY(配列番号9)
を有する第2の(LRP5結合)ISVDと
をこの順序で又は変更された上記ドメインの順序で含むポリペプチド。
CDR1:RYAVA(配列番号4)
CDR2:AITWSSGRIDYADSVKG(配列番号5)
CDR3:DRRPRSTGRSGTGSPSTYDY(配列番号6)
を有する第1の(LRP5結合)ISVDと、
以下のCDR配列:
CDR1:SFGMS(=配列番号15)
CDR2:SISGSGSDTLYADSVKG(=配列番号16)
CDR3:GGSLSR(=配列番号17)
を有するアルブミン結合ISVDと、
以下のCDR配列:
CDR1:IGAMG(配列番号7)
CDR2:AVSSGGSTYYVDSVKG(配列番号8)
CDR3:ETGPYGPPKRDY(配列番号9)
を有する第2の(LRP5結合)ISVDと
をこの順序で又は変更された上記ドメインの順序で含むポリペプチド。
CDR1:TYVMG(配列番号1)
CDR2:AISWSGGSTYYADSVKG(配列番号2)
CDR3:SRGTSTPSRASGVSRYDY(配列番号3)
を有する第1の(LRP5結合)ISVDと、
以下のCDR配列:
CDR1:SFGMS(=配列番号15)
CDR2:SISGSGSDTLYADSVKG (=配列番号16)
CDR3:GGSLSR(=配列番号17)
を有するアルブミン結合ISVDと、
以下のCDR配列:
CDR1:IGAMG(配列番号7)
CDR2:AVSSGGSTYYVDSVKG(配列番号8)
CDR3:ETGPYGPPKRDY(配列番号9)
を有する第2の(LRP5結合)ISVDと
をこの順序で又は変更された上記ドメインの順序で含むポリペプチド。
を有するISVD(i)及び(ii)からなる群から選択される第1のISVD(a)と、
以下の配列:
を有するISVD(iii)及び(iv)からなる群から選択される第2のISVD(b)と
を含む。
− 配列番号23に示されるアミノ酸配列を有する第1のISVD及び配列番号14に示されるアミノ酸配列を有する第2のISVD;又は
− 配列番号12に示されるアミノ酸配列を有する第1のISVD及び配列番号13に示されるアミノ酸配列を有する第2のISVD;又は
− 配列番号11に示されるアミノ酸配列を有する第1のISVD及び配列番号22に示されるアミノ酸配列を有する第2のISVD
を含むポリペプチドである。
isvd(a)−[リンカーペプチド]−isvd(b)
(式中、「isvd」は、それぞれのISVDを意味し、そして、その他の点では、特に任意のリンカーペプチド及び/又は更なるドメイン、特にAlb11ドメインの存在に関して、そして、ISVDの異なる順序に関して、上記と同じ定義及び変形が適用されるものとする)。
− 配列番号23に示されるアミノ酸配列を有する第1の(LRP5結合)ISVD;
− 配列番号21に示されるアミノ酸配列を有するアルブミン結合ISVD;
− 配列番号14に示されるアミノ酸配列を有する第2の(LRP5結合)ISVD;
をこの順序で又は変更された上記3つのドメインの順序で含むポリペプチド。
− 配列番号12に示されるアミノ酸配列を有する第1の(LRP5結合)ISVD;
− 配列番号21に示されるアミノ酸配列を有するアルブミン結合ISVD;
− 配列番号13に示されるアミノ酸配列を有する第2の(LRP5結合)ISVD;
をこの順序で又は変更された上記3つのドメインの順序で含むポリペプチド。
− 配列番号11に示されるアミノ酸配列を有する第1の(LRP5結合)ISVD;
− 配列番号21に示されるアミノ酸配列を有するアルブミン結合ISVD;
− 配列番号22に示されるアミノ酸配列を有する第2の(LRP5結合)ISVD;
をこの順序で又は変更された上記3つのドメインの順序で含むポリペプチド。
配列番号18によって同定される配列を有するF012900082、
配列番号19によって同定される配列を有するF012900135、及び
配列番号20によって同定される配列を有するF012900141。
更なる態様によれば、本発明は、本発明のポリペプチドをコードしている核酸分子及び発現ベクター、並びにそれを発現する宿主細胞に関する。これら核酸、ベクター、及び宿主細胞は、本発明のポリペプチドを製造するために有用であり、そして、その更なる態様及び実施態様は、本発明のポリペプチドを製造する方法の概要に関連して以下に更に記載される。
その生物学的特性から、本発明のポリペプチドは、過剰又は異常な細胞増殖を特徴とする疾患、例えば、癌及び特発性肺線維症(IPF)を処置するのに好適である。
頭頸部の癌;肺の癌、例えば、非小細胞肺癌(NSCLC)及び小細胞肺癌(SCLC);縦隔の新生物、例えば、神経原性腫瘍及び間葉腫瘍;消化(GI)管の癌、例えば、食道、胃(胃癌)、膵臓、肝臓、及び胆道(例えば、肝細胞癌(HCC)を含む)、並びに小腸及び大腸(例えば、結腸直腸癌を含む)の癌;前立腺の癌;精巣の癌;婦人科癌、例えば、卵巣の癌;乳癌、例えば、乳腺癌、ホルモン受容体陽性乳癌、Her2陽性乳癌、及びトリプルネガティブ乳癌;内分泌系の癌;軟組織の肉腫、例えば、線維肉腫、横紋筋肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫;骨の肉腫、例えば、骨髄腫、骨肉腫、ユーイング腫瘍、線維肉腫、骨軟骨腫、骨芽細胞腫、及び軟骨芽細胞腫;中皮腫;
皮膚の癌、例えば、基底細胞癌、扁平上皮癌、メルケル細胞癌、及び黒色腫;中枢神経系及び脳の新生物、例えば、星状細胞腫、神経膠芽腫、神経膠腫、神経芽細胞腫、及び網膜芽細胞腫;リンパ腫及び白血病、例えば、B細胞非ホジキンリンパ腫(NHL)、T細胞非ホジキンリンパ腫、慢性B細胞リンパ性白血病(B-CLL)、慢性T細胞リンパ性白血病(T-CLL)、ホジキン病(HD)、大型顆粒リンパ球白血病(LGL)、慢性骨髄性白血病(CML)、急性骨髄性/骨髄白血病(AML)、急性リンパ性/リンパ芽球性白血病(ALL)、多発性骨髄腫(MM)、形質細胞腫、及び骨髄異形成症候群(MDS);並びに原発部位不明の癌。
本発明のポリペプチドは、単独で使用してもよく、又は他の薬理学的活性物質、例えば、最先端の若しくは標準治療の化合物等、例えば、細胞増殖抑制性若しくは細胞毒性の物質、細胞増殖阻害剤、抗血管新生物質、ステロイド、免疫調節剤/チェックポイント阻害剤等と組み合わせて使用してよい。
(i)乳癌患者における、化学療法の組み合わせ(ネオアジュバント設定におけるドキソルビシン/シクロホスファミドの組み合わせ、及び/又はカペシタビン/ドセタキセルの組み合わせ;第一及びそれ以降の選択処置のためのタキサン/白金レジメンを含む)を用いる又は用いない、抗VEGF抗体(ベバシズマブ及び他の抗血管新生物質);
(ii)肺癌患者における、化学療法の組み合わせ(第一選択処置におけるゲムシタビン/シスプラチン;第二選択処置におけるドセタキセル又はペメトレキセドを含む白金ベースの細胞毒性併用療法)を用いる又は用いない、EGFR変異体NSCLCのためのEGFR TKI又はALK移行NSCLCのためのクリゾチニブ;
(iii)例えば、CRC患者を処置するための、化学療法の組み合わせ(イリノテカンを含む)、抗VEGF抗体の組み合わせ(ベバシズマブ及び他の抗血管新生物質)、又はレゴラフェニブの組み合わせを用いる又は用いない、抗EGFR抗体(KRAS野生型腫瘍におけるセツキシマブ及びパニツムマブ)。
(iv)例えば、乳癌、肺癌、及びCRCの患者を処置するための、抗PD-1剤、例えば、ペンブロリズマブ及びニボルマブ、抗PD-L1剤、抗CTLA4剤、抗BTLA剤、抗LAG3剤、及び抗TIM3剤、例えば、抗PDL1抗体等を含む免疫療法剤
(v)例えば、乳癌又はCRCの患者を処置するための、フォリン酸、5’−フルオロウラシル、及びオキサリプラチンを含むFOLFOX化学療法レジメンと組み合わせた、又はフォリン酸、5’−フルオロウラシル、オキサリプラチン、及びイリノテカンを含むFOLFOXIRI化学療法レジメンと組み合わせた、化学療法剤、例えば、白金ベースの抗新生物剤。
上記疾患の処置方法が該疾患を処置するための医薬の調製を含むことは、当業者に明らかであろう。したがって、本発明は、更に、上述の疾患を処置するための医薬組成物であって、少なくとも1つの本発明のポリペプチドを含む医薬組成物に関する。
医薬用途の場合、本発明のポリペプチドを、(i)少なくとも1つの本発明のポリペプチドと、(ii)少なくとも1つの薬学的に許容し得る担体、希釈剤、賦形剤、補助剤、及び/又は安定剤と、(iii)場合により、1つ以上の更なる薬理学的活性ポリペプチド及び/又は化合物とを含む医薬調製物として製剤化してもよい。「薬学的に許容し得る」とは、個体に投与されたときにそれぞれの物質が生物学的にも他の点でも望ましくない作用を全く示さず、そして、それが含有されている医薬組成物の他の成分(例えば、薬学的活性成分)のいずれとも有害に相互作用しないことを意味する。具体例は、標準的なハンドブック、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Company, USA (1990)に見出すことができる。例えば、本発明のポリペプチドは、従来の抗体及び抗体断片、並びに他の薬学的活性タンパク質についてそれ自体公知の任意の方法で製剤化及び投与してよい。したがって、更なる実施態様によれば、本発明は、少なくとも1つの本発明のポリペプチドと、少なくとも1つの薬学的に許容し得る担体、希釈剤、賦形剤、補助剤、及び/又は安定剤と、場合により、1つ以上の更なる薬理学的活性物質とを含有する医薬組成物又は調製物に関する。
− リン酸緩衝生理食塩水、pH7.4、
− 他のリン酸緩衝液、pH6.2〜8.2、
− 酢酸緩衝液、pH3.2〜7.5、好ましくは、pH4.8〜5.5、
− ヒスチジン緩衝液、pH5.5〜7.0、
− コハク酸緩衝液、pH3.2〜6.6、及び
− クエン酸緩衝液、pH2.1〜6.2、
と、場合により、溶液を等張にするための塩(例えば、NaCl)及び/又は糖(例えば、スクロース及びトレハロース)、及び/又は他のポリアルコール(例えば、マンニトール及びグリセロール)とを含む溶液である。
本発明は、更に、本発明のポリペプチドを製造する方法であって、一般に、
− 本発明のポリペプチドを発現させる条件下で、本発明のポリペプチドをコードしている核酸(以後「本発明の核酸」)を含む宿主細胞を培養する工程と、
− 該宿主細胞によって発現された該ポリペプチドを培養物から回収又は単離する工程と、
− 場合により、本発明のポリペプチドを更に精製及び/又は修飾及び/又は製剤化する工程と
を含む方法を提供する。
実施例1:体液性免疫応答を誘導するための、LRP5によるラマの免疫
LRP5結合VHHドメインを同定するために、ラマを免疫するための幾つかのプロトコールを考案し、そして、実施する必要があった:最初に、LRP5タンパク質(マウス)の組み換え細胞外ドメインでラマを免疫した。しかし、上述のLRP5組み換えタンパク質の機能特性評価から、該組み換えタンパク質が適切に折り畳まれないことが明らかになった。したがって、免疫に好適な抗原を開発するために更なる研究が必要であった。次善の策として、ヒトLRP5又はカニクイザル(cyno)LRP5が安定的にトランスフェクトされたHEK293細胞でラマを免疫した。しかし、この場合も、一過的なトランスフェクションによっても安定的なトランスフェクションによっても、また、異なる細胞株(HEK293及びCHO)を使用しても、ヒト又はカニクイザルのLRP5の非常に低い発現しか達成することができなかった。したがって、LRP5を十分に発現させるために更なる研究が必要であった。幾つかの不成功に終わった試行錯誤の後、遂に、外因性LRP5の発現を増加させることを意図するシャペロンであるMesDC-2をHEK293細胞に安定的に共トランスフェクトすることを含むプロトコールを開発することによって、これを達成することができた。この場合でさえも、すなわち、LRP5が安定的にトランスフェクトされた細胞株の生成中にMesDC-2を共発現させた場合でさえも、タンパク質発現の不安定性が繰り返し観察された。対照的に、HEK293細胞においてヒトLRP6をMesDC-2と共発現させた際には、著しく高くかつ安定な発現レベルが達成された。これら知見は、タンパク質の発現が非常に少ないことがヒトLRP5の固有の課題であることを示す発表データと一致している(Fleury et al, Protein Expr Purif. 2010 Mar;70(1):39-47)。これによって、免疫及びセレクション中にLRP5発現が失われる可能性があるという問題が生じた。この更なる問題を解決するために、LRP5を発現している細胞の継代数を可能な限り制限し、そして、LRP5を発現している細胞を濃縮するために追加の細胞選別を実施した。
ライブラリの構築:
免疫組織の回収直後に全RNAを抽出し、そして、RNAの完全性及び濃度を検証した。これらRNA調製物からcDNAサンプルを作製した。一段階RT-PCR反応において、VHHをコードしているヌクレオチド配列をcDNAサンプルから増幅した。サンプル中のIgG2及びIgG3のcDNAから特異的に増幅した700bpのアンプリコンをアガロースゲルから単離し、次いで、ネステッドPCR反応においてテンプレートして使用した。次いで、PCR生成物をSfiI及びBstEIIで切断し、そして、ファージミドベクターpAX50の対応する制限酵素部位にライゲーションした。ライゲーション混合物を大腸菌TG-1にエレクトロポレーションした。得られた形質転換体のプールによって、遺伝的に多様なファージディスプレイライブラリが構成された。
VHHドメイン−ファージミドライブラリを構築し、そして、セレクションのために使用した。種間(ラマ及びヒトのLRP5間)で種相同性が非常に高いことに鑑みて、ラマで生じた免疫応答がVHHドメインの十分な多様性を生じさせるかどうかは不確実であった。したがって、セレクション中に免疫ライブラリと並行して2つの合成ライブラリを使用した。
− ヒト/マウスLRP5種間交差反応性VHHドメインを同定する機会を増やすために種起源を変更する(すなわち、ヒト及びマウスのLRP5に由来するツール)、例えば、ヒトLRP5で免疫されたラマ由来のライブラリにおいて、マウスLRP5を安定的に発現しているHEK293をセレクションする、又は合成ライブラリにおけるセレクション中にマウス及びヒトのLRP5を両方発現しているHEK293細胞株を使用する(このようなLRP5アンタゴニストのマウス交差反応性によって、同じ前臨床モデル(すなわち、異種移植腫瘍マウスモデル)において、処置濃度域を評価するために必要な有効性、すなわち腫瘍成長阻害及び安全性のプロファイルを評価することが可能になる)。
− エピトープをそのネイティブな高次構造で維持するための、LRP5組み換えタンパク質による「溶液中(In solution))」セレクション:更なる障害として、LRP5組み換えタンパク質は、ELISA結合プレートに直接コーティングされた場合、適切なフォールディングが失われることが見出された。したがって、組み換えタンパク質をビオチン化し、そして、機能性アッセイにおいて適切なフォールディングを確認した後、「溶液中」でセレクションのために使用した。
− 受容体がネイティブな高次構造を有するように、LRP5を過剰発現している細胞を使用するセレクション。これは、驚くべきことに、特にLRP5のWnt3aクラス結合ドメインに対するバインダーのセレクションを改善するために必要な、重要な計略であることが判明したが、その理由は、組み換えタンパク質の機能データが、Wnt3a結合エピトープが適切にフォールディングされていないことを示したためである。
− LRP5選択的バインダーを同定するための、LRP6を過剰発現している細胞を使用するネガティブセレクション。
セレクション後、96深型ウェルプレート(体積1mL)でクローンを増殖させ、そして、IPTGを添加することによってVHH発現を誘導した。標準的な方法、例えば、国際公開公報第2011/107507号に報告されている方法に従って、シングルクローンの周辺質抽出物を調製し、そして、ヒトLRP5に対する結合についてスクリーニングした。最初に、FACSベースの結合アッセイと比較して高感度で、ロバストで、ハイスループットなアッセイである組み換えLRP5を使用する結合ELISAアッセイで、該周辺質抽出物をスクリーニングした。精製後、ELISAアッセイで同定されたVHHを、結合FACSアッセイを使用して更に特性評価して、精製されたVHHがそのネイティブな高次構造でLRP5受容体に結合することを確認した。
コード配列をpAX100発現ベクターにクローニングし、そして、c-Mycヘキサヒスチジンタグ付きタンパク質として大腸菌で発現させた。対象となるVHHコンストラクトを含有する大腸菌TG-1細胞を、振盪フラスコ内のカナマイシンを補給したTB培地中で増殖させ(37℃、250rpm)、そして、発現のために1mM IPTGを添加することによって誘導した。細胞培養物をスピンした後、ペレットを凍結融解し、そして、dPBSに再懸濁することによって、周辺質抽出物を調製した。
コード配列をpAX159発現ベクターにクローニングし、そして、c-Mycヘキサヒスチジンタグ付きタンパク質としてピキア・パストリスで発現させた。対象となるVHHコンストラクトを含有するピキア・パストリスX-33細胞をBGCM(Buffered Glycerol-Complex Medium; Invitrogen)中で増殖させた(30℃、250rpm)。3日目に、培地をBMCM(Buffered Methanol-Complex Medium; Invitrogen)に交換し、そして、培養物を更に増殖させ、そして、0.5体積% メタノール(100%)を添加することによって定期的に誘導した。細胞培養物をスピンした後、上清(分泌されたVHHを含有する)を回収した。
ヘキサヒスチジンタグ付きVHHを、固定化金属アフィニティクロマトグラフィ(RoboColumns 100ul Nickel Sepharose(商標)6 FF、Atoll)によってTecan EVO150において精製し、250mM イミダゾールを用いてカラムから溶出し、続いて、dPBSに対して脱塩した。VHHの純度及び完全性を、SDS-PAGE並びに/又は抗Myc及び抗VHH検出を用いるウエスタンブロットによって検証した。
VHHのスクリーニング後、LRP5を発現している細胞に対して高い親和性を有する精製VHHを、下記の幾つかの機能性アッセイ及び生物物理学的アッセイを使用することによって特性評価した:
LRP5選択的一価VHHの特性評価中、結合FACSアッセイにおいて得られるデータは、Wnt1及びWnt3aのレポータアッセイで観察される効力と常に相関する訳ではないことが観察され、これは、VHHのうちの幾つかのオフ速度が速いことに起因している可能性が最も高い。したがって、LRP5の結合とLRP6の結合欠如とを含む選択性及び結合効力の判定についてより信頼性が高いことが証明されている、この追加のアッセイを確立する必要があった(すなわち、DKK1競合FACS)。目的は、1μM以下の濃度でLRP5には選択的に結合するが、LRP6に対する結合は検出されない機能性VHHを選択することであった。したがって、同定されたWnt1及びWnt3aの機能性VHHを以下の通りDKK-1競合FACSにおいて特性評価した:
LRP5選択的VHHの選択されたパネルがマウス及びカニクイザルの起源のLRP5に結合することができるかどうかを判定するために、DKK1競合FACSを以下の通り実施した:
様々なエピトープのビンを同定するために、最も強力なWnt1シグナル伝達ブロッキングLRP5選択的VHHについてビニング実験を実施した。具体的には、FACSベースのアッセイを使用して、LRP5受容体結合について他のビオチン化VHH(参照VHHと呼ばれる)と競合する能力について、個々のVHHを分析した。200pM又は500pM ビオチン化参照VHH(EC50値を下回る濃度)と共に、ヒトLRP5を安定的に発現しているHEK293において、個々のVHHの連続希釈物をインキュベートした。ストレプトアビジン−PEを使用して、ビオチン化参照VHHの細胞への結合を検出した。LRP5に対する結合について参照VHHと競合するVHHは、FACSアレイを使用して測定される蛍光の減少を示す。
Wntシグナル伝達を阻害するLRP5選択的VHHの能力を、機能性Wnt1及びWnt3aアッセイで試験した。これに関しても、使用することができる確立されたプロトコールが存在しなかったので、生化学的機能性アッセイ、例えば、Wnt1/Wnt3a−LRP5ブロッキングアッセイを確立するために幾つかの試みを試す必要があった:組み換えLRP5タンパク質が直面する問題点(実施例1を参照)に加えて、機能性組み換えWnt1リガンドは、市販されていないのはもちろんのこと、入手不可能である。Wntタンパク質は多くの保存システインを含有しており、そして、保存セリンに結合した一価不飽和脂肪酸(パルミトレイン酸)によって修飾されている。これら翻訳後修飾は、効率的なシグナル伝達及びWnt分泌に必要である。構造解析は、パルミトレイン酸脂質を含有するドメインのうちの1つが、Frizzled受容体に結合して、細胞表面上におけるWntリガンドとLRP5受容体との相互作用が可能になるように高次構造を変化させるために必要であることを示す。したがって、このタンパク質が関与する機能性研究にはこのような翻訳後修飾が必要であるが、同時に、このような脂質ベースの翻訳後修飾によって、これらタンパク質の発現及び精製が非常に困難になる(低可溶性)ことが判明した。したがって、これは、生化学的アッセイにとって大きなハードルであることが判明した。
続いて、Wnt1ブロッカーの各ビンから最も強力かつ有効なリード及び最も強力かつ有効なWnt3aブロッカーを、Wnt1及びWnt3a依存性LRP5リン酸化アッセイで試験した。Wnt1又はWnt3aのいずれかをコードしている発現ベクターが共トランスフェクトされたInvitrogen製のCellsensor LEF/TCF 293F細胞(カタログ番号K1677)をリン酸化アッセイで使用した。Wnt-Frizzled-LRP5複合体が形成された結果、LRP5がリン酸化され、続いて、下流のシグナル伝達が生じるので、リン酸化の定量を使用してこのようなシグナル伝達を測定することができる。LRP5特異的な読み出しを得るために、細胞を溶解させ、そして、(受容体の細胞内ドメインに対する)LRP5選択的抗体を用いて免疫沈降を実施した。ウエスタンブロットでは、LRP5リン酸化タンパク質と交差反応するポリクローナル抗ホスホ-LRP6(Ser1490)抗体(Cell Signaling Technology)を使用して、リン酸化されたLRP5を検出した。各ビンからの少なくとも1つの代表的なVHHを含有する、精製Wnt1及びWnt3aブロッキングVHHの選択されたパネルを、最終濃度10〜100nMで試験した。具体的には、細胞溶解及びLRP5免疫沈降の前に、ブロッキングVHHの存在下で細胞を一晩インキュベートした。ポジティブコントロール(DKK1、最終濃度1μM)に対してウエスタンブロットのバンドを定量化することを介して、LRP5リン酸化のブロッキングにおけるWnt1又はWnt3aブロッキングVHHの有効性を計算した。
実施例3で報告した通り、大腸菌及びピキア・パストリスにおける発現及び精製について、LRP5選択的VHHを更に特性評価した。具体的には、一価リードパネルVHHの発現収量が0.1mg/Lを上回っていた場合、許容可能であるとみなした。選択されたLRP5選択的VHHは、大腸菌において0.3〜22.6mg/Lの範囲の発現を示し、そして、ピキア・パストリスではより高い発現を示した(>1mg/L)。SDS-PAGE分析によって発現を評価した。
LRP5選択的Wnt1及びWnt3a VHHを構成要素として使用して、図1に示す二重パラトープコンストラクトを生成した。血清アルブミン結合VHHへの遺伝子融合を半減期延長法として使用した。3つの構成要素(Wnt1ブロッカー、Wnt3aブロッカー、及びアルブミンバインダー)を、可撓性リンカーを介して連結した。実施例3に記載の通り、ピキア・パストリスにおいてVHHを生成させ、そして、精製した。例えば、国際公開公報第2012/131078号に報告されている標準的な手順に従って、得られたコンストラクト、すなわち、二重パラトープ半減期延長LRP5選択的VHHコンストラクトを、C末端にcMyc−ヘキサヒスチジンタグの付いたVHHコンストラクトの形態でピキア・パストリス発現ベクターpAX159にクローニングした。様々な配向の構成要素及び様々なリンカー、特にGSリンカーを調査した。LRP5における潜在的なWnt1及びWnt3aの結合部位間の表面積の拡張を反映するホモロジーモデリングデータに基づいて、比較的長いGSリンカーを選択した。複合Wnt1及びWnt3aレポータアッセイにおける効力に関する最良の結果は、中央にヒト血清アルブミン/HSA結合VHHを配置することによって得られた。35GSリンカーを使用し、そして、Wnt1及びWnt3a VHHブロッカーを好ましい順序で配置した。
最終濃度30μM HSAの存在下で、実施例4.4に記載の通り、Wnt1及びWnt3aのレポータアッセイを実施した。精製された二重パラトープLRP5選択的コンストラクトを、2.5μMで始まる12個の希釈物で試験した。
配列最適化は、親配列に変異を導入して、ヒトIGHV3-IGHJ生殖系列コンセンサス配列とより同一なものにするプロセスである。例えば、タンパク質の構造、活性、及び安定性が保存される方法で、フレームワーク領域における特定のアミノ酸(いわゆるホールマーク残基を除く)をそのヒト対応物に交換する。
1. 標準:これら位置の配列最適化は、VHHの安定性又は活性又は親和性を劇的に変化させるとは予測されないので、該位置を一斉に変化させて、基本的変種を生成する。
2. 独自:これら位置における配列最適化がVHHの安定性又は活性又は親和性に影響を与えるかどうか分からないので、基本的変種に加えて、個々のレベルで調べる。
VHHの配列最適化後、3つの半減期延長二重パラトープLRP5選択的VHHコンストラクト(上記表IIIを参照)を組み換え的に発現させ、そして精製し、そして、下記の通り幾つかの機能性及び生物物理学的アッセイを使用することによって特性評価した。
それぞれ図2A及び2Bに報告する通り、FACS分析によって細胞においてヒトLRP5及びLRP6に対する結合を判定した。具体的には、ヒトLRP5に対する結合は、ヒトLRP5を安定的に過剰発現しているHEK293細胞において試験した。ヒトLRP6の結合については、ヒトLRP6を安定的に過剰発現しているHEK293細胞を使用した。プレートシェーカー上において、4℃で1.5時間、LRP5バインダー希釈物(図2A及び2Bで指定されている最終濃度に対応するバインダーの1:5連続希釈物)と共に細胞をインキュベートした。FACSバッファ(1×PBS(Invitrogenカタログ番号141190-094)+10% FBS(Sigmaカタログ番号F7524)+0,05% アジ化ナトリウム)で5回該細胞を洗浄した後、4℃で1時間、VHHのフレームワーク領域に結合するポリクローナルマウス抗体と共に該細胞をインキュベートした。FACSバッファで該細胞を3回洗浄した後、標識された二次抗体(抗マウスPE(115-116-071)と共に、4℃で1時間、該細胞をインキュベートし、続いて、FACSバッファで3回洗浄工程を行った。FACSアレイ(BD)を使用して蛍光を測定した。ヒトのLRP5及びLRP6に対する結合は、試験した最高濃度において≧3000MCF値に相当する。ネガティブコントロールは、非ターゲティングバインダー(HEK293細胞で発現していない細菌タンパク質に結合するVHHコンストラクト)からなっていた。図2Aに示す通り、ヒトLRP5に対する結合は、3つの半減期延長二重パラトープLRP5選択的VHHコンストラクトの最高試験濃度において≧3000MCF値に相当する。対照的に、図2Bに示される通り、ヒトLRP6に対する結合は検出されなかった(MCF値≦300)。これらデータから、フォーマット化二重パラトープ配列最適化結合分子が、細胞アッセイ系においてそのネイティブな高次構造のヒトLRP5受容体に選択的に結合することが確認される。hLRP5に対する結合のEC50値を以下の表Vに報告する。
実施例4.1に記載されている通り、FACSベースのDKK1競合アッセイを使用して、LRP5選択的VHHコンストラクトの効力及び有効性を更に分析した。ヒトLRP5又はマウスLRP5を安定的に過剰発現しているHEK293細胞を、LRP5選択的VHHコンストラクトの連続希釈物(図3A及び図3Bで指定されている最終濃度に対応する1:5連続希釈物)と共にインキュベートした。それぞれ図3A及び3Bに示されている通り、LRP5選択的VHHは、ヒトLRP5を過剰発現しているHEK293細胞に対する結合について、更に、マウスLRP5を過剰発現しているHEK293細胞に対する結合について、ヒトDKK1と競合した。試験した最高濃度(≧1μM)でDKK1結合の完全阻害が達成され、そして、MCF値≦100に相当していた。この実験の結果として、本LRP5選択的VHHが、ヒトLRP5を過剰発現しているHEK293細胞及びマウスLRP5を過剰発現しているHEK293細胞に対する結合についてヒトDKK1と競合する(すなわち、バインダーの濃度が増大するにつれてMCF値が減少し、DKK1結合の完全な阻害は、試験した最高濃度において≦100MCF値に相当していた)ことを示すことができた。したがって、本LRP5選択的VHHは、マウス交差反応性である。このデータによって、フォーマット化二重パラトープ配列最適化結合分子が、そのネイティブな高次構造のヒト/マウスLRP5受容体に結合するという考えが強化される。
実施例4.4に記載されている通り、Wnt1及びWnt3aレポータアッセイを使用して、フォーマット化二重パラトープ配列最適化LRP5結合分子の効力及び有効性を分析した。図4Aにおいて、「Wnt1」として報告される蛍光の比[460/535nm]の値は、Wnt1を過剰発現している細胞から決定されたWnt1経路の活性化に対応し;Wnt1経路の完全阻害は、蛍光の比[460/535nm]≦0.8に対応する。図4Bにおいて、「Wnt3a」として報告される蛍光の比[460/535nm]の値は、Wnt3aを過剰発現している細胞から決定されたWnt1経路の活性化に対応し;図4Bにおいて「ベースライン」として報告される蛍光の比[460/535nm]の値は、ポジティブコントロール(DKK1;最終濃度200nM)で処理することによって決定されたWnt3a経路の完全阻害に対応する。図4A及び4Bに示されている通り、3つのLRP5選択的な、フォーマット化二重パラトープ配列最適化結合分子で処理することによって、Wnt1及びWnt3aの両経路の完全阻害が達成される。更に、IC50値によって以下の表VIに示されている通り、高い効力も報告される。
既に記載されている通り(Bafico et al. “An autocrine mechanism for constitutive Wnt pathway activation in human cancer cells”. Cancer Cell 2004;6(5):497-506;DeAlmeida et al. “The soluble wnt receptor Frizzled8CRD-hFc inhibits the growth of teratocarcinomas in vivo”. Cancer Res. 2007;67(11):5371-9);Akiri et al. “Wnt pathway aberrations including autocrine Wnt activation occur at high frequency in human non-small-cell lung carcinoma”. Oncogene. 2009; 28(21):2163-72)、活性Wntシグナル伝達を有する癌細胞株を使用して、半減期延長二重パラトープLRP5選択的VHHコンストラクトの活性Wntシグナル伝達を阻害する能力を更に特性評価した。簡潔に述べると、活性Wntシグナル伝達を有する癌細胞株PA-TU-8988Sを12ウェルプレートに播種し、そして、最終濃度1μMのLRP5選択的VHHコンストラクトで一晩処理した。内因性Wnt標的遺伝子であるAxin2のmRNA発現の阻害によって、Wntシグナル伝達を阻害する能力を検出した。標準的なRNA技術を使用して、qPCR発現分析を実施した:QIAGENによって提供されているプロトコールに従って、QIAGEN RNeasy Mini Kitを使用してRNAの単離を実施し;SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit(Invitrogen、カタログ番号11754050)を使用してcDNA合成を実施し、そして、Axin2 TaqManプライマー/プローブ(Hs00610344_m1 AXIN2 FAM、Life Technologies)及び真核生物18s内因性コントロールVIC-MGB(4319413E-1307061、Applied Biosystems)を使用するTaqMan Gene Expression Assayを使用してqPCRを実施した。
LRP5選択的二重パラトープ半減期延長VHHコンストラクト/結合分子を、Wntによって駆動される腫瘍モデルにおいてインビボで更に特性評価した。これら結合分子がインビボにおいて腫瘍成長を阻害するかどうかを判定するために実験を実施した。マウス乳腺癌ウイルスLTRエンハンサ(MMTVプロモータ)を使用してWntリガンドをトランスジェニック発現させることによって、マウスでは、広範囲に及ぶ乳管過形成、続いて、6月齢までにトランスジェニック(TG)マウスにおいて乳腺腺癌が引き起こされる。これら乳腺癌は、グルココルチコイドによって誘導されるWntリガンドの過剰発現によって駆動され、そして、上皮及び間葉系のマーカーの発現(basal-like表現型)及び細胞内のベータ−カテニンの局在によって評価される活性Wntシグナル伝達を含む、TNBC腫瘍と類似の特徴を有する。具体的には、MMTV-Wnt-1トランスジェニックマウス由来の乳腺腫瘍は、Wnt1依存性である。ヒトFcドメインに融合しているFrizzled8システインリッチドメイン(CRD)を含む可溶性Wnt受容体(F8CRDhFc)(DeAlmeida et al. “The soluble wnt receptor Frizzled8CRD-hFc inhibits the growth of teratocarcinomas in vivo”. Cancer Res. 2007;67(11):5371-9)を使用してWnt活性をブロックすると、インビボにおいて腫瘍成長を阻害すると報告されている。したがって、MMTV-Wnt1トランスジェニックマウスから単離された腫瘍を、有効性実験の開始前に、ヌードマウスにおいて腫瘍片として2〜5回皮下継代した。移植の14〜21日間後、腫瘍が約150〜300mm3の平均体積に達したとき、マウスを7マウス/群の群に無作為化し、そして、化合物をi.v.投与した。LRP5選択的二重パラトープ半減期延長VHHコンストラクトを週3回(F012900082)又は週2回(F012900141)マウスにi.v.投与し、F012900082の投与量については図6Aに、そして、F012900141については図6Bに示す。有効性実験中の腫瘍体積(左のパネル)及び体重(右のパネル)をモニタリングし、そして、平均腫瘍体積を図6A及び6Bに報告する。有効性実験の最後に腫瘍成長阻害(TGI)を判定した。具体的には、対照群(マウスをヒスチジンバッファ−20mM ヒスチジンpH6.5バッファで処理)と比較して、各処理群ごとにTGIを判定した。更に、有効性実験の最後に、LRP5アンタゴニストの潜在的毒性を評価するために、消化器(GI)組織病理学的分析(十二指腸から直腸までのGI管の切片をH&E染色することを介する)を実施した。腫瘍成長阻害(TGI)、インビボ有効性試験の最後のGI組織病理学的分析の結果、体重(有効性試験の開始時と比べて>18%の体重減少)が著しく減少したことから屠殺する必要があったマウスの数に対応する死亡数、及び腫瘍退縮(実験の最後における腫瘍体積が、実験の開始時における腫瘍体積測定値よりも小さい)の数を、表VIIA及びVIIBに各処理群ごとに報告し、そして、実験及びデータに関しては、それぞれ図6A及び6Bにも示す。
Wntシグナル伝達に対するLRP5選択的二重パラトープ半減期延長VHHコンストラクト/結合分子の効果を更に特性評価するために、実施例9に記載した有効性実験の最後に腫瘍を単離した。具体的には、化合物(50mg/kg F012900082又は15mg/kg F012900141)又は対照処理の最後の注射の24時間後に腫瘍を単離した。Axin2及び追加のWnt標的遺伝子のmRNA発現の減少によって、Wntシグナル伝達阻害を判定した:それぞれF012900082及びF012900141で処理した腫瘍におけるRNF43及びNotumを、実施例8に記載の通り分析した。Notum及びRNF43を分析するために、TaqManプライマー/プローブを使用した(Mm01253278_m1 Notum FAM及びMm00552558_m1 RNF43 FAM Life Technologies)。対照群に対するAxin2、RNF43、又はNotumのmRNA発現の倍数変化を、F012900082によるインビボ有効性については図7(左側のパネル)(図6Aを参照)に、そして、F012900141によるインビボ有効性については図7(右側のパネル)(図6Bを参照)に報告する。
11.1 発酵:上記表IIIに記載のポリペプチドはいずれかも、誘導可能なプロモータの制御下において、W3110、TG1、BL21、BL21(DE3)、HMS174、HMS174(DE3)、MM294のような様々な大腸菌株の細胞質で発現することができる。このプロモータは、lacUV5、tac、T7、trp、T5、araBから選択することができる。培養培地は、好ましくは、Wilms et al., 2001(Wilms, B., Hauck, A., Reuss, M., Syldatk, C., Mattes, R., Siemann, M., and Altenbuchner, J.: High-Cell-Density Fermentation for Production of L-N-Carbamoylase Using an Expression System Based on the Escherichia coli rhaBAD Promoter. Biotechnology and Bioengineering, 73: 95-103 (2001))、DeLisa et al., 1999(DeLisa, M. P., Li, J. C., Rao, G., Weigand, W. A., and Bentley, W. E.: Monitoring GFP-operon fusion protein expression during high cell density cultivation of Escherichia coli using an on-line optical sensor. Biotechnology and Bioengineering, 65: 54-64.(1999)))に従って十分に定義されているか、又は等価物である。しかし、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、及びバリン等のアミノ酸、又は大豆ペプトン若しくは酵母抽出物等の天然培地成分を該培地に補給することが有益である場合もある。発酵プロセスは、流加回分モードで実施される。条件:温度30〜40℃、pH6〜7.5、溶存酸素は20%超で維持する。初期C源が消費された後、培養物に上述の流加培地(又は等価物)を供給する。発酵槽内の乾燥細胞重量が40〜90g/Lに達したら、使用されるプロモータ系に対応する適切な誘導因子(例えば、IPTG、ラクトース、アラビノース)で培養物を誘導する。誘導は、パルス化完全誘導として、又は長時間にわたってそれぞれの誘導因子を発酵槽に供給することによって部分誘導として実施することができる。生産相は、少なくとも4時間持続しなければならない。ボウル形遠心分離機、管状ボウル形遠心分離機、又はディスクスタック形遠心分離機において遠心分離することによって細胞を回収し、培養上清を廃棄する。
以下の通りの組成を有する皮下に適用するための医薬製剤を製造するために、上記本発明の二重パラトープポリペプチドコンストラクトのいずれを選択してもよい:
原薬:100mg/mL(1〜3nmol/mL)
酢酸バッファ:25mM
トレハロース:220mM
Tween-20:0.02%
上記実施例11.2で調製した溶液を、それを必要としている患者、例えば、Wntシグナル伝達阻害剤に対して感受性である癌に罹患しているヒトに、2〜4週間ごとに静脈内注入(投薬量 100〜200mg)によって適用する。
インフォームド・コンセントを得た健常ドナーからPBMCを入手した。ヒト単球由来樹状細胞(Mo-DC)を、以下の通り生成した:50ng/mL GM-CSF及び50ng/mL IL-4を補給したX-VIVO培地中でPBMCを培養した。24時間培養した後、上清を慎重に除去し、そして、同じGM-CSF及びIL-4を補給したX-VIVO培地と交換した。4日目、LRP5及びLRP6の発現をFACS分析するために細胞のアリコートを除去し、そして、残りの細胞の上清を慎重に除去し、そして、LPSのみ、又はヒトWnt3a若しくはヒトWnt3a及びLRP5選択的結合分子と組み合わせたLPSの存在下でX-VIVO培地と交換した。次の日、上清を回収し、そして、製造業者の指示書に従ってELISAを通してTNF-アルファの分析に供した。
− LRP5特異的モノクローナル抗体:マウスIgG1抗ヒトLRP5−クローン1E9(Sigma #WH0004041M1)、1mg/mL〜10μg/mLで1:100連続希釈
− LRP6特異的モノクローナル抗体:マウスIgG2a抗ヒトLRP6(R&D #Mab1505);500μg/mL〜10μg/mLで1:50連続希釈)
− 対照:マウスIgG2aアイソタイプ対照(Dako #X0943);1:10連続希釈
− 二次標識ポリクローナル抗体:ヤギ抗マウスIgG/Fc−PE(Dianova #115-115-164);1:100希釈。
増殖(細胞生存の阻害によって検出される)及び活性Wntシグナル伝達(Axin2のmRNAレベルの低下によって検出される)を選択的に阻害する半減期延長二重パラトープLRP5選択的VHHコンストラクトの能力を、RNF43変異体結腸直腸癌(CRC)オルガノイドを使用して特性評価した。既に記載されている通り(van de Wetering et al. “Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell 2015;161(4):933-45)、CRCオルガノイドを樹立した。簡潔に述べると、細胞生存率アッセイを実施するために、3つのCRC患者由来オルガノイド(RNF43 mut1、RNF43 mut2、及びRNF43 WT)のそれぞれを40μmフィルタで濾過し、そして、384ウェルプレート(Basement Membrane Matrix -BMEでコーティング)に播種した。具体的には、〜500個のオルガノイドを1ウェル当たり合計体積40μLの培地(5% BMEを含む)に再懸濁させた。培養培地は、Wntリガンドを含有していなかった。Tecan D300 Digital Dispenserを使用して化合物を分注した。LRP5選択的VHHコンストラクト又は対照化合物の8点連続希釈物及び1つの固定濃度のスタウロスポリン(2μM)に、オルガノイドを曝露した。オルガノイド播種後0日目及び3日目に、新たな化合物を添加した。5日間後、CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay(Promega)を使用して、CRC患者由来オルガノイドの細胞生存率を求めた。CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assayは、代謝的に活性のある細胞の存在のマーカーである存在するATPの定量に基づいて、3D細胞培養物中の生存細胞数を求めるためのホモジニアス法である。各実験において、半減期延長二重パラトープLRP5選択的VHHコンストラクト及び対照化合物による処理を、オルガノイド株ごとにトリプリケートで実施した。内部標準として、3つのCRC患者由来オルガノイドをDMSO及びスタウロスポリンでも処理し、そして、対応する細胞生存率データを基準として使用した:DMSO値を100% 生存とし、そして、スタウロスポリン値を0% 生存とした。DMSOを全てのウェルに添加して、最高濃度(スタウロスポリン中DMSOについては0.1%)に対して正規化した。
Claims (46)
- 低密度リポタンパク質受容体様タンパク質5(LRP5)に結合するポリペプチドであって、免疫グロブリン単一可変ドメイン(ISVD)(i)〜(iv):
(i)以下の相補性決定領域(CDR)配列:
CDR1:TYVMG(配列番号1)
CDR2:AISWSGGSTYYADSVKG(配列番号2)
CDR3:SRGTSTPSRASGVSRYDY(配列番号3)
を含むISVD、
(ii)以下のCDR配列:
CDR1:RYAVA(配列番号4)
CDR2:AITWSSGRIDYADSVKG(配列番号5)
CDR3:DRRPRSTGRSGTGSPSTYDY(配列番号6)
を含むISVD、
(iii)以下のCDR配列:
CDR1:IGAMG(配列番号7)
CDR2:AVSSGGSTYYVDSVKG(配列番号8)
CDR3:ETGPYGPPKRDY(配列番号9)
を含むISVD、及び
(iv)以下のCDR配列:
CDR1:INAMG(配列番号10)
CDR2:AVSSGGSTYYVDSVKG(配列番号8)
CDR3:ETGPYGPPKRDY(配列番号9)
を含むISVD
からなる群から選択されるISVDを含むポリペプチド。 - ISVD(i)及び(ii)から選択される第1のISVDと、ISVD(iii)及び(iv)から選択される第2のISVDとを含む、請求項1記載のポリペプチド。
- 前記第1のISVDがISVD(i)であり、そして、前記第2のISVDがISVD(iii)である、請求項2記載のポリペプチド。
- 前記第1のISVDがISVD(i)であり、そして、前記第2のISVDがISVD(iv)である、請求項2記載のポリペプチド。
- 前記第1のISVDがISVD(ii)であり、そして、前記第2のISVDがISVD(iii)である、請求項2記載のポリペプチド。
- 前記第1のISVDがISVD(ii)であり、そして、前記第2のISVDがISVD(iv)である、請求項2記載のポリペプチド。
- 前記ISVDが、VHHドメイン、好ましくはヒト化VHHドメインである、請求項1〜6のいずれか一項記載のポリペプチド。
- ISVD(i)が、配列番号11の配列若しくは配列番号23の配列を含む、
ISVD(ii)が、配列番号12の配列を含む、
ISVD(iii)が、配列番号13の配列若しくは配列番号22の配列を含む、及び/又は
ISVD(iv)が、配列番号14の配列を含む、請求項1記載のポリペプチド。 - 第1のISVD及び第2のISVDを含み、前記第1のISVDが、配列番号11、配列番号12、又は配列番号23の配列を含み、そして、前記第2のISVDが、配列番号13、配列番号14、又は配列番号22の配列を含む、請求項8記載のポリペプチド。
- 前記第1のISVDが、配列番号11の配列を含み、そして、前記第2のISVDが、配列番号22の配列を含む、請求項9記載のポリペプチド。
- 前記第1のISVGが、配列番号12の配列を含み、そして、前記第2のISVDが、配列番号13の配列を含む、請求項9記載のポリペプチド。
- 前記第1のISVDが、配列番号23の配列を含み、そして、前記第2のISVDが、配列番号14の配列を含む、請求項9記載のポリペプチド。
- 前記第1のISVD及び前記第2のISVDが、リンカーペプチドによって共有結合的に連結しており、前記リンカーペプチドが、場合により、第3のISVDを含むか又はからなる、請求項2〜12のいずれか一項記載のポリペプチド。
- 半減期延長部分を更に含み、前記半減期延長部分が、ポリペプチドに共有結合的に連結しており、そして、場合により、アルブミン結合部分、例えば、アルブミン結合ペプチド又はアルブミン結合免疫グロブリンドメイン、トランスフェリン結合部分、例えば、抗トランスフェリン免疫グロブリンドメイン、ポリエチレングリコール分子、ヒト血清アルブミン、及びヒト血清アルブミンの断片からなる群から選択される、請求項2〜13のいずれか一項記載のポリペプチド。
- 前記半減期延長部分が、アルブミン結合部分、好ましくは、アルブミン結合ISVD、より好ましくは、配列番号21の配列を含むAlb11ドメインである、請求項14記載のポリペプチド。
- 第1及び第2のLRP5結合ISVDと、1つのアルブミン結合ISVDとを含むポリペプチドであって、
− 前記第1のLRP5結合ISVDが、ISVD(i)及び(ii):
(i)以下のCDR配列:
CDR1:TYVMG(配列番号1)
CDR2:AISWSGGSTYYADSVKG(配列番号2)
CDR3:SRGTSTPSRASGVSRYDY(配列番号3)
を含むISVD、
(ii)以下のCDR配列:
CDR1:RYAVA(配列番号4)
CDR2:AITWSSGRIDYADSVKG(配列番号5)
CDR3:DRRPRSTGRSGTGSPSTYDY(配列番号6)
を含むISVD
からなる群から選択され、
− 前記第2のISVDが、ISVD(iii)及び(iv):
(iii)以下のCDR配列:
CDR1:IGAMG(配列番号7)
CDR2:AVSSGGSTYYVDSVKG(配列番号8)
CDR3:ETGPYGPPKRDY(配列番号9)
を含むISVD、及び
(iv)以下のCDR配列:
CDR1:INAMG(配列番号10)
CDR2:AVSSGGSTYYVDSVKG(配列番号8)
CDR3:ETGPYGPPKRDY(配列番号9)
を含むISVD
からなる群から選択され、
− 前記アルブミン結合ISVDが、以下のCDR配列:
CDR1:SFGMS(配列番号15)
CDR2:SISGSGSDTLYADSVKG(配列番号16)
CDR3:GGSLSR(配列番号17)
を含むことによって定義される、ポリペプチド。 - 前記第1のISVDがISVD(i)であり、そして、前記第2のISVDがISVD(iii)である、請求項16記載のポリペプチド。
- 前記第1のISVDがISVD(i)であり、そして、前記第2のISVDがISVD(iv)である、請求項16記載のポリペプチド。
- 前記第1のISVDがISVD(ii)であり、そして、前記第2のISVDがISVD(iii)である、請求項16記載のポリペプチド。
- 前記第1のISVDがISVD(ii)であり、そして、前記第2のISVDがISVD(iv)である、請求項16記載のポリペプチド。
- 配列番号18、19、及び20から選択される配列を含むか又はからなる、LRP5に結合するポリペプチド。
- LRP5に対する結合について参照ISVDと競合するISVDを含む、LRP5に結合するポリペプチドであって、前記参照ISVDが、配列番号11、12、13、14、22、又は23によって同定される配列を有し;好ましくは、前記ISVDが、LRP5のWnt1又はWnt3aの結合部位をブロックし、具体的には、前記ISVDが、Wnt1によって駆動されるか又はWnt3aによって駆動される標的遺伝子の転写を阻害する、ポリペプチド。
- LRP5に対する結合について第1の参照ISVDと競合する第1のISVDであって、前記第1の参照ISVDが配列番号11、23、又は12によって同定される配列を有する、第1のISVDと、LRP5に対する結合について第2の参照ISVDと競合する第2のISVDであって、前記第2の参照ISVDが配列番号13、22、又は14によって同定される配列を有する、第2のISVDとを含み;好ましくは、前記第1のISVDが、LRP5のWnt3a結合部位をブロックし、具体的には、Wnt3aによって駆動される標的遺伝子の転写を阻害する、及び/又は好ましくは、前記第2のISVDが、LRP5のWnt1結合部位をブロックし、具体的には、Wnt1によって駆動される標的遺伝子の転写を阻害する、請求項22記載のポリペプチド。
- リンカーペプチドが、前記第1のISVDを前記第2のISVDに共有結合的に連結し、前記リンカーペプチドが、場合により、更なるISVD、好ましくはアルブミン結合ISVD、特に請求項16記載のアルブミン結合ISVDを含むか又はからなる、請求項23記載のポリペプチド。
- 前記第1及び/又は前記第2のISVDが、VHHドメイン、好ましくはヒト化VHHドメインである、請求項23又は24記載のポリペプチド。
- 第1のLRP5結合ドメイン、好ましくはISVDと、第2のLRP5結合ドメイン、好ましくはISVDとを含む、LRP5に結合するポリペプチドであって、前記第1のLRP5結合ドメインが、前記第2のLRP5結合ドメインが結合するLRP5領域とは異なるLRP5の領域に結合する、ポリペプチド。
- 前記第1のドメインが、LRP5のWnt3a結合部位をブロックし、そして、好ましくは、Wnt3aによって駆動される標的遺伝子の転写を阻害する、及び/又は前記第2のドメインが、LRP5のWnt1結合部位をブロックし、そして、好ましくは、Wnt1によって駆動される標的遺伝子の転写を阻害する、請求項26記載のポリペプチド。
- 半減期延長部分を更に含み、前記半減期延長部分が、ポリペプチドに共有結合的に連結しており、そして、好ましくは、アルブミン結合部分、例えば、アルブミン結合ペプチド又はアルブミン結合免疫グロブリンドメイン(例えば、アルブミン結合ISVD)、トランスフェリン結合部分、例えば、抗トランスフェリン免疫グロブリンドメイン、ポリエチレングリコール分子、ヒト血清アルブミン、及びヒト血清アルブミンの断片からなる群から選択される、請求項22〜27のいずれか一項記載のポリペプチド。
- LRP6、具体的にはヒトLRP6に対する親和性及び/又は結合活性よりも少なくとも10倍、好ましくは少なくとも100倍、より好ましくは少なくとも1000倍、更により好ましくは少なくとも10000倍、更により好ましくは少なくとも100000倍強い、LRP5、特にヒトLRP5に対する親和性及び/又は結合活性を有する、請求項1〜28のいずれか一項記載のポリペプチド。
- LRP6、具体的にはヒトLRP6との交差反応性がない、請求項1〜28のいずれか一項記載のポリペプチド。
- 請求項1〜30のいずれか一項記載のポリペプチドをコードしている、好ましくは単離された形態の、核酸分子。
- 請求項31記載の核酸を含む発現ベクター。
- 請求項32記載の発現ベクターを保有している宿主細胞。
- 請求項1〜30のいずれか一項記載のポリペプチドを製造する方法であって、
− 請求項1〜30のいずれか一項記載のポリペプチドを発現させる条件下で、請求項33記載の宿主細胞を培養する工程と、
− 前記ポリペプチドを回収する工程と、
を含む方法。 - − 前記ポリペプチドを精製する工程
を更に含む、請求項34記載の方法。 - (i)活性成分としての、請求項1〜30のいずれか一項記載のポリペプチドと、(ii)薬学的に許容し得る担体と、場合により、(iii)希釈剤、賦形剤、補助剤、及び/又は安定剤とを含む、医薬組成物。
- ヒト又は動物における疾患、障害、又は病態を治療、予防、又は緩和する方法において医薬として使用するための、請求項1〜30のいずれか一項記載のポリペプチド。
- 癌、好ましくは、乳癌、肺癌、具体的には非小細胞肺癌(NSCLC)、膵臓癌、結腸直腸癌、肉腫、卵巣癌、若しくは肝細胞癌の処置において使用するための、又は特発性肺疾患の処置において使用するための、又は異常なWntシグナル伝達によって引き起こされる網膜症の処置において使用するための、請求項1〜30のいずれか一項記載のポリペプチド。
- トリプルネガティブ乳癌(TNBC)の処置において使用するための、請求項1〜30のいずれか一項記載のポリペプチド。
- 化学療法剤、血管新生を阻害する処置活性化合物、シグナル伝達経路阻害剤、EGFR阻害剤、免疫調節剤、免疫チェックポイント阻害剤、又はホルモン療法剤と組み合わせて使用するための、請求項1〜30のいずれか一項記載のポリペプチド。
- 請求項1〜30のいずれか一項記載のポリペプチドと組み合わせて使用するための、化学療法剤、血管新生を阻害する処置活性化合物、シグナル伝達経路阻害剤、EGFR阻害剤、免疫調節剤、免疫チェックポイント阻害剤、及びホルモン療法剤からなる群から選択される処置剤。
- それを必要としている患者における癌又は特発性肺疾患又は網膜症を処置する方法であって、有効量の請求項1〜30のいずれか一項記載のポリペプチド又は請求項36記載の医薬組成物を前記患者に投与することを含む方法。
- 樹状細胞におけるWnt1及びWnt3aによって駆動される標的遺伝子の転写を阻害することによって腫瘍微小環境を調節するための、請求項1〜30のいずれか一項記載のポリペプチドの使用であって、好ましくはインビトロにおける使用である、使用。
- 抗PD1抗体、抗PDL1抗体、抗CTLA4抗体、抗BTLA抗体、抗LAG3抗体、及び抗TIM3抗体からなる群から選択される免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて、又は癌ワクチンと組み合わせて、癌の処置において使用するための、請求項1〜30のいずれか一項記載のポリペプチド。
- 癌の処置における医薬の製造における、請求項1〜30のいずれか一項記載のポリペプチドの使用。
- 抗PD1抗体、抗PDL1抗体、抗CTLA4抗体、抗BTLA抗体、抗LAG3抗体、及び抗TIM3抗体からなる群から選択される免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせた、又は癌ワクチンと組み合わせた、癌の処置における医薬の製造における、請求項1〜30のいずれか一項記載のポリペプチドの使用。
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